專(zhuān)利名稱(chēng)：用于防止皮膚損傷的含有人參皂苷f(shuō)1和(－)表兒茶素－3－沒(méi)食子酸酯的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于防止皮膚損傷的含有人參皂苷F1(20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參萜三醇)和(-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸((-)epigallocatechin-3-gallate，EGCG)的組合物。更具體地，本發(fā)明涉及能通過(guò)協(xié)同作用防止紫外線(xiàn)引起的皮膚損傷的含有低濃度人參皂苷F1和EGCG的組合物，以及涉及防止皮膚損傷的方法。
背景技術(shù)：
人的皮膚作為第一道保護(hù)屏障，保護(hù)身體重要器官不受例如溫度或濕度變化、紫外線(xiàn)和污染的外部刺激，并且在諸如體溫調(diào)節(jié)的生物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)中起著重要作用。然而，皮膚暴露于外部環(huán)境而容易受到外部刺激的傷害。這些外部刺激中，紫外線(xiàn)是引起皮膚老化和表皮中調(diào)亡細(xì)胞死亡的主要刺激。
引起皮膚老化最嚴(yán)重的原因是280-320納米波長(zhǎng)的紫外線(xiàn)(UVB)。如果皮膚暴露于紫外線(xiàn)，可能損傷諸如DNA或蛋白質(zhì)的細(xì)胞成分形成曬斑細(xì)胞，紫外線(xiàn)激活一種酶——胱天蛋白酶，并且經(jīng)歷細(xì)胞凋亡途徑(apoptoticpathway)，伴隨酶作用的DNA片段化，最后終止于細(xì)胞死亡。以此方式，細(xì)胞凋亡(apoptosis)誘發(fā)受傷細(xì)胞的死亡，防止它們發(fā)展成腫瘤。
Bcl-2是在這種細(xì)胞凋亡途徑中起著重要作用的基因，并且編碼位于核膜和線(xiàn)粒體外膜的26千道爾頓蛋白。Bcl-2蛋白附著于例如Bax的有利于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白，并且阻礙該蛋白的功能，抑制細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。因此，經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的敏感性取決于Bcl-2蛋白和Bax蛋白之間的比例。
有人報(bào)道過(guò)，Bcl-2的表達(dá)受表皮中紫外線(xiàn)輻射的快速減量調(diào)節(jié)。此外，紫外線(xiàn)引發(fā)的細(xì)胞凋亡在過(guò)度表達(dá)Bcl-2蛋白的細(xì)胞中被抑制。然而，Bcl-2的過(guò)量表達(dá)也可以抑制有嚴(yán)重DNA損傷從而可能發(fā)展成癌癥的細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。因此，特異性調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)是非常重要的。
EGCG，綠茶中的一種主要的多酚，有強(qiáng)抗氧化活性和清除有害基團(tuán)的活性。還已知這種化合物能抑制紫外線(xiàn)輻射引起的炎癥反應(yīng)和皮膚癌的發(fā)生。最近，發(fā)現(xiàn)EGCG增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)并且減小正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中Bax表達(dá)，抑制紫外線(xiàn)引起的細(xì)胞凋亡。對(duì)鱗狀癌細(xì)胞使用EGCG，減少Bax蛋白的磷酸化作用，從而抑制癌細(xì)胞增殖。然而，EGCG在涉及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的靶標(biāo)仍然未知。
成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Retinoblastoma，Rb)蛋白由腫瘤阻抑基因表達(dá)，并且在生殖、癌、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化以及細(xì)胞死亡中起著重要作用。Rb是一種核蛋白，并且該蛋白的磷酸化作用受細(xì)胞周期或DNA損傷因子調(diào)節(jié)。因此，Rb涉及與E2F轉(zhuǎn)錄因子一起誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，已知Rb蛋白的去磷酸化作用受Bcl-2過(guò)量表達(dá)的抑制，從而Rb是穩(wěn)定的。也就是說(shuō)，它還涉及細(xì)胞凋亡的抑制。
但是，沒(méi)有關(guān)于能通過(guò)保護(hù)受到弱傷害的細(xì)胞不經(jīng)歷細(xì)胞凋亡和通過(guò)誘導(dǎo)嚴(yán)重受損細(xì)胞的細(xì)胞凋亡來(lái)調(diào)節(jié)人表皮細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，從而能保護(hù)皮膚，并且人容易使用而無(wú)害的物質(zhì)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
在上述情況下，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了具有極好的保護(hù)表皮細(xì)胞并防止其損傷的作用的含有人參皂苷F1(20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參萜三醇)和EGCG((-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸)的組合物，從而完成本發(fā)明。
詳細(xì)地說(shuō)，含有低濃度的人參皂苷F1和EGCG兩者之一的組合物并沒(méi)有表現(xiàn)出任何保護(hù)皮膚的作用。然而，含有所述濃度的人參皂苷F1和EGCG的混合物的組合物通過(guò)它們的協(xié)同作用而表現(xiàn)出極好的保護(hù)皮膚的作用。也就是說(shuō)，這兩種化合物的聯(lián)合處理通過(guò)它們的協(xié)同作用，即使在低濃度下，也能調(diào)節(jié)抗紫外線(xiàn)輻射的Bcl-2的表達(dá)，而這兩種化合物任何一種單獨(dú)處理都沒(méi)有作用。
因此，本發(fā)明涉及用于防止皮膚損傷的含有下面化學(xué)式1代表的人參皂苷F1和下面化學(xué)式2代表的EGCG作為活性成分的組合物 化學(xué)式1 化學(xué)式2本發(fā)明提供的組合物涉及表皮細(xì)胞的凋亡，防止皮膚老化并保持表皮細(xì)胞的功能。
所述人參皂苷F1和EGCG可以?xún)?yōu)選以組合物總重量為基準(zhǔn)，摻入0.0001％至10％的合計(jì)量。此外，所述人參皂苷F1和EGCG可以?xún)?yōu)選以1∶0.1-10的重量比摻入。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種由低劑量紫外線(xiàn)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制劑，該抑制劑含有人參皂苷F1和EGCG的結(jié)合作為活性成分。
此外，本發(fā)明提供了一種由紫外線(xiàn)輻射減量調(diào)節(jié)的Bcl-2表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑含有人參皂苷F1和EGCG的結(jié)合作為活性成分。
另外，本發(fā)明提供了一種由紫外線(xiàn)輻射減量調(diào)節(jié)的Brn-3a表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑含有人參皂苷F1和EGCG的結(jié)合作為活性成分。
根據(jù)本發(fā)明，人參皂苷F1本身不能增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)，但是能防止Bcl-2表達(dá)不受紫外線(xiàn)輻射而減量調(diào)節(jié)。也就是說(shuō)，人參皂苷F1將Bcl-2表達(dá)水平保持在Bcl-2-特異性轉(zhuǎn)錄因子Brn-3a的表達(dá)調(diào)節(jié)的正常水平，從而能抑制表皮細(xì)胞中由低劑量紫外線(xiàn)輻射引起的細(xì)胞調(diào)亡。同時(shí)，因?yàn)楦邉┝孔贤饩€(xiàn)輻射減量調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)，可能誘導(dǎo)受損細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，而受損細(xì)胞沒(méi)有發(fā)展成皮膚癌的危險(xiǎn)。
本發(fā)明在下文實(shí)施例的所述作用中證明人參皂苷F1與EGCG的協(xié)同作用。詳細(xì)地說(shuō)，低濃度的所述兩種化合物的聯(lián)合處理，將由紫外線(xiàn)輻射減量調(diào)節(jié)的Bcl-2表達(dá)恢復(fù)到人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞——HaCaT細(xì)胞的正常水平，從而抑制調(diào)亡細(xì)胞死亡，而任何一種化合物的單獨(dú)處理都沒(méi)有明顯作用。此外，我們?cè)谙惹把芯康幕A(chǔ)上證明，通過(guò)調(diào)節(jié)Brn-3a——Bcl-2特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)獲得與EGCG的協(xié)同作用的細(xì)胞凋亡抑制作用。只有所述這兩種化合物的聯(lián)合處理防止了腫瘤-抑制Rb蛋白的去磷酸化作用，從而抑制調(diào)亡細(xì)胞死亡。
上面的結(jié)果表明，人參皂苷F1和EGCG的聯(lián)合處理通過(guò)這兩種化合物的協(xié)同作用，即使在低濃度下，也能保持Bcl-2在細(xì)胞中的水平不變，并且能防止Rb蛋白的去磷酸化，抑制凋亡細(xì)胞死亡。
因此，人參皂苷F1和EGCG通過(guò)它們的協(xié)同作用保持Bcl-2在細(xì)胞中的水平不變來(lái)抑制凋亡細(xì)胞死亡。此外，因?yàn)槿藚⒃碥誇1本身不能增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)，并且不保護(hù)有發(fā)展成癌癥的可能性的細(xì)胞使之不發(fā)生細(xì)胞凋亡，所以沒(méi)有受損傷細(xì)胞發(fā)展成癌癥的危險(xiǎn)。這些結(jié)果提示使用人參皂苷F1和EGCG組合物作為抗人皮膚老化的藥物的可能性，該組合物通過(guò)抑制紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并防止細(xì)胞損傷。
結(jié)論是，本發(fā)明提供了一種含有人參皂苷F1和EGCG的結(jié)合作為活性成分的護(hù)膚組合物。本發(fā)明的組合物能防止紫外線(xiàn)引起的皮膚損傷從而防止老化。所述組合物可以配制成外用護(hù)膚組合物，例如化妝品組合物。然而，所述組合物的目的和制劑并不局限于此。
本發(fā)明中使用的人參皂苷F1是通過(guò)將純化的人參皂甙(ginseng saponin)溶解于水性溶劑，例如蒸餾水或緩沖液，或者所述水性溶劑和有機(jī)溶劑的混合物中，然后與從青霉(Penicillium)分離的柚苷酶和從曲霉(Aspergillus)分離的果膠酶中的至少一種反應(yīng)而獲得的化合物。但是，人參皂苷F1的制備方法并不限于此。


圖1圖示說(shuō)明噻唑藍(lán)還原分析(MTT-reduction assay)的結(jié)果，這項(xiàng)分析說(shuō)明人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理在表皮細(xì)胞中的抗細(xì)胞凋亡作用；圖2給出蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，該結(jié)果說(shuō)明人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)聚(腺苷酸二磷酸-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)裂解的抑制作用。A顯示沒(méi)有紫外線(xiàn)輻射的結(jié)果，B顯示60毫焦/平方厘米(mJ/cm2)的紫外線(xiàn)輻射存在下的結(jié)果。Hsp70代表使用等量蛋白質(zhì)。在圖2中，泳道1顯示未處理的對(duì)照組的結(jié)果泳道2顯示用2μM人參皂苷F1處理的試驗(yàn)組的結(jié)果；泳道3是用10μM EGCG處理的結(jié)果；泳道4是用2μM人參皂苷F1和10μM EGCG處理的結(jié)果；泳道5是用5μM人參皂苷F1處理的結(jié)果；泳道6是用50μM EGCG處理的結(jié)果；圖3給出蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，該結(jié)果說(shuō)明人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)Bcl-2表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的抑制作用。A顯示沒(méi)有紫外線(xiàn)輻射的結(jié)果，B顯示60毫焦/平方厘米紫外線(xiàn)輻射存在下的結(jié)果。Hsp70代表使用等量蛋白質(zhì)。各受處理的試驗(yàn)樣品的量與圖2所示的相等；圖4給出蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，該結(jié)果說(shuō)明人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)Brn-3a表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的抑制作用。A顯示沒(méi)有紫外線(xiàn)輻射的結(jié)果，B顯示60毫焦/平方厘米紫外線(xiàn)輻射存在下的結(jié)果。Hsp70代表使用等量蛋白質(zhì)。各受處理的試驗(yàn)樣品的量與圖2所示的相等；圖5給出蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，該結(jié)果說(shuō)明人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)Rb蛋白的去磷酸化作用的抑制作用。上面的印跡是通過(guò)使用識(shí)別Rb蛋白的所有磷酸化形式的抗體獲得的，下面的印跡是使用只識(shí)別磷酸化不足的Rb蛋白的抗體對(duì)相同膜印跡得到的。A顯示沒(méi)有紫外線(xiàn)輻射的結(jié)果，B顯示60毫焦/平方厘米紫外線(xiàn)輻射存在下的結(jié)果。各受處理的試驗(yàn)樣品的量與圖2所示的相等。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過(guò)下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述。然而，提供這些實(shí)施例只是詳細(xì)說(shuō)明的目的，而不應(yīng)該解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，這一點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
參考實(shí)施例1純化的人參皂甙的制備將含有蒸餾水的4升甲醇加入2千克紅參(韓國(guó)煙草人參公社KT&G，六年齡紅參)并且回流三次，然后在15℃下靜置6天。將粗提取液通過(guò)濾紙過(guò)濾并離心分離殘余物和濾液。減壓濃縮濾液。將濃縮物懸浮于蒸餾水，然后用1升乙醚萃取五次，去除色素。用500毫升1-丁醇將含水部分(aqueouspart)萃取三次。用5％KOH處理得到的1-丁醇部分并且用蒸餾水洗滌，然后減壓濃縮。將獲得的1-丁醇萃取物溶解于少量甲醇并加入大量乙酸乙酯。將得到的沉淀干燥，得到70克純化的人參皂甙。
參考實(shí)施例2人參皂苷F1的制備將參考實(shí)施例1中獲得的10克純化的人參皂甙溶解于1000毫升檸檬酸緩沖液(pH4.0)。然后向其中加入15克從青霉分離的柚苷酶(Sigma，St.Louis，MO)，并且在40℃水浴中攪拌下反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)終止之后，通過(guò)加熱10分鐘使酶失活，并用等量乙酸乙酯將反應(yīng)混合物萃取三次，然后濃縮。通過(guò)硅膠柱色譜，用氯仿∶甲醇(9∶1)將得到的產(chǎn)物分級(jí)分離，得到1.5克人參皂苷F1。
實(shí)施例1人參皂苷F1和EGCG的聯(lián)合處理在HaCaT細(xì)胞中的抗細(xì)胞調(diào)亡作用步驟1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞系由N.E.Fusenig博士(DeutschesKrebsforschungszentrum(DKFZ)，海德堡，德國(guó))提供，在加有10％胎牛血清的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，Gibco 1210-0038)中培養(yǎng)。培養(yǎng)物在37℃下在有5％CO2的潮濕空氣中孵育。
步驟2用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)HaCaT細(xì)胞中紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡的抑制用胰蛋白酶處理步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞系，得到單細(xì)胞懸浮液，并以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔微量培養(yǎng)板上，然后培養(yǎng)24小時(shí)。接著，用不含血清的DMEM新鮮替換培養(yǎng)基并將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。然后用2μM人參皂苷F1；10μM EGCG；2μM人參皂苷F1和10μM EGCG組合物；5μM人參皂苷F1以及50μM EGCG分別處理微量培養(yǎng)板各孔。
為了參照，將人參皂苷F1以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度溶解于100％乙醇，并且以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度將EGCG(Sigma，美國(guó))溶解于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，然后以需要的量加入培養(yǎng)基。
對(duì)各個(gè)試驗(yàn)樣品處理24小時(shí)之后，用磷酸緩沖鹽水(phosphate bufferedsaline，PBS)沖洗各個(gè)微量培養(yǎng)板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm2的UVB。然后去除PBS，用含有相應(yīng)濃度的各化合物的培養(yǎng)基新鮮替換培養(yǎng)基。作為對(duì)照，以相同步驟培養(yǎng)未處理的細(xì)胞。
紫外線(xiàn)照射24小時(shí)之后，向用各種化合物處理的或者未處理的微量培養(yǎng)板加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT，Sigma)溶液，然后在37℃下將細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)。加入DMSO并完全溶解。使用酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定(ELISA)讀數(shù)器(Thermo Max，Molecular Devices Co，美國(guó))在540納米下測(cè)定形成的甲簪(formazan)的光密度(optical density，OD)。以相對(duì)值評(píng)價(jià)各個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞成活率，以未處理對(duì)照細(xì)胞的OD為100％。結(jié)果在圖1中給出。
如圖1所示，與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比，單獨(dú)用2μM人參皂苷F1或10μM EGCG單一處理，紫外線(xiàn)引起的凋亡細(xì)胞總數(shù)沒(méi)有差別。然而，用2μM人參皂苷F1和10μM EGCG聯(lián)合處理抑制的紫外線(xiàn)引起的凋亡細(xì)胞死亡是未處理對(duì)照細(xì)胞的大約2倍。這與單獨(dú)用5μM人參皂苷F1或50μM EGCG單一處理獲得的抗細(xì)胞凋亡效果相似。
實(shí)施例2用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)PARP蛋白裂解的抑制作用步驟1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)這項(xiàng)試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系及其培養(yǎng)與實(shí)施例1步驟1中使用的相同。
步驟2用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的PARP裂解的抑制作用用胰蛋白酶處理步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞系，得到單細(xì)胞懸浮液，并以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔微量培養(yǎng)板上，然后培養(yǎng)24小時(shí)。接著，用不含血清的DMEM新鮮替換培養(yǎng)基并將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。然后分別用2μM人參皂苷F1；10μM EGCG；2μM人參皂苷F1和10μM EGCG組合物；5μM人參皂苷F1和50μM EGCG處理微量培養(yǎng)板。將人參皂苷F1以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度溶解于100％乙醇，并且以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度將EGCG(Sigma)溶解于二甲亞砜(DMSO)。對(duì)各個(gè)試驗(yàn)樣品處理24小時(shí)之后，用PBS沖洗各個(gè)微量培養(yǎng)板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm2的UVB。然后去除PBS，用含有相應(yīng)濃度的各化合物的培養(yǎng)基新鮮替換培養(yǎng)基。作為對(duì)照，以相同步驟培養(yǎng)未處理的細(xì)胞。
紫外線(xiàn)照射24小時(shí)之后，用PBS洗滌用各種化合物處理的或者未處理的細(xì)胞，并用胰蛋白酶處理收獲。然后將細(xì)胞溶解于含有8M尿素、2％3-[3-(膽酰氨丙基)二甲銨基]丙磺酸內(nèi)鹽(3-[(3-Chloamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS)、50mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、2M硫脲、2mM苯甲基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonylfiuoride，PMSF)和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取緩沖液中，室溫下反應(yīng)10分鐘。4℃下以15000重力加速度(g)離心10分鐘收集上清液，并使用BIO-Rad的Protein Dye ReagentTM測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)8％ SDS-PAGE將20微克蛋白按大小級(jí)別分離，并在50伏下經(jīng)12小時(shí)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(BioRad，美國(guó))上。印跡(blots)在5％脫脂奶液中封閉1小時(shí)，然后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Amersham，瑞典)，與作為一抗的抗-PARP兔多克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó))和作為二抗的馬辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)-偶聯(lián)的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反應(yīng)。印跡暴露給X-射線(xiàn)膠片(Fuji，日本)并顯影，測(cè)定蛋白表達(dá)水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)掃描儀對(duì)印跡膜上的泳帶掃描并且用ImageMaster 2D Elite軟件(Amersham Biosciences，瑞典)分析。以未處理的對(duì)照組中含量為基礎(chǔ)以相對(duì)值評(píng)價(jià)裂解的PARP的含量。結(jié)果如圖2所示。
如圖2所示，與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比，或者與用等濃度的每種化合物的單一處理相比，用2μM人參皂苷F1和10μM EGCG聯(lián)合處理將紫外線(xiàn)引起的PARP蛋白裂解抑制了大約1.4倍。
實(shí)施例3用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)Bcl-2表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的抑制作用步驟1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)這項(xiàng)試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系及其培養(yǎng)與實(shí)施例1步驟1中使用的相同。
步驟2用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的抑制作用用胰蛋白酶處理步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞系，得到單細(xì)胞懸浮液，并以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔微量培養(yǎng)板上，然后培養(yǎng)24小時(shí)。接著，用不含血清的DMEM新鮮替換培養(yǎng)基并將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。然后分別用2μM人參皂苷F1；10μM EGCG；2μM人參皂苷F1和10μM EGCG組合物；5μM人參皂苷F1以及50μM EGCG處理微量培養(yǎng)板。將人參皂苷F1以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度溶解于100％乙醇，并且以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度將EGCG(Sigma，美國(guó))溶解于DMSO。對(duì)各個(gè)試驗(yàn)樣品處理24小時(shí)之后，用PBS沖洗各個(gè)微量培養(yǎng)板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm2的UVB。然后去除PBS，用含有相應(yīng)濃度的各化合物的培養(yǎng)基新鮮替換培養(yǎng)基。作為對(duì)照，以相同步驟培養(yǎng)未處理的細(xì)胞。
紫外線(xiàn)照射24小時(shí)之后，用PBS洗滌用各種化合物處理的或者未處理的細(xì)胞，并用胰蛋白酶處理收獲。然后將細(xì)胞溶解于含有8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取緩沖液中，室溫下反應(yīng)10分鐘。4℃下以15000重力加速度(g)離心10分鐘收集上清液，并使用BIO-Rad Protein Dye ReagentTM測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)8％SDS-PAGE將20微克蛋白按大小級(jí)別分離，并在50伏下經(jīng)12小時(shí)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(BioRad，美國(guó))上。印跡在5％脫脂奶液中封閉1小時(shí)，然后使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Amersham，瑞典)，與作為一抗的抗-Bcl-2兔多克隆抗體(Santa Cruz)和作為二抗的HRP-偶聯(lián)的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反應(yīng)。印跡暴露給X-射線(xiàn)膠片(Fuji，日本)并顯影，測(cè)定蛋白表達(dá)水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)掃描儀對(duì)膜上的泳帶掃描并且用ImageMaster 2D Elite軟件(AmershamBiosciences，瑞典)分析。結(jié)果如圖3所示。
如圖3所示，紫外線(xiàn)照射下未處理的細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)Bcl-2蛋白質(zhì)。此外，與未處理的對(duì)照組相比，只用2μM人參皂苷F1或10μM EGCG單一處理，Bcl-2表達(dá)沒(méi)有差別。但是，用2μM人參皂苷F1或10μM EGCG聯(lián)合處理，紫外線(xiàn)照射下Bcl-2表達(dá)水平維持在沒(méi)有紫外線(xiàn)照射時(shí)的相同水平。也就是說(shuō)，與未處理的對(duì)照組或用一種化合物單一處理相比，兩種化合物聯(lián)合處理將Bcl-2表達(dá)提高大約3倍。
實(shí)施例4用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)Brn-3a表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的抑制作用步驟1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)這項(xiàng)試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系及其培養(yǎng)與實(shí)施例1步驟1中使用的相同。
步驟2用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的Brn-3a表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的抑制作用用胰蛋白酶處理步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞系，得到單細(xì)胞懸浮液，并以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔微量培養(yǎng)板上，然后培養(yǎng)24小時(shí)。接著，用不含血清的DMEM新鮮替換培養(yǎng)基并將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。然后分別用2μM人參皂苷F1；10μM EGCG；2μM人參皂苷F1和10μM EGCG組合物；5μM人參皂苷F1以及50μM EGCG處理微量培養(yǎng)板。將人參皂苷F1以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度溶解于100％乙醇，并且以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度將EGCG(Sigma)溶解于DMSO。對(duì)各個(gè)試驗(yàn)樣品處理24小時(shí)之后，用PBS沖洗各個(gè)微量培養(yǎng)板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm2的UVB。然后去除PBS，用含有相應(yīng)濃度的各化合物的培養(yǎng)基新鮮替換培養(yǎng)基。作為對(duì)照，以相同步驟培養(yǎng)未處理的細(xì)胞。
紫外線(xiàn)照射24小時(shí)之后，用PBS洗滌用各種化合物處理的或者未處理的細(xì)胞，并用胰蛋白酶處理收獲。然后將細(xì)胞溶解于含有8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取緩沖液中，室溫下反應(yīng)10分鐘。4℃下以15000重力加速度(g)離心10分鐘收集上清液，并使用BIO-Rad Protein Dye ReagentTM測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)8％SDS-PAGE將20微克蛋白質(zhì)按大小級(jí)別分離，并在50伏下經(jīng)12小時(shí)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(BioRad，美國(guó))上。印跡在5％脫脂奶液中封閉1小時(shí)，并且使用ECL試劑盒(Amersham，瑞典)與作為一抗的抗-Brn-3a兔多克隆抗體(Santa Cruz)和作為二抗的HRP-偶聯(lián)的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反應(yīng)。印跡暴露給X-射線(xiàn)膠片(Fuji，日本)并顯影，測(cè)定蛋白表達(dá)水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)對(duì)膜上的泳帶掃描并且用ImageMaster 2D Elite軟件(Amersham Biosciences，瑞典)分析。結(jié)果如圖4所示。
如圖4所示，紫外線(xiàn)照射降低了Brn-3a蛋白的表達(dá)，只有用兩種化合物聯(lián)合處理才恢復(fù)。
實(shí)施例5用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)Rb蛋白的去磷酸化作用的抑制作用步驟1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)這項(xiàng)試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系及其培養(yǎng)與實(shí)施例1步驟1中使用的相同。
步驟2用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理對(duì)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的Rb蛋白質(zhì)的去磷酸化作用的抑制作用用胰蛋白酶處理步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞系，得到單細(xì)胞懸浮液，并以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔微量培養(yǎng)板上，然后培養(yǎng)24小時(shí)。接著，用不含血清的DMEM新鮮替換培養(yǎng)基并將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。然后分別用2μM人參皂苷F1；10μM EGCG；2μM人參皂苷F1和10μM EGCG組合物；5μM人參皂苷F1以及50μM EGCG處理微量培養(yǎng)板。將人參皂苷F1以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度溶解于100％乙醇，并且以相對(duì)于培養(yǎng)基1/1000倍濃度將EGCG(Sigma)溶解于DMSO。對(duì)各個(gè)試驗(yàn)樣品處理24小時(shí)之后，用PBS沖洗各個(gè)微量培養(yǎng)板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm2的UVB。然后去除PBS，用含有相應(yīng)濃度的各化合物的培養(yǎng)基新鮮替換培養(yǎng)基。作為對(duì)照，以相同步驟培養(yǎng)未處理的細(xì)胞。
紫外線(xiàn)照射24小時(shí)之后，用PBS洗滌用各種化合物處理的或者未處理的細(xì)胞，并用胰蛋白酶處理收獲。然后將細(xì)胞溶解于含有8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取緩沖液中，室溫下反應(yīng)10分鐘。4℃下以15000重力加速度(g)離心10分鐘收集上清液，并使用BIO-Rad Protein Dye ReagentTM測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)8％SDS-PAGE將20微克蛋白按大小級(jí)別分離，并在50伏下經(jīng)12小時(shí)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(BioRad)上。印跡在5％脫脂奶液中封閉1小時(shí)，并且使用ECL試劑盒(Amersham，瑞典)與作為一抗的抗-Rb兔多克隆抗體(識(shí)別所有形式的Rb(高度磷酸化形式、磷酸化不足形式等)，SantaCruz)和作為二抗的HRP-偶聯(lián)的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反應(yīng)。印跡暴露給X-射線(xiàn)膠片(Fuji，日本)并顯影，測(cè)定蛋白表達(dá)水平。50℃下，使用含有6.25mM Tris、2％SDS和100mM β-巰基乙醇的緩沖液，將相同的印跡沖洗兩次，每次10分鐘。印跡在5％脫脂奶液中又封閉1小時(shí)，并且使用ECL試劑盒(Amersham，瑞典)，與作為一抗的單克隆抗體抗磷酸化不足的Rb(只識(shí)別Rb的磷酸化不足形式，BD Biosciences，美國(guó))和作為二抗的HRP-偶聯(lián)的抗-小鼠IgG(Amersham，瑞典)反應(yīng)。印跡暴露給X-射線(xiàn)膠片(Fuji，日本)并顯影，測(cè)定蛋白表達(dá)水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)掃描儀對(duì)膜上的泳帶掃描并且用ImageMaster 2D Elite軟件(Amersham Biosciences，瑞典)分析。結(jié)果如圖5所示。
如圖5所示，紫外線(xiàn)照射下，單獨(dú)用兩種化合物中的一種處理的細(xì)胞中或者未處理的細(xì)胞中Rb蛋白被去磷酸化成為磷酸化不足的形式。然而，使用兩種化合物聯(lián)合處理抑制Rb蛋白去磷酸化作用，產(chǎn)生所有形式的Rb蛋白。
下面，根據(jù)本發(fā)明，以下面的配方提供含有人參皂苷F1和EGCG的外用組合物。然而，本發(fā)明的外用組合物制劑不局限于此。
表1制劑1皮膚軟化劑

表2制劑2營(yíng)養(yǎng)化妝水(toilet water)

表3制劑3營(yíng)養(yǎng)霜

表4制劑4香精

表5制劑5洗液

表6制劑6軟膏

表7制劑7噴霧劑

本發(fā)明的工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明中用人參皂苷F1和EGCG聯(lián)合處理，通過(guò)它們的協(xié)同作用，即使在低濃度下，通過(guò)抑制紫外線(xiàn)引起的Bcl-2表達(dá)或Bcl-2轉(zhuǎn)錄因子——Brn-3a表達(dá)的減量調(diào)節(jié)，或者通過(guò)防止Rb蛋白的去磷酸化作用，能抑制紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而任何單一處理都沒(méi)有效果。這樣，本發(fā)明提供使用人參皂苷F1和EGCG的組合物作為抗老化劑對(duì)人皮膚防止紫外線(xiàn)引起的細(xì)胞損傷的可能性。此外，本發(fā)明通過(guò)以低濃度使用兩種昂貴的化合物，能提供低價(jià)格、高功效的化妝品(單一處理情況下，對(duì)于目標(biāo)效果分別需要2.5倍和5倍濃度的人參皂苷F1和EGCG)。
權(quán)利要求
1.一種護(hù)膚組合物，該組合物含有20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參萜三醇即人參皂苷F1和(-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，通過(guò)所述活性成分的細(xì)胞凋亡抑制作用獲得所述護(hù)膚效果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中，所述細(xì)胞調(diào)亡為低劑量紫外線(xiàn)輻射誘導(dǎo)的調(diào)亡細(xì)胞死亡。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中，通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)獲得所述細(xì)胞凋亡抑制作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中，通過(guò)調(diào)節(jié)Brn-3a的表達(dá)獲得所述Bcl-2表達(dá)的調(diào)節(jié)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中，以組合物總重量為基準(zhǔn)，摻入合計(jì)量為0.0001％至10％的所述人參皂苷F1和(-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中，以1∶0.1-10的重量比摻入所述人參皂苷F1和(-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯。
8.一種Rb蛋白去磷酸化作用抑制劑，該抑制劑含有人參皂苷F1和(-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯作為活性成分。
9.一種用于防止暴露于紫外線(xiàn)引起的細(xì)胞損傷的皮膚損傷抑制劑，該抑制劑含有低濃度的人參皂苷F1和(-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯的結(jié)合作為活性成分。
10.一種外用護(hù)膚組合物，該組合物含有人參皂苷F1和(-)表兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯的結(jié)合作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有人參皂苷F1和(－)表兒茶素－3－沒(méi)食子酸酯(EGCG)的護(hù)膚組合物。更具體地，本發(fā)明涉及能通過(guò)所述人參皂苷F1和EGCG的協(xié)同作用，即使在低濃度下也表現(xiàn)出極好護(hù)膚效果，抑制紫外線(xiàn)引起的表皮細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的抑制劑，以及涉及抑制表皮細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的方法。
文檔編號(hào)A61K8/60GK1925834SQ200480042552
公開(kāi)日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2004年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者曹始泳, 姜炳永, 廉明勛, 李泰龍, 張利燮 申請(qǐng)人:株式會(huì)社太平洋