專利名稱：泵阿米德衍生物、其制備方法與在治療癌中的用途的制作方法
癌是人類和動物所患的疾病之一，這種疾病大部分是致命的，是由內(nèi)源細(xì)胞不可控制生長所引起的。癌是用于描述形成的惡性腫瘤(malignomas)和瘤(腫瘤或癌)或白血球細(xì)胞惡性變性和受擾成熟(白血病、血癌)而采用的術(shù)語。癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞是由內(nèi)源細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。癌細(xì)胞的惡性是通過其生長的自主性表現(xiàn)的，即這種細(xì)胞以一種不受抑制并且與器官結(jié)構(gòu)不相配的方式生長，并且還以一種浸潤方式生長，由此會導(dǎo)致組織破壞。腫瘤細(xì)胞通過血液或淋巴傳播后，在距腫瘤一定距離的地方形成散布區(qū)(轉(zhuǎn)移灶)，這是惡性腫瘤出現(xiàn)的確定信號。癌是引起人死亡的最普遍的原因之一，因此，人類特別需要一些能夠消除或治療惡性變性的方法和手段。
除采用外科手術(shù)進(jìn)行切除的根本性治療(如果可能的話)外，其它可以用于治療惡性腫瘤的手段包括使用X-射線、α-射線、β-射線和γ-射線進(jìn)行放射性治療，還包括免疫療法和化療。目前，免疫療法的應(yīng)用非常有限。腫瘤化療是指通常在局部手術(shù)治療或輻照之后，服用細(xì)胞毒藥物(細(xì)胞生長抑制劑)來治療仍存在的腫瘤和腫瘤細(xì)胞。這些藥物可以特異性地干擾細(xì)胞分裂的某些過程，也就是說機體內(nèi)存在高比例分裂細(xì)胞的組織，例如快速生長的腫瘤組織，這些組織可以更敏感地作出反應(yīng)。使用的細(xì)胞生長抑制劑是烷基化化合物(例如環(huán)磷酰胺)、抗代謝藥(例如甲氨蝶呤)、生物堿(例如長春新堿)，以及抗生素(例如柔紅霉素和阿霉素)。但是，所有這些藥物均具有大量的副作用的嚴(yán)重缺陷，以致它們僅僅能延緩而不能防止患者死亡。另外，變性(癌)細(xì)胞對所用藥物產(chǎn)生了抗性；導(dǎo)致目前使用的藥物不再有任何的細(xì)胞生長抑制作用，同時由于它們具有副作用導(dǎo)致對患者產(chǎn)生毒性。此外人們還發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞生長抑制劑結(jié)合或順序使用達(dá)到的效果超過單個細(xì)胞生長抑制劑(單一療法)使用達(dá)到的效果，因此，采用多種化療藥進(jìn)行治療時，所產(chǎn)生的嚴(yán)重的副作用可能并不是加成性的?；谒羞@些理由，人們迫切需要新的化療藥，也正因為如此在世界范圍內(nèi)人們正在積極尋找這樣的化療藥。
泵阿米德類(bengamides)的第一類實例是在己內(nèi)酰胺環(huán)上十二烷?；?取代的泵阿米德A和B，它們是從海綿(sea sponge)Jaspis cf.Coriacea(Coppatiidae科，Choristida B Astrophorida目)分離得到的(Adamczewski等人，《有機化學(xué)雜志》(J.Org.Chem.)1986，51，4497-4498)，并且據(jù)報道它們對真核細(xì)胞、線蟲和細(xì)菌是有生物毒性的。
人們已經(jīng)證明，下式泵阿米德E 及其N-甲基化衍生物泵阿米德F是具有抗腫瘤活性的泵阿米德衍生物的實例。泵阿米德E是通過在細(xì)胞周期的G1/S限制位點和G2/M期使細(xì)胞分裂停止而抑制細(xì)胞增殖的。泵阿米德B衍生物可以抑制MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞增殖(Kinder等人，《J.Med.Chem.》2001，44，3692-3699)。
已知泵阿米德衍生物一個共同特征為它們是從Jaspis sp.或Pachastrissa sp.屬的海綿分離得到的(Thale等人，《有機化學(xué)雜志》2001，66，1733-1741)。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，微生物菌株變綠粘球菌(Myxococcus virescens)ST200611(DSM 15898)能生成新的泵阿米德衍生物，它們在低濃度下抑制細(xì)胞增殖，因此適用于治療和/或預(yù)防癌疾病。
因此，本發(fā)明涉及一種下式(I)化合物或式(I)化合物在生理學(xué)上可耐受的鹽 式中R1是H或(C1-C6)-烷基，
R2是H或OH，以及R3是H或-C(＝O)-(C1-C6)-烷基。
彼此獨自地，R1優(yōu)選是H或甲基，而R3優(yōu)選是H。
優(yōu)選本發(fā)明涉及如下定義的式(I)化合物，其中R1是H或甲基，R2是H或OH，以及R3是H。
(C1-C6)-烷基是指具有至多6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基(Me)、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基或正己基，優(yōu)選甲基。
此外，本發(fā)明還涉及一種式(I)化合物，它可用下式(II)化合物、下式(III)化合物、下式(IV)化合物表征 本發(fā)明還涉及本發(fā)明式(I)化合物的所有明顯的化學(xué)等效物。這些化學(xué)等效物僅顯示很小的化學(xué)差異，并且它們具有相同的藥理學(xué)作用，或它們在溫和條件下可以轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。所述的等效物還包括例如式(I)化合物的鹽、還原產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物、酯、醚、乙縮醛或酰胺以及本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員采用標(biāo)準(zhǔn)方法可以制備的等效物，除此之外，還包括所有光學(xué)對映體和非對映體以及所有立體異構(gòu)體形式。
本發(fā)明還涉及制備下式(V)化合物或式(V)化合物在生理學(xué)上可耐受的鹽的方法 式中R1是H或(C1-C6)-烷基，R2是H或OH，R3是H或-C(＝O)-(C1-C6)-烷基，以及R4是甲基或乙基，該方法包括1.將菌株變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)或其變異株和/或突變株中的一種在培養(yǎng)介質(zhì)中在合適條件下發(fā)酵直到一種或多種式(V)化合物在該培養(yǎng)介質(zhì)中自然增長，2.從該培養(yǎng)介質(zhì)中分離式(V)化合物，以及3.適當(dāng)時，將式(V)化合物衍生和/或轉(zhuǎn)化成在生理學(xué)上可耐受的鹽。
優(yōu)選本發(fā)明涉及制備其中R4是乙基的式(V)化合物的方法。該方法的產(chǎn)物相應(yīng)于如前面描述的式(I)化合物。
特別優(yōu)選本發(fā)明涉及制備這樣的式(V)化合物的方法，在式中，彼此獨自地R1是H或甲基，R3是H，而R4是乙基。
此外，本發(fā)明涉及制備式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物以及泵阿米德衍生物E和F的方法。
除非另外指出，式(I)和(V)化合物的手性中心可以為R構(gòu)型或為S構(gòu)型。本發(fā)明涉及光學(xué)純的化合物和立體異構(gòu)體混合物，例如對映異構(gòu)體混合物和非對映異構(gòu)體混合物。
式(I)和(V)化合物在生理學(xué)上可耐受的鹽應(yīng)該理解是它們的有機鹽和無機鹽，如《Remington′s Pharmaceutical Sciences)》(第17版，第1418頁(1985))中所描述的。鑒于較好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性以及較高溶解性的原因，所以對于含有酸基團的化合物，優(yōu)選鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽和銨鹽；對于含有堿基團的化合物，優(yōu)選鹽酸、硫酸或磷酸的鹽，或羧酸或磺酸的鹽，例如乙酸、檸檬酸、苯甲酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸和對甲苯磺酸的鹽。
所述培養(yǎng)介質(zhì)是一種營養(yǎng)液或一種固體介質(zhì)，它們含有至少一種通常的碳源和氮源以及通常的無機鹽。如果向該培養(yǎng)介質(zhì)添加羥基賴氨酸，則菌株變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)由于消化了羥基賴氨酸能夠產(chǎn)生其中R2是OH的化合物(V)。
因此，本發(fā)明主題的一部分涉及制備如前面所描述的其中R2是OH的式(V)化合物的方法，并且其中步驟1的培養(yǎng)介質(zhì)含有羥基賴氨酸。
本發(fā)明的方法可以用于實驗室規(guī)模(毫升至升規(guī)模)發(fā)酵，也可以用于工業(yè)規(guī)模(立方米規(guī)模)發(fā)酵。
所述發(fā)酵的合適的碳源是可同化碳水化合物和糖醇，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或D-甘露醇，以及含碳水化合物的天然產(chǎn)品，例如麥芽汁或酵母提取物。含氮營養(yǎng)物的實例是氨基酸、肽和蛋白質(zhì)，還有其降解產(chǎn)物，例如酪蛋白、蛋白胨或胰蛋白胨；肉膏、酵母提取物、谷蛋白、磨細(xì)種籽，例如玉米、小麥、豆、黃豆或棉花植物的種籽；生產(chǎn)醇的蒸餾殘留物；肉粉；酵母提取物、銨鹽、硝酸鹽。優(yōu)選的氮源是一種或多種肽，它們可采用合成或生物合成方法得到。無機鹽的實例是堿金屬、堿土金屬、鐵、鋅、鈷和錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽。微量元素實例是鈷和錳。
制備本發(fā)明泵阿米德的合適條件如下優(yōu)選在一種培養(yǎng)介質(zhì)中生成本發(fā)明的泵阿米德，所述培養(yǎng)介質(zhì)含有0.05-5％、優(yōu)選0.1-2.5％酵母提取物；0.2-5.0％、優(yōu)選0.1-2％酪胨；0.02-1.0％、優(yōu)選0.05-0.5％CaCl2·2H2O；0.02-1.5％、優(yōu)選0.05-0.7％MgSO4·7H2O和0.00001-0.001％氰基維生素B12。在每種情況下給出的百分?jǐn)?shù)值都是以總營養(yǎng)液總重量計。
對所述微生物進(jìn)行需氧培養(yǎng)，即例如進(jìn)行深層培養(yǎng)，同時在振蕩瓶或發(fā)酵器中進(jìn)行振蕩或攪拌，或在固體介質(zhì)中進(jìn)行需氧培養(yǎng)，必要時通入空氣或氧氣。可以在溫度約18-35℃下、優(yōu)選20-32℃、特別優(yōu)選27-30℃下培養(yǎng)這種微生物。pH范圍可以為4-10，優(yōu)選6.5-7.5。一般而言，在這些條件下培養(yǎng)所述微生物的時間是2-10天，優(yōu)選72-168小時。最好分幾步培養(yǎng)這種微生物，即開始用一種液體營養(yǎng)介質(zhì)制備一個或多個初步培養(yǎng)物，然后將這些初步培養(yǎng)物接種到實際生產(chǎn)介質(zhì)中，即主培養(yǎng)物中，例如按體積計以1∶10至1∶100的比例進(jìn)行接種。例如將呈營養(yǎng)細(xì)胞或子實體形式的菌株接種到一種營養(yǎng)液中，再使其生長約20-120小時，優(yōu)選48-96小時，由此得到初步培養(yǎng)物。例如，使所述菌株在固體或液體營養(yǎng)底物，例如酵母瓊脂上生長約1-15天、優(yōu)選4-10天可以得到營養(yǎng)細(xì)胞和/或子實體。
采用已知的方法并考慮到天然物質(zhì)的化學(xué)、物理和生物性質(zhì)，可以由所述培養(yǎng)介質(zhì)分離或純化，從而得到一種式(V)泵阿米德衍生物。采用HPLC測定了在這種培養(yǎng)介質(zhì)或在各個分離步驟中泵阿米德衍生物的濃度，同時很方便地將生成物質(zhì)的量與一種校正液進(jìn)行比較。
分離時，所述培養(yǎng)液或培養(yǎng)物與固體介質(zhì)一起進(jìn)行冷凍干燥，此后使用一種有機溶劑，例如甲醇或2-丙醇，從這種凍干物提取泵阿米德衍生物。所述有機溶劑相含有本發(fā)明的天然物質(zhì)；適當(dāng)時，對其進(jìn)行真空濃縮，然后再進(jìn)行進(jìn)一步純化。
采用適當(dāng)材料的層析法，優(yōu)選例如分子篩、硅膠、氧化鋁、離子交換劑或吸附樹脂或反相層析(RPs)，對本發(fā)明的一種或多種化合物進(jìn)行進(jìn)一步純化。采用這種層析法分離泵阿米德衍生物。使用緩沖水溶液或水溶液和有機溶液的混合物對這些泵阿米德衍生物進(jìn)行層析分離。
水溶液和有機溶液的混合物應(yīng)該理解是所有與水混溶的有機溶劑，優(yōu)選甲醇、2-丙醇或乙腈，有機溶劑的濃度是5-95％，優(yōu)選5-40％，或與有機溶劑混溶的所有緩沖水溶液。使用的緩沖液與前面指出的相同。
基于它們的極性不同，可以采用反相層析法，例如使用MCl(日本，Mitsubishi的吸附樹脂)或Amberlite XAD(TOSOHMS)，或其它疏水材料，例如RP-8或RP-18相，分離這些泵阿米德衍生物。另外，可以采用正相層析法，例如采用硅膠、氧化鋁等，進(jìn)行這種分離。
使用緩沖的堿性或酸化水溶液或水溶液與醇或其它與水混溶的有機溶劑的混合物，對這些泵阿米德衍生物進(jìn)行層析分離。優(yōu)選的是使用乙腈和甲醇作為有機溶劑。
緩沖的堿性或酸化水溶液應(yīng)該理解是例如水、磷酸鹽緩沖液、乙酸銨和檸檬酸鹽緩沖液，其濃度直到0.5M，以及甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨和三乙胺，或本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的市售酸和堿，優(yōu)選其濃度高至1％。在緩沖水溶液的情況下，特別優(yōu)選的是0.1％乙酸銨。
采用100％水開始、100％溶劑結(jié)束的梯度法進(jìn)行這種層析分離，優(yōu)選采用5％到95％乙腈的線性梯度法進(jìn)行這種層析分離。
或者，也可以進(jìn)行凝膠層析分離或疏水相的層析分離。凝膠層析采用聚丙烯酰胺凝膠或共聚物凝膠進(jìn)行，例如Biogel-P 2(Biorad)或FractogelTSK HW40(Merck，德國)。上述層析分離步驟的順序可以顛倒。
如果泵阿米德以非對映異構(gòu)體存在，那么則可以采用已知的方法，例如采用手性柱分離方法，將它們分離。
采用本身已知的方法(J.March，《高級有機化學(xué)》(Advanced OrganicChemistry)，John Wiley & Sons，第4版，1992年)，例如通過與一種酸酐進(jìn)行反應(yīng)，可將式(I)和/或(V)化合物(在每種情況下R3都是H)側(cè)鏈OH基團衍生得到一種?；?在每種情況下R4是-C(＝O)-(C1-C6)-烷基)。例如Adamczeski等人在《J.Am.Chem.Soc.》1989，111，647-654中描述了與乙酸酐反應(yīng)，得到一種式(I)和/或(V)化合物，其中R3是-C(＝O)-CH3。
同樣地，采用本身已知的方法(J.March，《高級有機化學(xué)》，John Wiley& Sons，第4版，1992年)，例如通過與Me2CO3或Me2SO4反應(yīng)制備相應(yīng)的N-甲基化衍生物，或通過在堿存在下與(C1-C6)-烷基溴進(jìn)行反應(yīng)，使式(I)和/或(V)化合物(在每種情況下R1是H)的己內(nèi)酰胺中的NH基團進(jìn)行烷基化。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于2003年9月11日將微生物菌株變綠粘球菌ST200611分離物保藏于德國的德意志微生物保藏中心(DSM)，保藏號為DSM 15898，Mascheroder Weg 1B，38124 Braunschweig。
菌株DSM 15898的營養(yǎng)細(xì)胞為棒狀，這是變綠粘球菌的特征。在固體營養(yǎng)底物上，變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)形成含有圓形粘液孢子的橙黃色子實體。
除菌株變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)外，還可以使用能合成一種或多種本發(fā)明化合物的該菌株的突變株和/或變異株。
突變株是這樣一種微生物，即其中基因組中的一種或多種基因已被決定著該生物體產(chǎn)生本發(fā)明化合物的一種基因或多種基因改性，同時依然保持功能性和可遺傳性。
采用物理方法，例如輻照，像使用紫外射線或X-射線，或使用化學(xué)誘變劑，例如甲磺酸乙酯(EMS)、2-羥基-4-甲氧基苯甲酮(MOB)或N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，或如Brock等人在《微生物生物學(xué)》(Biology ofMicroorganism)，Prentice Hall，第238-247頁(1984)中所描述的方法，以已知的方式可以生產(chǎn)這樣一些突變株。
變異株是所述微生物的表型。微生物具有適應(yīng)環(huán)境的能力，因此具有高發(fā)育的生理可塑性。在這種表型適應(yīng)過程中涉及到微生物的所有細(xì)胞，在改變的條件下，其變化的性質(zhì)不是遺傳調(diào)節(jié)的，但是是可逆的(H.Stolp，《(微生物生態(tài)學(xué)有機體、生長環(huán)境、活力》(Microbial ecologyorganismus，habitats，activities)，劍橋大學(xué)出版社，劍橋，GB，第180頁，1988年)。
按照下面流程篩選可合成本發(fā)明的一種或多種化合物的突變株和/或變異株-將發(fā)酵介質(zhì)冷凍干燥；-用有機溶劑提取所述種冷凍干燥物；-使用固相從培養(yǎng)物濾液中提取所述化合物；-采用HPLC、TLC或通過試驗生物活性進(jìn)行分析。
描述的發(fā)酵條件可以適用于變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)及其突變株和/或變異株。
本發(fā)明還涉及微生物變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)或其突變株和/或變異株在制備如前面所述的式(V)化合物、特別是式(IV)化合物或其在生理學(xué)上可接受鹽中的用途。
采用基于測定細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的試驗來檢測對細(xì)胞增殖的抑制作用。可以使用已知的腫瘤細(xì)胞系，例如Hep-G2和Colo205。在這個試驗中，代謝活性細(xì)胞的ATP含量在熒光素酶反應(yīng)中用作活細(xì)胞數(shù)的度量。
在該試驗中采用的式(II)-(VI)化合物的單次劑量為0.3-40μM，以TC50值給出劑量相關(guān)性，在每種情況下，(IIA)和(IIB)表示式(II)化合物的非對映異構(gòu)體
因此，本發(fā)明還涉及式(I)化合物或其在生理學(xué)上可接受鹽作為人或動物藥物的用途，特別是在治療和/或預(yù)防癌疾病中的用途。優(yōu)選本發(fā)明涉及式(I)化合物或其在生理學(xué)上可接受鹽在治療乳腺癌、腸癌、胃癌、肝癌、腦腫瘤、卵巢腫瘤、食道癌、腎癌和肌肉細(xì)胞瘤、特別是頭和頸肌肉癌中的用途。
此外，本發(fā)明涉及一種含有至少一種式(I)化合物或其在生理學(xué)上可耐受的鹽的藥物，可以將一種或多種式(I)化合物本身給藥，但是優(yōu)選以含有一種或多種通常在藥理學(xué)上合適的載體物質(zhì)或輔助物質(zhì)的混合物形式給藥。
本發(fā)明化合物在固態(tài)下是穩(wěn)定的，在pH2-9、特別是在5-7的溶液中也是穩(wěn)定的，因此可以配制為常規(guī)的蓋侖制劑。
盡管本發(fā)明的藥物可以口服或腸胃道外給藥，但是直腸給藥原則上也是可能的。合適的固體或液體蓋侖制劑形式的實例是顆粒劑、粉劑、片劑、糖衣片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿、乳劑、混懸液、氣霧劑或安瓿注射液，以及緩釋活性化合物的制劑，制備這些制劑時，可以使用在藥理學(xué)上合適的載體物質(zhì)或輔助物質(zhì)，例如崩解劑、粘合劑、包衣劑、膨脹劑、助流劑、潤滑劑、矯味劑、甜味劑或穩(wěn)定劑，例如碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動植物油、聚乙二醇和溶劑，例如無菌水、醇、乙二醇和多元醇。
必要時，可以將口服劑量單位微膠囊化，以便延緩釋放或延緩達(dá)到一個相對長的時間，例如將顆粒狀活性化合物包衣或包埋在適當(dāng)?shù)木酆衔?、蠟等中?br> 優(yōu)選生產(chǎn)劑量單位的藥物制劑并進(jìn)行給藥，每個單位含有確定劑量的一種或多種式(I)泵阿米德衍生物化合物作為活性組分。在固體劑量單位，例如片劑、膠囊和栓劑的情況下，該劑量可以多至每天約500mg，優(yōu)選0.1-200mg，而在安瓿注射液的情況下，該劑量可以多至每天約200mg，但優(yōu)選約0.5-100mg。
給藥的日劑量取決于哺乳動物個體的體重、年齡、性別和狀況。但是，可以理解，更高或更低的日劑量可能也適合。這種日劑量可以是單個劑量單位進(jìn)行給藥，或分為幾個更小劑量單位進(jìn)行給藥，以及按照確定間隔將亞劑量分多次進(jìn)行給藥。
可以通過將一種或多種本發(fā)明的式(1)化合物加到適當(dāng)給藥形式中，任選加入一種或多種常規(guī)載體物質(zhì)或輔助物質(zhì)，來生產(chǎn)本發(fā)明的藥物。
下面的實施例用于更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除非另外指出，百分?jǐn)?shù)值系指重量百分?jǐn)?shù)，而在液體情況下混合比系指體積混合比。
實施例1在-135℃儲存變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)在瓊脂板(1％新baker氏酵母、1％CaCl2·2H2O、20mM HEPES、0.00005％氰基維生素B12、1.5％瓊脂，pH7.2)上接種菌株變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)，并在30℃培養(yǎng)約7天。使用無菌藥刀從瓊脂表面刮下在表面培養(yǎng)物中的細(xì)胞，將其懸浮于0.5ml酪胨介質(zhì)(1％酪胨(Difco)、0.15％MgSO4·7H2O，pH7.0)中，儲存在-135℃下。
實施例2在錐形瓶中制備變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)初步培養(yǎng)物在300ml無菌錐形瓶中的100ml營養(yǎng)液(1％新baker氏酵母、1％CaCl2·2H2O、20mM HEPES、0.00005％氰基維生素B12，pH7.2)中接種菌株變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)，該培養(yǎng)物在30℃、180rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)4天。然后使用5ml這種初步培養(yǎng)物制備主培養(yǎng)物。
實施例3制備變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)的液體主培養(yǎng)物在裝有100ml含有下述營養(yǎng)液(0.5％酵母提取物、0.5％酪胨、0.1％CaCl2·2H2O、0.2％MgSO4·7H2O、0.00005％氰基維生素B12，pH7.4)的300ml無菌錐形瓶中，接種5ml初步培養(yǎng)物(見實施例2)或在新瓊脂板(1％新baker氏酵母、1％CaCl2·2H2O、20mM HEPES、0.00005％氰基維生素B12，pH7.2，1.5％瓊脂)上生長的培養(yǎng)物，在30℃、于180rpm振蕩器上進(jìn)行培養(yǎng)。在72-96小時后本發(fā)明的泵阿米德達(dá)到最大量。如實施例2所述的由同樣營養(yǎng)液得到的72-96小時齡深層培養(yǎng)物(接種量約5-10％)足以接種10-200L發(fā)酵罐。
實施例4制備變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)的液體主培養(yǎng)物，同時加入羥基賴氨酸，用于生產(chǎn)泵阿米德衍生物(IV)在裝有100ml含有下述營養(yǎng)液(0.5％酵母提取物、0.5％酪胨、0.1％CaCl2·2H2O、0.2％MgSO4·7H2O、0.00005％氰基維生素B12、1mM羥基賴氨酸，pH7.4)的300ml無菌錐形瓶中，接種5ml實施例2的初步培養(yǎng)物或在新瓊脂板(1％新baker氏酵母、1％CaCl2·2H2O、20mM HEPES、0.00005％氰基維生素B12，pH7.2，1.5％瓊脂)上生長的培養(yǎng)物，在30℃、于180rpm振蕩器上進(jìn)行培養(yǎng)。在72-96小時后泵阿米德衍生物(IV)產(chǎn)生達(dá)到最大量。采用HPLC-MS進(jìn)行分析。如實施例2所述由同樣營養(yǎng)液得到的72-96小時齡深層培養(yǎng)物(接種量約5-10％)足以接種10-200L發(fā)酵罐。
實施例5在發(fā)酵罐中制備泵阿米德衍生物按照下述條件操作10L和30L發(fā)酵罐接種物約5％約9％發(fā)酵罐30L 10L營養(yǎng)介質(zhì) 見實施例2見實施例2培養(yǎng)溫度 30℃ 30℃攪拌速度 112rpm 150rpm通氣 8L/min 4L/min
pH調(diào)節(jié)PH7.8至pH7.5PH8.1至pH7.5pO2調(diào)節(jié) 無 無始終分別周10％KOH或10％H2SO4調(diào)節(jié)pH。重復(fù)添加Clerol FBA265(Cognis Deutschland GmbH)可以抑制泡沫的形成。在約72-96小時后達(dá)到最大的產(chǎn)生量。
實施例6從振蕩的變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)培養(yǎng)物中分離泵阿米德衍生物(II)和(III)以及泵阿米德E和F在變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)發(fā)酵結(jié)束后，實施例3(30L培養(yǎng)液)的培養(yǎng)液與菌體一起進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥物用甲醇(2×5L)提取。甲醇提取物在真空下濃縮到1.2L，然后上樣到制備柱上，該柱裝填約1.5升CHP-20P材料(MCI凝膠，75-150μ，Mitsubishi Chemical Corporation)。該柱用95％甲醇洗脫。收集柱流出物(120ml/min)，并在真空下濃縮到1.5L。
實施例7采用RP-18層析法制備泵阿米德衍生物(II)和(III)以及泵阿米德E和F將1.5L如實施例6描述所得到的溶液上樣于Phenomenex Luna10μC18(2)柱(尺寸50mm×250mm)上，該柱具有一個Luna10μC18(2)前置柱(尺寸21.2mm×60mm)，使用從5％到95％乙腈在水中的溶液(0.1％乙酸銨，pH4.6，用乙酸調(diào)節(jié)pH)進(jìn)行梯度洗脫60min。流速是150ml/min，餾分量是200ml。在餾分5-9、10-11和12-14中有泵阿米德。
實施例8泵阿米德衍生物(II)和(III)以及泵阿米德E和F的純化將實施例7的單個餾分進(jìn)行冷凍干燥，并用Phenomenex Luna10μC18(2)柱(尺寸21mm×250mm)的HPLC純化再一次，該柱有一個XTerraPrep MS C18 10μm(Waters，尺寸19×10mm)前置柱。該柱在40min內(nèi)使用5％到40％乙腈在水中的溶液梯度洗脫(加入0.1％乙酸銨，pH8.8，用三乙胺調(diào)節(jié)pH)。按餾分收集柱流出物(50ml/min)，每餾分7.5ml。實施例7的餾分5-9含有式(III)化合物，在層析分離與冷凍干燥后得到86mg泵阿米德E(純度＞95％)。在層析分離后，實施例7的餾分10-11得到145mg泵阿米德(II)(純度＞95％，70/30非對映異構(gòu)體混合物)和5mg泵阿米德F(純度＞95％)。由實施例7的餾分12-14得到35mg泵阿米德(III)(純度＞95％)，為非對映異構(gòu)體混合物，其比75∶25。在每種情況下，該非對映異構(gòu)體是相應(yīng)的C-16差向異構(gòu)體。
實施例9從振蕩的變綠粘球菌ST200611(DSM15898)培養(yǎng)物中分離羥基泵阿米德(IV)在變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)發(fā)酵結(jié)束后，實施例5(10L培養(yǎng)液)的培養(yǎng)液與菌體一起進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥物用甲醇(2×3L)提取。甲醇提取物在真空下濃縮到400ml，然后上樣于一個制備柱上，該柱裝填約0.6升CHP-20P(MCI凝膠，75-150μ，Mitsubishi Chemical Corporation)材料。該柱用5％至95％甲醇水溶液洗脫。在60min內(nèi)按餾分收集柱流出物(100ml/min)。匯集含有所需衍生物的餾分(餾分45-109)，并在真空下濃縮到700ml。
實施例10采用RP-18層析法預(yù)純化羥基泵阿米德(IV)將實施例9的溶液上樣到一個Phenomenex Luna10μC18(2)柱(尺寸50mm×250mm)中，該柱有一個Phenomenex Luna10μC18(2)前置柱(尺寸21.2mm×60mm)，在60min內(nèi)使用從5％至40％梯度乙腈水溶液洗脫(0.1％乙酸銨，pH8.8，用三乙胺調(diào)節(jié)其pH)。流速是150ml/min，餾分的量是225ml。餾分22含有所需的泵阿米德衍生物。
實施例11純化羥基泵阿米德(IV)將實施例10的餾分22進(jìn)行冷凍干燥，再采用PhenomenexLuna10μC18(2)柱(尺寸21mm×250mm)的HPLC再純化一次，該柱有一個Waters XTerraPrep MS C18 10μm前置柱(尺寸19×10mm)。該柱再使用從5％到95％乙腈在水中的梯度溶液洗脫60分鐘(加入0.1％乙酸銨，pH4.6，用乙酸調(diào)節(jié)pH)。按餾分(每種餾分7.5ml)收集柱流出物(50ml/min)。將含有泵阿米德的餾分(餾分26-28)合并、脫鹽并凍干。由此，得到7mg泵阿米德(IV)，為比75∶25的非對映異構(gòu)體混合物。
實施例12式(II)化合物的表征經(jīng)驗式C18H32N2O6分子量372.47非對映異構(gòu)體混合物75∶25
實施例13式(III)化合物的表征經(jīng)驗式C19H34N2O6分子量386.49非對映異構(gòu)體混合物75∶25
實施例14式(IV)化合物的表征經(jīng)驗式C18H32N2O7分子量388.46非對映異構(gòu)體混合物75∶25
實施例15泵阿米德E的表征經(jīng)驗式C17H30N2O6分子量358.44
實施例16泵阿米德F的表征經(jīng)驗式C18H32N2O6分子量372.47
實施例17分離化合物(II)非對映異構(gòu)體采用一種手性柱(AD/H，Daicel，20×200mm，0.5ml流速，移動相乙腈∶甲醇4∶1+0.1％NH4Ac)分離實施例8的式(II)化合物非對映異構(gòu)體混合物。采用分析AD/H柱(Daicel)(4.6×250mm，30℃，移動相乙腈∶甲醇4∶1+0.1％NH4Ac、0.75ml流速，Rt峰19.9min，Rt峰210.9min)校正光學(xué)純度。
實施例18對各種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞增殖測定腫瘤細(xì)胞系Hep-G2(ATCC No.HB-8065)和COLO 205(ATCC No.CCL-222)用于測定細(xì)胞增殖。該細(xì)胞系分別以比率1000個細(xì)胞/孔[Hep-G2]和3500個細(xì)胞/孔[Colo205]接種到細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中，并在37℃、5％CO2下培養(yǎng)4小時。
Hep-G2的介質(zhì)Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基/Ham氏F12-Mix(Gibco)；NEAA(10％；非必需氨基酸，Gibco)、丙酮酸鈉(1％，Gibco)，L-谷氨酰胺(1％，Gibco)、胎牛血清(5％；PAA)]。
COLO 205的介質(zhì)RPMI 1640(Gibco)、L-谷氨酰胺(1％，Gibco)、HEPES(1％，Gibco)、胎牛血清(10％；PAA)。
在4小時后，將化合物(II)、(III)和(IV)以及泵阿米德E和F溶于DMSO/細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中，再以各種濃度加入，將這些混合物在37℃、5％CO2下培養(yǎng)72小時。使用檢測試劑CellTiterGlo(Promega)測定細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。
細(xì)胞增殖試驗結(jié)果列于表1。
權(quán)利要求
1.下式(I)化合物或它們在生理學(xué)上可耐受的鹽 式中R1是H或(C1-C6)-烷基，R2是H或OH，以及R3是H或-C(＝O)-(C1-C6)-烷基，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1是H或甲基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中R3是H。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的化合物，其中R1是H或甲基，R2是H或OH，且R3是H。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于所述化合物為下式(II)化合物
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于所述化合物為下式(III)化合物
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于所述化合物為下式(IV)化合物
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的式(I)化合物或其在生理學(xué)上可耐受的鹽在生產(chǎn)藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的式(I)化合物或其在生理學(xué)上可耐受的鹽在生產(chǎn)治療和/或預(yù)防癌病的藥物中的用途。
10.藥物，該藥物含有根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的式(I)化合物或其在生理學(xué)上可耐受的鹽。
11.制備下式(V)化合物或式(V)化合物在生理學(xué)上可耐受的鹽的方法 式中R1是H或(C1-C6)-烷基，R2是H或OH，R3是H或-C(＝O)-(C1-C6)-烷基，且R4是甲基或乙基，該方法包括1.將變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)菌株或其變異株和/或突變株中的一種在培養(yǎng)介質(zhì)中在合適條件下發(fā)酵直到一種或多種式(V)化合物在該培養(yǎng)介質(zhì)中自然增長，2.從該培養(yǎng)介質(zhì)中分離式(V)化合物，以及3.適當(dāng)時，將式(V)化合物衍化和/或轉(zhuǎn)化為其在生理學(xué)上可耐受的鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中R4是乙基。13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中彼此獨自地R1是H或甲基，R3是H，而R4是乙基。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項權(quán)利要求所述的方法，其中R2是OH，并且所述培養(yǎng)介質(zhì)含有羥基賴氨酸。
15.微生物變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)。
16.微生物變綠粘球菌ST200611(DSM 15898)或其突變株和/或變異株在制備下式(V)化合物或它們在生理學(xué)上可耐受的鹽中的用途 式中R1是H或(C1-C6)-烷基，R2是H或OH，R3是H或-C(＝O)-(C1-C6)-烷基，以及R4是甲基或乙基。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物變綠粘球菌(Myxococcusvirescens)ST200611(DSM15898)在發(fā)酵時生成的泵阿米德衍生物、它們在治療癌中的用途、含有泵阿米德衍生物的藥物、生產(chǎn)式(V)泵阿米德的方法。本發(fā)明還涉及微生物變綠粘球菌。
文檔編號A61K31/55GK1871217SQ200480030646
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者H·霍夫曼, S·哈格-里施特, M·庫爾茨, H·蒂特根 申請人:塞諾菲-安萬特德國有限公司