專利名稱：Vero細(xì)胞流感病毒疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種Vero細(xì)胞流感病毒疫苗制備方法，涉及多種流感病毒疫苗株在 Vero細(xì)胞上的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的制備流感疫苗的方法是使用雞胚制備的，國內(nèi)使用雞胚培養(yǎng)疫苗已經(jīng)有 50多年歷史。目前使用的流感疫苗主要是雞胚制備的滅活的流感三價裂解疫苗，包括甲型 流感病毒株、H3N2和乙型流感病毒株以及大流感疫苗(包括H5W等)。疫苗株的來源主要是 由WHO根據(jù)每年全球流感病毒的變化規(guī)律推薦的用于下一年度流感疫苗生產(chǎn)用流感病毒 流行株的表面抗原來確定的，將WHO推薦的流行野毒株與雞胚高產(chǎn)株(A/PR/8/34 (HlNl)) 雙重感染產(chǎn)生重配或反遺傳學(xué)重配，得到的新的疫苗株，在雞胚上具有高產(chǎn)的特性，但雞胚 存在有潛在污染可能，以及潛在的雞胚蛋白引起的變態(tài)反應(yīng)，而且培養(yǎng)周期過長，不易于 控制產(chǎn)量，不利于應(yīng)對大規(guī)模的流感爆發(fā)；如使用SPF級雞胚成本過高；再者流感病毒在 雞胚上傳代易引起變異，而以Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞傳代的流感病毒其抗原性和HAl區(qū)氨 基酸順序幾乎沒有變化。流感病毒在雞胚內(nèi)容易發(fā)生變異，可能是造成禽流感流行的一個 重要原因。為此世界衛(wèi)生組織、美國政府等都鼓勵發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代目前的雞胚培養(yǎng) 技術(shù)來生產(chǎn)流感疫苗。在流感疫苗制備領(lǐng)域內(nèi)許多廠家都進(jìn)行了不屑努力，利用常規(guī)的組織培養(yǎng)技術(shù)， 用已經(jīng)建立MCDCK和Vero細(xì)胞等流感病毒敏感細(xì)胞種子庫，進(jìn)行流感疫苗的研究與生產(chǎn)。 非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)是世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗生產(chǎn)細(xì)胞，屬貼壁依賴和規(guī)定代次 以內(nèi)非致瘤性，現(xiàn)在采用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗主要有狂犬病疫苗、乙型腦炎疫苗、出血熱 疫苗等。Vero細(xì)胞流感疫苗研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)難題是疫苗病毒株在Vero細(xì)胞上快速適應(yīng)，建 立能夠快速培育流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，解決這一關(guān)鍵技術(shù)，為Vero細(xì)胞流感疫苗 的制備打下堅實基礎(chǔ)。病毒純化，即應(yīng)用各種物理、化學(xué)方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿 主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提純出高純度濃縮的病毒樣品。一種好的病毒抗原純化工藝可 以有效去除病毒培養(yǎng)過程中的所帶來的雜蛋白、宿主細(xì)胞DNA、內(nèi)毒素、及其它雜質(zhì)，并且具 有很好的病毒抗原回收率及純度。傳統(tǒng)的病毒類疫苗純化采用蔗糖密度梯度超速離心純化工藝，該工藝需要大型離 心設(shè)備，價格高，上樣量少，花費時間長，去除宿主細(xì)胞DNA效果也不理想，不適合疫苗產(chǎn)業(yè) 化的要求；親和層析方法雖然分離蛋白純度高，但其對分離條件較嚴(yán)格，相對處理能力低， 特別是由于易在表層形成蛋白膠質(zhì)層，阻礙后期樣品滲透，同樣不適合大規(guī)模生產(chǎn)需要。采 用常規(guī)的凝膠過濾層析雖然其條件溫和、重復(fù)性好、便于產(chǎn)業(yè)化，在疫苗純化工藝中被廣泛 采用，但去除雜蛋白和DNA效果并不明顯，所以在疫苗制備純化工藝中只能作為輔助手段。目前國內(nèi)對于Vero細(xì)胞等傳代細(xì)胞的宿主細(xì)胞殘余DNA，嚴(yán)格限制在每劑小于 lOOpg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于WHO和歐盟藥典標(biāo)準(zhǔn)即小于IOng水平，因此應(yīng)用傳統(tǒng)的疫苗工藝很難達(dá)到
3我們國家藥典標(biāo)準(zhǔn)，因此，需要對疫苗純化工藝進(jìn)行創(chuàng)新研究。疫苗收獲液經(jīng)連續(xù)流離心后經(jīng)0. 45-1 μ m柱芯過濾，100KD-500KD膜包超濾濃縮
至適宜血凝滴度。疏水層析疏水柱層析主要是利用病毒在一定硫酸銨濃度下，充分暴露其疏水性， 從而使其能夠結(jié)合在層析柱上，而部分雜蛋白由于疏水性弱，殘余宿主細(xì)胞DNA不具有疏 水性，不能結(jié)合，所以流穿出來，這樣就可以達(dá)到去除雜蛋白及宿主細(xì)胞DNA目的，然后用 凝膠層析或超濾除鹽，減少高鹽對病毒活性的影響
超濾及除鹽通過超濾去除硫酸銨，更換離子交換所使用緩沖液，并進(jìn)行適當(dāng)濃縮。離子交換柱層析利用病毒、雜蛋白和DNA的等電點不同，通過改變緩沖液濃度的 辦法，收集病毒，其操作簡單，對病毒作用溫和，可反復(fù)上樣，上樣量大，適合疫苗產(chǎn)業(yè)化的 要求。超濾濃縮及滅活通過超濾濃縮，再加入β-丙內(nèi)酯滅活。再次離子交換層析進(jìn)一步去除宿主細(xì)胞殘余DNA。超濾及除鹽通過超濾去除鹽類，并進(jìn)行適當(dāng)濃縮，即為疫苗原液。目前尚無文獻(xiàn)報道使用疏水層析方法純化傳統(tǒng)病毒性疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是流感病毒疫苗株利用Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗，通過一系列 純化，制備成季節(jié)性三價流感疫苗和大流感儲備疫苗。本發(fā)明利用流感病毒疫苗株感染Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗。本發(fā)明所述的Vero細(xì)胞流感病毒疫苗，其特征是所述病毒抗原為季節(jié)性流感疫 苗病毒，含有甲1、甲3、乙型流感病毒的當(dāng)年流行株三價抗原，或H5W型病毒流行株抗原。本發(fā)明所述流感疫苗的生產(chǎn)方法，包括下面步驟
1)(Vero)細(xì)胞為培養(yǎng)的單層細(xì)胞，規(guī)定代次以內(nèi)無致瘤性，所述培養(yǎng)液為含小牛血清 的普通細(xì)胞培養(yǎng)基；
2)疫苗病毒液的制備
用非洲綠猴腎Vero單層細(xì)胞經(jīng)洗液沖洗后，加入0. 005-1. O復(fù)合感染量的MOI病毒稀 釋液，(或35-37°C吸附1-4小時)，棄吸附液，補(bǔ)加維持液置32-36°C培養(yǎng)，所述維持液為普 通細(xì)胞培養(yǎng)基或含生長因子的無血清培養(yǎng)基，添加1_6μ g/ml胰酶；所述洗液或含1-6 μ g/ ml胰酶，不超過96小時收獲病毒上清懸液；
3)疫苗病毒液的純化
a)采用杯式或連續(xù)流離心(離心力5000-18000g)，0.45-2. 5 μ m柱芯過濾，100-500KD
膜包超濾濃縮；
b)采用PhenylSepharose 6 Fast Flow (Low Sub)進(jìn)行疏水柱層析超濾濃縮液 加入至終濃度為10-40%硫酸銨后，用10-40%硫酸銨，0. 01-0. 05MPB緩沖液平衡層析柱 1-4個柱體積后上樣，上樣體積以流穿峰達(dá)到一定高度時結(jié)束，然后用10-40%硫酸銨， 0. 01-0. 05MPB緩沖液沖洗至基線，用0. 01-0. 05MPB緩沖液洗脫收集洗脫峰；
c)用超濾除鹽后進(jìn)行及陰離子交換層析，在一定鹽濃度(0.2-1. OM NaCL)下，并經(jīng)該鹽濃度緩沖液平衡后上樣，收集流穿峰，用高鹽(1-4M NaCL)和高濃度Na0H(0. 1-1M)處理再 生；
d)100-500KD膜包超濾濃縮后β -丙內(nèi)酯滅活Μ-48小時，37°C水解2小時(或2_8°C 滅活及水解7-14天)；
e)陰離子交換層析，在(0.2-1. OM NaCL)濃度下緩沖液平衡后，調(diào)樣品鹽濃度(終濃度 0. 2-1. 0 M NaCL)，進(jìn)行離子交換層析，收集流穿峰；
f)100-500KD膜包超濾濃縮，經(jīng)0. 22-0. SOym濾膜澄清過濾即為疫苗原液，或超濾后 裂解，并經(jīng)分子篩及IOKD超濾去除裂解劑后即為疫苗原液。本發(fā)明的積極效果在于對疫苗純化工藝進(jìn)行改進(jìn)，采用疏水層析和離子交換相 結(jié)合的方法，再輔以其它純化方法，可以制備成質(zhì)量合格的病毒性疫苗。


圖1為甲1型流感病毒疫苗宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜； 圖2為甲3型流感病毒疫苗宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜；
圖3為乙型流感病毒疫苗宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜； 圖4為流感病毒裂解疫苗(Vero細(xì)胞)宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜； 圖5為H5N1型禽流感全病毒疫苗(Vero細(xì)胞)宿主殘余DNA含量圖譜。
具體實施例方式
實施例1
甲1型毒種，Who批準(zhǔn)的，所羅門株，A/Solomon/3/06 (HlNl)-，IVR-145,來源于英國 NIBSC，批號Ivr-145，06/234，代次E7 (雞胚代次用E和數(shù)字表示，細(xì)胞用C和數(shù)字表示) Vero單層細(xì)胞，140-145代。將A/Solomon/3/06 (HlNl) E7C0來源于NIBSC毒種感染Vero細(xì)胞和雞胚
進(jìn)行傳代，雞胚傳代后毒種代次為E8Ctl,血凝滴度為640，而Vero細(xì)胞傳代代次為E7C1，血凝 滴度為20-40。將雞胚傳代的E8Ctl代毒種感染Vero細(xì)胞繼續(xù)傳代，細(xì)胞病變達(dá)+++-++++時 收獲，并建立主代種子批(血凝滴度320)和工作種子批(血凝滴度480)，并用于單價疫苗的 制備。225瓶單層Vero細(xì)胞3立升轉(zhuǎn)瓶，細(xì)胞代次145，5日齡，用洗液沖洗細(xì)胞三 遍，加 0. 005-0. IMOI，A/Solomon/3/06 (HlNl)E8C3 工作種子批毒種 37°C吸附 1_4 小時，棄 吸附液，加含1-6微克/ml的普通培養(yǎng)基的維持液，33-36°C繼續(xù)孵育，不超過96小時收獲。 收獲病毒液量約90立升。1)澄清濃縮
病毒收獲液經(jīng)5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，并 經(jīng)0. 02MPBS洗濾后體積為16立升，即為待純化的甲1型流感病毒抗原。2)疏水層析
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質(zhì)，按與水比例為 4 1混勻，充分?jǐn)嚢韬笱b填于層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速沖洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存 2- 小時，用注射用水沖洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖液平衡層析柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨并最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達(dá)到一定高度時結(jié)束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖 液平衡層析柱1-4個體積，上樣后繼續(xù)用平衡液沖洗至基線，然后用PB緩沖液洗脫收集疫 苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6500ml，收集樣品經(jīng)100-500KD超濾除鹽后(收集體 積為3000ml)進(jìn)行離子交換層析。將超濾純化樣品進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān) 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為3700ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為2000ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內(nèi)酯4°C滅 活，48小時后37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān)測。將樣品鹽濃度調(diào) 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 2500ml，用 0. 5-4M NaCL 和 0. I-IM NaOH 處理再生。6)采用100-500KD膜包適當(dāng)超濾濃縮及除鹽，用0. 06-0. 2%Triton-101裂解病毒， 并經(jīng)分子篩kpharose 4 Fast Flow去除裂解劑后即為疫苗原液。收集分子篩第一峰即為病毒峰，并經(jīng)IOKD膜包超濾適當(dāng)濃縮后體積為500ml，并 經(jīng)0. 22-0. 45微米濾膜澄清后即為單價的疫苗原液。7)進(jìn)行血凝素含量、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)含量、宿主殘余DNA含量測定。血凝素含量測定
采用單向免疫擴(kuò)散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時后，干燥、染色、脫色。 準(zhǔn)確測量抗原參考品和供試品形成的沉淀環(huán)直徑，以抗原參考品形成的沉淀環(huán)直徑對其相 應(yīng)抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉淀環(huán)直徑，即可得到樣品的血凝
素含量。宿主細(xì)胞殘余DNA測定采用地高辛標(biāo)記檢測法，利用與標(biāo)準(zhǔn)參考DNA比較確定殘 余DNA含量。蛋白含量測定采用Lowrry法，進(jìn)行測定。實驗結(jié)果
甲1型抗原回收率72.6%
蛋白去除率98.5%
內(nèi)毒素含量原倍合格
血凝素含量92. 5μδ/πι1
宿主細(xì)胞殘余DNA含量小于100pg/ml 宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜見圖1。結(jié)論經(jīng)此工藝純化后，甲1型抗原回收率在70%以上，宿主細(xì)胞殘余DNA含量在 IOOpg以下。實施例2甲 3 型毒種，A/wisconsin/67/2005 (H3N2)-，NYMC-161,來源于 NIBSC，批號06/112， 代次E9
SPF種蛋北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司 37°C生化培養(yǎng)箱中孵育，10日齡。Vero 單層細(xì)胞，140-145 代；
將A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E9C0來源于NIBSC毒種感染雞胚進(jìn)行傳代，雞 胚傳代后毒種代次為EltlCtl,血凝滴度為480，此毒種感染Vero細(xì)胞繼續(xù)傳代，細(xì)胞病變達(dá) +++-++++時收獲，并建立主代種子批(血凝滴度M0)和工作種子批(血凝滴度480)，并用于 單價疫苗的制備。225瓶單層Vero細(xì)胞3立升轉(zhuǎn)瓶，細(xì)胞代次145，5日齡，用洗液沖洗細(xì)胞三 遍，加 0. 01-0. IMOI, A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E10C3 工作種子批毒種 37°C吸附 1-4 小 時，棄吸附液，加含1-6微克/ml的普通培養(yǎng)基的維持液，33-36°C繼續(xù)孵育，不超過96小時 收獲。收獲病毒液量約90立升。3)澄清濃縮
病毒收獲液經(jīng)5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，并 經(jīng)0. 02MPBS洗濾后體積為16立升，即為待純化的甲3型流感病毒抗原。4)疏水層析
采用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質(zhì)，按與水比例 為4 :1混勻，充分?jǐn)嚢韬笱b填于層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速沖洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存 2- 小時，用注射用水沖洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖液平衡層析 柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨并最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達(dá)到一定高度時結(jié)束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖 液平衡層析柱1-4個體積，上樣后繼續(xù)用平衡液沖洗至基線，然后用PB緩沖液洗脫收集疫 苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6300ml，收集樣品經(jīng)100-500KD超濾除鹽后(收集體 積為3500ml)進(jìn)行離子交換層析。將超濾純化樣品進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān) 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為4300ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為1900ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內(nèi)酯4°C滅 活，48小時后37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān)測。將樣品鹽濃度調(diào) 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 2400ml，用 0. 5-4M NaCL 和 0. I-IM NaOH 處理再生。6)采用100-500KD膜包適當(dāng)超濾濃縮及除鹽，用0. 06-0. 2%TritonN-101裂解病 毒，并經(jīng)分子4 Fast Flow或IOKD超濾去除裂解劑后即為疫苗原液。收集分子篩第一峰即為病毒峰，并經(jīng)10KD超濾適當(dāng)濃縮后體積為500ml，并經(jīng) 0. 22-0. 45微米濾膜澄清后即為單價的疫苗原液。
7)進(jìn)行血凝素含量、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)含量、宿主殘余DNA含量測定。血凝素含量測定采用單向免疫擴(kuò)散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時后，干燥、染色、脫色。 準(zhǔn)確測量抗原參考品和供試品形成的沉淀環(huán)直徑，以抗原參考品形成的沉淀環(huán)直徑對其相 應(yīng)抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉淀環(huán)直徑，即可得到樣品的血凝 素含量。宿主細(xì)胞殘余DNA測定采用地高辛標(biāo)記檢測法，利用與標(biāo)準(zhǔn)參考DNA比較確定殘 余DNA含量。蛋白含量測定采用Lowrry法，進(jìn)行測定。實驗結(jié)果
甲3型抗原回收率73.2%
蛋白去除率96.5%
內(nèi)毒素含量原倍合格
血凝素含量93. 2μδ/πι1
宿主細(xì)胞殘余DNA含量 小于100pg/ml 甲3型流感疫苗宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜見圖2。結(jié)論經(jīng)此工藝純化后，甲3型抗原回收率在70%以上，宿主細(xì)胞殘余DNA含量在 IOOpg以下。實施例3
乙型毒種，B/Malaysia/2506/2004,來源于英國NIBSC，批號06/104，代次& SPF種蛋北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司 37°C生化培養(yǎng)箱中孵育，10日齡。Vero 單層細(xì)胞，140-145 代；
將B/Malaysia/^SOe/^OCMEAQ來源于NIBSC毒種感染雞胚和Vero細(xì)胞，血凝 滴度，達(dá)對0，傳代后病毒代次為^Ctl,而Vero細(xì)胞傳代后代次為^C1，血凝滴度達(dá)10。將B/ Malaysia/2506/2004E4C1毒種回傳雞胚，血凝滴度可達(dá)480，再繼續(xù)在Vero細(xì)胞上傳代建立 主代種子批(血凝滴度160)和工作種子批(血凝滴度240)，并用于單價疫苗制備。225瓶單層Vero細(xì)胞3立升轉(zhuǎn)瓶，細(xì)胞代次145，5日齡，用洗液沖洗細(xì)胞三 遍，加0. 1-1. OMOI, B/Malaysia/2506/2004E5C3工作種子批毒種37°C吸附1-4小時，棄吸附 液，加含1-6微克/ml的普通培養(yǎng)基的維持液，33-36°C繼續(xù)孵育，不超過96小時收獲。收 獲病毒液量約110立升。5)澄清濃縮
病毒收獲液經(jīng)5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，并 經(jīng)0. 02MPBS洗濾后體積為16立升，即為待純化的乙型流感病毒抗原。6)疏水層析
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質(zhì)，按與水比例為 4 1混勻，充分?jǐn)嚢韬笱b填于層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速沖洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存2- 小時，用注射用水沖洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖液平衡層析 柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨并最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達(dá)到一定高度時結(jié)束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖 液平衡層析柱1-4個體積，上樣后繼續(xù)用平衡液沖洗至基線，然后用PB緩沖液洗脫收集疫 苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6600ml，收集樣品經(jīng)100-500KD超濾除鹽后(收集體 積為3500ml)進(jìn)行離子交換層析。將超濾純化樣品進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān) 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為4200ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為2000ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內(nèi)酯4°C滅 活，48
小時后37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān)測。將樣品鹽濃度調(diào) 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 ^OOml,用 0. 5-4M NaCL 和 0. I-IM NaOH 處理再生。6)采用100-500KD膜包適當(dāng)超濾濃縮及除鹽，用0. 06-0. 2%Triton N-101裂解病 毒，并經(jīng)分子4 Fast Flow或IOKD超濾去除裂解劑后即為疫苗原液。收集分子篩第一峰即為病毒峰，并經(jīng)10KD適當(dāng)濃縮體積為400ml，并經(jīng) 0. 22-0. 45微米濾膜澄清后即為單價的疫苗原液。7)進(jìn)行血凝素含量、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)含量、宿主殘余DNA含量測定。血凝素含量測定采用單向免疫擴(kuò)散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時后，干燥、染色、脫色。 準(zhǔn)確測量抗原參考品和供試品形成的沉淀環(huán)直徑，以抗原參考品形成的沉淀環(huán)直徑對其相 應(yīng)抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉淀環(huán)直徑，即可得到樣品的血凝 素含量。宿主細(xì)胞殘余DNA測定采用地高辛標(biāo)記檢測法，利用與標(biāo)準(zhǔn)參考DNA比較確定殘 余DNA含量。蛋白含量測定采用Lowrry法，進(jìn)行測定。實驗結(jié)果
乙型抗原回收率70.4%
蛋白去除率96.
內(nèi)毒素含量原倍合格
血凝素含量90. 6μδ/πι1
宿主殘余DNA含量小于100pg/ml
乙型流感疫苗宿主殘余DNA含量圖譜見圖3。結(jié)論經(jīng)此工藝純化后，乙型抗原回收率在70%以上，宿主殘余DNA含量在IOOpg 以下。
實施例4
經(jīng)上述3個實施例制備的實驗性裂解疫苗單價原液試驗結(jié)果如下 甲 1 型 A/Solomon/3/06 (HlNl)血凝素含量 92. 5μδ/πι1 原液體積為 500ml 甲 3 型 A/wisconsin/67/2005 (H3N2)血凝素含量 93. 2μδ/πι1 原液體積為 500ml 乙型B/Malaysia/2506/2004血凝素含量90. 6μδ/πι1原液體積為400ml
為了制備季節(jié)性流感病毒裂解三價疫苗，需將三型裂解病毒液按1 1 1配比合并，各 取三型病毒裂解原液300ml，配制成三價的流感裂解疫苗半成品，并進(jìn)行全面檢測。實驗結(jié)果如下
內(nèi)毒素含量小于30EU/0. 5ml
血凝素含量 甲 1 型 30. 84μδ/πι1，甲 3 型 30. 60μδ/πι1，乙型 30. 02μδ/πι1
宿主細(xì)胞殘余DNA含量小于100pg/0. 5ml
流感裂解疫苗(Vero細(xì)胞)宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜見圖4。結(jié)論經(jīng)此工藝制備的流感裂解疫苗(Vero細(xì)胞)經(jīng)實驗室檢測血凝素含量合格， 宿主細(xì)胞殘余DNA含量符合《中華人民共和國藥典》2010版三部標(biāo)準(zhǔn)。實施例5
H5N1 型毒種，A/Vietnam/1194/2004 (NIBRG-14)來源于英國 NIBSC，批號09/184，代次
E3
SPF種蛋北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司 37°C生化培養(yǎng)箱中孵育，11日齡。Vero 單層細(xì)胞，140-146 代。將 A/Vietnam/1194/2004 (NIBRG-14)來源于 NIBSC 毒種感染雞胚，一代雞 胚血凝滴度，達(dá)320，傳代后病毒代次為^Cci,再傳Vero細(xì)胞后代次為^C1，血凝滴度達(dá)160。 再繼續(xù)在Vero細(xì)胞上傳代建立主代種子批(血凝滴度M0)和工作種子批(血凝滴度320)， 并用于人用禽流感疫苗制備。225瓶單層Vero細(xì)胞3立升轉(zhuǎn)瓶，細(xì)胞代次145，5日齡，用洗液沖洗細(xì)胞三 遍，加 0. 01-0. IMOI, A/Vietnam/1194/2004 (NIBRG-14)工作種子批毒種 37°C吸附 1-4 小 時，棄吸附液，加含1-6 μ g/ml的普通培養(yǎng)基的維持液，33-36°C繼續(xù)孵育，不超過96小時收 獲。收獲病毒液量約90立升。7)澄清濃縮
病毒收獲液經(jīng)5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，并 經(jīng)0. 02MPBS洗濾后體積約為16立升，即為待純化的H5W型流感病毒抗原。8)疏水層析
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質(zhì)，按與水比例為 4 1混勻，充分?jǐn)嚢韬笱b填于層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速沖洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存 2- 小時，用注射用水沖洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖液平衡層析 柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨并最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達(dá)到一定高度時結(jié)束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩沖 液平衡層析柱1-4個體積，上樣后繼續(xù)用平衡液沖洗至基線，然后用PB緩沖液洗脫收集疫苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6400ml，收集樣品經(jīng)100-500KD超濾除鹽后(收集體 積為3900ml)進(jìn)行離子交換層析。將超濾純化樣品進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān) 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為4600ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為2000ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內(nèi)酯4°C滅 活，48
小時后37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監(jiān)測。將樣品鹽濃度調(diào) 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩沖液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 1500ml，用 0. 5-4M NaCL 禾口 0. I-IM NaOH 處理再生。6)采用100-500KD膜包適當(dāng)超濾濃縮及除鹽，收集膜上液體積為2100ml，并經(jīng) 0. 22-0. 45微米濾膜澄清后即為疫苗原液。7)進(jìn)行血凝素含量、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)含量、宿主殘余DNA含量測定。血凝素含量測定采用單向免疫擴(kuò)散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時后，干燥、染色、脫色。 準(zhǔn)確測量抗原參考品和供試品形成的沉淀環(huán)直徑，以抗原參考品形成的沉淀環(huán)直徑對其相 應(yīng)抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉淀環(huán)直徑，即可得到樣品的血凝 素含量。宿主細(xì)胞殘余DNA測定采用地高辛標(biāo)記檢測法，利用與標(biāo)準(zhǔn)參考DNA比較確定殘 余DNA含量。蛋白含量測定采用Lowrry法，進(jìn)行測定。實驗結(jié)果
H5m型抗原回收率71.8%
蛋白去除率98.7%
內(nèi)毒素含量原倍合格
血凝素含量26. 52μδ/πι1
宿主殘余DNA含量小于100pg/ml
H5N1型禽流感全病毒疫苗(Vero細(xì)胞)宿主細(xì)胞殘余DNA含量圖譜見圖5。結(jié)論經(jīng)此工藝純化后，H5W型抗原回收率在70%以上，宿主細(xì)胞殘余DNA含量小 于 IOOpg0
權(quán)利要求
1.利用流感病毒疫苗株感染Vero細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗。
2.依據(jù)權(quán)利1要求所述的Vero細(xì)胞流感病毒疫苗，其特征是所述病毒抗原為季節(jié)性 流感疫苗病毒，含有甲1、甲3、乙型流感病毒的當(dāng)年流行株三價抗原，或H5W型病毒流行株 抗原。
3.權(quán)利要求1或2所述流感疫苗的生產(chǎn)方法，包括下面步驟1)Vero細(xì)胞為培養(yǎng)的單層細(xì)胞，規(guī)定代次以內(nèi)無致瘤性，所述培養(yǎng)液為含小牛血清的 普通細(xì)胞培養(yǎng)基；2)疫苗病毒液的制備用非洲綠猴腎Vero單層細(xì)胞經(jīng)洗液沖洗后，加入0. 005-1. O復(fù)合感染量的MOI病毒維 持液，或加入病毒稀釋液35-37°C吸附1-4小時，棄吸附液，補(bǔ)加維持液置32-36°C培養(yǎng)；所 述維持液為普通細(xì)胞培養(yǎng)基或含生長因子的無血清培養(yǎng)基，添加1_6μ g/ml胰酶；所述洗 液或含1-6 μ g/ml胰酶，不超過96小時收獲病毒上清懸液；3)疫苗病毒液的純化a)采用杯式或連續(xù)流離心(離心力5000-18000g)，0.45-2. 5 μ m柱芯過濾，300-500KD膜包超濾濃縮；b)采用PhenylSepharose 6 Fast Flow (Low Sub)進(jìn)行疏水柱層析超濾濃縮液 加入至終濃度為10-40%硫酸銨后，用10-40%硫酸銨，0. 01-0. 05MPB緩沖液平衡層析柱 1-4個柱體積后上樣，上樣體積以流穿峰達(dá)到一定高度時結(jié)束，然后用10-40%硫酸銨， 0. 01-0. 05MPB緩沖液沖洗至基線，用0. 01-0. 05MPB緩沖液收集洗脫峰；c)用分子篩或超濾除鹽后進(jìn)行陰離子交換層析，在一定鹽濃度(0.2-1. OM NaCL)下，并 經(jīng)該鹽濃度緩沖液平衡后上樣，收集流穿峰，用高鹽(1-4M NaCL)和高濃度Na0H(0. 1-1M) 處理再生；d)300-500KD膜包超濾濃縮后β -丙內(nèi)酯滅活Μ-48小時，37°C水解2小時(或2_8°C 滅活及水解7-14天)；e)陰離子交換層析，在(0.2-1. OM NaCL)濃度下緩沖液平衡后，調(diào)樣品鹽濃度(終濃度 0. 2-1. 0 M NaCL)，進(jìn)行離子交換層析，收集流穿峰；f)100-500KD膜包超濾濃縮，經(jīng)0. 22-0. SOym濾膜澄清過濾即為疫苗原液，或超濾后 裂解，并經(jīng)分子篩或IOKD超濾去除裂解劑后即為疫苗原液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種Vero細(xì)胞流感病毒疫苗制備方法，對疫苗純化工藝進(jìn)行改進(jìn)，采用疏水層析和離子交換相結(jié)合的方法，再輔以其它純化方法，可以制備成質(zhì)量合格季節(jié)性三價流感疫苗和大流感儲備疫苗。
文檔編號A61P31/16GK102078605SQ20101060553
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者于洪濤, 周慶玲, 岳振齊, 張瑩, 李光譜, 李淑蘭, 胡曉明, 董喚, 郭巖 申請人:吉林亞泰生物藥業(yè)股份有限公司