專利名稱：：Septin1蛋白在制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，提供了一種Septinl蛋白的新用途，即其在制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。表現(xiàn)為正常血細(xì)胞生成減少，周圍血白細(xì)胞發(fā)生質(zhì)和量的異常，白細(xì)胞及其幼稚細(xì)胞(即白血病細(xì)胞)在骨髓或其它造血組織中進(jìn)行性、失控制的異常增生，浸潤(rùn)并損害各種組織，產(chǎn)生不同癥狀。根據(jù)白血病的病程及細(xì)胞形態(tài)學(xué)可將白血病分為(1)急性白血病病情發(fā)展迅速，骨髓及周圍血中主要是異常原始和幼稚細(xì)胞。其自然病程多在6個(gè)月以內(nèi)。急性白血病又分A、急性淋巴細(xì)胞白血病(急淋)；B、急性非淋巴細(xì)胞白血病(急非淋)。包括急性粒細(xì)胞白血病(急粒)、急性單核細(xì)胞白血病(急單)。(2)慢性白血病病程較長(zhǎng)，骨髓及血中主要是較成熟的異常細(xì)胞，其次為幼稚細(xì)胞。自然病程多在一年以上。慢性白血病主要包括慢性粒細(xì)胞白血病(慢粒)；慢性淋巴細(xì)胞白血病(慢淋)；多毛細(xì)胞白血??；幼淋巴細(xì)胞白血病。(3)特殊類型白血病如低增生性白血病、綠色瘤或粒細(xì)胞肉瘤、嗜酸粒細(xì)胞白血病、嗜堿粒細(xì)胞白血病等。白血病是一種常見的惡性腫瘤，我國(guó)已將其列入重點(diǎn)防治的十大惡性腫瘤之一。白血病占惡性腫瘤總發(fā)病數(shù)的5%左右，發(fā)病以兒童和青年居多，在我國(guó)各年齡組惡性腫瘤的死亡率中占第六位(男性)和第八位(女性)，在兒童及35歲以下的人群中則占第一位。人類白血病的確切病因至今未明。有關(guān)研究表明，病毒可能是主要的因素，此外尚有遺傳因素、放射、化學(xué)毒物和藥物等因素。某些染色體的異常與白血病的發(fā)生也有直接關(guān)系，染色體的斷裂和易位可使癌基因激活或位置發(fā)生移動(dòng)，染色體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)的改變可直接引起細(xì)胞發(fā)生突變。免疫功能的降低，也有助于白血病的發(fā)生。由于目前白血病的治療大多需要進(jìn)行骨髓移植，這就阻礙了進(jìn)一步提高治愈率或者緩解率。首先，找到可以配型的骨髓機(jī)率就不高；其次，在骨髓移植手術(shù)期間，由于成熟免疫細(xì)胞被一率殺滅，患者的免疫力極其低下，需要住在無菌室進(jìn)行治療，給患者帶來了非常大的痛苦；再次，骨髓移植手術(shù)耗費(fèi)巨大人力、物力，給患者及其家屬都帶來了很大的負(fù)擔(dān)和壓力。Septin是一個(gè)GTP酶家族，最早是在AzccAanw^cwcerev/wae酵母中被鑒定的。Septin的功能研究主要有兩方面首先是Septin蛋白形成lOmn直徑的頸絲環(huán)繞胞漿膜內(nèi)側(cè)的母芽頸一周，作為胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的載物臺(tái)[Bi，E.，Maddox，P.，Lew,DJ.,"a/.(1998)JCe〃5/o/'142:1301-1312.;Boyne，JR.,Yosuf,HM.,Bieganowski,P"Wa/(2000)JCe〃Sc/113:4533-4543.]。次之，Septin與極性生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[Barral,Y.,Me腿ll，V,，Mooseker，MS,,er(2000).Afo/Ce〃.5，84卜851;Takizawa，PA.，Derisi，JL.，Wilhelm，JE.,a/.(2000).Sc/CTce.290，341-344]。然而，尚未有人報(bào)道關(guān)于Septinl在制備免疫制劑中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供蛋白S印tinl的新用途，即將其應(yīng)用于制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物。本發(fā)明提供了GTP酶蛋白Septinl的一種新用途，即將其應(yīng)用于制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物。本發(fā)明的Septinl表達(dá)組織譜分析表明，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤、腦、心臟、外周血白細(xì)胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，Septinl只在外周血、胸腺和脾臟的淋巴細(xì)胞中大量表達(dá)，這說明Septinl蛋白主要在淋巴細(xì)胞中發(fā)揮功能，而不會(huì)對(duì)其它組織或者細(xì)胞起作用。細(xì)胞結(jié)果顯示，Septinl可被磷酸化，而在206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳時(shí)，Septinl就不能被磷酸化。這說明了206位絲氨酸殘基是Septinl被磷酸化的關(guān)鍵。在淋巴系統(tǒng)來源細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的Septinl、SeptinlS206A突變體(即在Septinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳)和SeptinlS206E突變體(即在Septinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)镋),結(jié)果顯示，以表達(dá)正常Septinl的細(xì)胞為對(duì)照，SeptinlS206A突變體會(huì)使細(xì)胞不進(jìn)入G2期，即細(xì)胞不能分裂；SeptinlS206E突變體使G2期細(xì)胞大大增加，即促進(jìn)細(xì)胞分裂。這說明Septinl可調(diào)控細(xì)胞分裂，尤其是206位的絲氨酸殘基。這也說明，如果將Septinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳、抑制Septinl蛋白活性或者使Septinl蛋白失活，就可以使細(xì)胞停止分裂增殖。因而，可以將S印tinl蛋白作為藥靶，篩選Septinl蛋白的抑制劑和失活劑。一旦篩選到了Septinl蛋白的抑制劑或者失活劑，施用于細(xì)胞，就可以使細(xì)胞停止分裂。另一方面，一旦篩選到了Septinl蛋白的增強(qiáng)劑，施用于細(xì)胞，就可以使細(xì)胞加速分裂生長(zhǎng)。有絲分裂是細(xì)胞周期過程中很重要的一個(gè)階段。大多數(shù)的腫瘤其發(fā)生原因是有絲分裂所致的基因組的不穩(wěn)定性，基因組的不穩(wěn)定又來源于染色體的不穩(wěn)定，染色體的不穩(wěn)定是癌癥的特征性標(biāo)志。染色體的分離、中心粒的復(fù)制和分離發(fā)生異常，會(huì)導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目的異常，既非整倍體，增加雜合性缺失的機(jī)會(huì)，抑癌基因的缺失或原癌基因的數(shù)目增加都會(huì)使細(xì)胞生命代謝和信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生紊亂，增加癌變的機(jī)會(huì)。腫瘤與正常細(xì)胞的區(qū)別就是無限制增生，即有絲分裂失去正常調(diào)控。綜上所述，Septinl可調(diào)控細(xì)胞分裂，尤其是淋巴細(xì)胞的細(xì)胞分裂。Septinl的突變體可以特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡。曰前，淋巴細(xì)胞白血病患者在接受治療時(shí)，往往需要進(jìn)行骨髓移植。本發(fā)明的S印tinl蛋白抑制劑或者Septinl蛋白突變體，可以在骨髓移植期間及前期治療和準(zhǔn)備階段用于抑制淋巴細(xì)胞的增殖。本發(fā)明的Septinl蛋白突變體及Septinl蛋白抑制劑可以特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡。例如，本發(fā)明的SeptinlS206A突變體會(huì)使細(xì)胞不進(jìn)入G2期，即細(xì)胞不能分裂；將其施用于淋巴細(xì)胞白血病患者，就可以特異性的使淋巴細(xì)胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細(xì)胞，例如中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞等等，的生長(zhǎng)增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態(tài)、縮短患者的恢復(fù)時(shí)間，減輕患者及其家屬的負(fù)擔(dān)。用本發(fā)明的Septinl蛋白篩選到的Septinl蛋白抑制劑也能起到相似的作用。本發(fā)明中，所述的淋巴細(xì)胞白血病包括急性淋巴細(xì)胞白血病或者急性復(fù)發(fā)的慢性淋巴細(xì)胞白血病。本發(fā)明中，Septinl可以作為篩選和制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物的藥耙。將S印tinl作為藥靶，可以用于篩選使淋巴細(xì)胞停止分裂或者加速分裂生長(zhǎng)的物質(zhì)，作為治療淋巴細(xì)胞白血病或者緩解白血病的藥物。本發(fā)明的SEPTIN1可以作為靶標(biāo)，篩選抑制SEPTIN1活力的物質(zhì)或者方法。篩選方法包括以下步驟A選擇候選化合物；B提供檢測(cè)SEPTIN1表達(dá)或者活性的體系；C用SEPTIN1的檢測(cè)體系選擇候選化合物；D確定SEPTIN1表達(dá)量或者活性在候選化合物的影響下的改變。所述候選化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、RNA等，可以是siRNA、反義寡核苷酸、核酶或者與SEPTIN1核苷酸序列互補(bǔ)的其它核酸分子;氨基酸包括肽、抗體、互作蛋白等；小分子化合物則包括天然和人工的合成的。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SEPTIN1蛋白"指可維持細(xì)胞正常分裂的、序列與(NCBI登陸號(hào)NP一443070)所示多肽序列至少70%同源性的SEPTIN1多肽及其變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地l-30個(gè)，更佳地l-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為IO個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人SEPTIN1蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人SEPTIN1DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人SEPTIN1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人SEPTIN1多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人SEPTIN1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人SEPTIN1多肽序列的至少約IO個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約IOO個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供人SEPTIN1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人SEPTIN1多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明的SEPTIN1蛋白可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，可將SEPTIN1基因表達(dá)為蛋白而得。本發(fā)明的SEPTIN1基因可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的SEPTIN1基因序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明的SEPTIN1核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SEPTIN1基因"指編碼具有維持淋巴細(xì)胞正常分裂生長(zhǎng)活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列號(hào)為(NCBI登陸號(hào)NM—052838)的序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指該核酸序列開放閱讀框中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與該核酸序列開放閱讀框序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出神經(jīng)元分化相關(guān)基因SEPTIN1的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與NM—052838開放閱讀框序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與NM_052838開放閱讀框序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼序列號(hào)為NP—443070氨基酸序列的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為l-90個(gè)，較佳地l-60個(gè)，更佳地l-20個(gè)，最佳地l-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5，和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。獲得了SEPTIN1基因序列后，就可以將SEPTIN1基因序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，以獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。一旦獲得了含有SEPTIN1基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒，就可將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)。作為靶標(biāo)的除了SEPTIN1蛋白，還可以是SEPTIN1基因、SEPTIN1的mRNA、SEPTIN1的表達(dá)產(chǎn)物及其前述三者的特異性片斷。所述"特異性片斷"是指可以區(qū)別本發(fā)明的SEPTIN1與其它基因的片斷。利用本發(fā)明的SEPTIN1，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與其發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。這些與SEPTIN1發(fā)生相互作用或者抑制其活性的物質(zhì)可以是核酸、氨基酸、化合物等。本發(fā)明的SEPTIN1及其抑制劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的人SEPTIN1蛋白的抑制劑為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人SEPTIN1可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的SEPTIN1還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)本發(fā)明的人SEPTIN1蛋白抑制劑被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該抑制劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明中，所述的治療淋巴細(xì)胞白血病藥物是由含有效治療量的SEPTIN1抑制劑和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至5微克/千克體重。本發(fā)明還提供了一種用于篩選治療淋巴細(xì)胞白血病藥物的試劑盒，該試劑盒中包括Septinl蛋白或者特異性擴(kuò)增人Septinl編碼核苷酸序列的引物對(duì)。上述試劑盒中含有特異性擴(kuò)增人Septinl的引物對(duì)、進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的其他試劑例如緩沖液等，和使用說明。其中，該特異性引物的序列衍生自(Septinl-F:5'-ATGGACAAGGAGTACGTG-3'Septinl-R:5'-TCAGAGGGCGTCTGACTG-3')的序列，長(zhǎng)度為15-35。此外，較佳地，至少一個(gè)所用的引物跨越了兩個(gè)外顯子，因?yàn)榇藭r(shí)對(duì)應(yīng)于SEPTIN1的基因組序列將不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。使用該試劑盒時(shí)，可以按照實(shí)施例2的方法篩選治療淋巴細(xì)胞白血病藥物。如果候選藥物對(duì)Septinl蛋白活力或者表達(dá)水平的有較強(qiáng)的抑制作用，則該候選藥物可以作為治療淋巴細(xì)胞白血病藥物。本發(fā)明還提供了一種用于治療淋巴細(xì)胞白血病的試劑盒。該試劑盒中包括Septinl蛋白的抑制劑或者其編碼核苷酸序列的互補(bǔ)序列。該試劑盒還可含有使用說明、分子標(biāo)記、將Septinl蛋白的抑制劑或者其編碼核苷酸序列的互補(bǔ)序列引入細(xì)胞或者組織所需的其他試劑，例如緩沖液等。將Septinl蛋白的抑制劑或者其編碼核苷酸序列的互補(bǔ)序列引入細(xì)胞或者組織，可以將細(xì)胞的有絲分裂停滯在S期，即使細(xì)胞不分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。本發(fā)明還提供了一種生物芯片，該生物芯片的載體上含有Septinl蛋白或者其編碼核苷酸序列。本發(fā)明根據(jù)上述方法篩選到了一種Septinl蛋白的抑制劑(雙鏈小RNA)，稱為SEPTIN1SR(序列如下正義鏈5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCtt-3'反義鏈5、GAUGUGGAUCUCCUCUUCCtt-3')。將其轉(zhuǎn)入了內(nèi)源表達(dá)septinl的人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat中，48小時(shí)后western印跡法檢測(cè)了內(nèi)源septinl的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示，在所取細(xì)胞量相同的條件下(P-actin蛋白表達(dá)水平大致相同)，轉(zhuǎn)入干擾siRNA的細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)septinl的水平明顯下降(下降水平〉50%)。為了驗(yàn)證SEPTIN1SR的功能，本發(fā)明首先檢測(cè)了千擾septinl后，Jurkat細(xì)胞在不同濃度的PHA刺激下的增殖能力，結(jié)果如圖8所示，與轉(zhuǎn)入對(duì)照siRNA(將SEPTIN1SR序列中的l，9，19三位核苷酸進(jìn)行置換所得片斷，序列如下正義鏈5'-AGAAGAGGGGAUCCACAUGtt-3'反義鏈5'-CAUGUGGAUCCCCUCUUCUtt-3')的Jurkat細(xì)胞相比，干擾了septinl后的Jurkat細(xì)胞對(duì)PHA刺激的敏感性明顯下降，對(duì)比lpg/ml的PHA剌激與O.lpg/ml的PHA剌激下Jurkat細(xì)胞的增殖水平，對(duì)照組升高約200%,而干擾組只升高了約25%。隨后本發(fā)明又檢測(cè)了在lpg/ml的PHA刺激下，60小時(shí)內(nèi)干擾septinl的Jurkat細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果如圖9所示，對(duì)照組在60小時(shí)后增殖了161%，而干擾組只增殖了44%。這充分證實(shí)了septinl是Jurkat細(xì)胞增殖所必需的，同時(shí)也證明了用上述方法篩選Septinl蛋白的抑制劑是正確的。本發(fā)明的Septinl蛋白及其突變體可以特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡。將SeptinlS206A突變體施用于淋巴細(xì)胞白血病患者，就可以特異性的使淋巴細(xì)胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態(tài)、縮短患者的恢復(fù)時(shí)間，減輕患者及其家屬的負(fù)擔(dān)。用本發(fā)明的Septinl蛋白篩選到的Septinl蛋白抑制劑也能起到相似的作用。圖1為Septinl的組織表達(dá)譜圖。其中，1為心臟、2為腦、3為胎盤、4為肺、5為肝、6為骨胳肌、7為腎、8為胰腺、9為脾臟、IO為胸腺、ll為前列腺、12為睪丸、13為卵巢、14為小腸、15為大腸、16為外周血白細(xì)胞。圖2為septinl蛋白在17種人類細(xì)胞系中的表達(dá)情況圖。圖3為septinl蛋白與CK2互作IB-免疫印跡雜交試驗(yàn)的結(jié)果。圖4為septinl蛋白在Jurkat細(xì)胞株的定位結(jié)果。圖5為septinl蛋白被CK2體內(nèi)磷酸化的結(jié)果。圖6為septinl蛋白被CK2體外磷酸化的結(jié)果。圖7為septinl蛋白在Jurkat細(xì)胞株內(nèi)被SEPTIN1SR抑制的結(jié)果。圖8為SEPTIN1SR抑制Jurkat細(xì)胞株分裂受PHA濃度影響的結(jié)果。圖9為在相同PHA濃度條件下SEPTIN1SR抑制Jurkat細(xì)胞株分裂的結(jié)果。圖10為空載體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)。為圖11-13的空白對(duì)照，由流式細(xì)胞儀分析而得。圖11為野生型septinl蛋白轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)。為圖12-13的對(duì)照，由流式細(xì)胞儀分析而得。圖12為septinl蛋白S206A突變體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)，由流式細(xì)胞儀分析而得?？梢?，與圖10和11相比，G2期細(xì)胞幾乎沒有。圖13為septinl蛋白S206A突變體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)，由流式細(xì)胞儀分析而得。可見，與圖10和11相比，G2期細(xì)胞明顯增加。具體實(shí)施方式下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方案，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等人的《分子克隆》實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或者按照生產(chǎn)商建議的條件進(jìn)行操作。實(shí)施例1Septinl的組織中的表達(dá)情況1.1Northern探針制備用ClontechMultipleTissuenorthen膜檢測(cè)成人組織中septinl基因的分布情況，所用探針為克隆到的septinl全長(zhǎng)開放閱讀框(即NCBI登陸號(hào)NM_052838所示核苷酸序列中第188到1291位)。1)用septinl基因的特異的引物從構(gòu)建好并已經(jīng)測(cè)序的質(zhì)粒中擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCR純化試劑盒純化后，用GeneQuantII型紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后DNA的濃度。2)DNA模板經(jīng)100'C熱變性2min后，用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒以隨機(jī)引物標(biāo)記法摻入Y-32PdCTP。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，加入EDTA至終濃度20mmol/L中止反應(yīng)，100°C熱變性5min，置于冰上。3)將探針用MicroSpinG-25純化柱純化。純化前后分別取樣lpl稀釋IOO倍，取3pl稀釋液點(diǎn)樣在WhatmanDE81濾紙上,用Monitor卯0型放射性檢測(cè)儀測(cè)定其放射強(qiáng)度(cps)。將純化后的放射性強(qiáng)度除以純化前的放射性強(qiáng)度記為摻入率，摻入率大于30%則認(rèn)為探針制備合格。1.2Northen雜交1)將雜交膜用2XSSC液潤(rùn)濕后將膜帶RNA的一面朝上放入雜交管中，每10cm2膜面積加入lml甲酰胺預(yù)雜交液，預(yù)雜交液含50%甲酰胺，5XSSPE，10XDenhardt試劑，2Q/SDS,1000mg/L小牛胸腺DNA。42'C預(yù)雜交2-4小時(shí)。2)預(yù)雜交結(jié)束后，將純化后的標(biāo)記探針加入剩余的預(yù)雜交液中。42'C雜交48小時(shí)。3)雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交液棄去，加入雜交洗脫液l(2XSSC,0.05%SDS)室溫洗滌3次，每次30min，其間不?；蝿?dòng)膜。然后加入雜交洗脫液2(0.1XSSC，0.1。/。SDS)，5(TC洗滌2次，每次30min。用Monitor卯O型放射性檢測(cè)儀測(cè)定整張膜上的放射強(qiáng)度。如果背景的放射強(qiáng)度過高，可以適當(dāng)?shù)奶岣呦茨囟龋俅蜗礈臁?)將洗滌完畢的膜放入保鮮袋中封口，進(jìn)行放射自顯影.結(jié)果顯示，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤、腦、心臟、外周血白細(xì)胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，Septinl的mRNA僅在外周血、胸腺、脾臟等組織中有表達(dá)，而且在胸腺中表達(dá)量最高。詳見圖l。實(shí)施例2western-blot分析septinl蛋白在17種人類細(xì)胞系中的表達(dá)情況1、17種人類細(xì)胞系的培養(yǎng)所選17種細(xì)胞均來自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，其組織來源及培養(yǎng)條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.Western印跡檢測(cè)septinl蛋白的表達(dá)水平(1)分別收獲17種細(xì)胞各約106個(gè)，加入500nl細(xì)胞裂解液，振蕩混勻后4。C孵育30min。12000rpm/min離心15分鐘，取上清。(2)分別取每種上清10^1進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(3)用BIORAD轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上，冰浴中轉(zhuǎn)移2hr，電壓為100V。置于麗春紅染色液中510min,水洗去染料，標(biāo)記蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶。(4)封閉將膜放置于30ml封閉緩沖液中，室溫下置于搖床震蕩lhr。(5)—抗反應(yīng)按推薦的稀釋比加入septinl特異性抗體(購(gòu)于SANTACRUZ公司)，將膜浸于稀釋好的一抗中，室溫下?lián)u床孵育2hr;用洗滌緩沖液洗膜4次，每次10min;(6)二抗反應(yīng)按1:1,0000的稀釋比加入HRP耦聯(lián)的抗羊抗體，將膜浸于稀釋好的二抗中，室溫下?lián)u床孵育lhr;用洗滌緩沖液洗膜4次，每次10min。(7)ECL發(fā)光反應(yīng)把膜用三倍稀釋或不稀釋的ECL發(fā)光試劑顯影曝光。結(jié)果顯示，Septinl主要在T細(xì)胞(Jurkat，ATCC;6T-CEM，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院)和B細(xì)胞(EB-3，ATCC)中表達(dá)。實(shí)施例3Septinl在Jurkat細(xì)胞中的定位本發(fā)明中，首先將全長(zhǎng)septinl的cDNA構(gòu)建入Ds-Red-Cl熒光表達(dá)載體。將所得的RFP一septinl重組子轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)過固定處理后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。具體步驟如下(1)收取懸浮培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞，充分打散后滴加在涂有多聚賴氨酸的載波片上，靜置5min后置于4X的多聚甲醛中室溫固定10min(分鐘)。(2)PBS洗三遍，于0.2%TritonX-100中室溫打孔15min。(3)PBS洗三遍，于含有10%馬血清、1%BSA的TBS中室溫封閉1hr(小時(shí))。(4)TTBS洗一遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的一抗(抗septinl抗體，1:20)，37°C孵育2hr。(5)TTBS洗三遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的二抗(Rhodamine-抗羊，1:100)，37。C孵育lhr。(6)TTBS洗三遍，于lng/plDAPI溶液中37°C染色20min。(7)TTBS洗三遍，封片，上熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)septinl呈細(xì)胞質(zhì)分布(如圖4)，且其分布具有一定的極性，另外，其分布隨細(xì)胞周期的變化有所不同，在細(xì)胞分裂的全過程中，septinl極有可能在紡錘體兩極的中心粒周圍分布，在中期以后，septinl還會(huì)在兩細(xì)胞分裂溝處聚集。實(shí)施例4pull-down檢測(cè)septinl蛋白與CK2激酶的互作1、將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有PCMV-Myc-CK2a的細(xì)胞裂解液(細(xì)胞數(shù)5X106)與50|al50%的谷胱甘肽瓊脂糖珠和20pg的GST在搖床上4。C孵育2h.2、4°C,2000rpm離心2分鐘。3、將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，分為兩等份，各加入50pl谷胱甘肽瓊脂糖珠，其中一管加入10iag的GST蛋白，另一管加入10ng的GST-septinl融合蛋白，4°C搖床孵育2小時(shí)。4、2000rpm離心2分鐘，上清取到新的離心管中，4°C保存，以備后用。5、用lml冰浴的裂解緩沖液(20mMTris-clpH8.0，500mMNaCl,lmMEDTA，1%NP-40)洗珠子，2000rpm離心1分鐘，棄上清，再重復(fù)洗3次。6、用20^120mM的還原谷胱甘肽(在50mM的Tris-ClpH8.0的緩沖液中)從珠子上洗脫GST融合蛋白和與它結(jié)合的蛋白。2000rpm離心2分鐘。7、洗脫的蛋白加入等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸4分鐘。8、WesternBlotting檢測(cè)。頁(yè)結(jié)果顯示，如圖3所示，Septinl與CK2能相互作用。實(shí)施例5CK2激酶在體外、體內(nèi)磷酸化septinl1、體外磷酸化(1)取His-CK2a激酶0.2ng，底物蛋白5ug(GST-septinl，GST-septinl-206A)，加入lXKinasebuffer(cellsignal公司)，反應(yīng)體系中另含有200(iMr-32p-ATP5pCi一)。(2)在30'C讓反應(yīng)物作用30分鐘，然后加5pl5XSDS上樣緩沖液終止反應(yīng)。(3)取2(^1反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，膠染色、脫色。(4)真空干燥儀上干膠60。C2小時(shí)，冷卻后，壓上X-光片，-80匸曝光。(5)顯影2、體內(nèi)磷酸化(1)將PCMV-HA-CK2a分別與PCMV-myc-septin1、PCMV-myc-septinl(206A)共轉(zhuǎn)染人H1299細(xì)胞系(2)37°C培養(yǎng)48hr后收獲細(xì)胞并裂解。(3)向每500(xl細(xì)胞裂解液中加入3ialanti-myc—抗(sigma),25^ilProteinGPlus/ProteinAAgarose(sigma公司)，置于4'C搖床緩慢震蕩1小時(shí)。(4)2000rpm離心l分鐘后用1XPBS洗滌Agarose三次(5)向Agarose中加入2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸4分鐘。取上清20(il進(jìn)行SDS-PAGE電泳(6)用磷酸化蛋白染色試劑盒(invitrogen)染色結(jié)果顯示，在體外和體內(nèi)，Septinl均可被CK2激酶磷酸化。體外磷酸化詳見圖5，體內(nèi)磷酸化詳見圖6。實(shí)施例6檢測(cè)septinl的磷酸化突變體對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)及周期的影響1、分別將PCMV-myc,PCMV-myc-septinl,PCMV-myc-septinl(S206A)，PCMV-myc-septinl(S206E)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞2、37°C培養(yǎng)60hr后流式細(xì)胞儀檢測(cè)個(gè)細(xì)胞的周期結(jié)果顯示，如圖10-13所示，septinl(S-A)突變體(即將s印tinl蛋白第206位絲氨酸突變?yōu)楸彼?alanine，Ala,A))導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，G2/M期細(xì)胞明顯減少，而septinl(S-E，即將septinl蛋白第206位絲氨酸突變?yōu)楣劝彼?glutamicacid，Glu，E))突變體則不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但引起細(xì)胞G2/M期增高。這提示，septinl可以維持細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行，septinl206位絲氨酸突變時(shí)，細(xì)胞不能正常分裂。實(shí)施例7細(xì)胞中RNA干擾septinl的表達(dá)1、將合成的siRNA溶于去RNAase的ddH20中，制成50mM的工作母液2、取5nl脂質(zhì)體(GIBCO公司脂質(zhì)體Lipfectmine2000)與250plOPTI—MEM培養(yǎng)基混合均勻，靜置5min3、取25plsiRNA工作母液與250nlOPTI—MEM培養(yǎng)基混合均勻4、將2與3溶液混合均勻，室溫靜置20min5、將lX10e的懸浮細(xì)胞離心收集并用lXPBS洗滌一次，用400plOPTI—MEM培養(yǎng)基重懸后與4所得溶液混合，加入6孔板一孔6、37°C培養(yǎng)5hr后更換完全培養(yǎng)基7、繼續(xù)培養(yǎng)48-60hr后收獲細(xì)胞，取出一半細(xì)胞進(jìn)行western-blot檢測(cè)septinl的表達(dá)情況，同時(shí)另一半細(xì)胞用于流式細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示，在lpg/ml的PHA刺激下，60小時(shí)內(nèi)干擾septinl的Jurkat細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果如圖9所示，對(duì)照組在60小時(shí)后增殖了161%，而干擾組只增殖了44%。這提示，septinl是淋巴系統(tǒng)來源的細(xì)胞增殖所必需的。權(quán)利要求1.GTP酶蛋白Septin1在制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是，所述的淋巴細(xì)胞白血病是急性淋巴細(xì)胞白血病或者急性復(fù)發(fā)的慢性淋巴細(xì)胞白血病。3.如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征是，S印tinl是篩選和制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物的藥靶。4.如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用方法，其特征是，將候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與SEPTIN1蛋白的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)結(jié)合，候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與RTN4B蛋白第206位的絲氨酸殘基結(jié)合的，該候選化合物即為治療淋巴細(xì)胞白血病藥物的活性成分。5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征是，將候選化合物加入含有S印tinl蛋白的溶液中，然后，檢測(cè)S印tinl蛋白活性，S印tinl蛋白活性下降的候選化合物為治療淋巴細(xì)胞白血病藥物的活性成分。6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征是，將如權(quán)利要求4或者5得到的候選化合物轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞中，導(dǎo)致癌細(xì)胞數(shù)量不增加的候選化合物為治療淋巴細(xì)胞白血病藥物的活性成分。7.—種用于篩選和制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物的試劑盒，其特征是，該試劑盒中包含S印tinl蛋白。8.—種篩選和制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物生物芯片，其特征是，該生物芯片的載體上含有S印tinl蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，提供了一種Septin1蛋白的新用途，即其在制備治療淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的Septin1蛋白及其突變體可以特異性的使淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡。將Septin1S206A突變體施用于淋巴細(xì)胞白血病患者，就可以特異性的使淋巴細(xì)胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態(tài)、縮短患者的恢復(fù)時(shí)間，減輕患者及其家屬的負(fù)擔(dān)。用本發(fā)明的Septin1蛋白篩選到的Septin1蛋白抑制劑也能起到相似的作用。文檔編號(hào)A61K38/43GK101239183SQ200710037189公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者丁向明,龍余,余文博,唐麗莎申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)