一種用于抑制流感病毒感染的制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于抑制流感病毒感染的制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒（簡(jiǎn)稱(chēng)流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強(qiáng)、 傳播速度快的疾病。其主要通過(guò)空氣中的飛沫、人與人之間的接觸或與被污染物品的接觸 傳播。典型的臨床癥狀是:急起高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度呼吸道癥狀。一般秋冬季節(jié) 是其高發(fā)期，所引起的并發(fā)癥和死亡現(xiàn)象非常嚴(yán)重。該病是由流感病毒引起，可分為甲（A)、 乙（B)、丙（C)三型，甲型病毒經(jīng)常發(fā)生抗原變異，感染性強(qiáng)，傳播迅速，極易發(fā)生大范圍流 行。甲型HlNl也是甲型流感病毒的一種。本病具有自限性，但在嬰幼兒、老年人和存在心肺 基礎(chǔ)疾病的患者容易并發(fā)肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡。
[0003] 人類(lèi)面臨病毒性傳染病的現(xiàn)實(shí)和潛在威脅日益嚴(yán)峻，人類(lèi)應(yīng)對(duì)突發(fā)傳染病的防控 壓力日感倍增，但愈來(lái)愈多的實(shí)際情況表明：當(dāng)病毒發(fā)生突變或出現(xiàn)新型病毒而導(dǎo)致傳染 病疫情暴發(fā)時(shí)，原來(lái)的特異性防治藥物難以發(fā)揮應(yīng)有防控效果，甚至毫無(wú)療效，而人類(lèi)認(rèn)知 水平和科研周期的限制，又使具有顯著療效的新一代特異性預(yù)防和治療藥物難以在短時(shí)間 內(nèi)推出，極易導(dǎo)致疫情的迅速擴(kuò)散和局部地區(qū)的災(zāi)難性暴發(fā)，不僅對(duì)當(dāng)?shù)氐墓残l(wèi)生服務(wù) 造成極大的破壞，同時(shí)也對(duì)社會(huì)的政治和經(jīng)濟(jì)造成巨大的沖擊。因此，依據(jù)病毒的基本生物 學(xué)特性，針對(duì)病毒侵染宿主細(xì)胞的共性靶點(diǎn)，研發(fā)新型病毒感染抑制劑，對(duì)于應(yīng)對(duì)病毒性傳 染病疫情的持續(xù)挑戰(zhàn)具有重要意義。
[0004]植物化合物被稱(chēng)為"第七類(lèi)營(yíng)養(yǎng)素"，廣泛存在于日常食物，是一類(lèi)對(duì)人體健康具 有特殊作用的非營(yíng)養(yǎng)性化學(xué)物質(zhì)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物 活性，并逐漸成為抗病毒研究的熱點(diǎn)之一。初步的研究結(jié)果顯示:植物化合物的生物學(xué)效應(yīng) 主要表現(xiàn)在其對(duì)細(xì)胞膜生物學(xué)特性的影響和局部微環(huán)境平衡的改變等方面，部分植物化合 物通過(guò)直接嵌入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜正常的功能性流動(dòng)和電勢(shì)電位差，進(jìn)而 發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制流感病毒感染的制劑及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為一種制劑在如下（1)或(2)中的應(yīng)用：
[0007] (1)制備用于抑制流感病毒感染的產(chǎn)品；
[0008] (2)用于抑制流感病毒感染；
[0009] 所述制劑主要由表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、單寧酸和黃芪多糖混合而成;所述 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、所述單寧酸和所述黃芪多糖的質(zhì)量配比為(〇. 5-1.0): (0.5-1.0)：(0.5-1.5)〇
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述用于抑制病毒感染的制劑具體由表沒(méi)食子兒茶素 沒(méi)食子酸酯(EGCG)、單寧酸和黃芪多糖混合而成;所述表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、 所述單寧酸和所述黃芪多糖的質(zhì)量配比為1: 1: 1.5。
[0011] 在本發(fā)明中，所述抑制流感病毒感染為如下(a)或(b):
[0012] (a)預(yù)防流感病毒感染；
[0013] (b)在與流感病毒同時(shí)作用于宿主或宿主細(xì)胞時(shí)，抑制所述流感病毒對(duì)所述宿主 或所述宿主細(xì)胞的感染。
[0014] 更加具體的，在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述制劑對(duì)所述流感病毒感染的抑制作用具 體體現(xiàn)為：以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為流感病毒感染對(duì)象，在流感病毒感染細(xì)胞的同時(shí)或者在流 感病毒感染細(xì)胞前施用所述制劑，所述制劑對(duì)流感病毒的半數(shù)抑制濃度與抑制病毒感染的 陽(yáng)性對(duì)照藥物相比顯著降低。所述陽(yáng)性對(duì)照藥物具體為利巴韋林(Ribavirin)。
[0015] 在本發(fā)明中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞(或(b)中所述的宿主細(xì)胞)具體為犬腎細(xì)胞(MDCK 細(xì)胞）。
[0016] 在本發(fā)明中，所述流感病毒為甲型流感病毒。更加具體的，所述甲型流感病毒為 HlNl亞型流感病毒，如HlNl亞型流感病毒A/Beijing/501/2009(H1N1)株。
[0017] 本發(fā)明以甲型HlNl流感病毒為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用觀察細(xì)胞病變的方法，在不同的感 染條件下，分別分析了表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、單寧酸和黃芪多糖這三種植物 化合物單體及其混合制劑抑制流感病毒感染的規(guī)律和特點(diǎn)。結(jié)果證實(shí):本發(fā)明所提供的三 種植物化合物單體和復(fù)合配方混合物的細(xì)胞毒性均不高于已經(jīng)獲得安全許可的對(duì)照樣品 利巴韋林，較為安全。在安全的使用濃度下，預(yù)防性使用EGCG和單寧酸等植物化合物單體以 及植物提取物復(fù)合配方混合物，可以有效的抑制甲型HlNl流感病毒的感染。本發(fā)明所提供 的制劑具有進(jìn)一步研發(fā)為流感病毒感染抑制劑的商業(yè)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0019] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020]下述實(shí)施例中涉及的定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（土s)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng) 計(jì)軟件運(yùn)用單因素水平方差分析的方法對(duì)組間比較數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
[0021 ] 細(xì)胞株:犬腎細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)為ATCC產(chǎn)品，編號(hào)為ATCC CCL-34。細(xì)胞按常規(guī)方法 傳代培養(yǎng)。
[0022]病毒：甲型 HlNl 流感病毒（A/Beijing/501/2009(H1N1)株），記載于 "Xiaoping KangjTao Jiang,Yongqiang Li,Fang LinjHong LiujGuohui ChangjQingyu ZhujEde Qin,Chengfeng Qin and Yinhui Yang.A duplex real-time RT-PCR assay for detecting H5N1 avian influenza virus and pandemic HlNl influenza virus. Virology Journal，2010,7:113"一文，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，僅用于重復(fù)本發(fā)明 實(shí)驗(yàn)使用。
[0023] 培養(yǎng)液：1 )、細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液：以DMEM培養(yǎng)基(G1 ibo公司產(chǎn)品）為母液，分別加入 10 % (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(Sigma公司產(chǎn)品），0 · 2mg/ml谷氨酰胺(G1 ibo公司產(chǎn)品），100U/ml 青霉素，鏈霉素。2)、細(xì)胞維持培養(yǎng)液，胎牛血清含量為2% (體積分?jǐn)?shù)），其余與1)均相同。 3)、病毒增殖培養(yǎng)液:加入2μg/ml TPCK-Trypsin(Sigma公司產(chǎn)品），其余成分與1)中的細(xì)胞 生長(zhǎng)培養(yǎng)液相同。
[0024]表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG) :Sigma公司產(chǎn)品（分析純度>95%)，產(chǎn)品編號(hào) 為E4143，CAS#989-51-5。
[0025] 單寧酸（Tannin):Sigma公司產(chǎn)品（分析純度>99%)，產(chǎn)品編號(hào)為V900190;CAS# 1401-55-4。
[0026] 黃芪多糖（APS):上海金穗生物科技有限公司產(chǎn)品^-(ChloromethyD-fU- nitrophenyD-lJ-thiazole)(分析純度 >70%)，產(chǎn)品編號(hào)為 JS11328;CAS#89250-26-0。 [0027]陽(yáng)性對(duì)照藥物:利巴韋林(Ribavirin)，美侖生物公司產(chǎn)品。因目前還未有通過(guò)改 變宿主細(xì)胞膜特性抑制病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照藥物。本研究以目前抗病毒最常用藥物利 巴韋林作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)前以PBS緩沖液溶解，制成2560μg/ml過(guò)濾，除菌后，-20 °C保存。
[0028] 倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司產(chǎn)品。
[0029] 細(xì)胞培養(yǎng)箱:美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。
[0030] 多功能酶儀:美國(guó)Molecular Devices公司SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀。
[0031] 1、細(xì)胞復(fù)蘇與傳代
[0032] 液氮中分別取出MDCK細(xì)胞，37 °C水浴，融化后，以1000 rpm離心5min，棄上清，加入 適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打均勻，使細(xì)胞密度約為2X IO5個(gè)/ml，以IOml/瓶，于T25細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。24h后于鏡下觀察，細(xì)胞的貼壁情況，48-72h后，或待 細(xì)胞生長(zhǎng)到密度大約為95 %時(shí)，棄原培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液，漂洗兩次，0.5ml 0.25 % (0.25g/100ml)EDTA，于37°C培養(yǎng)箱中溫育消化，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時(shí)，迅速加入細(xì)胞生長(zhǎng)培 養(yǎng)液，終止消化，反復(fù)吹打均勻后，以1000 rpm離心，5min，棄上清，使懸浮細(xì)胞濃度約為I X IO5個(gè)/ml，IOml/每瓶，移入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
[0033] 2、病毒增殖
[0034] 取細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為80%的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄原液，以roS，漂洗兩次，以去除血 清殘留，加入已稀釋病毒(稀釋液為PBS緩沖液），接種量MOI = O.01，以及Iml培養(yǎng)基，晃勻， 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附lh，棄上清，每瓶加入IOml相應(yīng)病毒增殖培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞病變，48-72h后，或待細(xì)胞病變達(dá)75 %以上時(shí)，收毒，取上清，反復(fù)凍融3次，以3000rpm，4°C，離心 5min，分裝上清，并測(cè)定病毒滴度TCID50。
[0035] 3、病毒滴度TCID5q測(cè)定
[0036]采用致細(xì)胞病變法(CPE)測(cè)定，以單細(xì)胞懸液，加入96孔微量培養(yǎng)板中，每孔200μ 1，使細(xì)胞量達(dá)到2 X IO5個(gè)/ml，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，直至細(xì)胞單層密度約為80 %時(shí)， 取出，棄培養(yǎng)基，以PBS漂洗兩遍(MDCK以含2μg/ml TPCK-Trypsin維持培養(yǎng)基漂洗），利用病 毒增殖培養(yǎng)液將病毒原液10倍梯度稀釋為1〇_3~1〇_ 13,每濃度梯度8孔一列，每孔100μ1，設(shè) 立空白對(duì)照兩列，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附lh，棄上清，后加入維持培養(yǎng)液200μ1。每日鏡下觀 察，當(dāng)病毒對(duì)照組細(xì)胞病變?yōu)?++++"時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按Reed-Muench兩氏法計(jì)算，病毒滴 度TCID 5Q。每組毒株，重復(fù)三次。<