專利名稱：鈀取代的細菌葉綠素衍生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鈀取代的細菌葉綠素衍生物、其制備方法和中間體、和包含所述鈀取代的細菌葉綠素衍生物的藥用組合物、及其在體內(nèi)光動力療法和診斷領(lǐng)域以及在體外光動力殺傷病毒和微生物領(lǐng)域的應(yīng)用。定義和縮寫B(tài)Chl＝細菌葉綠素a(含Mg的7，8，17，18-四氫卟啉，具有一個植基或香葉基香葉基位于位置173、一個COOCH3基團位于位置132、一個H原子位于位置132、一個乙酰基位于位置3和一個乙基位于位置8)。
BChlide＝細菌脫植基葉綠素a(衍生自BChla的C-172游離羧酸)。
BPhe＝細菌脫鎂葉綠素a(其中中心Mg原子被2個H原子取代的BChl)。
BPheid＝細菌脫鎂葉綠甲酯一酸a(衍生自Bphe的C-172游離羧酸)。
Pd-BPheid＝Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯一酸a(衍生自Bphe的C-172游離羧酸，具有一個中心Pd原子、一個COOCH3基團位于位置132、一個H原子位于位置132、一個乙?；挥谖恢?和一個乙基位于位置8)。
在本說明書中，全文用所述細菌葉綠素衍生物的IUPAC編號。采用該命名法，雖然所述天然細菌葉綠素在位置132和172攜帶二個羧酸酯，但是它們在位置133和173被酯化。
背景技術(shù)：
人們對利用光敏劑治療癌癥興趣目益增加。根據(jù)被稱為光動力療法(PDT)的該技術(shù)，將光敏劑例如用于腫瘤，并且在原位光敏化產(chǎn)生使惡性腫瘤細胞中毒的化合物。
迄今為止，采用卟啉和相關(guān)化合物的光動力療法已具有悠久的歷史。二十世紀(jì)四十年代(1940s)的早期研究，證明可以引起卟啉在被照射的腫瘤組織中發(fā)熒光。所述卟啉看來在這些組織中累積，并能夠在原位吸收光，提供根據(jù)熒光的部位探測腫瘤的一種方法。在光動力療法的早期階段，一種既用于檢測又用于治療、廣泛應(yīng)用的制劑是一種血卟啉的粗制衍生物，也稱為血卟啉衍生物HpD，或是按照Lipson和合作者在J Natl Cancer Inst(1961)261-8中描述的方法制備的Lipson衍生物。已經(jīng)用該制劑進行大量的研究工作，并且Dougherty和合作者報道了該衍生物在治療惡性腫瘤方面的用途(Cancer Res(1978)382628-2635；J Natl CancerInst(1979)62231-237)。
Dougherty和合作者制備了一種更有效形式的血卟啉衍生物，所述衍生物包含聚集體重量(aggregate weight)＞10kd的HpD的一部分。可用于光動力療法的該種形式的藥物是美國專利4,649,151的主題，是市場上可得到的，并正處于臨床試驗中。
已經(jīng)完全確立了應(yīng)用吸收光的化合物，尤其是與卟啉相關(guān)的那些化合物的一般原則，作為系統(tǒng)給藥時用于腫瘤的一種療法。這些制劑破壞腫瘤組織但不破壞正常組織的鑒別能力(differential ability)，是由于這些制劑對有害細胞的尋靶效應(yīng)(homing effect)產(chǎn)生的。(參見，例如，Dougherty，T.J.等，“CancerPrinciples and Practice of Oncology”(1982)，V.T.de Vita，Jr.等編著，第1836-1844頁)。人們一直努力通過將血卟啉衍生物綴合到抗體來提高尋靶能力(homing ablity)。(參見，例如，Mew，D.等，J Immunol.(1983)1301473-1477)。這些藥物在殺傷細胞中的機制看來涉及照射后單線態(tài)氧的生成(Weishaupt，K.R.等，Cancer Research(1976)第2326-2329頁)。
美國專利4,753,958中也已經(jīng)描述了，采用局部給藥，應(yīng)用血卟啉衍生物或其有效成分治療皮膚病。另外，已經(jīng)用所述藥物消毒含可感染生物如細菌和病毒的生物樣品(Matthews，J.L.等，Transfusion(1988)81-83)。也已經(jīng)將各種其它光敏化合物用于該目的，如例如美國專利第4,727,027號中所陳述的。
一般來說，應(yīng)用各種各樣結(jié)構(gòu)的輻照致敏劑來選擇性地削弱生物底物在體內(nèi)和體外的作用的方法是本領(lǐng)域已知的?？捎糜谶@些方法的化合物必須對待削弱或破壞的靶生物底物具有差別親和力，還必須能夠吸收光，使得照射藥物以某種方式被活化，以便對相鄰的組合物和物質(zhì)具有有害作用。
因為人們總是希望使治療學(xué)和診斷學(xué)性能的最佳化，所以一直在探索傳統(tǒng)用于治療和診斷的卟啉藥物的變化。已經(jīng)提出了許多普通類型的光敏劑，總的來講包括酞菁、補骨脂素相關(guān)化合物和具有共振體系的多環(huán)化合物。最類似于本文公開的化合物是各種脫鎂葉綠甲酯一酸衍生物，其在光動力療法中的應(yīng)用已經(jīng)描述于Nihon MetaphysicsCompany的EPO申請220686中；用于該目的的脫鎂葉綠甲酯一酸的乙二胺衍生物，描述于Tama Seikayaku，KK.的日本申請J85/000981中；以及日本申請J88/004805涉及的10-羥基脫鎂葉綠甲酯一酸-a。另外，Beems，E.M.等，在Photochemistry and Photobiology(1987)46639-643中公開了用作光敏劑的細菌葉綠素-a的二種衍生物-細菌葉綠酸-a(也稱為細菌脫鎂葉綠甲酯一酸-a，其在細菌葉綠素-a中缺乏衍生的植醇(phythl alcahol))和細菌二氫卟酚-a(其既缺乏植基又缺乏所述Mg離子)。這些作者注意這些衍生物，因為基于與細菌葉綠素-a相比這些衍生物的水溶性增強，它們是有利的。
EP 584552和WO97/19081，兩個專利均屬于Yeda Research andDevelopment Co.Ltd.，分別描述了葉綠素和細菌葉綠素衍生物及其作為PDT藥物的用途，以及金屬化的細菌葉綠素及其通過對應(yīng)的Cd-BChl衍生物的金屬轉(zhuǎn)移作用的制備方法。
問題仍是發(fā)現(xiàn)合適的可用于光動力療法和診斷的光敏劑，所述光敏劑最適于特定靶和特定范圍。因此，本發(fā)明提供了另一類的光敏化合物，為了用于具體治療和診斷情況，所述光敏化合物成為候選化合物所有組成部分的一部分。
本發(fā)明因此涉及式I、I’或I”化合物
其中A代表OH，OR1，-O-(CH2)n-Y，-S-(CH2)n-Y，-NH-(CH2)n-Y，-O-(CH2)2-NH2，-O-(CH2)2-OH，-NH-(CH2)n-+No，X-，-NH-(CH2)2-NH＝BOC或-N-(CH2-CH＝CH2)2其中R1代表Na+、K+、(Ca2+)0.5、(Mg2+)0.5、Li+、NH4++NH3-C(CH2OH)3、+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH，+NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH或+N(Cn′H2n′+1)4；R2代表H、OH或COOR4，其中R4為C1-C12烷基或C3-C12環(huán)烷基；R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；n為1、2、3、4、5或6，Y為-NR′1R′2或-+NR′1R′2R′3，X-，其中R′1、R′2和R′3相互獨立地代表-CH3或-C2H5；X為F、Cl、Br或I，n′為1、2、3或4，并且其中*表示不對稱碳，而-代表飽和單鍵或不飽和雙鍵。
此外，本發(fā)明涉及以上新化合物的制備方法。
因此，一方面，本文描述了實現(xiàn)削弱或破壞靶生物底物的方法，所述方法包括用一定量的式I、I’或I”化合物處理靶底物，以有效光致敏所述底物，然后用被式I、I’或I”化合物吸收的波長譜帶中的輻照所述靶底物一段時間，以有效削弱或破壞所述底物。
另一方面，本發(fā)明因此涉及包括至少一種作為活性劑的式I、I’或I”化合物以及藥學(xué)上可按受的載體的藥用組合物。根據(jù)眾所周知的光動力技術(shù)，所述組合物可用于腫瘤的體內(nèi)光動力療法和診斷并可用于殺傷樣品中以及活組織中的細胞、病毒和細菌、寄生物和真菌。
此外，本發(fā)明涉及應(yīng)用式I、I’或I”化合物制備可用于光動力療法的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用本發(fā)明化合物制備可用于診斷和活體外殺傷細菌、寄生物、病毒和真菌的組合物。
本發(fā)明還涉及下文作為中間體的相應(yīng)的式II或式III的?；群退狒?。
圖2和圖3分別描述了由快速原子轟擊進行的Pd-BPheid的低分辨率質(zhì)譜和高分辨率質(zhì)譜(FAB-MS)。
圖4顯示在用Pd-BPheid或BChl-SerOMe的PDT后A431細胞的時間依賴性形態(tài)變異[在所述圖中，Bchl-Ser代表BChl-SerOMe，即BChl的絲氨酰甲酯]。
圖5顯示被測Pd-BPheid和BChl-SerOMe對ECV-304細胞的光毒性。
圖6顯示Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯對培養(yǎng)的M2R小鼠黑素瘤細胞的光毒性。(A)將色素溶于95％乙醇中，然后在培養(yǎng)基+10％血清中進一步稀釋至所示濃度至1％乙醇。(B)將色素直接溶于培養(yǎng)基+10％血清中。
圖7顯示Pd-Bpheid對培養(yǎng)的M2R小鼠黑素瘤細胞和人H29結(jié)腸癌細胞的光毒性。
圖8顯示M2R小鼠黑素瘤用溶于Cremophor和稀釋于鹽溶液的Pd-BPheid(2.5mg/Kg)進行的PDT。
圖9顯示M2R小鼠黑素瘤用溶于鹽溶液和用Cremophor稀釋的Pd-BPheid(2.5mg/Kg)進行的PDT。


圖10圖示說明用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe[在所述圖中為Pd-Bchl-Ser]進行PDT后，治愈原發(fā)性C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
圖11顯示外科手術(shù)(切斷術(shù))后或用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe[在所述圖中為Pd-Bchl-Ser]進行PDT后，CD1裸鼠中的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的表象(appearance)。
發(fā)明詳述在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的化合物具有以下光學(xué)構(gòu)型的以下結(jié)構(gòu)式 其中A為如上所述。
如果在上述結(jié)構(gòu)中代表C7和C8以及C17和C18之間鍵的虛線為一個飽和單鍵時，則編號7、8、17和18的碳原子為不對稱碳原子。如果R2或R3為H時，則C132為一個不對稱碳原子。
在氧存在下或于環(huán)境空氣下及在光作用下，上述C7-C8和C17-C18鍵的氧化作用可以發(fā)生，產(chǎn)生在所述位置C7-C8和C17-C18具有雙鍵的化合物。
本發(fā)明的式I’和式I”化合物為式I化合物的氧化形式，并可以通過描述于Chlorophyll(由Scheer H.(編著)，CRC Press，1991，第147-209頁)中的方法獲得。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述化合物是其中A為OR1的那些化合物。
在一個最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明化合物為Pd-PBheid(本文有時也命名為Pd-BChl-COOH)，這是其中A為OH、具有以下結(jié)構(gòu)的式I化合物 其中A為OH的式I化合物的制備方法之一，至少包括以下步驟a)將M-BPheid-173-Z化合物聯(lián)合脫金屬和水解，其中Z為植基、香葉基香葉基(gg)或SerOMe(絲氨酰O-甲酯)，而M為選自Mg、Cd或Zn的金屬；b)用Pd試劑將Pd摻入(a)中獲得的化合物中，由此獲得Pd-BPheid，并且，如有需要，c)隨后，將獲得的Pd-BPheid與對應(yīng)的式R1-H或A-H化合物反應(yīng)，生成對應(yīng)的R1鹽或其中A不為OH的化合物。
在一個優(yōu)選實施方案中，本方法涉及Pd-BPheid的制備，而細菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中脫金屬并水解，然后將獲得的細菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)在步驟(b)中與Pd試劑反應(yīng)，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
式I化合物的另一種制備方法至少包括以下步驟
a)對BChlide-173-Z進行金屬轉(zhuǎn)移，獲得對應(yīng)的其中Z為植基、gg或SerOme的Pd-BPheid-173-Z，b)水解所獲得的化合物，和c)隨后，任選地將獲得的Pd-BPheid與對應(yīng)的式R1-H或A-H化合物反應(yīng)，生成對應(yīng)的R1鹽或其中A不為OH的化合物。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法涉及Pd-BPheid的制備，而細菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)進行金屬轉(zhuǎn)移以由Pd取代天然中心Mg原子，然后將獲得的其中Z為植基的Pd-BPheid-173-Z在步驟(b)中進行水解，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
式I化合物的另一種制備方法至少包括以下步驟a)酶促水解其中Z為植基或香葉基香葉基的BChlide-173-Z，獲得Bchlide；b)將(a)的所述BChlide進行酸性脫金屬；c)用Pd試劑將Pd摻入到(b)的所述脫金屬的BPheid中；和d)隨后，任選地將獲得的Pd-BPheid與對應(yīng)的式R1-H或A-H化合物反應(yīng)，生成對應(yīng)的R1鹽或其中A不為OH的化合物。
在式I化合物的上述制備方法中，所述Pd試劑可以是在這類結(jié)構(gòu)中提供Pd的任何方便的反應(yīng)性化合物，例如乙酸鈀和氯化鈀。
經(jīng)采用抗壞血酸鈉或抗壞血酸的兩步法，或者經(jīng)采用6-O-棕櫚酰-L-抗壞血酸的一步法，可以實現(xiàn)上述方法中的Pd的摻入。
通過將Pd-BPheid(Pd-BChl-COOH)與對應(yīng)的A-H化合物反應(yīng)，可以獲得其中A不同于OH和OR1的本發(fā)明化合物。
以上式II和式III化合物是本發(fā)明式I化合物的中間體。經(jīng)采用適合于生成酰氯的任何試劑例如SOCl2，可以獲得式II的?；?，即Pd-BPheid-COCl。
通過用乙酸酐使式I、I’、I”化合物脫水，可以獲得式III的酸酐。
通過使這些中間體II和III與對應(yīng)的化合物AH反應(yīng)，可以獲得式I、I’或I”化合物。
本發(fā)明還包括式I、I’和I”化合物游離酸的藥學(xué)上可接受的鹽。用本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如通過使游離酸或其鹽與無機或有機試劑反應(yīng)，可以制備所述鹽，所述無機或有機試劑例如但不限于NaOH、KOH、鈣或鎂合適的鹽、LiOH、NH4OH、氫氧化四烴基銨例如氫氧化四乙銨或N-甲基葡糖胺、葡糖胺和三乙醇胺。
本發(fā)明化合物可用于靶生物底物的光動力療法和診斷。所謂“靶生物底物”是指在采用療法或其它矯正作用例如滅菌的環(huán)境中、或在應(yīng)用診斷的環(huán)境中需要知道的位置中不希望有的任何細胞、病毒或組織行。
按照本發(fā)明，將所述藥物注射到受治療者體內(nèi)，并容許在靶底物中達到最佳濃度。然后將所述靶底物暴露于適于所給予化合物吸收光譜的波長下的輻照。通過伴隨的所述靶底物溫度的升高，可以提高所述化合物的作用。
采用適于計劃用途的常規(guī)賦形劑，配制本發(fā)明化合物供本發(fā)明的方法之用。對于系統(tǒng)給藥，一般來說，使用緩沖水性組合物，其含有足夠的無毒去垢劑以溶解所述活性化合物。因為本發(fā)明化合物一般不大溶于水，因此可以使用增溶量的這種去垢劑。合適的無毒去垢劑包括但不限于吐溫80、多種膽汁鹽例如甘氨膽酸鈉(sodium glycholate)、各種膽汁鹽類似物例如梭鏈孢酸鹽。替代組合物應(yīng)用脂質(zhì)體載體。采用常規(guī)緩沖液例如Hank溶液、Ringer溶液或磷酸鹽緩沖液，于所需的pH下緩沖所述溶液。也可以包括不干擾所述藥物活性的其它成分，諸如穩(wěn)定量的蛋白例如血清白蛋白、或低密度脂蛋白或高密度脂蛋白(分別為LDL和HDL)。
系統(tǒng)性制劑可以經(jīng)注射給予，例如靜脈內(nèi)(i.v.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、肌內(nèi)、或皮下(s.c.)注射，或者可以通過經(jīng)膜或經(jīng)皮技術(shù)給予系統(tǒng)性制劑。適于經(jīng)皮或經(jīng)膜給藥的制劑包括含有滲透劑的噴霧劑和栓劑，所述滲透劑通常可以是上述去垢劑。
對于局部給藥，所述制劑也可以含有滲透劑，為軟膏、油膏、搽劑、乳膏或油的形式。合適的既可用于系統(tǒng)給藥又可用于局部給藥的制劑在Remington′s Pharmaceutical Sciences，最新版，Mack PublishingCo.，Easton，PA中找到。
對于活體外治療應(yīng)用，例如用于輸血的血液或血漿或者血液制品的制劑，不需要特殊的配制，但將本發(fā)明化合物溶于合適的相容性溶劑中并在輻照前以合適的濃度、通常約為1-100μg/ml，混合到所述生物流體中。
對于光動力治療應(yīng)用和診斷應(yīng)用，合適的劑量范圍將隨應(yīng)用的模式和化合物的選擇以及待治療或診斷的病癥的性質(zhì)而變化。然而，一般來說，合適的劑量約為0.01-50mg/kg體重，最好是0.1-10mg/kg。對于局部給藥，通常使用的總劑量約為5-100mg。
用于光動力活體外療法的通用方法類似于由Mattews，J.L.等，Transfusion(參見上文)描述的那些方法。
簡而言之，對于系統(tǒng)給藥，給藥后經(jīng)過一段合適的時間，通常為數(shù)分鐘至2天，以便在靶生物底物中使本發(fā)明化合物的濃度達到最佳。一般來說，這種底物將是腫瘤血管系統(tǒng)、腫瘤細胞或任何其它腫瘤組分，并通過測量與背景相比靶組織的光吸收，可以監(jiān)測所述化合物的定位。已經(jīng)達到最優(yōu)化后，用范圍為740-800nm或500-600nm或700-900nm的合適譜帶的輻照；以5-750mW/cm2的輻射率和100-1000J/cm2的總能量，，照射所述靶生物底物。
對于局部療法，定位是快速的，因此此后可以提供相應(yīng)的輻照。對于生物液體活體外的療法，在達到靶組織最佳結(jié)合/攝取后應(yīng)用輻照。輻照通量(radiationfluence)約為1-10J/cm2。因為不需要穿透組織，所以可以使用較低的總能量。
本發(fā)明組合物包括至少一種如上定義的式I、I’或I”化合物以及生理上可接受的載體。這些組合物可以為溶液、脂乳濁液或凝膠的形式或為脂質(zhì)體或納級粒子(nanoparticles)的形式。選擇合適的載體以使本發(fā)明化合物在靶底物的濃度最大。這類載體的實例包括但不限于“吐溫80”、聚乙二醇例如PEG400、“Cremophor EL”、丙二醇、乙醇、羅勒油、膽汁鹽和膽汁鹽類似物及它們的混合物。脂質(zhì)體制劑可以基于例如二豆蔻?；字Ｄ憠A或磷脂酰甘油。所述載體也可以包括棕櫚?；字Ｄ憠A。
當(dāng)使用納粒子時，它們可以為PEG包衣的聚乳酸納級粒子的形式。在脂乳濁液的形式中，通常使用低密度脂蛋白和甘油三酯。
在本發(fā)明組合物中，本發(fā)明化合物的量為組合物總重量的0.01-20％，最好是0.05％-5％(重量)。
現(xiàn)在通過以下非限制性實施例說明本發(fā)明。
實施例實施例1.Pd-BPheid的制備用以下3-步法從BChla制備Pd-BPheid。(a)細菌葉綠素a(BChla)的分離如下從凍干細菌嗜硫小紅卵菌(Rhodovolum sulfidophilum)中提取BChla將凍干細胞(100gr)研磨成粉，用總共1250ml丙酮洗滌5次，以部分洗去類胡蘿卜素，過濾該混合物，用無水甲醇從所述固體物中提取(約1200ml，4-5次過濾)BChla。過濾后，將深藍綠色溶液真空下部分蒸發(fā)，用石油醚(b.p.80-100℃，約1300ml)萃取所述濃縮溶液(約500ml)2-3次，進一步除去類胡蘿卜素，用甲醇(約550ml)萃取石油醚相2次。然后除去該相，將混合的甲醇相真空蒸發(fā)，并將藍綠色殘留物再溶于甲醇-丙酮(1∶3，v/v)，上樣于用甲醇-丙酮(1∶3，v/v)平衡的DEAE-瓊脂糖凝膠柱(3×10cm)。用甲醇-丙酮(1∶3，v/v)洗脫BChla，蒸發(fā)甲醇-丙酮混合物，將干燥的Bchla再溶于精確體積(用于吸收光譜)的乙醚中，通過棉絨(coton wool)過濾，去除溶解的柱材料。在最后一次蒸發(fā)后，將所述固體色素于氬氣下避光貯藏于-20℃。提取得率約700mgBChla/100g凍干細胞。
如先前所述制備DEAE-瓊脂糖凝膠柱(Omata和Murata，1983，“通過用DEAE-瓊脂糖凝膠C1-6B和瓊脂糖凝膠C1-6B的柱層析，制備葉綠素a、葉綠素b和細菌葉綠素a”，Plant Cell Physiol.，第24卷，第1093-1100頁)。簡而言之，用蒸餾水洗滌DEAE-瓊脂糖凝膠柱，然后通過將其懸浮于1M乙酸鈉緩沖液(pH＝7)，使其轉(zhuǎn)化成乙酸鹽形式。將所述漿液用丙酮洗滌3次，最后懸浮于甲醇-丙酮(1∶3，v/v)，貯藏于5℃。(b)細菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)的制各將如(a)中得到的粗制Bchla提取物(含一些殘留類胡蘿卜素的約100mg Bchla)溶于80％三氟乙酸水溶液(約15ml)中，所述三氟乙酸水溶液已經(jīng)用氮通氣10分鐘。于環(huán)境溫度下攪拌所述溶液2小時。然后將反應(yīng)混合物傾入水(約250ml)中，并用氯仿萃取。將提取物用水洗滌2次，經(jīng)無水Na2SO4干燥。蒸發(fā)所述溶劑后，殘留物在二氧化硅上層析(3cm×15cm柱，Kieselgel 60，Merck)，用甲醇的氯仿溶液的分段梯度2％、5％、10％、15％洗脫。首先，洗出類胡蘿卜素和少量的細菌脫鎂葉綠素，然后洗出異細菌脫鎂葉綠素和類胡蘿卜素。于10％甲醇的氯仿溶液，開始收集產(chǎn)物并通過TLC(Kieselgel，氯仿-甲醇，9∶1)監(jiān)測。蒸發(fā)所述產(chǎn)物(60mg)，然后將溶解于CHCl3的殘留物經(jīng)UltraPore膜過濾，除去可能在其它情況下引起氧化作用的二氧化硅。(c)將鈀摻入細菌脫鎂葉綠甲酯一酸(Bpheid)中將如(b)中得到的BPheid(100mg)和乙酸鈀(80mg)溶于二氯甲烷(約10ml)，然后加入到200mg抗壞血酸鈉在50ml甲醇中的懸浮液中。于室溫下在密閉的燒瓶中攪拌所述反應(yīng)混合物，然后每15-20分鐘從所述反應(yīng)混合物中收集樣品，并記錄其光吸收。約4小時后，大多數(shù)于357nm的BPheid吸收被于330nm和390nm的Pd-BPheid吸收取代。
將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到氯仿/水溶液(200ml；50∶50v/v)中，并在分液漏斗中振蕩。收集有機相，用水洗滌，經(jīng)無水氯化鈉干燥，然后蒸發(fā)。將干燥的物質(zhì)加入到80mg乙酸鈀中，重復(fù)以上步驟直到于357nm的所述殘留的吸收完全消失，并且于765nm的吸收(紅峰-最大躍遷)和于330nm的最大吸收之間的比率達到數(shù)值≈2.4(在氯仿中)為止。
將所述干燥反應(yīng)混合物溶解于最小體積的2∶1氯仿∶丙酮中，然后上樣于已經(jīng)用丙酮預(yù)平衡的CM-瓊脂糖凝膠柱(150mm×25mm)。首先用丙酮洗滌所述柱，并棄去洗脫的第一流分。然后用9∶1丙酮∶甲醇洗滌所述柱。二條帶占優(yōu)勢，并被洗出一第一條為主要產(chǎn)物，而第二條為加氧(allomerized)副產(chǎn)物(被棄去)。將所述產(chǎn)物濃縮幾乎至干，然后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中的50∶50氯仿∶水體系中。充分振搖所述混合物，分離有機相，經(jīng)無水硫酸鈉(或氯化鈉)干燥，然后蒸發(fā)至干。實施例2.Pd-BPheid的制備(a)Bchla的分離如以上實施例1(a)進行所述方法的該步驟。(b)Pd-Bpheid的制備將6-O-棕櫚酰-L-抗壞血酸(246mg，593μmol)溶于MeOH(84ml)，并用N2通過所述溶液。將Bpheid(92mg，151μmol)和Pd(CH3COO)2(83mg，370μmol)溶于CHCl3(34ml，用N2脫氣)，然后加入到所述甲醇溶液中。于惰性氛圍下經(jīng)連續(xù)攪拌保持所述混合物，并通過每幾分鐘記錄小部份反應(yīng)物的吸收光譜，監(jiān)測反應(yīng)進程。約30分鐘后，完成所述反應(yīng)，并蒸發(fā)所述溶劑。(c)Pd-Bpheid的純化將粗制Pd-BPheid溶于CHCl3，然后上樣于用15g 0.4％-二氧化硅-Asc裝填的柱。將少量體積的CHCl3(約30ml)通過該柱，然后用MeOH∶CHCl3(1∶99，約250ml)洗脫所述色素。經(jīng)TLC和光學(xué)吸光譜法測定所述流分的純度。對代表性樣品進行質(zhì)譜分析和NMR檢測。產(chǎn)量82.5mg純的Pd-BPheid(76％)。
對于制備0.4％-二氧化硅-Asc，將抗壞血酸(240mg)溶于240ccEtOH∶CHCl3∶MeOH(60∶60∶120)混合物中。加入硅膠60(60g，Merck，Cat.No.107734，70-230目)，將所述漿液混合物攪拌10分鐘，然后在泵下過濾。最后將所述淡黃色二氧化硅-Asc于約50C干燥約1小時。該0.4％-二氧化硅-Asc隨時可以用作標(biāo)準(zhǔn)硅膠；其性質(zhì)為極性較少并且它具有某些抗氧化特性。實施例3.Pd-BPheid的制備(a)Bchla的分離如以上實施例1(a)進行本步驟。(b)葉綠素酶(Chlase)的制備從Melia azedarach L.，Chine樹葉的葉綠體制備葉綠素酶(Chlase)。將新鮮葉片(50g)在含有350ml冷卻至-20℃的丙酮溶液的搗碎機中研磨2分鐘。將所述勻漿通過4層紗布過濾，收集濾液，于4℃放置過夜以進一步進行沉淀。經(jīng)過濾除去丙酮，用冷丙酮將余下的粉末洗滌幾次以去除痕量Chlase和類胡蘿卜素，直到所述濾液無色為止。最后將Chlase丙酮粉在凍干機中干燥，并再貯藏于-20℃。在這些條件下，所述酶制備物可穩(wěn)定1年以上，而不顯著損失活性。得率每1kg葉片獲得20g Chlase。(c)細菌脫植基葉綠素(BChlide)的合成和純化將抗壞血酸(70mg；Merck)溶于水(9ml)中，用10M KOH水溶液將所述溶液的pH調(diào)節(jié)至7.7，加入1ml 0.5M磷酸鈉緩沖液(pH7.7)以在反應(yīng)期間保持所述pH。加入Triton X-100(約80μl)以達到去垢劑終濃度為0.8％(v/v)。用Polytron勻漿器，將Chlase丙酮粉末(200mg)在6ml該溶液中勻漿。用剩余溶液洗滌該裝置，然后與所述勻漿混合。所述酶溶液與20mg用氬氣(Argon)飽和的固體BChla一起超聲處理，然后于37℃避光攪拌溫育6小時。
對于純化，反應(yīng)6小時后，將所述反應(yīng)物質(zhì)直接冰凍(-20℃)，并隨后凍干。將所述干殘留物溶于丙酮，超聲處理，然后將所述溶液上樣于平衡于丙酮的CM-瓊脂糖凝膠柱。用丙酮洗滌該柱以洗出未反應(yīng)的物質(zhì)，然后用5％和7％甲醇(v/v)的丙酮溶液洗滌，以洗脫細菌脫植基葉綠素(Bchlide)和細菌脫鎂甲酯一酸(Bpheid)。用25％甲醇的丙酮溶液洗脫所述產(chǎn)物。蒸發(fā)溶劑，然后將所述固體色素在氬氣下避光貯藏于-20℃。反應(yīng)得率30-55％。
在填充柱和平衡于丙酮之前，首先用水洗滌CM-瓊脂糖凝膠，然后用丙酮洗滌3次，制備用于色譜法的CM-瓊脂糖凝膠。在用2MNaCl水溶液徹底漂洗至無色后，可以重復(fù)使用所述色譜材料，用水洗滌并重新懸浮于丙酮。(d)將鈀摻入到細菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)本方法與以上實施例1(c)中的方法相同。干燥的物質(zhì)的HPLC顯示出2個差向異構(gòu)體形式的主要產(chǎn)物和殘余異分同晶體，所述2個差向異構(gòu)體在化學(xué)上是相同的(全部混合物的88％)。也有微量(0.5％)污染的原材料BPheid。實施例4.化合物Pd-BPheid的表征(a)吸收光譜采用標(biāo)準(zhǔn)化到基線的PM檢測器，用UVICON分光光度計(1cm光程長度)，測定Pd-BPheid的吸收光譜。靈敏度為0.05。
Pd-BPheid在丙酮中的吸收光譜以及甲醇/磷酸鉀緩沖液混合物中的吸收光譜報告于表1和圖1中。
Pd-BPheid在血漿中的吸收光譜紅移至763nm。
表1
照片檢測顯示按照圖1的以下峰值為758nm1.2502；537nm0.3239；384nm0.5351；和329nm0.7766。(b)Pd-BPheid的HPLC檢測開發(fā)出反相HPLC方法以表征雜質(zhì)圖形(impurity profile)并定量鈀-BPheid。固相C8Inertsil 5μm，250×4.6mm液相甲醇∶磷酸鉀緩沖液20mMpH＝6.59(70％∶30％)流速1ml/分鐘注射體積100μl檢測1-Spectroflow 783，氘燈385nm2-Spectroflow 757，鎢燈753nm正如表2中所示，實施例3中獲得的產(chǎn)物Pd-Bpheid的HPLC分析顯示出7個峰。主峰代表了總產(chǎn)物的64-70％。
于-20℃儲存于丙酮中的Pd-BPheid溶液至少穩(wěn)定2個月。將所述儲備液于室溫保持18小時時，則在HPLC圖形中沒有觀察到變化，表明Pd-Bpheid是一種穩(wěn)定的化合物。
表2.Pd-BPheid的HPLC檢測
(c)用NMR表征Pd-BPheid在按照實施例3制備的Pd-BPheid的純化步驟后，主峰的百分比為90％以上。經(jīng)制備HPLC C8進行該純化。用這種純化的化合物經(jīng)NMR和質(zhì)譜法表征所述產(chǎn)物。
用NMR進行Pd-BPheid的分析，化學(xué)位移列于表3中-1H NMR和13C NMR-2D1H NMR(COSY和NOESY)-2D1H-13C NMR(HMQC和HMBC逆檢測)
表3.1H、13C化學(xué)位移(ppm)甲基 質(zhì)子碳
內(nèi)消旋
C-H
其它
無質(zhì)子的碳
(d)用質(zhì)譜法表征Pd-BPheidPd-BPheid的質(zhì)譜法分析產(chǎn)生示于圖2和圖3中波譜。于低分辨率和高分辨率下經(jīng)快速原子轟擊(FAB)進行該分析。分光計為“ZabSpecTOF Micromass”分光計；電離方式利用Cs+的LSIMS，正性，加速8kV；源溫度40℃；所用的溶劑mNBA(間硝基二苯乙醇(meta-nitrobenzilic alcohol))；輸入側(cè)部。
結(jié)果離子型M+；分子式C35H36N4O6106Pd；理論值714.1670Z1m/z理論值714.1670m/z實測值714.1689。
這些結(jié)果證實所述NMR研究m/e＝714，并證實鈀金屬的嵌入。
經(jīng)NMR和質(zhì)譜法分析的化學(xué)結(jié)構(gòu)是BChl游離酸形式的鈀衍生物-Pd-BPheid。實施例5.Pd-Bpheid對鼠L1210和人HT29細胞的生物活性(i)細胞系。用補充10％馬血清、1mM谷胺酰胺、1mM巰基乙醇和慶大霉素的Fischer培養(yǎng)基，在懸浮培養(yǎng)物中保持鼠白血病細胞系(L1210)。按照Twentyman等的說明(1980，“用于比較終點研究的新型小鼠腫瘤模型系統(tǒng)(RIF-1)(A new mousetumor model system(RIF-1)forcomparison of end-point studies)”，J.Natl.Cancer Inst.，64，595-604)保持RIF(輻照誘發(fā)的纖維肉瘤)腫瘤。在含10％胎牛血清和慶大霉素的Weymouth培養(yǎng)基中培育培養(yǎng)物。
在無酚紅而含有10％FCS的RPMI 1640中培養(yǎng)HT29人結(jié)腸腺癌細胞。通過用0.25％胰蛋白酶使細胞分散在0.02％EDTA，傳代培養(yǎng)細胞，然后將1瓶分成5瓶(at a 1∶5 split)再接種。(ii)體外光毒性。對于涉及L1210和RIF細胞的光毒性研究，由600瓦具有10cm水濾光器和850nm截止濾光片濾波以去除IR的石英-鹵素光源，提供光源。通過干涉濾光片(Oriel)，將所述帶寬進一步限定于660±5nm。在生長培養(yǎng)基(為加入緩沖能力，用20mM HEPES pH7取代NaHCO3)中，在規(guī)定濃度的致敏劑存在下，將懸浮液中的細胞(L1210)或貼壁至24mm直經(jīng)蓋玻片的細胞溫育15分鐘。然后將所述細胞洗滌直至不含致敏劑，將其轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中。于10℃進行照射。對于某些研究，然后將所述細胞用熒光探針標(biāo)記，確定光損傷部位。在其它研究中，然后將所述細胞于37℃在新鮮培養(yǎng)基中溫育60分鐘，讓編程性細胞死亡開始發(fā)生。用96孔板和72小時MTT測定，以四個復(fù)份進行生存力研究。
對于HT29模型，將細胞與不同濃度的Pd-Bpheid一起溫育1小時，然后用鹵素?zé)艋蜮佀{寶石激光于10J/cm2和25J/cm2，以300mW/cm2進行照射。(iii)細胞生存力。通過在96孔板中接種1,000-50,000細胞后3天進行的MTT反應(yīng)，評價細胞存活率。與含可變數(shù)對照細胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較顏色強度。用BioRad平板讀出器于xnm測定吸光度。對于L1210，在下一個3天內(nèi)讓其在新鮮培養(yǎng)基中發(fā)生生長，采用MTT測定方法，類似估計細胞數(shù)目。(iv)脂蛋白結(jié)合測定Pd-BPheid與對照人血漿的蛋白和脂蛋白化合物的結(jié)合。將250μl血漿樣品與3μM所述化合物一起于37℃溫育30分鐘。然后用密度梯度離心機分離脂蛋白和蛋白組分。分級分離所述梯度，分級分離部分在3ml 10mM Triton X-100去垢劑中稀釋或在400nm激發(fā)下測定分級分離部分的750-800nm熒光。結(jié)果(v)Pd-Bpheid對L1210細胞的光毒性效應(yīng)將L1210鼠白血病細胞與1μM Pd-BPheid一起于37℃溫育30分鐘，于760±5nm下采用75mJ/cm2的光劑量，導(dǎo)致50％細胞致死。在RIF系中相似程度的細胞致死需要215mJ/cm2的光劑量。(vi)Pd-Bpheid對HT29細胞的光毒性效應(yīng)當(dāng)HT29細胞在無光照下與Pd-BPheid一起溫育時，存活率在100％和79％之間變化。當(dāng)Pd-BPheid濃度較高，并且所傳遞能量的劑量增加時，所述細胞的存活率降低。引起50％死亡率的Pd-BPheid光敏劑劑量(也稱為LD50)在25J/cm2的照射下為48μM。引發(fā)最嚴重光毒性的激發(fā)波長為773nm。(vii)光損傷部位。采用小鼠白血病L1210細胞，Pd BPheid是高度特異性線粒體光敏劑，而對質(zhì)膜或?qū)θ苊阁w沒有可檢測的光損傷。這種結(jié)果與快速引發(fā)編程性細胞死亡相關(guān)。(viii)血漿脂蛋白結(jié)合。進行的研究指出，Pd-BPheid結(jié)合于HDL＞LDL＞＞＞人血清白蛋白部分，認為是一種PDP選擇性的決定子。實施例6.Pd-Bpheid的制劑Pd-Bpheid在動物實驗所用溶劑中的溶解和穩(wěn)定性以不同的配方構(gòu)成Pd-BPheid的溶液，以獲得0.05-2％的濃度。
(a)如下制備Cremophor制劑將40mgPd-BPheid溶于2ml干管中的Cremophor EL中，或者通過緩慢旋轉(zhuǎn)所述管形瓶直至所述溶液已經(jīng)完全無微粒，或者采用超聲振蕩探頭的短脈沖處理進行溶解。將所述管冷卻，以便使溫度不上升至30℃以上。所述藥物溶解后，加入0.6ml丙二醇，再次或者通過緩慢旋轉(zhuǎn)法或者用超聲探頭混合。然后以0.1ml部份加入等滲NaCl至總體積為4ml。每次加入后，所述混合物應(yīng)是澄清的，無沉淀跡象。所述組合物在每次加入NaCl 0.9％后，簡單地用所述超聲探頭處理，并小心地保持溫度在25-30℃以下。稀釋到乙醇中后，通過于757nm測量吸光度，評估所述藥物的濃度。
當(dāng)將20mg/kg Pd-BPheid用于實驗研究時，這變成每20克小鼠為0.4mg Pd-BPheid。由于可以將不超過0.1ml的cremophor注射到尾靜脈，于是所述藥物的濃度為4mg/ml。
(b)如下制備改進的Cremophor制劑將5mg Pd-BPheid與0.4mlCremophor EL混合。溶解后，加入0.12ml丙二醇。然后以小份兒加入等滲鹽水(1.48ml)，并且每次加入后混合所溶液。最終溶液應(yīng)是完全澄清的并且不含微粒。用超聲探頭幫助溶解所述藥物，按照需要通過在冰浴中冷卻，保持所述溶液的溫度在25℃以下。
通過在甲醇中稀釋，進行Pd-BPheid在Cremophor溶液中濃度的測定。在740-780nm范圍內(nèi)測量吸收光譜。將所述峰值與來自已知濃度的Pd-BPheid的結(jié)果進行比較。
(c)用吐溫80和乙醇溶解Pd-BPheid(1mgPd-BPheid/ml溶液)，制備其它的制劑。實施例7.體內(nèi)毒性研究-Pd-BPheid對鼠腫瘤模型的作用用涉及鼠腫瘤模型的兩組實驗評估Pd-BPheid的光毒性。
(a)首先，在兩種鼠腫瘤模型BA-乳腺癌和輻照誘發(fā)性纖維肉瘤(RIF-1)中，評價Pd-BPheid的光動力反應(yīng)性。
光動力療法參數(shù)用患有腫瘤(測量直經(jīng)為5-7mm)的小鼠進行PDT實驗。評價3種Pd-BPheid藥物劑量(1、5和10mg/kg)和2種光劑量(100和300焦耳/cm2)。通過尾靜脈注射給予溶于Cremophor的Pd-BPheid制劑。注射后15分鐘、1小時或4小時，開始PDT光照射。在每種治療條件下處理3只小鼠，除非最初結(jié)果已證實致死毒性或無反應(yīng)性。將調(diào)至757nm的鈦藍寶石激光用作PDT的光源。將激光產(chǎn)生的光耦合到石英纖維中，用于將光傳遞至腫瘤。使用75mW/cm2的光功率密度。PDT治療后，3天/周測量腫瘤大小，然后確定腫瘤治愈(定義為治療后40天無腫瘤復(fù)發(fā))的百分比。
體內(nèi)PDT反應(yīng)下文表4和5提供或者移植BA乳腺瘤或者移植RIF-1纖維肉瘤的C3H小鼠的PDT治療結(jié)果的小結(jié)。每個表指出以下參數(shù)1)靜脈內(nèi)藥物劑量，以mg/kg表示；2)激光療法參數(shù)，包括總光劑量(J/cm2)、波長(757nm)、光劑量率(mW/cm2)和時間間隔(每組治療之間)；4)毒性(治療后不久4只小鼠死亡)；5)腫瘤再生長(包括PDT治療和腫瘤復(fù)發(fā)之間的天數(shù))；和6)用Pd-BPheid PDT誘發(fā)的腫瘤治愈的小鼠數(shù)目(和百分比)。
如本文所述，發(fā)現(xiàn)Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT在兩種小鼠腫瘤模型中誘發(fā)標(biāo)準(zhǔn)而有效的殺腫瘤反應(yīng)。PDT介導(dǎo)的腫瘤反應(yīng)性直接與藥物劑量、光劑量和藥物給予和光治療之間的時間間隔相關(guān)。具體來講，較高的藥物劑量和/或較高的光劑量產(chǎn)生增強的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)BA乳腺癌對Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT的反應(yīng)性比RIF-1纖維肉瘤的相當(dāng)PDT療法的反應(yīng)性更強。如果在給予藥物的1小時內(nèi)開始光療法，則Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT有效；而如果在藥物給予和光療法之間采用4小時間隔，則Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT無效。
(b)在第二組實驗中，在移植HT29人結(jié)腸腺癌的小鼠腫瘤模型中評估Pd-BPheid的光毒性。
動物和腫瘤模型從剛死的供體小鼠中立即取出的實體瘤組織(直經(jīng)2cm)，在1ml 0.9％鹽水溶液中機械地壓碎，然后將所述溶液(0.1ml)皮下注射到每只小鼠的一條后腿中。當(dāng)腫瘤直經(jīng)為8-10mm時，將小鼠用于實驗。在實驗之前10天，在8周齡瑞士裸鼠中進行腫瘤皮下移植。
光毒性研究以15mg/kg靜脈內(nèi)注射0.15ml Pd-BPheid。恰好在照射之前，用40mg/kg硫噴妥麻醉小鼠。注射后30分鐘、1小時、4小時或24小時，于300mW/cm2用鈦藍寶石激光照射小鼠，測量平均直經(jīng)以調(diào)節(jié)照射時間，以達到200或300J/cm2。不用Pd-BPheid注射的對照小鼠也以相同條件進行照射。用在實驗性放療已完成的試驗，同等地分析PDT誘發(fā)的腫瘤生長延遲。對于體內(nèi)研究和對于每個獨立的實驗，所有結(jié)果都是2個或3個獨立實驗的平均值，并且對于每個獨立的實驗，每種實驗條件均使用2只小鼠。
對于腫瘤生長研究，結(jié)果以腫瘤指數(shù)變化表示，參比(＝1)相當(dāng)于來自未處理細胞的腫瘤指數(shù)。如下計算所述腫瘤指數(shù)腫瘤指數(shù)＝(最大腫瘤直經(jīng)+垂直相對的直經(jīng)(perpendicularlyopposite diameter))/2溫度變化研究為保證熱效應(yīng)不是太大，采用不吸收性氧化鋁包埋的精密熱電偶，測量鹵素?zé)艉外佀{寶石激光照射的溫度變化。
該實驗結(jié)果如下(i)于200J/cm2763nm照射對于注射后30分鐘和4小時的所述條件，觀察到腫瘤生長減少(與對照比較)。對于注射后1小時和24小時的所述條件，觀察到腫瘤指數(shù)減少多達7天。
(ii)于300J/cm2763nm照射對于注射后30分鐘和24小時的所述條件，觀察到腫瘤生長減少(與對照比較)。對于注射后1小時和4小時的所述條件，觀察到腫瘤指數(shù)減少多達7天。
(iii)注射后1小時300J/cm2照射對于773nm下的所述條件，觀察到腫瘤生長減少(與對照比較)多達5天，而對于753nm和763nm下的所述條件，則腫瘤生長減少多達12天。對于763nm觀察到最大腫瘤生長減少。
(iv)注射后24小時300J/cm2照射對于753nm下的所述條件，觀察到腫瘤生長減少(與對照比較)多達4天，而對于763nm和773nm下的所述條件，腫瘤生長減少則多達12天。對于773nm觀察到最大腫瘤生長減少。
在鹵素?zé)艋蜮佀{寶石照射小鼠期間，沒有觀察到太大的溫度變化。
該研究總起來說，發(fā)現(xiàn)照射的最適波長為773nm。在注射和照射之間的延遲對腫瘤反應(yīng)有影響。于764nm，1小時延遲顯示最有效。當(dāng)使用773nm波長時，最有效延遲為24小時。
表4C3H/BA乳腺癌對Pd-BPheid的反應(yīng)藥物 光 所治療 毒性(療 有原發(fā)性腫瘤 小結(jié)劑量 參數(shù) 的動物 法相關(guān)再生長的動物(治愈)(mg/Kg) 數(shù)目 的死亡) 數(shù)(至復(fù)發(fā)的天 ％數(shù))1i.v300J/cm21 0 1(1天)-757nm 無反應(yīng)75mW/cm215分鐘間隔5i.v300J/cm23 0+757nm 2(41天)75mW/cm22(40天)15分鐘間隔 100％5i.v300J/cm23 0 1(11天) +757nm 1(41天)75mW/cm266.66％1小時間隔10i.v 300J/cm23 0+757nm 2(41天)75mW/cm21(41天)1小時間隔 100％10i.v 300J/cm22 0 2(1天)-757nm 無反應(yīng)75mW/cm24小時間隔10i.v 100J/cm23 0+757nm 2(42天)75mW/cm21(41天)15分鐘間隔 100％10i.v 100J/cm23 0 1(5天)+757nm 2(40天)75mW/cm266.66％1小時間隔表5RIF-1對Pd-BPheid的反應(yīng)藥物光所治療毒性(療 有原發(fā)性腫瘤 小結(jié)劑量 參數(shù) 的動物法相關(guān) 再生長的動物(治愈)(mg/Kg) 數(shù)目 的死亡) 數(shù)(至復(fù)發(fā)的天 ％數(shù))1i.v. 300J/cm22 0 2(1天) -757nm無反應(yīng)75mW/cm215分鐘間隔5i.v 300J/cm23 01(5天) +757nm1(12天) 1(40天)75mW/cm233.33％15分鐘間隔5i.v 300J/cm23 01(4天) +757nm1(2天)75mW/cm21(7天)1小時間隔10i.v 300J/cm23 2+757nm 2(1天) 1(41天)75mW/cm233.33％15分鐘間隔10i.v 300J/cm24 21(20天) +757nm 2(1天) 1(40天)75mW/cm225.00％1小時間隔10i.v 300J/cm21 0-757nm無反應(yīng)75mW/cm24小時間隔10i.v 100J/cm23 02(12天) +757nm1(7天)75mW/cm215分鐘間隔10i.v100J/cm23 0 2(3天)+757nm1(6天)75mW/cm21小時間隔實施例8.基于Pd-BPheid和BChl-Ser的PDT后A431人上皮類癌瘤細胞的形態(tài)學(xué)評估為了檢查在用Pd-BPheid或BChl-SerOMe對A431人上皮類癌瘤細胞進行PDT后發(fā)生的時間依賴性形態(tài)變異，進行本實驗。(i)材料如以上實施例1制備Pd-BPheid，而按照EP 584552制備絲氨酸甲酯BChl-SerOMe。(ii)光源鹵素?zé)?Osram，德國，100W)，具有4.5cm水濾光器和＞650nm的截止濾光片。以15mW/cm2、總能注量為9J/cm2，將所述細胞照射10分鐘。對于照射，將培養(yǎng)板置于玻璃臺上，以從底部提供光源。(iii)光毒性研究以兩個復(fù)份將A431細胞(5×104細胞)接種于3cm平皿內(nèi)，然后在Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)＋F12(1∶1)中培養(yǎng)至75％鋪滿，所述培養(yǎng)基用HEPES(25mM，pH7.4)緩沖、含有胎牛血清(FCS)以及青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)。于對應(yīng)的LD90濃度(分別為0.1μM和1μM)，將Pd-BPheid或BChl-Ser加入所述細胞中。4小時后，用培養(yǎng)基洗滌所述細胞，然后用以上所述光源照射所述細胞。采用裝備Contax 35mm SLR照相機的Zeiss Axiovert-35光學(xué)顯微鏡(放大倍數(shù)×320)，于照射后的不同時間點(PDT后0、0.5、4和24小時)，進行相差顯微鏡檢查。在每種重復(fù)的第二個平皿中，采用中性紅生存力測定(Zhang SZ.，1990，Cell Biol Toxicol 6(2)219-234)，于PDT后24小時，評價細胞生存力。(iv)結(jié)果在所述細胞形態(tài)學(xué)方面，兩種致敏劑均引起顯著變化。Pd-BPheid引起所述細胞膜結(jié)構(gòu)的快速改變(30分鐘)，所述細胞快速萎縮并且形成纖維性連接，將所述細胞膜與原始粘著斑點(纖維表型)連接。4小時后，90％所述細胞喪失其大部份內(nèi)水體積并且其大部分脫離所述平皿，24小時后沒有觀察到進一步的變化(圖4，右欄)。BChl-Ser顯示可能僅在4小時后觀察到的不同型式的時間依賴性形態(tài)變異。觀察到膜泄漏(blabbing)為從所述細胞膜芽生的暗色小泡。24小時內(nèi)沒有觀察到顯著的體積減少，而該時期后，大多數(shù)細胞附著于所述平皿，但出現(xiàn)中空(泄漏(blabbing)表型，圖4，左欄)。照射后24小時，在兩個實驗組中，進行中性紅生存力測定，證明已殺傷90％±7％細胞。在圖4中，右柱圖代表所述纖維表型，而左柱圖代表所述泄漏表型。實心白色箭頭顯示纖維或泄漏物(blab)的形成。實施例9.Pd-BPheid和BChl-SerOMe對人膀胱癌細胞系ECV304的光細胞毒性為了評價光敏劑Pd-BPheid和BChl-SerOMe對ECV304人膀胱癌細胞的光細胞毒性效應(yīng)，進行本實驗。(i)材料如實施例8(i)所述材料。(ii)光源如實施例8(ii)所述光源。(iii)光毒性研究在96孔中的含有青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)的M-199、10％FCS中，培養(yǎng)ECV304細胞(2×104細胞/孔)至鋪滿(約2×105細胞/孔)。用增加濃度的Pd-BPheid或BChl-SerOMe與所述細胞一起溫育4小時，然后用新鮮培養(yǎng)基進行洗滌，并如以上小節(jié)1所述進行照射。照射后24小時，采用中性紅生存力測定評價細胞生存力。使用以下對照光對照不用致敏劑處理的照射細胞；黑暗對照在黑暗中用致敏劑處理的非照射細胞；未處理對照為了計算100％存活率，使用既不用致敏劑處理也不照射的細胞(Rosenbach-Belkin V.等，1996，Photochem Photobiol 64(1)174-181)。(iv)結(jié)果Pd-BPheid和BChl-SerOMe兩者均表現(xiàn)出對ECV304細胞的依賴于劑量和光的細胞毒性(圖5)。相應(yīng)的LD50值為19nM和1000nM。PDT后的形態(tài)變異與用A431細胞進行的觀察一致(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例10.Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯左M2R小鼠黑素癌細胞上的PDT本實驗的目的是測試Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯對M2R細胞的作用。(i)材料如以上實施例1制備Pd-Bpheid，而按照WO97/19081所描述的方法制備Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯一酸a乙酯(Pd-Bpheid-乙酯)。(ii)光源如以上實施例8(ii)所述光源，但以12mW/cm2、總能注量為7J/cm2，將細胞照射10分鐘。(iii)光毒性研究將M2R細胞在用HEPES(25mM，pH7.4)緩沖的Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)＋F12(1∶1)中培養(yǎng)為單層。包括胎牛血清(FBS)(10％)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)，并于37℃在含8％CO2的濕潤氛圍中培育所述細胞。對于光毒性分析，將細胞(1×104細胞/孔)在96孔板中培養(yǎng)24小時至2×104細胞/孔的合適密度。將色素直接溶于培養(yǎng)基中或95％乙醇中，并在培養(yǎng)基中進一步稀釋至終濃度為1％乙醇。加入所述稀釋的色素，于37℃在黑暗中將所述細胞溫育4小時。照射之前，用新鮮培養(yǎng)基將所述細胞洗滌一次，并更換新鮮培養(yǎng)基。然后將所述板于室溫下從底部照射10分鐘，并置于37℃避光培養(yǎng)箱中。24小時后測定細胞存活率。使用以下對照系統(tǒng)黑暗對照-保持在黑暗中的未處理細胞；光照對照-未用致敏劑處理的照射細胞；黑暗毒性-用色素處理但保持在黑暗中的細胞。通過如先前(WO97/19081)所述的[3H]-胸苷摻入，測定細胞存活率。(iv)結(jié)果正如可以在圖6A中所觀察的，如果將所述色素溶于95％乙醇中，則Pd-BPheid的LD50為0.03μM，而Pd-BPheid-乙酯的LD50為0.07μM。如果將所述色素直接溶于含10％血清的培養(yǎng)基中，則只有Pd-BPheid是完全有活性，而Pd-BPheid-乙酯在高達所測試的最高濃度1μM下都完全沒有活性(圖6B)。實施例11.Pd-BPheid在M2R小鼠黑素瘤細胞和人HT29結(jié)腸癌細胞上的PDT這些實驗?zāi)康脑谟跍y定Pd-BPheid對兩種細胞系M2R小鼠黑素瘤細胞和人HT29結(jié)腸癌細胞的光毒性效應(yīng)。(i)材料如以上實施例1所述制備Pd-Bpheid。(ii)光源光源為氟氙LS3-PDT燈(Bio-Spec，Russia)，具有10cm水濾光器和720-850nm光帶。以12mW/cm2、總能量為7J/cm2，將細胞照射10分鐘。(iii)光毒性研究用具有以下變化如上所述(實施例10)的相同方案進行分析將Pd-BPheid直接溶于含10％血清的培養(yǎng)基中，然后將其加入到所述細胞中。通過[3H]-胸苷摻入，測定M2R細胞的存活率，而用MTT分析測定人HT29細胞的存活率(Merlin JL等，1992 Eur.J.Cancer28A1452-1458)。(iv)結(jié)果如可以在圖7中所觀察的，人結(jié)腸HT-29細胞顯示對該色素較低的敏感性(0.5μM的LD50)，而M2R細胞的敏感性高約10倍(0.03μM的LD50)。實施例12.用Pd-BPheid的M2R小鼠黑素瘤腫瘤的體內(nèi)PDT本實驗的目的是研究在CD1裸鼠中用2.5mg/kgPd-BPheid的M2R小鼠黑素瘤腫瘤的PDT。(i)材料如以上實施例1所述制備Pd-Bpheid。(ii)小鼠CD1裸鼠(25-30g)。(iii)麻醉法腹膜內(nèi)注射50μl氯胺酮/Rumpon(體積/體積＝85/15)。(iv)腫瘤植入法.用106M2R細胞植入小鼠背部，并在2-3周內(nèi)使腫瘤生長至所述處理的大小(7-8mm)。(v)光源Osram 150W鹵素光學(xué)照相燈64643(D.K.Keller等1999，Int.J.Hyperthermia 15，467-474)，裝備λ＝650-900mn光譜窗，300mW/cm-2。照射30分鐘。(vi)PDT方案將所述已麻醉的小鼠靜脈內(nèi)注射所述色素，然后立即照射所述腫瘤。在療法結(jié)束時，將所述小鼠放回籠中。于指定的時間之前或于指定的時間，對所述腫瘤進行照相。實驗1致敏劑的制備將2mg Pd-BPheid溶于0.2ml cremophor EL中，然后超聲處理20分鐘。加入0.075ml 1，2-丙二醇，再繼續(xù)進行超聲處理15分鐘。加入0.9ml 0.15mM NaCl，然后超聲處理5分鐘。將所述樣品于13,000rpm(Eppendorf)離心12分鐘。根據(jù)氯仿中的光譜，計算出Pd-BPheid的終濃度為0.5mg/ml。腫瘤的PDT將帶有M2R黑素瘤腫瘤的CD1裸鼠靜脈內(nèi)注射Pd-BPheid 2.5mg/kg。于300mW cm-2照射所述腫瘤30分鐘。所述小鼠皮膚腫瘤區(qū)的溫度為37.7-38℃。處理后1和4天繼續(xù)腫瘤的反應(yīng)。結(jié)果示于圖8中。實驗2致敏劑的制備將2mg Pd-BPheid溶于0.1ml甲醇、0.1ml 0.1MKH2PO4、pH＝8.0和0.9mlPBS中，然后超聲處理10分鐘。用氬氣蒸發(fā)甲醇，加入20％cremophor EL1，2-丙二醇(3∶1)，然后超聲處理15分鐘。將所述樣品于13,000rpm離心8分鐘，根據(jù)氯仿中的光譜，計算出Pd-BPheid的終濃度為0.5mg/ml。腫瘤的PDT將帶有M2R黑素瘤腫瘤的CD1裸鼠靜脈內(nèi)給予Pd-BPheid 2.5mg/kg(120μl)。于300mW cm-2照射所述腫瘤組織30分鐘。所述小鼠皮膚腫瘤區(qū)的溫度為37.7-38℃。處理后1和4天繼續(xù)腫瘤的反應(yīng)。結(jié)果示于圖9中。結(jié)果如圖8和圖9所示，如上所述用2.5mg/Kg Pd-Bpheid的M2R黑素瘤腫瘤的PDT在24小時內(nèi)誘發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)和腫瘤壞死。實施例13.基于Pd-BPheid的PDT降低小鼠中C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移形成的比率比外科手術(shù)有利為了比較基于Pd-BPheid和BChl-SerOMe的PDT的治療潛力，以及由基于Pd-BPheid和BChl-SerOMe的PDT引起的轉(zhuǎn)移擴散的可能性，進行這些實驗。(i)材料20％Cremophor EL中的Pd-BPheid(如實施例1所述制備)或Pd-BPpheid-SerOMe 5mg/kg。(ii)光源光源為氟氙LS3-PDT燈(Bio-Spec，Russia)，具有10cm水濾光器和720-850nm光帶。(iii)小鼠CD1裸鼠。(iv)腫瘤用106C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞移植至小鼠后腿的爪內(nèi)。當(dāng)達到長度為7-8mm時，治療腫瘤。(v)麻醉50μl Vetalar/Rumpon(體積/體積＝85/15)。(vi)鎮(zhèn)痛在5％蔗糖飲水中加入羥考酮(12mg/升)，從(切斷術(shù)或PDT)時起持續(xù)1周。(vii)方案用5mg/Kg致敏劑(Pd-BPheid或Pd-BPpheid-SerOMe)靜脈內(nèi)注射3組小鼠(每組10只小鼠)，然后立即于200mw/cm2下照射30分鐘，讓動物在其籠中恢復(fù)。組1和組2分別接受PDT Pd-Bpheid和Pd-BPpheid-SerOMe的動物。在腹股溝中的腫瘤反應(yīng)和轉(zhuǎn)移形成持續(xù)4周。組3切斷踝關(guān)節(jié)，并且在腹股溝中的腫瘤轉(zhuǎn)移形成持續(xù)4周的動物(與組1成對)。對PDT的反應(yīng)參數(shù)為腫瘤壞死和消失的動物占處理動物總數(shù)的百分比。轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為腫瘤在腹股溝或其它部位的出現(xiàn)。認為的終點是跟蹤4周，自然死亡，腫瘤達到直經(jīng)2cm，轉(zhuǎn)移，無論哪種反應(yīng)先出現(xiàn)均是終點。(viii)結(jié)果腫瘤變平(消失)的結(jié)果示于圖10中。而在第11天，對Pd-BPheid的反應(yīng)比對Pd-BPheid-SerOMe強(分別為100％和80％腫瘤變平)，過后，在第28天，反應(yīng)的百分比相似，約60％。從長遠觀點來看，在某些處理的動物中，腫瘤變平下降是由于某些腫瘤再生長引起的，或可能是由于光場(light field)與腫瘤區(qū)錯配引起的。轉(zhuǎn)移出現(xiàn)的結(jié)果示于圖11中。通過腿切斷的外科手術(shù)療法與PDT比較產(chǎn)生顯著更高的轉(zhuǎn)移百分比(高達78％)。此外，切斷后的轉(zhuǎn)移出現(xiàn)得更早。用Pd-Bpheid進行PDT后的轉(zhuǎn)移頻率最低(至多23％)。該結(jié)果類似于用Pd-BPheid-SerOMe獲得的結(jié)果，并且Pd-BPheid的主要優(yōu)點是延遲轉(zhuǎn)移出現(xiàn)。用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe的PDT治愈C6神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤。PDT后的轉(zhuǎn)移形成如果與外科手術(shù)療法比較則顯著較低。
權(quán)利要求
1.一種式I、I’或I”的化合物 其中A代表OH，OR1，-O-(CH2)n-Y，-S-(CH2)n-Y，-NH-(CH2)n-Y，-O-(CH2)2-NH2，-O-(CH2)2-OH，-NH-(CH2)n-+No，X-，-NH-(CH2)2-NH＝BOC或-N-(CH2-CH＝CH2)2其中R1代表Na+、K+、(Ca2+)0.5、(Mg2+)0.5、Li+、NH4++NH3-C(CH2OH)3、+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH，+NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH或+N(Cn′H2n′+1)4；R2代表H、OH或COOR4，其中R4為C1-C12烷基或C3-C12環(huán)烷基；R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；n為1、2、3、4、5或6，Y為-NR′1R′2或-+NR′1R′2R′3，X-，其中R′1、R′2和R′3相互獨立地代表-CH3或-C2H5；X為F、Cl、Br或I，n′為1、2、3或4，并且其中*表示一個不對稱碳，而一代表一個飽和單鍵或一個不飽和雙鍵。
2.具有如下所示結(jié)構(gòu)式和光學(xué)構(gòu)型的權(quán)利要求1的化合物 其中A為OH或OR1，而R1如權(quán)利要求1中所限定。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中A為OH，所述化合物在此鑒定為Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯一酸a(Pd-BPheid)。
4.一種作為藥物的如在權(quán)利要求1-3中任一項所限定的式I、I’或I”化合物。
5.一種藥用組合物，其包含至少一種如在權(quán)利要求1-3中任一項所限定的式I、I’或I”化合物以及生理上可接受的載體。
6.權(quán)利要求5的藥用組合物，其中所述組合物為溶液、脂質(zhì)乳劑或凝膠的形式，或為脂質(zhì)體或納級粒子的形式。
7.權(quán)利要求5或6的藥用組合物，其中所述化合物的存在量為所述組合物的總重量的0.01％-20％(重量)。
8.一種制備權(quán)利要求1中的式I化合物的方法，其中A為OH，所述方法包括以下步驟a)將M-BPheid-173-Z化合物聯(lián)合脫金屬和水解，其中Z為植基、香葉基香葉基或絲氨酰甲酯(SerOMe)，而M為選自Mg、Cd和Zn的金屬；和b)用Pd試劑將Pd摻入(a)中獲得的化合物中。
9.按照權(quán)利要求8用于制備Pd-BPheid的方法，其中細菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中被脫金屬和水解，并將所獲得的細菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)在步驟(b)中與Pd試劑反應(yīng)，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
10.一種制備權(quán)利要求1中的其中A為OH的式I化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)對BChlide-173-Z進行金屬轉(zhuǎn)移，獲得對應(yīng)的Pd-BPheid-173-Z，其中Z為植基、香葉基香葉基或SerOMe；和b)水解(a)中所獲得的化合物。
11.按照權(quán)利要求10用于制備Pd-BPheid的方法，其中細菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中被進行金屬轉(zhuǎn)移，以由Pd取代所述天然中心Mg原子，并將所獲得的其中Z為植基的Pd-BPheid-173-Z在步驟(b)中水解，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
12.一種制備權(quán)利要求1中的其中A為OH的式I化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)酶促水解其中Z為植基或香葉基香葉基的BChlide-173-Z，獲得BChlide；b)將(a)的所述Bchlide進行酸性脫金屬；和c)用Pd試劑將Pd摻入到(b)的所述脫金屬的化合物中。
13.按照權(quán)利要求12用于制備Pd-BPheid的方法，其中細菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中進行酶促水解、在步驟(b)中脫金屬并在步驟(c)中與Pd試劑反應(yīng)，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
14.按照權(quán)利要求8-13中任一項的方法，還包括使所述獲得的Pd-BPheid化合物與對應(yīng)的R1-H或A-H化合物反應(yīng)的步驟，以獲得其中A不為OH的式I化合物。
15.按照權(quán)利要求8-14中任一項的方法，其中所述Pd試劑是乙酸鈀或氯化鈀。
16.按照權(quán)利要求15的方法，其中通過采用抗壞血酸鈉或抗壞血酸的兩步法，或者通過采用6-O-棕櫚酰-L-抗壞血酸的一步法，進行所述Pd的摻入。
17.如在權(quán)利要求1-3中任一項所限定的式I、I’或I”化合物的用途，用于制備可用于腫瘤的光動力療法(PDT)的藥用組合物。
18.如在權(quán)利要求1-3中任一項所限定的式I、I’或I”化合物的用途，用于制備可用于活體外殺傷細菌、病毒、寄生物和真菌的組合物。
19.Pd-BPheid的按照權(quán)利要求17或18的用途。
20.一種作為中間體的式II或式III化合物
全文摘要
鈀取代的式(Ⅰ)細菌葉綠素衍生物可用于光動力療法(PDT)領(lǐng)域,其中A代表OH、OR
文檔編號A61P31/10GK1334728SQ99816058
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月9日
發(fā)明者A·謝茲, Y·薩洛蒙, A·布蘭迪斯, H·謝爾 申請人:耶達研究及發(fā)展有限公司