H9n2亞型禽流感病毒細胞高產(chǎn)疫苗株構建及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物疫苗制備技術領域。具體設及一株H9N2亞型禽流感病毒細胞高產(chǎn) 疫苗株構建及應用。
【背景技術】
[0002] H9N2亞型禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒感染家禽后引起一種傳 染性綜合征，在世界范圍內廣泛傳播，嚴重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展。1966年首次從火雞中檢測 朋N2亞型AIV，此后，AIV在禽類中廣泛傳播流行。1994年，我國首次報道從廣東某雞場中分 離到朋N2亞型AIV，而此后朋N2亞型AIV-直在我國的養(yǎng)禽地區(qū)廣泛傳播。朋N2亞型AIV雖然 屬于低致病性AIV，但是現(xiàn)在研究表明它還可W感染小鼠，雪貂和人類。除此之外，可W引起 禽產(chǎn)蛋率下降、造成免疫抑制、W及激發(fā)其他病毒或細菌的混合或繼發(fā)感染，給我國的養(yǎng)禽 業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。而且H5N1流感病毒的內部基因都有可能構成朋N2的內部基因，運 引起了人們對朋N2禽流感病毒的高度重視。1999年，在中國香港發(fā)生了人感染H9N2亞型AIV 事件。再到2009年12月，香港第7次在人身上檢測出H9N2AIV。運表明，H9N2AIV可W從禽類到 哺乳動物跨越物種障礙進行傳播，從而擴大了宿主范圍。2013年，中國發(fā)生了H7N9禽流感病 毒感染人事件，導致134人感染和45人死亡。到2014年2月23日為止，總共有213人感染66人 死亡。根據(jù)禽流感病毒基因組比對和親緣分析顯示，H7N9病毒的6個基因片段來源于 朋N2AIV。運表明，朋N2有可能成為將來流行的一種病毒，應該引起高度的重視。因此，為了 人類健康和畜牧經(jīng)濟的健康發(fā)展，必須加強對H9N2亞型AIV的防控。
[0003] 接種疫苗，是預防禽流感發(fā)生與傳播最有效的手段。從1878年流感爆發(fā)到現(xiàn)在，雞 胚滅活疫苗一直是預防禽流感發(fā)生的重要的疫苗之一。目前，我國使用的H9N2亞型AIV疫苗 均為雞胚尿囊液滅活疫苗。雞胚是禽流感疫苗生產(chǎn)和研究的主要材料。雖然雞胚滅活苗具 有方便運輸，制備工藝簡單，安全穩(wěn)定等優(yōu)點，但是雞胚培養(yǎng)流感病毒也存在如下許多弊 端：（一)在流感大規(guī)模爆發(fā)的時候，在短期內收集9-10日齡雞胚甚是困難。（二)用雞胚培養(yǎng) 流感病毒，容易產(chǎn)生大量廢棄的雞胚及其病毒的殘留，排放到自然中對環(huán)境危害很大。（Ξ) 受到母源抗體的影響；（四）生產(chǎn)成本高、周期性長等缺點。為了克服禽流感爆發(fā)時大量雞胚 的短缺問題及生產(chǎn)周期長的缺點，通過利用反向遺傳操作技術，改造病毒內部基因，提高 H9N2禽流感病毒在MDCK細胞中的增殖滴度。用細胞培養(yǎng)AIV的方法取代用雞胚生產(chǎn)AIV疫苗 的方法，改變傳統(tǒng)的方法，完善H9N2亞型禽流感疫苗滅活疫苗生產(chǎn)方法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)在使用雞胚培養(yǎng)禽流感病毒的傳統(tǒng)方法，獲得一種在細 胞上穩(wěn)定增殖且具有高病毒滴度的細胞疫苗。
[0005] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0006] 本發(fā)明的H9N2禽流感細胞疫苗的疫苗株的原始分離株H9N2禽流感病毒株A/duck/ Hubei/Wl/2004化9N2)是申請人2004年在湖北某雞場分離得到【參見:Xia〇-化an Xu，Ga〇- Yuan Xu,Hong-Bo Zhou,Zheng-Jun Yu.Evolutionary characterization of influenza virus A/duck/Hubei/Wl/2004(H9N2)isolated from central ChinaVirus Genes.2008Feb;36(l):79-83.Epub 2007NOV 20】；將A/chicken/Hubei/Wl/2004化9N2)中 的8個內部基因片段(其核酸序列已被收錄在NCBI中），分別克隆至轉錄/表達載體PWH2000 上(美國St. Jude兒童研究醫(yī)院胖663*64専±惠贈），構建得到8個質粒。構建W1毒株的內部基 因的載體分別命名為PWH2000-PB2、PWH2000-PB1、PWH2000-PA、PWH2000-NP、PWH2000-NA、 PWH2000-HA、PWH2000-M、PWH2000-NS，將其中命名為PWH2000-HA質粒3,5,8位點的堿基進行 人工突變（突變方向為:G3 一 A3,呪一巧和C8 一 U8)，構建得到一個突變質粒，然后利用反向 遺傳操作技術，將該突變質粒和其余7個內部流感基因片段，將W1其余7個構建好的質粒和 突變質粒共轉染293T+MDCK混合細胞，捶救得到H9N2禽流感病毒突變株W1-HA358，將所述的 H9N2禽流感病突變毒株W1-HA358在MDCK細胞上傳代，獲得高增值滴度并穩(wěn)定細胞適應的毒 株，將其滅活后作為油乳滅活苗檢測其免疫原性，證明構建所得的疫苗株具有良好的免疫 原性。
[0007] 申請人將該細胞適應毒株命名為朋N2亞型禽流感病毒W(wǎng)1-HA358毒株，于2015年6 月11日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，保藏編號為：CCTCC NO: V201522。
[0008] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是；
[0009] (1)本發(fā)明利用禽流感病毒朋N2作為背景，將HA基因的3 '端的3、5、8位點的堿基進 行人工突變，然后捶救并得到突變毒株。該突變毒株在MDCK細胞上具有更好的適應性，提高 了病毒滴度。
[0010] (2)本發(fā)明制備的突變毒株在MDCK細胞上傳代獲得高增殖滴度的細胞適應毒株， 有利于緩解禽流感爆發(fā)時亟需大量雞胚W及雞胚短缺問題。
[0011] 更詳細的技術方案參考見《具體實施方案》所示。
【附圖說明】
[0012] 序列表沈Q ID N0:1是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 HA的DNA序列，序列長度為1472bp。
[0013] 序列表沈Q ID N0:2是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 NA的DNA序列，序列長度為1457bp。
[0014] 序列表沈Q ID N0:3是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 Μ基因的DNA序列，序列長度為1027bp。
[0015] 序列表沈Q ID N0:4是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 NP的DNA序列，序列長度為1565bp。
[0016] 序列表沈Q ID N0:5是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 NS基因的DNA序列，序列長度為89化P。
[0017] 序列表沈Q ID N0:6是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 PA的DNA序列，序列長度為2233bp。
[0018] 序列表沈Q ID N0:7是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 PB1的DNA序列，序列長度為234化P。
[0019] 序列表沈Q ID N0:8是朋N2禽流感分離株A/cMcken/Hubei/Wl/2004化9N2)內部 基因 PB2的DNA序列，序列長度為234化P。
[0020] 序列表SEQ ID N0:9是擴增相關基因的通用引物化il2的DNA序列。
[0021] 序列表SEQ ID N0:10是擴增HA基因（登錄號:DQ465400.1)的引物對的上游引物。
[0022] 序列表SEQ ID N0:11是HA基因（登錄號:DQ465400.1)的引物對的下游引物。
[0023] 序列表SEQ ID N0:12是擴增NA基因（登錄號:DQ465402.1)的引物對的上游引物。
[0024] 序列表SEQ ID N0:13是擴增NA基因（登錄號:DQ465402.1)的引物對的下游引物。
[0025] 序列表沈Q ID N0:14是擴增Μ基因（登錄號:DQ465403.1)的引物對的上游引物。
[0026] 序列表SEQ ID Ν0:15是擴增Μ基因（登錄號:DQ465403.1)的引物對的下游引物。
[0027] 序列表SEQ ID Ν0:16是擴增ΝΡ基因（登錄號:DQ465401.1)的引物對的上游引物。 [002引序列表SEQ ID Ν0:17是擴增ΝΡ基因（登錄號:DQ465401.1)的引物對的下游引物。
[0029] 序列表SEQ ID Ν0:18是擴增NS基因（登錄號:DQ465404.1)的引物對的上游引物。
[0030] 序列表SEQ ID Ν0:19是擴增NS基因（登錄號:DQ465404.1)的引物對的下游引物。
[0031] 序列表SEQ ID Ν0:20是擴增ΡΑ基因（登錄號:DQ465399.1)的引物對的上游引物。
[0032] 序列表SEQ ID Ν0:21是擴增ΡΑ基因（登錄號：DQ465399.1)的引物對對的下游引 物。
[0033] 序列表SEQ ID Ν0:22是擴增ΡΒ1基因（登錄號:DQ465398.1)的引物對的上游引物。
[0034] 序列表SEQ ID Ν0:23是擴增ΡΒ1基因（登錄號:DQ465398.1)的引物對的下游引物。 [00巧]序列表SEQ ID Ν0:24是擴增ΡΒ2基因（登錄號:DQ465397.1)的引物對的上游引物。
[0036] 序列表SEQ ID Ν0:25是