專利名稱：一種用mdck細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用哺乳動物細(xì)胞獲得流感病毒疫苗毒株制備方法，特別涉及一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒毒株的方法。
背景技術(shù)：
流感病毒是威脅人類健康的重大傳染病之一，主要通過呼吸道傳播，具有傳播速度快，致死率高及快速變異的特點(diǎn)，在人類歷史上多次發(fā)生過多次全球范圍的流感大流行。 流感病毒分為A，B，C(又稱甲、乙、丙)三型。其中A型病毒容易發(fā)生變異，依其兩種主要抗原(HA，NA)的不同，區(qū)分為不同的亞型?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)一共有15種HA(H1-H15)及9種NA(N1_N9) 亞型。B型病毒的變異比較緩慢，C型病毒甚少對人類造成威脅。疫苗免疫仍是目前預(yù)防控制流感流行的行之有效的手段，臨床上應(yīng)用的是用雞胚生產(chǎn)的三價滅活疫苗。早在20世紀(jì)30年代，流感的滅活疫苗就開展了動物實驗研究。1941 年雞胚培養(yǎng)的流感疫苗在美國首次獲得批準(zhǔn)。目前應(yīng)用的流感疫苗為三價滅活疫苗包括 Hmi、H3N2、B型。但是經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用表明，滅活的流感病毒疫苗的效果基本上是肯定的，但也有不理想的地方，主要由于1、疫苗株與當(dāng)前流行的毒株不匹配，因為疫苗的生產(chǎn)需要經(jīng)過疫苗株的篩選和制備階段，耗時的特點(diǎn)限制了它的合理時效；2、雞胚供應(yīng)和生長活性的限制，導(dǎo)致流感病毒的低產(chǎn)值；3、部分接種者對雞胚蛋白過敏，甚至危及到生命。近年來流感病毒全球流行有愈演愈烈之勢，對流感病毒疫苗的需求日趨增加。在研發(fā)的非雞胚培養(yǎng)的新型流感疫苗中利用哺乳動物細(xì)胞(主要是MDCK細(xì)胞) 代替雞胚培養(yǎng)病毒，可以達(dá)到降低成本，減少過敏反應(yīng)，培養(yǎng)后的病毒株更接近自然分離的病毒(即病毒的抗原性保持不變)的特點(diǎn)。而且經(jīng)過試驗表明，MDCK被連續(xù)傳代100代， 每代均做鼠的成瘤性實驗結(jié)果陰性，證明該細(xì)胞系不具備致瘤性，用于疫苗生產(chǎn)也是安全可靠的。傳統(tǒng)上利用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)新型流感疫苗毒株是利用弱毒株與當(dāng)前流行的毒株進(jìn)行基因重配獲得，而弱毒株疫苗的生產(chǎn)要有冷適應(yīng)毒株與流行毒株重配的步驟，通過免疫壓力篩選大約需要1-2個月的時間才能獲得重組毒株，而在疫苗的生產(chǎn)過程中，疫苗生產(chǎn)周期的長短決定了對流感病毒變異的反應(yīng)能力，也直接決定了疫苗的質(zhì)量，因此能否在較短的周期內(nèi)制備高產(chǎn)的毒株成為疫苗生產(chǎn)過程中亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種制備周期短，只需一周左右時間，具有高產(chǎn)特性的流感病毒疫苗毒株的制備方法。本發(fā)明的解決方案是一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，包括以下步驟步驟一對流感病毒毒株進(jìn)行篩選，選取5 50株原始毒株行10-3-10-4稀釋，取 200 μ L-1000 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細(xì)胞上，放置在(X)2培養(yǎng)箱中1 2個小時，等到病毒完全吸附后取出，在M 72小時之間加入濃度為1 y g/ml-4 U g/ml TPCK胰酶顯 微鏡下觀察細(xì)胞病變(〔？幻，當(dāng)細(xì)胞病變(cpm呈“冊”時，收獲病毒；步驟ニ 用50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落監(jiān)測方法(PFU 法)來檢測和計算病毒株的毒ヵ；步驟三提取流感病毒基因組RNA ；步驟四RT-PCR擴(kuò)增流感病毒各基因節(jié)段；步驟五對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；步驟六用氯化韓法制備感受態(tài)宿主菌；步驟七制備質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶體系，此體系包括IOX限制性內(nèi)切酶緩沖液 1 y 1-2 U 1lOX乙?；疊SA(lmg/ml) Iu l-2u 1質(zhì)粒0嫩0.2ug-1.0ug限制性內(nèi)切酶2U-4U滅菌去離子水10ia-20iU;步驟八0嫩片段回收；步驟九制備以下體系進(jìn)行連接反應(yīng)，5XT4DNA Ligase Buffer 2u l-4u 1PGEM-3ZF 載體(50ng/ U 1) 1 U 1-2 U 1PCR 產(chǎn)物(經(jīng)純化)2 U 1-5 U 1T4DNA Ligase0. 5 U 1-1 U 1去離子水5 U 1-8 U 1步驟十提取質(zhì)粒小量；步驟^^一將PCR擴(kuò)增的片段克隆到pGEM-3zf 載體的Sma 1酶切位點(diǎn)中，采用八81 PRISMTM 377XL DNA %9じ61106『進(jìn)行測序，從而確定高產(chǎn)毒株的基因序列；步驟十ニ 利用Vector NTI軟件進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)序列的對比，利用DNASTAR軟 件進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯分析。所述步驟ー中優(yōu)選10株原始毒株行10_3-10_4稀釋，取500 U L稀釋液接種在成片 生長的1 0(細(xì)胞上，放置在0^培養(yǎng)箱中1個小時，等到病毒完全吸附后取出，在48小時之 間加入濃度為2 U g/mlTPCK胰酶顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPm，當(dāng)細(xì)胞病變(CP^呈“冊” 時，收獲病毒。所述步驟ニ中優(yōu)選用50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)方法來檢測和計算病毒株的 母カ。所述50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)方法是將病毒株行倍比稀釋，接種對孔板，鋒 稀釋度設(shè)置平行4個復(fù)孔，鋒孔加入200 Uし稀釋液，35"C CO2培養(yǎng)箱孵育1小時后用Hank’ s 液洗ー遍，然后加入含終濃度2 U g/mlTPCK胰酶的維持液3ml后置35でCO^培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并 于感染后M，48，72小時再分別加入終濃度2ilg/mlTPCK胰酶，促進(jìn)病毒增埴，在感染后的 72小時收獲病毒。所述步驟三中提取流感病毒基因組8離方法為取10011し病毒液，加入 l 5mLEppendorf管中，然后加入 500ilL Lysis BufferRLT、0-巰基乙醇、60011し 70%乙醇，混勻，吸出600 μ L混合液進(jìn)行離心，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。所述步驟四中RT-PCR擴(kuò)增流感病毒各基因節(jié)段，選用病毒反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT-PCR System對模板RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或Pfu DNAPolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述步驟五中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化的方法是通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒，把純化柱放置在2mL收集管上，將PCR產(chǎn)物混同5倍體積的PB Buffer,進(jìn)行離心收集，然后加40 μ L 雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。所述步驟六中用氯化鈣法制備感受態(tài)宿主菌的方法為取DH5CI單菌落，接種無抗菌素LB培養(yǎng)液，振搖培養(yǎng)，當(dāng)至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養(yǎng)，于冰上預(yù)冷10 分鐘，離心后加入滅菌甘油，混勻，分裝于Eppendorf管中，貯于低溫冰箱中。所述步驟八中DNA片段回收的方法為采用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)生的線形化載體DNA進(jìn)行回收。所述步驟十中提取質(zhì)粒小量的方法為取單菌落于5ml含氨芐青霉素(IOOg/ ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，離心后將沉淀懸浮于150μ 1溶液I(50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，lOmmol/LEDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配制 20 μ 1 溶液 II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴 10 分鐘；加入 150 μ 1 預(yù)冷的溶液 III (3. Omol/L KCl，ρΗ4. 8)，混勻，冰浴10分鐘，再次離心，用70%乙醇洗滌沉淀一次，干燥后加入50 μ 1含 RNA 酶 Οθμ /ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，ρΗ8· 0)，37°C 水浴 30 分鐘。本發(fā)明的流感疫苗毒株制備方法是建立在流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上的，方便體外對病毒基因的操作，在無輔助病毒存在的情況下，完全由質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的形式獲得疫苗病毒株，達(dá)到周期短，產(chǎn)量高的效果。流感病毒MDCK細(xì)胞高產(chǎn)株反向遺傳技術(shù)平臺的建立，其方法步驟如下1、流感病毒真核表達(dá)載體的構(gòu)建以質(zhì)粒pHH21為模板，擴(kuò)增出一段全長27^pDNA產(chǎn)物。該序列含有225bp人源RNA polymerase I啟動子和33bp鼠源RNApolymerase I終止子。PCR產(chǎn)物兩端引入Avr II和 HindIII酶切位點(diǎn)。引物設(shè)計如下AAG CTTPl :5’ -GTG-----CGG AGT ACT GGT CGA CCT CCG AAG-3’HindIIICCT AGGP2 5' -ATC-----GGC GGC CGG GAG GGC GT-3'Avr IIPCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72 "C 200秒，共30個循環(huán)；72°C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測，與目的片段大小相符，純化PCR產(chǎn)物備用。將上述PCR產(chǎn)物用Avr II和HindIII雙酶切，質(zhì)粒載體pcDNA3. 1 (+)用Xba I和 HindIII雙酶切，純化回收相應(yīng)片段；體外連接質(zhì)粒載體與目的基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選陽性克隆，酶切鑒定正確后送測序；測序結(jié)果與目的基因相符，命名載體為PIVV II ；2、流感病毒反向遺傳8質(zhì)粒及6+2質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建將構(gòu)建成功的PIVV II質(zhì)粒載體用BSMBl酶切線性化，然后用Qiagen回收試劑盒回收線性化的PIVV II片段。同樣，將連接到PGEM-T載體的目的基因片段用BSMBI酶切，回收目的片段。將A/CNIC/246/00(Hmi)的1-8節(jié)段分別連接到PIVV II載體上，體系為 3 μ 1目標(biāo)片段，1 μ 1載體，1 μ 1T4DNA連接酶15 μ lddH20,從而得到連接產(chǎn)物PIVV II-AX 系列8質(zhì)粒。另外將甲1亞型流行代表株A/滬防/7/99的HA，NA基因片段擴(kuò)增，依上述方法克隆入PIW II。替代pIVV II-AX系列中的HA，NA質(zhì)粒，構(gòu)成6+2系列。3、轉(zhuǎn)化將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)菌(Sure菌)中，42°C熱休克60秒，冰浴5分鐘， 37°C震蕩(轉(zhuǎn)速小于200轉(zhuǎn)/分鐘)45分鐘，離心，取沉淀涂布抗性平板，37°C孵育過夜，次日挑單菌落接種于5ml含抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩過夜后小提質(zhì)粒。4、酶切鑒定用內(nèi)切酶鑒定目標(biāo)序列是否與載體相連，實驗條件參照相關(guān)酶的使用說明。5、質(zhì)粒的大量制備(聚乙二醇沉淀法)挑取單菌落接種5ml含氨芐青霉素(lOOug/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接200ml含氨芐青霉素(lOOug/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)12-16小時，5000rpm離心15分鐘，棄上清；重懸細(xì)菌于IOOml冰預(yù)冷STE (0. Imol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA PH8. 0)。5000rpm 離心 15 分鐘，收集細(xì)菌；IOml 溶液 1 (50mmol/ L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCL, IOmmo 1/L EDTAPH8. 0)重懸細(xì)菌，混勻，冰浴10分鐘；加入20ml新配置的溶液2(0. 2mol/L NaOH 1 % SDS)，混勻，冰浴10分鐘；加入15ml預(yù)冷的溶液3 (3. Omol/L KCL, PH4. 8)，混勻，冰浴10分鐘；IOOOOrpm離心15分鐘，棄沉淀；加入等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，-20°C沉淀1小時；IOOOOrpm離心15分鐘，棄上清，干燥； 3ml TE(10mmol/L Tris-HCL, lmmol/L EDTA, PH8. 0)溶解沉淀，再加入 3ml 冰預(yù)冷的 5mol/ L LiCl溶液，充分混勻，IOOOOrpm離心15分鐘，棄沉淀；上清中加入等體積冰預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，IOOOOrpm離心15分鐘，棄上清，干燥沉淀；用500 μ 1含RNA酶(20 μ g/ml) 的TE(10mmol/L EDTA, ρΗ8· 0)溶解沉淀，轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，室溫放置30分鐘；加入 500μ 1含13%聚乙二醇8000的1.6mol/L NaCl，充分混勻，_20°C沉淀2小時，于臺式離心機(jī)上12000rpm離心10分鐘，棄上清；400 μ 1 ΤΕ(ρΗ8. 0)溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；轉(zhuǎn)移水相于新的Eppendorf管，加100 μ 1 10Μ乙酸銨，充分混勻，加2倍體積乙醇，-20°C沉淀1小時，12000rpm離心10分鐘。70%冰預(yù)冷乙醇洗滌沉淀一次，晾干；50 μ 1 ΤΕ(ρΗ8. 0)溶解沉淀，儲存于_20°C冰箱備用。6、轉(zhuǎn)染將四31~細(xì)胞培養(yǎng)在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。80%成片后，將8個質(zhì)粒DNA各取Iyg 共8 μ g與20 μ 1LF2000混合在室溫放置45分鐘，然后加入到培養(yǎng)板內(nèi)。6小時后，用 optim-MEM維持液在33°C孵箱中繼續(xù)孵育，分別收獲M小時，48小時和72小時的細(xì)胞培養(yǎng)上清接種MDCK細(xì)胞，維持液中含TPCK-Trypsin至終濃度1 μ g/ml。7、重配病毒單向血凝抑制實驗鑒定首先RDE處理標(biāo)準(zhǔn)參照血清，然后制備用于血凝抑制試驗的4個血凝單位的抗原。 具體實施單向血凝抑制實驗的步驟加PBS或生理鹽水25 μ 1于96孔板的第B行至H行的每一孔。加1 10稀釋的經(jīng)受體破壞酶處理過的標(biāo)準(zhǔn)血清50 μ 1于A行的每一孔。用多通道移液器從A行各孔取25 μ 1血清，倍比稀釋至H排各孔，最后25 μ 1棄去。取25 μ 1被檢病毒的4個血凝單位抗原加至相應(yīng)一排各孔，混勻，室溫靜置15-30min，所有孔中加50 μ 1的紅血球(0. 5%雞紅細(xì)胞或0. 75%豚鼠紅細(xì)胞)，室溫靜置30-60min(雞血球30min ；豚鼠血球60min)后觀察結(jié)果。結(jié)果判定血凝被完全抑制的血清最大稀釋度的倒數(shù)為血凝抑制試驗的終點(diǎn)，該孔稀釋度即為HI實驗的效價。8,6+2重配病毒的基因型鑒定收獲重配病毒，依第一章實驗方法所述提取病毒核酸，應(yīng)用甲1亞型特異性引物作RT-PCR，用QIAGEN公司的試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后測定DNA序列，結(jié)果提交NCBI比對。
具體實施例方式結(jié)合具體實施列進(jìn)行說明。實施例1通過以下步驟用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)Hmi毒株1、高產(chǎn)Hmi毒株的篩選將10株備選毒株Hmi (經(jīng)MDCK細(xì)胞分離，病毒滴度彡1 160的原始毒株)行 10_3，10_4稀釋。取500 μ L病毒稀釋液接種成片生長的MDCK細(xì)胞05cm2培養(yǎng)瓶)，細(xì)胞記數(shù)約3-4X 106，接種前細(xì)胞用Hank，s液洗兩遍。正常MDCK細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)密度為3-4X106， 病毒的接種量MOI為1X10_4TCID50/細(xì)胞和X10_5TCID50/細(xì)胞。維持液中含有TPCK胰酶，并于感染后的對，48小時分別加入，使TPCK胰酶的終濃度達(dá)到1 μ g/ml。置于35°C CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于感染后72小時或96小時收獲病毒，測定病毒血凝滴度。置35°C CO2培養(yǎng)箱1小時，待病毒完全吸附后，棄感染液，用Hank's液洗一遍。每瓶細(xì)胞加入含終濃度2 μ g/ml TPCK胰酶的細(xì)胞維持液:3ml，置35°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。并于感染后M，48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶，促進(jìn)病毒增殖。細(xì)胞感染后48 小時，鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)。當(dāng)CPE呈冊時，收獲病毒。病毒滴度測定，采用紅細(xì)胞凝集實驗，計算血凝單位。2、Hmi毒株的毒力檢測TCID50檢測和計算將Hmi毒株行倍比稀釋，接種M孔板，每稀釋度設(shè)置平行4 個復(fù)孔。每孔加入200 μ L稀釋液，35°C CO2培養(yǎng)箱孵育1小時后用Hank’ S液洗一遍。然后加入含終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶的維持液3ml后置35°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。并于感染后24， 48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶，促進(jìn)病毒增殖。在感染后的72小時收獲病毒。-80°C冰箱凍存，待血凝滴度的測定。PFU檢測將Hmi毒株進(jìn)行倍比稀釋，接種于小方瓶，每小方瓶加入500 μ L病毒稀釋液，33°C孵育1小時后，用HANKS液沖洗，然后加入第一層覆蓋液，33°C孵育72小時后加入第二層覆蓋液，24小時后計數(shù)空斑。3、HlNl病毒基因組RNA的提取取10(^1^病毒液，加入1.51111^ 611(10什管中，然后加入50(^1^ Lysis Buffer RLT、β -巰基乙醇、600 μ L 70%乙醇，混勻，吸出600微升混合液轉(zhuǎn)入帶吸附柱的離心管中，12000rmp離心15秒，棄離心液。將上部剩余的其它液體再此上柱離心。12000rmp離心 15秒,棄離心液。向柱內(nèi)力口入700yL Washing Buffer冊1，12000rmp離心15秒，棄離心液。將柱子移到新的收集管上，加入500 μ L WashingBuffer RPE，12000rmp離心15秒，棄離心液。再于柱子上加入500 μ L Washing Buffer RPE，13000_14000rmp離心2分鐘。將柱子移到一無^ia se污染的Eppendorf管上，加入40 μ LDEPC處理的水，室溫放置1_3分鐘，12000rmp離心1分鐘，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。4、RT-PCR擴(kuò)增流感病毒各基因節(jié)段使用GIBCO BRL公司的病毒反轉(zhuǎn)錄試劑盒THERMOSCRIPT RT-PCRSystem對模板 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取一只無Rnase，無Dnase的Eppendorf管，依次加入RNA 模板5 μ L引物 F QOpM) 1 μ LddH204 μ L混勻后，在90°C水浴中加熱3分鐘，置于冰浴3分鐘使之迅速冷卻。然后加入cDNA Buffer 4 μ LDEPC-water 1 μ L0. IM DTT1 μ LRnase OUT1 μ LdNTPs2 μ LRT1 μ L60°C作用1小時，85°C 5分鐘，然后置冰上。加foiaseH 1 μ L 37°C作用30分。即為反轉(zhuǎn)錄好的cDNA。此步反應(yīng)由通用引物完成全部8個基因節(jié)段的反轉(zhuǎn)錄。使用STRATAGENE 公司 Pfu DNA Polymerase 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5μ LdNTPs1 μ LPrimer F(20pM) 1 μ LPrimer R(20pM) 1 μ LPfu 酶(5U/ μ L) 1 μ LcDNA2 μ LddH2040 μ LTotal50 μ LPCR反應(yīng)條件94 °C預(yù)變性5分鐘94°C30 秒55°C30 秒72 "C 420 秒；共 30 個循環(huán)72 °C延伸5分鐘5、PCR產(chǎn)物的純化采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，具體步驟如下把純化柱放置在aiiL收集管上，將PCR 產(chǎn)物混同5倍體積的PB Buffer，上柱，13000rmp離心45秒，棄離心液。向純化柱中加 750 μ L的PE Buffer, 13000rmp離心45秒，棄離心液。以同樣的速度再離心1分鐘充分去除洗液。將柱子放在一支干凈的Eppendorf管上，加40 μ L雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。 13000rmp離心1分鐘收集離心液，_20°C保存。
6、用氯化鈣法感受態(tài)宿主菌的制備取DH5ci單菌落，接種無抗菌素LB培養(yǎng)液，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日按1 100轉(zhuǎn)入新的LB中繼續(xù)培養(yǎng)2小時左右，至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養(yǎng)。于冰上預(yù)冷10分鐘，4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；以IOml冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸細(xì)胞，放置于冰浴中20分鐘；4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；按每50ml培養(yǎng)物加入2ml 冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2的比例重懸細(xì)胞沉淀，再加入15%體積滅菌甘油，混勻，分裝于 Eppendorf管中，貯于_70°C低溫冰箱中備用。7、質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶消化取一滅菌Eppendorf管，依次加入限制性內(nèi)切酶緩沖液、乙?；疊SA、質(zhì)粒DNA、限制性內(nèi)切酶，并以滅菌的去離子水補(bǔ)充至所需體積。以20 μ 1總反應(yīng)體系為例IOX限制性內(nèi)切酶緩沖液2μ1IOX 乙?；?BSA(lmg/ml) 2μ 1質(zhì)粒DNAΙ.ΟμΙ限制性內(nèi)切酶4U滅菌去離子水補(bǔ)充至20 μ 1混勻，于離心機(jī)上快速離心5秒，將反應(yīng)管至于37°C水浴保溫1-4小時。8、DNA片段回收采用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)生的線形化載體DNA進(jìn)行回收，方法如下將待回收的DNA片段經(jīng)電泳分離后，在長波紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA 片段，轉(zhuǎn)移到1. 5mlEppendorf管中，于天平上稱量，然后用1個吸頭搗碎，動作輕柔；加入60 μ 1 Ll Buffer,在50°C水浴中加熱15min，每!Bmin搖動1次，使瓊脂糖完全融化。將液體轉(zhuǎn)入吸附柱中，放在套管上，13000rpm離lmin;倒掉套管中的液體，向吸附柱中加入 500 μ 1 Ll Buffer，，室溫下放置lmin，1300rpm離Imin ；棄去套管中的液體，向吸附柱中加入700μ1 L2 Buffer，室溫下放置5min，13000rpm離Imin ；棄去管中的液體，再以1300rpm 離Imin ；將吸附柱放于1. 5mlEppendorf管中，加入30μ 1去離子水(或TE溶液，IOmmol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA，ph8. 0)，室溫下放置 lmin，13000rpm 離心 2min，所得液體中即含有回收的DNA片段，置于-20°C保存。9、連接反應(yīng)體系的制備與轉(zhuǎn)化按下列體系進(jìn)行連接反應(yīng)5XT4DNA Ligase Buffer4μ 1PGEM-3ZF 載體(50ng/ μ 1)2 μ 1PCR產(chǎn)物(經(jīng)純化)5 μ 1T4DNA Ligase1 μ 1去離子水8μ1 混合均勻后，于4°C連接過夜。取上述連接產(chǎn)物5 μ 1，加入到100 μ 1 DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，置冰浴上45min后，42°C熱休克2min，再置于冰浴上2min，加入無抗生素的LB培養(yǎng)液400 μ 1，37°C搖床振搖Ih后，取100 μ 1菌液，向其中加入40 μ 1 120mg/ml 5，-溴-4 氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4μ 120mg/ml異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混勻后涂布含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB平板，37°C培養(yǎng)12_16h，挑取白色菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。10、提取質(zhì)粒小量取單菌落于5ml含氨芐青霉素(100g/ml)的LB培養(yǎng)基中，37 ！振蕩培養(yǎng)過夜， 取1. 5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm離心1分鐘，棄上清，沉淀懸浮于150 μ 1溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配制20 μ 1溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴10分鐘；加入150 μ 1預(yù)冷的溶液 III (3. Omol/L KCl, ρΗ4· 8)，混勻，冰浴10分鐘· 12000rpm5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管， 加等體積酚/氯仿抽提；轉(zhuǎn)移上層相至新的離心管，再用等體積氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積無水乙醇，混勻，_20°C沉淀30分鐘，12000離心5分鐘。70%乙醇洗滌沉淀一次， 干燥后加入 50 μ 1 含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，pH8.0)， 37°C水浴30分鐘，_20°C保存?zhèn)溆谩?1、將PCR擴(kuò)增的片段以平端連接的方式克隆到pGEM-3zf載體的Sma I酶切位點(diǎn)中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer進(jìn)行測序。為了保證病毒基因組中的點(diǎn)突變是高產(chǎn)毒株所特有的，而不是PCR過程中發(fā)生的變異，我們對每一個基因節(jié)段至少測定3個克隆，并且各克隆序列符合率> 99%，從而確定高產(chǎn)毒株的基因序列。12、利用Vector NTI軟件進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)序列的對比，利用DNASTAR軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯分析。制備好毒株后，將10株流感病毒MDCK分離株血凝滴定，再進(jìn)行10-3，10-4稀釋接種細(xì)胞，兩代后血凝滴度仍保持> 1 160有四株，四代后血凝滴度仍保持> 1 160有兩株，五代以上仍保持高產(chǎn)特性的有一株，命名為A/CNIC/246/00 (Hmi)。

圖1為高產(chǎn)Hmi毒株細(xì)胞傳代記錄圖。由上圖可知，HlNl病毒株在傳代5代以后滴度> 1 640，高產(chǎn)性狀穩(wěn)定下來。再對上述高產(chǎn)毒株做血凝抑制實驗，試驗結(jié)論如下
^^^^Antiseram virusesA/SH/7/99 (HlNl)A/BJ/1/86 (HlNl)Pl1:12801:160PlO1:12801:160P151:12801:160由上表可知高產(chǎn)毒株A/CNIC/246/2000(Hmi)Pl，P10, Ρ15代之間針對兩種標(biāo)準(zhǔn)血清的血凝抑制效價沒有差別，初步證實高產(chǎn)毒株的抗原性保持不變。高產(chǎn)毒株針對當(dāng)前流行毒株A/SH/7/99 (HlNl)的血凝抑制效價比A/BJ/1/86 (Hmi)的血凝抑制效價要高。實施例2通過以下步驟用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)Η2Ν2毒株1、高產(chǎn)Η2Ν2毒株的篩選將5株備選毒株Η2Ν2(經(jīng)MDCK細(xì)胞分離，病毒滴度彡1 160的原始毒株)行10_3，10_4稀釋。取200 μ L病毒稀釋液接種成片生長的MDCK細(xì)胞Q5cm2培養(yǎng)瓶)，細(xì)胞記數(shù)約3-4X 106，接種前細(xì)胞用Hank’ s液洗兩遍。維持液中含有TPCK胰酶，并于感染后的 24，48小時分別加入，使TPCK胰酶的終濃度達(dá)到1 μ g/ml。置于35°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于感染后96小時收獲病毒，測定病毒血凝滴度。置35°C CO2培養(yǎng)箱1. 5小時，待病毒完全吸附后，棄感染液，用Hank’ s液洗一遍。每瓶細(xì)胞加入含終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶的細(xì)胞維持液:3ml，置35°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。并于感染后對，48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK 胰酶，促進(jìn)病毒增殖。細(xì)胞感染后48小時，鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)。當(dāng)CPE呈冊時，收獲病毒。病毒滴度測定，采用紅細(xì)胞凝集實驗，計算血凝單位。2、H2N2毒株的毒力檢測PFU檢測將H2N2毒株進(jìn)行倍比稀釋，接種于小方瓶，每小方瓶加入500 μ L病毒稀釋液，33°C孵育1小時后，用HANKS液沖洗，然后加入第一層覆蓋液，33°C孵育72小時后加入第二層覆蓋液，24小時后計數(shù)空斑。3、H2N2病毒基因組RNA的提取取10(^1^病毒液，加入1.51111^口口611(10什管中，然后加入50(^1^ Lysis Buffer RLT、β -巰基乙醇、600 μ L 70%乙醇，混勻，吸出600微升混合液轉(zhuǎn)入帶吸附柱的離心管中，12000rmp離心15秒，棄離心液。將上部剩余的其它液體再此上柱離心。12000rmp離心 15秒，棄離心液。向柱內(nèi)力口入700yL Washing Buffer冊1，12000rmp離心15秒，棄離心液。將柱子移到新的收集管上，加入500 μ L Washing Buffer RPE，12000rmp離心15秒，棄離心液。再于柱子上加入500 μ L Washing Buffer RPE，13000_14000rmp離心2分鐘。將柱子移到一無toase污染的Eppendorf管上，加入40 μ LDEPC處理的水，室溫放置1_3分鐘， 12000rmp離心1分鐘，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。4、RT-PCR擴(kuò)增流感病毒各基因節(jié)段使用GIBCO BRL公司的病毒反轉(zhuǎn)錄試劑盒THERMOSCRIPT RT-PCRSystem對模板 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取一只無Rnase，無Dnase的Eppendorf管，依次加入RNA 模板5yL引物 F QOpM) 1 μ LddH204μ L混勻后，在90°C水浴中加熱3分鐘，置于冰浴3分鐘使之迅速冷卻。然后加入cDNA Buffer 4μ LDEPC-water 1 μ L0. IM DTT1 μ LRnase OUT1 μ LdNTPs2μ LRT1 μ L60°C作用1小時，85°C 5分鐘，然后置冰上。加foiaseH 1 μ L 37°C作用30分。即為反轉(zhuǎn)錄好的cDNA。此步反應(yīng)由通用引物完成全部8個基因節(jié)段的反轉(zhuǎn)錄。使用STRATAGENE 公司 Pfu DNA Polymerase 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系0161]10XPCR Buffer5 μ L0162]dNTPs1 μ L0163]Primer F(20pM)1 μ L0164]Primer R(20pM)1 μ L0165]Pfu 酶(5U/ μ L)1 μ L0166]cDNA2μ L0167]ddH2040 μ L0168]Total50 μ L0169]PCR反應(yīng)條件0170]94°C預(yù)變性5分鐘0171]94 °C 30 秒0172]55 °C 30 秒0173]72 °C 420秒；共30個循環(huán)0174]72°C延伸5分鐘0175]5、PCR產(chǎn)物的純化0176]采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，具體步驟如下把純化柱放置在2mL收集管上，將PCR
產(chǎn)物混同5倍體積的PB Buffer，上柱，13000rmp離心45秒，棄離心液。向純化柱中加 750 μ L的PE Buffer, 13000rmp離心45秒，棄離心液。以同樣的速度再離心1分鐘充分去除洗液。將柱子放在一支干凈的Eppendorf管上，加40 μ L雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。 13000rmp離心1分鐘收集離心液，_20°C保存。6、用氯化鈣法感受態(tài)宿主菌的制備取DH5ci單菌落，接種無抗菌素LB培養(yǎng)液，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日按1 100轉(zhuǎn)入新的LB中繼續(xù)培養(yǎng)2小時左右，至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養(yǎng)。于冰上預(yù)冷10分鐘，4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；以IOml冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸細(xì)胞，放置于冰浴中20分鐘；4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；按每50ml培養(yǎng)物加入2ml 冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2的比例重懸細(xì)胞沉淀，再加入15%體積滅菌甘油，混勻，分裝于 Eppendorf管中，貯于_70°C低溫冰箱中備用。7、質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶消化取一滅菌Eppendorf管，依次加入限制性內(nèi)切酶緩沖液、乙酰化BSA、質(zhì)粒DNA、限制性內(nèi)切酶，并以滅菌的去離子水補(bǔ)充至所需體積。以20 μ 1總反應(yīng)體系為例IOX限制性內(nèi)切酶緩沖液 Ιμ IOX 乙?；?BSA(lmg/ml) 1 μ 1質(zhì)粒DNA0. 2μ 1限制性內(nèi)切酶2U滅菌去離子水補(bǔ)充至10 μ 1混勻，于離心機(jī)上快速離心5秒，將反應(yīng)管至于37°C水浴保溫1-4小時。8、DNA片段回收采用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)生的線形化載體DNA進(jìn)行回收，方法如下將待回收的DNA片段經(jīng)電泳分離后，在長波紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段，轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管中，于天平上稱量，然后用1個吸頭搗碎，動作輕柔；加入 60 μ 1 Ll Buffer，在50°C水浴中加熱15min，每;3min搖動1次，使瓊脂糖完全融化。將液體轉(zhuǎn)入吸附柱中，放在套管上，13000rpm離Imin ；倒掉套管中的液體，向吸附柱中加入500 μ 1 Ll Buffer，，室溫下放置lmin，1300rpm離心Imin ；棄去套管中的液體，向吸附柱中加入 700 μ 1 L2 Buffer，室溫下放置5min，13000rpm離心Imin ；棄去管中的液體，再以1300rpm 離Imin ；將吸附柱放于1. 5mlEppendorf管中，加入30 μ 1去離子水(或TE溶液，IOmmol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA，ph8. 0)，室溫下放置 lmin，13000rpm 離心 2min，所得液體中即含有回收的DNA片段，置于-20°C保存。9、連接反應(yīng)體系的制備與轉(zhuǎn)化按下列體系進(jìn)行連接反應(yīng)5XT4DNA Ligase Buffer 2μ 1PGEM-3ZF 載體(50ng/ μ 1) 1 μ 1PCR產(chǎn)物(經(jīng)純化)2 μ 1T4DNA Ligase0. 5 μ 1去離子水5μ1混合均勻后，于4°C連接過夜。取上述連接產(chǎn)物5 μ 1，加入到100 μ 1 DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，置冰浴上45min后，42°C熱休克2min，再置于冰浴上2min，加入無抗生素的LB培養(yǎng)液400 μ 1，37°C搖床振搖Ih后，取100 μ 1菌液，向其中加入40 μ 1 120mg/ml 5，-溴-4 氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4 μ 1 20mg/ml異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混勻后涂布含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB平板，37°C培養(yǎng)12_16h，挑取白色菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。10、提取質(zhì)粒小量取單菌落于5ml含氨芐青霉素(100g/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜， 取1. 5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm離心1分鐘，棄上清，沉淀懸浮于150μ 1溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配制20 μ 1溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴10分鐘；加入150 μ 1預(yù)冷的溶液 III (3. Omol/L KCl, ρΗ4· 8)，混勻，冰浴10分鐘· 12000rpm5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管， 加等體積酚/氯仿抽提；轉(zhuǎn)移上層相至新的離心管，再用等體積氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積無水乙醇，混勻，_20°C沉淀30分鐘，12000離心5分鐘。70%乙醇洗滌沉淀一次， 干燥后加入 50 μ 1 含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，pH8.0)， 37°C水浴30分鐘，_20°C保存?zhèn)溆谩?1、將PCR擴(kuò)增的片段以平端連接的方式克隆到pGEM-3zf載體的Sma I酶切位點(diǎn)中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer進(jìn)行測序。為了保證病毒基因組中的點(diǎn)突變是高產(chǎn)毒株所特有的，而不是PCR過程中發(fā)生的變異，我們對每一個基因節(jié)段至少測定3個克隆，并且各克隆序列符合率> 99%，從而確定高產(chǎn)毒株的基因序列。12、利用Vector NTI軟件進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)序列的對比，利用DNASTAR軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯分析。所測高產(chǎn)H2N2毒株細(xì)胞傳代記錄與圖1大體一致。實施例3
通過以下步驟用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)H3N2毒株與實施例1的不同之處在于，在第一步驟中篩選50株原始毒株H3N2行10_4稀釋， 取1000 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細(xì)胞上，放置在(X)2培養(yǎng)箱中2個小時，等到病毒完全吸附后取出，在72小時之間加入濃度為4 μ g/ml TPCK胰酶顯微鏡下觀察細(xì)胞病變 (CPE)，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)呈“冊”時，收獲病毒；其它步驟相同。所測高產(chǎn)H3N2毒株細(xì)胞傳代記錄與圖1大體一致。
權(quán)利要求
1. 一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于包括以下步驟 步驟一對流感病毒毒株進(jìn)行篩選，選取5 50株原始毒株行KT3-IO-4稀釋，取 200 μ L-1000 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細(xì)胞上，放置在(X)2培養(yǎng)箱中1 2個小時， 等到病毒完全吸附后取出，在M 72小時之間加入濃度為1 μ g/ml-4 μ g/ml TPCK胰酶顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)呈“冊”時，收獲病毒；步驟二 用50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落監(jiān)測方法(PFU法)來檢測和計算病毒株的毒力；步驟三提取流感病毒基因組RNA ；步驟四=RT-PCR擴(kuò)增流感病毒各基因節(jié)段；步驟五對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；步驟六用氯化鈣法制備感受態(tài)宿主菌；步驟七制備質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶體系，此體系包括IOX限制性內(nèi)切酶緩沖液 IOX 乙?；?BSA(lmg/ml) 質(zhì)粒DNA 限制性內(nèi)切酶滅菌去離子水1 μ 1-2 μ 1 1 μ 1-2 μ 1 0. 2μ g-1. 0μ g2U-4U10 μ 1-20 μ 1 ；步驟八DNA片段回收；步驟九制備以下體系進(jìn)行連接反應(yīng)，5XT4DNA Ligase Buffer PGEM-3ZF 載體(50ng/ μ 1) PCR產(chǎn)物(經(jīng)純化) T4DNA Ligase 去離子水2 μ 1-4 μ 1 1 μ 1-2 μ 1 2 μ 1-5 μ 1 0. 5 μ 1-1 μ 1 5 μ 1-8 μ 1步驟十提取質(zhì)粒小量；步驟i^一 將PCR擴(kuò)增的片段克隆到pGEM-3zf載體的Sma I酶切位點(diǎn)中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer進(jìn)行測序，從而確定高產(chǎn)毒株的基因序列；步驟十二 利用Vector NTI軟件進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)序列的對比，利用DNASTAR軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟一中優(yōu)選10株原始毒株行10_3-10-4稀釋，取500 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細(xì)胞上，放置在CO2培養(yǎng)箱中1個小時，等到病毒完全吸附后取出，在48小時之間加入濃度為2 μ g/ml TPCK胰酶顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)呈“冊”時，收獲病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟二中優(yōu)選用50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)方法來檢測和計算病毒株的毒力。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)方法是將病毒株行倍比稀釋，接種M孔板，每稀釋度設(shè)置平行4個復(fù)孔，每孔加入200 μ L稀釋液，350C CO2培養(yǎng)箱孵育1小時后用Hank’ s液洗一遍，然后加入含終濃度2μ g/mlTPCK胰酶的維持液3ml后置35°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并于感染后M，48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶，促進(jìn)病毒增殖，在感染后的72 小時收獲病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟三中提取流感病毒基因組RNA方法為取IOOyL病毒液，加入 1. 5mLEppendorf 管中，然后加入 500μ L Lysis Buffer RLT、β -巰基乙醇、600 μ L 70% 乙醇，混勻，吸出600 μ L混合液進(jìn)行離心，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟四中RT-PCR擴(kuò)增流感病毒各基因節(jié)段，選用病毒反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT-PCR System對模板RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或Pfu DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟五中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化的方法是通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒，把純化柱放置在 2mL收集管上，將PCR產(chǎn)物混同5倍體積的PB Buffer,進(jìn)行離心收集，然后加40 μ L雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟六中用氯化鈣法制備感受態(tài)宿主菌的方法為取DH5ci單菌落，接種無抗菌素 LB培養(yǎng)液，振搖培養(yǎng)，當(dāng)至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養(yǎng)，于冰上預(yù)冷10分鐘，離心后加入滅菌甘油，混勻，分裝于Eppendorf管中，貯于低溫冰箱中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟八中DNA片段回收的方法為采用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)生的線形化載體DNA進(jìn)行回收。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，其特征在于所述步驟十中提取質(zhì)粒小量的方法為取單菌落于5ml含氨芐青霉素(100g/ml) 的LB培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，離心后將沉淀懸浮于150μ 1溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl, lOmmol/LEDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配制 20 μ 1 溶液 II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴 10 分鐘；加入 150 μ 1 預(yù)冷的溶液 III (3. Omol/L KCl，ρΗ4. 8)，混勻，冰浴10分鐘，再次離心，用70%乙醇洗滌沉淀一次，干燥后加入50 μ 1含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE (10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)，37°C水浴 30 分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用MDCK細(xì)胞獲得流感病毒高產(chǎn)毒株的方法，通過以下步驟進(jìn)行制備對流感病毒毒株的篩選；對流感病毒株的毒力檢驗；流感病毒基因組RNA的提取；RT-PCR擴(kuò)增流感病毒各基因節(jié)段；PCR產(chǎn)物的純化；用氯化鈣法制備感受態(tài)宿主菌；制備質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶；DNA片段回收；用體系驚醒連接與轉(zhuǎn)化；提取質(zhì)粒小量；進(jìn)行序列測定和與病毒原始序列對比；用此方法生產(chǎn)的流感病毒毒株制備周期短(一周左右時間)，具有高產(chǎn)特性。
文檔編號C12N7/00GK102191225SQ20101012595
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者李福勝 申請人:李福勝