專利名稱：包含脂質(zhì)體的射線照相造影劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在射線照相法中使用的非口服造影劑，特別是涉及含有包封了造影劑材料的脂質(zhì)體的射線照相造影劑。
背景技術(shù)：
簡(jiǎn)單的X射線照相術(shù)和計(jì)算機(jī)X射線斷層造影是當(dāng)前醫(yī)學(xué)影像診斷的核心。所謂的硬度大的組織例如骨骼和牙齒能夠有效的吸收X射線，因此可以得到高對(duì)比度的X射線影像。反之，不同的軟組織之間吸收X射線的差別相對(duì)小，難于獲得高對(duì)比度的影像。此時(shí)，通常使用造影劑來(lái)獲得高對(duì)比度的影像。
當(dāng)前實(shí)際應(yīng)用的X射線造影劑幾乎全部都是包含三碘苯基基團(tuán)的水溶性化合物的造影劑材料。造影劑被送入內(nèi)腔區(qū)域中，例如血管、輸尿管或者輸卵管，用來(lái)檢查內(nèi)腔的形狀和狹窄。然而，由于上述化合物沒(méi)有與組織或疾病區(qū)域相互作用而迅速?gòu)膬?nèi)腔區(qū)域流出，這不益于對(duì)組織或疾病區(qū)域具體例如癌組織的詳細(xì)檢查。所以，期望有一種X射線造影劑能夠選擇性積聚于目標(biāo)組織或疾病區(qū)域之內(nèi)/或之上，由此獲得和周?chē)蚱渌麉^(qū)域具有清晰對(duì)比區(qū)別的影像。這樣的造影劑能夠?qū)词刮⑿×康陌┙M織進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。不但X射線照相術(shù)而且其它基于不同測(cè)量原理的方法也已經(jīng)發(fā)展成為定位腫瘤的檢查方法。例如，MRI(核磁共振成像)在癌組織具體例如微小量的癌組織的精確成像中顯示出有限的靈敏度，PET(正發(fā)射X射線斷層造影)由于其需暴露于放射線中和其操作成本而沒(méi)有普遍應(yīng)用，上面兩種方法都需要大型的設(shè)備和昂貴的儀器，仍都不是常規(guī)使用的檢查方法。
國(guó)際公開(kāi)WO98/46275、同WO95/31181、同WO96/28414、同WO96/00089，美國(guó)專利號(hào)4873075和4567034公開(kāi)的方法中將疏水性的碘化合物分散在存有表面活性劑或脂肪的水中，以使腫瘤、肝臟、脾臟、腎上腺皮質(zhì)、動(dòng)脈硬化巢、脈管和淋巴系統(tǒng)成像。在上述方法中，微粒造影劑的使用延長(zhǎng)了它的內(nèi)部保留時(shí)間，以選擇性增強(qiáng)疾病區(qū)域的影象對(duì)比。然而，為了這個(gè)目的而提出的藥學(xué)制劑在增強(qiáng)對(duì)比效率和選擇性方面是不足的。而且，其中使用的碘化合物是疏水性的，因此成像之后向外排出會(huì)受到阻礙，產(chǎn)生一些問(wèn)題，比如增加病人的不適。
此外，對(duì)于生成微粒形式造影劑這一技術(shù)的方法進(jìn)行了研究，該方法中造影劑化合物被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，該脂質(zhì)體含有與生物膜類似的脂類，并且由于它的低抗原性而顯示出高安全性。國(guó)際公開(kāi)WO88/09165、同WO89/00988、同WO90/07491，JP-A No.07-316079和2003-5596(在下文中，術(shù)語(yǔ)JP-A指日本專利申請(qǐng)公開(kāi))提出了一種包含離子或非離子型造影劑的脂質(zhì)體。日本專利號(hào)2619307公開(kāi)了一種方法，其中水溶性的碘化合物被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，通過(guò)將脂質(zhì)體內(nèi)碘化合物的量增加到1.5至6g/g類脂會(huì)增強(qiáng)器官選擇性。然而，這種方法被證明對(duì)腫瘤是低選擇性的。推斷這可能是由于尺寸為0.5-1.0μm的相對(duì)大的粒子。大約0.1μm的粒子可能更適合積聚在腫瘤組織上，然而，在上述方法中很難得到細(xì)小粒子，并且減小囊泡的尺寸會(huì)導(dǎo)致碘/脂質(zhì)量比降低。此外，在上面的方法中，盡管脂質(zhì)體作為原料在體內(nèi)顯示出高度安全性和體內(nèi)最佳降解性，然而在制備過(guò)程中使用了有機(jī)溶劑，特別是含氯溶劑如氯仿和二氯甲烷，作為磷脂形成脂質(zhì)體膜的溶劑。因此，由于殘留溶劑的毒性，上述方法均不能進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。
從另一方面來(lái)說(shuō)，盡管脂溶性的化學(xué)物質(zhì)易于被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，然而取決于其它因素包封量不必很大。盡管水溶性電解質(zhì)也能被包封在脂質(zhì)體內(nèi)通過(guò)化學(xué)物質(zhì)的電荷與帶電脂類相互作用，但是對(duì)于水溶性的非電解質(zhì)，上述方法是行不通的。通常期望將基本上表現(xiàn)出低毒性的非離子型碘化合物而不是離子型造影劑化合物包封在脂質(zhì)體內(nèi)，從上述的原因來(lái)看，這并非易事。此外，成型的脂質(zhì)體容易形成多層膜，并且碘化合物的包封率低。將水溶性的非電解質(zhì)有效的包封在脂質(zhì)體內(nèi)的方法包括，例如，反相蒸發(fā)法和乙醚注射法。然而，在這些方法中使用了有機(jī)溶劑，會(huì)產(chǎn)生安全性問(wèn)題。
JP-A No.2003-119120公開(kāi)了一種通過(guò)使用超臨界二氧化碳制備含有脂質(zhì)體的化妝品或者皮膚外用藥品的方法，該方法具體實(shí)施在制備皮膚外用藥品中，使親水性和疏水性的藥用成分密閉在脂質(zhì)體內(nèi)。然而，盡管其中公開(kāi)了作為藥用成分的水溶性電解質(zhì)的例子，但是水溶性非電解質(zhì)通過(guò)這種方法是否有效地包封在脂質(zhì)體內(nèi)是不清楚的。
即使造影劑材料能夠很好的包封在脂質(zhì)體內(nèi)，一些問(wèn)題例如造影劑隨著時(shí)間推移的泄漏或者脂質(zhì)體自身環(huán)境變得不穩(wěn)定都是必須要考慮的。進(jìn)一步指出因?yàn)橹|(zhì)體導(dǎo)入生物體后幾乎總是陷進(jìn)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)中，例如肝或脾，因而并沒(méi)有達(dá)到預(yù)想的效果(Cancer Res.，43，5328(1983))。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供一種用于X射線診斷的造影劑，其通過(guò)將造影劑材料包封在脂質(zhì)體內(nèi)顯示了有效傳輸和高度選擇性。具體地，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠探測(cè)出微小的癌組織并顯示出極佳的腫瘤圖像的射線照相造影劑及其制備方法，在該造影劑中碘化合物被包封在脂質(zhì)體內(nèi)且沒(méi)有使用毒性有機(jī)溶劑。
上述目的是通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的射線照相造影劑，其特征在于該造影劑包含包封了水溶性非離子型碘化合物的脂質(zhì)體，并且該造影劑基本上不含含氯溶劑。
該造影劑的特征在于脂質(zhì)體是通過(guò)以下步驟制備的，將磷脂與超臨界二氧化碳或亞臨界二氧化碳混合，并使得水溶性非離子型碘化合物與磷脂接觸形成脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體優(yōu)選基本上是單層囊泡。
碘化合物優(yōu)選至少含有一個(gè)2，4，6-三碘苯基基團(tuán)。
脂質(zhì)體的優(yōu)選平均囊泡尺寸為0.05到0.5μm。
平均囊泡尺寸優(yōu)選0.05到0.2μm。
平均囊泡尺寸優(yōu)選0.11到0.13μm。
脂質(zhì)體優(yōu)選包含經(jīng)具有10到3500個(gè)氧化乙烯單元的聚乙二醇修飾的脂質(zhì)膜(lipid membrane)，該P(yáng)EG的量為基于形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的0.1重量％到30重量％。
脂質(zhì)體優(yōu)選是經(jīng)0.1到0.4μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾的脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體優(yōu)選包封碘化合物，該碘化合物與脂質(zhì)體膜脂質(zhì)(liposomemembrane lipid)重量比為1～10(1 to 10)。
碘化合物與脂質(zhì)體膜脂質(zhì)的重量比為3～8。
碘化合物與脂質(zhì)體膜脂質(zhì)的重量比為5～8。
包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物占造影劑中全部碘化合物重量的5％到30％。
脂質(zhì)體優(yōu)選含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)的水相，脂質(zhì)膜包含選自含有聚氧化烯烴基基團(tuán)的化合物和甾醇類至少一種，水相包含碘化合物。
脂質(zhì)體優(yōu)選含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)的水相，脂質(zhì)膜包含由聚氧化烯烴修飾的磷脂，水相包含碘化合物。
脂質(zhì)體是含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)水相的囊泡，脂質(zhì)膜包含聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物，水相包含碘化合物。
含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)水相的脂質(zhì)體，優(yōu)選分散在含水介質(zhì)中，水相和含水介質(zhì)中含有碘化合物和添加劑，并且碘化合物的濃度和添加劑的濃度在水相和含水介質(zhì)中都分別基本上相等。
添加劑優(yōu)選水溶性的胺類緩沖劑或螯合劑。
胺類緩沖劑優(yōu)選氨基丁三醇。
螯合劑優(yōu)選EDTA Na2-Ca。
本發(fā)明的制備方法包括將磷脂與超臨界二氧化碳或亞臨界二氧化碳混合形成混合物，使得水溶性非離子型碘化合物與磷脂接觸形成包含包封了碘化合物的囊泡的脂質(zhì)體。
制備方法優(yōu)選將磷脂與超臨界二氧化碳或亞臨界二氧化碳混合形成混合物，將含有非離子型碘化合物的水溶液導(dǎo)入到混合物中，排出二氧化碳以形成包含包封了碘化合物的囊泡的脂質(zhì)體。
二氧化碳優(yōu)選在50到500kg/cm2的壓力下應(yīng)用。
二氧化碳的溫度優(yōu)選25到200℃。
上述方法中，磷脂和作為脂質(zhì)體膜成分的選自聚氧化烯烴修飾的磷脂、含有聚氧化烯烴基基團(tuán)的化合物、含有聚乙二醇基團(tuán)的化合物和甾醇的化合物中的至少一種相混合，與磷脂、超臨界二氧化碳或亞臨界二氧化碳一起，將碘化合物的水溶液導(dǎo)入其中，之后，排出二氧化碳，形成包封了碘化合物的脂質(zhì)體，并且脂質(zhì)體經(jīng)0.1到0.4μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾。
上述方法中，磷脂和作為脂質(zhì)體膜成分的選自由聚氧化烯烴修飾的磷脂和甾醇中的至少一種相混合，與磷脂、超臨界二氧化碳或亞臨界二氧化碳一起，將碘化合物的水溶液導(dǎo)入其中，之后，排出二氧化碳，形成包封了碘化合物的脂質(zhì)體，并且脂質(zhì)體經(jīng)0.1到0.4μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾，形成包含脂質(zhì)膜和脂質(zhì)膜內(nèi)的封閉水相的脂質(zhì)體，將該脂質(zhì)體分散在含水介質(zhì)中，水相和含水介質(zhì)中都含有碘化合物和添加劑，并且碘化合物的濃度和添加劑的濃度在水相和含水介質(zhì)中都分別基本上相等。
發(fā)明詳述本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述了造影劑化合物、脂質(zhì)體和射線照相造影劑。
造影劑化合物任何可用作于造影劑的離子或非離子型的水溶性碘化合物均可應(yīng)用于本發(fā)明中。非離子的碘化合物，由于通常比離子型碘化合物顯示出較低的滲透壓力而優(yōu)選。特別地，本發(fā)明優(yōu)選含有至少一個(gè)碘代苯基基團(tuán)如2，4，6-三碘苯基基團(tuán)的水溶性非離子型碘化合物。
非離子型碘化合物的具體例子包括碘海醇(iohexol)、碘噴托(iopentol)、碘克沙醇(iodixanol)、碘普胺(iopromide)、碘曲侖(iotrolan)、碘美普爾(iomeprol)、N，N’-雙[2-羥基-1-羥甲基-乙基]-5-[(2-羥基-1-氧代丙基)-氨基]-2，4，6-三碘-1，3-苯-二羧基酰胺(碘帕醇(iopamidol))和甲泛葡胺(metrizamide)。
此外，非離子型碘化合物的例子包括泛影酸(diatrizoic aicd)、泛影酸鈉、泛影葡胺(meglumine diatrizoate)、acetorizoic acid及其可溶性鹽、尿影酸(diprotrizo acid)、碘達(dá)酸(iodamide)、膽影酸鈉(iodipamide sodium)、膽影葡甲胺(meglumine iodipamide)、碘馬尿酸(iodohippuric acid)及其可溶性鹽、iodomethamic acid、碘吡拉啥(iodopyracet)、碘-2-羥基吡啶-N-乙酸、3，5-二碘-4-羥基吡啶-N-乙酸(碘吡拉啥)以及上述酸的二乙基銨鹽、碘他拉酸(iothalamic acid)、甲泛影酸(metrizoic acid)及其鹽、碘番酸(iopanoic acid)、碘醋胺酸(iocetamic acid)、碘芬酸(iophenoic acid)及其可溶性鹽、sodiumthyropanoate、碘泊酸鈉(sodium iopodate)和其它類似的碘化合物。
這些碘化合物可以單獨(dú)使用也可聯(lián)合使用。應(yīng)用于本發(fā)明中的碘化合物并不限于上述所列舉的化合物，并且不僅包括游離形式，還包括其鹽和水合物形式。
在本發(fā)明中適合作為射線照相造影劑的碘化合物優(yōu)選碘美普爾(iomeprol)、碘帕醇(iopamidol)、碘曲侖(iotrolan)和碘克沙醇(iodixanol)，它們即使在相對(duì)高的濃度中也表現(xiàn)出高親水性和低滲透壓。特別是二聚的非離子型碘化合物如碘曲侖和碘克沙醇更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楫?dāng)在相同的碘濃度中制備時(shí)，它們制備得到的造影劑有更低的總分子量，會(huì)使?jié)B透壓降低。
造影劑中包含的水溶性碘化合物的濃度可根據(jù)以下因素任意設(shè)定例如造影劑化合物的性質(zhì)、藥物的推薦劑量途徑和臨床指南等。脂質(zhì)體內(nèi)包封的水溶性碘化合物的量一般占造影劑中所包含的全部碘化合物重量的5％到95％，優(yōu)選5％到70％重量。特別地，本發(fā)明中為了防止脂質(zhì)體內(nèi)包封的碘化合物不穩(wěn)定，脂質(zhì)體內(nèi)包封的水溶性碘化合物通常占全部碘化合物5％到30％重量，優(yōu)選5％到25％，更優(yōu)選5％到20％重量。如果被包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的水溶性碘化合物的比例占到造影劑中包含的全部碘化合物重量的5％到25％(優(yōu)選5％到20％重量)，存在有70％到95％重量(或者75％-95％重量)的殘余物，基本上可以忽略流出到囊泡外的水分散體中的被包封的碘化合物。相應(yīng)地，由于脂質(zhì)體滲透壓的影響，碘化合物的包封能夠防止不穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)造影劑材料的穩(wěn)定性。
脂質(zhì)體根據(jù)本發(fā)明的射線照相造影劑，上述造影劑化合物以脂質(zhì)體內(nèi)包封物的形式被使用，脂質(zhì)體作為一種微型載體能夠有效且有選擇地將造影劑化合物轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)區(qū)域，例如靶器官或組織。應(yīng)用脂質(zhì)體的造影劑能增加在血液中的保留時(shí)間，促進(jìn)血液的穩(wěn)定性，由此獲得有效的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向作用。需要對(duì)于與保留效果密切相關(guān)的改進(jìn)如穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)和包封材料的保留穩(wěn)定性以及一些特性如血液穩(wěn)定性和血液保留性的改進(jìn)，從而產(chǎn)生對(duì)獲得極佳的腫瘤影像很有效的EPR(增強(qiáng)的滲透性和保留時(shí)間)效果。
在本發(fā)明的射線照相造影劑中，適當(dāng)設(shè)計(jì)的囊泡尺寸和包被造影劑化合物的脂質(zhì)體雙分子膜能夠獲得靶向作用，其中考慮了主動(dòng)靶向作用和被動(dòng)靶向作用。前者通過(guò)調(diào)整囊泡尺寸、脂類成分或者脂質(zhì)體的電荷可以控制生物學(xué)行為。通過(guò)隨后描述的方法可以很容易地將脂質(zhì)體的尺寸調(diào)整到狹窄的范圍。脂質(zhì)體膜表面的設(shè)計(jì)可以通過(guò)改變磷脂的種類和組分及包封材料來(lái)完成，以提供想要得到的特性。
還應(yīng)考察主動(dòng)靶向的引入，它能夠提高造影劑的完整性和選擇性。例如，引入能夠控制向靶向區(qū)域的指引過(guò)程的聚氧化烯烴或者聚乙二醇(PEG)的聚合物鏈，是非常有好處的。適合本發(fā)明造影劑的脂質(zhì)體是表面經(jīng)聚氧化烯烴或者PEG修飾的能夠延長(zhǎng)在血液中的保留時(shí)間的脂質(zhì)體和不容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞如肝臟吞噬(binged)的脂質(zhì)體。沒(méi)有到達(dá)癌組織或者發(fā)病區(qū)域的造影劑沒(méi)有積聚在正常區(qū)域，在由脂質(zhì)體降解引起副作用之前就被排出體外。這可以通過(guò)在脂質(zhì)體設(shè)計(jì)中優(yōu)化控制脂質(zhì)體的穩(wěn)定性與向外排出的時(shí)間關(guān)系而實(shí)現(xiàn)。碘化合物作為造影劑材料能夠迅速經(jīng)腎排入尿中，因此能夠阻止由體內(nèi)無(wú)效保留引起的不利影響和延遲副作用的發(fā)生。
下面將描述在射線照相造影劑中用作轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的脂質(zhì)體的設(shè)計(jì)和制備。
脂質(zhì)體通常由脂質(zhì)雙分子層形成。大多數(shù)情況下，優(yōu)選磷脂和/或糖脂作為脂質(zhì)層的組分。
脂質(zhì)體中優(yōu)選的中性磷脂的例子包括從大豆或蛋黃中得到的卵磷脂和溶血卵磷脂，以及它們的氫化物或羥基衍生物。此外，磷脂的例子還包括磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和神經(jīng)鞘磷脂，它們都來(lái)源于蛋黃、大豆或其它動(dòng)植物，或者通過(guò)半合成的方法獲得；通過(guò)合成的方法得到的為磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPS)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕櫚酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和二硬脂酰磷脂酸(DSPA)。
這些磷脂可以單獨(dú)使用也可以兩種或兩種以上聯(lián)合使用。優(yōu)選所用的兩種或兩種以上帶電磷脂帶同種電荷，即全帶負(fù)電或全帶正電，這樣可以防止脂質(zhì)體的凝集。中性磷脂和帶電磷脂聯(lián)合使用優(yōu)選重量比為200∶1到3∶1，更優(yōu)選100∶1到4∶1，且更優(yōu)選40∶1到5∶1。
甘油糖脂的例子包括甘油脂類，例如雙半乳糖甘油二酯和雙半乳糖甘油二酯硫酸酯；鞘氨醇糖脂如半乳糖神經(jīng)酰胺、半乳糖神經(jīng)酰胺硫酸酯、乳糖神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂G7、神經(jīng)節(jié)苷脂G6和神經(jīng)節(jié)苷脂G4。
除了上述的脂類外，也可以選擇性的含有其它物質(zhì)作為脂質(zhì)膜的組分。例如，用作脂層穩(wěn)定劑的有膽固醇、二氫膽固醇、膽固醇酯、植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、羊毛甾醇和2，4-二羥基羊毛甾醇。此外，甾醇的衍生物例如1-O-甾醇葡糖苷、1-O-甾醇麥芽糖苷和1-O-甾醇半乳糖苷顯示對(duì)穩(wěn)定脂質(zhì)體有效，參見(jiàn)JP-A No.5-245357，前面所述的甾醇，特別優(yōu)選膽固醇。優(yōu)選甾醇用量為0.01到0.5mol，更優(yōu)選0.05到0.1mol甾醇每摩爾磷脂。甾醇使用量小于0.01mol時(shí)不能通過(guò)甾醇增強(qiáng)混合脂類的分散性而起到穩(wěn)定作用，使用量大于0.5mol時(shí)會(huì)抑制脂質(zhì)體的形成或得到其不穩(wěn)定的形式。
被包封在脂質(zhì)膜內(nèi)的膽固醇能夠起到像錨(anchor)一樣的作用而將聚氧化烯烴引入。具體地，膽固醇作為脂質(zhì)膜組分包含在脂質(zhì)體中，可以選擇性地經(jīng)錨與聚氧化烯烴基基團(tuán)連接。短鏈的烯基或氧化烯基可被用作錨。JP-A No.9-3093中公開(kāi)了用作脂質(zhì)體的組分新的膽固醇衍生物，其中多種活性物質(zhì)能夠有效的固定在聚氧化烯烴鏈的上部。
其它的添加劑化合物包括，例如，提供負(fù)電荷的物質(zhì)、磷脂酸烷基酯如二乙酰磷酸酯和提供正電荷的物質(zhì)，脂肪胺如硬脂酰胺。
在本發(fā)明中，包含聚氧化烯烴(PAO)基團(tuán)(又稱為聚氧化烯烴基基團(tuán)，-(RO)n-H，R為亞烷基)或類似基團(tuán)的磷脂或化合物被用作脂質(zhì)體囊泡膜的組分，以得到預(yù)期目的的造影劑。為了克服一些問(wèn)題如被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞俘獲和脂質(zhì)體本身的不穩(wěn)定性如破壞或凝集，試圖向脂質(zhì)體表面引入聚合物鏈如聚乙二醇(PEG)鏈(又稱為聚氧化烯烴基基團(tuán)，(CH2CH2O)n-H)，參見(jiàn)JP-A NO.1-249717中和FEBS letters 268，235(1990)中的描述。將聚氧化烯烴鏈(又稱為聚氧化烯烴鏈)或PEG鏈連接到脂質(zhì)體囊泡的表面上能夠給脂質(zhì)體帶來(lái)新的作用。例如，這種PEG修飾的脂質(zhì)體預(yù)計(jì)對(duì)于免疫系統(tǒng)具有更低的可識(shí)別性(所謂的隱身狀態(tài))。已經(jīng)證明脂質(zhì)體具有親水傾向會(huì)促進(jìn)血液穩(wěn)定性，從而在很長(zhǎng)一段時(shí)間可穩(wěn)定地保持血液濃度，參見(jiàn)Biochim.Biophys.Acta.，1066，29-36(1991)。JP-A NO.2002-37833中公開(kāi)了一種技術(shù)，其中經(jīng)聚氧化烯烴修飾的磷脂摻入脂質(zhì)體膜中，來(lái)增加脂質(zhì)體在血液中的保留時(shí)間。這種脂質(zhì)體還顯示出改善的老化穩(wěn)定性。
上述性質(zhì)能夠使本發(fā)明的射線照相造影劑具有器官-特異性。例如，因?yàn)橹惓煞秩菀追e聚在肝臟，欺期望使用未含有或含有微量PEG的脂質(zhì)體能選擇性地提供與肝臟的對(duì)照。將囊泡的尺寸增加到0.2μm或更大，將導(dǎo)致被肝臟枯否氏細(xì)胞(Kupffer cells)吞噬作用而迅速合并的機(jī)率增加，引起在肝臟的所述位點(diǎn)中的積聚。在給肝癌成像時(shí)，由于癌組織的枯否氏細(xì)胞比正常細(xì)胞少，造影劑脂質(zhì)體合并的量較少，能形成清晰的對(duì)照。脾臟中的情況是類似的。
相反，對(duì)其它器官成像時(shí)，通過(guò)引入PEG，脂質(zhì)體成了隱身狀態(tài)，在肝臟中聚集變的困難，所以，推薦PEG修飾的脂質(zhì)體。PEG的引入形成了水合球體，從而穩(wěn)定了脂質(zhì)體并增強(qiáng)了血液保留。通過(guò)改變PEG中氧化乙烯單元的長(zhǎng)度和引入比例，可以調(diào)整其功能。作為PEG，優(yōu)選具有10到3500個(gè)氧化乙烯單元的聚乙二醇。按照構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)量，優(yōu)選含有的PEG的重量為0.1％到30％，更優(yōu)選重量的1％到15％。
在脂質(zhì)體中應(yīng)用PEG進(jìn)行修飾可以通過(guò)公知技術(shù)來(lái)完成。例如，將連接在一種錨式化合物(如膽固醇)上的PEG與作為膜組分的磷脂混合以形成脂質(zhì)體，并且該錨式化合物可以與活化的PEG相連接。由于引入脂質(zhì)體表面的聚乙二醇基團(tuán)與將在下文陳述的功能性材料(“functional material”)不發(fā)生反應(yīng)，很難將功能性物質(zhì)固定在脂質(zhì)體表面上。與其相反，使頂端經(jīng)化學(xué)修飾的PEG結(jié)合在磷脂上，將其作為制備脂質(zhì)體的組分。
可引入公知的聚氧化烯烴基基團(tuán)代替前述被引入的PEG，所述聚氧化烯烴用通式-(AO)n-Y表示，其中AO為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯烴基基團(tuán)；n表示平均加成摩爾數(shù)且為1至2000的整數(shù)；Y為氫原子、烷基基團(tuán)或者官能團(tuán)。具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯烴基基團(tuán)的例子包括氧化乙烯基基團(tuán)、氧化丙烯基基團(tuán)、氧化三亞甲基基團(tuán)、氧化四亞甲基基團(tuán)、氧-1-乙基乙烯基基團(tuán)和氧-1，2-二甲基乙烯基基團(tuán)。這些氧化烯烴基基團(tuán)是通過(guò)氧化烯烴如氧化乙烯、氧化丙烯、環(huán)氧丙烷(oxetane)、1-氧化丁烯、2-氧化丁烯或四氫呋喃的加成聚合反應(yīng)得到的。正數(shù)n為1至2000，優(yōu)選10至500，更優(yōu)選20至200。當(dāng)n大于等于2時(shí)，兩個(gè)以上的氧化烯烴基基團(tuán)可相同或不同。對(duì)于后者，不同的氧化烯烴基基團(tuán)可以是隨機(jī)的形式或者嵌段共聚的形式。為了使氧化烯烴基基團(tuán)具有親水性，優(yōu)選只用氧化乙烯進(jìn)行加成聚合反應(yīng)，其中n優(yōu)選大于等于10。在不同的氧化烯烴之間發(fā)生加成聚合反應(yīng)的情況中，預(yù)計(jì)至少20mol％(優(yōu)選至少50mol％)的氧化乙烯進(jìn)行了加成聚合。為了使氧化烯烴基基團(tuán)具有親油性，優(yōu)選增加除氧化乙烯之外的氧化烯烴的摩爾濃度。例如，包含聚氧化乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(或稱聚氧乙烯嵌段共聚聚氧丙烯)的脂質(zhì)體是本發(fā)明優(yōu)選的一種實(shí)施例。Y為氫原子、烷基基團(tuán)或官能團(tuán)。烷基基團(tuán)為具有1至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的脂肪烴。官能團(tuán)為將例如糖、糖蛋白、抗體、凝集素和細(xì)胞粘合因子的功能性物質(zhì)連接到聚氧化烯烴上的基團(tuán)，其中具體實(shí)例包括氨基基團(tuán)、氧化羰基咪唑基團(tuán)和N-羥基琥珀酰亞胺。
錨向聚氧化烯烴鏈且上部結(jié)合了前述的功能性物質(zhì)的脂質(zhì)體，不僅顯示出由于引入聚氧化烯烴基基團(tuán)的效果，還能給出功能性物質(zhì)全面的作用，例如，識(shí)別部件的功能，如對(duì)具體器官的方向性(即器官趨向性)和對(duì)癌組織的方向性。
包含聚氧化烯烴基基團(tuán)的磷脂或者化合物可單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用。按照脂質(zhì)體膜形成成分的總量計(jì)算，其含量?jī)?yōu)選為0.001到50mol％，更優(yōu)選0.01到25mol％，且更優(yōu)選0.1到10mol％。含量小于0.001mol％會(huì)導(dǎo)致降低的預(yù)期效果。
可通過(guò)公知技術(shù)將聚氧化烯烴鏈引入脂質(zhì)體中。例如，錨式化合物(anchor)(如膽固醇)與作為膜成分的磷脂混合形成脂質(zhì)體，并且將活化的聚氧化烯烴連接到錨式化合物上。在這種方法中，在脂質(zhì)體形成以后必需在脂質(zhì)體膜表面上進(jìn)行多級(jí)化學(xué)反應(yīng)，這會(huì)限制預(yù)期的功能性物質(zhì)的引入量或者導(dǎo)致反應(yīng)副產(chǎn)物或雜質(zhì)的污染，產(chǎn)生如對(duì)脂質(zhì)體膜的更大破壞等問(wèn)題。
從另一方面來(lái)說(shuō)，作為一種優(yōu)選的制備方法，磷脂聚氧化烯烴(PEO)衍生物被預(yù)先包括在原料如磷脂類中以形成脂質(zhì)體。適合此方法的經(jīng)修飾的磷脂由以下分子式表示，參見(jiàn)JP-A NO.7-165770分子式 其中R1和R2各自為具有2至29個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)；M為氫原子或堿金屬原子如鈉或鉀；AO、n和Y同前述定義。
其中具體實(shí)例包括磷脂酰胺的聚氧乙烯(PEO)衍生物等，如二硬脂酰磷脂酰二乙醇胺聚氧乙烯(DSPE-PEO)。此外，JP-A NO.2002-37883公開(kāi)了純度極高的聚氧化烯烴修飾的磷脂，以制備顯示增強(qiáng)血液保留性的水溶性的聚合物修飾的脂質(zhì)體。還公開(kāi)了在制備脂質(zhì)體時(shí)使用具有相對(duì)低單酰基含量的聚氧化烯烴修飾的磷脂，會(huì)給脂質(zhì)體分散體帶來(lái)非常出色的老化穩(wěn)定性。
這里還提出了多種制備脂質(zhì)體的方法。不同的方法通常最終產(chǎn)生形狀和性質(zhì)差別很大的脂質(zhì)體，參見(jiàn)JP-A NO.6-80560。所以，應(yīng)根據(jù)所需脂質(zhì)體的形式或特征選擇最適合的制備方法。通常，通過(guò)將脂類成分如磷脂、甾醇和凝集素幾乎沒(méi)有例外地溶解于有機(jī)溶劑如氯仿、二氯甲烷、乙醚、四氯化碳、乙酸乙酯、二噁烷或四氫呋喃(THF)特別是含氯溶劑中而制備脂質(zhì)體。減壓蒸餾揮發(fā)性物質(zhì)后，將脂類混合物分散在含有規(guī)定量包封物質(zhì)的緩沖溶液中。然后攪拌分散體幾個(gè)小時(shí)，形成脂質(zhì)體，并且部分分散體(包含包封物質(zhì))被包封在脂質(zhì)體囊泡中。接著，通過(guò)將分散體進(jìn)行超聲處理或使用表面活性劑或其它方法，減小脂質(zhì)體的尺寸和分散體的粘度。這種脂質(zhì)體產(chǎn)品一定包含有機(jī)溶劑。很難將殘余的有機(jī)溶劑特別是含氮溶劑完全排除，該含氯溶劑因?yàn)闀?huì)對(duì)生物體產(chǎn)生副作用而引起關(guān)注。
為了制備本發(fā)明的脂質(zhì)體，利用超臨界或亞臨界二氧化碳而沒(méi)有使用任何有機(jī)溶劑特別是任何氯化有機(jī)溶劑的制備方法，避免了上述的問(wèn)題。選擇二氧化碳，是因?yàn)樗哂?1.1℃的臨界溫度和73.8巴(bar)的臨界壓力且易于操作，并且因?yàn)槠錇槎栊詺怏w且即使殘留也對(duì)人體無(wú)毒，以及其高純度液體價(jià)廉且容易獲得。通過(guò)這種方法制備的脂質(zhì)體在作為射線照相造影劑包封碘化合物方面具有優(yōu)勢(shì)和優(yōu)點(diǎn)，這將在下文中陳述。
利用超臨界或亞臨界二氧化碳制備脂質(zhì)體，必須在二氧化碳的超臨界狀態(tài)(包括亞臨界狀態(tài))下溶解、分散或混合前述的脂質(zhì)膜組分。此超臨界二氧化碳容易滲透到物質(zhì)內(nèi)并表現(xiàn)出極強(qiáng)的溶解性。既然這樣，優(yōu)選使用一種或多種醇類作為輔助性溶劑，如低級(jí)醇、乙二醇或乙二醇醚增強(qiáng)前述脂質(zhì)膜組分的可溶性。例如，優(yōu)選使用醇類作為輔助性溶劑，用量為根據(jù)超臨界二氧化碳0.1％到10％重量，優(yōu)選用量為1％到8％重量。對(duì)于輔助性溶劑，考慮到根據(jù)安全性和除去的難易性，優(yōu)選乙醇。
在超臨界狀態(tài)下(包括亞臨界狀態(tài))二氧化碳的適宜壓力為50到500kg/cm2，優(yōu)選100到400kg/cm2。在超臨界狀態(tài)下(包括亞臨界狀態(tài))二氧化碳的適宜溫度是25到200℃，優(yōu)選31到100℃，更優(yōu)選35到80℃。超臨界狀態(tài)下(包括亞臨界狀態(tài))的二氧化碳通過(guò)優(yōu)化選擇上述范圍內(nèi)的壓力或溫度條件而獲得。
以下面的方式制備本發(fā)明中用作射線照相造影劑的脂質(zhì)體。在存在脂質(zhì)膜組分下加入液態(tài)二氧化碳，在上述適宜的壓力和溫度下達(dá)到超臨界狀態(tài)或亞臨界狀態(tài)?？墒褂眠x自聚氧化烯烴修飾的磷脂、含有聚氧化烯烴的化合物、含有聚乙二醇的化合物和與上述磷脂混合的甾醇中至少一種化合物作為膜脂質(zhì)。此時(shí)，可任選使用上述的輔助性溶劑。然后，連續(xù)加入碘化合物和任選的包含添加劑如藥物制劑助劑的溶液以形成水/二氧化碳乳液。在該乳液中，預(yù)計(jì)脂類成分以微團(tuán)的形狀分散，同時(shí)聚集或分離。連續(xù)攪拌一段時(shí)間之后，含有微團(tuán)的乳液變得穩(wěn)定，持續(xù)加水直到二氧化碳相和水相分離。據(jù)推斷增加水相會(huì)引起相轉(zhuǎn)移，且過(guò)量的二氧化碳會(huì)通過(guò)二氧化碳/水乳液以及二氧化碳/水的兩相系統(tǒng)而從二氧化碳/水乳液中分離出來(lái)。脂質(zhì)體按預(yù)期轉(zhuǎn)移到水相中，抽真空排除二氧化碳以形成水分散溶液，其中包封了碘化合物的脂質(zhì)體囊泡分散在該溶液中。在這種情況下，碘化合物還可包含于除脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部的水相之外的囊泡外面的水相中(外部水相)。既然上述的水溶液被包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部，則現(xiàn)在碘化合物不僅存在于外部水相中還主要存在于脂質(zhì)體囊泡的內(nèi)部，處于所謂的內(nèi)囊(endocyst)狀態(tài)。此外，脂質(zhì)體還要通過(guò)孔徑為0.1到0.4μm的多孔過(guò)濾器。然后，經(jīng)藥劑制備加工過(guò)程，如消毒和包裝，制備了本發(fā)明的射線照相造影劑。
已經(jīng)證實(shí)通過(guò)超臨界或亞臨界二氧化碳制備脂質(zhì)體具有脂質(zhì)體高形成率、包封材料d高包封百分率和脂質(zhì)體內(nèi)的被包封材料的高保持率，參見(jiàn)JP-A NO.2003-1191120。此外，本發(fā)明中的上述方法，甚至能達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用程度，能使非離子型水溶性物質(zhì)在脂質(zhì)體中得到有效包封，基本上不需任何有機(jī)溶劑，適用于制備本發(fā)明的射線照相造影劑。具體地，本發(fā)明的造影劑基本不包含含氯溶劑。在此處，術(shù)語(yǔ)“基本不包含含氯溶劑”是指造影劑中包含的含氯溶劑量不超過(guò)10μg/升造影劑。含氯溶劑的例子包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷和三氯乙烯。
本發(fā)明涉及的脂質(zhì)體基本上是單層囊泡，也就是說(shuō)由單一的磷脂雙分子層形成的單層囊泡。術(shù)語(yǔ)“基本上”的意思是囊泡由磷脂雙分子層構(gòu)成，利用冷凍割裂復(fù)制技術(shù)經(jīng)透射電子顯微觀察其復(fù)制品，幾乎均被識(shí)別為單層的。因此，當(dāng)觀察在碳膜上保留的微粒印記時(shí)，沒(méi)有差別的可判斷為單層囊泡，具有兩個(gè)或兩個(gè)以上差別的是多層囊泡。在本發(fā)明中，以總脂質(zhì)體的量也就是射線照相造影劑中含有的總囊泡量計(jì)，這種單層囊泡的量?jī)?yōu)選至少80％，更優(yōu)選90％。
通過(guò)使用上述超臨界二氧化碳作為脂類溶劑并經(jīng)使用水的相分離方法能夠有效地制備單層囊泡。反之，在傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備方法中，脂質(zhì)體包含多層囊泡(MLV)，即通常多層囊泡占相當(dāng)大的比例。因此，需要一些如超聲處理或者經(jīng)特定大小的孔過(guò)濾操作以增加單層脂質(zhì)體的比例。單層囊泡具有使得加入的脂質(zhì)體量或給予的脂類量通常少于多層囊泡的優(yōu)點(diǎn)。
單層囊泡，特別是大單層囊泡(LUV)其優(yōu)勢(shì)是比多層囊泡具有更好的包裹能力。應(yīng)用在射線照相造影劑中的脂質(zhì)體，為介于尺寸為0.2至1.0μm的LUV和小于0.05μm的SUV(小單層囊泡)之間。因此，保留體積超過(guò)了SUV，碘化合物特別是水溶性碘化合物的俘獲率即包封率變得更好，將在后面描述。此外，與MLV或LUV所不同的是，這種囊狀脂質(zhì)體由于結(jié)合在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞內(nèi)從而不會(huì)從血流中迅速消失。
然而，即使單層囊泡表現(xiàn)出較好的碘化合物包封率，當(dāng)包封的碘化合物重量相對(duì)過(guò)多時(shí)，會(huì)降低其穩(wěn)定性。據(jù)觀察它表現(xiàn)出變?nèi)鮾A向因?yàn)殡x子強(qiáng)度迅速改變。通過(guò)將本發(fā)明造影劑所應(yīng)用的脂質(zhì)體調(diào)整為相對(duì)小的囊泡尺寸，向囊泡膜上引入甾醇或者含聚氧化烯烴或磷酯的化合物，可以增強(qiáng)脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性。結(jié)果證明這種脂質(zhì)體能夠抵抗鹽的沖擊。
脂質(zhì)體的囊狀微粒尺寸(下文也簡(jiǎn)稱為囊泡尺寸)及其分布，與增強(qiáng)血液保留性質(zhì)、靶向能力和轉(zhuǎn)運(yùn)效率這些與本發(fā)明目有關(guān)的方面密切相關(guān)。囊泡尺寸可以用以下方法測(cè)定，將含有包封碘化合物的脂質(zhì)體囊泡的分散體冷凍破裂后，使碳蒸發(fā)沉積(vapor-deposited)在斷裂界面上，并通過(guò)電子顯微鏡觀察沉積的碳(冷凍割裂TEM法)。本發(fā)明中，平均囊泡尺寸是指被觀察的20個(gè)囊泡的平均算術(shù)值。囊泡大小可以通過(guò)設(shè)定或控制工藝條件來(lái)調(diào)節(jié)。例如，增加前述的超臨界壓力而使脂質(zhì)體囊泡的尺寸減小。利用聚碳酸酯膜過(guò)濾以使囊泡尺寸在更窄范圍內(nèi)分布。在這方面，使脂質(zhì)體穿過(guò)安裝了0.1到0.4μm孔徑過(guò)濾器的擠壓機(jī)可有效獲得具有不到0.5μm的最理想平均囊泡尺寸的單層囊泡脂質(zhì)體。除了前述的調(diào)整大小的操作，又加入了該擠壓操作，具有如下優(yōu)點(diǎn)調(diào)整存在于脂質(zhì)體外部的碘化合物濃度、改變脂質(zhì)體分散溶液和除去雜質(zhì)。
脂質(zhì)體微粒的尺寸對(duì)增強(qiáng)脂質(zhì)體的主動(dòng)靶向能力是重要的。例如，日本專利NO.2619037公開(kāi)了，將3μm或更大的脂質(zhì)體排除就可避免在肺毛細(xì)管中的不利保留。然而，0.15到0.3μm的脂質(zhì)體不一定表現(xiàn)出腫瘤的指向性。
本發(fā)明中的造影劑應(yīng)用的脂質(zhì)體的平均囊泡尺寸通常是0.05到0.5μm，優(yōu)選0.05到0.3μm，更優(yōu)選0.05到0.2μm，而且更優(yōu)選0.05到0.13μm。平均囊泡尺寸可以根據(jù)X射線成像的目標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。例如，目的是給腫瘤區(qū)域有選擇的成像，優(yōu)選0.11到0.13μm。調(diào)整平均脂質(zhì)體囊泡尺寸到0.1到0.2μm范圍(優(yōu)選0.11到0.13μm)可使造影劑選擇性的集中在癌組織。這被認(rèn)為是EPR效應(yīng)。實(shí)體癌組織血管化壁上的微孔異常地大于孔徑為0.03到0.08μm的正常組織毛細(xì)管壁微孔，因此即使是約0.1到約0.2μm的大分子也通過(guò)血管壁泄漏。因此，EPR效應(yīng)是由于癌組織血管壁的滲透性比正常組織微血管壁的滲透性高。
由于淋巴管在癌組織周?chē)鷽](méi)有充分生長(zhǎng)，泄漏到血管壁的造影劑不能回到血管中，并在那里保留相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間。由于EPR效應(yīng)是利用血流的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)而增加血液保留時(shí)間，因此需要有效的發(fā)展這種效應(yīng)。因此，造影劑微粒(或者包封碘化合物的脂質(zhì)體囊狀微粒)需要保留在血液中，并且經(jīng)過(guò)很多次靠近癌細(xì)胞的血管。本發(fā)明的射線照相造影劑，其沒(méi)有包含任何特別大的粒子，不易變成被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞俘獲的目標(biāo)。脂質(zhì)體囊泡，其形狀與紅細(xì)胞相似并且行為也與紅細(xì)胞相似，在血液中長(zhǎng)時(shí)間保留且不會(huì)經(jīng)腎迅速排出，被覆蓋時(shí)不會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞吞噬。EPR效應(yīng)必然會(huì)加強(qiáng)造影劑化合物向目標(biāo)器官或組織的轉(zhuǎn)移，并且有選擇地集中并積聚在癌組織中。瘤細(xì)胞/正常細(xì)胞累積比率的升高可以增強(qiáng)造影劑的對(duì)照效果。改進(jìn)的腫瘤造影術(shù)使發(fā)現(xiàn)到目前為止還是難于被檢測(cè)的微小的轉(zhuǎn)移瘤成為可能。
射線照相造影劑在本發(fā)明的射線照相造影劑中，通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和造影劑材料的保留穩(wěn)定性，改進(jìn)了包被在脂質(zhì)體內(nèi)的造影劑材料的保留率。
造影劑優(yōu)選在脂質(zhì)體膜內(nèi)的水相中和在分散脂質(zhì)體囊泡的含水介質(zhì)中包含碘化合物和至少一種輔助性添加劑(藥用輔助制劑)，其中各自的濃度優(yōu)選在膜內(nèi)和膜外基本相同。語(yǔ)句基本相同是指濃度幾乎一樣。輔助性添加劑是指與造影劑材料一起加入的化合物，根據(jù)制備造影劑的技術(shù)可應(yīng)用多種物質(zhì)。其中具體的例子包括生理可接受的緩沖劑、螯合劑如乙二胺四乙酸二鈉鈣鹽(又被稱為EDTA二鈉鈣或者EDTA Na2-Ca)或乙二胺四乙酸二鈉鹽(又被稱為EDTA二鈉或者EDTA Na2)以及任選的，滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑如α-生育酚和粘度調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選水溶性胺類緩沖劑和螯合劑。作為pH緩沖劑，優(yōu)選胺類緩沖劑和碳酸鹽類緩沖劑，其中更優(yōu)選胺類緩沖劑并且特別理想的是氨基丁三醇(又被稱為氨基三丁醇或2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇)。螯合劑優(yōu)選EDTA Na2-Ca。含水介質(zhì)是指主要包含可溶解碘化合物或輔助性添加劑的水的溶劑。除了脂質(zhì)膜內(nèi)部的水相之外(或叫做包封水溶液)，還有一種水溶液，即其中分散了脂質(zhì)體囊泡的含水介質(zhì)，也包含碘化合物和輔助性添加劑，如水溶性的胺類緩沖劑或螯合劑。因此，膜內(nèi)外的滲透壓沒(méi)有差別，由此可保持脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
在射線照相術(shù)中，已經(jīng)披露為了提供預(yù)定造影效果而轉(zhuǎn)運(yùn)到靶器官的碘化合物量，參見(jiàn)日本專利NO.2619037。當(dāng)?shù)饣衔锉话庠谖⑤d體如脂質(zhì)體中，除了要考慮造影劑材料的運(yùn)載率和保留穩(wěn)定性外，還必須考慮囊泡膜脂質(zhì)的重量。增加膜脂質(zhì)重量會(huì)提高造影劑的粘度。對(duì)于包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物量，在水溶液中被脂質(zhì)體囊泡包封的碘化合物和形成囊泡膜的類脂的重量比率，優(yōu)選為1～10，更優(yōu)選3～8且更優(yōu)選5～8。
包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物重量比小于1時(shí)需要注入相對(duì)大量的類脂，結(jié)果降低了造影劑材料的轉(zhuǎn)運(yùn)率。根據(jù)日本專利NO.2619037中的描述，考慮到當(dāng)時(shí)的技術(shù)水平，即使重量比為1也是相對(duì)高的值。因?yàn)樯渚€照相造影劑的粘度取決于脂質(zhì)體中類脂的量，因而表現(xiàn)出增加了保留體積和包封率性能的單層脂質(zhì)體顯然具有優(yōu)勢(shì)。相反，當(dāng)包封的碘化合物與脂質(zhì)體膜脂質(zhì)的重量比超過(guò)10，脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)會(huì)變得不穩(wěn)定，并且在儲(chǔ)藏期間或者甚至在被注射進(jìn)生物體內(nèi)后不可避免地發(fā)生碘化合物從脂質(zhì)膜中的擴(kuò)散或泄漏。此外，專利申請(qǐng)?zhí)枮镹O.9-505821的PCT國(guó)際申請(qǐng)的日本公開(kāi)文本中描述到，即使在制備和分離脂質(zhì)體分散體系之后立即達(dá)到100％的包封，由于滲透壓造成的不穩(wěn)定影像，包封的組分會(huì)在短時(shí)間內(nèi)減少。
本發(fā)明的射線照相造影劑在藥用溶液中劑量是10到300ml，含碘量是100到50mg I/ml，優(yōu)選150到300mg I/ml。藥用溶液的粘度在37℃時(shí)不超過(guò)6cPa，優(yōu)選0.9到3cPa。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，能促進(jìn)腫瘤成像和脂質(zhì)體造影劑保留穩(wěn)定性的射線照相造影劑含有具有脂質(zhì)膜的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體在脂質(zhì)膜中包含含有聚氧化烯烴基基團(tuán)的化合物和/或甾醇，并且碘化合物被包含在脂質(zhì)膜內(nèi)部包封的水相中。此外，所述脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體，其包含平均囊泡尺寸為0.05到0.2μm的單層囊泡，并且該單層脂質(zhì)體包含碘化合物/脂質(zhì)膜重量比為3到8的碘化合物，被包封在脂質(zhì)體中的碘化合物的量是全部碘化合物重量的5-25％。
造影劑以等滲溶液或懸浮液的形式被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，使脂質(zhì)體穩(wěn)定地保留在人體內(nèi)。使用水或者緩沖溶液如tris-鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液或檸檬酸緩沖液作為這種溶液或懸浮液的介質(zhì)。上述溶液或懸浮液的pH室溫下優(yōu)選6.5到8.5，更優(yōu)選6.8到7.8。如美國(guó)專利NO.4278654所述，當(dāng)射線照相造影劑是含有多羥基基團(tuán)的碘化合物時(shí)，優(yōu)選具有負(fù)溫度系數(shù)的緩沖液。胺類緩沖液具有滿足這種要求的性質(zhì)并特別優(yōu)選TRIS。這種類型的緩沖液在高壓滅菌溫度下表現(xiàn)出相對(duì)低的pH，其增加了高壓釜內(nèi)造影劑的穩(wěn)定性，而且在室溫下pH回復(fù)到生理允許的范圍內(nèi)。此時(shí)，沒(méi)有減小脂質(zhì)體囊泡尺寸的限制，如過(guò)濾滅菌。所以，在高壓釜中對(duì)脂質(zhì)體產(chǎn)品進(jìn)行滅菌以制備用于注射的無(wú)菌造影劑是非常方便的，由此還可保持存儲(chǔ)穩(wěn)定性。不能通過(guò)高壓滅菌的脂質(zhì)體可通過(guò)過(guò)濾滅菌。
等滲溶液或懸浮液通過(guò)將造影劑材料以形成等滲溶液的濃度溶解或懸浮在介質(zhì)中而制備。例如，當(dāng)?shù)葷B溶液由于造影劑化合物的低溶解性而不能僅用造影劑化合物制備時(shí)，可加入非離子型水溶性物質(zhì)，如鹽類如氯化鈉，或糖類如甘露醇、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇，以形成等滲溶液或懸浮液。
本發(fā)明的射線照相造影劑不是經(jīng)口服而是經(jīng)血管優(yōu)選經(jīng)靜脈內(nèi)如注射或滴注給予人類，然后在X射線下進(jìn)行成像。劑量與傳統(tǒng)的碘類造影劑相同。脂質(zhì)體內(nèi)的碘總量或者脂質(zhì)體內(nèi)外的碘總量與常規(guī)劑量相同。
本發(fā)明的射線照相造影劑包含包封在脂質(zhì)體膜內(nèi)水相中的碘化合物和分散脂質(zhì)體的含水介質(zhì)中的碘化合物，并且碘化合物的濃度在膜內(nèi)和膜外基本相同。這就意味著同一碘化合物同時(shí)存在并具有不同的形式。這種狀態(tài)的造影劑材料在診斷檢查中表現(xiàn)出以下優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的射線照相造影劑的應(yīng)用，未被包封的造影劑材料和被包封在脂質(zhì)體內(nèi)的造影劑材料在體內(nèi)的擴(kuò)散時(shí)間不同，使所呈現(xiàn)的影像隨著時(shí)間的流逝在分布行為上發(fā)生變化，這會(huì)提供有價(jià)值的診斷信息。
在實(shí)際診斷檢查中，聯(lián)合應(yīng)用本發(fā)明的造影劑和計(jì)算機(jī)X射線斷層造影裝置將會(huì)有效地顯示出進(jìn)一步增強(qiáng)的成像效果。例如，在肝臟的計(jì)算機(jī)X射線斷層造影診斷中，未被包封在脂質(zhì)體內(nèi)的造影材料自由地穿過(guò)肝臟竇狀隙(liver sinusoid)，給藥后迅速到達(dá)肝臟主質(zhì)細(xì)胞(liver parenchyma cell)，提高健康肝臟組織的影像密度，其會(huì)迅速降低。密度的降低可以通過(guò)脂質(zhì)體造影劑的持續(xù)加強(qiáng)得到補(bǔ)償，因此造影劑材料能夠長(zhǎng)時(shí)間的維持高的濃度。游離的未被包封的造影劑材料在分布方面有差別，能夠進(jìn)行組織狀態(tài)的詳細(xì)分析。
射線照相造影劑含有含單層囊泡的脂質(zhì)體，該單層囊泡具有相對(duì)均勻粒徑，其中烯氧化物鏈和/或甾醇被包含在脂質(zhì)膜中，水溶性碘化合物被包封在水相中，導(dǎo)致改善了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和包封材料的保留穩(wěn)定性。
此外，本發(fā)明的射線照相造影劑含有含單層囊泡的脂質(zhì)體，該單層囊泡具有相對(duì)均勻粒徑，其中在脂質(zhì)體膜內(nèi)的水相和分散脂質(zhì)體的含水介質(zhì)中均包含碘化合物和輔助性添加劑，該碘化合物在膜內(nèi)和膜外的濃度基本相同，因此改善了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和包封材料的保留穩(wěn)定性。
此外，本發(fā)明的射線照相造影劑顯示出突出的血液保留性且表現(xiàn)出EPR效應(yīng)，結(jié)果是其將有選擇的集中積聚在目標(biāo)疾病區(qū)域或組織，特別是癌組織。成像之后，碘化合物是水溶性的且易于排出體外。此外，未包封的造影劑材料和被包封在脂質(zhì)體內(nèi)的造影劑材料在體內(nèi)具有不同的擴(kuò)散時(shí)間，使所呈現(xiàn)的影像隨時(shí)間流逝在分布行為上發(fā)生變化，這會(huì)提供有價(jià)值的診斷信息。
上述脂質(zhì)體的制備方法，由于采用將磷脂或類似物溶解在超臨界二氧化碳中，因此沒(méi)有必要使用有毒溶劑，特別是毒性很高的含氯溶劑。
相比傳統(tǒng)的射線照相造影劑，本發(fā)明的射線照相造影劑用量少，從而減小毒性和副作用，減小病人的負(fù)擔(dān)。
實(shí)施例本發(fā)明將根據(jù)實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不限于此。
脂質(zhì)體的形狀和囊泡大小利用透射電子顯微鏡冷凍破裂法(TEM)測(cè)定造影劑中包含的脂質(zhì)體微粒(或者囊泡)尺寸和脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)。因此，脂質(zhì)體分散體經(jīng)液氮迅速冷凍，在冷凍狀態(tài)下破裂，暴露出脂質(zhì)體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。然后，將碳蒸發(fā)-沉積在斷裂界面上，再通過(guò)透射電子顯微鏡觀察碳沉積膜。
將脂質(zhì)體的囊狀微粒尺寸大小表示為20個(gè)微粒直徑的平均算術(shù)值。至于脂質(zhì)體微粒的結(jié)構(gòu)，當(dāng)觀察保留在碳膜上的微粒印記時(shí)，在水平上(in level)沒(méi)有區(qū)別的為單層囊泡，具有兩種或以上區(qū)別的是多層囊泡。當(dāng)20個(gè)被觀察的脂質(zhì)體的囊狀微粒中至少80％被認(rèn)為是單層結(jié)構(gòu)時(shí)，可判斷該脂質(zhì)體為均勻囊泡(或者單層脂質(zhì)體)。
碘化合物的測(cè)定脂質(zhì)體分散體用氯化鈉等滲溶液進(jìn)行透析。透析結(jié)束后，向其中加入乙醇使脂質(zhì)體降解，再用吸收比色法測(cè)定包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物量。
實(shí)施例1二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和二氧化碳與乙醇一起加入到不銹鋼高壓反應(yīng)釜內(nèi)，在高壓釜保持60℃和300kg/cm2的條件下，攪拌使DPPC溶解在超臨界二氧化碳中。在攪拌超臨界二氧化碳溶液的同時(shí)，用計(jì)量泵持續(xù)加入碘美普爾(iomeprol)溶液。碘美普爾溶液通過(guò)以下方法制備，816.5mg的碘美普爾通過(guò)加熱溶解在注射用水中，加入20mM的抗壞血酸，再加入1mg氨基丁三醇，調(diào)節(jié)pH到生理性pH值，最后加入注射用水至1.0ml。其后，將高壓釜抽真空排出二氧化碳，得到包封碘美普爾的脂質(zhì)體分散體。所得的分散體倒入玻璃瓶中于高壓釜內(nèi)121℃滅菌20分鐘得到造影劑。
利用透射電子顯微鏡(TEM)經(jīng)冷凍破裂法測(cè)定造影劑中包含的脂質(zhì)體囊狀微粒的尺寸。脂質(zhì)體的平均囊泡大小是0.13μm，且脂質(zhì)體是單層囊泡的脂質(zhì)體。
實(shí)施例2將實(shí)施例1制備的造影劑用等滲葡萄糖溶液稀釋到50mg碘/ml。當(dāng)將此溶液通過(guò)靜脈注射到大鼠體內(nèi)，利用射線照相術(shù)觀察達(dá)肝臟的濃度。發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)的成像水平(或影象對(duì)比)與其它所有器官的成像水平同時(shí)隨時(shí)間推移而減弱，并且?guī)缀跛械牡饷榔諣柖急慌诺侥蚶铩?br> 實(shí)施例3將實(shí)施例1制備的造影劑用等滲葡萄糖溶液稀釋到50mg碘/ml。將此溶液注射進(jìn)帶有大量轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞的大鼠靜脈。轉(zhuǎn)移腫瘤區(qū)域顯示出很高的成像水平(或影象對(duì)比)，其中可以觀察到直徑為5mm的腫瘤。隨時(shí)間推移，相對(duì)其它器官的成像水平，在腫瘤區(qū)域的影象對(duì)比的減弱會(huì)延遲。
實(shí)施例4造影劑的制備同實(shí)施例1，只是調(diào)整壓力和溫度使形成的脂質(zhì)體具有0.07μm、0.18μm和0.22μm的平均脂質(zhì)體微粒尺寸。
實(shí)施例5造影劑的制備同實(shí)施例1，只是另外加入了40g具有2000個(gè)氧化乙烯單元的PEG。平均脂質(zhì)體微粒尺寸為0.12μm。
實(shí)施例6將實(shí)施例4和5中制備的造影劑分別按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行評(píng)測(cè)。利用射線照相術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)施例4中制備的造影劑注射后特別集中在肝臟內(nèi)。實(shí)施例5中制備的造影劑比實(shí)施例4中的造影劑較少集中在肝臟。
實(shí)施例7將實(shí)施例4和5中制備的造影劑分別按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行評(píng)測(cè)。含有平均脂質(zhì)體囊泡尺寸為0.07μm脂質(zhì)體的造影劑在腫瘤區(qū)域的造影水平(或影象對(duì)比)的減弱比實(shí)施例3中的造影劑更快。與實(shí)施例3中的造影劑相比較，含有平均脂質(zhì)體囊泡尺寸為0.18μm脂質(zhì)體的造影劑在腫瘤區(qū)域的造影水平的減弱會(huì)延遲。與實(shí)施例3中的造影劑相比較，含有平均脂質(zhì)體囊泡尺寸為0.22μm脂質(zhì)體的造影劑在腫瘤區(qū)域顯示出明顯減弱的造影水平。這進(jìn)一步證明實(shí)施例5中的造影劑在腫瘤區(qū)域的影象對(duì)比實(shí)施例3中的造影劑更高，且成像水平的減弱會(huì)延遲。
對(duì)比實(shí)施例1在常規(guī)的造影劑制備方法中，包含脂質(zhì)體的分散體是通過(guò)將磷脂溶解在有機(jī)溶劑中而不是溶解在超臨界二氧化碳中而制備的。顯示表明這樣制備的脂質(zhì)體不是單層脂質(zhì)體。按照實(shí)施例3中的同樣方法進(jìn)行評(píng)測(cè)，與實(shí)施例3中的造影劑相比較，證明其在腫瘤區(qū)域的造影水平明顯減弱。
與將磷脂溶解在有機(jī)溶劑中制備得到的傳統(tǒng)的造影劑相比較，上述結(jié)果顯然可以證明將磷脂溶解在超臨界二氧化碳中制備的射線照相造影劑顯示出優(yōu)異的癌癥成像。
實(shí)施例8將0.04g二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、1.2mg的Pluronic F-88(聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段聚合物，來(lái)自ADEKA Co.)和0.9g乙醇的混合物，加入至不銹鋼高壓反應(yīng)釜內(nèi)，將高壓釜內(nèi)部加熱到60℃，隨后，加入13g液態(tài)二氧化碳。將高壓釜內(nèi)的壓力從50kg/cm2升高到200kg/cm2，在高壓釜內(nèi)攪拌使DPPC溶解在超臨界二氧化碳中。在攪拌超臨界二氧化碳溶液的同時(shí)，使用定量泵持續(xù)加入下述溶液5g，該溶液含有647mg/ml的碘海醇(iohexol)(具有300mg/ml的碘含量)、1.21mg/ml的氨基丁三醇和0.1mg/ml的乙二胺四乙酸鈣二鈉并且用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到大約等于7。其后，將高壓釜內(nèi)抽真空排出二氧化碳，得到包封碘海醇的脂質(zhì)體分散體。將相同的操作重復(fù)幾次，并將得到的分散體加熱到60℃，且用0.1μm由Advantech Co.生產(chǎn)的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾。通過(guò)壓力過(guò)濾得到的脂質(zhì)體囊泡的尺寸為0.15μm或者更小。將這樣得到的造影劑命名為樣品1。平均脂質(zhì)體囊泡尺寸為0.12μm且脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。包封在囊泡內(nèi)的碘化合物與囊泡膜脂質(zhì)的重量比是5.6。
實(shí)施例9除了將壓力調(diào)節(jié)為高內(nèi)壓，控制了排空速度和改變了所用磷脂的量，與實(shí)施例8相同地，脂質(zhì)體分散體是通過(guò)用0.1μm的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾(由Advantech Co.生產(chǎn))制備得到，且命名為樣品2。用冷凍割裂技術(shù)通過(guò)透射電子顯微觀察，證明樣品2的脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。脂質(zhì)體囊泡的尺寸見(jiàn)表1。
實(shí)施例10除了調(diào)高了壓力，控制了排空速度和改變了所用磷脂的量，與實(shí)施例8相同地，脂質(zhì)體分散體是通過(guò)用0.1μm的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾(由Advantech Co.生產(chǎn))制備得到，且命名為樣品3。用冷凍割裂技術(shù)通過(guò)透射電子顯微觀察，證明樣品3的脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。脂質(zhì)體囊泡的尺寸見(jiàn)表1。
實(shí)施例11除了調(diào)高了壓力，控制了排空速度和改變了所用磷脂的量，與實(shí)施例8相同地，脂質(zhì)體分散體是通過(guò)用0.1μm的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾(由Advantech Co.生產(chǎn))制備得到，且命名為樣品4。用冷凍割裂技術(shù)通過(guò)透射電子顯微觀察，證明樣品4的脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。脂質(zhì)體囊泡的尺寸見(jiàn)表1。
實(shí)施例12除了調(diào)高了壓力，控制了排空速度和改變了所用磷脂的量，與實(shí)施例8相同地，脂質(zhì)體分散體是通過(guò)用0.2μm的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾(由Advantech Co.生產(chǎn))制備得到，且命名為樣品5。用冷凍割裂技術(shù)通過(guò)透射電子顯微觀察，證明樣品5的脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。囊狀微粒的尺寸見(jiàn)表1。
對(duì)比實(shí)施例2包含脂質(zhì)體的分散體按照傳統(tǒng)的方法制備，即磷脂溶解在有機(jī)溶劑中，而不是超臨界二氧化碳中，并且改變了所用磷脂的量。這樣，制備了兩種射線照相造影劑(樣品6和7)。如此制備的脂質(zhì)體并不是單層的脂質(zhì)體。囊泡的尺寸見(jiàn)表1。
實(shí)施例13將VX2 calcinorma細(xì)胞懸浮液通過(guò)皮下植入兔子體內(nèi)。植入兩周后，將實(shí)施例8制得的造影劑通過(guò)靜脈注射到兔子體內(nèi)，然后通過(guò)射線照相術(shù)觀察。盡管隨著時(shí)間的過(guò)去成像水平(或影象對(duì)比)減弱了，但是成像水平或者影象對(duì)比在植入?yún)^(qū)域的減弱延遲了。
實(shí)施例9到12中制備的造影劑樣品(樣品2到5)和對(duì)比實(shí)施例2中制備的造影劑樣品6按照相同的方法進(jìn)行評(píng)測(cè)。此外，根據(jù)日本專利NO.2619037的實(shí)施例2中的樣品2B制備的造影劑(樣品8，對(duì)比實(shí)施例3)，也進(jìn)行了評(píng)測(cè)。其結(jié)果見(jiàn)表1。癌癥的成像水平根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)測(cè)
A影象對(duì)比在植入?yún)^(qū)域的減弱相比其它區(qū)域明顯延遲了；B影象對(duì)比在植入?yún)^(qū)域的減弱相比其它區(qū)域略微延遲了；C影象對(duì)比在植入?yún)^(qū)域的減弱相比其它區(qū)差不多相同；D影象對(duì)比在植入?yún)^(qū)域的增強(qiáng)幾乎沒(méi)有。
表1
*1脂質(zhì)體囊泡內(nèi)包封的碘化合物與脂質(zhì)體囊狀膜脂質(zhì)的重量比從表1中明顯可以看出，樣品8的脂質(zhì)體囊泡的尺寸大于0.5μm，導(dǎo)致了失效的腫瘤成像水平。相反，與通過(guò)溶解在有機(jī)溶劑中制得的樣品6至8相比較，通過(guò)將磷脂溶解在超臨界二氧化碳中制備得到的樣品1到5，表現(xiàn)出極佳的腫瘤成像水平。
實(shí)施例14將0.04g二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、1.2mg的pluronic(F-88，來(lái)自ADEKA Co.)和0.9g乙醇的混合物，加入至不銹鋼高壓反應(yīng)釜內(nèi)，將高壓釜內(nèi)部加熱到60℃，隨后，加入13g液態(tài)二氧化碳。將高壓釜內(nèi)的壓力從50kg/cm2升高到200kg/cm2，在高壓釜內(nèi)攪拌使DPPC溶解在超臨界二氧化碳中。在攪拌超臨界二氧化碳溶液的同時(shí)，使用定量泵持續(xù)加入含有647mg/ml的碘海醇(具有300mg/ml的碘含量)、1.21mg/ml的氨基丁三醇和0.1mg/ml的乙二胺四乙酸鈣二鈉(EDTA Na2-Ca)的溶液5g，該溶液用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到大約等于7。其后，將高壓釜內(nèi)抽真空排出二氧化碳，得到包封碘海醇的脂質(zhì)體分散體。將得到的分散體加熱到60℃，且用0.1μm由Advantech Co.生產(chǎn)的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾。將這樣得到的造影劑命名為樣品9。脂質(zhì)體的平均囊泡尺寸為0.12μm且脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。包封在囊泡內(nèi)的碘化合物與囊泡膜脂質(zhì)的重量比是5.6。
除了調(diào)高了壓力，控制了排空速度和改變了所用磷脂的量，與實(shí)施例14相同地，脂質(zhì)體分散體是通過(guò)用0.1μm、0.2μm或者0.4μm的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾制備得到的，且命名為樣品10到15。
樣品16的制備方法同實(shí)施例1，只是加進(jìn)不銹鋼高壓反應(yīng)釜的混合物是0.04g二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、0.01g膽固醇、1.2mg的pluronic(F-88，來(lái)自ADEKA Co.)和0.9g乙醇。樣品17的制備同樣品16，只是沒(méi)有使用pluronic F-88。對(duì)比樣品18的制備同樣品9，只是沒(méi)有使用pluronic F-88。樣品9到18均被證明是單層囊泡。
各個(gè)樣品包含的脂質(zhì)體見(jiàn)表2，涉及到脂質(zhì)體囊狀微粒、包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物的碘含量與脂質(zhì)的重量比，和包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。
表2
*1包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物與脂質(zhì)體囊泡膜脂質(zhì)的重量比*2包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物的重量百分比實(shí)施例15將樣品9到18分別加入到生理鹽水溶液中，密封后加熱到42℃，放置3天。這樣用光學(xué)顯微鏡觀察老化的(aged)樣品和未經(jīng)老化的樣品。
在任何一個(gè)未老化的樣品中都沒(méi)有觀察到微粒。在老化的樣品18中，觀察到了幾微米的脂質(zhì)體微粒，推斷其可能是由于脂質(zhì)體囊泡的聚集作用形成的。這種脂質(zhì)體微粒在樣品17中也有少許被觀察到。在又經(jīng)過(guò)了4天的老化后，這種脂質(zhì)體微粒在樣品9到15中有少許被觀察到，在樣品16中沒(méi)有觀察到脂質(zhì)體微粒。
從上述的結(jié)果中可以看出，使用含有包含聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物或膽固醇的脂質(zhì)體的造影劑能夠增強(qiáng)穩(wěn)定性。
實(shí)施例16將樣品9到18用等滲葡萄糖溶液稀釋到濃度為50mg碘/ml。將此溶液分別經(jīng)靜脈注射進(jìn)大鼠中，通過(guò)射線造影術(shù)觀察到達(dá)肝臟的濃度，特別是樣品17和18。
結(jié)果證明使用含有沒(méi)有聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物的脂質(zhì)體囊泡的造影劑能夠選擇性的對(duì)肝臟成像。
實(shí)施例17將VX2 calcinorma細(xì)胞懸浮液通過(guò)皮下植入兔子體內(nèi)。植入兩周后，將實(shí)施例14制得的造影劑樣品9到18分別通過(guò)靜脈注射到兔子體內(nèi)，然后通過(guò)射線照相術(shù)觀察。與樣品13、15、17和18相比較，樣品9、10、11、12、14和16的成像水平或影象對(duì)比在兔子植入?yún)^(qū)域的減弱延遲了。
實(shí)施例18將0.032g二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、0.008g膽固醇、1.2mg的pluronic(F-88，來(lái)自ADEKA Co.)和0.9g乙醇的混合物，加入至不銹鋼高壓反應(yīng)釜內(nèi)，將高壓釜內(nèi)部加熱到60℃，隨后，加入13g液態(tài)二氧化碳。將高壓釜內(nèi)的壓力從50kg/cm2升高到200kg/cm2，在高壓釜內(nèi)攪拌使DPPC溶解在超臨界二氧化碳中。在攪拌超臨界二氧化碳溶液的同時(shí)，使用定量泵持續(xù)加入含有647mg/ml的碘海醇(iohexol)(具有300mg/ml的碘含量)、1.21mg/ml的氨基丁三醇和0.1mg/ml的乙二胺四乙酸鈣二鈉(EDTA Na2-Ca)的溶液5g，該溶液也用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到大約等于7。其后，將高壓釜內(nèi)抽真空排出二氧化碳，得到包封碘海醇的脂質(zhì)體分散體。將得到的分散體加熱到60℃，用0.1μm由Advantech Co.生產(chǎn)的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾。將這樣制得的造影劑命名為樣品19。脂質(zhì)體的平均囊泡尺寸為0.12μm且脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。被包封的碘化合物與脂質(zhì)體膜脂質(zhì)的重量比是5.6，包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物重量的23％。
除了調(diào)高了壓力，控制了排空速度和改變了所用磷脂的量，與實(shí)施例19相同地，脂質(zhì)體分散體通過(guò)用0.1μm、0.2μm和0.4μm的纖維素類過(guò)濾器進(jìn)行壓力過(guò)濾制備得到的，且命名為樣品20到25。樣品20到25均被證明基本上包含單層脂質(zhì)體。在表3中，列出了各樣品含有的脂質(zhì)體，其涉及脂質(zhì)體囊狀微粒、包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物的碘含量與脂質(zhì)體囊泡膜脂質(zhì)的重量比，和包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。
樣品26的制備方法同樣品19，只是所用的是0.024g二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和0.006g膽固醇，且分別調(diào)整了壓力和排空速度。
樣品27的制備方法同樣品19，只是所用的是0.048g二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和0.012g膽固醇，且分別調(diào)整了壓力和排空速度。
樣品26和27均為單層囊泡的脂質(zhì)體。各樣品中包含的脂質(zhì)體見(jiàn)表3，其涉及脂質(zhì)體囊泡、包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物的碘含量與脂質(zhì)的重量比，和包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。
樣品29到37的制備方法分別同樣品19到27，只是均沒(méi)有使用乙二胺四乙酸鈣二鈉(EDTA Na2-Ca)。樣品29到27均為單層囊泡的脂質(zhì)體。各樣品中包含的脂質(zhì)體見(jiàn)表3，其涉及脂質(zhì)體囊泡、包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物的碘含量與脂質(zhì)的重量比，和包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。從表中可以明顯看出，這些樣品和使用了乙二胺四乙酸鈣二鈉的樣品表現(xiàn)出幾乎相同的結(jié)果。
樣品39到47的制備方法分別同樣品19到27，只是均沒(méi)有使用氨基丁三醇。樣品39到47均為單層囊泡的脂質(zhì)體。各樣品中包含的脂質(zhì)體見(jiàn)表3，其涉及脂質(zhì)體囊泡、包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物的碘含量與囊泡膜脂質(zhì)的重量比，和包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。從表中可以明顯看出，這些樣品和使用了氨基丁三醇的樣品表現(xiàn)出幾乎相同的結(jié)果。
對(duì)比樣品119到127、129到137和139到147的制備方法分別同樣品19到27、29到37和39到47，只是各個(gè)樣品所得的脂質(zhì)體分散體分別用等滲鹽溶液進(jìn)行透析，使包含在脂質(zhì)體分散體的含水介質(zhì)中的碘化合物和輔助性添加劑的濃度低于其被包封在脂質(zhì)體內(nèi)的濃度。在表3中，列出了各樣品中包含的脂質(zhì)體，涉及平均脂質(zhì)體囊泡尺寸、包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物的碘含量與膜脂質(zhì)的重量比，和包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物的百分比。
實(shí)施例19穩(wěn)定性評(píng)測(cè)將生理鹽水分別加入到實(shí)施例18中制得的樣品中，密封后，加熱到42℃，放置14天。用光學(xué)顯微鏡觀察這樣老化的(aged)樣品和未經(jīng)老化的樣品。
在任何一個(gè)未老化的樣品中都沒(méi)有觀察到微粒。在一些老化的對(duì)比樣品中，觀察到了幾微米的微粒，推斷其可能是由于脂質(zhì)體囊狀微粒的聚集作用形成的。老化穩(wěn)定性的評(píng)測(cè)根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)5沒(méi)有觀察到聚集的微粒；4觀察到幾個(gè)聚集的微粒；3聚集的微粒比較明顯；2觀察到許多聚集的微粒；1觀察到大量聚集的微粒。
實(shí)施例20從表3中明顯可以證明，當(dāng)脂質(zhì)體內(nèi)部和外部的水溶性成分不同時(shí)，穩(wěn)定性降低了。那些用0.1到0.4μm的過(guò)濾器過(guò)濾的樣品得到了增強(qiáng)穩(wěn)定性。相反，當(dāng)脂質(zhì)體內(nèi)部和外部的水溶性成分相同時(shí)，由于水溶性胺類緩沖液或螯合劑的存在，得到了增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
表3
*1水溶性成分在脂質(zhì)體內(nèi)外的濃度差別*2使用孔徑0.1μm、0.2μm和0.4μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾*3包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物與脂質(zhì)體囊泡膜脂質(zhì)的重量比*4包封在囊泡內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物的重量百分比表3(續(xù)-1)
*1水溶性成分在脂質(zhì)體內(nèi)外的濃度差別*2使用孔徑0.1μm、0.2μm和0.4μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾*3包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物與脂質(zhì)體囊泡膜脂質(zhì)的重量比*4包封在囊泡內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物的重量百分比表3(續(xù)-2)
*1水溶性成分在脂質(zhì)體內(nèi)外的濃度差別*2使用孔徑0.1μm、0.2μm和0.4μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾*3包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物與脂質(zhì)體囊泡膜脂質(zhì)的重量比*4包封在囊泡內(nèi)的碘化合物占全部碘化合物的重量百分比
權(quán)利要求
1.一種射線照相造影劑，其包含脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包含水溶性非離子型碘化合物，并且該造影劑基本上不含含氯溶劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中所述脂質(zhì)體通過(guò)下述方法進(jìn)行制備，該方法是將磷脂與超臨界二氧化碳或者亞臨界二氧化碳混合，以及使水溶性非離子碘化合物與磷脂接觸而形成脂質(zhì)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中所述脂質(zhì)體基本上是單層囊泡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中所述碘化合物包含至少一個(gè)2，4，6-三碘苯基基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中所述脂質(zhì)體的平均尺寸為0.05到0.5μm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的造影劑，其中所述平均尺寸為0.05到0.2μm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的造影劑，其中所述平均尺寸為0.11到0.13μm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中所述脂質(zhì)體是PEG修飾的脂質(zhì)體，每個(gè)該脂質(zhì)體含有經(jīng)具有10到3500個(gè)氧化乙烯單元的PEG修飾的脂質(zhì)膜，該P(yáng)EG的量為基于形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的0.1重量％到30重量％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中所述脂質(zhì)體是經(jīng)具有0.1到0.4μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾的脂質(zhì)體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中所述脂質(zhì)體包含碘化合物，該碘化合物與脂質(zhì)體膜脂質(zhì)的重量比為1～10。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的造影劑，其中重量比為3～8。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的造影劑，其中重量比為5～8。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物占造影劑中全部碘化合物重量的5％到30％。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中每個(gè)脂質(zhì)體含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)的水相，該脂質(zhì)膜含有選自含有聚氧化烯烴基團(tuán)的化合物和甾醇中的至少一種，并且水相包含碘化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中每個(gè)脂質(zhì)體含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)的水相，該脂質(zhì)膜含有經(jīng)聚氧化烯烴修飾的磷脂，且水相包含碘化合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中每個(gè)脂質(zhì)體含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)的水相，該脂質(zhì)膜含有聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，且水相包含碘化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的造影劑，其中含有脂質(zhì)膜和包封在脂質(zhì)膜內(nèi)的水相的脂質(zhì)體分散在含水介質(zhì)中，所述水相和含水介質(zhì)均包含碘化合物和添加劑，并且在水相和含水介質(zhì)中的碘化合物濃度基本相同，在水相和含水介質(zhì)中的添加劑濃度基本相同。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的造影劑，其中添加劑是水溶性的胺類緩沖劑或螯合劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的造影劑，其中胺類緩沖劑是氨基丁三醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的造影劑，其中螯合劑是EDTANa2-Ca。
21.一種制備射線照相造影劑的方法，包括以下步驟將磷脂與超臨界二氧化碳或者亞臨界二氧化碳混合以形成混合物，以及使得水溶性的非離子型碘化合物與磷脂接觸以形成包含了碘化合物的脂質(zhì)體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中該方法包括以下步驟將磷脂與超臨界二氧化碳或者亞臨界二氧化碳混合以形成混合物，將包含非離子型的碘化合物的水溶液導(dǎo)入到混合物中，以及排出二氧化碳以形成包封了碘化合物的脂質(zhì)體。
23.跟據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中向二氧化碳施用50到500kg/cm2的壓力。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中向二氧化碳施用25到200℃的溫度。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中將選自由聚氧化烯烴修飾的磷脂、包含聚氧化烯烴基基團(tuán)的化合物、包含聚乙二醇基團(tuán)的化合物和甾醇中的至少一種進(jìn)一步與超臨界二氧化碳或者亞臨界二氧化碳混合，然后，向該混合物中導(dǎo)入含有非離子型碘化合物的水溶液，再排出二氧化碳以形成包封了碘化合物的脂質(zhì)體；該方法還包括使用0.1到0.4μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾脂質(zhì)體。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中將選自由聚氧化烯烴修飾的磷脂和甾醇中的至少一種進(jìn)一步與超臨界二氧化碳或者亞臨界二氧化碳混合，然后，向該混合物中導(dǎo)入含有非離子型碘化合物和添加劑的水溶液并排出二氧化碳，以形成包封了碘化合物和添加劑的脂質(zhì)體；該方法還包括使用0.1到0.4μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾脂質(zhì)體以形成含有脂質(zhì)膜和包封于脂質(zhì)膜內(nèi)的水相的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體被分散在含水介質(zhì)中，所述水相和含水介質(zhì)均包含碘化合物和添加劑，并且在水相和含水介質(zhì)中的碘化合物濃度基本相同，在水相和含水介質(zhì)中的添加劑濃度基本相同。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種射線照相造影劑，其含有具有窄的囊泡尺寸分布且含有包含含聚氧化烯烴基基團(tuán)化合物和/或甾醇的脂質(zhì)膜的脂質(zhì)體，并且該脂質(zhì)體包封了水溶性的非離子型碘化合物。將脂質(zhì)膜內(nèi)封閉了水相的脂質(zhì)體分散在含水介質(zhì)中，優(yōu)選地，水相和含水介質(zhì)均含有碘化合物和添加劑，并且碘化合物的濃度和添加劑的濃度在水相和含水介質(zhì)中都分別基本上相等，其中碘化合物與脂質(zhì)膜的重量比為1～10。該造影劑通過(guò)超臨界二氧化碳法制備得到，并因此基本上不含有毒溶劑如含氯溶劑。
文檔編號(hào)A61K47/16GK1929868SQ200480030669
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2004年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日
發(fā)明者上田榮一, 川勝哲, 中島彰久, 長(zhǎng)池千秋 申請(qǐng)人:柯尼卡美能達(dá)醫(yī)療印刷器材株式會(huì)社