專利名稱：流感病毒感染抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有唾液酸半乳糖結(jié)合肽，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽作為活性成分的流感病毒感染抑制劑。
背景技術(shù)：
細(xì)胞表面的糖綴合物，例如糖脂、糖蛋白和蛋白聚糖的寡糖是胞外分子識(shí)別的靶分子。這種寡糖與細(xì)胞特異性結(jié)合過(guò)程相關(guān)(參考文獻(xiàn)(1)、(2))。熟知唾液酸半乳糖(NeuAc-Gal)結(jié)構(gòu)是細(xì)菌毒素、病毒、內(nèi)皮細(xì)胞等的受體。(參考文獻(xiàn)(3)-(5))。稱為神經(jīng)節(jié)苷脂的含唾液酸的鞘糖脂與取決于它們的碳水化合物部分的重要生物學(xué)功能相關(guān)(參考文獻(xiàn)(6)-(8))。在過(guò)去10年間，對(duì)膜組分，例如脂質(zhì)、糖脂與其它組分的定位和分布的研究致力于它們特性和功能之間的關(guān)系(參考文獻(xiàn)(9)-(12))。大多數(shù)鞘糖脂以洗滌劑不可溶膜與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子從細(xì)胞中提取(參考文獻(xiàn)(13)-(15))。已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞刺激和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變了富含糖脂的亞組分。含有糖脂的膜重建為氣-水界面單層(參考文獻(xiàn)(16)-(18))。Sato等報(bào)道說(shuō)凝集素結(jié)合模式取決于鞘糖脂在脂質(zhì)單層中的分布(參考文獻(xiàn)(19)-(22))。關(guān)于膜中富含糖脂的微結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能信息有助于搞清細(xì)胞表面糖鏈的生物學(xué)作用。許多結(jié)合糖的蛋白質(zhì)，例如凝集素和抗體用于標(biāo)記糖綴合物，從而可應(yīng)用于碳水化合物相關(guān)疾病的治療(參考文獻(xiàn)(23)、(24))。
開(kāi)發(fā)了選擇特異性結(jié)合靶分子的肽的生物選擇系統(tǒng)(噬菌體展示文庫(kù))(參考文獻(xiàn)(25)、(26))。利用該系統(tǒng)有助于選擇各種糖綴合物、單糖(參考文獻(xiàn)(27)、(28))、腫瘤相關(guān)糖抗原(參考文獻(xiàn)(29)-(32))、唾液酸Lewisx(參考文獻(xiàn)(33)、(34))、鞘糖脂(參考文獻(xiàn)(35)、(36))、蛋白聚糖(參考文獻(xiàn)(37)-(39))和多糖(參考文獻(xiàn)(40)、(41))。在以前的論文中，本申請(qǐng)的發(fā)明人進(jìn)行了神經(jīng)節(jié)苷脂GM1(Galβ1→3GalNAcβ1→4(NeuAcα2→3)Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)結(jié)合肽的選擇(參考文獻(xiàn)(35))。所選擇的肽序列顯示特異性結(jié)合GM1，從而抑制了霍亂毒素與GM1結(jié)合。
流感病毒在它們的包膜中具有兩種分別在宿主細(xì)胞的病毒感染和病毒出芽中起重要作用的糖蛋白血凝素(HA)和唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)。血凝素識(shí)別存在于動(dòng)物宿主細(xì)胞膜上作為受體的含唾液酸的糖鏈，特異性結(jié)合這種受體，從而導(dǎo)致流感病毒的胞內(nèi)胞吞作用。唾液酸酶是一種破壞受體的酶，當(dāng)病毒顆粒出芽或從宿主細(xì)胞釋放時(shí)，其切斷宿主細(xì)胞膜或病毒本身膜上的唾液酸殘基。
目前，利用預(yù)防性/治療性藥物抵御流感病毒感染的療法選擇很少。疫苗用于預(yù)防感染，但因需要注射而使其范圍有限。近來(lái)，唾液酸酶(一種流感病毒膜蛋白)抑制劑作為治療性藥物應(yīng)用于臨床。認(rèn)為唾液酸酶抑制劑可抑制流感病毒在胞內(nèi)繁殖后的胞外釋放。因此，唾液酸酶抑制劑不是有效的預(yù)防性藥物。此外，因?yàn)樗鼞?yīng)在感染1或2天后立即給予，其應(yīng)用受限制。
基于流感病毒感染過(guò)程中血凝素與宿主細(xì)胞上存在的含唾液酸糖鏈結(jié)合的事實(shí)，發(fā)明人以前通過(guò)上述噬菌體展示文庫(kù)方法篩選了血凝素結(jié)合肽，報(bào)道該肽能通過(guò)防止流感病毒的胞內(nèi)侵入來(lái)抑制其感染(日本公開(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?002-284798，WO0/59932)，揭示了這些肽可用于預(yù)防流感病毒感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及含有唾液酸半乳糖結(jié)合肽作為活性成分的流感病毒感染抑制劑，該肽，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽可結(jié)合唾液酸半乳糖基團(tuán)(具有唾液酸半乳糖結(jié)構(gòu)的基團(tuán))。
如上所述，當(dāng)流感病毒膜中的血凝素識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞上含有唾液酸的糖鏈時(shí)，該病毒感染宿主細(xì)胞。本發(fā)明涉及通過(guò)阻斷宿主細(xì)胞上存在的血凝素受體來(lái)抑制流感病毒感染。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及利用與細(xì)胞表面存在的唾液酸半乳糖基團(tuán)結(jié)合的肽來(lái)阻斷流感病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制其感染。
本發(fā)明人以前發(fā)現(xiàn)與流感病毒血凝素結(jié)合的血凝素結(jié)合肽能抑制流感病毒感染。這些肽通過(guò)與流感病毒膜中存在的血凝素結(jié)合來(lái)抑制流感病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合。
雖然血凝素結(jié)合肽能作用于流感病毒從而防止它們感染，但其作用的前提是流感病毒存在。這提示，臨床應(yīng)用時(shí)，在已經(jīng)證實(shí)流感病毒感染后給予上述肽時(shí)有效，這與采用唾液酸酶抑制劑的情況一樣。因此，期望這些肽可有效地作為治療性藥物而非預(yù)防性藥物?；诳山o予作用于活機(jī)體的化合物而無(wú)論是否存在流感病毒感染從而產(chǎn)生顯著的預(yù)防作用的信念，本發(fā)明人努力研究了抑制流感病毒感染的方法，得到可通過(guò)阻斷與存在于流感病毒膜中的血凝素結(jié)合的宿主細(xì)胞上的受體來(lái)抑制流感病毒感染的結(jié)論。在該方法中，即使流感病毒未感染對(duì)象，也可期望通過(guò)預(yù)先阻斷宿主細(xì)胞上的受體而獲得預(yù)防作用。此外，考慮到生物相容性、半衰期、易于生產(chǎn)等，也得出分子量相當(dāng)?shù)偷幕衔锖线m的結(jié)論。然而，盡管發(fā)現(xiàn)唾液酸半乳糖在流感病毒感染入動(dòng)物細(xì)胞的過(guò)程中起受體的作用，能作用于唾液酸半乳糖從而抑制流感病毒感染的化合物以前未見(jiàn)報(bào)道；傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為一種化合物難以阻斷受體。本發(fā)明人將注意力集中于一種流感病毒的宿主細(xì)胞表面受體—唾液酸半乳糖的結(jié)構(gòu)，檢測(cè)了含有10個(gè)以下氨基酸的肽與包含在唾液酸半乳糖結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(NeuAcα2→3Galβ→4Glcβ1→1’Cer)結(jié)合的效力。發(fā)明人利用噬菌體展示法通過(guò)靶向在細(xì)胞表面高度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞得到了與神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合的肽。發(fā)明人認(rèn)真檢測(cè)了所獲得的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽，出乎意料地發(fā)現(xiàn)這些肽可獨(dú)自防止流感病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合并侵入細(xì)胞。
因此，本發(fā)明包括以下內(nèi)容(1)一種含有唾液酸半乳糖結(jié)合肽作為活性成分的流感病毒感染抑制劑；(2)如(1)所述的流感病毒感染抑制劑，其中所述唾液酸半乳糖結(jié)合肽是神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽；(3)如(1)所述的流感病毒感染抑制劑，其含有以下(a)或(b)的唾液酸半乳糖結(jié)合肽作為活性成分(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；(b)具有從SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中刪除、取代或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列并具有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合活性的肽；(4)如(1)到(3)中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其中所述唾液酸半乳糖結(jié)合肽被烷基化或脂質(zhì)化(lipidized)；(5)如(1)到(3)中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其中所述唾液酸半乳糖結(jié)合肽包含于脂質(zhì)體中；(6)如(1)到(5)中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其中所述流感病毒選自甲型、乙型和丙型流感病毒；
(7)如(1)到(5)中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其中所述流感病毒是禽流感病毒或豬流感病毒；(8)如(1)到(7)中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體；(9)一種預(yù)防或治療流感的方法，包括給予非人動(dòng)物(1)到(8)中任一項(xiàng)所述流感病毒抑制劑的步驟；(10)如(9)所述預(yù)防或治療流感的方法，其中所述非人動(dòng)物是鳥或豬；(11)一種預(yù)防或治療流感的方法，包括制備(1)到(8)中任一項(xiàng)所述流感病毒抑制劑和給予對(duì)象該抑制劑的步驟；(12)如(11)所述預(yù)防或治療流感的方法，其中所述對(duì)象選自人、鳥和豬；(13)(1)到(8)中任一項(xiàng)所述流感病毒抑制劑用于預(yù)防或治療流感；和(14)以下(a)或(b)所示神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽在制備流感病毒抑制劑中的應(yīng)用(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；(b)具有從SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中刪除、取代或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列并具有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合活性的肽；附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了與固定于石英-水晶微量天平上的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3單層結(jié)合的噬菌體的時(shí)間曲線。
圖2顯示了噬菌體克隆與NeuAc-Gal結(jié)構(gòu)的結(jié)合選擇性的檢測(cè)結(jié)果。
圖3顯示了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)噬菌體克隆與小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果。
圖4顯示了通過(guò)c01-噬菌體檢測(cè)唾液酸寡糖識(shí)別的結(jié)果。
圖5顯示合成肽與GM3的結(jié)合量是肽濃度的函數(shù)。
圖6顯示了通過(guò)含有肽的脂質(zhì)體抑制流感病毒感染MDCK細(xì)胞。
圖7顯示了通過(guò)含有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽的脂質(zhì)體和含有血凝素結(jié)合肽的脂質(zhì)體抑制流感病毒感染MDCK細(xì)胞。
優(yōu)選實(shí)施方案描述本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療流感病毒感染并含有唾液酸半乳糖結(jié)合肽，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽作為活性成分的感染抑制劑。
當(dāng)流感病毒透過(guò)細(xì)胞時(shí)，具有唾液酸和半乳糖相結(jié)合結(jié)構(gòu)的唾液酸半乳糖基團(tuán)作為血凝素的受體。因此，唾液酸半乳糖結(jié)合肽能通過(guò)防止流感病毒經(jīng)唾液酸半乳糖基團(tuán)與細(xì)胞結(jié)合來(lái)抑制流感病毒感染入細(xì)胞。具有唾液酸半乳糖基團(tuán)的化合物的例子包括神經(jīng)節(jié)苷脂GM3。本發(fā)明的唾液酸半乳糖結(jié)合肽包括神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽。
應(yīng)注意到本發(fā)明的肽不受具體限制，只要它能結(jié)合唾液酸半乳糖基團(tuán)；只要細(xì)胞在其表面表達(dá)唾液酸半乳糖基團(tuán)，即使其表面不表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂GM3，該肽也能抑制流感病毒感染入細(xì)胞。
本發(fā)明的感染抑制劑要抑制其感染的流感病毒是直徑約100nm的球形RNA病毒，其屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，它們的類型不受限制。本發(fā)明的流感病毒抑制劑能抑制流感病毒感染而無(wú)論該流感病毒的類型，因?yàn)樗钄嗔肆鞲胁《舅R(shí)別的細(xì)胞上的受體。流感病毒的類型包括甲型(H2N2、H3N2、H1N1等)、乙型、丙型、人分離物、禽類分離物(禽流感病毒(H5N1、H7N2、H7N7等))、豬分離物(豬流感病毒)和其它哺乳動(dòng)物分離物(例如，馬分離物)。該流感病毒抑制劑能廣泛抑制所有這些類型的流感病毒。一些流感病毒依照血凝素和唾液酸酶(神經(jīng)氨酸)的血清型而具有許多亞型。本發(fā)明的流感病毒抑制劑能抑制流感病毒感染而無(wú)論其類型或亞型。
此外，本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑可用于任何動(dòng)物，只要它是流感病毒能感染的動(dòng)物，因此該抑制劑可抑制流感病毒感染人、鳥、豬等。
如下所述，可利用已知的噬菌體展示文庫(kù)通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)法來(lái)選擇本發(fā)明的唾液酸半乳糖結(jié)合肽。例如，可通過(guò)Scott和Smith(Scott，J.M.和Smith，G.P.，Science，249，386-390，(1990)；Smith，G.P.和Scott，J.K.，Methods inEnzymology，217，228-257，(1993))的方法進(jìn)行噬菌體展示文庫(kù)法?；蛘撸砂凑杖毡竟_(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?000-253900和2002-284798進(jìn)行。
采用的噬菌體展示文庫(kù)可購(gòu)得。
首先，將隨機(jī)DNA序列插入已知的噬菌體展示文庫(kù)，它們應(yīng)構(gòu)建為使具有隨機(jī)氨基酸序列的肽能表達(dá)在噬菌體外包膜表面上。如實(shí)施例中所示，在此情況中，所用的展示噬菌體是，例如，通過(guò)將隨機(jī)DNA插入噬菌體包衣蛋白pIII基因而構(gòu)建的能在噬菌體外包膜表面表達(dá)隨機(jī)十五肽的噬菌體。。通過(guò)利用展示噬菌體，可獲得其中每種表達(dá)約108類肽的噬菌體。
然后，用神經(jīng)節(jié)苷脂GM3淘選隨機(jī)表達(dá)肽的噬菌體。就這種淘選而言，可在合適的基板(神經(jīng)節(jié)苷脂GM3單層組合基板)上制備神經(jīng)節(jié)苷脂GM3單層，然后可選擇與該單層結(jié)合的噬菌體。使選出的噬菌體感染入大量培養(yǎng)的、分離并純化的大腸桿菌以獲得與神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合的表達(dá)肽的噬菌體。通過(guò)重復(fù)該淘選操作數(shù)次，可選擇并集中能特異性結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的能表達(dá)肽的噬菌體。
然后，通過(guò)從所選擇的噬菌體中提取DNA并測(cè)序，可獲得與唾液酸半乳糖基團(tuán)特異性結(jié)合的肽。可通過(guò)已知的方法，例如Maxam-Gilbert方法利用商業(yè)購(gòu)得的測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序。
當(dāng)以此方式利用單層時(shí)，由于表面上只有糖鏈伸出，可有效地選擇唾液酸半乳糖結(jié)合肽。應(yīng)注意當(dāng)制備了單層并選擇了表達(dá)與神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合的肽的噬菌體，可利用稱為微量天平的石英晶體振蕩器。利用石英晶體振蕩器，可以頻率變化來(lái)檢測(cè)與噬菌體結(jié)合所致的石英晶體振蕩器上金電極表面的重量變化?？筛鶕?jù)，例如Biochim.Biophys.Acta.，1138，82-92，(1998)或Biochim.Biophys.Acta，1285，14-20，(1996)所述的方法進(jìn)行基于石英晶體振蕩器的方法。具體地說(shuō)，振蕩器上電極的表面與在凹槽中用作水面下相(water subphase)的Tris緩沖鹽水(TBS)上制備的單層表面水平連接并振蕩。當(dāng)振蕩穩(wěn)定后，加入噬菌體文庫(kù)溶液并測(cè)量對(duì)應(yīng)于噬菌體結(jié)合的振蕩頻率。從而可檢測(cè)結(jié)合存在與否。
唾液酸半乳糖結(jié)合肽的例子包括具有SEQ ID NO.1和2所示15聚體氨基酸序列的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽。這些肽中的每一種可用作本發(fā)明流感病毒感染抑制劑的活性成分?；蛘?，含有從SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中刪除、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列并能結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的肽可用作本發(fā)明流感病毒感染抑制劑的活性成分。上述“一個(gè)或幾個(gè)”優(yōu)選1到10，更優(yōu)選1到5、1到4、1到3、1到2或1?；蛘撸梢韵翫NA編碼的氨基酸序列構(gòu)成并能結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的肽可用作本發(fā)明流感病毒感染抑制劑的活性成分所述DNA可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽的DNA的互補(bǔ)DNA雜交。本文所述“嚴(yán)謹(jǐn)條件”包括可通過(guò)雜交來(lái)鑒定DNA的條件在68℃，有0.7到1.0M NaCl存在時(shí)可利用其上固定有DNA的過(guò)濾器，然后在68℃利用0.1到2倍濃度的SSC溶液(1倍濃度的SSC包含150mMNaCl和15mM檸檬酸鈉)洗滌該過(guò)濾器?；蛘?，具有編碼含有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽的DNA的簡(jiǎn)并突變體所編碼的氨基酸序列并能結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的肽也可用作本發(fā)明流感病毒抑制劑的活性成分。例如，可通過(guò)上述連接有神經(jīng)節(jié)苷脂單層的石英晶體振蕩器來(lái)檢測(cè)肽是否可結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM3。
可通過(guò)已知的液相和固相肽合成方法來(lái)合成上述肽?；蛘?，也可用所選擇的噬菌體和大腸桿菌來(lái)制備這些肽?？赏ㄟ^(guò)已知的肽純化方法來(lái)純化以此方式得到的肽。
也可使用神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽的修飾肽。由于修飾的肽可提高其親水性、延長(zhǎng)其血液半衰期，也能提高細(xì)胞親和力和/或組織親和力，期望修飾的肽作為流感病毒感染抑制劑可產(chǎn)生更強(qiáng)作用。此外，由于通過(guò)修飾來(lái)聚合肽在空間上影響了流感病毒與神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的結(jié)合，作為抑制劑可期望具有更強(qiáng)的作用。
肽修飾的例子包括烷基化、脂質(zhì)化和結(jié)合水溶性聚合物如PEG。
可通過(guò)已知的方法與烷基結(jié)合。例如，烷基胺可與神經(jīng)節(jié)苷脂GM結(jié)合肽的C-末端羧基結(jié)合，或者脂肪酸可與N-末端氨基結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)酰胺鍵形成反應(yīng)實(shí)現(xiàn)烷基胺與末端羧基或者脂肪酸與末端氨基的結(jié)合。待結(jié)合的烷基的例子包括但不限于具有2到20個(gè)(例如，18個(gè))碳原子的烷基。用于結(jié)合的脂肪酸也不限，但是適合采用有活的機(jī)體中存在的脂肪酸。具體例子包括具有約12到20個(gè)碳原子的脂肪酸飽和的脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸等；不飽和的脂肪酸，例如油酸、反油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等。
也可通過(guò)已知的方法，例如根據(jù)New Current，11(3)，15-20，(2000)；Biochemica et Biophysica Acta.，1128，44-49，(1992)；FEBS Letters，413，177-180，(1997)和J.Biol.Chem.，257，286-288，(1982)等所述對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽進(jìn)行脂質(zhì)化。具體地說(shuō)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM-3結(jié)合肽可通過(guò)磷脂的2-羥基或3-磷酸基與各種磷脂結(jié)合。這種結(jié)合可采用合適的間隔基團(tuán)。該反應(yīng)可采用各種類型的縮合方法。一個(gè)例子是利用反應(yīng)性SH基團(tuán)的方法，其中具有包括半胱氨酸的少許氨基酸的長(zhǎng)度合適的氨基酸序列與神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽的N-末端或C-末端結(jié)合?？捎玫牧字睦影ǖ幌抻诹字帷⒘字Ｄ憠A(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰甘油等。如此得到的脂質(zhì)化的肽稱為脂肽。
當(dāng)通過(guò)與水溶性聚合物結(jié)合來(lái)修飾肽時(shí)，可用的水溶性聚合物的例子包括聚乙二醇、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物和聚乙烯醇等。這些聚合物可通過(guò)反應(yīng)活性基團(tuán)，例如醛與蛋白質(zhì)N末端的α氨基或賴氨酸的ε-氨基共價(jià)結(jié)合。這些聚合物中優(yōu)選PEG，PEG的分子量?jī)?yōu)選6kDa到50kDa。
聚合神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽的方法的另一例子是接枝化(dendrimerization)。
此外，含有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽的脂質(zhì)體制備物也可用作本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑。術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”指由膜形式的聚集脂質(zhì)層和內(nèi)部含水層構(gòu)成的膜狀閉合囊泡?？赏ㄟ^(guò)制備含有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽的脂質(zhì)體來(lái)制備本發(fā)明的脂質(zhì)體制備物。所述脂質(zhì)體包括由脂質(zhì)磷脂構(gòu)成膜的脂質(zhì)體和由中性和酸性磷脂構(gòu)成膜的脂質(zhì)體。
作為膜成分的酸性磷脂的例子包括天然或合成的磷脂酰甘油(PG)，例如二月桂?；字８视?DLPG)、二肉豆蔻?；字８视?DMPG)、二棕櫚?；字８视?DPPG)、二硬脂?；字８视?DSPG)、二油?；字８视?DOPG)、卵磷脂酰甘油(卵PG)、氫化卵磷脂酰甘油；和天然或合成的磷脂酰肌醇(PI)，例如磷脂酰肌醇(DLPI)、二肉豆蔻?；字＜〈?DMPI)、二棕櫚?；字＜〈?DPPI)、二硬脂?；字＜〈?DSPI)、二油?；字＜〈?DOPI)、大豆磷脂酰肌醇(大豆PI)和氫化大豆磷脂酰肌醇?？蓡为?dú)使用每種這些組分或聯(lián)用兩種或多種。
中性磷脂的例子包括天然或合成的磷脂酰膽堿(PC)，例如大豆磷脂酰膽堿、卵磷脂酰膽堿、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化卵磷脂酰膽堿、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二月桂?；字Ｄ憠A(DLPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)、肉豆蔻?；貦磅；字Ｄ憠A(MPPC)、棕櫚?；仓；字Ｄ憠A(PSPC)和二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)；和天然或合成的磷脂酰乙醇胺(PE)，例如大豆磷脂酰乙醇胺、卵磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化卵磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?DMPE)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、二月桂?；字Ｒ掖及?DLPE)、二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)、肉豆蔻?；貦磅；字Ｒ掖及?MPPE)、棕櫚?；仓；字Ｒ掖及?PSPE)和二油?；字Ｒ掖及?DOPE)?？蓡为?dú)使用每種這些組分或聯(lián)用兩種或多種。
可根據(jù)已知的方法用上述磷脂制備含有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽的脂質(zhì)體。在該制備物中，酸性磷脂在脂質(zhì)體膜組分中按比例計(jì)占約0.1到約100摩爾％，優(yōu)選約1到約90摩爾％，更優(yōu)選約10到約50摩爾％。
當(dāng)制備上述脂質(zhì)體時(shí)，可加入膽固醇等。通過(guò)加入膽固醇可以調(diào)節(jié)磷脂的流動(dòng)性從而可簡(jiǎn)單且方便地制備脂質(zhì)體。膽固醇一般以和磷脂相等的體積加入并混合，優(yōu)選0.5到1倍的體積。
脂質(zhì)分散體中酸性磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽的混合比一般約為0.5到約100當(dāng)量的酸性磷脂/當(dāng)量肽，優(yōu)選約1到約60當(dāng)量的酸性磷脂/當(dāng)量肽，更優(yōu)選約1.5到約20當(dāng)量的酸性磷脂/當(dāng)量肽。
脂質(zhì)體中神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽含量的比例通常是所有脂質(zhì)的幾到幾十摩爾％，優(yōu)選5到30摩爾％，最優(yōu)選5到10摩爾％。
可通過(guò)已知方法制備含有本發(fā)明神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽的脂質(zhì)體制備物。
例如，按照以下步驟制備多層脂泡(MLV)。首先，將脂質(zhì)溶解于有機(jī)溶劑(氯仿、乙醚等)，然后裝入圓底燒瓶。在氮?dú)饬飨禄驕p壓除去有機(jī)溶劑，從而在燒瓶底部形成薄的脂質(zhì)膜?？扇芜x將燒瓶在減壓下置于干燥器中以完全除去殘留溶劑。然后，通過(guò)將藥物溶液加在薄的脂質(zhì)膜上使脂質(zhì)水化以得到混濁的，乳白色的脂質(zhì)體混懸液。
通過(guò)向小單層磷脂酰絲氨酸小泡中加入Ca2+，這些小泡融合形成圓柱形片狀物，然后加入螯合劑EDTA以除去Ca2+來(lái)制備大單層脂泡(LUV)(Biochim.Biophys.Acta，394，483-491，1975)。也可通過(guò)將乙醚配制的脂質(zhì)注射入水溶液，然后在60℃蒸發(fā)掉乙醚來(lái)制備LUV(Biochim.Biophys.Acta，443，629-634，1976)。
或者可采用Szoka等(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A，75，4194-4198，1978)設(shè)計(jì)的利用反相技術(shù)的脂質(zhì)體制備方法。按照該方法，通過(guò)將藥物溶液加入磷脂的乙醚溶液并超聲處理得到的混合物可形成W/O型乳液。用蒸發(fā)器減壓除去該W/O型乳液這的乙醚。然后加入緩沖液，得到的乳液在漩渦混合器上攪拌，從而導(dǎo)致W/O型乳液向O/W型乳液的相轉(zhuǎn)換。除去殘留溶劑得到脂質(zhì)體。
除了這些方法，可通過(guò)弗氏壓碎法(FEBS lett.，99，210-214，1979)制備小粒徑脂質(zhì)體?；蛘?，也可采用Ohsawa等報(bào)道的用于高容量脂質(zhì)體的凍干法(Chem.Pharm.Bull，32，2442-2445，1984)和凍融法(Chem.Pharm.Bull.，33，2916-2923，1985)。
可利用聚碳酸酯膜通過(guò)透析(J.Pharm.Sci.，71，806-812，1982)或過(guò)濾方法使如此制備的脂質(zhì)體制成粒徑均勻(Biochim.Biophys.Acta，557，9-23，1979；Biochim.Biophys.Acta，601，559-571，1980)?？刹捎猛肝?、凝膠過(guò)濾方法和離心方法從所制備的脂質(zhì)體乳液中除去未留在脂質(zhì)體中的藥物(參見(jiàn)Liposome(脂質(zhì)體)，“Shishitsu no Kagaku”(脂質(zhì)的化學(xué))；Biochemical Experiment Lecture 3(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義3)，Japanese Biochemical Society編，Tokyo Kagaku Dojin出版，1974)。此外，也可利用透析膜濃縮脂質(zhì)體。
如此制備的脂質(zhì)分散體可適當(dāng)?shù)睾懈鞣N種類的已知物質(zhì)，例如防腐劑、等滲劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和吸收促進(jìn)劑等作為配制制備物所需的添加劑。如果需要，也可用水或含有這些添加劑的溶液稀釋脂質(zhì)分散體。上述添加劑的具體例子比例有效用于真菌和細(xì)菌的防腐劑，例如苯扎氯銨、苯索氯銨、氯己定、對(duì)羥基苯甲酸酯(對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯等)和乙基汞硫代水楊酸鈉；等滲劑，例如D-甘露醇、D-山梨醇、D-木糖醇、甘油、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和電解質(zhì)(例如，多元醇和氯化鈉)；和穩(wěn)定劑，例如育兒酚、丁基羥基茴香醚(burylhydroxyanisole)、丁基羥基甲苯、乙二胺四乙酸鹽(EDTA)和半胱氨酸。
此外，還可將另一種藥物，例如抗病毒藥物包裹入上述含有本發(fā)明HA-結(jié)合肽的脂質(zhì)體中，可類似地制備脂質(zhì)體制備物。
可按照，例如Woodle等(Long Circulating Liposomesold drug，Newtherapeutic(長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體老藥新療法)，M.C.Woodle，G.Storm編Springer-Verlag，Berlin，(1998))或Namba等(Liposomal applications to cancertherapy(癌癥治療中的脂質(zhì)體應(yīng)用)，Y.Namba，N.Oku，J.Bioact.Compat.Polymers，8，158-177，(1993))具體描述的方法制備脂質(zhì)體制備物。
為制備脂質(zhì)體制備物，上述烷基化肽和/或脂質(zhì)化肽可用作脂質(zhì)組分。
含有上述本發(fā)明脂質(zhì)體制備物的藥學(xué)組合物中神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽的量不限，但可取決于組合物所給予的對(duì)象而適當(dāng)選擇一般約為組合物的0.0002到0.2(w/v％)，優(yōu)選約為0.001到0.1(w/v％)。
可通過(guò)將本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑給予未感染流感病毒的對(duì)象來(lái)預(yù)防流感病毒感染，也可通過(guò)將其給予已感染流感病毒的對(duì)象來(lái)用作抵御流感病毒的治療性藥物，因?yàn)樗芤阴チ鞲胁《靖腥救肷眢w的其它細(xì)胞。本發(fā)明的流感病毒抑制劑可含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、稀釋劑和賦形劑，以及作為茴香成分的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽。就水性制備物而言，純水(無(wú)菌水)、生理緩沖溶液、等滲溶液等可用作運(yùn)載體。也可用乙二醇、甘油、可注射有機(jī)酯類，例如橄欖油等。就片劑而言，膠凝劑、乳糖、硬脂酸鎂等也可用作運(yùn)載體或賦形劑。
作為藥物組合物，本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑可以各種劑型給予。這種劑型包括口服制備物，例如片劑、膠囊、顆粒、粉末、糖漿等；或胃腸外制備物，例如注射液、輸液、栓劑等。噴劑是另一種選擇。就噴劑而言，含有本發(fā)明流感病毒抑制劑的溶液可經(jīng)口或鼻噴給對(duì)象。這種噴劑可有效地給予家養(yǎng)動(dòng)物，例如鳥和豬等。這些組合物可通過(guò)已知方法制備并通常用于藥學(xué)領(lǐng)域。
本發(fā)明流感病毒感染抑制劑的給藥途徑包括但不限于口服給藥、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射、噴霧等?；蛘撸图茵B(yǎng)動(dòng)物，例如鳥、豬等而言，也可將本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑混合入飲用水、食物等來(lái)給予?？筛鶕?jù)患者的嚴(yán)重性來(lái)適當(dāng)確定劑量，給予患者藥物有效劑量的本發(fā)明組合物。本文所述的“給予藥物有效劑量”指以適當(dāng)治療各種疾病的水平給予藥物。可根據(jù)患者的癥狀適當(dāng)選擇本發(fā)明組合物的給藥次數(shù)。例如，就成人患者而言，劑量的可選擇范圍等于約0.001到100mg/天的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽用量。本發(fā)明的制備物可以，但不限于每日一次的劑量給予，也可以多劑量給予。當(dāng)給予家養(yǎng)動(dòng)物，例如鳥或豬時(shí)，可考慮體重等(因素)適當(dāng)確定劑量。
本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑可含有抑制流感病毒感染的另一種化合物作為活性成分。這種化合物的例子包括日本公開(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?002-284798所述的流感病毒血凝素-結(jié)合肽。具體的例子是日本公開(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?002-284798和WO00/59932所述的肽。通過(guò)使流感病毒抑制劑含有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽和流感病毒血凝素-結(jié)合肽，可同時(shí)阻斷流感病毒上存在的用于和細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)與細(xì)胞上存在的用于和流感病毒結(jié)合的位點(diǎn)，故而可期待更強(qiáng)的流感病毒抑制作用。與上述神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽相似，流感病毒血凝素-結(jié)合肽也可含有部分突變的氨基酸以及修飾的氨基酸。脂質(zhì)體中可含有流感病毒血凝素-結(jié)合肽。當(dāng)本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑是脂質(zhì)體制備物時(shí)，肽可含有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽與流感病毒血凝素-結(jié)合肽。
接下來(lái)將參考實(shí)施例來(lái)詳細(xì)解釋本發(fā)明。
實(shí)施例材料的取得神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)得自Snow BrandMilk Products Co.，Ltd.(日本)。通過(guò)參考文獻(xiàn)(42)所述的方法制備合成的GM3類似物-6’GM3(NeuAcα2→6Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)。乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)、半乳糖基神經(jīng)酰胺(GalCer)和葡糖腦苷脂(GlcCer)購(gòu)自SigmaChemical Co.(St Louis，MO，USA)。卵磷脂酰膽堿(卵PC)和膽固醇分別得自NOF Corporation Inc.(日本)和Nacalai Tesque Inc.(日本)。
按照參考文獻(xiàn)(43)所述得到噬菌體展示15聚體隨機(jī)肽文庫(kù)(多樣性為108)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Fmoc法利用Advanced Chemtech的自動(dòng)肽合成儀ACT357合成15聚體肽酰胺(肽-NH2)和N-硬脂酰基(十八烷?；?肽酰胺(C17H35CO-肽-NH2)。通過(guò)反相高效液相色譜純化肽酰胺和N-硬脂?；孽０贰Ｈ缓笸ㄟ^(guò)MALDI-TOF/MS確認(rèn)它們的純度和所期望的結(jié)構(gòu)。
小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞得自RIKEN Cell Bank(日本)。Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞和流感病毒A/Puerto Rico/8/34毒株(H1N1)由K.Nagata(Universityof Tsukuba，Japan)提供。
實(shí)施例1選擇神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽(1)唾液酸半乳糖-結(jié)合肽的親和力選擇將含有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(約0.5mg/mL)的脂質(zhì)溶液(氯仿/甲醇＝2∶1，v/v)鋪在涂有Teflon的Langmuir凹槽(USI Co.，Ltd，(日本))內(nèi)的Tris-緩沖鹽水(TBS)(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)上。水層底部的溫度維持在20℃。通過(guò)Wilhelmy平板法(Wilhelmy plate method)檢測(cè)表面壓力-面積(p-A)等溫線。以恒定速率(10cm2/分鐘)壓縮GM3單層并以30mN/m的表面壓力將其水平轉(zhuǎn)移至石英-晶體微量天平的金表面(QCM；9MHz，AT-切口(AT-cut)，直徑4.5mm，面積15.9mm2)(參考文獻(xiàn)(21))。將QCM轉(zhuǎn)移至裝有1ml TBS的手工制塑料試管，緩沖液的溫度維持在20℃并攪拌。將噬菌體(每輪選擇6.1到87×1010個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)注射入比色皿。為確定培育時(shí)間，監(jiān)測(cè)噬菌體與單層的結(jié)合(ΔF，Hz)(參考文獻(xiàn)(35))。噬菌體的結(jié)合在15分鐘內(nèi)變得幾乎平衡(數(shù)據(jù)未顯示)。從緩沖液中取出QCM并用TBS洗滌3次。與單層結(jié)合的噬菌體用0.1N Gly-HCl緩沖液(pH2.2)洗滌15分鐘。用1M Tris-HCl緩沖液(pH9.1)中和洗出液，然后通過(guò)感染大腸桿菌K91Kan宿主細(xì)菌細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增噬菌體。該過(guò)程重復(fù)4次以擴(kuò)增GM3-特異性噬菌體。分離單個(gè)噬菌體克隆，擴(kuò)增并用聚乙二醇/NaCl(PEG#6000)沉淀(參考文獻(xiàn)(26))。用QIAprep Spin M13試劑盒(QIAGEN)純化每個(gè)噬菌體克隆的DNA，將其用作測(cè)序模板以推測(cè)氨基酸排列。
(2)通過(guò)ELISA測(cè)定噬菌體克隆結(jié)合能力預(yù)先用1％BSA/TBS封閉聚苯乙烯多孔板并洗滌3次。塑料板(直徑13.5mm；Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，日本)與上述制備的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3或6’GM3單層水平相連。噬菌體克隆(200μl TBS配制，0.01到10nM)與單層在4℃培育30分鐘。通過(guò)加入0.5％BSA/TBS封閉塑料板的另一側(cè)，然后用0.5％BSA/TBS洗滌兩次。結(jié)合的噬菌體與1∶2000(v/v)稀釋的抗-fd噬菌體(Sigma)在4℃培育1小時(shí)，然后在4℃用1∶2000(v/v)稀釋的抗-家兔免疫球蛋白G過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物標(biāo)記1小時(shí)。用鄰苯二胺顯色，492nm檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。吸光度增加(492nm處的ΔA)顯示了噬菌體濃度的簡(jiǎn)單飽和曲線，反映了[噬菌體]/ΔA和[噬菌體]之間的線性關(guān)系，如以下方程所示[噬菌體]/ΔA＝[噬菌體]/ΔAmax+Kd/ΔAmax(I)分別從方程的斜率和截距計(jì)算最大吸光度(ΔAmax)和解離常數(shù)(Kd)。Kd的范圍是0.018到0.091nM。每次也測(cè)試對(duì)照噬菌體的ΔAmax并計(jì)算相對(duì)結(jié)合親和力(ΔAmax/ΔAmax對(duì)照)(表1)。野生型噬菌體用作對(duì)照噬菌體。
(3)細(xì)胞小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2、95％空氣的條件下生長(zhǎng)在添加了10％胎牛血清(Life Technologies，Inc.)、100單位/ml青霉素G和100單位/ml鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(ICN Biomedicals)中。Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞在37℃、5％CO2、95％空氣的條件下生長(zhǎng)在添加了10％胎牛血清、0.1％NaHCO3、10μg/ml谷氨酰胺、100單位/ml青霉素G和100單位/ml鏈霉素的極限必需eagle培養(yǎng)基(MEM；GIBCO BRL)中。
(4)流式細(xì)胞術(shù)胰蛋白酶處理的B16細(xì)胞(2×105)與用1％BSA/磷酸緩沖鹽水(PBS)連續(xù)稀釋的200μl噬菌體克隆([噬菌體]＝0.1到500nM)在冰上培育0.5小時(shí)。用1％BSA/PBS洗滌3次后，細(xì)胞與200μl稀釋400倍的(v/v)家兔抗-fd噬菌體抗體(Sigma)在冰上培育0.5小時(shí)。洗滌兩次后，細(xì)胞與200μl稀釋400倍的(v/v)抗-家兔IgG異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)物(Sigma)在冰上培育0.5小時(shí)。用1％BSA/PBS洗滌FITC標(biāo)記的細(xì)胞兩次并用流式細(xì)胞儀(EPICS XL；Coulter)分析。
(5)加入單糖的抑制作用胰蛋白酶處理的B16細(xì)胞(2×105)在存在或不存在單糖(1或5mM N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)、葡萄糖(Glc)或葡糖醛酸(GlcU))時(shí)與200μl噬菌體克隆([噬菌體]＝10nM)在冰上培育1小時(shí)。洗滌細(xì)胞、用FITC標(biāo)記并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。
(6)從細(xì)胞的糖蛋白上除去唾液酸胰蛋白酶處理的B16細(xì)胞(2×105)在37℃與得自Arthrobacter ureafaciens(Sigma)的0.05單位神經(jīng)氨酸酶培育1.5小時(shí)。用1％BSA/PBS洗滌細(xì)胞3次后，細(xì)胞與噬菌體克隆([噬菌體]＝10nM)一起培育，F(xiàn)ITC標(biāo)記并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。
(7)通過(guò)利用石英-晶體微量天平(QCM)分析合成的肽和糖脂單層之間的相互作用在Langmuir型凹槽上制備糖脂(GM3、6’GM3、LacCer、GalCer或GlcCer)單層并水平轉(zhuǎn)移至QCM(27MHz，AT-切口，直徑2.5mm，面積4.9mm2)。27-MHz QCM的靈敏度顯示比9-MHz QCM高(約10倍)(參考文獻(xiàn)(44)-(46))。向QCM設(shè)備的細(xì)胞比色皿中加入0.1mM、1mM和10mM肽的TBS溶液，監(jiān)測(cè)響應(yīng)加入肽所致的頻率降低(ΔF，Hz)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2到6次。通過(guò)Sauerbrey方程獲得結(jié)合量(Δm，ng cm-2)和ΔF之間的關(guān)系(參考文獻(xiàn)(27))。在這些實(shí)驗(yàn)中，1Hz的ΔF對(duì)應(yīng)于肽的質(zhì)量增加1.1ng cm-2。Δm對(duì)肽濃度作圖(終濃度1到70μM)。然后按照參考文獻(xiàn)(44-45，48)所述的以下方程計(jì)算最大結(jié)合量(Δmmax)和解離常數(shù)(Kd)。
/Δm＝[肽]/Δmmax+Kd/Δmmax(II)(8)制備含有肽的脂質(zhì)體將溶解于氯仿/甲醇(2∶1，v/v)的卵磷脂酰膽堿(PC)和膽固醇的混合脂質(zhì)(2∶1，摩爾比)加入圓底燒瓶并蒸發(fā)得到薄的脂質(zhì)膜。真空干燥脂質(zhì)膜過(guò)夜。用PBS(pH7.4)在漩渦(混合器)上溶脹該膜并超聲處理30分鐘。PC/膽固醇脂質(zhì)體與N-硬脂?；孽０返乃芤夯旌?。PC∶膽固醇∶肽的最終摩爾比是20∶10∶3。
以下結(jié)果得自實(shí)施例1。
(a)GM3單層的噬菌體展示選擇通過(guò)參考文獻(xiàn)35所述與脂質(zhì)單層結(jié)合的噬菌體文庫(kù)的方法來(lái)選擇與GM3的糖鏈結(jié)合的肽序列。在氣-水界面處制備GM3單層并用于親和力選擇。通過(guò)重復(fù)4次親和力選擇方法富集GM3特異性噬菌體。通過(guò)4輪生物淘選回收的噬菌體的相對(duì)產(chǎn)量增加到0.2-15×106(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)利用9MHz石英-晶體微量天平(QCM)確認(rèn)所選擇噬菌體對(duì)GM3單層的親和力(參考文獻(xiàn)(21)-(22))。監(jiān)測(cè)響應(yīng)加入用Tris-緩沖鹽水(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)配制的噬菌體(1010TU/mL)的QCM頻率降低(圖1)。圖1顯示了在利用GM3單層進(jìn)行的第4輪親和力選擇中的噬菌體文庫(kù)(白色圓圈)和噬菌體克隆(黑色圓圈)的結(jié)果。GM3單層與9MHz QCM的金表面相連，QCM浸在pH7.5的1ml Tris-緩沖鹽水中。將含有6×1010轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的噬菌體溶液注射入緩沖液，以響應(yīng)噬菌體結(jié)合的頻率降低對(duì)時(shí)間作圖。結(jié)果顯示最終噬菌體的濃度是2nM。
頻率變化顯示所選擇的噬菌體的結(jié)合量(26Hz)比原始文庫(kù)的(4Hz)高6.5倍。這些結(jié)果表明親和力選擇從隨機(jī)噬菌體文庫(kù)中得到了GM3結(jié)合噬菌體。
分離了27個(gè)GM3特異性噬菌體克隆并鑒定了它們的DNA序列。代表隨機(jī)區(qū)域的推測(cè)的氨基酸序列表明發(fā)現(xiàn)了如表1所示的7種15聚體序列(序列1到7)。這些序列分為兩組，每組具有推測(cè)的共有基序，W-xxxA-R或WRx-VxFxS。每種共有基序含有Arg(R)、Trp(W)和Phe(F)。非常令人感興趣的是，GM1結(jié)合肽共有基序也含有這3種氨基酸(精氨酸和芳族氨基酸)(參考文獻(xiàn)35)。此外，此項(xiàng)研究中所選擇的c01序列與GM1結(jié)合肽之一(GM1/肽2)具有相同的序列。這是因?yàn)槭褂玫氖峭皇删w文庫(kù)，而文庫(kù)的多樣性有限。這些結(jié)果提示c01-序列對(duì)含有唾液酸的糖脂具有廣泛的親和力。
表14輪親和力選擇后分離的噬菌體克隆的推測(cè)的肽序列和結(jié)合親和力

a.推測(cè)的氨基酸序列；黑體字母表示推測(cè)的共有基序。
b.所分離的噬菌體克隆數(shù)。
c.ΔAmax/ΔAmax，對(duì)照之比。通過(guò)ELISA評(píng)估噬菌體克隆與GM3的結(jié)合。對(duì)照噬菌體克隆(野生型)的N-末端序列是AETVESCLAKPHTEN。
(b)通過(guò)ELISA進(jìn)行的親和力篩選通過(guò)ELISA評(píng)估所分離的噬菌體克隆對(duì)GM3的結(jié)合親和力。在氣-水界面制備GM3單層并將其轉(zhuǎn)移至塑料板。將板轉(zhuǎn)移至24-孔多層板(multiplate)，然后與噬菌體克隆一起培育30分鐘。酶染色的吸光度對(duì)噬菌體濃度作圖得到飽和曲線。通過(guò)上述方程I計(jì)算最大吸光度(ΔAmax)。ELISA得到的結(jié)果顯示7種噬菌體克隆以以下順序強(qiáng)烈結(jié)合GM3c01＞c03＞c15＞c30＞c07＞c21＝c11。相對(duì)結(jié)合親和力，即(所選擇噬菌體的ΔAmax)/(展示AETVESCLAKPHTEN的對(duì)照噬菌體的ΔAmax)在1.1和2.1之間(表1)。表現(xiàn)出最高頻率(15/27)的噬菌體克隆c01顯示對(duì)GM3的親和力最高。
(c)噬菌體克隆的結(jié)合親和力通過(guò)ELISA進(jìn)一步檢測(cè)了兩種噬菌體克隆，c01和c03的結(jié)合親和力。通過(guò)利用含有NeuAcα2→3Gal鍵的GM3和含有NeuAcα2→6Gal鍵的合成的6’GM3測(cè)試了這些克隆的結(jié)合親和力。c01克隆與GM3和6’GM3的結(jié)合親和力分比對(duì)照克隆高2.1倍和1.6倍(圖2)。
連續(xù)稀釋分離的c01和c03噬菌體克隆(0.05到10nM)，通過(guò)ELISA方法評(píng)估與GM3(NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)或6’GM3(NeuAcα2→6Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)單層相互作用的結(jié)合的噬菌體克隆的量。用噬菌體克隆的最大吸光度(ΔAmax)除以對(duì)照克隆的最大吸光度(ΔAmax，對(duì)照)得到相對(duì)結(jié)合親和力(ΔAmax/ΔAmax，對(duì)照)。
c01噬菌體克隆顯示與兩種NeuAc-Gal鍵結(jié)合，而c03-克隆以高于對(duì)照克隆1.8-倍的特異性結(jié)合GM3。c03噬菌體克隆對(duì)唾液酸到半乳糖的α2→3和α2→6鍵顯示不同的結(jié)合親和力。
(d)特異性結(jié)合B16細(xì)胞上糖蛋白中的唾液酸寡糖檢測(cè)了為動(dòng)物細(xì)胞所選擇的噬菌體克隆的結(jié)合親和力。小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞在其表面具有兩種唾液酸-半乳糖鍵(α2→3和α2→6)。B16細(xì)胞系主要表達(dá)GM3但幾乎不表達(dá)其它神經(jīng)節(jié)苷脂(參考文獻(xiàn)(13)、(15)、(49)-(51))。細(xì)胞與噬菌體克隆以及所結(jié)合的克隆一起培育，并用熒光素-偶聯(lián)物抗體標(biāo)記。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中的熒光素，并將所觀察到的熒光強(qiáng)度作為噬菌體濃度的函數(shù)作圖(圖3)。
B16細(xì)胞于0℃在1％BSA/PBS中與c01-噬菌體克隆(黑色圓圈)、c03-噬菌體克隆(白色圓圈)或?qū)φ帐删w克隆(野生型；黑色三角形)一起培育。用第一抗噬菌體抗體和第二FITC-偶聯(lián)物抗體標(biāo)記所結(jié)合的噬菌體克隆。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)得與細(xì)胞結(jié)合的噬菌體克隆的量。
c01噬菌體克隆在噬菌體濃度為1到10nM范圍時(shí)與B16細(xì)胞結(jié)合。相反，c03或?qū)φ帐删w克隆為觀察到明顯的結(jié)合。
為確定噬菌體的結(jié)合是否為細(xì)胞表面的唾液酸所介導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抑制試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶處理。通過(guò)轉(zhuǎn)化1mM NeuAc抑制01-噬菌體克隆(10nM)與B16細(xì)胞的結(jié)合(圖4A)。
圖4A顯示了單糖對(duì)c01-噬菌體克隆和B16細(xì)胞之間結(jié)合的抑制。B16細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞)在沒(méi)有(-)或有NeuAc、Glc或GlcU(1mM)存在時(shí)與噬菌體克隆(10nM)一起培育。
在有葡糖醛酸(GlcU)存在時(shí)觀察到微弱的抑制。由于GlcU與NeuAc一樣是酸性糖，提示羧酸部分負(fù)責(zé)噬菌體和糖鏈之間的相互作用。相反，加入葡萄糖未觀察到抑制。Arthrobacter ureafaciens的神經(jīng)氨酸酶(唾液酸酶)優(yōu)先水解糖綴合物的末端α2→3和α2→6結(jié)合的唾液酸(相對(duì)活性α2→6＞α2→3＞α2→8)，參考文獻(xiàn)(52))。于37℃在緩沖液(pH6.5)中用神經(jīng)氨酸酶處理B16細(xì)胞1.5小時(shí)。在此條件下，推測(cè)從細(xì)胞上除去的唾液酸的量為13μg/106個(gè)細(xì)胞，這幾乎與現(xiàn)有糖蛋白中NeuAc的總量相同(參考文獻(xiàn)(49)-(50))。另一方面，薄層層析分析未觀察到有NeuAc從GM3上分解下來(lái)(數(shù)據(jù)未顯示)。用神經(jīng)氨酸酶消化GM3中純化的唾液酸。然而，處理完整的細(xì)胞未顯示唾液酸從GM3上解離。因此認(rèn)為當(dāng)用神經(jīng)氨酸酶處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞上的唾液酸糖綴合物只是GM3。雖然ELISA顯示c01-噬菌體克隆與GM3結(jié)合，c01-噬菌體與神經(jīng)氨酸酶處理的B16細(xì)胞結(jié)合降低至與對(duì)照噬菌體相同的水平(圖4B)。
圖4B顯示神經(jīng)氨酸酶處理對(duì)噬菌體與B16細(xì)胞結(jié)合的作用。B16細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞)于37℃在1％BSA/PBS中與0.05單位的神經(jīng)氨酸酶(pH6.5)一起培育90分鐘，然后再與噬菌體克隆一起培育。在圖4B中，星號(hào)表示p＜0.05。
當(dāng)用神經(jīng)氨酸酶在酶無(wú)活性的pH7.4條件下處理細(xì)胞時(shí)，c01-噬菌體與細(xì)胞結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明c01-噬菌體克隆與糖蛋白上的唾液酸寡糖而非GM3結(jié)合。由于噬菌體是柔韌的絲狀(約1μm長(zhǎng)，6-10nm厚)(參考文獻(xiàn)(26))，此親和力可能是因噬菌體的空間位阻所致?；贓LISA的結(jié)果(圖2)，推斷c01-噬菌體克隆與糖蛋白中α2→6結(jié)合的唾液酸半乳糖相互作用。
(e)合成的15聚體肽的糖識(shí)別(能力)為檢測(cè)所選擇肽的糖識(shí)別(能力)，合成了15聚體肽H-GWWYKGRARPVSAVA-NH2(c01-肽；SEQ ID NO.1)和H-RAVWRHSVATPSHSV-NH2(c03-肽；SEQ ID NO.2)。利用27MHz QCM方法分析了這些肽與糖脂的結(jié)合試驗(yàn)(27-MHz QCM的靈敏度約是9MHz QCM的10倍)(參考文獻(xiàn)(44)-(46))。在氣-水界面制備糖脂單層(GM3、6’GM3、LacCer、GalCer或GlcCer)并轉(zhuǎn)移至QCM金表面。然后將肽溶液注射入QCM比色皿，檢測(cè)作為時(shí)間函數(shù)的肽的結(jié)合量(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖5所示，肽與單層的結(jié)合(Δm)作為肽濃度的函數(shù)作圖。
通過(guò)QCM分析可知，平衡時(shí)，響應(yīng)c01-肽(黑色圓圈)和c03-肽(白色圓圈)結(jié)合的質(zhì)量增加值(Δm，ng cm-2)在最終肽濃度為1.0-10μM的范圍內(nèi)。利用方程II從相互關(guān)系圖(mutual plot)計(jì)算最大結(jié)合量(Δmmax)和解離常數(shù)(Kd)(表2)(參考文獻(xiàn)(44)-(45)，(47))。Kd值等于50％最大結(jié)合所需的肽濃度。c01-肽和c03-肽分別在Kd值為1.8和0.34μM時(shí)對(duì)GM3具有最高的親和力。c01-肽的最大結(jié)合量(46ng cm-2)大于c03-肽(11ng cm-2)。然而，雖然這些肽也對(duì)6’GM3和LacCer具有親和力，它們的Kd值高于對(duì)GM3的Kd值。這兩類肽對(duì)GalCer和GlcCer的結(jié)合(能力)低或者不結(jié)合二者。因此，這些肽看起來(lái)與末端NeuAc-Gal結(jié)構(gòu)相互作用。同時(shí)，調(diào)控肽(H-AETVESCLAKPHTEN-NH2)不與該項(xiàng)研究所用的任一鞘糖脂結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
表2與神經(jīng)節(jié)苷脂和鞘糖脂結(jié)合的合成的肽

a.下劃線處是肽所識(shí)別的區(qū)域。
b.通過(guò)QCM分析(1Hz＝0.91ng cm-2)得到Δmmax和Kd值。
c.未檢測(cè)。
如實(shí)施例1所示，利用噬菌體文庫(kù)方法來(lái)測(cè)定在氣-水界面與脂單層結(jié)合的糖脂-結(jié)合肽序列(參考文獻(xiàn)(35))。在該方法中，由于在表面壓力為30mN m-1(0.4nm2/分子)時(shí)糖脂分子高度定向，所以只有糖鏈接觸水相。結(jié)果只有噬菌體分子與糖鏈相互作用。在該項(xiàng)研究中，由于GM3具有唾液酸半乳糖殘基(細(xì)胞表面主要的寡糖)，其用作親和力選擇的靶分子。經(jīng)過(guò)4輪親和力選擇，富集了GM3-結(jié)合噬菌體。每輪用石英-晶體微量天平檢測(cè)富集情況(數(shù)據(jù)未顯示)。最后檢測(cè)到質(zhì)量增加約6.5倍(圖1)。第4輪時(shí)觀察到的QCM頻率降低(26Hz)對(duì)應(yīng)于QCM電極上噬菌體結(jié)合量的飽和。
從27個(gè)分離的噬菌體克隆中推測(cè)了7種肽序列。該7種肽序列分為兩種共有基序W-xxxA-R和WRx-VxFxS(表1)。在GM1-結(jié)合肽中也觀察到了共有基序中的精氨酸和芳香族氨基酸(參考文獻(xiàn)(35))。此外，c01-肽的序列與GM1-結(jié)合肽一樣(GWWYKGRARPVSAVA)?；瘜W(xué)合成含有所選擇序列的15聚體c01-和c03-肽。檢測(cè)了它們對(duì)幾種糖脂的結(jié)合親和力，測(cè)定了參與和這些肽相互作用的糖部分(圖5和表2)。該兩種肽對(duì)GM3的Kd值最低的事實(shí)說(shuō)明末端NeuAc-Gal結(jié)構(gòu)是肽識(shí)別碳水化合物所需。因此，推斷肽基序中的(R)、Trp(W)、Ala(A)、Val(V)、Phe(F)和Ser(S)參與和GM3的NeuAc-Gal相互作用。糖的羥基同時(shí)用作氫鍵的供體和受體(參考文獻(xiàn)(53)、(54))。在許多情況中，肽的酰胺基團(tuán)還用作氫鍵供體，肽的羰基或羧酸基團(tuán)和NeuAc用作氫鍵受體。此外，吡喃型半乳糖的B位點(diǎn)和NeuAc的甲基可與Trp和Phe的芳香環(huán)相互作用。GM3-結(jié)合肽的共有基序含有結(jié)合糖的氨基酸。因此，這些肽可通過(guò)氫鍵和范德華力相互作用識(shí)別NeuAc-Gal部分。
唾液酸半乳糖(NeuAc-Gal)結(jié)構(gòu)是糖蛋白和糖脂的末端糖序列。由于小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞主要表達(dá)GM3，而幾乎不表達(dá)其它神經(jīng)節(jié)苷脂，B16細(xì)胞用于測(cè)定所選擇噬菌體對(duì)細(xì)胞表面GM3的親和力(參考文獻(xiàn)(13)、(15)、(49)-(50))。當(dāng)B16細(xì)胞與所選擇的噬菌體克隆一起培育時(shí)，只有c01-噬菌體與細(xì)胞結(jié)合(圖3)。從細(xì)胞上除去唾液酸和加入游離的N-乙?；窠?jīng)氨酸可抑制噬菌體與細(xì)胞結(jié)合。這些結(jié)果顯示c01-噬菌體克隆的結(jié)合受糖蛋白的唾液酸殘基介導(dǎo)。c01噬菌體克隆對(duì)Neuα2→3Gal和Neuα2→6Gal鍵具有親和力，c03-噬菌體克隆對(duì)Neuα2→3Gal鍵具有親和力(圖2)。這表明只有噬菌體克隆c01與B16細(xì)胞表面的Neuα2→6Gal相互作用。雖然GM3表達(dá)于B16細(xì)胞表面，但是未觀察到與這些細(xì)胞結(jié)合的噬菌體。神經(jīng)氨酸酶不能消化GM3-NeuAc。這些結(jié)果顯示大分子(例如噬菌體克隆和酶)不能接近B16細(xì)胞上的GM3。
實(shí)施例2抑制流感病毒感染的實(shí)驗(yàn)噬菌斑試驗(yàn)通過(guò)MDCK細(xì)胞的噬菌斑試驗(yàn)測(cè)定流感病毒感染的抑制情況。6孔板中的MDCK細(xì)胞與含有脂質(zhì)體或含肽脂質(zhì)體的0.2ml流感病毒A/PR/8/34溶液(100-200 pfu；pfu表示噬菌斑形成單位)一起培育。在37℃、5％CO2條件下培育30分鐘后，除去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞。加入2mL(每孔)含有0.6％瓊脂糖(0.01％0-二乙氨基乙基纖維素葡聚糖)、0.1％NaHCO3，和0.01μ/m乙酰胰蛋白酶的2×MEM+BSA，細(xì)胞培育兩天。用結(jié)晶紫溶液(20％乙醇配制為1mg/mL)染色活細(xì)胞，噬菌斑計(jì)數(shù)。將不存在脂質(zhì)體情況下的噬菌斑數(shù)量定義為最大感染活性(100％)。從log[f/(1-f)]和log[含肽脂質(zhì)體]的圖中得到含肽脂質(zhì)體的IC50值(50％抑制濃度)，其中f是感染活性百分比。
含肽脂質(zhì)體抑制流感病毒感染入MDCK細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果如下。
通過(guò)噬菌斑試驗(yàn)測(cè)定含肽脂質(zhì)體對(duì)流感病毒感染入MDCK細(xì)胞的抑制。利用硬脂酰基團(tuán)對(duì)肽的N-末端乙?；⑵鋼饺隤C/膽固醇脂質(zhì)體(含肽脂質(zhì)體)。由于合成的c01和c03-肽對(duì)NeuAcα2→3Gal和NeuAcα2→6Gal結(jié)構(gòu)具有親和力，含肽脂質(zhì)體能與MDCK細(xì)胞上的唾液酸半乳糖結(jié)合。在有含肽脂質(zhì)體存在時(shí)，流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染入MDCK細(xì)胞得到抑制(圖6)。
MDCK細(xì)胞在有含c01肽的脂質(zhì)體(黑色圓圈)、含c03肽的脂質(zhì)體(白色圓圈)或單獨(dú)脂質(zhì)體(黑色三角形)存在時(shí)與流感病毒A/PR/8/34培育30分鐘。洗滌細(xì)胞并培育兩天。然后染色活細(xì)胞并對(duì)噬菌斑計(jì)數(shù)。
含c01肽的脂質(zhì)體和含c03肽的脂質(zhì)體的IC50值分別是0.36和0.37nM(表3)。對(duì)照肽序列未顯示抑制作用。c01和c03-噬菌體克隆對(duì)流感病毒不具有親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，這些脂質(zhì)體與細(xì)胞表面的結(jié)合顯示抑制了流感病毒感染。
表3脂質(zhì)體中的N-硬脂酰基肽抑制甲型流感病毒感染

此外，利用含有c01-肽和c03-肽的脂質(zhì)體進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，二者均是神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽和流感病毒血凝素結(jié)合肽A-1(ARLSPTMVHPRGAQP(SEQ ID NO.8))。這些結(jié)果示于圖7，其中橫軸表示脂質(zhì)體中卵PC的濃度(mM)，縱軸表示感染抑制的百分比(％)。感染抑制百分比計(jì)算為與加入不含肽脂質(zhì)體時(shí)的噬菌斑數(shù)量相比，加入含肽脂質(zhì)體時(shí)的噬菌斑數(shù)量降低的比例。如圖7所示，所有3種肽抑制了流感病毒感染，其中神經(jīng)節(jié)苷脂GM3-結(jié)合肽顯示抑制作用較高卵PC濃度為1mM時(shí)(肽濃度0.15mM)，c01-肽、c03-肽和A1肽的感染抑制百分比分別是83％、94％和76％。
多種毒素和病毒識(shí)別感染早期步驟中細(xì)胞表面的糖鏈(參考文獻(xiàn)(6))。人們認(rèn)為淀粉樣β蛋白也與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1相互作用，因此淀粉樣(蛋白)-GM1復(fù)合物導(dǎo)致原纖維形成(參考文獻(xiàn)(55)、(56))。抑制病原分子與糖鏈相互作用的幾種化合物正處于醫(yī)學(xué)應(yīng)用開(kāi)發(fā)中(參考文獻(xiàn)(57)、(58))。本發(fā)明將合成的肽引入脂質(zhì)體以評(píng)價(jià)它們作為流感病毒抑制劑的功能。肽的N-末端用硬脂?；鶊F(tuán)乙酰化得到疏水性部分。如期望的那樣，含肽脂質(zhì)體抑制流感病毒(H1N1型)感染入MDCK細(xì)胞(圖6)。甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的血清型H1血凝素對(duì)NeuAcα→3Gal鍵特異。MDCK細(xì)胞在它們的表面具有α2→3和α2→6鍵合的唾液酸(參考文獻(xiàn)(59))。肽脂質(zhì)體與MDCK細(xì)胞上的唾液酸半乳糖部分鍵合從而抑制了流感病毒與MDCK細(xì)胞上的唾液酸半乳糖受體結(jié)合。Takikawa等近來(lái)報(bào)道說(shuō)含有糖基-復(fù)制肽的脂質(zhì)體可與癌細(xì)胞結(jié)合從而抑制了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移(參考文獻(xiàn)(58))。將功能性肽引入脂質(zhì)體可以是抑制細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-病毒相互作用的有效方法。
通過(guò)噬菌體文庫(kù)選擇得到能識(shí)別唾液酸半乳糖部分的15聚體肽序列。得到的肽不只對(duì)糖脂單層的糖鏈具有親和力，也對(duì)細(xì)胞表面的糖蛋白具有親和力。肽與細(xì)胞表面的結(jié)合明顯抑制了流感病毒感染。本發(fā)明所選擇的肽可用作流感病毒抑制劑。
以下是本發(fā)明所提及的參考文獻(xiàn)清單。當(dāng)本說(shuō)明書提及以下清單中的參考文獻(xiàn)時(shí)，顯示了其參考文獻(xiàn)號(hào)。
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本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑阻斷了宿主細(xì)胞上的受體。因此，即使給予未感染的對(duì)象，該抑制劑也能抑制隨后的流感病毒感染，從而可用作有效的預(yù)防感染的藥物。由于本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑阻斷了流感病毒所識(shí)別的細(xì)胞受體，該抑制劑可抑制感染而無(wú)論流感病毒的類型，它不僅能抑制分離自人的流感病毒，例如甲型或乙型流感病毒的感染，也能抑制分離自鳥類的流感病毒等的感染。此外，即使在流感病毒感染后，本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑也能抑制通過(guò)出芽復(fù)制的流感病毒的再感染，因此也可有效地用作流感的治療性藥物。由于本發(fā)明的流感病毒感染抑制劑含有具有10個(gè)以下氨基酸的肽作為活性成分，它易于合成與制備，因此可以廣泛的各種形式用作藥物組合物。
本說(shuō)明書引用的所有出版物均全文納入部位作為參考。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不難了解，在本文中可作出各種改變和改進(jìn)而不脫離以下權(quán)利要求所公開(kāi)的技術(shù)思想和范圍。本發(fā)明要包括這種改變和改進(jìn)。
序列表<110>慶應(yīng)大學(xué)(Keio University)<120>抑制流感病毒感染，含有對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂GM3具有結(jié)合活性的肽的藥物<130>PH-2026-PCT<140>
<140>
<160>8<170>PatentIn version 2.1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>1Gly Trp Trp Tyr Lys Gly Arg Ala Arg Pro Val Ser Ala Val Ala1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>2Arg Ala Val Trp Arg His Ser Val Ala Thr Pro Ser His Ser Val1 5 10 15<210>3
<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>3Leu Ser Trp Pro Leu His Ala Gly Arg Gly Phe Arg Trp Val Ser1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>4Gly Trp Tyr Ser Ser Arg His Tyr Val Arg Ser Leu Asn Gly Leu1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>5Gln Gln Leu Val Tyr Asn Trp Trp Ala Val Ser Ser Ala Arg Arg1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>6Leu Trp Arg Pro Val Leu Phe His Ser Ala Val Arg Ala Leu Gly1 5 10 15<210>7<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>7Trp Arg Gly Val Tyr Phe Gly Asp Arg Trp Leu Gly Ser Gln Pro1 5 10 15<210>8<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的肽<400>8Ala Arg Leu Ser Pro Thr Met Val His Pro Asn Gly Ala Gln Pro1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種含有唾液酸半乳糖結(jié)合肽作為活性成分的流感病毒感染抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的流感病毒感染抑制劑，其特征在于，所述唾液酸半乳糖結(jié)合肽是神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽。
3.如權(quán)利要求1所述的流感病毒感染抑制劑，其特征在于，含有以下(a)或(b)的唾液酸半乳糖結(jié)合肽作為活性成分(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；(b)具有從SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中刪除、取代或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列并具有神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合活性的肽。
4.如權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其特征在于，所述唾液酸半乳糖結(jié)合肽被烷基化或脂質(zhì)化。
5.如權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其特征在于，所述唾液酸半乳糖結(jié)合肽含在脂質(zhì)體中。
6.如權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其特征在于，所述流感病毒選自甲型、乙型和丙型流感病毒。
7.如權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其特征在于，所述流感病毒是禽流感病毒或豬流感病毒。
8.如權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的流感病毒感染抑制劑，其特征在于，還含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
9.一種預(yù)防或治療流感的方法，包括給予非人動(dòng)物權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述流感病毒抑制劑的步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的預(yù)防或治療流感的方法，其特征在于，所述非人動(dòng)物是鳥或豬。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供一種含有唾液酸半乳糖基結(jié)合肽(例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM3結(jié)合肽)作為活性成分的流感病毒感染抑制劑。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供含有以下(a)或(b)所示唾液酸半乳糖基結(jié)合肽作為活性成分的流感病毒感染抑制劑(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；(b)具有通過(guò)從SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中刪除、取代或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從而得到的氨基酸序列并具有唾液酸半乳糖基團(tuán)結(jié)合活性的肽。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1938041SQ20048004276
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2004年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者佐藤智典 申請(qǐng)人:糖源醫(yī)藥科技有限公司