專利名稱：Cathelicidin ll－37及其衍生物在傷口愈合中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽LL-37和N-末端片段，及其功能性衍生物，其中所述肽可用于細(xì)胞增殖，上皮修復(fù)和傷口愈合。本發(fā)明也涉及包含一種或一種以上所述肽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
上皮構(gòu)成了宿主和可能的有害環(huán)境之間的第一道屏障，因此該界面的保護(hù)是至關(guān)重要的。傷口表明屏障破損并立即啟動(dòng)一系列緊密協(xié)調(diào)的事件，其目的是為了迅速恢復(fù)此屏障的完整性。在較高等生物中緊急傷口閉合已經(jīng)得到進(jìn)化，這不同于在較低等物種見到的組織完全再生的費(fèi)時(shí)過程。傷口愈合受損是臨床醫(yī)學(xué)的一個(gè)主要難題，它的范圍從隨年齡增長(zhǎng)見到的“正常”愈合相對(duì)遲緩到病理性的非愈合性(non-healing)潰瘍。
慢性潰瘍是臨床的主要問題，盡管我們對(duì)生理損傷過程的理解在過去數(shù)十年逐漸增加，但僅僅獲得了微小的治療上的進(jìn)步。獨(dú)特的病因?qū)W可能導(dǎo)致潰瘍?cè)诓煌R床狀況發(fā)展，但無論原因如何，非愈合性潰瘍都以上皮細(xì)胞不能遷移，增殖并閉合屏障缺陷為特征。慢性皮膚潰瘍最常見的種類是由于靜脈功能不全導(dǎo)致的腿潰瘍。這些患者出現(xiàn)外周靜脈水腫隨后是皮膚潰瘍，但是動(dòng)脈循環(huán)是完好的。由于動(dòng)脈硬化缺陷導(dǎo)致的腿和腳潰瘍較不常見。
另外，皮膚潰瘍的發(fā)展與免疫疾病如壞疽性膿皮病(pyodermagangrenosum)和脈管炎(vasculitis)相關(guān)。現(xiàn)在的治療包括長(zhǎng)期的全身性免疫抑制法，它并不總是有效。在口腔、生殖器和胃腸粘膜的上皮缺陷和潰瘍是常見的，并會(huì)導(dǎo)致很多痛苦。根本的病理機(jī)制不很清楚，例如口瘡(aphtae)和侵蝕性苔蘚(erosive lichen)，且治療方法貧乏。
傳統(tǒng)傷口護(hù)理包括通過機(jī)械或酶去除壞死殘?jiān)鼇硇纬扇庋拷M織。細(xì)菌密集定居的傷口可能需要抗菌治療來避免侵入性感染(invasive infection)。使用多種局部抗微生物試劑，如碘酒(iodine)，氯已定(chlorhexidine)，雙氧水(hydrogen peroxide)，銀和抗生素，但必須考慮這些試劑對(duì)基質(zhì)和新生表皮(neoepidermis)的有毒作用的風(fēng)險(xiǎn)。一旦從傷口清除了壞死組織，應(yīng)用敷料來促進(jìn)肉芽組織形成。可以得到很多種這樣的敷料，并且多項(xiàng)動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明了它們對(duì)傷口愈合的有益效果。
某些部分的傷口仍是治療抵抗性的，所以需要附加的治療。在過去的十年中生長(zhǎng)因子在加快傷口修復(fù)中的潛在用途引起了很多關(guān)注。生長(zhǎng)因子是控制對(duì)組織修復(fù)關(guān)鍵的細(xì)胞過程(cellular process)的分子，包括細(xì)胞遷移，增殖，血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)從頭(de novo)合成。已經(jīng)在很多實(shí)驗(yàn)中顯示出了這些生長(zhǎng)因子的有益效果(Scharffetter-Kochanek等，Basic ResCardiol931-3，1999)。然而，至今在臨床實(shí)踐中用生長(zhǎng)因子治療慢性潰瘍都很令人失望?，F(xiàn)在在美國(guó)和歐洲(瑞典除外)被許可的becaplermin(Regranex)是唯一，優(yōu)選在糖尿病的足潰瘍中使用的生長(zhǎng)因子。用生長(zhǎng)因子治療慢性潰瘍的臨床失敗的原因被認(rèn)為涉及傳遞問題和迅速降解。
與此同步，使用生物工程化的人皮膚類似物中的自體和同種異體材料的組織療法已經(jīng)有了進(jìn)展。培養(yǎng)的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成了用于覆蓋(例如燒傷病人的)大面積損傷的皮膚的功能療法，但該治療昂貴，費(fèi)時(shí)并且需要實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。為提供表皮基底(dermal substrate)已經(jīng)使用了多種策略，如無細(xì)胞的人尸體和有細(xì)胞或無細(xì)胞的牛膠原蛋白。所有可行的方法都具有相當(dāng)多的不足，如可能傳染疾病，費(fèi)用高，以及幾乎不適合基礎(chǔ)傷口護(hù)理。
抗微生物肽是先天免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子，其作用是保護(hù)宿主抵御可能的有害微生物。進(jìn)化中它們是保守的，并在自然界分布廣泛。人類的抗微生物肽，目前只有少數(shù)進(jìn)行了鑒定；其中防衛(wèi)素(defensin)和人cathelicidin抗微生物肽hCAP18已涉及在上皮防護(hù)中起作用(Selsted等，J Biol Chem25814485-14489，1983)。
WO 96/08508涉及人多肽FALL-39，以及包含所述肽并具有抗細(xì)菌的抗微生物活性的藥物組合物。所述肽由開始的四個(gè)氨基酸殘基被命名為FALL-39，并由被三個(gè)分別的小組同時(shí)鑒定的前體蛋白的39個(gè)氨基酸的C-末端部分組成(Cowland等，F(xiàn)EBS，1995；Agerberth等，Proc Natl Acad SciUSA 1995；Larrick等，F(xiàn)EBS Letters 1996)。所述肽顯示具有抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的有效抗微生物活性。進(jìn)一步定性C-末端肽顯示去除了開始的兩個(gè)(FA)得到LL-37，包含37個(gè)氨基酸的較短序列，它是現(xiàn)在可接受的名稱(Gudmundsson等，Eur J Biochem 238325-332，1996)。
該前體蛋白命名為hCAP18，它是人陽離子抗微生物蛋白，還是包含cathelin的cathelicidin蛋白家族的成員之一，其中cathelin在進(jìn)化中保守并且C-末端部分在不同物種可變。在人類中，hCAP18是此蛋白家族的唯一成員，而在其它物種中，如小鼠和豬，則有此蛋白家族的若干成員。所述C-末端肽LL-37被認(rèn)為在細(xì)胞外起作用，并且沒有證據(jù)證明此前體蛋白在細(xì)胞內(nèi)被切割。hCAP18/LL-37存在于白細(xì)胞以及屏障器官(barrier organ)如皮膚，粘膜，呼吸道上皮和生殖器官。hCAP18/LL-37定位于屏障上皮(barrier epithelia)似乎與該肽在預(yù)防局部感染和全身性微生物侵入中的保護(hù)性作用是一致的。LL-37被描述為無半胱氨酸的肽，它能容納(adopt)兩親性的(amphiphatic)，或換言之兩親性的(amphiphilic)，α-螺旋構(gòu)象。高陽離子性(cationicity)與穩(wěn)定化的兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)似乎是此肽抗革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌的抗微生物作用所需要的，這已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)予以證明(Gianga-spero等，Eur J Biochem2685589-5600，2001)。兩親性的和α-螺旋的結(jié)構(gòu)似乎對(duì)于殺死革蘭氏陰性細(xì)菌不太重要。與炎癥相關(guān)，hCAP18/LL-37在皮膚上皮(Frohm等，J Biol Chem27215258-15263，1997)及粘膜(Frohm Nilsson等，Infect Immun672561-2566，1999)上調(diào)。
現(xiàn)有技術(shù)Dorschner等，J Invest Dermatol 11791-97，2001，顯示切割后cathelicidin的表達(dá)量在人和鼠皮膚中增加，并且缺乏鼠同系物cathelicidin基因不能保護(hù)這些小鼠抵御A族(Group)鏈球菌侵入。
WO 96/09322，兒童醫(yī)療中心公司(Children′s Medical Center Corporation)公開了抗菌肽PR-39具有多配體蛋白聚糖(syndecan)-1和-4的誘導(dǎo)活性，因此能同時(shí)減少感染，并且作為synducin，影響參與組織修復(fù)的生長(zhǎng)因子，基質(zhì)組分及其它細(xì)胞效應(yīng)物(effector)的作用。所述synducin可在藥物載體如常用的脂質(zhì)體中給藥。
EP 0 935 965 A1，Toray Industries，Inc.，涉及抗幽門螺桿菌制劑(antipyloriagent)，其包含作為活性劑的抗微生物肽，如豬的肽PR-39。其結(jié)論是PR-39的外源性(exogeneous)給藥有抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的抗微生物活性，并加快小鼠胃潰瘍的愈合。FALL39被提到是cathelin家族的成員之
US 6,255,282，Helix Biomedix，Inc.，公開了新合成的裂解肽(lyticpeptide)，所述的裂解肽共享已知的不同裂解肽的結(jié)構(gòu)和功能特性。具體描述了具有α-螺旋構(gòu)象的18個(gè)到約40個(gè)氨基酸的肽。但沒有提到裂解cathelicidin肽。
Frohm Nilsson，Thesis，Karolinska Institutet，Stockholm 2001，同時(shí)闡述了人cathelicidin抗微生物蛋白hCAP18在人皮膚傷口被高水平誘導(dǎo)，并在生理性愈合而不是慢性非愈合性潰瘍中釋放活性的C-末端肽LL-37。hCAP18在傷口床(bed)和正常傷口愈合過程中的上皮中可被檢測(cè)到，但它在慢性腿潰瘍的上皮中不存在，它只在傷口床和基質(zhì)中被檢測(cè)到。據(jù)推測(cè)慢性潰瘍上皮中hCAP18的低水平及其缺乏造成了愈合受損。
Zasloff，Nature 415389-395，2002在抗微生物肽的綜述中討論了多項(xiàng)應(yīng)用，其中已經(jīng)闡述所述肽為抗感染劑，并且描述了抗微生物肽用于藥物開發(fā)。
EP 1 358 888 A1，Bals等，其
公開日2003年11月5日，涉及所述肽LL-37在預(yù)防或治療由血流減少和動(dòng)脈硬化造成的疾病和治療由動(dòng)脈血供給減少造成的傷口中的用途。顯示了LL-37誘導(dǎo)新血管形成和刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。本發(fā)明完全涉及血管生成效應(yīng)，并沒提到上皮。
雖然抗微生物肽，具體是LL-37，已經(jīng)顯示出治療用途，但至今仍未實(shí)現(xiàn)。肽LL-37在高濃度時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性效應(yīng)。然而，血清存在時(shí)LL-37表現(xiàn)出的潛在的細(xì)胞毒性效應(yīng)被抑制，但藥物制劑應(yīng)避免包含血清，因?yàn)樗袀鞑ゼ膊〉娘L(fēng)險(xiǎn)、得到的途徑有限且成本高。
發(fā)明概述作為對(duì)損傷的正常反應(yīng)，人的抗微生物肽hCAP18在皮膚上皮中被正向調(diào)節(jié)。但在慢性非愈合性腿潰瘍中發(fā)現(xiàn)了低水平的hCAP18。明顯地，在慢性腿潰瘍中hCAP18和LL-37在上皮完全不存在但在傷口床的炎性滲出物(infiltrate)和基質(zhì)中存在。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)hCAP18在器官培養(yǎng)的皮膚傷口的上皮再形成中被誘導(dǎo)，并且此上皮再形成被抗LL-37的抗體以濃度依賴方式抑制。這些發(fā)現(xiàn)提示LL-37像生長(zhǎng)因子一樣發(fā)揮功能，在傷口閉合中起決定性作用。本發(fā)明涉及LL-37或衍生自LL-37的新合成的肽或其功能性衍生物的用途，以補(bǔ)償體內(nèi)產(chǎn)生的天然LL-37的缺乏。
也顯示hCAP18的上調(diào)和/或加入LL-37肽會(huì)刺激正常上皮和基質(zhì)細(xì)胞的增殖，顯示正常傷口的愈合和上皮再生也可得到增強(qiáng)。
也發(fā)現(xiàn)LL-37的細(xì)胞毒性可在包含某些脂質(zhì)的組合物中降低。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是18kDa的hCAP18蛋白的示意圖，該蛋白包含信號(hào)肽S.P，保守的cathelin部分，及抗微生物肽LL-37(它在體內(nèi)被酶截?cái)?。
圖2是cathelicidin蛋白家族的示意圖，其中說明了不同物種中C-末端肽的多樣性。
圖3A，3B和3C顯示了pIRES2-EGFP載體的cDNA序列，該載體包括hCAP18的編碼序列，該序列用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)hCAP18。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及肽和它的可藥用鹽及其衍生物，所述肽具有LL-37的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列，前提是所述肽不包括LL-37。LL-37具有氨基酸序列SEQ ID NO1H-Leu-Leu-Gly-Asp-Phe-Phe-Arg-Lys-Ser-Lys-Glu-Lys-Ile-Gly-Lys-Glu-Phe-Lys-Arg-Ile-Val-Gln-Arg-Ile-Lys-Asp-Phe-Leu-Arg-Asn-Leu-Val-Pro-Arg-Thr-Glu-Ser-OH。
LL-37的N-末端序列指從氨基酸殘基編號(hào)1的亮氨酸(Leu)開始的序列。
可藥用鹽包含，例如抗衡離子的乙酸鹽，碳酸鹽，磷酸鹽，硫酸鹽，三氟乙酸鹽和氯化物。優(yōu)選的鹽是乙酸鹽。酯和酰胺是可藥用衍生物的例子。
本發(fā)明的肽應(yīng)具有不超過40個(gè)氨基酸的氨基酸鏈。本發(fā)明涉及具有在LL-37的C-末端已添加了1-3個(gè)氨基酸的序列的肽?？商砑舆x自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val的任何氨基酸及其衍生物。具有38個(gè)氨基酸的肽的例子LL-38，SEQ IDNO19，具有在LL-37的C-末端已經(jīng)添加了絲氨酸的序列。
本發(fā)明具體涉及具有至少20個(gè)氨基酸的序列的肽，其選自LL-36，LL-35，LL-34，LL-33，LL-32，LL-31，LL-30，LL-29，LL-28，LL-27，LL-26，LL-25，LL-24，LL-23，LL-22，LL-21或LL-20，上述肽分別具有序列SEQID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17或SEQ ID NO18。
優(yōu)選的肽選自LL-36，LL-35，LL-34，LL-33，LL-32，LL-31，LL-30，LL-29，LL-28，LL-27，LL-26或LL-25。
本發(fā)明的肽的氨基酸序列見下表。

可用新的肽作為用于細(xì)胞增殖，上皮再生，正?；蚵詡谟系乃幬?，并作為抗微生物劑。
相信新的肽具有在生理?xiàng)l件下形成α-螺旋結(jié)構(gòu)的潛力。
本發(fā)明其它方面涉及肽及它的可藥用鹽及其衍生物在制備用于上皮再生及上皮和基質(zhì)傷口的愈合的藥物中的用途，所述肽具有選自以下序列之一的氨基酸序列a)SEQ ID NO1；b)包含SEQ ID NO1的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列；其中該肽通過非裂解機(jī)制來增強(qiáng)上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明具體涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的肽LL-37的用途，所述肽呈鹽的形式，優(yōu)選乙酸鹽形式。
本發(fā)明也涉及肽的用途，所述肽選自上述的LL-20到LL-36。
由于初級(jí)結(jié)構(gòu)中的陽離子氨基酸殘基賴氨酸和精氨酸，LL-37以及LL-25到LL-36在中性pH具有凈正電荷(+5到+7)。具體是LL-34和LL-35具有7個(gè)凈正電荷。其它的氨基酸殘基是非極性的/疏水的或極性和中性的，或者在較小的程度上是極性的并帶負(fù)電荷的，這使得整個(gè)肽分子為兩親性的。這種肽與疏水面插入雙層的帶負(fù)電荷的磷脂微生物細(xì)胞壁發(fā)生靜電相互作用。疏水性和/或電荷中任一個(gè)減少都降低所述肽的抗微生物效應(yīng)。通常用溶血活性來評(píng)估肽對(duì)宿主細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性效應(yīng)，該效應(yīng)顯示與肽的抗微生物效應(yīng)相關(guān)(Chen等，F(xiàn)EBS Lett 236462-466，1988)。多項(xiàng)研究已確認(rèn)對(duì)于其它兩親性的，α-螺旋的抗微生物肽這也是正確的。
對(duì)具有37個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的兔CAP18(Cap18106-142)C-末端肽的研究顯示廣譜抗菌活性在高度基礎(chǔ)的20個(gè)殘基的N-末端序列中保留，但如果N-末端被截短，就不會(huì)保留該活性(Larrick等，Antimicrob AgentsChemother 372534-2539，1993)。
LL-37以及新的LL-20到LL-36肽可用自動(dòng)肽合成儀并用合成肽的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成。
本發(fā)明具體涉及所述LL-37肽或肽LL-20到LL-36的任一在制備用于治療慢性潰瘍的藥物中的用途。所述慢性潰瘍可由于靜脈功能不全，如腿潰瘍，代謝功能異常，如糖尿病，或免疫疾病，如脈管炎和壞疽性膿皮病造成。本發(fā)明的肽也可用于治療由于外傷或燒傷導(dǎo)致的傷口。所述肽具體可被用于上皮組織再生，并增強(qiáng)微型皮膚磨削術(shù)(microdermabrasion)后的上皮再生。
除了對(duì)細(xì)胞有毒性，LL-37在傷口環(huán)境迅速降解。近來顯示絲氨酸蛋白酶3負(fù)責(zé)hCAP18的細(xì)胞外切割(Srensen等，Blood 973951-3959，2001)。
為預(yù)防所述肽的沉積也為減少內(nèi)部細(xì)胞毒性，所述肽可用極性脂質(zhì)載體配制。所述制劑應(yīng)便于將所述肽給藥到傷口并另外提供給藥后所述肽的延遲釋放。這會(huì)在體內(nèi)和體外提高所述肽的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一目的是藥物組合物，其包含呈可藥用鹽或其衍生物形式的抗微生物cathelicidin肽，與由成雙層性極性脂質(zhì)和水溶液組成的載體。
所述cathelicidin肽除了人的LL-37外，還可衍生自不同動(dòng)物物種，例如綿羊的SC5，母牛的Bac5，豬的PR-39，小鼠的CRAMP，及兔的p15，見圖2。
雙層一般指極性脂質(zhì)在水中的片層排列。?；溞纬闪藘?nèi)部的疏水部分并且極性頭部-基團(tuán)形成雙層的親水部分。極性的成雙層性的脂質(zhì)的例子，無論來源是天然的還是合成的，可以提到的有磷脂酰膽堿，磷脂酰甘油，雙半乳糖基甘油二酯(digalactosyldiacylglycerol)，鞘磷脂等。依賴于所述極性脂質(zhì)在極性溶劑如水中的濃度，可形成脂質(zhì)體或片層液晶類的粘性凝膠。
所述藥物組合物具體包含具有選自如下序列之一的氨基酸序列a)SEQ ID NO1；b)包含SEQ ID NO1的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列；呈可藥用鹽或其衍生物的形式的肽，以及由成雙層性極性脂質(zhì)和水溶液組成的載體。
優(yōu)選的與所述肽混合或配制的成雙層性極性脂質(zhì)是那些電荷中性的。特別有用的是雙半乳糖基甘油二酯，及其它糖脂，如糖基神經(jīng)酰胺(glycosylceramide)，無論是天然的還是合成的，其中非離子性的糖部分(moiety)構(gòu)成極性頭部-基團(tuán)。較不優(yōu)選但仍有用的是那些在生理環(huán)境是兩性離子的和中性的極性脂質(zhì)，如磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。最不優(yōu)選的是那些帶負(fù)電荷的極性脂質(zhì)，因此與帶正電荷的肽形成強(qiáng)的復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明所述的成雙層性極性脂質(zhì)載體優(yōu)選選自磷脂，半乳糖脂或鞘脂。
特別優(yōu)選的成雙層性極性脂質(zhì)是雙半乳糖基甘油二酯或富含雙半乳糖基甘油二酯的極性脂質(zhì)混合物，這是由于這類極性脂質(zhì)的極好的皮膚耐受性。雙半乳糖基甘油二酯是一類屬于糖脂家族的脂質(zhì)，是植物細(xì)胞膜的公知成分。豐度最大的類之一包含兩個(gè)半乳糖單位，并且它的常用命名和縮寫是雙半乳糖基甘油二酯，DGDG，有時(shí)稱為半乳糖脂。半乳糖脂，首先是DGDG和富含DGDG的物質(zhì)，已經(jīng)調(diào)查并發(fā)現(xiàn)它是工業(yè)應(yīng)用如食品、化妝品和藥劑中有用的表面活性物質(zhì)。WO 95/20944描述了富含DGDG的物質(zhì)“半乳糖脂物質(zhì)”的用途，它作為成雙層性的物質(zhì)在極性溶劑中用于制藥、營(yíng)養(yǎng)和化妝品用途。這些應(yīng)用沒公開半乳糖脂以及通常的肽和蛋白的用途，具體沒公開本發(fā)明的肽的用途。
本發(fā)明優(yōu)選方面涉及藥物組合物，其中成雙層性極性脂質(zhì)載體是富含雙半乳糖基甘油二酯的極性脂質(zhì)混合物。
本發(fā)明另一優(yōu)選方面是藥物組合物，其中所述肽為乙酸鹽形式。優(yōu)選的肽為乙酸鹽形式的LL-37。特別優(yōu)選的是藥物組合物包含LL-37的乙酸鹽與作為成雙層性的脂質(zhì)載體的CPL-半乳糖脂。CPL-半乳糖脂是包含重量百分比為50-70％的雙半乳糖基甘油二酯和30-50％或其它極性脂質(zhì)的半乳糖脂組分的商標(biāo)。
所述藥物組合物中鹽形式的所述肽和糖脂載體的比例應(yīng)優(yōu)選為重量比1∶5到1∶50，特別優(yōu)選是1∶10-1∶25。
除了所述成雙層性的脂質(zhì)，所述載體也包含水溶液。水溶液指具有關(guān)于pH，離子強(qiáng)度，等滲性等的生理學(xué)或可藥用特性的溶液。作為例子可提及的水和其它生物相容性溶劑的等滲溶液有水溶液，如生理鹽水和葡萄糖溶液，以及形成水凝膠的物質(zhì)。所述水溶液可以是緩沖的，如磷酸鹽緩沖鹽水PBS。
此藥物組合物可還包含可藥用賦形劑，如防腐劑來預(yù)防微生物在組合物中生長(zhǎng)，抗氧化劑，等滲劑，著色劑等。在水的懸浮液中所述組合物可以與懸浮劑和穩(wěn)定劑組合。
組合物的膠體性質(zhì)使其能通過使用最終的過濾除菌步驟來制備無菌的組合物。
為形成凝膠，所述肽優(yōu)選用形成水凝膠的物質(zhì)配制。形成水凝膠的物質(zhì)的例子是合成的聚合物，如聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸，聚乙二醇，泊洛沙姆(poloxamer)嵌段共聚物等；半合成聚合物，如纖維素酯，包括羧甲基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，甲基纖維素，甲基羥丙基纖維素和乙基羥乙基纖維素等；天然的膠，如阿拉伯樹膠(acacia)，角叉藻聚糖(carragenan)，殼聚糖(chitosan)，果膠，淀粉，黃原膠等。
使用粘膜附著性(muco-adhesive)的水凝膠是有利的。該方面特別有用的是使用透明質(zhì)酸及其衍生物，卡波姆(carbomer)和聚卡波菲(polycarbophil)類的交聯(lián)的聚丙烯酸，已知會(huì)強(qiáng)有力地附著到粘膜的從凝膠容易得到的聚合物。
用泊洛沙姆類的嵌段共聚物也是有利的，即為包含聚乙二醇和聚丙二醇嵌段的聚合物。分散在水中的某些泊洛沙姆是熱致可逆的(thermoreversible)在室溫它們是低粘性的，但隨溫度升高顯示出明顯的粘性增加，導(dǎo)致在體溫形成凝膠。因此將藥物制劑向相對(duì)溫暖的傷口給藥的接觸時(shí)間可能會(huì)延長(zhǎng)，因此可提高所摻入的肽的有效性。
本發(fā)明藥物組合物可被配制用來局部或腸道，也就是口腔，頰，舌下，粘膜，鼻腔，支氣管，直腸，和陰道給藥。
局部給藥的藥物組合物的非限制性例子是溶液，噴霧，懸浮液，乳狀液，凝膠和膜。如需要，可用添加了藥物組合物的繃帶或急救繃帶(band aid)或膏劑(plaster)。片劑，膠囊，溶液或懸浮液可用于腸道給藥。
本發(fā)明另一方面涉及肽通過非裂解機(jī)制在體外使上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞增殖的用途，所述肽呈可藥用鹽或其衍生物的形式，具有選自如下序列之一的氨基酸序列a)SEQ ID NO1；b)包含SEQ ID NO1的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列；所述的增殖能具體用于人的自體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的體外增殖。
本發(fā)明也涉及培養(yǎng)真核細(xì)胞，如上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其包含LL-37或所述肽與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組合。可加入細(xì)胞毒性降低試劑如血清。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A-I(apoA-I)是人血漿中主要的結(jié)合LL-37的蛋白并作為L(zhǎng)L-37的清除劑(scavenger)(Wang等，J Biol Chem27333115-33118，1998；Srensen et al，J Biol Chem 27422445-22451，1999)，這提示了調(diào)控cathelicidin肽所涉及的機(jī)制。細(xì)胞毒性降低試劑也可以是成雙層性極性脂質(zhì)，如選自上述磷脂，半乳糖脂或鞘脂的脂質(zhì)。
本發(fā)明生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基基于雙蒸餾水(double-distilled water)，及若干如下成分無機(jī)鹽，酚紅，葡萄糖，胸苷(thymidine)，次黃嘌呤核苷酸(hypoxanthinine)，HEPES，丙酮酸鈉，氨基喋呤，氨基酸和維生素。為了在體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞，如例如角質(zhì)形成細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基可包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和促進(jìn)生長(zhǎng)的試劑盒，該試劑盒包括a)鹽溶液中的LL-37肽，b)青霉素+鏈霉素，c)胰島素，d)轉(zhuǎn)鐵蛋白，e)三碘甲腺原氨酸(triiodotyronine)，f)氫化可的松，g)霍亂毒素，可選的細(xì)胞毒性降低試劑，如血清或極性脂質(zhì)。為了在體外培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基可包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和促進(jìn)生長(zhǎng)的試劑盒，該試劑盒包括a)鹽溶液中的LL-37肽，b)青霉素+鏈霉素，及可選的細(xì)胞毒性降低試劑，如血清或極性脂質(zhì)。
本發(fā)明其它目的是增強(qiáng)人的自體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的體外擴(kuò)展(expansion)用于體內(nèi)細(xì)胞移植的方法，其中所述細(xì)胞分離自健康皮膚的切片(excised piece)，所分離的細(xì)胞在本發(fā)明的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，之后收獲所培養(yǎng)的細(xì)胞并用于傷口治療，如燒傷和潰瘍。
本發(fā)明也涉及促進(jìn)生長(zhǎng)的試劑盒，其包含肽LL-37或所述肽，和細(xì)胞毒性降低的成雙層性極性脂質(zhì)，并可選包含在單獨(dú)容器中的抗生素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基，及其它常用添加物。
本發(fā)明又一方面涉及將全長(zhǎng)hCAP18cDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到自體的人角質(zhì)形成細(xì)胞用于潰瘍和燒傷的細(xì)胞移植。所述cDNA構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為能夠通過開關(guān)機(jī)制調(diào)節(jié)hCAP18基因的表達(dá)(Resnitzky等，Mol CellBiol 141669-1679，1994)。自體的人角質(zhì)形成細(xì)胞得自患者的健康皮膚切片。所述角質(zhì)形成細(xì)胞如所述在細(xì)胞培養(yǎng)物中分離并擴(kuò)展。所述cDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到角質(zhì)形成細(xì)胞。然后將所轉(zhuǎn)染的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)一步在體外擴(kuò)展并送回患者。
本發(fā)明具體涉及包含具有序列SEQ ID NO20的hCAP18完整cDNA序列的基因構(gòu)建體的用途，所述用途是為了轉(zhuǎn)染上皮和/或基質(zhì)細(xì)胞來增強(qiáng)所述細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例實(shí)施例1制備會(huì)成肽根據(jù)固相合成用9-芴甲氧羰基/叔丁基策略(9-fluorenylmethoxycarbonyl/tert-butyl strategy)來合成LL-37肽。未經(jīng)加工的肽，作為三氟乙酸鹽，用HPLC純化并最后用冷凍干燥分離(批號(hào)971/26，來自PolypeptideLaboratories A/S，Hillerd，Denmark)。通過HPLC和面積積分(integration)來確定純度，并發(fā)現(xiàn)其為99％。用質(zhì)譜法分析分子量，并對(duì)應(yīng)于游離堿(free base)形式的理論值4493g/mol。分析氨基酸組成顯示每個(gè)氨基酸的相對(duì)量對(duì)應(yīng)于LL-37理論值。從氨基酸分析結(jié)果計(jì)算肽含量，發(fā)現(xiàn)其為73％，剩余物為平衡離子及殘余溶劑。
合成多批LL-37，用于如下實(shí)施例2和5的LL-37肽呈乙酸鹽形式。
以乙酸鹽形式相應(yīng)合成肽LL-36和LL-38。
在如下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)使用的不同肽見下表。

實(shí)施例2制備包含LL-37肽和脂質(zhì)載體的混合物的藥物組合物用如下成分制備藥物組合物

*ppm＝百萬分之幾(重量比)將作為乙酸鹽的肽LL-37(批號(hào)990/37/A)，及得自Lipocore Holding AB的脂質(zhì)載體CPL-半乳糖酯(其為富含雙半乳糖基甘油二酯的脂質(zhì)物質(zhì)并從燕麥制備)，在50ml玻璃燒瓶中稱重。輕輕混合此兩種成分然后加入甘油溶液。劇烈混合混合物120分鐘然后靜置1小時(shí)。所得組合物為細(xì)致(fine)、均質(zhì)的分散體(dispersion)。將其冷藏直至使用。
實(shí)施例3制備包含肽LL-37及脂質(zhì)載體的含水混合物L(fēng)L-37的三氟乙酸鹽(批號(hào)971/26)和極性的成雙層性脂質(zhì)載體的混合物，
用如下成分(重量百分比)來制備表1.

得自Lipocore Holding AB的CPL-半乳糖酯(CPL-Galactolipid)是來自燕麥的層析純化的半乳糖脂級(jí)分，得自Lucas Meyer GmbH的Epikuron 200是來自大豆的磷脂酰膽堿，并且來自Lipocore Holding AB的CPL-鞘磷脂(CPL-Sphingomyelin)是來自牛奶的層析純化的鞘磷脂。來自Invitrogen Corp.的DMEM，Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基是包含無機(jī)鹽、葡萄糖、酚紅、氨基酸和維生素的水溶液。
在玻璃燒瓶中稱重肽LL-37及脂質(zhì)載體然后加入DMEM。用HeidolphPromax混合器以頻率200/min劇烈震搖所得的分散體1.5小時(shí)，然后在室溫令其平衡并靜置約3小時(shí)。進(jìn)行視覺估計(jì)，獲得如下結(jié)果所有樣本為混濁分散體，在任意樣本B1，B2，C1和C2之間無混濁度的差別。唯一可見不同是在樣本A1和A2之間包含所述肽的A1明顯不如不包含所述肽的A2混濁。樣本A2的混濁度依次低于樣本B1，B2，C1和C2的混濁度。這些觀察表明樣本A1的兩個(gè)組分之間存在較強(qiáng)的相互作用，從而與無所述肽的樣本A2以及其余的對(duì)應(yīng)樣本相比，其分散體的平均顆粒較小。在室溫儲(chǔ)存一天后，樣本A1和A2不變，即兩者都是均質(zhì)分散體并且A1不如A2混濁，而其它四個(gè)樣本在玻璃燒瓶底部都具有可觀的沉淀。
肽和極性脂質(zhì)載體的所有三種混合物可用于各種目的，例如作為傳遞系統(tǒng)，并且用于細(xì)胞培養(yǎng)物中的實(shí)驗(yàn)；然而，因?yàn)殡暮桶肴樘侵幕旌衔锏膬?chǔ)存期限(shelf-life)比其他的那些相對(duì)較長(zhǎng)(無沉淀)，所述混合物是對(duì)于實(shí)際應(yīng)用是最優(yōu)選的。
實(shí)施例4制備包含LL-37肽和脂質(zhì)載體的混合物的水混合物L(fēng)L-37的三氟乙酸鹽樣本(批號(hào)971/26)和極性的成雙層性脂質(zhì)載體用如下成分(用重量百分比表示)制備表2.

LTP Lipid Technologies Provider AB生產(chǎn)的CPL-半乳糖酯是來自燕麥的層析純化的半乳糖脂級(jí)分。所用的多種磷脂是來自大豆的磷脂酰膽堿(PC)，大約40％(Sigma；P-3644)；來自蛋黃的PC，大約60％(Sigma；P-5394)；合成的二油醇磷脂酰膽堿(dioleylphosphatidylcholine)(DOPC)，大約99％(Sigma；P-6354)；來自大豆的PC，大約70％(Lipoid S75)；及來自大豆的PC，大約94％(Lipoid S100)。PBS是來自Invitrogen Corp.的磷酸鹽緩沖鹽水(Dulbecco’s；批號(hào)14190-094)。
所有被研究的極性脂質(zhì)具有恰好低于(well below)0℃的鏈熔融相變(chain melting transition)溫度，即在完全水化時(shí)，在-10到-15℃的范圍。
在100ml玻璃燒瓶中稱重肽LL-37及脂質(zhì)載體然后加入PBS?？傮w積約為30ml。將ST混合器(B1型，E.Büchler，Tübingen)設(shè)置為5.5(相當(dāng)于頻率約150/min)劇烈震搖所述樣本2小時(shí)，然后在室溫令其平衡并靜置約30分鐘。用ShimadZu UV-VIS Spectrophotometer UV-160A在400-800nm記錄所得分散體的混濁度。在室溫用10mm比色池(cuvette cell)對(duì)比純水作測(cè)量。表3的混濁度數(shù)據(jù)以在600nm的透射％表示。也用視覺估計(jì)分散體。在室溫儲(chǔ)存所述分散體一到兩天后重復(fù)混濁度測(cè)量。
表3.混濁度數(shù)據(jù)

由視覺估計(jì)得出結(jié)論所有混合物或多或少地形成混濁分散體；樣本D，E，H及I形成最不混濁的分散體，由表3中的最高透光可見，而樣本F，G和J形成最混濁的分散體，結(jié)果使得分光光度計(jì)檢測(cè)的透光最低。在室溫儲(chǔ)存一天后，具有初始高混濁度(低透射性)的樣本F，G和J都沉淀并且不可測(cè)。樣本D，E，H和I都是穩(wěn)定的分散體，所以制備后一天到兩天混濁度數(shù)據(jù)可重復(fù)。
樣本D和H是一式兩份，都包含CPL-半乳糖酯，但樣本H具有的肽重量與半乳糖脂重量相比稍高。這使得樣本H中的混濁度稍低(透射較高)，這提示此樣本中肽和脂質(zhì)的相互作用比樣本D中的強(qiáng)，從而導(dǎo)致較小的復(fù)合體/聚集體，它們使混濁度較低。
進(jìn)一步在2-8℃監(jiān)測(cè)樣本D，E，H和I的膠體穩(wěn)定性2個(gè)月。
表4.穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

這些數(shù)據(jù)和觀察顯示肽和極性脂質(zhì)載體的兩個(gè)混合物優(yōu)于其余被測(cè)的混合物。包含CPL-半乳糖酯(樣本D和H)和來自大豆的PC，ca 40％(樣本E)的載體使得分散系統(tǒng)最細(xì)致，并且膠體穩(wěn)定性最長(zhǎng)；然而，藥物應(yīng)用中只接受CPL-半乳糖酯，因?yàn)閮H有具有僅40％磷脂酰膽堿的磷脂物質(zhì)能用于技術(shù)應(yīng)用。這些數(shù)據(jù)再次表明半乳糖脂物質(zhì)在多種藥物應(yīng)用中的有用性，例如作為肽的載體系統(tǒng)。
實(shí)施例5.制備包含不同含量的LL-37肽和不同含量的半乳糖脂的水混合物制備LL-37肽在PBS中的995ppm的母液(stock solution)(乙酸鹽；批號(hào)990/37/A)和CPL-半乳糖酯在PBS中的1.00％的母液。在20ml的帶橡皮塞和鋁帽的玻璃小瓶(vial)中混合等分母液加另外的PBS。所述混合物的組分見表5所示。在室溫平衡1小時(shí)后，將ST混合器(B1型，E.Büchler，Tübingen)設(shè)置為7.5(相當(dāng)于頻率大約為190/min)，以水平位置震搖小瓶1小時(shí)。然后在室溫過夜平衡并靜置所述混合物。評(píng)價(jià)所述混合物在4℃、一天和五天后的外觀為澄清膠體，輕度混濁，混濁，乳狀，結(jié)果總結(jié)見表5。
表5.


很明顯某些LL-37肽和半乳糖脂的比例導(dǎo)致了溶液外觀，這表明存在大小比無LL-37的對(duì)應(yīng)樣本的顆粒大小要小的小復(fù)合物。澄清溶液表明了膠體穩(wěn)定性優(yōu)異。
實(shí)施例6構(gòu)象測(cè)量測(cè)量LL-37在溶液中的圓二色性(CD)會(huì)揭示關(guān)于構(gòu)象變化的信息。LL-37的抗菌活性依賴于構(gòu)象螺旋含量高使得抗菌作用強(qiáng)并且細(xì)胞毒性活性高(Johansson等，JBiol Chem 2733718-3724，1998)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LL-37的α-螺旋構(gòu)象依賴于平衡離子，pH和肽濃度(Johansson等，JBiol Chem2733718-3724，1998)。也已知所述肽的某些級(jí)分在水溶液中具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，并且由于添加劑如脂質(zhì)的存在會(huì)促進(jìn)此結(jié)構(gòu)，將它由無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化為α-螺旋(Turner等，Antimicrob Agents Chemother 422206-2214，1998)。
制備用于圓二色性(CD)測(cè)量的樣本是在10mM磷酸鹽緩沖的水溶液，pH 7.0中，該溶液包含200ppm LL-37(作為三氟乙酸鹽，批號(hào)971/26)，有或無0.40％的CPL-半乳糖酯。將ST混合器(B1型，E.Büichler，Tübingen)，其設(shè)置為7.5(相當(dāng)于頻率大約為220/min)劇烈震搖50ml玻璃燒瓶中的20ml樣本2小時(shí)。在2-8℃過夜平衡并靜置所述樣品。
在Jasco J-720(Jasco Inc.)分光光度計(jì)記錄CD光譜。將比色池(1mm徑長(zhǎng)(path length))置于光電倍增管鄰近，來降低光從分散體散射的效果。在室溫測(cè)量所述樣本并從280到200nm以速率20nm/min掃描，其分辨率為1nm，每輪3次累積(accumulations per run)。結(jié)果表示為平均殘基橢圓率(meanresidue ellipticity)，[θ]，并用如下公式估計(jì)在222nm的α-螺旋構(gòu)象的百分率([θ]222+3900)·100/41900。
對(duì)于200ppm LL-37在10mM磷酸鹽緩沖溶液，pH 7.0中的CD測(cè)定，208和222nm的雙二色性最小值(double dichroic minima)顯示α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)。用在222nm的最小值來計(jì)算α-螺旋結(jié)構(gòu)的百分率，發(fā)現(xiàn)它為約63％。當(dāng)在相同緩沖溶液中加入的半乳糖脂濃度為0.40％(w/w)時(shí)，LL-37的α-螺旋結(jié)構(gòu)實(shí)際上不受影響，α-螺旋結(jié)構(gòu)約為64％。
加強(qiáng)的螺旋構(gòu)象與抗菌活性增加有關(guān)。推測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)也與LL-37的促傷口愈合能力有關(guān)，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)的高百分率表示活性加強(qiáng)。在緩沖水溶液中這也指高細(xì)胞毒性，但在存在半乳糖脂時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)被保留，因此活性不受影響但細(xì)胞毒性卻降低。
將陰離子的合成磷脂，棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG；Sigma-Aldrich，P6956)作為參照物(reference)用如上述的相同實(shí)驗(yàn)條件來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)存在此脂質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)的百分率較低，為58％，這表明LL-37的構(gòu)象以至于活性更多地被負(fù)電荷的磷脂而不是被中性的半乳糖脂影響。但更重要的是，在4℃儲(chǔ)藏一個(gè)月后所述樣本已部分分離，沉淀在容器底部。輕輕搖動(dòng)會(huì)得到粗制的分散體。在同一時(shí)間點(diǎn)，在相應(yīng)樣本中也觀察到基于半乳糖脂的沉淀，但程度較輕，它可通過輕輕攪拌再分散為細(xì)致的分散體。
實(shí)施例7細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)對(duì)于評(píng)價(jià)與活組織緊密接觸的物質(zhì)的細(xì)胞毒性，體外細(xì)胞毒性分析是有價(jià)值的。
在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(L 929小鼠成纖維細(xì)胞)中對(duì)所選擇的制劑進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)是基于US Pharmacopeia 26thedition，Method<87>及ISO 10993-5標(biāo)準(zhǔn)。
制劑D和E(見實(shí)施例4，表2)與完全細(xì)胞培養(yǎng)基(HAM F12培養(yǎng)基，10％的胎牛血清)以濃度10，2，0.4和0.08％(v/v)混合。用這些被試溶液來一式三份處理細(xì)胞培養(yǎng)物24小時(shí)。也包括一式三份未處理的培養(yǎng)物，陰性對(duì)照(用聚丙烯提取物處理)和陽性對(duì)照(用錫穩(wěn)定化的聚氯乙烯提取物處理)。
該兩種制劑在10％(v/v)時(shí)試驗(yàn)顯示無到輕微的毒性(細(xì)胞毒性級(jí)別0-1)，在2％，0.4％和0.08％(v/v)時(shí)顯示無毒性(細(xì)胞毒性級(jí)別0)。
用包含100ppm LL-37的PBS的陽性對(duì)照溶液進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，在所有被試的四個(gè)濃度(所述溶液與細(xì)胞培養(yǎng)基的10，2，0.4和0.08％的混合物)產(chǎn)生中等的毒性(細(xì)胞毒性級(jí)別2)。定義這個(gè)水平的毒性為20-50％的細(xì)胞死亡或顯示了毒性的形態(tài)學(xué)癥狀。等級(jí)范圍為0到4，當(dāng)對(duì)醫(yī)療設(shè)備的被試提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，級(jí)別3和4未通過實(shí)驗(yàn)。認(rèn)為此陽性對(duì)照溶液比顯示無或僅有輕微毒性的制劑D和E毒性高很多。
生物實(shí)驗(yàn)基于我們現(xiàn)在的發(fā)現(xiàn)-hCAP18/LL-37在與炎癥和傷口相關(guān)的皮膚和粘膜中被誘導(dǎo)，和-盡管炎癥范圍較廣(massive)，hCAP18/LL-37在慢性潰瘍上皮缺乏，我們假設(shè)hCAP18/LL-37與皮膚上皮的再生能力有關(guān)。為驗(yàn)證此假設(shè)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)1.研究在非炎性人傷口愈合中hCAP18/LL-37的表達(dá)類型組織樣本從常規(guī)腹部或乳房修復(fù)手術(shù)(reduction surgery)獲得人的皮膚。在無菌條件，用3-mm的活組織檢查鉆孔器(punch)在上皮側(cè)作全厚度(full-thickness)傷口。用6-mm活組織檢查鉆孔器切割這些活體外傷口，然后轉(zhuǎn)移到24-孔板并用2ml培養(yǎng)基覆蓋。這些傷口重復(fù)性地在4-7天內(nèi)再形成上皮(Kratz等Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg 28107-112，1994；Inoue等，J InvestDermatol 104479-483，1995；Kratz等，Microsc Res Tech 42345-350，1998)。每三天更換培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是包含10％胎牛血清(FCS)和抗生素(PEST＝青霉素50U/ml和鏈霉素50mg/ml)的DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，GIBCO)。在不同時(shí)間點(diǎn)，創(chuàng)傷后2，4和7天收獲并速凍傷口?？偣仓貜?fù)試驗(yàn)四次。利用四個(gè)不同的供者，并在每個(gè)試驗(yàn)對(duì)每種情況作一式三個(gè)傷口。每個(gè)試驗(yàn)只使用來自一個(gè)供者的皮膚。
制備RNA探針為檢測(cè)hCAP18基因的mRNA及對(duì)hCAP18/LL-37的免疫反應(yīng)性，我們對(duì)傷口樣本進(jìn)行了原位雜交和免疫組織化學(xué)，所述傷口樣本代表所有的時(shí)間點(diǎn)的順序上皮再形成。我們?cè)谠浑s交使用了35S-標(biāo)記的反義和有義的RNA探針，如(Frohm Nilsson等，Infect Immun 672561-2566，1999)所述進(jìn)行試驗(yàn)。
制備LL-37抗體為免疫組織化學(xué)，我們?nèi)缦庐a(chǎn)生并制備了多克隆LL-37抗體根據(jù)利用固相合成的Fmoc策略(Fields and Noble，1990)制備LL-37肽(批號(hào)YS 5253，EuroDiagnostica AB，Malm，Sweden)為三氟乙酸鹽，并用HPLC純化到純度為98％。在抗菌分析中確認(rèn)所述肽的生物活性。用標(biāo)準(zhǔn)方案將所述肽用于免疫三只兔子(AgriSera，Vnns，Sweden)。用合成的LL-37肽通過親合純化得到多克隆抗血清，并用ELISA估計(jì)純化的抗血清。免疫血清的IgG濃度被稀釋到0.5mg/ml。從每只兔子收集預(yù)免疫血清，IgG濃度是2mg/ml。
免疫組織化學(xué)速凍并等同處理所有的活組織檢查物。簡(jiǎn)言之，將6-7μm厚的冷凍切片與稀釋度1∶1000和1∶2000的LL-37抗體溫育，并用間接過氧化物酶法用Vectastain試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，USA)根據(jù)生產(chǎn)者說明來染色。用Mayer蘇木素溶液復(fù)染切片。所有實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)三次來確保可重復(fù)性。作為對(duì)照，不加入第一抗體，而用預(yù)免疫的兔IgG(DAKO，Glostrup，Denmark)作為第一抗體，來同步加工系列組織切片。
結(jié)果在0小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，有hCAP18mRNA的中度表達(dá)，并且整個(gè)組織中上皮基底層中的LL-37蛋白與我們以前發(fā)現(xiàn)的基層上皮中有hCAP18的組成型表達(dá)是一致的。上皮再形成中在不同時(shí)間點(diǎn)收獲的傷口顯示了hCAP18mRNA的獨(dú)特信號(hào)，并且上皮中的LL-37蛋白遷移來覆蓋受傷的表面。下面的真皮基質(zhì)中沒有細(xì)胞是hCAP18/LL-37陽性的。這些結(jié)果表明在無感染的上皮再形成中角質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)了hCAP18的再合成，也支持了我們關(guān)于hCAP18可與上皮再生有關(guān)的假設(shè)。
實(shí)驗(yàn)2.用LL-37抗體活體外抑制人皮膚傷口的上皮再形成。
將實(shí)驗(yàn)1中制備的LL-37抗體加入每孔2ml的培養(yǎng)基(DMEM，+10％FCS和PEST)至最終抗體稀釋度1∶10，1∶100和1∶1000。我們使用最終IgG濃度等于LL-37抗血清的1∶10稀釋度的對(duì)應(yīng)預(yù)免疫血清作為對(duì)照，并且一組傷口只用培養(yǎng)基處理。每種實(shí)驗(yàn)條件作一式三份并重復(fù)兩次。每三天更換培養(yǎng)基并如上述加入LL-37抗體或預(yù)免疫血清。創(chuàng)傷后2，4和7天收獲離體傷口。用蘇木素-伊紅染色前，所有樣本都速凍，完整切片并固定到Superfrost Plus玻片上。選擇代表在傷口中心的最大上皮再形成的切片來作評(píng)價(jià)。通過在代表所有治療條件的傷口上用增殖標(biāo)記物Ki67(小鼠單克隆Ki67抗血清(DAKO，Glostrup，Denmark)在1∶25的稀釋度)作免疫組織化學(xué)來研究角質(zhì)細(xì)胞的增殖能力。
結(jié)果用LL-37抗體處理產(chǎn)生上皮再形成的濃度-依賴性抑制。所有用最高的LL-37抗體濃度(1∶10)處理的傷口無上皮再形成。在這些傷口中只有單個(gè)帶有脆弱的扁平外觀的角質(zhì)細(xì)胞從每個(gè)傷口的邊緣遷移。用中等濃度(1∶100)的LL-37處理的傷口顯示了延遲的上皮再形成，這些傷口大多到第7天而不是到第4天愈合。并且上皮更薄以及角質(zhì)細(xì)胞外觀更脆弱。用最低濃度(1∶1000)的LL-37抗體處理的傷口與對(duì)照傷口無不同，它們到第4天都愈合了并有2-3層堅(jiān)固上皮。僅用中等和對(duì)照IgG抗體處理的對(duì)照傷口同等愈合。對(duì)照傷口中絕大部分在再上皮化性舌中的細(xì)胞為增殖標(biāo)記物Ki67陽性的，而在用LL-37以1∶10處理的傷口無Ki67陽性細(xì)胞。我們從此實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論LL-37可參與皮膚上皮再形成，并且增殖能力似乎優(yōu)選被影響，因?yàn)橛肔L-37抗體封閉會(huì)允許原來單個(gè)細(xì)胞從傷口邊緣的遷移，但會(huì)有效預(yù)防角質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。
實(shí)驗(yàn)3聯(lián)用合成型生物活性LL-37肽自身及極性脂質(zhì)載體處理HaCat細(xì)胞的增殖。
將HaCat細(xì)胞用于三個(gè)實(shí)驗(yàn)。HaCat細(xì)胞是無限增殖的人角質(zhì)細(xì)胞系(Boukamp等，J Cell Biol 106761-771，1988)，它適合試驗(yàn)角質(zhì)細(xì)胞的研究。在培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS和PEST)中培養(yǎng)HaCat細(xì)胞。兩種細(xì)胞培養(yǎng)物都用合成型生物活性LL-37(批號(hào)YS 5253)處理。另外，加入含2或10％血清的培養(yǎng)基中的LL-37(114μg/ml)與CPL-半乳糖酯(0.2％)混合物，來評(píng)估其提高增殖并抑制細(xì)胞毒性的能力。在不同時(shí)間點(diǎn)(24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)和96小時(shí))收獲細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)計(jì)數(shù)，再用錐蟲藍(lán)染色評(píng)價(jià)生存力。錐蟲藍(lán)陽性表示細(xì)胞膜已經(jīng)被破壞。也通過測(cè)定線粒體活性來確定增殖和生存力(WST-1，Roche，Cook等Anal Biochem 1791-7，1989)。
表6.用流式細(xì)胞儀估計(jì)在96小時(shí)的HaCat細(xì)胞增殖。

與基線(-EGF)相比計(jì)算細(xì)胞增殖增加。給出三個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)中一式三份樣本/條件的均值。
表7.通過線粒體活性(WST-1)測(cè)定HaCat細(xì)胞在48小時(shí)的增殖和生存力。

與基線(-EGF)相比計(jì)算細(xì)胞增殖增加。給出一個(gè)實(shí)驗(yàn)中6個(gè)樣本/條件的均值。
表8.用流式細(xì)胞儀估計(jì)在72小時(shí)的HaCat細(xì)胞增殖。

與基線(-EGF)相比計(jì)算增殖增加。給出一個(gè)實(shí)驗(yàn)中一式三份樣本/條件的均值。
結(jié)果用LL-37肽處理HaCat細(xì)胞導(dǎo)致增殖的濃度-依賴性方式增加。這表明LL-37肽具有刺激角質(zhì)細(xì)胞增殖到等于或超過EGF的增殖水平(上皮細(xì)胞增殖的金標(biāo)準(zhǔn))的能力。我們采用1.7nM的EGF，因?yàn)檫@已經(jīng)是刺激所培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞增殖的最適條件，并已經(jīng)是標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件(Cohen等，DevBiol12394-407，1965)。HaCat細(xì)胞是高度增殖的上皮細(xì)胞，有趣的是LL-37能更進(jìn)一步增加這些細(xì)胞的增殖。當(dāng)脂質(zhì)被加入混合物時(shí)，2％血清中的100μg/ml的LL-37誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用在被完全消除，這表明所述脂質(zhì)能夠在這個(gè)實(shí)驗(yàn)條件取代血清。
此實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示加入在含有10％胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中的HaCat細(xì)胞培養(yǎng)物的合成型生物活性LL-37(25-100μg/ml)使增殖以濃度-依賴性方式增加。然而如果將所述肽(100μg/ml)加入在包含2％FCS的培養(yǎng)基中的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，那么所有角質(zhì)細(xì)胞都變?yōu)殄F蟲藍(lán)染色陽性的，這表明對(duì)這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
血清的存在抑制了cathelicidin的細(xì)胞毒性活性，這機(jī)制被認(rèn)為保護(hù)宿主細(xì)胞不會(huì)受到潛在的有害作用。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)血清的存在(10％)抑制了LL-37的細(xì)胞毒性作用。另外，在包含較低血清濃度(2％FCS)的培養(yǎng)基中，LL-37(25μM)和極性脂質(zhì)載體(0.2％)的混合物抑制了細(xì)胞毒性作用并促進(jìn)了增殖。這些數(shù)據(jù)提示所述極性脂質(zhì)載體具有與血清類似的保護(hù)能力，不干擾LL-37的生物活性。
原始數(shù)據(jù)顯示人角質(zhì)細(xì)胞以與HaCat細(xì)胞相同的方式增殖。
實(shí)驗(yàn)4通過用合成肽LL-36，LL-37和LL-38處理來增殖HaCat細(xì)胞在培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS和PEST)中培養(yǎng)HaCat細(xì)胞。將HaCat細(xì)胞以每孔2000個(gè)細(xì)胞的濃度種于96孔板(Falcon，USA)。在-48小時(shí)用細(xì)胞鋪板，并用不同濃度的合成肽LL-37，LL-36和LL-38在第0小時(shí)并在第48小時(shí)后刺激細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中、每一種條件下，對(duì)6個(gè)孔來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將1Ci/mmol的3H-胸腺嘧啶(THYMIDINE，[METHYL-3H]-740.0GBq/mmol(20.00Ci/mmol)，1.0ml的乙醇∶水，7∶3，Perkin Elmer Life Sciences Inc.Boston MA.，USA)加到每個(gè)孔，并溫育12-17小時(shí)。72和96小時(shí)后通過3H-胸腺嘧啶摻入由液體閃爍計(jì)數(shù)器(liquid scintilator)來估計(jì)增殖(MicroBeta Perkin Elmer Life SciencesInc.Boston MA.，USA)。
表9.72和96小時(shí)后通過3H-胸腺嘧啶摻入來估計(jì)在96小時(shí)由于LL-37的HaCat細(xì)胞增殖。


與基線相比(對(duì)照＝0μg/ml)計(jì)算細(xì)胞增殖增加(增殖系數(shù))。給出一個(gè)實(shí)驗(yàn)中每種條件下的四個(gè)樣本的平均值。
表10.LL-36肽刺激的HaCat細(xì)胞。96小時(shí)后由3H-胸腺嘧啶摻入來評(píng)估增殖。

與基線相比(對(duì)照＝0μg/ml)計(jì)算細(xì)胞增殖增加(增殖系數(shù))。給出一個(gè)實(shí)驗(yàn)中每種條件下的四個(gè)樣本的平均值。
表11.LL-38肽刺激的HaCat細(xì)胞。96小時(shí)后由3H-胸腺嘧啶摻入來評(píng)估增殖。


與基線相比(對(duì)照＝0μg/ml)計(jì)算細(xì)胞增殖增加(增殖系數(shù))。給出一個(gè)實(shí)驗(yàn)中每種情況四個(gè)樣本的平均值。
實(shí)驗(yàn)5.用LL-37肽處理的人成纖維細(xì)胞的增殖本實(shí)驗(yàn)和如下實(shí)驗(yàn)所用的肽LL-37如實(shí)施例1(批號(hào)971/26)所述。成纖維細(xì)胞是一種基質(zhì)細(xì)胞，它得自患有由靜脈功能不全導(dǎo)致的慢性腿潰瘍患者的受傷和未受傷的皮膚。從傷口周邊取鉆孔-活組織檢查物(4-mm)，其包括50％上皮化的區(qū)域，并從膝蓋區(qū)域取未受傷的皮膚。排除有糖尿病，動(dòng)脈功能不全或慢性炎性病史的個(gè)體。也排除在潰瘍周邊有濕疹癥狀，有感染的臨床癥狀，或在活組織檢查時(shí)正進(jìn)行全身或局部抗生素治療的患者。用惰性的局部敷料和標(biāo)準(zhǔn)的壓迫繃帶來處理包括的患者。
用外植體技術(shù)(explant technique)(Hehenberger等，Cell BiochemFunct 15197-201，1997)將成纖維細(xì)胞置于培養(yǎng)物中。將成纖維細(xì)胞以每孔2000個(gè)細(xì)胞的濃度種于96孔板(Falcon，USA)。在-48小時(shí)種細(xì)胞，并用不同濃度的合成LL-37肽來刺激細(xì)胞指導(dǎo)第0小時(shí)。對(duì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)中、每種條件下的6個(gè)孔來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過24小時(shí)和48小時(shí)后測(cè)定線粒體活性(WST-1，Roche)來確定增殖和生存力。見下表12和表13。與基線(對(duì)照＝0μg/ml)相比計(jì)算細(xì)胞增殖增加(增殖系數(shù))?？梢娨粋€(gè)實(shí)驗(yàn)中每種條件下的六個(gè)樣本的均值。
表12.LL-37刺激的人傷口成纖維細(xì)胞。在第48小時(shí)由線粒體活性(WST-1)測(cè)定的人成纖維細(xì)胞的增殖和生存力。

表13.LL-37肽刺激的人正常成纖維細(xì)胞。在第48小時(shí)由線粒體活性(WST-1)測(cè)定的人成纖維細(xì)胞的增殖和生存力。

實(shí)驗(yàn)6.hCAP18在HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因表達(dá)及HEK293-hCAP18細(xì)胞的增殖包含hCAP18完整編碼序列的Image克隆3057931(ref)的Bfal片段，其包括5′-未翻譯區(qū)的16bp，該片段亞克隆到雙順反子(bycistronic)載體pIRES2-EGFP(BD Biosciences，Bedford，MA)的Smal-位點(diǎn)。人胚胎腎細(xì)胞HEK293用Fugene(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)在標(biāo)準(zhǔn)條件下轉(zhuǎn)染，并用400ng/ml G418 antibioticum (Invitrogen，Paisley，UK)選擇兩周。用MoFlo高速細(xì)胞分選流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(DakoCytomation，F(xiàn)ort Collins，CO)分選表達(dá)EGFP的細(xì)胞，使用SummitTM軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所述細(xì)胞的CAP18表達(dá)用免疫印跡來定量。通過用僅表達(dá)EGFP的載體轉(zhuǎn)染來類似建立對(duì)照細(xì)胞系。
為了增殖分析，70％滿底時(shí)收獲細(xì)胞并接種在24-孔板。24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，于2ml補(bǔ)充了5％FCS和PEST的培養(yǎng)基(OPTIMEM，Gibco BRL，Life Technologies，Scotland)中培養(yǎng)細(xì)胞。所有條件都一式三份進(jìn)行。每隔一天更換培養(yǎng)基。然后在第6天收獲細(xì)胞系并用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。用錐蟲藍(lán)測(cè)定細(xì)胞生存力；在所有條件下＜5％的細(xì)胞為錐蟲藍(lán)陽性的。與基線(HEK293-EGFP)相比來計(jì)算細(xì)胞增殖的增加(增殖系數(shù))。可見一個(gè)實(shí)驗(yàn)中每種條件下的一式三份樣本的平均值。
表14.用流式細(xì)胞儀估計(jì)的HEK293-hCAP-18細(xì)胞在144小時(shí)的增殖。

所述HEK293-hCAP18細(xì)胞的增殖也用3H-胸腺嘧啶摻入來評(píng)估，所得結(jié)果見下表15。與基線(HEK293-EGFP)相比來計(jì)算細(xì)胞增殖增加(增殖系數(shù))。可見一個(gè)實(shí)驗(yàn)中每種條件下的四個(gè)樣本的平均值。
表15.96小時(shí)后用3H-胸腺嘧啶摻入來評(píng)估HEK293-hCAP-18細(xì)胞在144小時(shí)的增殖。

實(shí)驗(yàn)7.在不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于移植的人細(xì)胞培養(yǎng)上皮細(xì)胞從患者的健康皮膚切割1×1cm的一片皮膚。切碎該皮膚并用胰蛋白酶/EDTA(0.05/0.01％)處理，而且將2-5×106的募集的(recruited)角質(zhì)細(xì)胞加入在75cm2培養(yǎng)燒瓶中的1.5×106絲裂霉素-預(yù)處理的(4μg/ml，2小時(shí))3T3細(xì)胞。加入包含LL-37肽的生長(zhǎng)培養(yǎng)基A。通過胰酶消化收獲薄片狀細(xì)胞并移植到患者。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基A用于上皮細(xì)胞如例如角質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，它由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和促進(jìn)生長(zhǎng)的試劑盒(GPK)組成，其包括a)鹽溶液中的LL-37肽，b)青霉素+鏈霉素，c)胰島素，d)轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring)，e)三碘甲腺原氨酸(triiodotyronine)，f)氫化可的松，g)霍亂毒素和選出的細(xì)胞毒性降低制劑，如血清或極性脂質(zhì)。
基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞得自4mm的皮膚活組織檢查物，清理皮下組織，并用外植技術(shù)種于細(xì)胞培養(yǎng)皿來獲得原代成纖維細(xì)胞。生長(zhǎng)培養(yǎng)基B用于活組織檢查物的培養(yǎng)。用胰酶消化收獲細(xì)胞并送回患者。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基B用于基質(zhì)細(xì)胞如例如成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)，它由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和促進(jìn)生長(zhǎng)的試劑盒組成，其包括a)鹽溶液中的LL-37肽，b)青霉素+鏈霉素和選出的細(xì)胞毒性降低制劑，如血清或極性脂質(zhì)。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基是基于包含無機(jī)鹽，酚紅，葡萄糖，胸腺嘧啶，次黃嘌呤，HEPES，丙酮酸鈉，氨基喋呤，氨基酸和維生素的重蒸餾水。
實(shí)驗(yàn)總結(jié)總言之，已經(jīng)闡述了正常傷口愈合過程中皮膚上皮中產(chǎn)生LL-37，并且出現(xiàn)上皮再形成需要LL-37。已經(jīng)顯示慢性潰瘍上皮缺乏內(nèi)源性LL-37。因此我們認(rèn)為，利用LL-37、以及所述肽的N-末端片段、及其功能性衍生物的治療，提供了促進(jìn)所述潰瘍愈合的合理策略。另外加入LL-37和hCAP18/LL-37的轉(zhuǎn)基因表達(dá)也刺激健康皮膚的增殖，這表明LL-37可用來增強(qiáng)正常和有缺陷上皮的體內(nèi)修復(fù)以及上皮細(xì)胞的體外增殖使其用于自體細(xì)胞移植。我們也鑒定了合適的載體和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其降低細(xì)胞毒性并具有保護(hù)LL-37及其它c(diǎn)athelicidin肽不在體內(nèi)被迅速降解的潛力。
序列表<110>利波佩普泰德公司(Lipopeptide AB)<120>CATHELICIDIN LL-37及其衍生物在傷口愈合中的用途<130>52144<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>肽<222>(1)..(37)<223>LL-37<400>1Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu Ser35<210>2<211>36<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(36)<223>LL-36<400>2Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu35<210>3<211>35<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽
<222>(1)..(35)<223>LL-35<400>3Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr35<210>4<211>34<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(34)<223>LL-34<400>4Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg<210>5<211>33<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(33)<223>LL-33<400>5Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro<210>6
<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(32)<223>LL-32<400>6Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(31)<223>LL-31<400>7Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu20 25 30<210>8<211>30<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(30)<223>LL-30<400>8Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn20 25 30<210>9<211>29<212>PRT
<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(29)<223>LL-29<400>9Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg20 25<210>10<211>28<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(28)<223>LL-28<400>10Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu20 25<210>11<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(27)<223>LL-27<400>11Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe20 25<210>12<211>26<212>PRT<213>人工的
<220>
<221>肽<222>(1)..(26)<223>LL-26<400>12Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp20 25<210>13<211>25<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(25)<223>LL-25<400>13Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu15 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys20 25<210>14<211>24<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(24)<223>LL-24<400>14Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile20<210>15<211>23<212>PRT<213>人工的
<220>
<221>肽<222>(1)..(23)<223>LL-23<400>15Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg20<210>16<211>22<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(22)<223>LL-22<400>16Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln20<210>17<211>21<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(21)<223>LL-21<400>17Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val20<210>18<211>20<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)<223>LL-20<400>18Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile20<210>19<211>38<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(38)<223>LL-38<400>19Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu Ser Ser35<210>20<211>36<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>cDNA<222>(1)..(536)<223>hCAP18基因插入pIRES2-EGFP載體的部分的cDNA序列<400>20tagagggagg cagacatggg gaccatgaag acccaaaggg atggccactc cctggggcgg 60tggtcactgg tgctcctgct gctgggcctg gtgatgcctc tggccatcat tgcccaggtc120ctcagctaca aggaagctgt gcttcgtgct atagatggca tcaaccagcg gtcctcggat180gctaacctct accgcctcct ggacctggac cccaggccca cgatggatgg ggacccagac240acgccaaagc ctgtgagctt cacagtgaag gagacagtgt gccccaggac gacacagcag300tcaccagagg attgtgactt caagaaggac gggctggtga agcggtgtat ggggacagtg360accctcaacc aggccagggg ctcctttgac atcagttgtg ataaggataa caagagattt420gccctgctgg gtgatttctt ccggaaatct aaagagaaga ttggcaaaga gtttaaaaga480
attgtccaga gaatcaagga ttttttgcgg aatcttgtac ccaggacaga gtccta53權(quán)利要求
1.肽和它的可藥用鹽及其衍生物，所述肽具有LL-37的SEQ ID NO1的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列，前提是所述肽不包括LL-37。
2.權(quán)利要求1的肽，其中LL-37序列SEQ ID NO1的C-末端已添加了1-3個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求1的肽，其選自LL-36，LL-35，LL-34，LL-33，LL-32，LL-31，LL-30，LL-29，LL-28，LL-27，LL-26，LL-25，LL-24，LL-23，LL-22，LL-21或LL-20，上述肽分別具有序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17或SEQ ID NO18。
4.權(quán)利要求1-3任一的肽，其用作藥物。
5.權(quán)利要求1-3任一的肽在制備促使傷口愈合、細(xì)胞增殖、上皮再生并用作抗微生物劑的藥物中的用途。
6.肽及它的可藥用鹽及其衍生物在制備用于使上皮再生及上皮和基質(zhì)傷口愈合的藥物中的用途，所述肽具有選自以下序列之一的氨基酸序列a)SEQ ID NO1；b)包含SEQ ID NO1的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列；其中該肽通過非裂解機(jī)制來增強(qiáng)上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞的增殖。
7.權(quán)利要求6的用途，所述肽為呈乙酸鹽形式的LL-37，SEQ ID NO1。
8.權(quán)利要求6的用途，所述肽選自LL-36，LL-35，LL-34，LL-33，LL-32，LL-31，LL-30，LL-29，LL-28，LL-27，LL-26，LL-25，LL-24，LL-23，LL-22，LL-21或LL-20，上述肽分別具有序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17或SEQ ID NO18。
9.權(quán)利要求6-8任一的肽用途，該用途是制備用于治療由于靜脈功能不全，代謝功能異常，或免疫調(diào)節(jié)異常造成的慢性潰瘍的藥物。
10.權(quán)利要求6-8任一的肽用途，該用途是制備用于治療由于外傷或燒傷導(dǎo)致的傷口的藥物。
11.藥物組合物，其包含呈可藥用鹽或其衍生物形式的抗微生物cathelicidin肽，以及由成雙層性極性脂質(zhì)和水溶液組成的載體。
12.藥物組合物，其包含呈可藥用鹽或其衍生物形式的肽與由成雙層性極性脂質(zhì)和水溶液組成的載體，其中所述肽具有選自以下序列之一的氨基酸序列a)SEQ ID NO1；b)包含SEQ ID NO1的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列。
13.權(quán)利要求11或12的藥物組合物，其中所述成雙層性極性脂質(zhì)選自磷脂，半乳糖脂或鞘脂。
14.權(quán)利要求11-13任一的藥物組合物，其中所述肽為乙酸鹽形式。
15.權(quán)利要求11-14任一的藥物組合物，其中所述成雙層性極性脂質(zhì)包含至少50％(w/w)的雙半乳糖基甘油二酯。
16.權(quán)利要求12-15任一的藥物組合物，其中所述肽為乙酸鹽形式的LL-37。
17.權(quán)利要求11-16任一的藥物組合物，其包含LL-37的乙酸鹽與CPL-半乳糖酯的復(fù)合物。
18.權(quán)利要求11-17任一的藥物組合物，其中成鹽的肽和半乳糖脂載體的重量比為1∶10-1∶50。
19.肽在通過非裂解機(jī)制而在體外增強(qiáng)上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞增殖中的用途，所述肽具有選自以下序列之一的氨基酸序列a)SEQ ID NO1；b)包含SEQ ID NO1的N-末端片段的至少20個(gè)氨基酸的序列；其中所述肽呈可藥用鹽或其衍生物的形式。
20.權(quán)利要求19的用途，該用途是使人的自體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在體外增殖。
21.培養(yǎng)上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其包含LL-37或權(quán)利要求1-3任一所述的肽與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組合。
22.培養(yǎng)上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其包含LL-37或權(quán)利要求1-3任一所述的肽與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的成雙層性極性脂質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的培養(yǎng)基，其中所述極性脂質(zhì)選自磷脂，半乳糖脂或鞘脂。
24.增強(qiáng)人的自體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的體外擴(kuò)展用于體內(nèi)細(xì)胞移植的方法，其中所述細(xì)胞分離自健康皮膚的切割片，所分離的細(xì)胞在權(quán)利要求21-23任一的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在體外培養(yǎng)，之后收獲所培養(yǎng)的細(xì)胞并用于傷口如燒傷損傷和潰瘍的治療。
25.培養(yǎng)上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含LL-37或權(quán)利要求1-3任一所述的肽及可降低細(xì)胞毒性的成雙層性極性脂質(zhì)，并可選包含抗生素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基，及其它常用添加物。
26.包含hCAP18的cDNA序列SEQ ID NO20的基因構(gòu)建體的用途，所述用途是為了進(jìn)行上皮細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因表達(dá)來增強(qiáng)所述細(xì)胞的增殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗微生物的cathelicidin肽LL－37，LL－37的N－末端片段，或在C－末端具有1－3個(gè)氨基酸的LL－37的延伸序列的用途，所述用途用于刺激上皮和基質(zhì)細(xì)胞的增殖，從而使傷口如慢性潰瘍愈合。通過在藥物組合物及包含LL－37的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中包括成雙層性極性脂質(zhì)，具體為雙半乳糖基甘油二酯，可降低LL－37的細(xì)胞毒性作用。
文檔編號(hào)A61K47/44GK1744913SQ200480003209
公開日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2004年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月29日
發(fā)明者莫娜·斯塔爾-巴克達(dá)爾, 約翰·海爾博恩, 安德斯·卡爾森, 康尼·博根托夫特 申請(qǐng)人:利波佩普泰德公司