專利名稱：一種靶向于人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4的抗腫瘤小分子化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明具體涉及一種基于生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)，經(jīng)虛擬篩選得到的特異性抑制hPEBP4蛋白的小分子化 合物，該小分子化合物具有靶向性抗腫瘤細(xì)胞hPEBP4蛋白功能、抑制腫瘤細(xì)胞 生長(zhǎng)和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，從而起到治療腫瘤的作用。本發(fā)明還涉及含 有該小分子化合物的藥物組合物，并公開了將該化合物藥物用于疾病治療的方 法，特別是在惡性腫瘤的治療中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是當(dāng)今人類面臨的第二大殺手。隨著腫瘤分子生物學(xué)fit發(fā)展和基因信 息的解碼，科學(xué)家已經(jīng)揭示了大量在腫瘤發(fā)生中起作用的分子。在這基礎(chǔ)上， 腫瘤靶向治療應(yīng)運(yùn)而生。靶向治療讓海量的基函數(shù)據(jù)從實(shí)驗(yàn)室走向臨床為病人 服務(wù)，成為腫瘤學(xué)研究中最為激動(dòng)人心的領(lǐng)域之一?？梢哉f(shuō)近二十年來(lái)腫瘤治 療領(lǐng)域取得的最顯著的進(jìn)展就在于多個(gè)靶向藥物的投入使用。計(jì)算機(jī)輔助藥物 篩選借助軟件在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖上直接與化合物實(shí)現(xiàn)對(duì)接和篩選，不僅大大 縮短了傳統(tǒng)藥物研發(fā)的周期，而且具有針對(duì)性強(qiáng)，生物耐受性好，起效迅速， 細(xì)胞滲透性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是腫瘤耙向治療的一支生力軍。人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4(hPEBP4)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因。它在卵巢、 乳腺、前列腺、和B淋巴系腫瘤中普遍高表達(dá)，而在正常組織未見表達(dá)。王曉 健等在2004年第一次報(bào)道該基因的過(guò)表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞抗TNF-ot引起的凋亡 有關(guān)，其抑制凋亡的機(jī)制和hPEBP4結(jié)合Raf-1和MEK而阻斷下游信號(hào)的活化 有關(guān)(Wang X, et al， J Biol Chem， 2004,279: 45855-45864)。另有實(shí)驗(yàn)表 明hPEBP4可能也參與抑制了 TRAIL引起的前列腺癌的凋亡。腫瘤發(fā)病機(jī)制經(jīng) 過(guò)一百多年的探索至今尚未徹底闡明，但對(duì)凋亡信號(hào)的逃逸("evasicm of apoptosis")參與了細(xì)胞癌變過(guò)程的觀點(diǎn)已被廣泛接受(Hanahan， D. &Weinberg, R. A. Cell, 2000， 100:57-70)。驟然hP肪P4只是特靜牲的在腫瘤 細(xì)胞髙表達(dá)而且參與了腫瘤對(duì)凋亡信號(hào)的lfc抗，因此針對(duì)該分子約小分子化合 物可能能夠取消其凋亡抑制功能，將有可能和TNF-a等藥物聯(lián)用，開辟一條治 療腫瘤的新路。另外，雖然已經(jīng)開發(fā)了一些抑制腫瘤生長(zhǎng)釣化合物，然而人fJ仍需要開發(fā)新的具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)ii獮亡活性的化合物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種具有抑制胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)舯l瘤細(xì)胞凝亡 活性的化合物。本發(fā)明的另一目的就是提供所述化合物釣用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰^r)硫脲基)苯 甲酸的用途，用于制備治療腫瘤、神制腫癯細(xì);飽生長(zhǎng)、和/或誘導(dǎo)耕瘤細(xì)胞凋 亡的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有致髑亡化療藥物。 在另一優(yōu)選例中，所述的致凋亡化療藥物包括腫瘤壞死因子，更佳地為人 TNFou在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物荊型是片劑、膠囊、粉末ii、顆粒劑、 混懸劑、或注射劑。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤或腫瘤緬癱是表達(dá)hPE柳4蛋白的腫瘤或腫 瘤細(xì)胞。較佳地，所述的腫瘤選自下組乳縢癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列 腺癌、肝癌等；更佳地，所述的腫瘤選自下組乳腺癌。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種組合物，所述的組合物含有藥學(xué)上可接 受的載體以及4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基〉硫鱖綦)苯甲酸和致凋亡化療藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的致凋亡化療藥物是腫瘤壞死因子。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有選自下組的治療劑TRAIL、 TGF-(3、 IFN-a、血管他丁(Angiostatin)、內(nèi)皮他丁(Eadostatin)、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜堿內(nèi)銨鹽、鴉膽子乳、足葉乙甙(即依托;浪拔)、鋭水衛(wèi)矛醇、柯霉素、三 苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、雙呋喃氟嚴(yán)嘧啶、葫蘆素、三尖杉酯堿、 冬凌草乙素、馬藺子甲素、云芝糖肽、阿糖臃苷、卡波鉑、紫杉醇、香菇多耱、 氟他胺、異環(huán)磷酰胺、烏苯美司、醋酸亮丙瑞林、脫氧氟尿蒔、洛被鉑、依林 諾特肯、來(lái)屈唑和替尼泊甙。在另一優(yōu)選例中，所述的4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲綦)苯甲酸和致 凋亡化療藥物之間重量比為1:1000至1000:1。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲基)苯 甲酸的用途，用于制備人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4的抑制劑。在本發(fā)明的第四方面，提供了 一種由4-(3-(2-苯基喹琳-4-f皿)硫脲基) 苯甲酸和腫瘤壞死因子構(gòu)成的混合物的用途，所述混合物被用于制備治療腫 瘤、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的組合物。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明所針對(duì)的腫瘤是生長(zhǎng)過(guò)程中iiPEBP4蛋白表達(dá)異常 的腫瘤，如乳腺癌。在本方面的第五方面中，提供了一種治療腫瘤的方法，它包括步驟給需 要治療的哺乳動(dòng)物對(duì)象施用本發(fā)明的小分子化合物。在另一優(yōu)選例中，該方法還包括在施用本發(fā)明小分子化合物之前、之中或 之后施用其他的腫瘤化療藥物，尤其是腫瘤壞死因子等致凋亡化療藥物。


圖1顯示了小分子化合物DC240042的結(jié)構(gòu)式；圖2顯示了 DC240042和hPEBP4體外結(jié)合購(gòu)表面等離子體子共振結(jié)果；圖3顯示了 DC240042增強(qiáng)TNF-a引起鹼總胞生長(zhǎng)的抑制；圖4顯示了 DC240042增強(qiáng)TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；圖5顯示了 siRNA干擾后MCF-7細(xì)胞中hPEBP4表達(dá)的蛋白印跡檢測(cè)；圖6顯示了干擾hPEBP4表達(dá)后DC240042和TNF- a的協(xié)同促凋亡效應(yīng)消失;圖7顯示了 DC240042的促凋亡作用具有劑量依賴性；圖8顯示了 DC240042的促凋亡作用具有贈(zèng)間依賴性；圖9顯示了 DC240042協(xié)同TNF-a抑制IK卜7纏臓的繊著非依賴性生長(zhǎng)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)鄱分腫瘤鲴胞內(nèi)hPEM^的表達(dá)往往 升高，抑制hPEBP4的表達(dá)和功能可以抑制胂癩姻胞的增殖和體內(nèi)外的致瘤活 性。本發(fā)明人運(yùn)用軟件從數(shù)萬(wàn)個(gè)侯選化合物中篩出了若干可能會(huì)和hPEBP4蛋白 結(jié)合的小分子化合物；隨后運(yùn)用體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)和MTT的方法對(duì)這些化合物進(jìn)行 了第二輪篩選，首次得到一個(gè)可以強(qiáng)烈增強(qiáng)TOF-a對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7增殖抑 制作用的化合物DC240042。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明人的研究表明，hPE趙P4在乳腺癌胂瘤組織中的選擇性 高表達(dá)，而在正常乳腺組織中未見表達(dá)，提示hPEBP4可能與腫瘤發(fā)生及生長(zhǎng) 密切相關(guān)。在L929細(xì)胞系內(nèi)，hPEBP4的過(guò)表達(dá)可明顯抵制TNF-a誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn) 細(xì)胞生長(zhǎng)，提示其可能是一個(gè)具有抗凋亡作用的的分子。本發(fā)明人的研究還發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)hHB 4的乳腺癌腫瘤ltt胞內(nèi)，抑制 hPEBP4的表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌腫瘤細(xì)胞對(duì) 誘導(dǎo)凋亡的敏感性，抑制腫瘤 細(xì)胞的克隆形成能力。提示hPEBP4很可能是治療乳腺癌的作用靶點(diǎn)。因此，本發(fā)明人的研究表明，抗凋亡作用的的分子hPEBP4在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控、 細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。因此，hPEBP4很可能在臨床腫 瘤的診斷和治療中作為潛在的候選靶標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人篩選了大量的化合物，從而獲得了一種可有效抑制 腫瘤的小分子化合物，所述的小分子化合物特異性地在蛋白水平靶向抗凋亡分 子一hPEBP4蛋白，對(duì)表達(dá)hPEBP4的腫瘤細(xì)胸的生物學(xué)行為進(jìn)行干預(yù)，從而有效 抑制hPEBP4的功能，達(dá)到抗腫瘤效果。活性成分如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的小分子化畬物"、"化合物K24t042"或"本 發(fā)明化合物"、"本發(fā)明的硫脲基苯甲酸銜生物"可互換使用，都指出小分子 化合物4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫鱖綦》,考酸及其藥學(xué)上可接受的鹽和活 性衍生物。4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲基)苯寧酸是一種靶向于人磷 旨酰乙醇胺 結(jié)合蛋白(hPEBP4)的先導(dǎo)化合物，其結(jié)構(gòu)式如下(式I)4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲基)苯甲酸是一種已知化合物，可從商業(yè) 途徑購(gòu)買到(如可購(gòu)自從荷蘭Specs公司)，也可常規(guī)的有機(jī)合成方法制備獲得。在本發(fā)明中，優(yōu)選的"活性成分"指這樣的小分子化合物所述的化合物 與人hPEBP4蛋白能夠相互結(jié)合，并且所述的化合物與TNFa聯(lián)合可使乳腺癌 MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)降低到70%以上。如本文所用，本發(fā)明中所用的硫脲基苯甲酸衍生物可以以由藥學(xué)上或生理 學(xué)可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下無(wú)機(jī)酸形 成的鹽如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及與有機(jī)酸形成的鹽，而有機(jī)酸則指 乙酸、草酸、丁二酸和馬來(lái)酸。其他鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、 鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的"前體藥物"的形式(當(dāng) 以這種形式給藥時(shí)，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成活性部分)。一類特別優(yōu)選的鹽是鈉鹽或鉀鹽。本發(fā)明的小分子化合物能有效抑制人hPEBP4蛋白的功能，從而抑制腫瘤 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。具體地，本發(fā)明的小分子化合物在分子水 平針對(duì)人hPEBP4蛋白，對(duì)陽(yáng)性表達(dá)人hPEBP4蛋白的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)已證明(1)抑制hPEBP4的表達(dá)和功能可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖， 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；(2)體內(nèi)抑制hPEBP4的表達(dá)和功能可抑制腫癯細(xì)胞的體外 致瘤性；(3)抑制hPEBP4的表達(dá)和功能可抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)的生長(zhǎng)。藥物組合物本發(fā)明還包括含有硫脲基苯甲酸衍生物及其藥學(xué)上可接受的逾的藥物組 合物。本發(fā)明的硫脲基苯甲酸衍生物及其,齟合物可用于治療癌癥腫瘤，即給哺乳動(dòng)物施用安全有效量的硫脲基苯甲酸衍生物。本發(fā)明化合物可單獨(dú)直接用于疾病治療，還可與其他治療劑聯(lián)用，如TNF-a、 TRAIL、 TGF-p、 IFN-a、血管他丁(Aagiostatin)、內(nèi)皮他丁(Endostatin)、 甘磷酰芥、血卟啉、石蒜堿內(nèi)銨鹽、鴉膽子乳、足葉乙甙(即依托泊甙)、脫水 衛(wèi)矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、雙呋瞎氟尿嘧啶、葫 蘆素、三尖杉酯堿、冬凌草乙素、馬藺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波鉑、 紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、異環(huán)磷酰胺、烏苯美司、醋酸亮丙瑞林、脫氧氟 尿苷、洛波鉑、依林諾特肯、來(lái)屈唑和替尼泊甙等。此外，還可與抗腫瘤的中 藥(或其制劑)合用。一種優(yōu)選的藥物組合物還含有致凋亡化療藥物，尤其是腫瘤壞死因子如人 腫瘤壞死因子a等。當(dāng)硫脲基苯甲酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于治療腫瘤時(shí)，它可與一 種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，從而形成藥 物組合物。液態(tài)載體包括無(wú)菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，而固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷醆氳鈣、微晶纖 維素、蔗糖和白陶土，只要適合活性成分的特性和所需的特定給藥方式。在制 備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐 劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)和叔丁基羥基 茴香醚(朋A)。通常，本發(fā)明的藥物組合物包括以下劑型如下口服給藥片劑、膠囊、可分散的粉末、顆粒或懸浮液(混懸劑)(含有如約0.05-5%懸浮劑(助溶劑))、 糖漿(含有如約10-50%糖)、和酏劑(含有約20-50%乙醇)，或者以無(wú)菌可注射溶 液或混懸劑形式(在等滲介質(zhì)中含有約0.05-5f助溶劑)進(jìn)行非腸胃給藥。這些 藥物制劑通常可含有與載體混合的約0.5-99,5wt%，較佳地2. 5-90wt%,更佳地 5%-60討％(重量)的活性成分(硫脲基苯甲酸銜生物或其藥學(xué)上可接受的鹽)，按 組合物的總重量計(jì)。在制備藥物組合物時(shí)，通常，可將這些本發(fā)明的化合物配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為 6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于) 瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、口服或局部給藥。優(yōu)選靜脈給藥 方式。本發(fā)明所用的硫脲基苯甲酸衍生物也可腸胃外或腹腔內(nèi)給藥。也可在適當(dāng) 混合有表面活性劑(如羥丙基纖維素)的水中制備這些活性化合物(作為游離堿 或藥學(xué)上可接受的鹽)的溶液或懸浮液。還可在甘油、液體、聚乙二醇及其在 油中的混合物中制備分散液。在常規(guī)儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑中含有防腐 劑以防止微生物生長(zhǎng)。適應(yīng)于注射的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散液和無(wú)菌粉(用于臨時(shí)制 備無(wú)菌注射溶液或分散液)。在所有情況中，這些形式必須是無(wú)嵐的且必須是 流體以易于注射器排出流體。在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防 止微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染影響。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有 如水、醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、它們的適當(dāng)混合物和植物油。在使用本發(fā)明所述的硫脲基苯甲酸衍生物時(shí)，還可與其他腫瘤治療手段(如 放療)或其他治療劑(如TNFa等)聯(lián)用。所用的活性成分的有效劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度 而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明化合物每天以約0.05-500mg/kg動(dòng)物體重(較佳地 0. l-100mg/kg體重，更佳地O. 5-50mg/kg體重給藥)的劑量給予時(shí)，能得到令人 滿意的效果，較佳地每天以1-4次的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對(duì)大部分 大型哺乳動(dòng)物而言，每天的總劑量約為1-1000mg或更高，較佳地5-500mg。適用 于內(nèi)服的劑量形式，包含與固態(tài)或液態(tài)藥學(xué)上可接受的載體混合的約0.5-500mg的活性化合物?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療 狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。從易于制備和給藥的立場(chǎng)看，優(yōu)選的藥物組合物是液態(tài)組合物。硫脲基苯 甲酸衍生物的靜脈給藥是優(yōu)選的。保健品組合物除了制備藥物組合物用于治療腫瘤之外，在本發(fā)明中，還可將 脲基苯甲 酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或提取物用于制備保健品組合物，從而用于輔助治療腫瘤。在本發(fā)明中，保健品組合物含有安全有效量(如0.01-99wt《)6W脲基苯甲 酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或提取物和藥學(xué)上可接受(或保健品上可接受) 的載體。本發(fā)明的保健品組合物可與藥物組合物一樣含有相同含量的硫脲基苯甲 酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或提取物。通常，保健品組合物中硫脲基苯甲 酸衍生物的含量(純度)可略低一些，例如含0.01-50^%硫脲基苯甲酸衍生物或 其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的保健品組合物，可以通過(guò)常規(guī)方法制成任何常規(guī)的制劑形式，優(yōu) 選的是片劑、口服液、顆粒劑和膠囊制劑。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a) 本發(fā)明針對(duì)人hPEBP4蛋白的結(jié)構(gòu)所設(shè)計(jì)的小分子化合物，可有效耙向 抑制抗凋亡分子——hPEBP4蛋白，從而用于癌癥治療；(b) 本發(fā)明的小分子化合物還可以與其它藥物和治療手段聯(lián)合，用于惡性 腫瘤的治療。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō) 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。實(shí)施例 細(xì)膽系MCF-7細(xì)胞系A(chǔ)TCC: HTB-22 (購(gòu)自AT€C),這是一種陽(yáng)性表達(dá)hP趙BP4的乳腺癌腫瘤細(xì)胞系。MCF-7細(xì)胞系的培養(yǎng)方法如下細(xì)胞接種于含10%的小牛血澝的 RPMI1640(Invitrogen公司)培養(yǎng)液，置于37攝氏度、體積分?jǐn)?shù)為5%的(302培 養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前無(wú)藥培養(yǎng)兩周。實(shí)施例1小分子化合物(DC240042)的讎選釆用計(jì)算機(jī)輔助的虛擬篩選方法進(jìn)行。首先用生物信息學(xué)的方法利用計(jì)算機(jī)軟件建立hPEBP4的三維結(jié)構(gòu)模型然 后用DOCK4.0軟件(美國(guó)Kuntz實(shí)驗(yàn)室)對(duì)購(gòu)自荷蘭Specs公司的化合物庫(kù)(約28 萬(wàn)個(gè)化合物)進(jìn)行篩選，根據(jù)打分選取最好的8700個(gè)。繼續(xù)使用HexX軟件進(jìn) 行對(duì)接，根據(jù)打分取前600個(gè)。接著使用市售的Autodock3.05軟件以FlexX對(duì) 接的構(gòu)象為起始構(gòu)象進(jìn)行對(duì)接。對(duì)接的結(jié)果結(jié)合類藥性分析和肉眼觀察除去多 余的相似化合物和明顯不合理的，最后選取100個(gè)化合物。其中，DC240042小分子化合物結(jié)構(gòu)式如圖1和式I所示，即4-(3-(2-苯基 喹啉-4-羰基)硫脲基)苯甲酸。<formula>formula see original document page 11</formula>(式I)小分子化合物(DC240042)與乾標(biāo)hPEBP4蛋白的體外雄合,對(duì)于選出的DC240042(購(gòu)自荷蘭Specs公司)，邇過(guò)基于表面等離子體子共 振(surface plasmon resonance, SPR)技術(shù)的biacore3000儀器(Amersham公 司)實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用。結(jié)果證實(shí)DC240042與hPEBP4在體外有結(jié)合，圖2所示為DC240042的hPEBP4體外結(jié)合曲線。由分析軟件計(jì)算出來(lái)得剎其解離常數(shù)R-l#e-6。 實(shí)施例3小分子化合物對(duì)胂癯細(xì)應(yīng)的生長(zhǎng)擲制本實(shí)施例采用了常規(guī)的MTT法。方法如下先將MCF-7細(xì)胞以3000個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪96孔板過(guò)夜，然后把小分子 化合物DC240042以不同濃度單獨(dú)或和20ng/ral終濃度的人TNF-a聯(lián)合加入。 44小時(shí)后每孔加入MTT(5tng/ml)10ul， 37度孵育4小時(shí)后吸棄上清，用150nl 二甲亞楓溶解紫色結(jié)晶后放置于酶標(biāo)儀以570鵬吸光度檢測(cè)。結(jié)果顯示，DC240042可以在5-IO一終濃度顯著增強(qiáng)TNF-a對(duì)細(xì)胞增殖的 抑制，而其本身未對(duì)細(xì)胞造成顯著的毒性作用的化合物。圖3顯示，5pM的 DC240042顯著增強(qiáng)TNF-a對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖的抑制。實(shí)施例4DC240042化"##對(duì)TNF-a殺傷辨瘺維l^l纖iW麴鶬鍘將乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞以30000個(gè)/孔鋪24孔板，16-24小時(shí)后加入 DC240042至終濃度10uM， 4小時(shí)后再加入TNF-a至終濃度20ng/肌l或50ng/ml。 48小時(shí)后用熒光染料羅丹明123(R-123)和P!(Invitrogen公司)標(biāo)記凋亡細(xì)胞后用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。R-123/PI雙陰性的細(xì)胞代表了早期凋亡的細(xì)胞，R-123陰性 PI陽(yáng)性的細(xì)胞代表晚期凋亡和死亡的細(xì)胞。結(jié)果如圖4所示，合用了 20ng/ml TNF-a和E>C240042的細(xì)胞凋亡率(約30%) 顯著性高于單獨(dú)用TNF-a的細(xì)胞(約15%)。與50ng/ml的TNF-a聯(lián)合后也存在 這個(gè)效應(yīng)，但相對(duì)協(xié)同率稍低于與20ng/miTNF-a聯(lián)合。實(shí)施例5小分子化合物DC240042抗靜癱效鷹像，hPEW^的獰在為了驗(yàn)證小分子化合物進(jìn)入細(xì)胞后是否真正與hPEBP4發(fā)生了結(jié)合從而阻 斷了后者功能的發(fā)揮，本實(shí)施例邇過(guò)s汰NA技術(shù)抑制MCF-7縐胞內(nèi)hPEBP4 的表達(dá)。如圖5所示，轉(zhuǎn)染siRNA48小時(shí)后，hPEBP4在mRNA的表達(dá)水平明顯下降，表明該蛋白的表達(dá)被成功抑制。隨后檢測(cè)了 DC240042對(duì)TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)飽凋亡的協(xié)同增殲敷應(yīng)(具體方法參見實(shí)施例4)。由圖6可見，干擾了 hPEBP4表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞對(duì)聯(lián)合運(yùn)用 TNF-a及DC240042跟單獨(dú)用TNF-a所產(chǎn)生的凋亡差異消失。換言之，干擾hPEBP4 表達(dá)后DC240042和TNF-ot的協(xié)同促凋亡效應(yīng)消失，這個(gè)結(jié)果從反面說(shuō)明hPEBP4 是小分子化合物DC240042發(fā)揮TNF-a協(xié)同作用所必須的。實(shí)施例6DC240O42協(xié)同增強(qiáng)TNF"Ot的效魔威IWPWit歸,性采用不同濃度的化合物與20ng/ml的TOP-a處理MCF-7細(xì)胞，48小時(shí)后收 取細(xì)胞進(jìn)行R-123/PI標(biāo)記，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。將每個(gè)濃度細(xì) 胞的凋亡率減去背景的自發(fā)凋亡再除以單獨(dú)用20ng/ml TNF-a所得到的相對(duì)凋 亡比為縱坐標(biāo)的值，以化合物濃度(ng/ml)作用橫坐標(biāo)的值。結(jié)果獲得如圖7所 示的曲線圖。圖7顯示，隨著化合物濃度的增加，相對(duì)凋亡數(shù)也隨之增加，提示DC240042對(duì)TNF-a的效應(yīng)的協(xié)同作用成劑量依賴性。在本實(shí)施例中，還采用10uM的化合物濃度來(lái)檢測(cè)TNF-a作用不同時(shí)間后 細(xì)胞的凋亡率。根據(jù)不同時(shí)間細(xì)胞的凋亡率得到如國(guó)8的曲線。圖8顯示，在不同的時(shí)間點(diǎn)聯(lián)合運(yùn)用化合物和TNF-ot的凋亡率明顯大于 TNF-oc組，而且隨著時(shí)間的推移細(xì)胞的凋亡率都隨之增加，提示DC240042對(duì) TNF-a的效應(yīng)的協(xié)同作用成時(shí)間依賴性。DC240042的上述劑量和吋間依賴性進(jìn) 一步確證了該化合物具有協(xié)同TNF-a促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的能力。實(shí)施例7DC240042協(xié)同TNF-a擲鑭JWi覷iiSW^i^生饞鵝饞力本實(shí)施例采用常規(guī)的半固體瓊脂培養(yǎng)法。方法如下先在6孔板鋪設(shè)終濃度為0.6%的低條點(diǎn)軟瓊脂，待凝閨。將齟清饑餓24 小時(shí)的MCF-7細(xì)胞用胰酶消化吹散成單個(gè)鑛膽懸液，細(xì)胞濃度為2X105/rnl。然后將5(^1的細(xì)胞懸液與lml含lO網(wǎng)ol化合物和(或)20ng/ml頂F-a的0. 3% 的瓊脂混合，均勻鋪在凝固了的底層瓊脂上。每隔三天補(bǔ)加一次培養(yǎng)基。置于 37度孵箱，三周后光鏡下計(jì)數(shù)分析。結(jié)果如圖9所示，DC240042協(xié)同TNF-a銀的細(xì)胞集落數(shù)(反秧了細(xì)胞的錨 著非依賴性生長(zhǎng)能力)明顯低于對(duì)照組(ctrl)、單獨(dú)DC240042組、單獨(dú)TNF-ot組。實(shí)施例8藥物齟合物的制備口服膠囊的制備按常規(guī)方法混合以下成分，制得50個(gè)口繊膠囊，每個(gè)含有幼亳克4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲基)苯甲酸和180毫克可溶性淀粉。本發(fā)明的化合物可特異性抑制人磷脂酰乙醇胺結(jié)合愛白4(hP節(jié)P4)，因此 可用于治療高表達(dá)該蛋白的腫瘤，如乳腺癌。本發(fā)明上述的實(shí)施例的結(jié)果表明， 本發(fā)明化合物可穩(wěn)定地抑制hPEBP4，協(xié)同TNF-a殺傷腫瘤綑胞。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中弓f翔作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在闔讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形或同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲基)苯甲酸的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的組合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物是H物組合物。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還含有致凋亡化療藥物。
4. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物劑型是片劑、 膠囊、粉末劑、顆粒劑、混懸劑、或注射劑。
5. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤或腫瘤細(xì)胞是表達(dá) hPEBP4蛋白的腫瘤或腫瘤細(xì)胞。
6. —種組合物，其特征在于，所述的組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及 4- (3- (2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲基)苯甲酸和致凋亡化療藥物。
7. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述的致凋亡化療藥物是 腫瘤壞死因子。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的組合物，其特征在于，所述的tl合物還含有 選自下組的治療劑TRAIL、 TGF-P、 IFN-a、血管他丁(Angiostatin)、內(nèi)皮他丁 (Endostatin)、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜堿內(nèi)銨鹽、鴉膽子乳、足葉乙甙(即依托 泊甙)、脫水衛(wèi)矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5*氟尿嘧啶、去甲斑螯素、雙呋喃氟 尿嘧啶、葫蘆素、三尖杉酯堿、冬凌草乙素、馬藺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞 苷、卡波鉑、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、異環(huán)磷酰胺、烏苯美司、醋酸亮丙 瑞林、脫氧氟尿苷、洛波鉑、依林諾特肯、來(lái)屬唑和替尼泊武。
9. 一種4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲綦)苯甲酸的用途，其特征在于，用于制備人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4的抑制劑。
10. —種由4-(3-(2-苯基喹啉-4-羰基)硫脲基)苯甲酸和腫瘤壞死因子構(gòu) 成的混合物的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、和 /或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合的藥物虛擬篩選平臺(tái)而合成的靶向腫瘤相關(guān)蛋白的新型抗腫瘤小分子先導(dǎo)化合物。該小分子化合物具有滲透性好，毒副作用小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于合成等優(yōu)點(diǎn)。而且可以和腫瘤壞死因子(TNF-α)聯(lián)用，增強(qiáng)后者的腫瘤殺傷效應(yīng)，從而起到治療腫瘤的作用，所以有望發(fā)展成為一種抗腫瘤新藥。本發(fā)明還涉及含有該小分子化合物的藥物組合物和用途。
文檔編號(hào)A61K31/47GK101234113SQ20071003704
公開日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2007年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日
發(fā)明者曹雪濤, 楠 李, 段文虎, 旭 沈, 蔣華良, 裘建明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué);中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所