專利名稱：一種含多種病毒抗原表位的禽多價(jià)核酸疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種含多種病毒抗原表位的禽多價(jià)核酸疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的疫苗是以減毒或滅活的病原微生物作為免疫原，接種動(dòng)物體內(nèi)引起免疫反應(yīng)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，把病原體的基因片段導(dǎo)入作為載體的非致病性微生物，再進(jìn)行免疫動(dòng)物。近年來，隨著生物安全和食品安全在現(xiàn)代社會(huì)日益重要，由于減毒疫苗存在因病毒返祖或變異產(chǎn)生強(qiáng)毒株的潛在可能，而滅活疫苗則由于免疫原性差而需要大劑量和添加佐劑。特別是疫苗誘導(dǎo)的是一種特異性免疫應(yīng)答，所以，一種疫苗只能預(yù)防一種相應(yīng)的病原。為了預(yù)防傳染病，家畜禽在短時(shí)間內(nèi)必須接種多種疫苗。由于疫苗劑型和種類不同，必須多次接種。由此產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)等，影響畜禽生產(chǎn)性能，如生長(zhǎng)速度、產(chǎn)蛋等。
免疫學(xué)研究表明，盡管病原體存在多種抗原，但是其中具有誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答功能，使動(dòng)物獲得免疫力的抗原只是極少數(shù)，這類抗原被稱作保護(hù)性抗原。重要的是在一個(gè)保護(hù)性抗原分子中，存在多個(gè)抗原表位，即由5至7個(gè)氨基酸序列組成的多肽；其中只有個(gè)別抗原表位具有作用，它們被稱作保護(hù)性抗原表位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服減毒疫苗因變異、返祖的潛在毒力增強(qiáng)的危險(xiǎn)、滅活疫苗的免疫原性差和一種疫苗只預(yù)防一種疫病的缺點(diǎn)，提供一種安全、高效，且只進(jìn)行一次免疫，就能使動(dòng)物同時(shí)獲得抗多種病毒的特異性免疫能力的疫苗的含多種病毒抗原表位的禽多價(jià)核酸疫苗制備方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)措施和步驟實(shí)現(xiàn)的；一種含多種病毒抗原表位的禽多價(jià)核酸疫苗制備方法，包括針對(duì)新城疫、禽流感和法氏囊炎等多種病毒的單克隆抗體的制備和該多種病毒保護(hù)性抗原表位核苷酸序列的確定和構(gòu)建重組真核質(zhì)粒，其特征在于對(duì)上述多種病毒的單克隆抗體應(yīng)用噬菌展示技術(shù)確定編碼該多種病毒保護(hù)性抗原表位的核苷酸序列，最后用特定引物經(jīng)PCR獲得連接它們的核苷酸鏈并插入真核表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)。與現(xiàn)有的疫苗相比較，本發(fā)明制備的多價(jià)抗原表位的核酸疫苗。具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.一次免疫接種可特異性預(yù)防多種病原。如新城疫、禽流感、法氏囊炎等多種病毒。
2.由于核酸疫苗不存在病原返祖和變異的可能，所以安全可靠。
3.由于接種的是特定的多種抗原表位，動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答也只是針對(duì)該特定的多個(gè)特異抗原表位，所以，與滅活疫苗相比，動(dòng)物的免疫應(yīng)答產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)較小，有利于動(dòng)物生產(chǎn)性能的維持。


圖1為本發(fā)明的引物示意圖；圖2為本發(fā)明PCR擴(kuò)增合成的含編碼3種病毒保護(hù)性抗原表位基因片段和連接臂的示意圖；圖3為本發(fā)明所用的pcDNA3真核表達(dá)質(zhì)粒示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1。制備含新城疫、禽流感和法氏囊炎三種病毒抗原表位的禽多價(jià)核酸疫苗。
1，制備針對(duì)新城疫、禽流感和法氏囊炎三種病毒保護(hù)性抗原的單克隆抗體。
1)病毒的復(fù)制與純化分別接種新城疫、法氏囊炎和禽流感病毒0.2mL于9～10日齡的SPF雞胚絨毛尿囊腔內(nèi)，37℃孵育，去除24h內(nèi)死亡的雞胚，取死亡雞胚立即置于4℃過夜，無菌收取尿囊液。反復(fù)凍融尿囊液3次，分別經(jīng)3000rpm、5000rpm、8000rpm各離心30min，上清經(jīng)100000g離心2h，用少量TEN緩沖液將病毒沉淀懸浮，再用20～60％，梯度為20％的蔗糖溶液經(jīng)密度梯度法進(jìn)一步純化，即將前一步初步純化的病毒液加于蔗糖梯度上，經(jīng)100000g離心8h，收集40～60％梯度層內(nèi)的病毒帶，用pH7.4 0.01mol/1PBS透析48h，小量分裝，于-20℃凍存?zhèn)溆?。獲取純化蛋白抗原，其蛋白質(zhì)濃度不低于1mg/mL，在聚丙烯酰鞍凝膠電泳圖譜少于兩條區(qū)帶。
2)免疫小鼠取6～8周齡雌性Balb/C小鼠6只，初次免疫皮下注射約100～200μg/只(按體積比1/1的比例與弗氏完全佐劑)，15天后以同樣劑量皮下注射NDV(按體積比1/1的比例與弗氏不完全佐劑)，21天后以同樣劑量(不加佐劑)尾靜脈加強(qiáng)免疫。
3)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備使SP2/0細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，輕輕吹打使之懸浮、分散成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)1000rpm離心5min，再用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸洗滌3次，活細(xì)胞95％以上，取約2×107～5×107用于細(xì)胞融合。
4)免疫脾細(xì)胞的準(zhǔn)備于加強(qiáng)免疫后3天，取鼠眼球放血致死，無菌取脾，將脾臟移入含1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的平皿中，剪碎、研磨，經(jīng)200目尼龍篩過濾，過濾液經(jīng)小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離得脾細(xì)胞，然后用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌3次，制成單細(xì)胞懸液，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，約1×108～2×108用于細(xì)胞融合。
5)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備于融合前2天取小鼠一只，眼球放血致死，浸泡于75％乙醇5min，取出后置無菌操作臺(tái)，用一次性注射器吸取10mL 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，注入腹腔，注射器置于肝上，輕輕按壓腹腔3～5次，重新吸出注入的液體，用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌3次，計(jì)數(shù)，用含15％犢牛血清的HAT培養(yǎng)基稀釋至1×105～2×105個(gè)細(xì)胞/mL，每孔0.1mL接種于96孔微量培養(yǎng)板。
6)細(xì)胞融合與克隆以3∶1的比例將脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合于50mL刻度離心管，用20～30m LRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌2次，用手掌輕擊管底，使沉淀細(xì)胞松散的基礎(chǔ)培養(yǎng)基滴加到融合管中，先慢后快，5min內(nèi)加完，邊加邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，37℃靜置10min，1000rpm離心5min，棄上清，加入50賓mL HAT培養(yǎng)基，每孔0.1mL接種于培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔微量培養(yǎng)板，置37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用新鮮的HAT培養(yǎng)基換出組織培養(yǎng)板孔中1/2培養(yǎng)基，10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其分布至孔底面積1/10以上時(shí)，吸出上清液作抗體檢測(cè)。
7)陽性細(xì)胞株的篩選(間接ELISA)取聚苯乙烯平底微孔板，用包被緩沖液將經(jīng)梯度離心純化所得的抗原稀釋至最適濃度，每孔100μL，振蕩器振勻，4℃過夜；將板孔內(nèi)液體甩掉，用洗滌液洗滌3次，甩干；每孔加待檢雜交瘤上清100μL，37℃溫箱孵育30min，同前洗滌；每孔加100μL 1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37℃溫箱孵育30min，同前洗滌；每孔加OPD底物100μL，室溫避光靜置15min；每孔加終止液100μL，輕輕振搖；酶標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)OD492值，S/N≥2.5者判為陽性。
8)針對(duì)保護(hù)性抗原的單克隆抗體的確定經(jīng)過雞胚成纖維細(xì)胞的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)初步篩選和2周齡SPF雛雞的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)確定針對(duì)三種病毒的保護(hù)性單克隆抗體。
2.用噬菌展示技術(shù)確定編碼新城疫、法氏囊炎和禽流感病毒保護(hù)性抗原表位的核苷酸序列。
1)擴(kuò)增肽庫肽庫(噬菌體表面蛋白展示的7肽庫(肽庫的滴度2.8×1014pfu/ml，隨機(jī)多樣性2.7×109)，New England Biolabs公司)80μL預(yù)先接種200μLER2738感染5min，加入40ml低鹽LB培養(yǎng)基中，37□ 200rpm振搖4.5小時(shí)；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml離心管中，4□ 6800rpm 15min離心；上清吸入另一個(gè)大離心管中，加入3.4mlPEG/NaCl沉淀4□過夜；4□ 6800rpm 15min離心，棄上清；用1mL TBS溶沉淀，轉(zhuǎn)到1.5ml離心管，離心1分鐘，4500rpm，吸取上清；上清加入1/6體積PEG/NaCl(167ul)，-20□沉淀5min，冰上沉淀最多30min，4□12000rpm離心12min；沉淀溶于TBS(含0.02％NaN3)。
2)包被用包被液配制成100ug/ml的抗體溶液；用75％酒精浸泡聚苯乙烯板后，再用包被液洗板，加入包被的靶蛋白溶液，每孔100μL。對(duì)照孔不包被。4C濕盒包被過夜。
3)封閉吸盡包被液，加封閉液300ul/孔，室溫放置1小時(shí)；吸盡封閉液，用0.1％TBS-T(TBS+0.1％(V/V)Tween-20)洗6次。
4)生物淘篩取擴(kuò)增的噬菌體7肽庫5ul，加95μL 0.1％ TBS-T，放置30min。倒出未結(jié)合的噬菌體，吸盡或排去殘液，用0.1％ TBS-T每孔洗6遍，吸盡殘液，每孔加入(0.2M甘氨酸-HCl，pH2.2，1mg/ml BSA)100μL，室溫輕搖9min30s。立即用移液槍吸出洗脫液移至已經(jīng)預(yù)先加入15μL 1M Tris-HCl pH9.1的離心管中，混勻。
5)擴(kuò)增洗脫的噬菌體洗脫的噬菌體80ul加入20ml低鹽LB培養(yǎng)基中，加入500ul ER2738菌(E.Coli ER2738的基因型為F□lacq□(lacZ)M15 proA+B+zzf∷Tn10(TetR)/fhuA2 supE thi□(lac-proAB)□(hsdMS-mcrB)5(rk-mk-McrBC-))。37℃200rpm振搖4.5小時(shí)。重復(fù)1)擴(kuò)增庫肽。
6)噬菌體克隆和抗體的ELISA分析以100μg/ml濃度的抗體包被ELISA板，4□過夜，加入10％脫脂奶粉或5％BSA室溫封閉1小時(shí)。加入滴度為1012pfu/L的噬菌體克隆，室溫結(jié)合1小時(shí)。用PBS-T(0.1％Tween-20)洗滌后，加入抗M13的單抗(1∶2000)室溫孵育60min。再用PBS-T洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫孵育60min。PBS-T洗滌后，加入底物TMB，避光反應(yīng)10min，加入終止液(1mol/LH2SO4)，于波長(zhǎng)450nm測(cè)定光吸收A值。
7)噬菌體單鏈DNA的制備將ER2738按1∶100接種于低鹽LB培養(yǎng)基中，挑取噬菌斑加入其中，于37□振搖培養(yǎng)4.5小時(shí)，以10000rpm離心10min。取上清，加入200μL PEG/NaCl，混勻，室溫放置10min。再以10000rpm離心10min。棄上清，用碘緩沖液充分重懸沉淀，加入無水乙醇室溫放置10min。再以10000rpm離心10min。棄上清，用70％乙醇清洗，室溫放置10min后，用30ulTE溶解沉淀，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并測(cè)序。
3.構(gòu)建含3種抗原表位核苷酸序列的重組真核質(zhì)粒并用特定引物經(jīng)PCR獲得連接它們的核苷酸鏈并插入真核表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)。
1)引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)3對(duì)引物P1/P2；P3/P4和P5/P6(見圖1)P1從5’端起，含保護(hù)堿基、HindIII酶切位點(diǎn)和編碼新城疫病毒保護(hù)性抗原核苷酸序列的起始區(qū)；P2的3’和5’端分別含編碼新城疫病毒和法氏囊炎病毒保護(hù)性抗原核苷酸序列的終止區(qū)和起始區(qū)，其間有連接臂堿基組成P3的5’和3’端分別含編碼新城疫病毒和法氏囊炎病毒保護(hù)性抗原核苷酸序列的終止區(qū)和起始區(qū)，其間有連接臂堿基組成P4的3’和5’端分別含編碼法氏囊炎病毒和禽流感病毒保護(hù)性抗原核苷酸序列的終止區(qū)和起始區(qū)，其間有連接臂堿基組成；P5的5’和3’端分別含編碼法氏囊炎病毒和禽流感病毒保護(hù)性抗原核苷酸序列的終止區(qū)和起始區(qū)，其間有連接臂堿基組成；P6的3’和5’端含保護(hù)堿基、BamHI酶切位點(diǎn)和禽流感病毒保護(hù)性抗原核苷酸序列的終止區(qū)。
2)第一次PCR擴(kuò)增3種病毒特異性保護(hù)性抗原核苷酸片段分別以3種病毒的cDNA為模板與相應(yīng)的3對(duì)引物(P1/P2；P3/P4和P5/P6)擴(kuò)增出編碼3種病毒特異性保護(hù)性抗原的核苷酸片段。
3)第二次PCR擴(kuò)增1條含3種病毒特異性保護(hù)性抗原核苷酸片段以P1/P6為引物和上述3種PCR產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增獲得連接編碼3種病毒特異性保護(hù)性抗原的核苷酸片段(見圖2)。
4)定向插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3以3∶1摩爾比加入經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切的第二次擴(kuò)增產(chǎn)物與pcDNA3(見圖3)的回收產(chǎn)物，用于兩者的連接；分別加入適量的T4連接酶及相應(yīng)的緩沖液，16℃下連接過夜。制得的多價(jià)核酸疫苗的重組真核表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)，含有編碼上述3種病毒特異性抗原表位基因片段21均為21個(gè)核苷酸，不同片段之間由9個(gè)核苷酸的連接臂序列相連。
5)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化取感受態(tài)細(xì)胞，放置冰浴內(nèi)10min，加入7.5μL連接產(chǎn)物，繼續(xù)冰浴30min，42℃水浴熱沖擊90s，迅速冰浴2min，每管加入900μL培養(yǎng)基，37℃，160rpm，振蕩培養(yǎng)45min，5000rpm離心3min，棄去上清，將剩余的轉(zhuǎn)化菌菌液涂布于含60μg/mL Amp的固體LB瓊脂板上，37℃培養(yǎng)12～16h，至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。
權(quán)利要求
1.一種含多種病毒抗原表位的禽多價(jià)核酸疫苗制備方法，包括針對(duì)新城疫、禽流感和法氏囊炎等多種病毒的單克隆抗體的制備和該多種病毒保護(hù)性抗原表位核苷酸序列的確定和構(gòu)建重組真核質(zhì)粒，其特征在于對(duì)上述多種病毒的單克隆抗體應(yīng)用噬菌展示技術(shù)確定編碼該多種病毒保護(hù)性抗原表位的核苷酸序列，最后用特定引物經(jīng)PCR獲得連接它們的核苷酸鏈并插入真核表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多價(jià)禽核酸疫苗制備方法，其特征在于所述的多種病毒的單克隆抗體應(yīng)用噬菌展示技術(shù)確定編碼該多種病毒保護(hù)性抗原表位的核苷酸序列，每個(gè)序列片段由21個(gè)核苷酸組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多價(jià)禽核酸疫苗制備方法，其特征在于所述的特定引物為P1/P2、P3/P4和P5/P6，多種病毒抗原表位基因片段的連接通過上述多對(duì)特定引物先分別PCR擴(kuò)增，再經(jīng)P1/P6PCR擴(kuò)增；其中引物P1和P6含有不同酶切位點(diǎn)、起始區(qū)(P1)和終止區(qū)(P6)序列，P2、P4和P3、P5分別含有3種病毒保護(hù)性抗原表位基因終止區(qū)、起始區(qū)序列和起始區(qū)和終止區(qū)序列，之間有連接臂序列。
全文摘要
一種含多種病毒抗原表位的禽多價(jià)核酸疫苗制備方法，屬疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。其所要解決的技術(shù)問題是提供一種安全、高效，且只進(jìn)行一次免疫，就能使動(dòng)物同時(shí)獲得抗多種病毒的特異性免疫能力的疫苗的制備方法。其技術(shù)要點(diǎn)分離獲得多種病毒毒株，提取其蛋白抗原，用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備和克隆相應(yīng)特異性抗體，經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定獲得保護(hù)性單克隆抗體。經(jīng)噬菌體展示技術(shù)篩選并測(cè)定與相應(yīng)抗體結(jié)合的病毒保護(hù)性抗原表位和編碼抗原表位的核苷酸序列；經(jīng)過分子操作將編碼多種病毒保護(hù)性抗原表位的核苷酸片段插入真核表達(dá)質(zhì)粒。該重組真核表達(dá)載體于雞體內(nèi)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)該多種病毒抗原的特異性免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫保護(hù)的作用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1640494SQ20041009459
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者余為一, 仲大蓮, 李槿年 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)