專利名稱：產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體地，涉及一種產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
慢性淋巴細(xì)胞白血病是一種相對少見的惡性腫瘤，大約占所有癌癥的0. 8%，它是一種影響B(tài)淋巴細(xì)胞系的惡性腫瘤，其特點(diǎn)是產(chǎn)生大量不成熟的淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能夠通過血液在全身擴(kuò)散，導(dǎo)致病人出現(xiàn)貧血、容易出血、感染及器官浸潤等。慢性淋巴細(xì)胞白血病是一種進(jìn)展緩慢、惰性的腫瘤，患者通常保持無癥狀達(dá)數(shù)月至數(shù)年。發(fā)病原因仍未明確。慢性淋巴細(xì)胞白血病慢性淋巴細(xì)胞白血病可以發(fā)生于任何年齡的人群，但以60歲以上的人群最常見，男性比女性更常見。 因?yàn)槁粤馨图?xì)胞白血病進(jìn)展比較緩慢，所以很多病人沒有癥狀，尤其在早期的病人，隨著疾病的進(jìn)展，白血病破壞骨髓正常造血功能，浸潤器官，引起了明顯但非特異的癥狀。包含有貧血，表現(xiàn)為乏力、頭暈、面色蒼白或活動(dòng)后氣促等；反復(fù)感染且不易治好，主要由于缺少正常的白細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞；出血傾向容易出血、出血不止、牙齦出血、大便出血及月經(jīng)不規(guī)則出血等，由于血小板減少引起；淺表淋巴結(jié)腫大、不明原因的消瘦及盜汗等。慢性淋巴細(xì)胞白血病是一種惰性的淋巴系統(tǒng)腫瘤，患者可以維持無癥狀長約數(shù)月至數(shù)年，不需要治療。但對于某些出現(xiàn)癥狀等需要治療，為了進(jìn)一步研究可以用于治療或預(yù)防或抑制慢性淋巴細(xì)胞白血病藥物，在研發(fā)過程中進(jìn)行藥物試驗(yàn)、藥效試驗(yàn)時(shí)，均需要大量的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞作為標(biāo)本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法，包括下述步驟
1)準(zhǔn)備受過輻射的巨噬細(xì)胞分散在細(xì)胞培養(yǎng)器中；
2)從慢性淋巴細(xì)胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細(xì)胞，將分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中沖洗，沖洗后置于離心管中以1500RPM離心3分鐘；
3)將離心后的外周血單個(gè)核細(xì)胞重新分散于完全培養(yǎng)基中形成2*106個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞/ml的完全培養(yǎng)基，該完全培養(yǎng)基包含50 V- g/ml的胰島素-反義c_myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸和5 u g/ml環(huán)孢菌素A ；
4)向步驟3)的完全培養(yǎng)基中添加皰疹病毒懸浮液；
5)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)；
6)保溫后，將皰疹病毒感染后的細(xì)胞以3500-4000個(gè)細(xì)胞/ml重新分散在包含有18 u g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的完全培養(yǎng)基中，然后分散于包含受過輻射的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)器中；
7)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養(yǎng)細(xì)胞；
8)每周一次,從每格中取出100V- I培養(yǎng)基,再添加100 V- I包含5 V- g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的新鮮培養(yǎng)基；
9)在感染后2-4周，用ELISA收集細(xì)胞培養(yǎng)器中的抗體產(chǎn)品，然后用雜交瘤細(xì)胞融合法產(chǎn)生并克隆出源于慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞株。具體地，所述步驟I)中的巨噬細(xì)胞為J774A. I細(xì)胞。 所述步驟I)中受過輻射的輻射劑量為4200rad。所述步驟9)中雜交瘤細(xì)胞融合法的具體步驟為在感染后2-4周后，對HIV-1、丙型肝炎病毒和流感病毒結(jié)合和中和活性篩選抗體，選擇呈陽性的細(xì)胞培養(yǎng)器中的細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞株融合，經(jīng)有限稀釋后獲得雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供一種產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法，該方法可以獲得大量的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞作為研究標(biāo)本，在研究用于治療或預(yù)防或抑制慢性淋巴細(xì)胞白血病藥物時(shí)用于藥物試驗(yàn)或藥效試驗(yàn)。并且，可以通過研究獲得的雜交瘤細(xì)胞株研究或者提純抗體，可以對于制備防治慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的藥物或者抗體或者生物片段作出進(jìn)一步研究。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不僅限于下述實(shí)施例。本實(shí)施例適用于產(chǎn)生無限克隆的B慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法具體步驟為 I、在皰疹病毒感染的24h前，準(zhǔn)備受過輻射(輻射劑量為4200rad)的巨噬細(xì)胞(本實(shí)施
例選用的巨噬細(xì)胞為J774A. I細(xì)胞)分散在細(xì)胞培養(yǎng)器中，培養(yǎng)器為圓底薄板，受過輻射的巨噬細(xì)胞并以50000細(xì)胞每格(IOOug/格)分散在96格薄板上。2、從慢性淋巴細(xì)胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細(xì)胞，將外周血單個(gè)核細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中，取300g置于15ml錐形離心管中，以1500RPM離心3分鐘。3、將離心后的外周血單個(gè)核細(xì)胞重新分散于完全培養(yǎng)基中，形成的細(xì)胞濃度為2*106個(gè)細(xì)胞/ml，該完全培養(yǎng)基包含50 u g/ml的胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸和5 u g/ml環(huán)孢菌素A。4、添加皰疹病毒懸浮液
5、在含5% 二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)。6、保溫后，將細(xì)胞以3500-4000個(gè)細(xì)胞/ml重新分散在包含有18 y g/ml的胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的完全培養(yǎng)基中；
7、以3500-4000個(gè)細(xì)胞/格(100 iil/格)分散在96格包含受輻射的J774A. I細(xì)胞的薄板上。8、在含5% 二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養(yǎng)細(xì)胞。9、每周一次，從每格中取出100 ill培養(yǎng)基，再添加IOOiU包含5 ii g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的新鮮培養(yǎng)基。
10、當(dāng)EBV病毒感染的細(xì)胞生長到足夠多(培養(yǎng)3周后)，用ELISA收集細(xì)胞培養(yǎng)器中的抗體產(chǎn)品，對HIV-I、丙型肝炎病毒和流感病毒結(jié)合和中和活性篩選抗體，選擇呈陽性的細(xì)胞培養(yǎng)器中的細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞株融合，經(jīng)有限稀釋后可產(chǎn)生并克隆出源于慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的能產(chǎn)生IgM的雜交瘤細(xì)胞株。上述方法中，J774A. I為小鼠巨噬細(xì)胞株。一般一個(gè)巨噬細(xì)胞株(例如嚙齒目動(dòng)物的巨噬細(xì)胞株)用作飼養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明，J774A. I巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生適合雜交瘤細(xì)胞的生長和克隆的生長因子。由J774A. I細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基已經(jīng)廣泛用于強(qiáng)化巨噬細(xì)胞的生存能力，也同樣顯示J774A. I細(xì)胞株作為飼養(yǎng)細(xì)胞與T細(xì)胞、EBV病毒感染的B細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)有助于在體外清除凋亡的細(xì)胞。根據(jù)上述方法，巨噬細(xì)胞株受到輻射以阻止飼養(yǎng)細(xì)胞的過度生長，最佳的Y輻射量為4200 Rad，然后受到輻射的細(xì)胞分散在培養(yǎng)器中(例如，當(dāng)用96孔板時(shí)，大約每孔可分散50000個(gè)細(xì)胞(大約100 1/孔))。使用現(xiàn)有技術(shù)手段，可以使B慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的EBV病毒感染生效。例 如，可以從慢性淋巴細(xì)胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細(xì)胞，然后這些細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中沖洗，然后懸浮在包含例如環(huán)抱霉素A的完全培養(yǎng)基中，加入環(huán)抱霉素A來抑制任何EBV病毒B細(xì)胞特異性細(xì)胞毒素T細(xì)胞反應(yīng)，通過測定EBV病毒B細(xì)胞的刺激潛力，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5 y g/ml為環(huán)孢霉素A較好的濃度范圍。根據(jù)上述方法，產(chǎn)自B慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的有治療作用的抗體(例如抗HIV抗體、抗丙型肝炎抗體和抗流感抗體)或可以配制為一個(gè)成分(例如一種藥品成分)。上述方法中，完全培養(yǎng)基的制備需要用到的物質(zhì)為1) 15. 2%熱滅活胎牛血清(FCS)、2) 1% 非必需氨基酸(NEAA)、3) ImM 丙酮酸鈉、4) 15mM HEPES 緩沖液，pH 為 7.3、5)2mM L-谷氨酰胺(Glu)、6) 100 U/ml 青霉素 G (Pen)
7)IOOu 1/ml 鏈霉素(Strep)。具體制備方法為
I、解凍一瓶FCS (500ml/瓶，-200C )，為了熱滅活在56°C下保溫30分鐘。2、冷卻，加入 31ml Glu+ Pen/ Strep (100X，IOOml/瓶，_2(TC )。3、將FCS-抗生素混合物分裝在兩個(gè)試管中，每個(gè)試管50ml，在_20°C冷凍。4、加入 IOOmlFCS-抗生素混合物于一瓶 RPMI 1640 中(500ml/ 瓶，4°C)。5、向瓶中加入 6.2ml HEPES 緩沖液(100X，IOOml/瓶，4°C )。6、加入 6. 2ml 丙酮酸鈉(100X，100ml/瓶，4°C )。7、加入 6.2ml NEAA (100X，100ml/瓶，4°C )。8、用0. 22 ii m的濾紙過濾完全培養(yǎng)基。9、總 CM :618. 6ml。如上所述，便可較好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法，其特征在于包括下述步驟 1)準(zhǔn)備受過輻射的巨噬細(xì)胞分散在細(xì)胞培養(yǎng)器中； 2)從慢性淋巴細(xì)胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細(xì)胞，將分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中沖洗，沖洗后置于離心管中以1500RPM離心3分鐘； 3)將離心后的外周血單個(gè)核細(xì)胞重新分散于完全培養(yǎng)基中形成2*106個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞/ml的完全培養(yǎng)基，該完全培養(yǎng)基包含50 V- g/ml的胰島素-反義c_myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸和5 u g/ml環(huán)孢菌素A ； 4)向步驟3)的完全培養(yǎng)基中添加皰疹病毒懸浮液； 5)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)； 6)保溫后，將皰疹病毒感染后的細(xì)胞以3500-4000個(gè)細(xì)胞/ml重新分散在包含有18 u g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的完全培養(yǎng)基中，然后分散于包含受過輻射的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)器中； 7)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養(yǎng)細(xì)胞； 8)每周一次,從每格中取出100V- I培養(yǎng)基,再添加100 V- I包含5 V- g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的新鮮培養(yǎng)基； 9 )在感染后2-4周，用ELISA收集細(xì)胞培養(yǎng)器中的抗體產(chǎn)品，然后用雜交瘤細(xì)胞融合法產(chǎn)生并克隆出源于慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟I)中的巨噬細(xì)胞為J774A. I細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟I)中受過輻射的輻射劑量為4200rad。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟9)中雜交瘤細(xì)胞融合法的具體步驟為在感染后2-4周后，對HIV-1、丙型肝炎病毒和流感病毒結(jié)合和中和活性篩選抗體，選擇呈陽性的細(xì)胞培養(yǎng)器中的細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞株融合，經(jīng)有限稀釋后獲得雜交瘤細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)生無限克隆的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的方法。該方法包括下述步驟1)準(zhǔn)備受過輻射的巨噬細(xì)胞分散在細(xì)胞培養(yǎng)器中；2)外周血單個(gè)核細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中，離心；3)重新分散于完全培養(yǎng)基中；4)添加皰疹病毒懸浮液；5)培養(yǎng)；6)保溫后，將細(xì)胞重新分散在完全培養(yǎng)基中，然后分散于包含受過輻射的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)器中；7)培養(yǎng)細(xì)胞；8)每周一次，更換新鮮培養(yǎng)基；9)在感染后2-4周，然后用雜交瘤細(xì)胞融合法產(chǎn)生并克隆出源于慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明可以通過研究獲得的雜交瘤細(xì)胞株研究或者提純抗體對制備防治慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的藥物或者抗體或者生物片段作出進(jìn)一步研究。
文檔編號C12N5/10GK102732485SQ201210207208
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者丁兆, 朱仲玉 申請人:四川匯宇制藥有限公司