專利名稱：水溶性陰離子型細(xì)菌葉綠素衍生物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的水溶性陰離子型細(xì)菌葉綠素衍生物，其制備方法，及其在體內(nèi)光動(dòng)力治療以及診斷腫瘤和不同血管疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration)、以及體內(nèi)和體外殺死病毒和微生物的方法中的用途。
定義和縮寫AMD年齡相關(guān)性黃斑變性；Bchl細(xì)菌葉綠素a，即五環(huán)7，8，17，18-四氫卟啉，其具有第五同素環(huán)(5thisoayclic ring)，中心Mg原子，在173位的葉綠基或者香葉基香葉基，在132位的COOCH3基團(tuán)，在132位的H原子，在2、7、12、18位的甲基，在3位的乙?；?，和在8位的乙基；Bphe細(xì)菌脫鎂葉綠素a(其中中心Mg被兩個(gè)H原子替代的Bchl)；Bpheid細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(衍生自BPhe的C-172-游離羧酸)；Pd-BpheidPd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a；PDT光動(dòng)力治療；玫紅細(xì)菌卟吩(Rhodobacteriochlorin)四環(huán)7，8，17，18-四氫卟啉，其在17位具有-CH2CH2COOH基團(tuán)，在13位具有-COOH，在2、7、12、8位具有甲基，在3和8位具有乙基。
在說明書全文中使用了細(xì)菌葉綠素衍生物的IUPAC編號(hào)規(guī)則。使用這一命名法，天然細(xì)菌葉綠素在132和172位帶有兩個(gè)羧酸酯，然而他們?cè)?33和173位被酯化。
背景技術(shù)：
光動(dòng)力治療(PDT)是腫瘤的非手術(shù)治療方法，其中將無毒藥物與無危險(xiǎn)的光敏照射組合使用，原位產(chǎn)生細(xì)胞毒活性氧物質(zhì)。這一技術(shù)比通常所用的腫瘤化療和放療技術(shù)的選擇性更高。迄今為止，在臨床中已經(jīng)使用卟啉作為主要的光敏劑。然而當(dāng)前敏化劑的幾個(gè)缺點(diǎn)限制了他們的應(yīng)用，所述缺點(diǎn)主要包括(1)在可見光譜區(qū)內(nèi)相對(duì)弱的吸收使治療局限于較淺的腫瘤；(2)敏化劑在患者皮膚的蓄積和長(zhǎng)期滯留，導(dǎo)致長(zhǎng)期(數(shù)天到數(shù)月)的皮膚光毒性；和(3)PDT對(duì)被照射腫瘤和非腫瘤組織的作用的差別很小或沒有差別。當(dāng)前藥物的缺點(diǎn)引發(fā)了對(duì)尋找長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收第二代敏化劑的廣泛研究，第二代敏化劑在腫瘤細(xì)胞的滯留和其在皮膚或其它正常組織的滯留之間具有更好的差異。
為了實(shí)現(xiàn)卟啉藥物在治療學(xué)和診斷學(xué)中性能的最優(yōu)化，已經(jīng)提出了幾種卟啉衍生物，例如其中具有與四吡咯環(huán)絡(luò)合的中心金屬原子(不同于Mg)，和/或吡咯環(huán)的周圍取代基經(jīng)過修飾和/或大環(huán)被二氫化成為葉綠素衍生物(二氫卟酚)或被四氫化成為細(xì)菌葉綠素衍生物(菌綠素)。
由于它們?cè)谟欣庾V區(qū)(650-850nm)的強(qiáng)吸收及其在處理后的易于降解，已經(jīng)確定葉綠素和細(xì)菌葉綠素衍生物是腫瘤PDT的優(yōu)異敏化劑，并具有與卟啉相媲美的出眾性質(zhì)，但是他們不易獲得并且較難處理。
細(xì)菌葉綠素與葉綠素相比具有潛在的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗麄儽热~綠素衍生物表現(xiàn)強(qiáng)的近紅外波段，即處在相當(dāng)長(zhǎng)的波長(zhǎng)處的波段。
天然的細(xì)菌葉綠素(Bchl)的光譜學(xué)、光物理學(xué)、和光化學(xué)使得他們成為最佳的光捕獲分子，與PDT目前所用的其它敏化劑相比明顯的有優(yōu)點(diǎn)。特別是，這些分子在長(zhǎng)波長(zhǎng)處具有非常高的消光系數(shù)(λmax＝760-780nm，ε＝(4-10)×104M-1cm-1)，這些波長(zhǎng)的光透過深入到組織內(nèi)。他們?cè)诟吡孔訄?chǎng)(依靠中心金屬)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(ROS)。
在正常的遞送條件下，即，在室溫和正常的光條件和氧的存在下，BChl部分與例如血卟啉衍生物(HPD)相比是不穩(wěn)定的并多少具較低的三線態(tài)形成所需的量子場(chǎng)。然而，由于他們可能引發(fā)生物氧化還原反應(yīng)、光譜特性有利及其在體內(nèi)易降解，使得細(xì)菌葉綠素具有優(yōu)于例如卟啉和葉綠素化合物的潛在的優(yōu)越性，用于PDT治療和診斷，殺死樣品和活組織內(nèi)的細(xì)胞、病毒和細(xì)菌。預(yù)計(jì)細(xì)菌葉綠素的化學(xué)修飾可進(jìn)一步改善它們的性質(zhì)，但是這受到了缺乏制備這種改良細(xì)菌葉綠素的適當(dāng)方法的約束。
已經(jīng)研究了不含金屬的Bchl衍生物的生物攝取和PDT效力，目的是控制敏化劑與腫瘤細(xì)胞區(qū)室的親合力。這一方法主要是利用高親脂性藥物，其可增加藥物在腫瘤細(xì)胞的積聚，但這也使遞送困難。另外，所報(bào)道的生物分布顯示了在給藥后在非腫瘤組織內(nèi)的長(zhǎng)期(至少數(shù)天)顯著的光毒性藥物水平。
在本申請(qǐng)人在先的以色列專利102645和相應(yīng)的EP 0584552、US5,726,169、US 5,726,169、US 5,955,585和US 6,147,195中，發(fā)明人使用了不同的方法。研究了在給藥后未從循環(huán)中外滲并且在血液中具有較短持續(xù)時(shí)間的高效抗血管敏化劑。人們期望在正常組織和異常組織如腫瘤或其它依靠新生血管的組織之間的固有差異將能夠相對(duì)選擇性地破壞異常組織。因此，目的是合成極性更大的Bchl衍生物，從而更好地停留在血管腔室內(nèi)，在那里他們發(fā)揮了主要的光動(dòng)力作用。為此目的，Bchla(本文示意圖1中的化合物1)的C-17位的香葉基香葉基殘基被各種殘基如氨基酸、肽或蛋白質(zhì)替代，他們提高了敏化劑的親水性。發(fā)現(xiàn)一個(gè)具體衍生物，Bchl-Ser(示意圖1，化合物1，其中R是絲氨?；?是水溶性的并在細(xì)胞培養(yǎng)物中具有高的光毒性。在腹膜內(nèi)注射后，Bchl-Ser以相對(duì)短的時(shí)間(t1/2分別為～2h和16h)從小鼠血液和組織內(nèi)以雙指數(shù)方式清除。在靜脈內(nèi)注射后從循環(huán)的清除更快一些。在所選治療方案中(在藥物注射后幾分鐘內(nèi)施用光)，光毒性主要地施加于腫瘤血管系統(tǒng)(Rosenbach-Belkin等人，1996；Zilberstein等人，2001和1997)。然而，令人遺憾的是，像天然Bchl那樣，Bchl-Ser衍生物經(jīng)歷迅速的光氧化，形成相應(yīng)的2-desvinyl-2-乙?；?脫植基葉綠素酯及其它產(chǎn)物。
為增加Bchl衍生物的穩(wěn)定性，在后一申請(qǐng)人的PCT公開WO 00/33833和US 6,569,846中，中心Mg原子被Pd替代。這一重原子先前顯示出顯著增加Bchl大環(huán)的氧化電位，并同時(shí)大大提高分子向其三線態(tài)的系統(tǒng)間跨越(intersystem-crossing，ISC)速率。金屬置換通過直接將Pd2+離子引入到Bpheid分子中進(jìn)行，如WO 00/33833所述。基于顏料生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)，推測(cè)衍生物Pd-Bpheid在循環(huán)中停留很短時(shí)間，并且實(shí)際上不向其它組織外滲，因此是血管靶向PDT的良好候選藥物，其避免了皮膚光毒性。對(duì)血管的治療效果通過被治療血管的活體鏡檢法并用依文氏藍(lán)(Evans-Blue)染色證明。使用治療方案，用最小的藥物-光照間隔，發(fā)現(xiàn)Pd-Bpheid(也稱作Tookad)在小鼠、大鼠及其他動(dòng)物模型的不同腫瘤的根除中是有效的，衍生物Pd-Bpheid目前進(jìn)入了患有前列腺癌患者的I/1I期臨床試驗(yàn)階段，所述患有前列腺癌的患者經(jīng)過放療后治療失敗(Chen等人，2002；Schreiber等人，2002；Koudinova等人，2003)。
由于Pd-Bpheid在水溶液中的低溶解性，Pd-Bpheid臨床應(yīng)用要求使用增溶劑如Cremophor，高劑量使用Cremophor時(shí)可引起副作用。非常希望使Pd-Bpheid具有水溶性并同時(shí)保持其理化性質(zhì)?；蛘撸Ｍ苽渚哂屑?xì)胞光毒性并同時(shí)具有水溶性較Pd-bpheid自身水溶性更高的Bchl衍生物。預(yù)計(jì)這種水溶性進(jìn)一步提高藥物在循環(huán)中的滯留，從而提高上述選擇性。另外，無需使用載體如洗滌劑或lyposomes，可防止副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)和/或在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)的細(xì)菌葉綠素衍生物，不包括在17位具有游離CH2CH2COOH或CH2CH2COO-基團(tuán)的五環(huán)細(xì)菌葉綠素衍生物和無中心金屬原子，在17位具有-CH2CH2COOH基團(tuán)，在15位具有-CH2COOH或-COOH基團(tuán)，在13位具有-COOH基團(tuán)，在2、7、12、18位具有甲基，和在3和8位具有乙基的四環(huán)細(xì)菌葉綠素衍生物。
本發(fā)明的帶負(fù)電荷的基團(tuán)包括但是不限于羧酸根(COO-)，硫代羧酸根(COS-)，磺酸根(SO3-)，和磷酸根(PO32-)，在生理pH條件下生成所述帶電荷基團(tuán)的酸性基團(tuán)是羧酸(COOH)，硫代羧酸(COSH)，磺酸(SO3H)和膦酸(PO3H2)基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌葉綠素衍生物具有下式I或II的結(jié)構(gòu)
其中M表示2H或選自二價(jià)Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，三價(jià)Fe、Mn和Cr的金屬原子，R1、R2和R4各自獨(dú)立地是Y-R5；Y是O、S或NR5R6；R3選自-CH＝CH2、-C(＝O)-CH3、-C(＝O)-H、-CH＝NR7、-C(CH3)＝NR7、-CH2-OR7、-CH2-SR7、-CH2-NR7R′7、-CH(CH3)-OR7、-CH(CH3)-SR7、-CH(CH3)-NR7R′7、-CH(CH3)Hal、-CH2-Hal、-CH2-R7、-CH＝CR7R′7、-C(CH3)＝CR7R′7、-CH＝CR7Hal、-C(CH3)＝CR7Hal和-C≡CR7；R5，R6，R7和R′7各自獨(dú)立地是H或選自(a)C1-C25烴基，其任選含有一個(gè)或多個(gè)雜原子，碳環(huán)或雜環(huán)部分，和/或任選被一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、氧代、OH、SH、CHO、NH2、CONH2、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、和在生理pH條件下變成帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)的官能團(tuán)取代；(b)氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；和(c)當(dāng)Y是O或S時(shí)，R5可進(jìn)一步是R8+；m是0或1；和R8+是H+或陽離子；條件是(1)R5，R6，R7和R′7中的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)是被帶負(fù)電荷的基團(tuán)或被在生理pH條件下變成帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)取代的上述(a)中的烴鏈；或(ii)R1、R2和R4中的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)是OH、SH、O-R8+或S-R8+；(iii)R1、R2和R4中的至少一個(gè)是OH、SH、O-R8+或S-R8+并且R5，R6，R7和R′7中的至少一個(gè)是被帶負(fù)電荷的基團(tuán)或被在生理pH條件下變成帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)取代的烴鏈；或(iv)R1、R2和R4中的至少一個(gè)是OH、SH、O-R8+或S-R8+并且R5，R6，R7和R′7中的至少一個(gè)是氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；或(v)R5，R6，R7和R′7中的至少一個(gè)是被帶負(fù)電荷的基團(tuán)或被在生理pH條件下變成帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)取代的烴鏈并且R5，R6，R7和R′7中的至少一個(gè)是氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；但是排除了以下結(jié)構(gòu)的式I化合物其中M如定義所述，R3是-C(＝O)CH3，R1是OH或O-R8+，R2是-OCH3，并且排除了以下結(jié)構(gòu)的式II化合物其中M是2H，R3是C(＝O)CH3，R1、R2和R4是OH，m是0或1。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括以上定義的細(xì)菌葉綠素衍生物的藥物組合物，用于光動(dòng)力治療(PDT)。特別是用于血管靶向PDT，如腫瘤或年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的PDT，或用于體內(nèi)或體外殺死包括細(xì)菌和病毒的細(xì)胞或傳染物，以及用于診斷目的。
本發(fā)明提供了使用光敏劑的光動(dòng)力治療，其中改進(jìn)之處在于所述光敏劑是本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物。根據(jù)這一方面，本發(fā)明涉及通過PDT進(jìn)行治療的方法，其包括對(duì)需要的個(gè)體給予有效量的本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物，然后局部照射。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用光敏劑診斷腫瘤的方法，其中改進(jìn)之處在于所述光敏劑是本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物。根據(jù)這一方面，本發(fā)明涉及診斷腫瘤的方法，其包括對(duì)懷疑患有腫瘤的個(gè)體給予有效量的本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物，然后局部照射并檢查懷疑區(qū)域的熒光，其中較強(qiáng)的熒光表明了腫瘤位置。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了使用光敏劑殺死包括細(xì)菌和病毒的細(xì)胞或傳染物的方法，改進(jìn)之處在于其中所述光敏劑是本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物。按照這一方面，本發(fā)明涉及生物制品例如血液滅菌的方法，其包括向所述生物制品如血液中加入有效量的本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物，然后照射。
附圖詳述本發(fā)明的不同化合物在以下


中用粗體和加下劃線的數(shù)字代表，它們的完全表征見于下文化學(xué)部分開頭的化合物列表。
圖1A-1B表示磺化化合物8對(duì)H5V小鼠內(nèi)皮細(xì)胞(圖1A)和M2R小鼠黑色素瘤細(xì)胞(圖1B)的光毒性曲線圖。細(xì)胞在8濃度增加的條件下培養(yǎng)4小時(shí)，洗滌并照射(空心形狀)或保持在黑暗中(黑暗對(duì)照，實(shí)心形狀)，各點(diǎn)是三個(gè)值的平均數(shù)±STD。
圖2A-2B表示磺化化合物4對(duì)H5V小鼠內(nèi)皮細(xì)胞(圖2A)和M2R小鼠黑色素瘤細(xì)胞(圖2B)的光毒性曲線。細(xì)胞在化合物4濃度增加的條件下培養(yǎng)4小時(shí)，洗滌并被照射(空心形狀)或保持在黑暗中(黑暗對(duì)照，實(shí)心形狀)。各點(diǎn)是三個(gè)值的平均數(shù)±STD。
圖3是磺化化合物5對(duì)M2R小鼠黑色素瘤細(xì)胞的光毒性曲線。細(xì)胞在化合物5濃度增加的條件下培養(yǎng)4小時(shí)，洗滌和照射(圈)或保持在黑暗中(黑暗對(duì)照，菱形)。各點(diǎn)是三個(gè)值的平均數(shù)。
圖4是磺化化合物11對(duì)M2R小鼠黑色素瘤細(xì)胞的光毒性曲線。細(xì)胞在化合物11濃度增加的條件下培養(yǎng)4小時(shí)，洗滌和被照射(圈)或保持在黑暗中(黑暗對(duì)照，菱形)。各點(diǎn)是三個(gè)值的平均數(shù)。
圖5是化合物4在CD1裸鼠血液中的藥代動(dòng)力學(xué)曲線。注射化合物4(6mg/kg)后，在標(biāo)示時(shí)間從相同小鼠收集血樣并測(cè)量Pd。每一時(shí)間點(diǎn)表示三只小鼠的平均數(shù)±STD。
圖6表示化合物4在CD1裸鼠中的生物分布。在注射化合物4(6mg/kg)后在不同時(shí)間處死小鼠，測(cè)量標(biāo)示器官的Pd含量。每一時(shí)間點(diǎn)表示三只小鼠的平均數(shù)±STD。
圖7表示使用化合物4的黑色素瘤異種移植的PDT。M2R黑色素瘤異種移植的小鼠被靜脈內(nèi)注射化合物4(6mg/kg)并用光強(qiáng)為30J/cm2(n＝14，實(shí)心正方形)、39J/cm2(n＝8，實(shí)心菱形)、或45J/cm2(n＝10，實(shí)心三角形)照射5分鐘。注射了9mg/kg的化合物4的小鼠用光強(qiáng)為30J/cm2(n＝10，實(shí)心圈)照射5分鐘。對(duì)照組未經(jīng)治療(n＝4，空心正方形)，接受6mg/kg的化合物4的黑暗對(duì)照(n＝4，空心圈)或接受9mg/kg化合物4的黑暗對(duì)照(n＝5，空心三角形)，和光對(duì)照(n＝6，空心菱形，45J/cm2)。
圖8a-8h是表示在異種移植大鼠C6膠質(zhì)瘤并用化合物4治療的小鼠中PDT的選擇性效果的照片。(a-d)用PDT治療的動(dòng)物；(e-h)未經(jīng)治療的動(dòng)物。(a)治療前；(b)PDT和注射伊文氏藍(lán)(EB)后3小時(shí)；(c)PDT后24小時(shí)經(jīng)過治療的區(qū)域的皮瓣；(d)PDT后24小時(shí)經(jīng)過治療的腫瘤的軸向切片；(e)注射EB之前；(f)注射EB后3小時(shí)；(g)注射EB后24小時(shí)的皮瓣；(h)注射EB后24小時(shí)的未經(jīng)治療的腫瘤的軸向切片。T-腫瘤；S-皮膚；M-肌肉；E-水腫。
圖9A-9D表示在兔眼模型中使用化合物4(光強(qiáng)為50J/cm2，劑量為5mg/Kg，DLI 1分鐘)進(jìn)行阻塞PDT2小時(shí)，病灶中心的半薄切片和TEM。觀察到了具有保存相對(duì)很好的RPB細(xì)胞和視網(wǎng)膜的脈絡(luò)膜血管的停滯和擴(kuò)張(9A和9B)。TEM表示在脈絡(luò)膜毛細(xì)管腔(9D的白色箭頭)和破裂的單核細(xì)胞(白色箭頭形)中血細(xì)胞的溶血。透明層(Bm)保持完整，容納有容易識(shí)別的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞細(xì)胞(RPE)。一些脈絡(luò)膜毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞顯著改變，顯示了凝聚染色質(zhì)(9C上的白色星形)?？s寫ONL外核層，ROS桿狀外部片段，CC脈絡(luò)膜毛細(xì)管，e脈絡(luò)膜毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞。
發(fā)明詳述本發(fā)明在較寬的方面提供了含有至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)和/或生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷基團(tuán)的酸性基團(tuán)的細(xì)菌葉綠素衍生物，不包括在17位具有游離-CH2CH2COOH或-CH2CH2COO-基團(tuán)的五環(huán)細(xì)菌葉綠素衍生物和具有以下結(jié)構(gòu)的四環(huán)細(xì)菌葉綠素衍生物無中心金屬原子，在17位具有-CH2CH2COOH基團(tuán)，在15位具有-CH2COOH或-COOH基團(tuán)，在13位具有-COOH基團(tuán)，在2、7、12、18位具有甲基，和在3和8位具有乙基。
細(xì)菌葉綠素衍生物可衍生自天然或合成的細(xì)菌葉綠素衍生物，包括其中無中心Mg原子或中心Mg原子被其它金屬原子替代的化合物，所述其它金屬原子如二價(jià)Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，三價(jià)Fe、Mn和Cr。在優(yōu)選方案中，無金屬原子或金屬原子是Pd、Cu、Zn或Mn。在最優(yōu)選方案中，中心金屬原子是Pd。
在一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供了如上文定義的式I或II的細(xì)菌葉綠素衍生物。
根據(jù)本發(fā)明，R5，R6，R7和R′7定義中的“烴基”是指任何直鏈或支鏈、飽和或不飽和、非環(huán)狀或環(huán)狀、包括芳烴的烴基，其具有1-25個(gè)碳原子、優(yōu)選1-20個(gè)碳原子、更優(yōu)選1-6個(gè)碳原子、最優(yōu)選2-3個(gè)碳原子。烴基可以是優(yōu)選具有1-4個(gè)碳原子的烷基如甲基、乙基、丙基、丁基，或鏈烯基，炔基，環(huán)烷基，芳基如苯基，或芳烷基如芐基，或在17位具有衍生自天然Chl和Bchl化合物的基團(tuán)，如香葉基香葉基(2，6-二甲基-2，6-辛二烯基)或植基(2，6，10，14-四甲基-十六-14-烯-16-基)。
R5，R6，R7和/或R′7的烴鏈可任選含有一個(gè)或多個(gè)雜原子如O、S、和/或NH，以及一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)部分如苯基，或雜環(huán)部分如吡啶基。在一個(gè)實(shí)施方案中，烴鏈含有一個(gè)或多個(gè)O原子和OH端基，由含4-10個(gè)碳原子的低聚乙二醇?xì)埢?yōu)選五氧乙二醇(pentaoxyethyleneglycol)代表。
R5，R6，R7和/或R′7也可是被一個(gè)或多個(gè)以下官能團(tuán)取代的烴基如Cl、CHO、OH、SH、NH2、CONH2、COOH、COSH、SO3H、PO3H2、或帶負(fù)電荷的基團(tuán)如COO-、COS-、SO3-、或PO32-。在一個(gè)優(yōu)選方案中，官能團(tuán)COOH、COSH、SO3H、PO3H2、COO-、COS-、SO3-、或PO32-是末端官能團(tuán)。在最優(yōu)選方案中，烴基具有2或3個(gè)碳原子和選自COO-、或PO32-，或最優(yōu)選SO3-的端基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R5，R6，R7或R′7也可被一個(gè)以上的OH和任選的NH2基團(tuán)取代，并且可以是單糖(monoaccharide)如葡糖胺的殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R5，R6，R7或R′7也可以是氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基。在一個(gè)優(yōu)選方案中，在任意位上，但優(yōu)選在173位上的R5是氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基。如果氨基酸、肽或蛋白質(zhì)含有游離的末端羧基和/或含非末端游離羧酸基團(tuán)的氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸的殘基，則該氨基酸、肽或蛋白質(zhì)可以是帶負(fù)電荷的基團(tuán)的來源。
在一個(gè)實(shí)施方案中，R5，R6，R7或R′7是含有羥基的氨基酸或肽(寡肽或多肽)的殘基，所述含有羥基的氨基酸或肽如絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，或含有它們的肽，或選自以下的所述氨基酸或肽的衍生物酯如烷基酯優(yōu)選甲酯，其中N-保護(hù)基是例如叔丁氧基、芐氧羰基或三苯甲基的N-保護(hù)衍生物，并且所述羥基化氨基酸或肽或其衍生物通過其羥基與Bchl衍生物的COO-基團(tuán)連接。這種氨基酸衍生物的例子是絲氨酸甲酯、N-叔丁基氧羰基絲氨酸、N-三苯甲基絲氨酸甲酯、酪氨酸甲酯、和N-叔丁基氧酪氨酸甲酯，這種肽的例子是N-芐氧羰基-絲氨酰基絲氨酸甲酯，其制備都在上述EP 0584552中描述。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R5，R6，R7和/或R′7是通過酰胺鍵(Y是NH)與-CO基團(tuán)連接的氨基酸或肽(寡肽或多肽)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R5，R6，R7或R′7是選自肽和蛋白質(zhì)的細(xì)胞特異性或組織特異性配體，其例證為，但不限于，激素肽，例如促黑素細(xì)胞激素如α-MSH，和抗體，如免疫球蛋白，和腫瘤特異性抗體。肽或蛋白可能通過酯鍵、硫代酯鍵或酰胺鍵直接與-CO基團(tuán)連接，或者可通過酯鍵或酰胺鍵與C1-C25烴基的選自O(shè)H、COOH和NH2的末端官能團(tuán)連接。
如以上EP 0584552中所述，通過使Bchl結(jié)合不同的氨基酸，和進(jìn)一步使Bchl氨基酸結(jié)合物結(jié)合激素、生長(zhǎng)因子或其衍生物、或腫瘤特異性抗體、或任何其它細(xì)胞特異性配體，獲得了適當(dāng)?shù)亩ㄎ坏墓饷魟?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的帶負(fù)電荷的基團(tuán)COO-、COS-、SO3-、或PO32-分別來自R5，R6，R7和/或R′7的取代烴鏈的官能團(tuán)COOH、COSH、SO3H、或PO3H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，COOH、COSH、COO-、和/或COS-基團(tuán)來自分別為OH、或SH、O-R8+或S-R8+的R1、R2和R4，即，當(dāng)在131、151(m是0)、152(m是1)、和/或173位存在羧酸或硫代羧酸基團(tuán)、或羧酸根或硫代羧酸根陰離子時(shí)。
陽離子R8+可為來自堿金屬或堿土金屬的單價(jià)或二價(jià)陽離子如K+、Na+、Li+、NH4+、Ca+，更優(yōu)選為K+，或者R8+為衍生自胺的陽離子。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物為式I，其中M表示二價(jià)的Pd；R1為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH(CH2)n-PO32-(R8+)2；R2為甲氧基；和R3為-C(＝O)-CH3；R8+為單價(jià)陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+；和n為1到10的整數(shù)，優(yōu)選為2或3。
根據(jù)這一實(shí)施方案，在式I的化合物中，R1優(yōu)選為基團(tuán)-NH-(CH2)n-SO3-R8+，其中n為3，R8+為K+。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物為式II，其中M表示2H，二價(jià)的Pd、Cu、或Zn，或三價(jià)的Mn；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；或Y-R5，其中Y為O、S或NH，R5為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；R2為C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更優(yōu)選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)n-SO3-R8+、-CH＝N-(CH2)n-COO-R8+、-CH＝N-(CH2)n-PO32-(R8+)2、-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、或-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價(jià)陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+、更優(yōu)選為K+；m為1，n為1到10的整數(shù)，優(yōu)選為2或3。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌葉綠素衍生物為式II并且M為Pd。
在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中M為Pd；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、或Y-R5，其中Y為O、S或-NH，R5為蛋白質(zhì)的殘基，優(yōu)選為免疫球蛋白的殘基；R2為C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更優(yōu)選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)nSO3-R8+、或-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、NH-(CH2)n-COO-R8+、NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價(jià)陽離子，如K+，Na+，Li+，NH4+，更優(yōu)選為K+；和m為1，n為2或3，更優(yōu)選為2。
在17位具有唯一帶負(fù)電荷的基團(tuán)(SO3-)的本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物的例子由在下文中的化合物目錄中標(biāo)識(shí)為化合物7的式I的化合物表示。
在13和17位具有兩個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)的本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物的例子包括在下文中的化合物目錄中標(biāo)識(shí)為化合物4、5、8、10、11、12、13、14、15的式II的化合物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物為化合物4。
在3、13和17位具有三個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)的本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物的例子包括在下文中的化合物目錄中標(biāo)識(shí)為化合物9和16的式II的化合物?；衔?3在13位具有一個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)并在173位具有作為蛋白質(zhì)分子的一部分的-COOH基團(tuán)，化合物15在13位具有一個(gè)二價(jià)的帶負(fù)電荷的基團(tuán)并在173位具有-COO-基團(tuán)。
可以通過例如本文圖解1所述的方法制備本發(fā)明的化合物。對(duì)于其中R5為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基的化合物的制備方法，可如圖解1所示用于與氨基磺酸(?；撬岷透吲；撬?的反應(yīng)使用上述提及的EP0584552中所述的方法，特別是催化縮合法。
因此，制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團(tuán)-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的式II的化合物的方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)；和(ii)分離所需的式II的化合物。
對(duì)于制備化合物4，該方法包括使Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a3與式H2N-(CH2)2-SO3H的?；撬嵩贙+-緩沖液中反應(yīng)并分離所需的化合物。
對(duì)于制備化合物5，該方法包括使細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a2與式H2N-(CH2)2-SO3H的?；撬嵩贙+-緩沖液中反應(yīng)并分離所需的化合物。
對(duì)于Cu和Zn化合物10、11的制備，該方法包括通過使化合物5分別與醋酸銅或乙酸鋅反應(yīng)，直接嵌入中心金屬Cu或Zn原子，而對(duì)于Mn化合物12的制備，中心金屬M(fèi)n原子的嵌入通過首先使化合物5與乙酸鎘反應(yīng)然后與氯化錳反應(yīng)的金屬轉(zhuǎn)移作用進(jìn)行。
對(duì)于其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙?；?、R4為基團(tuán)-NH-(CH2)n-COO-R8+、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的式II的化合物的制備，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)、和(ii)分離所需的式II的化合物。
因此，對(duì)于化合物14的制備，該方法包括使Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a3與式H2N-(CH2)2-COOH的β-丙氨酸在K+-緩沖液中反應(yīng)并分離所需的化合物。
對(duì)于其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙?；4為基團(tuán)-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的式II的化合物的制備，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)、和(ii)分離所需的式II的化合物。
因此，對(duì)于化合物15的制備，該方法包括使Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a3與式H2N-(CH2)3-PO3H2的3-氨基-1-丙烷膦酸在K+-緩沖液中反應(yīng)，并分離所需的化合物。
對(duì)于在13和17位具有相同的帶負(fù)電荷的基團(tuán)的化合物的制備，可如上所述使相應(yīng)的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與過量的試劑如氨基磺酸、氨基羧酸或氨基膦酸反應(yīng)，并分離所需的式II的13，17-二取代衍生物，或者遵循圖解1中所述和如下所述的不同反應(yīng)路線。
因此，對(duì)于其中R1和R4各自為基團(tuán)-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的式II化合物的制備，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯(lián)；(ii)使得到的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)，從而得到在17位具有唯一帶負(fù)電荷的基團(tuán)的式I的化合物；(iii)將這一產(chǎn)物與過量的H2N-(CH2)n-SO3H在R8+-緩沖液中反應(yīng)；并分離所需的式II的化合物。
對(duì)于化合物8的制備，與過量的式H2N-(CH2)3-SO3H高?；撬徇M(jìn)行反應(yīng)。
當(dāng)氨基磺酸被氨基羧酸和氨基膦酸代替時(shí)，得到相應(yīng)的羧酸酯和膦酸酯衍生物。
本發(fā)明的化合物，在本文中往往也稱為“顏料”，具有充分高的極性，為水溶性的，可以以水溶液形式注射而不需要加入表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于優(yōu)選的磺化-Pd-Bchl化合物4，還顯示了其生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)，并以此為基礎(chǔ)，推測(cè)本發(fā)明的這一衍生物和其它衍生物保留在循環(huán)中，并且保留很短的時(shí)間。因此，它們是用于血管靶向PDT的良好光敏劑。本文所示的對(duì)小鼠中的M2R黑素瘤和HT-29人結(jié)腸癌異種移植物的治療證明顏料對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)的選擇性效果。使用磺化-Pd-Bchl4的推薦方案者慮了藥物的短的消除時(shí)間。由于它們對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)的選擇性作用，這些化合物可用于腫瘤以及年齡相關(guān)性黃斑變性和其它基于新血管形成的組織異常。
因此，另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物和可藥用載體的藥物組合物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物組合物包括本文中式I或II的細(xì)菌葉綠素衍生物，更優(yōu)選為式II的磺化衍生物，最優(yōu)選為化合物4。
使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，如在Remington的PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，Penna.，最新版中所概括的，將本發(fā)明的陰離子型細(xì)菌葉綠素衍生物配制成最終的用于對(duì)患者給藥或應(yīng)用于體外靶的藥物組合物。該組合物可全身給藥，特別是注射給藥，或者可局部給藥。
本發(fā)明的陰離子型Bchl化合物具有與各自的非陰離子型Bchl類似的光學(xué)吸收特征和光物理學(xué)特征，因此，當(dāng)存在于被處理的組織內(nèi)時(shí)，預(yù)計(jì)它們?yōu)橛行У墓鈩?dòng)力學(xué)治療劑。因此，它們可用作光敏劑，作為治療劑和診斷劑，例如對(duì)若干類型的癌癥的治療，例如但不限于黑素瘤、前列腺癌、腦癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌、皮膚癌、肺癌、食管癌、和膀胱癌，和其它激素敏感的腫瘤，以及用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性，和用于如PDT領(lǐng)域中公知的殺死樣品和活組織中的細(xì)胞、病毒、真菌和細(xì)菌和用于其它光敏劑應(yīng)用。
本發(fā)明的新型水溶性Bchl衍生物可用于例如使贅生性細(xì)胞或其它異常組織敏化，使用適當(dāng)波長(zhǎng)的光通過體內(nèi)或體外輻射將其破壞。相信光活化能量被轉(zhuǎn)移到內(nèi)源性氧，將其轉(zhuǎn)化為被認(rèn)為具有細(xì)胞毒性作用的單線態(tài)氧和/或其它活性氧(ROS)如超氧化物和羥基基團(tuán)。另外，Bchls的光活化形式發(fā)出熒光，該熒光有助于定位給予Bchl衍生物的腫瘤或其它部位。
本領(lǐng)域中已知的可使用本發(fā)明的細(xì)菌葉綠素衍生物治療的適應(yīng)癥的例子包括破壞實(shí)體瘤中的腫瘤組織、和溶解血管中的斑塊(參見例如美國(guó)專利4,512,762)。特別是，由于這些衍生物極少保留在循環(huán)中和由于它們只最低限度地被非循環(huán)組織如皮膚和肌肉吸收，這些衍生物適合于血管靶向PDT。因此，這些化合物使得在刺激時(shí)活性氧(ROS)的生產(chǎn)局限在血管內(nèi)，從而產(chǎn)生異常血管如存在于腫瘤和年齡相關(guān)性黃斑變性中的那些血管的選擇性響應(yīng)。另外，細(xì)菌葉綠素衍生物可用于在局部病癥如粉刺、腳癬、疣、乳頭瘤和牛皮癬的治療中選擇性破壞；用于治療良性前列腺肥大和用于通過破壞傳染物用于生物制品如輸血用血液的滅菌。
可通過PDT中使用的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒈景l(fā)明的藥物組合物給予患者?？筛鶕?jù)PDT中使用其它卟啉積累的經(jīng)驗(yàn)建立給予有需要的個(gè)體以本發(fā)明陰離子型Bchl衍生物的量和給藥途徑，并且將取決于用作活性成分的衍生物的選擇、病癥如待治療腫瘤的種類、疾病的階段、患者年齡和健康狀況、和醫(yī)生的判斷而改變，但是其應(yīng)比現(xiàn)在使用的PhotofrinII的約20-40HPD/kg體重的用量低得多。優(yōu)選的給藥途徑為將包括常規(guī)的可藥用載體和添加劑的活性化合物水溶液靜脈內(nèi)注射或直接注射到實(shí)體瘤中和使用適當(dāng)?shù)木植拷M合物的皮膚腫瘤的局部治療。
優(yōu)選選擇輻照光的波長(zhǎng)與細(xì)菌葉綠素光敏劑的最大吸光度匹配。任何化合物的適合波長(zhǎng)可從其吸收光譜容易地測(cè)定。
除了體內(nèi)應(yīng)用之外，本發(fā)明的陰離子型Bchl衍生物可用于體外處理材料以殺死有害病毒或傳染物如有害細(xì)菌。例如，可使用本發(fā)明的Bchl處理并照射將來用于輸血的血液和血漿以滅菌。
特異性結(jié)合于靶細(xì)胞受體的蛋白質(zhì)如激素、生長(zhǎng)因子或其衍生物、抗體、肽對(duì)Bchl部分的結(jié)合和細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素如酪氨酸對(duì)Bchl部分的結(jié)合意味著增加在腫瘤和被處理位點(diǎn)的保留。紅移的增加使得能夠進(jìn)行更深入地滲透，同時(shí)保持天然系統(tǒng)的普遍性。由其它金屬代替Mg優(yōu)化了Bchl部分的固有的穩(wěn)定性和代謝穩(wěn)定性及其向受激三線態(tài)的系統(tǒng)間過渡，以及開啟了新的診斷方法的可能性。
對(duì)新生內(nèi)皮細(xì)胞具有高親合力的腫瘤特異性抗體和肽優(yōu)先將Bchl部分導(dǎo)向腫瘤或處理位置，同時(shí)激素和細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素也可由正常的非轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)物吸收。然而，選擇作為激素和細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素的靶的細(xì)胞如黑素細(xì)胞和新生內(nèi)皮細(xì)胞在正常情況下分散于其它細(xì)胞中和當(dāng)轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞時(shí)群集為實(shí)體瘤。結(jié)果是，預(yù)計(jì)惡性組織的血管和/或細(xì)胞區(qū)室中的光敏劑濃度相對(duì)于其在細(xì)胞更為分散的正常組織中顯著增加，保證了PDT效果在腫瘤位置中的放大。這使得能夠有效使用比正常組織損壞閾值更低的光劑量，從而減少了對(duì)空間界限清晰的輻射的需要。另外，由于具有非常強(qiáng)烈的熒光，定位的Bchl可用于腫瘤位置或其它靶點(diǎn)的熒光標(biāo)記。
在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，由于正常和異常的血管固有的對(duì)本文所述的PDT方案的敏感性的不同，使用本發(fā)明的光敏劑治療的靶為異常的血管，特別是實(shí)體瘤和年齡相關(guān)性黃斑變性的血管。
本發(fā)明另外涉及光動(dòng)力學(xué)治療方法，其包括對(duì)有需要的個(gè)體給予有效量的本發(fā)明的Bchl衍生物，隨后局部照射。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PDT方法用于治療癌癥，其包括對(duì)患有實(shí)體瘤癌癥的患者給予治療有效量的本發(fā)明的Bchl衍生物，然后使用670-780nm的強(qiáng)光源照射腫瘤位置。
本發(fā)明的Bchl衍生物還可用于正常或惡性動(dòng)物細(xì)胞以及培養(yǎng)物中微生物的光破壞，其能夠選擇性地光破壞培養(yǎng)物中的某些類型的細(xì)胞或傳染物；用于通過將卟啉部分結(jié)合于特定的多肽如激素或其它受體配體、結(jié)合于細(xì)胞或組織特異性抗體、或結(jié)合于其它配體如外源凝集素而使卟啉部分針對(duì)所選細(xì)胞；用于在實(shí)驗(yàn)室、診斷和工業(yè)應(yīng)用中的分析目的的熒光標(biāo)記分子；和用于熒光標(biāo)記動(dòng)物細(xì)胞或微生物或顆粒，用于實(shí)驗(yàn)室、診斷或工業(yè)應(yīng)用。由于它們優(yōu)異的吸光系數(shù)和較高的熒光收率，它們可以代替幾種現(xiàn)在使用的熒光標(biāo)記物如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白。
對(duì)于診斷目的，可單獨(dú)使用本發(fā)明的Bchl衍生物，或可用本領(lǐng)域中已知的放射性同位素或其它檢測(cè)手段標(biāo)記。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)程序由例如用67Ga、111In、201Tl、99mTc放射性標(biāo)記Bchl衍生物，并將放射性診斷劑給予患者，優(yōu)選通過靜脈注射給藥。在數(shù)小時(shí)后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)程序造影癌癥部位。
本發(fā)明另外提供本發(fā)明的Bchl衍生物用于體內(nèi)或體外殺死生物制品如血液中的細(xì)胞或傳染物如細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌的用途，其包括用本發(fā)明的化合物處理被感染的樣品，隨后照射樣品。
下文通過非限制性實(shí)施例說明本發(fā)明。
實(shí)施例為了方便和更好地理解，實(shí)施例部分分為兩個(gè)小部分(I)化學(xué)部分，描述水溶性衍生物和中間體4-16的合成，和(II)生物學(xué)部分，描述新型Bchl衍生物的生物活性。
I化學(xué)部分在本文的實(shí)施例中，根據(jù)以下化合物目錄，本發(fā)明的衍生物(4-5、7-9、和10-16)和中間體(1-3、和6)由它們各自為粗體并加下劃線的阿拉伯?dāng)?shù)字表示。相應(yīng)的分子式出現(xiàn)在說明書結(jié)尾、權(quán)利要求之前的圖解中。
化合物目錄1.細(xì)菌葉綠素a(Bchl a)2.細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(Bpheid a)3.Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(Pd-Bpheid a)4.鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實(shí)施例1]5. 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實(shí)施例2]6.鈀 細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧琥珀酰亞胺)酯鈉鹽[實(shí)施例6]7.鈀 細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺鉀鹽[實(shí)施例7]8.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二鉀鹽[實(shí)施例8]9.鈀 31-(3-磺基丙基亞胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽[實(shí)施例9]10.銅(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實(shí)施例3]11.鋅 31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實(shí)施例4]12.錳(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實(shí)施例5]13.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-致紅細(xì)菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺鉀鹽][實(shí)施例10]
14.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131-(2-羧乙基)酰胺二鉀鹽[實(shí)施例11]15.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩 131-(3-膦丙基)酰胺三鉀鹽[實(shí)施例12]16.鈀 31-(3-磺基丙基氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽[實(shí)施例13]材料和方法(i)Bchl a(1)為從前述(WO 00/33833)的RhodovolumSulfidophilum凍干細(xì)胞提取并純化得到。
(ii)鈀細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸(Pd-Bpheid，2)為如前所述(WO00/33833)制備或通過Negma-Lerads，F(xiàn)rance得自Steba BiotechLtd.。
(iii)3-氨基-1-丙烷磺酸(高?；撬?和3-氨基-1-丙烷膦酸購(gòu)自Aldrich(USA)，2-氨基乙烷磺酸(?；撬?和3-氨基丙酸(β-丙氨酸)購(gòu)自Sigma(USA)，N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)購(gòu)自Pierce(USA)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)購(gòu)自Fluka(瑞士)。
(iv)除了作HPLC時(shí)使用HPLC級(jí)溶劑之外，使用分析級(jí)的化學(xué)品和溶劑。
(v)TLC硅膠板(Kieselgel-60，Merck，德國(guó))；氯仿-甲醇(4∶1，v/v)。
(vi)在Avance DPX 250儀器(Bruker，法國(guó))上記錄1H核磁共振(NMR)光譜，并以剩余溶劑峰作為內(nèi)標(biāo)的四甲基硅烷低場(chǎng)的ppm(δ)表示。
(vii)通過使Pd濃度(使用PdCl2作為標(biāo)準(zhǔn)的火焰光度法)與在特定波長(zhǎng)的受檢溶液的光學(xué)密度相關(guān)測(cè)定Pd-衍生物的吸光系數(shù)。
(viii)在平臺(tái)LCZ光譜儀(Micromass，英國(guó))上記錄電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)。
(ix)使用ELAN-6000儀器(Perkin Elmer，CT)進(jìn)行電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)，用于測(cè)定Pd濃度。
(x)使用Genesis-2(Milton Roy，英國(guó))和V-570(JASCO，日本)分光光度計(jì)記錄各種絡(luò)合物的光學(xué)吸收。
(xi)使用裝備有UV-915二極管陣列檢測(cè)器的LC-900儀器(JASCO，日本)進(jìn)行HPLC。
化學(xué)實(shí)施例實(shí)施例1.鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物4)在含有120ml的DMSO并在氬氣(在溶液中鼓泡)下攪拌的1L圓底燒瓶中溶解935mg的Pd-Bpheid(3)。將牛磺酸(1288mg)溶解于40ml的1M K2HPO4緩沖液中，并(使用HCl)將溶液pH調(diào)節(jié)為8.2。在攪拌下將該水溶液加入到DMSO溶液中，并繼續(xù)向溶液中鼓入氬氣20分鐘。然后在30℃在2毫巴下蒸發(fā)反應(yīng)混合物3.5小時(shí)，然后在37℃再蒸發(fā)2小時(shí)以徹底干燥。將干燥的固體溶解于300ml的MeOH中，并通過脫脂棉過濾有色溶液，以除去過量的緩沖鹽和牛磺酸。
通過TLC(未反應(yīng)的Pd-Bpheid的Rf為0.8-0.85，反應(yīng)(氨解)產(chǎn)物的Rf為0.08-0.1)和通過跟蹤在凍干和在MeOH中重溶之后反應(yīng)混合物的光學(xué)吸收譜測(cè)定反應(yīng)的進(jìn)行。吸收光譜的特征為從756nm(Pd-Bpheid)到747nm(產(chǎn)物4)的Qy躍遷位移和Pd-Bpheid從534nm到519nm(產(chǎn)物4)的Qx位移。蒸發(fā)MeOH并通過使用ODS-A 250×20 S10Pμm柱(YMC，日本)的HPLC純化產(chǎn)物4。溶劑A95％的0.005M磷酸鹽緩沖液，pH 8.0的5％的甲醇。溶劑B100％甲醇。將干燥的固體溶解于42ml蒸餾水中并各自以1.5ml小份注入。
洗脫方案在表1中說明。將產(chǎn)物4(見下文圖解1)洗脫并在～9-11分鐘收集。在4-7分鐘收集的主要的雜質(zhì)(約5-10％)相當(dāng)于具有所述結(jié)構(gòu)7的副產(chǎn)物。在22-25分鐘(約2-5％)的峰可能相當(dāng)于主要產(chǎn)物4的異構(gòu)體(iso-form)和未處理的Pd-Bpheid殘留。
表1.化合物4梯度純化方案

減壓蒸發(fā)溶劑(含水的甲醇)。然后，將純化的產(chǎn)物4再溶解在～150ml MeOH中并通過脫脂棉過濾。再次蒸發(fā)溶劑并將固體顏料4在黑暗中在Ar下在-20℃貯存。反應(yīng)收率～90％(以重量計(jì)，相對(duì)于3)。
通過電噴霧離子質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物4的結(jié)構(gòu)(ESI-MS，負(fù)電模式，圖2)(在875(M--K-H)，859(M--2K-H+Na)，837(M--2K)，805(M2K-H-OMe)，719有峰)，1H-NMR光譜(圖4，在MeOH-d4中)。
表4提供了主要的NMR峰的位移(以ppm為單位)。
光學(xué)吸收(UV-VIS)光譜(MeOH)λ747(1.00)，516(0.13)，384(0.41)，330(0.50)；ε747(MEOH)為1.2×105mol-1cm-1。
NMR(MeOH-d4)9.38(5-H，s)，8.78(10-H，s)，8.59(20-H，s)，5.31和4.95(151-CH2，dd)，4.2-4.4(7，8，17，18-H，m)，3.88(153-Me，s)，3.52(21-Me，s)，3.19(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，1.92-2.41、1.60-1.75(171、172-CH2，m)，2.19(81-CH2，m)，1.93(71-Me，d)，1.61(181-Me，d)，1.09(82-Me，t)，3.62，3.05(?；撬岬腃H2)。
辛醇/水的分配比為40∶60。
實(shí)施例2. 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物5)的制備將160mg的?；撬崛芙庥?ml的1M K2HPO4緩沖液中，并調(diào)節(jié)溶液的pH為8.2。向該溶液中加入溶解于15ml DMSO中的120mg化合物2，反應(yīng)和隨后的純化與前述實(shí)施例中所述的類似。
吸收光譜(MeOH)λ750(1.00)，519(0.30)，354(1.18)nm。
ESI-MS(-)734(M--2K)。
NMR(MeOH-d4)9.31(5-H，s)，8.88(10-H，s)，8.69(20-H，s)，5.45和5.25(151-CH2，dd)，4.35(7，18-H，m)，4.06(8，17-H，m)，4.20和3.61(?；撬岬?-CH2，m)，3.83(153-Me，s)，3.63(21-Me，s)，3.52(?；撬岬?-CH2，m)，3.33(121-Me，s)，3.23(32-Me，s)，2.47和2.16(171-CH2，m)，2.32和2.16(81-CH2，m)，2.12和1.65(172-CH2，m)，1.91(71-Me，d)，1.66(181-Me，d)，1.07(82-Me，t)。
辛醇/水的分配比為60∶40。
實(shí)施例3.銅(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物10)的制備將50mg的實(shí)施例2化合物5和35mg的醋酸銅(II)溶解于40ml甲醇中，并向溶液中鼓入氬氣10分鐘。然后加入500mg的棕櫚酰抗壞血酸酯，并攪拌溶液30分鐘。吸收光譜的特征為在750nm(5)到768nm(產(chǎn)物10)的Qy躍遷位移和從5的519nm到537nm(產(chǎn)物10)的Qx位移。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，再溶解于丙酮中并通過脫脂棉過濾除去過量的醋酸鹽。蒸發(fā)丙酮并另外通過HPLC在表2中所述洗脫方案的條件下純化產(chǎn)物。
減壓下蒸發(fā)溶劑(含水的甲醇)。然后將純化的顏料10再溶解于甲醇中并通過脫脂棉過濾。再次蒸發(fā)溶劑并在Ar在黑暗中在-20℃貯存固體顏料10。反應(yīng)收率90％。
表2.化合物10梯度純化方案

吸收光譜(MeOH)λ768(1.00)，537(0.22)，387(0.71)和342(0.79)nm。
ESI-MS(-)795(M--2K)。
辛醇/水的分配比為40∶60。
實(shí)施例4.鋅31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物11)的制備如前所述(美國(guó)專利5,726,169)使用醋酸中的醋酸鋅將Zn嵌入到化合物5中。以與實(shí)施例2中化合物5同樣的條件通過HPLC進(jìn)行最終的純化。
吸收光譜(MeOH)λ762(1.00)，558(0.26)，390(0.62)和355(0.84)nm。
辛醇/水的分配比為50∶50。
實(shí)施例5.錳(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物12)的制備使用對(duì)如前所述(WO 97/19081、US 6,333,319)的方法略加改變的方法使用醋酸中的醋酸鋅將錳嵌入到化合物5中。因此，將在10ml的DMF中的50mg的化合物5與220mg乙酸鎘攪拌并在氬保護(hù)氣氛下在110℃下加熱約15分鐘(通過在丙酮中的從519到585nm的Qx躍遷吸收譜帶移動(dòng)監(jiān)測(cè)Cd-絡(luò)合物的形成)。然后將反應(yīng)混合物冷卻并蒸發(fā)。將干燥的殘余物再溶解于15ml的丙酮中并與氯化錳(II)攪拌以形成Mn(III)-產(chǎn)物12。通過在丙酮中的從585到600nm的Qx躍遷吸收譜帶移動(dòng)和從768到828nm的Qx躍遷吸收譜帶移動(dòng)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物的形成。蒸發(fā)丙酮并另外通過HPLC在上述實(shí)施例2中提及的條件下以以下表3中所述的洗脫方案純化產(chǎn)物12，其中溶劑系統(tǒng)包括A-5％含水甲醇，B-甲醇。
表3.化合物12梯度純化方案

減壓下蒸發(fā)溶劑(含水的甲醇)并在-20℃下在黑暗中在Ar下貯存固體顏料111012。
吸收光譜(MeOH)λ828(1.00)，588(0.32)和372(0.80)nm。
辛醇/水的分配比為5∶95。
實(shí)施例6.鈀 細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧基-琥珀酰亞胺)酯鈉鹽(化合物6)的制備在室溫下將50mg的Pd-Bpheid(化合物2)，80mg的N-羥基磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和65mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)在7ml的無水DMSO中混合過夜。然后減壓下排出溶劑。將干燥的殘余物再溶解于氯仿(約50ml)中，濾掉不溶性物質(zhì)并蒸發(fā)。轉(zhuǎn)化率為約95％(TLC)。產(chǎn)物6隨后不經(jīng)進(jìn)一步的色譜純化而使用。ESI-MS(-)890(M-Na)。
NMR(CDCl3)9.19(5-H，s)，8.49(10-H，s)，8.46(20-H，s)，5.82(132-H，s)，4.04-4.38(7，8，17，18-H，m)，3.85(134-Me，s)，3.47(21-Me，s)，3.37(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，1.77(71-Me，d)，1.70(181-Me，d)，1.10(82-Me，t)，4.05(NHS的CH2，s)，3.45(NHS的CH，s)。
實(shí)施例7.鈀 細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺鉀鹽(化合物7)的制備將1ml DMSO中的10mg化合物6與1ml的0.1M K-磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中的20mg高?；撬?3-氨基-1-丙烷磺酸)混合過夜。然后將反應(yīng)混合物在氯仿/水中分配。無水硫酸鈉干燥有機(jī)層并蒸發(fā)。將干燥的殘余物再溶解于氯仿-甲醇(19∶1)中并用于硅膠色譜柱純化。使用氯仿-甲醇(4∶1)洗脫得到產(chǎn)物7。收率為約80-90％。
ESI-MS(-)834(M-K)m/z。
NMR(MeOH-d4)9.16(5-H，s)，8.71(10-H，s)，8.60(20-H，s)，6.05(132-H，s)，4.51，4.39，4.11，3.98(7，8，17，18-H，都是m)，3.92(134-Me，s)，3.48(21-Me，s)，3.36(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，2.02-2.42(171和172-CH2，m)，2.15(81-CH2，q)，1.81(71-Me，d)，1.72(181-Me，d)，1.05(82-Me，t)，3.04、2.68和2.32(高牛磺酸的CH2，m)。
實(shí)施例8.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二鉀鹽(化合物8)的制備將10mg的化合物6或7溶解于3ml的DMSO中，將其與1ml的pH為8.2的0.5M K-磷酸鹽緩沖液中的100mg高?；撬峄旌希⒃谑覝叵卤剡^夜。然后如上所述減壓排出溶劑，在HPLC上純化產(chǎn)物8。收率83％。
吸收光譜(MeOH)747(1.00)，516(0.13)，384(0.41)，330(0.50)，ε747＝1.3×105mol-1cm-1。
ESI-MS(-)1011(M--K)，994(M--2K+Na)，972(M--2K)，775(M--2K-CO2Me-高牛磺酸NHCH2CH2CH2SO3)，486([M-2K]/2)NMR(MeOH-d4)9.35(5-H，s)，8.75(10-H，s)，8.60(20-H，s)，5.28和4.98(15-1-CH2，dd)，4.38，4.32，4.22，4.15(7，8，17，18-H，都是m)，3.85(15-3-Me，s)，3.51(21-Me，s)，3.18(121-Me，s)，3.10(32-Me，s，2.12-2.41(171-CH2，m)，2.15-2.34(81-CH2，m)，1.76-2.02(172-CH2，m)，1.89(71-Me，d)，1.61(181-Me，d)，1.07(82-Me，t).3.82，3.70，3.20，3.10，2.78，2.32，1.90(C-高?；撬岬?31和C-173的CH2)。
實(shí)施例9.鈀 31-(3-磺基丙基亞胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽(化合物9)在合成8的過程中從HPLC得到化合物9作為副產(chǎn)物。
吸收光譜(MeOH)729(1.00)，502(0.10)，380(0.69)，328(0.57)。
ESI-MS(30.4.2000)1171(M-K+H)，1153(M--2K-H+Na)，1131(M-2K)，566([M-K]/2)，364([M-3K]/3)。
NMR(MeOH-d4)8.71(1H)，8.63(1.5H)，8.23(0.5H)(5-，10-和20-H，都是m)，5.30和4.88(151-CH2，dd)，4.43和4.25(7，8，17，18-H，m)，3.85(15-3-Me，s)，3.31(21-Me，s)，3.22(121-Me，s)，3.17(32-Me，m)，1.89-2.44(171和172-CH2，m)，2.25(81-CH2，m)，1.91(71-Me，s)，1.64(181-Me，s)，1.08(82-Me，t)，4.12，3.56，3.22，3.16，2.80和2.68(高?；撬岬腃H2)。
實(shí)施例10.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺鉀鹽(化合物13)在室溫下將10mg的化合物4與1毫升無水DMSO中的20mg磺基-NHS和15mg的EDC反應(yīng)1小時(shí)，然后加入PBS(2.5ml)中的兔IgG(0.6mg)，并在室溫下進(jìn)一步保溫混合物過夜。蒸干混合物，然后再溶解于1ml的PBS中并加載到由PBS平衡的Sephadex G-25柱上。使用4-5ml的PBS洗脫色帶。分別通過753和280mn的光學(xué)密度測(cè)定得到的共軛物13中的顏料/蛋白質(zhì)比，其顏料13/蛋白質(zhì)為0.5/1到1/1。
實(shí)施例11.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-羧乙基)酰胺二鉀鹽(化合物14)的制備如實(shí)施例2中所述進(jìn)行標(biāo)題化合物14的制備和純化，使化合物2與代替?；撬岬?-氨基丙酸(β-丙氨酸)(150mg)反應(yīng)。收率85％。
實(shí)施例12.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(3-膦酸丙基)酰胺三鉀鹽(化合物15)的制備如實(shí)施例2中所述進(jìn)行標(biāo)題化合物15的制備和純化，使化合物2與代替牛磺酸的3-氨基丙烷膦酸(180mg)反應(yīng)。收率68％。
實(shí)施例13.鈀 31-(3-磺基丙基氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽(化合物16)為了將31-(3-磺基丙基亞胺基)中的亞氨基還原為相應(yīng)的31-(3-磺基丙基氨基)基團(tuán)，使化合物9(8mg)在室溫下通過攪拌與5ml甲醇中的氰基硼氫化鈉(15mg)反應(yīng)過夜。然后用0.05M HCl(5ml)處理反應(yīng)混合物，用0.01 M KOH中和并蒸發(fā)。在實(shí)施例2中所述條件下用HPLC純化標(biāo)題產(chǎn)物16。收率80-90％。
II 生物學(xué)部分材料和方法體外研究(i)細(xì)胞培養(yǎng)在包含25mM HEPES、pH 7.4、10％胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/F12(以下簡(jiǎn)稱為“培養(yǎng)液”)中將M2R小鼠黑素瘤、H5V小鼠內(nèi)皮細(xì)胞和C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)成為單層。細(xì)胞在37℃下在8％CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中生長(zhǎng)。
(ii)光毒性分析為了測(cè)定光動(dòng)力學(xué)效力，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)所示的時(shí)間和條件下在黑暗中在增加顏料濃度下預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。通過用培養(yǎng)液洗細(xì)胞除去未結(jié)合的光敏劑，并在室溫下從底部照射板(λ＞650nm，12J/cm2)。光源為裝備有4cm水過濾器的100W鹵素?zé)?Osram，德國(guó))。將培養(yǎng)物置于培養(yǎng)孵育器中并在照射24小時(shí)后通過中性紅生活力分析法測(cè)定細(xì)胞存活。使用了三種類型的對(duì)照(i)光照對(duì)照在沒有顏料的情況下照射細(xì)胞；(ii)黑暗對(duì)照用顏料處理細(xì)胞但保持在黑暗中；和(iii)保持在黑暗中的未經(jīng)處理的細(xì)胞。
體內(nèi)研究(iii)腫瘤植入在小鼠背上皮下植入M2R或C6細(xì)胞(2×106)；在2-3周內(nèi)腫瘤發(fā)展到治療尺寸(6-8mm)。
(iv)光敏劑的制備通過在使用之前將干燥的顏料直接溶解于PBS中到所需的注射濃度制備本發(fā)明的化合物的儲(chǔ)備液。
(v)生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)將本發(fā)明的顏料4(6mg/kg體重)通過尾部靜脈注射給CD1裸鼠。在標(biāo)示時(shí)間將小鼠處死并將標(biāo)示器官或組織的樣品置于預(yù)先稱重的小瓶中并稱重，并立即在干冰上冷凍。檢驗(yàn)時(shí)，將各個(gè)樣品解凍并在雙蒸水中(1∶10w/v)勻漿。將勻漿的等份試樣(0.5ml)在Eppendorff試管中凍干。然后向各個(gè)干燥樣品中加入0.2ml的HNO3(70％，TraceSelect，F(xiàn)luka)，在90℃培養(yǎng)1小時(shí)并在雙蒸水中稀釋到10ml。通過ICP-MS測(cè)定鈀濃度。使用取自未經(jīng)處理的小鼠的相同的樣品測(cè)定各個(gè)器官/組織的基底值，并相應(yīng)地減去該數(shù)值。
(vi)PDT方案將患有M2R腫瘤的小鼠麻醉并通過尾部靜脈靜脈內(nèi)(i.v.)注射顏料。立即通過755nm二極管激光器(CeramOptec，Germany)以30J/cm2(100mW/cm2)、39J/cm2(130mW/cm2)或45J/cm2(150mW/cm2)的光劑量經(jīng)皮照射腫瘤5分鐘。在治療之后，將小鼠放回籠中。在黑暗對(duì)照組中，為小鼠i.v.注射光敏劑并將其置于黑暗的籠中24小時(shí)。在光照對(duì)照組中，在45J/cm2下照射小鼠。
(vii)血管的關(guān)閉和滲透性用顏料4(9mg/kg)和光(100mW/cm2，5分鐘)處理患有C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植的小鼠。在處理后立即注射(0.5ml，i.p.)伊文思藍(lán)(EB，1％的PBS溶液)。在處理后的3和24小時(shí)為小鼠照相。在處理后24小時(shí)將小鼠處死并制備每只小鼠的皮瓣并照相。然后移取腫瘤，在其上面帶有皮膚，在-20℃冷凍1小時(shí)，然后制備軸向切片并為切片照相。對(duì)照小鼠與被處理的小鼠同時(shí)注射伊文思藍(lán)，并對(duì)所有小鼠一起進(jìn)行如上所述的方案。
實(shí)施例14.磺化細(xì)菌葉綠素衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞光毒性如以上(ii)中所述測(cè)定化合物4和8在M2R小鼠黑素瘤和H5V小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的光毒性。在增加化合物濃度下預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)，洗滌并照射或保持在黑暗中。
圖1A-1B中所示為雙磺化化合物8分別在H5V和MR2細(xì)胞中的結(jié)果，圖2A-2B為單磺化化合物4(對(duì)照)分別在H5V和MR2細(xì)胞中的結(jié)果?？梢钥闯?，顏料4和8兩者的光毒性為濃度依賴性和光依賴性的，在測(cè)試的范圍內(nèi)沒有任何的黑暗毒性。兩種顏料的LD50相同(～5μM)。并在兩個(gè)細(xì)胞系中相似。
在M2R小鼠黑素瘤細(xì)胞上測(cè)定磺化顏料5和11的光毒性。在圖3和4中可以看出，顏料5和11的光毒性為濃度依賴性和光依賴性的，兩種顏料的LD50相同(～5μM)。在測(cè)試的范圍內(nèi)沒有黑暗毒性。
實(shí)施例15.化合物4的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布在測(cè)試4對(duì)實(shí)體黑素瘤異種移植的PDT的光毒性之前的第一步為如上述部分(vi)中所述測(cè)定顏料的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布。在圖5可以看出，在i.v.注射后的第一個(gè)10分鐘內(nèi)約90％的顏料4以單相動(dòng)力學(xué)模型清除，t0.5為1.65分鐘(表4)。4從血液的快速清除可能意味著只有小部分(即使有的話)結(jié)合于血漿組分，否則清除會(huì)較慢。
表4.4在小鼠血液中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Ke1-消除速率；Vd-分布容積；CL-清除率。
化合物4的生物分布表明，在小鼠的大多數(shù)被測(cè)器官中，顏料水平在注射后立即很高，并在20-30分鐘內(nèi)降低到基底水平，它們的清除率與從血液的清除率類似(圖6)。這些結(jié)果可能表示在脾、肺和心臟中看見的器官的血管系統(tǒng)中截留的血液中的顏料水平。此外，該結(jié)果還暗示了到器官中的顏料擴(kuò)散可以忽略。顏料4迅速地從小鼠體內(nèi)清除并在注射后30分鐘內(nèi)在所有組織中處于基底水平。4從小鼠體內(nèi)的清除率比Pd-Bpheid(3)快得多，其只能在注射后48小時(shí)達(dá)到基底水平(未顯示)。
實(shí)施例16.用磺化顏料4對(duì)CD1裸鼠中的M2R黑素瘤異種移植物的光動(dòng)力學(xué)治療基于上述實(shí)施例15的結(jié)果，設(shè)置化合物4的治療方案為在注射顏料后立即照射5分鐘。在這些實(shí)驗(yàn)(參見上述部分(vii))中，使用與4的最大吸收相匹配的專用醫(yī)用激光器(CeramOptec，Germany，755nm)。為了測(cè)定最佳的藥物/光照方案，用6mg/kg劑量的藥物處理小鼠并增加光強(qiáng)(圖7)。從Kaplan-Meier存活曲線中可以看出，增加光強(qiáng)使小鼠的治愈率從30J/cm2的43％改善到45J/cm2的60％。當(dāng)使用30J/cm2的光強(qiáng)將藥物劑量升高到9mg/kg時(shí)，小鼠存活率有顯著的增加，達(dá)到70％(圖7)。在使用6或9mg/kg處理并保持在黑暗中的動(dòng)物中沒有看到黑暗毒性。
實(shí)施例17.化合物4的光動(dòng)力學(xué)治療的選擇性效果如上述部分(vii)中所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。圖8說明了光動(dòng)力學(xué)治療對(duì)植入小鼠的C6異種移植物中血液灌流的效果(a，e)。與同一動(dòng)物的未照射區(qū)域和未經(jīng)處理的動(dòng)物相比，在PDT之后立即給予伊文思藍(lán)的被處理的動(dòng)物在照射區(qū)域表現(xiàn)出浮腫和增加的由藍(lán)色顯示的EB血管滲漏到間質(zhì)組織(由于白蛋白-伊文思藍(lán)滲漏)(b，f)。在二十四小時(shí)后，可以看出，在被處理的小鼠中，腫瘤周圍為較深著色的藍(lán)色(浮腫，c)，而由于在PDT之后立即發(fā)生血管關(guān)閉，腫瘤保持白色(沒有EB著色)(d)。腫瘤下的肌肉組織以及腫瘤以上和周圍的皮膚(除了被處理區(qū)域內(nèi))為藍(lán)色，表明沒有發(fā)生血管關(guān)閉(c，d)。在未經(jīng)處理的動(dòng)物中，腫瘤與其它組織一樣被著色為藍(lán)色(g，h)。本發(fā)明的化合物選擇性地密封腫瘤中的新生血管，表明其可用于如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)中的異常血管系統(tǒng)的選擇性治療。
實(shí)施例18.化合物4的PDT治療-AMD動(dòng)物模型已經(jīng)針對(duì)從脈絡(luò)膜長(zhǎng)出的新形成血管膜誘導(dǎo)局限性血管阻塞(脈絡(luò)膜新血管形成-CNV)研究了光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)。在年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)中，使用維替泊芬的PDT降低了CNV繼發(fā)的失明的危險(xiǎn)。認(rèn)為PDT的作用機(jī)制涉及釋放活性氧物質(zhì)，其破壞內(nèi)皮細(xì)胞和激活下游的內(nèi)皮凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些事件導(dǎo)致在血管腔內(nèi)形成血栓。
對(duì)于脈絡(luò)膜血管增生的治療已經(jīng)開發(fā)了能夠精確集中和靶向病態(tài)血管并使對(duì)健康視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織的繼發(fā)性損傷效果最小化的高選擇性參數(shù)(激光功率密度或流量、光敏劑劑量和光照距離(DLI))。然而，使用目前臨床使用的唯一的光敏劑(維替泊芬)，通常需要重復(fù)的治療以實(shí)現(xiàn)所需的CNV阻塞效果。因此，側(cè)副組織損傷的危險(xiǎn)增加，并可能成為該治療的顯著副作用。
在這一實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)u(píng)價(jià)了本文中命名為WST11或化合物4的水溶性光敏劑的光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)效力，并將其特征與維替泊芬的那些特征進(jìn)行了比較。
化合物4為純的和穩(wěn)定的細(xì)菌葉綠素衍生物，其分離后為黑紫色晶體粉末。其分子量為916，并可溶解于水溶液中。其具有以下特征(a)有4個(gè)主要的吸收峰(750、530、385和330nm)。最強(qiáng)的吸光度接近其中組織透光度最高的紅外區(qū)(約750nm)；(b)在黑暗中具有非常低的細(xì)胞毒性。因此，可通過光劑量和照射時(shí)間控制組織損傷；(c)其在給藥之后迅速?gòu)捏w內(nèi)清除。因此，使暴露于環(huán)境光照或太陽光照的潛在的皮膚光敏損傷最小化；(d)由于有效的系統(tǒng)間跨越(ISC)活性氧(ROS)的產(chǎn)生量很高。
將WST11粉末在不含內(nèi)毒素的無菌水中稀釋為10mg/ml的濃度，并振搖直到完全溶解。該制劑在4℃下避光保持穩(wěn)定24小時(shí)。為了計(jì)算注射的量，根據(jù)兔的體重進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過耳靜脈將適當(dāng)量的溶液以小團(tuán)(bolus)形式靜脈內(nèi)注射。
使用兔眼模型比較化合物4和維替泊芬(Visudyne，Novartis，Switzerland)對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的PDT效力。使用著色的兔(136“Fauve de Bourgogne”兔，10-12周齡，2.5-3kg，Elevagedes Pins，Epeigne-sur-Deme，F(xiàn)rance)。根據(jù)以下參數(shù)研究急性和長(zhǎng)期PDT對(duì)兔眼的效果1)753nm激光流(25和50J/cm2)、化合物4(也稱為WST11)劑量(2.5和5mg/kg)和光照間距(DLI)為1、5、10和15分鐘。2)689nm激光流(10、50、100J/cm2)，維替泊芬劑量(3、6和12mg/m2)，恒定的DLI為5分鐘。遞送這些對(duì)脈絡(luò)膜及疊加的視網(wǎng)膜具有一系列作用的PDT參數(shù)83秒，以誘導(dǎo)阻塞、閾下阻塞和非阻塞的血管事件。檢查了經(jīng)過治療的兔眼并隨后在PDT后以不同的間隔進(jìn)行間接眼底檢查、熒光素血管造影(FA)和組織學(xué)檢查。使用流量為50J/cm2、5mg/kg藥物劑量和DLI為1分鐘的WST11 PDT在100％的經(jīng)過處理的眼中誘導(dǎo)了與疊加的RPE和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損害有關(guān)的完全脈絡(luò)膜阻塞(圖9A-9D)。較弱的非阻塞PDT參數(shù)(25J/cm2，5mg/kg藥物劑量和DLI為10分鐘)沒有誘導(dǎo)脈絡(luò)膜毛細(xì)血管阻塞也沒有誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損害。使用藥物劑量為12mg/m2、流量為100J/cm2的和DLI為5分鐘的維替泊芬PDT在89％的眼睛中誘導(dǎo)了阻塞事件(通過FA觀察)，并在所有的眼睛中誘導(dǎo)了疊加的視網(wǎng)膜和RPE層的組織學(xué)損傷。使用藥物劑量為3mg/m2、流量為10J/cm2和DLI為5分鐘的較弱的非阻塞的維替泊芬PDT參數(shù)在FA上沒有誘導(dǎo)任何的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管阻塞。然而，在這些眼睛中，在組織學(xué)上觀察到視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織的有限的結(jié)構(gòu)破壞。與維替泊芬類似，WST11 PDT在直到處理后一周誘導(dǎo)了脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的短暫阻塞。與維替泊芬不同，沒有誘導(dǎo)血管阻塞的WST11 PDT參數(shù)也沒有引起RPE或視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞。因此，盡管其具有誘導(dǎo)血管阻塞的能力，但當(dāng)沒有發(fā)生脈絡(luò)膜毛細(xì)血管阻塞時(shí)，WST11 PDT不引起RPE和疊加的視網(wǎng)膜的損害。這些特征的優(yōu)點(diǎn)表明WST11為用于年齡相關(guān)性黃斑變性中CNV的PDT治療的適合候選物。
對(duì)于組織學(xué)，在雙目顯微鏡下解剖摘出的眼睛。使用4mm的活檢穿孔器(biopsy punch)切除處理區(qū)域的全部厚度。將這些組織在戊二醛中固定，在二甲胂酸鹽緩沖液中處理并包在塑料中。使用切片機(jī)得到半薄切片并使用蘇木素-曙紅復(fù)染。使用相差顯微鏡分析這些切片。對(duì)感興趣的特定部位進(jìn)一步處理用于TEM。使用切片機(jī)得到超薄切片并使用乙酸雙氧鈾復(fù)染。
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圖解權(quán)利要求
1.細(xì)菌葉綠素衍生物，其包含至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)和/或在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)，不包括在17位具有游離的CH2CH2COOH或CH2CH2COO-基團(tuán)的五環(huán)細(xì)菌葉綠素衍生物，和沒有中心金屬原子并在17位有-CH2CH2COOH基團(tuán)、在15位有-CH2COOH或-COOH基團(tuán)、在13位有-COOH基團(tuán)、在2、7、12、18位有甲基、和在3和8位有乙基的四環(huán)細(xì)菌葉綠素衍生物。
2.權(quán)利要求1的細(xì)菌葉綠素衍生物，其包含兩個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)。
3.權(quán)利要求1的細(xì)菌葉綠素衍生物，其包含三個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)。
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中所述帶負(fù)電荷的基團(tuán)選自COO-、COS-、SO3-、和/或PO32-。
5.權(quán)利要求1的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中所述在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)選自COOH、COSH、SO3H和/或PO3H2。
6.權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的細(xì)菌葉綠素衍生物，其衍生自天然或合成的細(xì)菌葉綠素衍生物，包括其中中心Mg原子已經(jīng)被除去或由其它金屬原子代替的化合物。
7.式I或II的權(quán)利要求1的細(xì)菌葉綠素衍生物 其中M表示2H或選自二價(jià)的Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，和三價(jià)的Fe、Mn和Cr的金屬原子；R1、R2、和R4各自獨(dú)立地為Y-R5；Y為O、S或NR5R6；R3選自-CH＝CH2、-C(＝O)-CH3、-C(＝O)-H、-CH＝NR7、-C(CH3)＝NR7、-CH2-OR7、-CH2-SR7、-CH2-NR7R′7、-CH(CH3)-OR7、-CH(CH3)-SR7、-CH(CH3)-NR7R′7、-CH(CH3)Hal、-CH2-Hal、-CH2-R7、-CH＝CR7R′7、-C(CH3)＝CR7R′7、-CH＝CR7Hal、-C(CH3)＝CR7Hal、和-C≡CR7；R5、R6、R7和R′7各自獨(dú)立地為H或選自(a)C1-C25烴基，其任選包含一個(gè)或多個(gè)雜原子、碳環(huán)或雜環(huán)部分，和/或任選被選自鹵素、氧代、OH、SH、CHO、NH2、CONH2、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、和在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)取代；(b)氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；和(c)當(dāng)Y為O或S時(shí)，R5可進(jìn)一步為R8+；m為0或1；和R8+為H+或陽離子；條件是(i)R5、R6、R7和R′7中的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)為由帶負(fù)電荷的基團(tuán)或在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)取代的上述(a)中定義的烴鏈；或(ii)R1、R2和R4中的至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)為OH、SH、O-R8+或S-R8+；或(iii)R1、R2和R4中的至少一個(gè)為OH、SH、O-R8+或S-R8+，和R5、R6、R7和R′7中的至少一個(gè)為由帶負(fù)電荷的基團(tuán)或由在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為酸性基團(tuán)的帶負(fù)電荷的基團(tuán)取代的烴鏈；或(iv)R1、R2和R4中的至少一個(gè)為OH、SH、O-R8+或S-R8+，和R5、R6、R7和R′7中的至少一個(gè)為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；或(v)R5、R6、R7和R′7中的至少一個(gè)為由帶負(fù)電荷的基團(tuán)或由在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)取代的烴鏈，和R5、R6、R7和R′7中的至少一個(gè)為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；但是排除其中M如定義的、R3為-C(＝O)CH3、R1為OH或OR8+、R2為-OCH3的式I的化合物，和其中M為2H、R3為-C(＝O)CH3、R1和R2和R4為OH、m為0或1的式II的化合物。
8.權(quán)利要求7的式I或II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中所述帶負(fù)電荷的基團(tuán)選自COO-、COS-、SO3-和/或PO32-。
9.權(quán)利要求7的式I或II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中所述在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的所述酸性基團(tuán)選自COOH、COSH、SO3H和/或PO3H2。
10.權(quán)利要求7的式I或II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中R1為Y-R5；Y為O、S或NH；R5為由選自O(shè)H、SH、SO3H、NH2、CONH2、COOH、COSH、PO3H2的官能團(tuán)取代的烴鏈。
11.權(quán)利要求7的式I或II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中R5為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基。
12.權(quán)利要求1的式I或II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中包含中心Pd金屬原子。
13.權(quán)利要求7的式I的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中M為Pd；R1為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R2為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3；R8+為單價(jià)陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+；和n為1到10的整數(shù)，優(yōu)選2或3。
14.權(quán)利要求7的式II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中M表示2H，二價(jià)的Pd、Cu、或Zn，或三價(jià)的Mn；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；或Y-R5，其中Y為O、S或NH，R5為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；R2為C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更優(yōu)選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)n-SO3-R8+、-CH＝N-(CH2)n-COO-R8+、-CH＝N-(CH2)n-PO32-(R8+)2、-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+或-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價(jià)陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+、更優(yōu)選為K+；和m為1，n為1到10的整數(shù)，優(yōu)選為2或3。
15.權(quán)利要求7的式II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中M為二價(jià)的Pd；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、或Y-R5，其中Y為O、S或-NH，R5為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的殘基；R2為C1-C6烷氧基，優(yōu)選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)n-SO3-R8+、或-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、NH-(CH2)n-COO-R8+、NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價(jià)陽離子，優(yōu)選為K+；和m為1，n為2或3。
16.權(quán)利要求13的式I的細(xì)菌葉綠素衍生物，其包括化合物鈀細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺鉀鹽。
17.權(quán)利要求15的式II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其包括化合物鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-(3-磺基丙基亞胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽；銅(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；鋅31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；錳(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-羧基乙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(3-膦酸基丙基)酰胺三鉀鹽；和鈀31-(3-磺基丙氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽。
18.鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽。
19.藥物組合物，其包括權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的細(xì)菌葉綠素衍生物和可藥用載體。
20.用于光動(dòng)力學(xué)治療的權(quán)利要求19的藥物組合物。
21.用于血管靶向光動(dòng)力學(xué)治療的權(quán)利要求20的藥物組合物。
22.用于腫瘤包括轉(zhuǎn)移性腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療的權(quán)利要求20或21的藥物組合物。
23.用于黑素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、或前列腺癌的光動(dòng)力學(xué)治療的權(quán)利要求22的藥物組合物。
24.用于年齡相關(guān)性黃斑變性的光動(dòng)力學(xué)治療的權(quán)利要求20或21的藥物組合物。
25.用于良性前列腺肥大的光動(dòng)力學(xué)治療的權(quán)利要求20或21的藥物組合物。
26.用于腫瘤診斷的權(quán)利要求19的藥物組合物。
27.用于殺死細(xì)胞或包括細(xì)菌和病毒的傳染物的權(quán)利要求19的藥物組合物。
28.用于在照射生物制品時(shí)體外殺死所述制品中的細(xì)胞和包括細(xì)菌和病毒的傳染物的權(quán)利要求27的藥物組合物。
29.權(quán)利要求28的藥物組合物，其中所述生物制品為血液。
30.權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的化合物用于生產(chǎn)用于光動(dòng)力學(xué)治療的藥物組合物中的用途。
31.權(quán)利要求30的用途，用于腫瘤包括轉(zhuǎn)移性的腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療。
32.權(quán)利要求31的用途，用于黑素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、或前列腺癌的光動(dòng)力學(xué)治療。
33.權(quán)利要求30的用途，用于年齡相關(guān)性黃斑變性的光動(dòng)力學(xué)治療。
34.權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的化合物用于生產(chǎn)用于腫瘤診斷的藥物組合物中的用途。
35.權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的化合物用于生產(chǎn)殺死細(xì)胞或包括細(xì)菌和病毒的傳染物的藥物組合物中的用途。
36.腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療方法，其包括(a)對(duì)有需要的個(gè)體給藥權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的化合物；和(b)照射腫瘤部位。
37.年齡相關(guān)性黃斑變性的光動(dòng)力學(xué)治療方法，其包括(a)對(duì)有需要的個(gè)體給藥權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的化合物；和(b)照射黃斑變性部位。
38.腫瘤診斷方法，其包括(a)對(duì)懷疑患有腫瘤的受試者給藥權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的化合物；和(b)通過標(biāo)準(zhǔn)程序照射受試者并測(cè)量被懷疑區(qū)域的熒光，其中較強(qiáng)熒光表示腫瘤部位。
39.在使用光敏劑的光動(dòng)力學(xué)治療方法中，改進(jìn)之處在于所述光敏劑為權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的細(xì)菌葉綠素衍生物。
40.在使用光敏劑的腫瘤診斷方法中，改進(jìn)之處在于所述光敏劑為權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的細(xì)菌葉綠素衍生物。
41.在使用光敏劑的體外殺死細(xì)胞或包括細(xì)菌和病毒的傳染物的方法中，改進(jìn)之處在于所述光敏劑為權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的細(xì)菌葉綠素衍生物。
42.作為中間體的化合物鈀細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧琥珀酰亞胺)酯鈉鹽。
43.制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙?；4為基團(tuán)-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的權(quán)利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)；和(ii)分離所需的式II的化合物。
44.用于制備鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細(xì)菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽的權(quán)利要求43的方法，其包括(i)使Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)2-SO3H的?；撬嵩贙+-緩沖液中反應(yīng)；和(ii)分離標(biāo)題化合物。
45.制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團(tuán)-NH-(CH2)n-COO-R8+、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的權(quán)利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)；和(ii)分離所需的式II的化合物。
46.制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙?；4為基團(tuán)-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的權(quán)利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8-緩沖液中反應(yīng)；和(ii)分離所需的式II的化合物。
47.制備其中R1和R4包含同樣的帶負(fù)電荷的基團(tuán)的權(quán)利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應(yīng)的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與過量的氨基磺酸、氨基羧酸或氨基膦酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)；和(ii)分離所需的式II的13，17-二取代衍生物。
48.制備其中R1和R4各自為基團(tuán)-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R2為-OCH3、R3為乙?；?、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的權(quán)利要求7的式II化合物的方法，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯(lián)；(ii)使得到的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)，從而得到在17位具有唯一帶負(fù)電荷的基團(tuán)的式I的化合物；(iii)將步驟(ii)的產(chǎn)物與過量的H2N-(CH2)n-SO3H在R8+-緩沖液中反應(yīng)；和(iv)分離所需的式II的化合物。
49.制備其中R1和R4各自為基團(tuán)-NH-(CH2)n-COO-R8+、R2為-OCH3、R3為乙?；?、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的權(quán)利要求7的式II化合物的方法，該方法包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯(lián)；(ii)使得到的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)，從而得到在17位具有唯一帶負(fù)電荷的基團(tuán)的式I的化合物；(iii)將步驟(ii)的產(chǎn)物與過量的H2N-(CH2)n-COOH在R8+-緩沖液中反應(yīng)；和(iv)分離所需的式II的化合物。
50.制備其中R1和R4各自為基團(tuán)-NH-(CH2)n-PO32-R8+、R2為-OCH3、R3為乙?；?、R8+為單價(jià)陽離子、m為1、n為1到10的權(quán)利要求7的式II的化合物的方法，其包括(i)使相應(yīng)的其中R1為OH的式I的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯(lián)；(ii)將得到的M-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基-磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8+-緩沖液中反應(yīng)，從而得到在17位具有唯一帶負(fù)電荷的基團(tuán)的式I的化合物；(iii)將步驟(ii)的產(chǎn)物與過量的H2N-(CH2)n-PO3H2在R8+-緩沖液中反應(yīng)；和(iv)分離所需的式II的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于光動(dòng)力治療和診斷的陰離子型水溶性四環(huán)和五環(huán)的細(xì)菌葉綠素衍生物(Bchl)，其包含至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)和/或在生理pH條件下轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)，優(yōu)選具有通過酯或酰胺鍵結(jié)合于四環(huán)或五環(huán)Bchl分子的1文檔編號(hào)A61K31/40GK1741801SQ200380108906
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2003年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月17日
發(fā)明者阿維格多·謝爾茲, 亞歷山大·布蘭迪斯, 奧哈德·梅佐爾, 約拉姆·薩洛曼, 雨果·希爾 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司