專利名稱：結締組織生長因子片段及其方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及生長因子領域，并具體地涉及結締組織生長因子(CTGF)片段及其使用方法。
背景技術：
生長因子生長因子可以廣義地定義為多功能的、局部作用的細胞內信號傳導多肽，它們控制個體發(fā)育以及維持組織形態(tài)和功能。許多原致癌基因(Proto-oncogenes)的蛋白質產物已被鑒定為生長因子和生長因子受體。
在正在發(fā)育的組織中，生長因子一般刺激靶細胞的增殖、分化以及器官化。生長因子的作用依賴于它們與特異性受體的結合，該結合刺激細胞內的信號傳導事件。生長因子包括，例如，血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、轉化生長因子α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)以及結締組織生長因子(CTGF)。據(jù)報道，這些生長因子中的每一種均刺激細胞增殖。
結締組織生長因子CTGF是一種富半胱氨酸的單體肽，分子量約38kd。如以前所報道的那樣，CTGF對結締組織具有促分裂活性和趨化活性。CTGF由細胞分泌，據(jù)信它在與特定的細胞受體相互作用中具有活性。
CTGF是生長調節(jié)子家族中的一員，包括，例如，小鼠(fisp-12)和人的CTGF、Cyr-61(小鼠)、Cef10(雞)和Nov(雞)?；谛蛄斜容^，已提出該家族的成員具有一般包括至少以下之一的組件結構(1)胰島素樣生長因子結構域，負責結合；(2)von Willebrand因子結構域，負責形成復合物；(3)血小板反應素l型重復，可能負責結合基質分子；和(4)在基質蛋白質中發(fā)現(xiàn)的C-末端組件，推測負責結合受體。
人CTGF的cDNA序列含有一個1047個核苷酸的開放閱讀框架，起始位點在大約130核苷酸處，TGA終止位點在大約1177核苷酸處，編碼349個氨基酸的肽。人CTGF的cDNA序列已在美國專利5,408,040中公開。
CTGF的開放閱讀框架編碼一個含39個半胱氨酸殘基的多肽，提示是一個有多個分子內二硫鍵的蛋白質。肽的氨基末端含有一個預示分泌型蛋白質的疏水信號序列，并且在氨基酸序列中的28位和225位天冬酰胺殘基上有兩個N-連接的糖基化位點。
據(jù)信，CTGF的合成及分泌由TGF-β和BMP-2，以及潛在地由TGF-β蛋白質超家族的其它成員選擇性地誘導。正如本領域所報道，盡管TGF-β在軟瓊脂中能夠刺激正常的成纖維細胞的生長，但是單獨的CTGF并不能在成纖維細胞中誘導該特性。然而，已經證明CTGF的合成和作用對TGF-β刺激抗基非依賴的成纖維細胞生長是必需的。(參見，例如，Kothapalli等人.細胞生長和分化(Cell growth & Differentiation)，8(1)61-68和Boes等人.內分泌學(Endocrinology)，140(4)1575-1580)。
在生物學活性方面，據(jù)報道CTGF的性質基本上是促分裂(能夠刺激靶細胞增殖)。另據(jù)報道CTGF具有趨化活性。據(jù)報道，在病理學方面，全長的CTGF分子是結締組織細胞過生長以及胞外基質過沉積的條件之一。在本領域中CTGF被描述為與涉及血管內皮細胞的遷移和增殖以及新血管生成的條件相關。涉及到這些條件的疾病和障礙包括，例如，皮膚和主要器官的纖維化、癌癥，以及相關疾病和障礙諸如全身性硬皮病、血管生成、動脈粥樣硬化、糖尿病型腎病和腎性高血壓。(參見，例如，Toshifumi等人.1999，細胞生理學雜志(Journal of Cellular Physiology)，18191)153-159；Shimo等人.1999，生物化學雜志(Journal ofBiochemistry)，126(1)137-145；Murphy等人.1999，生物化學雜志(Journal ofBiological Chemistry)，274(9)5830-5834；Wenger等人.1999，致癌基因(Oncogene)，18(4)1073-1080；Frzier等人.1997，國際生物化學和細胞生物學雜志(International Journalof Biochemistry & Cellular Biology)，29(1)153-161；Oemar等人.1997，循環(huán)(Circulation)，95(4)831-839)。
另據(jù)報道，CTGF用于創(chuàng)傷愈合以及結締組織、骨和軟骨的修復。在這方面，在諸如骨質疏松癥、骨性關節(jié)炎或骨軟骨炎、關節(jié)炎、骨骼障礙、肥大性疤痕、燒傷、血管肥大或傷口愈合等障礙中，已將CTGF描述為骨、組織或軟骨形成的誘導物。(參見，例如，美國專利5837258；Ohnishi等人.1998，分子和細胞心臟病學(Journal of Molecular andCellular Cardiology)，30(11)2411-2422；Nakanishi等人.1997，生物化學和生物物理學研究通訊(Biochemical and Biophysical Research Communications)，234(1)206-210；Pawer等人.細胞生理學雜志(Journal of Cellular Physiology)，165(3)556-565)。
總之，CTGF與多種纖維化和癌性條件有關，并認為在傷口愈合中發(fā)揮作用。因而，在本領域中有必要鑒定調制CTGF活性的有用方法，以治療這些多種疾病和障礙。在本發(fā)明之前，沒有CTGF的區(qū)域或結構域負責信號傳導不同的生物學活性這樣的報道。而且，在本發(fā)明前，沒有這樣的公開內容，即通過抑制CTGF的特定區(qū)域或結構域的生物學活性來治療與細胞增殖和/或過量產生細胞外基質有關的疾病或障礙。
發(fā)明概述本發(fā)明提供新的組合物和方法，用于治療CTGF相關的疾病、障礙或失調，其中涉及到細胞外基質的沉積，包括，例如，膠原合成的誘導以及成肌成纖維細胞的分化。更具體地，本發(fā)明的組合物包括含有CTGFN-末端區(qū)域的CTGF片段。一方面，本發(fā)明的片段包含至少一部分外顯子2或3，或者其編碼多肽，它并非是在Brisgstock等人.1997，生物化學雜志(J.Biol.Chem.，)272(32)20275-82中公開的CTGF片段，另外它具有誘導細胞外基質的合成之能力，包括但不限于誘導膠原以及成肌纖維細胞分化之能力。在更進一步方面，本發(fā)明的片段包含大約四分之一至二分之一長度的全長CTGF蛋白質。
一方面，提供了具有如上所述之活性的結締組織生長因子(CTGF)多肽的片段。本發(fā)明的片段包括圖3所示的，具有由至少外顯子2編碼的氨基酸序列的CTGF。該片段也可以包括如圖3所示的，由至少外顯子3編碼的氨基酸序列。本發(fā)明的CTGF片段還可以包括，如圖3所示的，由至少外顯子2和3編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼這類片段的多核苷酸序列。
本發(fā)明進一步包括用本發(fā)明所公開的CTGF片段鑒定能夠調制所述CTGF片段活性的組合物的方法，其中這些組合物可用于控制細胞外基質正常沉積，諸如膠原沉積。更具體地講，CTGF片段可用于鑒定這樣的組合物，即它們可以控制膠原沉積的正常沉積以及成肌纖維細胞的分化，其中，這種組合物可用于抑制、壓制或增加本發(fā)明的CTGF片段的活性。
要求保護的本發(fā)明組合物進一步包含CTGF調制子，例如，由上述方法鑒別的抗體、反義分子、小分子和其它化合物，它們可以調制本發(fā)明的CTGF片段的活性。一方面，本發(fā)明提供抑制或壓制CTGF或者該CTGF片段的活性的CTGF調制子。本發(fā)明的另一方面，CTGF調制子提高了CTGF或者該CTGF片段的活性，例如，在需要誘導CTGF活性的適用癥，例如，在傷口愈合、組織修復和骨修復。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的方法包括將有效量的CTGF片段調制子單獨地或與一種或多種化合物組合，施用于需要治療疾病、障礙或希望操縱膠原合成失調的患者中。本發(fā)明的方法特別旨在利用這樣的化合物，即它們能夠通過調制本發(fā)明的CTGF片段的活性調制膠原合成，結果是，治療與膠原過多合成有關的障礙，包括纖維化障礙。優(yōu)選地是，所述的障礙為真皮、主要器官性的，和與疤痕組織的過量產生有關的障礙。
本發(fā)明也提供包含本發(fā)明之CTGF片段的藥物組合物。這類組合物可用于希望提高CTGF活性的傷口愈合、骨和組織修復。
附圖簡述

圖1顯示成肌細胞誘導測定中的細胞。
圖2A和2B為表示本發(fā)明的CTGF片段在NRK細胞中誘導膠原合成的曲線。
圖3A和3B給出全長CTGF分子的核酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ IDNO2)，其中鑒定了CTGF分子的每一個外顯子的位置。
圖4給出包含CTGF分子外顯子2和3的CTGF N-末端結構域之核酸序列(SEQ ID NO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖5給出有關用抗-CTGF抗體抑制膠原合成之數(shù)據(jù)。
圖6給出有關由導向CTGFN-末端結構域的抗體抑制膠原合成之數(shù)據(jù)。
圖7給出有關由CTGF和CTGF N-末端結構域刺激膠原合成之數(shù)據(jù)。
圖8給出有關CTGF N-末端結構域作為膠原合成以及誘導成肌纖維細胞的活性誘導物之數(shù)據(jù)。
圖9給出有關IGF-2對CTGF誘導的膠原合成的作用之數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述應該理解，本發(fā)明不限制于本文中所描述的特定的方法、方案、細胞系、載體和試劑等，因為這些是可以改變的。也應該理解，本文中所用術語僅僅用于描述特定的實施方案之目的，并不旨在限制本發(fā)明的范圍。必須指出的是，如在本文以及附加的權利要求書中所用，單數(shù)形式的“a(一，一個)”“an(一，一個)”和“the(此，該)”包括了復數(shù)范圍，除非文中另外明確指明。因此，例如，提及“an antibody(一個抗體)”是指本領域技術人員公知的一個或多個抗體和其等同物，等等。
除非另外定義，本文中所用的所有技術和科學術語的含義與由本領域的普通技術人員(本發(fā)明就屬于這些人)所通常理解的含義相同。對優(yōu)選的方法、裝置和材料進行了描述，盡管與本文中描述的那些材料和方法相似或等同的任何材料和方法能夠用于實施或測試本發(fā)明。本文所引用的所有參考文獻，本文全文引用作為參考。定義如本文所用，術語“CTGF片段”指包含至少一部分CTGF N-末端區(qū)域的片段。在一個實施方案中，該片段包含全長CTGF蛋白質之至少一部分外顯子2或3，并且進一步地具有誘導細胞外基質合成的能力。在另一個實施方案中，該片段的長度在全長CTGF蛋白質的大約四分之一至二分之一長度之間?！罢T導膠原合成能力”含義為通過膠原合成以及肌成纖維細胞分化，誘導細胞外基質的形成能力。CTGF片段可以通過從天然來源中分離、合成制造生產、重組遺傳工程技術或者本領域之其它可用技術獲得。
如本文所用，術語“N-末端”指包含至少部分外顯子2和3結構域、大約始于全長CTGF分子起始處的核酸序列以及所編碼的氨基酸序列，正如在圖3A和3B中所鑒定。術語“外顯子2”指其核酸序列和相應的N-末端結構域之氨基酸序列，大約始于全長CTGF分子的起始處及相應的氨基酸序列。術語“外顯子3”，指全長CTGF分子的N-末端結構域之核酸序列和所編碼多肽。
如本文所用，術語“C-末端”指包含全長CTGF分子之至少一部分外顯子4和5結構域的核酸序列以及其所編碼的多肽，正如在圖3A和3B中所鑒定。
如本文所用，術語“障礙”和“疾病”，指與CTGF的表達或者活性相關的狀態(tài)。疾病、障礙以及與CTGF相關的狀態(tài)包括但不限于從急性或反復創(chuàng)傷產生的過度結疤，包括外科手術或放射治療、諸如腎臟、肺臟、肝臟、眼、心臟以及皮膚等器官的纖維化，包括硬皮病、疤痕疙瘩以及肥大性結疤。已將CTGF的異常表達與一般的組織結疤、皮膚中的腫瘤樣生長以及持續(xù)性的血管結疤聯(lián)系起來，導致血液運輸能力的損害、高血壓、肥大等等。與CTGF相關的還有由血管內皮細胞增殖或遷移，諸如癌癥、包括皮膚纖維瘤、與內皮細胞異常表達相關的狀態(tài)、乳腺癌性結締組織生成、血管脂肪瘤和血管平滑肌瘤引起的多種疾病。其它相關的狀態(tài)包括動脈粥樣硬化，包括動脈粥樣化斑塊和全身性硬皮病、炎性腸疾病、慢性結腸炎、血管生成以及在動脈粥樣硬化中起關鍵作用的其它增殖性過程、關節(jié)炎、癌癥以及其它疾病狀態(tài)、青光眼中的新血管生成、由于疾病或損傷導致的包括關節(jié)炎癥的炎癥、腫瘤生長轉移、間質性疾病、皮膚性疾病、關節(jié)炎，包括慢性類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、糖尿病，包括糖尿病型腎病、高血壓和其它腎臟障礙，以及由化學治療、放射治療、透析和同種移植及移植排斥引起的纖維化。
如本文所用，“纖維增殖性”障礙包括但不限于任一上面列出的疾病或障礙，例如，腎臟纖維化、硬皮病、肺臟纖維化、關節(jié)炎、肥大性結疤和動脈粥樣硬化。與CTGF相關的纖維增殖性障礙還包括糖尿病型腎病和視網膜病、高血壓和其它腎臟障礙、與血管生成相關的障礙，包括但不限于與腫瘤形成相關的血管以及在動脈粥樣硬化、關節(jié)炎和其它疾病狀態(tài)中起關鍵作用的其它增殖過程以及，例如，在皮膚、心臟、肺臟和腎臟中的纖維化。總的來講，本文包括涉及腎臟、肝臟、肺臟以及心血管系統(tǒng)的嚴重纖維化。纖維化的例子非常多，包括心臟發(fā)作后的疤痕組織形成，它損害了心臟的泵能力。糖尿病常常引起腎臟損害/結疤，導致腎功能漸進性喪失。甚至在外科手術后，也能夠在內部器官之間形成疤痕組織，引起攣縮、疼痛和在某些情況下的不育癥。主要器官，諸如心臟、腎臟、肝臟、肺臟、眼以及皮膚易于產生慢性結疤，并常常與其它疾病相聯(lián)系。肥大疤痕(非惡性組織大塊)是纖維化的一種常見形式，由燒傷和其它創(chuàng)傷引起。另外，還有許多其它纖維增殖性障礙，諸如硬皮病、疤痕疙瘩和動脈粥樣硬化，它們分別與一般性的組織結疤、皮膚中的腫瘤樣生長或損害血液運輸能力的持續(xù)的血管結疤相關。由于CTGF在纖維化障礙中過表達，所以它代表用于開發(fā)抗-纖維化治療劑的一個非常特異的靶子。通過使用小分子和中和抗體能夠抑制CTGF，例如，在治療纖維增殖性障礙中就是如此。應當理解，“纖維增殖性”指任一上述病理例證，而不應當將其限制于細胞增殖。
“細胞外基質(ECM)”是由多種類型細胞，包括，例如，內皮、上皮、表皮和肌肉細胞合成并包圍該多種類型細胞的多組分結構。ECM主要由膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖形成。EMC還含有hl纖維結合素、玻璃體結合蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖和更小的蛋白質。生長因子通過與硫酸乙酰肝素蛋白多糖的葡糖胺聚糖部分結合而被隔絕于這些基質中。已知高艾杜糖醛酸和高硫酸化的“肝素樣”區(qū)域與來自人成纖維細胞的bFGF之硫酸乙酰肝素結合區(qū)相關(Turnbull等人.J.Biol.Chem.，267(15)10337-10341，1992)。然而，還不完全了解位于細胞外基質的硫酸乙酰肝素的組成特性。
如本文所用，術語“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或者指這些中的任一之片段，指基因組或合成來源的DNA或RNA，它可為單鏈或雙鏈，并可代表正義或反義鏈，指肽核酸(PNA)，或者指來源于天然或合成的任何DNA樣或RNA樣物質。
如本文所用，“氨基酸”或“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白質序列，或者指這些中的任一之片段、部分或亞基，并且指天然存在的或合成的分子。
“雜交”指一種過程，由該過程核酸鏈與互補鏈通過堿基配對連接起來。能夠使雜交反應既靈敏又具有選擇性，這樣，甚至能夠將特定的目的序列從含低濃度該目的序列的樣品中鑒定出來。通過，例如，預雜交和雜交液中鹽或者甲酰胺的濃度，或者通過雜交溫度，可以確定適宜的嚴謹條件，這已為本領域所公知。尤其是，通過減低鹽濃度、提高甲酰胺濃度或者提高雜交溫度，能夠提高嚴謹性。
例如，在含大約50％甲酰胺及大約37℃-42℃中能夠發(fā)生高嚴謹條件下的雜交。在含大約35％-25％甲酰胺及大約30℃-35℃中能夠發(fā)生嚴謹性減低狀態(tài)下的雜交。尤其是，在42℃以及含50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS和200μg/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA中能夠發(fā)生高嚴謹狀態(tài)下的雜交。嚴謹性減低狀態(tài)下的雜交能夠按如上所述發(fā)生，但是要在含35％甲酰胺及降低的溫度35℃條件下進行。通過計算目的核酸之嘌呤對嘧啶比率并相應地調整溫度，能夠進一步地縮窄與特定水平的嚴謹性相對應的溫度范圍。在上述范圍和條件內的改變?yōu)楸绢I域所公知。
術語“實質的氨基酸同源性”指與特定序列有大約75％或者更多，優(yōu)選地85％或者更多，更優(yōu)選地90-95％或者更多的序列相似性的分子。術語“％相似性”或“％相同”指在比較兩個或更多個氨基酸或核酸序列中所發(fā)現(xiàn)的序列相似或相同的百分比。由本領域公知的方法能夠確定百分比相似性。
氨基酸序列間的百分比相似性能夠通過使用，例如，聚簇方法計算出(參見，例如，Higgins，D.G.和P.M.Sharp，1988，基因(Gene)，73237-244)。通過測定所有配對間的距離，聚簇算法將序列分成簇。簇配對排列，接著分成若干類。例如，A序列和B序列的兩個氨基酸序列間的百分比相似性，能夠這樣計算出將序列A的長度分成序列A和序列B間殘基配對的總數(shù)，減去序列A中的間隙殘基的數(shù)目，減去序列B中的間隙殘基的數(shù)目乘以100。在確定百分比相似性時，并不將兩個氨基酸序列間低的或沒有同源性的間隙包括在內。由本領域公知的其它方法，例如，通過變化雜交條件能夠計算出百分比相似性，并且使用程序諸如，MEGALIGN程序等能夠由電腦計算出百分比相似性(DNASTAR Inc.，Madison，Wisconsin.)。
術語“膠原亞基”指由單一基因及該序列之任何衍生物，包括缺失衍生物、保守性替換，等等編碼之膠原蛋白的一條多肽鏈的氨基酸序列。
“融合蛋白質”是來自不同蛋白質的肽序列共價連接在一起而構成的蛋白質。
“反義序列”為能夠與靶序列特異雜交的任何序列。反義序列可以是DNA、RNA或者任何核酸模擬物或類似物。術語“反義技術”指依賴于反義序列與靶序列特異雜交的任何技術。
如本文所用，術語“功能性等同物”指具有CTGF片段的功能特性或結構特性的蛋白質或核酸分子。CTGF片段的功能性等同物可以含有修飾，根據(jù)這種修飾(用于執(zhí)行特定的功能)的需要而定。術語“功能性等同物”旨在包括分子的片段、突變體、雜合體、變異體、類似物或者化學衍生物。
在正常情況下不是該分子的一部分，而當一個分子含有另加的化學組分時，就將該分子說成是另一個分子的“化學衍生物”。這種組分能夠改善分子的可溶性、吸附性、生物學半壽期等等。該組分能夠選擇性地降低其分子的毒性、刪除或者減弱其分子之任何不希望的副作用等等。能夠介導這種效應的組分公開在，例如，Gennaro，A.R編輯，1990，Remington’s藥物科學，第18版，Mack出版公司，Easton PA中。將這種組分偶聯(lián)到分子的方法為本領域公知。
如本文所用，“變異體”指這樣的氨基酸序列，其中的一個或多個氨基酸已被改變。變異體可以有保守性的變化，其中的替代氨基酸具有相似的結構或化學特性，例如，用異亮氨酸取代亮氨酸。更稀少地，變異體可以有非保守性的變化，例如，用色氨酸取代甘氨酸。類似的次要變異也可以包括氨基酸的缺失和/或插入。使用本領域公知的電腦程序，例如，DNASTAR軟件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)，可發(fā)現(xiàn)確定哪些氨基酸殘基可被替代、插入或缺失的指南。制造CTGF片段的方法編碼CTGF的核酸序列依據(jù)本發(fā)明，編碼CTGF或其功能性等同物的核酸序列，正如在美國專利5408040中所描述，可用于產生這樣的重組DNA分子，它指導全長蛋白質或其功能性等同物的表達，或者替代性地，它指導編碼所需CTGF片段之核酸序列的表達，例如，在合適的宿主細胞中，包含CTGF之至少一部分外顯子2或3的片段。
或者，在嚴謹條件下與部分CTGF序列雜交的核酸序列也可用于核酸雜交測定、Southem和Northem印跡分析等等。在另一個方法中，由包含抗體篩選表達文庫以檢測所具有的結構特征的雜交方法可以分離出編碼CTGF的DNA分子。
由于遺傳密碼所固有的簡并性，可以將其它編碼具有實質氨基酸同源性的蛋白質或功能性等同物的氨基酸序列的DNA序列分離出，并在實施本發(fā)明中用于克隆和表達CTGF或CTGF片段。這樣的DNA序列包括那些在嚴謹條件下能夠與人CTGF序列雜交的DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明可以使用的改變的DNA序列包括不同核苷酸殘基的缺失、添加或替代，導致編碼相同或功能性等同物基因產物的序列?；虍a物本身可以含有CTGF序列內的氨基酸殘基之缺失、加入或替代，其導致沉默性改變從而產生功能性上相等的蛋白質?；谒婕皻埢跇O性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性質上的相似性，可以制造這樣的氨基酸替代。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；極性頭部基團不帶電荷并具有相似親水值的氨基酸包括如下亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
為改變蛋白質序列用于多種目的，可以對本發(fā)明的DNA序列進行工程設計，包括但不限于對基因產物的加工和表達進行修飾的改變。例如，使用本領域公知的技術可以將突變引入例如，定點誘變技術可用于，例如，插入新的限制性位點。例如，在某些表達系統(tǒng)，諸如酵母，宿主細胞可以過糖基化基因產物。當使用這樣的表達系統(tǒng)時，可以優(yōu)選改變CTGF或CTGF片段的編碼序列以刪除任何N-連接糖基化位點。
可以將CTGF或CTGF片段的序列連接到異源序列以編碼融合蛋白質。對于篩選肽文庫可以采用例如，構建編碼表達可由商業(yè)提供的抗體識別的異源表位的嵌合CTGF蛋白質。也可以對融合蛋白質進行工程設計，使得在CTGF或CTGF片段序列和異源蛋白質序列，例如，編碼與PDGF相關的生長因子的序列之間含有切割位點，這樣，可以將CTGF或CTGF片段從異源部分切除。這樣的方法為本領域公知。
使用本領域公知的化學方法，也可以全部或部分合成CTGF或CTGF片段的編碼序列。(參見，例如，Caruther等人.1980，Nucleic Acids Res.Symp.Ser.7215-233；Crea和Hom.1980，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，9(10)2331；Matteucci和Caruther.1980，TetrahedronLetters，21719；和Chow和Kempe.1981，核酸研究，9(12)2807-2817)?；蛘?，使用化學方法全部或部分合成CTGF氨基酸序列，能夠產生該蛋白質本身。例如，由固相技術能夠合成肽，將其從樹脂上切割出來，由制備性高效液相色譜進行純化。參見，例如，Creighton，1983，蛋白質結構和分子原理(Proteins Structure and Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，第50-60頁。合成肽的組成可以由氨基酸分析或測序證實。例如，關于Edman降解法，參見Creighton，1983，蛋白質，結構和分子原理(Proteins，Structure andMolecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，第34-49頁。
CTGF或CTGF片段的表達為了表達有生物學活性的CTGF片段和表達編碼該全長蛋白質的核苷酸序列或如上所述的功能性等同物，將CTGF片段插入到合適的表達載體，即其中含有轉錄和翻譯插入的編碼序列所必需的元件的載體。
更具體地講，為本領域技術人員所公知的方法能夠用于構建含有CTGF或CTGF片段的序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內重組/遺傳重組。參見，例如，在Maniatis等人，1989，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.和Ausubel等人，1989，分子生物學現(xiàn)代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.中描述的技術。
有多種宿主-表達載體系統(tǒng)可用于表達CTGF或CTGF片段的編碼序列。這些包括但不限于微生物體諸如，用含有CTGF或CTGF片段編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；用含有CTGF或CTGF片段編碼序列的重組酵母表達載體轉化的，包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等酵母和多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)；用含有CTGF或CTGF片段編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用含有CTGF或CTGF片段編碼序列的重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或者用含有CTGF或CTGF片段編碼序列的重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉化的植物細胞系統(tǒng)；或者用重組病毒表達載體(例如，腺病毒、痘病毒、人腫瘤細胞(包括HT-1080))感染的動物細胞系統(tǒng)，包括工程設計的含有多拷貝CTGF DNA(在雙微染色體中穩(wěn)定地擴增(CHO/dhfr)或者不穩(wěn)定地擴增(例如，鼠細胞系))的動物細胞系統(tǒng)。應該明白，正如本文所用，術語“宿主-表達載體系統(tǒng)”和更普遍地，術語“宿主細胞”包括宿主細胞或宿主-表達載體系統(tǒng)的任何后代。更應該明白，盡管不是所有的后代與親代細胞可能完全一樣(這是由于在復制期間可能發(fā)生突變)，但這樣的后代將包括在本發(fā)明的范圍內。
這些系統(tǒng)的表達元件在其強度和特異性方面有所變化。根據(jù)所采用的宿主/載體系統(tǒng)，可將多種合適的，包括組成型和誘導型啟動子的轉錄和翻譯元件中的任何一種用于表達載體。例如，當在細菌系統(tǒng)中克隆時，可以使用誘導型啟動子，諸如，噬菌體λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)等等；當在昆蟲細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用啟動子諸如桿狀病毒多角體蛋白啟動子；當在植物細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用衍生自植物細胞基因組的啟動子(例如，熱休克啟動子；RUBISCO小亞基的啟動子；葉綠素a/b結合蛋白質的啟動子)或者衍生自植物病毒的啟動子(例如，CaMV的35S RNA啟動子；TMV衣殼蛋白質的啟動子)；當在哺乳動物細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用衍生自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或者衍生自哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；痘病毒7.5K啟動子)；當構建含有多拷貝CTGF或CTGF片段DNA的細胞系時，可以使用帶有合適的選擇性標記的基于SV40、BPV和EBV的載體。
在細菌系統(tǒng)中，依據(jù)旨在用于表達CTGF或CTGF片段，可以有利地選擇多種表達載體。例如，用于在細菌中表達的合適載體包括基于T7的載體(正如在Rosenberg等人，1987，基因(Gene)，56125中所描述)。作為進一步的例子，當希望產生大量的CTGF或CTGF片段以篩選肽文庫時，可能需要這樣的載體，它指導可被容易地純化的蛋白質產物高水平表達。這樣的載體包括但不限于大腸桿菌(E.coli)表達載體pUR278(Rurher等人，1983，EMBO J.，21791)，其中CTGF或CTGF片段的編碼序列可連接到載體中l(wèi)acZ編碼區(qū)的框架中，如此則產生AS-lacZ雜合蛋白質；pIN載體(Inouye和Inouye，1985，核酸研究，133101-3109；VanHeeke和Schuter，1989，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，2645503-5509)；等等。也可以使用pGEX載體表達諸如帶有谷胱甘肽S-轉移酶的CTGF或CTGF片段的外源多肽。一般情況下，這樣的融合蛋白質是可溶的，并且通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，隨后在有游離的谷胱甘肽存在下洗脫，可容易地將其從裂解細胞中純化。在pGEX載體中設計有凝血酶或因子Xa蛋白酶的切割位點，這樣能夠將所克隆的目的多肽從GST部分釋放出來。
一般當宿主為原核生物時，使用本領域公知的方法，收集對數(shù)生長之后的細胞并隨后用CaCl2處理，或者替代性地用MgCl2或RbCl處理，可從這樣的細胞制備出能夠吸收DNA的感受態(tài)細胞。
當宿主為真核生物時，則可使用多種DNA轉移方法。這些方法包括由磷酸鈣沉淀轉染DNA、常規(guī)的機械方法，包括顯微注射、包裹于脂質體內的質粒的插入，或者使用病毒載體。真核細胞也可以用編碼本發(fā)明之多肽的DNA序列以及第二種外源DNA分子，編碼可選擇表型，諸如單純皰疹胸苷激酶基因共轉化。另一個方法是用真核病毒載體，諸如猿猴病毒40(SV40)或者牛乳頭瘤病毒，瞬時轉染或轉化真核細胞并表達蛋白質。參見，真核細胞表達載體(Eukaryotic Viral Vectors)，1992，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman編輯。真核宿主細胞包括酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞。
在酵母中，可以使用含有組成型或誘導型啟動子的多種載體。這方面的綜述見，例如，分子生物學現(xiàn)代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第2卷，1988，Ausubel等人編輯，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，第13章；Grant等人，1987，酶學方法(Methodsin Enzymology)，Wu&Grossman編輯，Acad.Press，N.Y.，153516-544；Glover，1986，DNA克隆(DNA Cloning)，第II卷，IRL Press，Wash.D.C.，第3章；Bitter，1987，異源基因在酵母中的表達，酶學方法(Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods inEnzymology)，Berger和Kimmel編輯，Acad.Press，N.Y.，152673-684；和釀酒酵母的分子生物學(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)，1982，Strathem等人編輯，ColdSpring Harbor Press，第I和II卷。例如，已報道用于在酵母中表達外源基因的多種穿梭載體(Heinemann等人，1989，自然(Nature)，340205；Rose等人，1987，基因，60237)。
在使用植物表達載體的情況下，CTGF或CTGF片段編碼序列的表達可以由許多啟動子中的任一來驅動。例如，可以使用病毒啟動子，諸如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動子(Brisson等人，1984，自然，310511-514)或者TMV的外殼蛋白質啟動子(Takamatsu等人，1987，EMBO J.，6301-311)；或者，可以使用植物啟動子諸如RUBISCO小亞基(Coruzzi等人，1984，EMBO J.，31671-1680；Broglie等人，1984，科學(Science)，224838-843)或者熱休克啟動子例如大豆hsp17.5-E和hsp17.3-B(Gurley等人，1986，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)，6559-565)。使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接的DNA轉化、顯微注射、電穿孔等等能夠將這些構建體引入到植物細胞中。關于此類技術之綜述，參見，例如，Weissbach和Weissbach，1988，植物分子生物學方法(Methodsfor Plant Molecular Biology)，Academic Press，NY，第VIII節(jié)，第421-463頁；Grierson和Corey，1988，植物分子生物學(Plant Molecular Biology)，第2版，Blackie，London，第7-9章。
在昆蟲系統(tǒng)，可以使用替代的表達系統(tǒng)用于表達CTGF或CTGF片段。在一個這樣的系統(tǒng)中，將桿狀病毒用作表達外源基因的載體。接著，該病毒在昆蟲細胞中生長。可以將CTGF或CTGF片段的編碼序列克隆到病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)并置于桿狀病毒啟動子的控制之下。接著，將這些重組病毒用于感染昆蟲細胞，使插入基因在這些昆蟲細胞中表達。參見，例如，Smith等人，1983，病毒學雜志(J.Virol.)，46584；Smith，美國專利4,215,051。
在哺乳動物宿主細胞中，可以使用許多基于病毒的表達系統(tǒng)。在使用腺病毒作為表達載體的情況下，可以將CTGF或CTGF片段的編碼序列連接到腺病毒轉錄/翻譯控制復合物，例如，后期啟動子和三聯(lián)引導序列。通過體外或體內重組，接著可以將此嵌合基因插入到腺病毒基因組中。在病毒基因組非必需區(qū)(例如，區(qū)域E1或E3)中插入，將產生有活性并能夠在被感染宿主中表達CTGF或CTGF片段的重組病毒。參見，例如，Logan和Shenk，1984，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))，813655-3659?；蛘撸梢允褂门６?.5K啟動子。參見，例如，Mackett等人，1982，美國國家科學院院刊，797415-7419；Mackett等人，1984，病毒學雜志，49857-864；Panicali等人，1982，美國國家科學院院刊，794927-4931。
在另一個實施方案中，將CTGF或CTGF片段序列在已用磷酸鈣沉淀和新霉素抗性基因穩(wěn)定地轉染的人腫瘤細胞，諸如，HT-180中表達。而在另一個實施方案中，將pMSXND表達載體等等用于在多種哺乳動物細胞包括COS、BHK 293和CHO細胞中的表達(Lee和Nathans，1988，J.Biol.Chem.，2633521)。
為有效地翻譯插入的CTGF或CTGF片段編碼序列，還可能需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。如果在將完整CTGF基因，包括它自己的起始密碼子和鄰近序列插入到合適的表達載體的情況下，則不需要任何另加的翻譯控制信號。但是，如果在將僅僅一部分CTGF編碼序列插入的情況下，必需提供外源性的翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼子一定要與CTGF或CTGF片段的編碼序列處在相同相位的閱讀框架中，以確保插入的完整表達。這些外源性的翻譯控制信號和起始密碼子可有多種來源，既包括天然的又包括合成的。在包含有適宜的轉錄增強子元件、轉錄終止子等的條件下，表達效率可以得到提高。參見，例如，Bitter等人，1987，酶學方法，153516-544。可以加入添加序列，即引導序列等，指導CTGF或CTGF片段沿多種途徑分泌。這可以在許多表達系統(tǒng)中，通過使用本領域公知的多種方法實現(xiàn)。
另外，可以選擇這樣的宿主細胞菌株，它們調制插入序列的表達或者以所希望的特定方式修飾和加工基因產物。對蛋白質產物如此修飾(例如，糖基化)和加工(例如，剪切)對蛋白質的功能可能是重要的。不同的宿主細胞具有特有的和特定的蛋白質翻譯后加工和修飾機制。可選擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)，確保所表達的外源蛋白質的正確修飾和加工。為了這個目的，可以使用這樣的真核宿主細胞，它們具有恰當?shù)丶庸こ跏嫁D錄本、將基因產物糖基化和磷酸化的細胞器。這樣的哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、W138、HT-1080等等。
為長期高水平地產生重組蛋白質，優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，可以工程設計穩(wěn)定地表達CTGF或CTGF片段的細胞系?？梢允褂糜珊线m的表達控制元件(例如，啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等等)和選擇標記控制的CTGF或CTGF片段DNA，而不是使用含有病毒復制起始點的表達載體，轉化宿主細胞。將外源DNA引入后，可以讓工程化細胞在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長1-2天，接著轉換到選擇培養(yǎng)基中。重組質粒中的選擇標記賦予選擇抗性并允許細胞將質粒穩(wěn)定地整合到它們的染色體中，細胞生長形成病灶，它們又轉過來能夠被克隆和擴增為細胞系。
可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括但不限于分別可以在tk-、hgprt-和aprt-細胞中使用的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，細胞，11223)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska和Szybalski，1962，美國國家科學院院刊，482026)和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶的基因(Lowry等人，1980，細胞，22817)。
抗代謝物抗性也可用作選擇基礎，dhfr基因賦予甲氨蝶呤抗性(Wigler等人，1980，美國國家科學院院刊，773567；O’Hare等人，1981，美國國家科學院院刊，781527)；gpt基因賦予麥考酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，美國國家科學院院刊，782072)；neo基因賦予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)，1501)和hyrgro基因賦予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，基因，30147)。最近，對更多的選擇基因進行了描述，它們是trpB(它允許細胞利用吲哚代替色氨酸)、hisD(它允許細胞利用組氨醇代替組氨酸)(Hartman和Mulligan，1988，美國國家科學院院刊858047)和ODC(鳥氨酸脫羧酶，賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑(2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸，DFMO(McConlogue，1987，在Current Communications in Molecular Biology，Cold SpringHarbor Laboratory中)抗性)。
可用任何常規(guī)手段，諸如，例如，制備型色譜分離和免疫分離(諸如涉及使用單克隆和多克隆抗體的分離)分離和純化宿主細胞表達的本發(fā)明之多肽。
表達CTGF或CTGF片段的轉染子或轉化子的簽定含有編碼序列并表達有生物學活性的基因產物的宿主細胞可通過至少四種方法鑒定(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)“標記”基因的功能是否存在；(c)通過測量CTGF或CTGF片段的mRNA轉錄本在宿主細胞中的表達確定轉錄水平；和(d)通過分析基因產物或者測定其生物學活性檢測基因產物。
在第一個方法中，使用包含與CTGF或CTGF片段編碼序列分別同源的核苷酸序列或者其部分，或者其衍生物作為探針，通過DNA-DNA或DNA-RNA雜交能夠檢測插入到表達載體中的CTGF或CTGF片段編碼的序列的存在。
在第二個方法中，基于某些“標記”基因的功能(例如，抗生素抗性、甲氨蝶呤抗性、轉化表型、在桿狀病毒中包涵體(occlusion body)的形成，等等)的存在與否能夠鑒定和選擇重組表達載體/宿主系統(tǒng)。例如，在優(yōu)選的實施方案中，將CTGF編碼序列插入到載體的新霉素抗性標記基因序列內，含有CTGF編碼序列的重組子可以通過標記基因功能的不存在予以鑒定?；蛘?，將標記基因與CTGF序列串聯(lián)，共同受用于控制CTGF編碼序列表達的相同或不同啟動子的控制。響應誘導或選擇而出現(xiàn)的標記表達提示CTGF編碼序列的表達。
在第三個方法中，可通過雜交測定評價CTGF或CTGF片段編碼區(qū)域的轉錄活性。例如，使用與CTGF或CTGF片段編碼序列同源的序列或者與其特定部分同源的序列作探針，分離RNA并通過Northern印跡對其進行分析。或者，提取宿主細胞的總核酸，測定其與這些探針的雜交。
第四個方法涉及檢測有生物學活性或免疫反應的CTGF或CTGF片段之基因產物。有許多測定法，包括但不限于在美國專利5408040中描述的那些測定法，能夠用于檢測CTGF活性。
切割全長CTGF蛋白質以產生CTGF片段在表達出全長CTGF蛋白質后，可以通過本領域普通技術人員公知的許多蛋白水解酶切割該蛋白質，產生本發(fā)明之CTGF片段。例如，使用本領域中已知的方法，CTGF N-末端半分子和C-末端半分子之間的半胱氨酸游離橋對胰蛋白酶敏感。
調制和抑制CTGF片段活性的方法如上所述，本發(fā)明中描述的CTGF片段是在纖維化狀態(tài)中細胞外基質沉積的關鍵決定簇。通過調節(jié)、調制和/或抑制該片段的活性和/或表達，或者如果希望，可提高該片段的活性，本發(fā)明提供預防和治療與所述片段活性相關的并發(fā)癥的方法。更具體地，本發(fā)明的方法提供用于施用治療有效量的制劑，該制劑按照所希望的那樣調節(jié)、調制和/或抑制CTGF之N-末端片段的產生細胞外基質活性，以治療、預防或改善與CTGF的表達和活性相關的疾病或障礙。
抗體在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法涉及到施用治療有效量的，特異性地與本發(fā)明的CTGF片段反應抗體。在美國專利5,783,187和PCT公開文件WO9638172中對特異性地與CTGF反應的抗體進行了描述。使用本領域公知的方法可以產生CTGF抗體。這樣的抗體可包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈抗體，以及包括F(ab’)2和Fv片段的Fab片段。通過例如Fab表達文庫可產生片段。特別優(yōu)選中和抗體，即抑制二聚體形成的那些抗體，用于治療用途。
可以對靶多肽(諸如，CTGF或者調制CTGF活性或表達的制劑)進行評價，確定高免疫原性區(qū)。分析方法和表位選擇方法為本領域公知。參見，例如，Ausubel等人編著，1988，分子生物學現(xiàn)代方法(Current Protocols in Molecular Biology)。通過例如多種軟件包，諸如LASERGENE NAVIGATOR軟件(DNASTAR；Madison，WI)，也能夠完成分析和選擇。用于誘導抗體的肽或片段應具有抗原性，但并不一定要具有生物學活性。優(yōu)選地，抗原片段或肽的長度為至少5個氨基酸，更優(yōu)選地，長度為至少10個氨基酸，最優(yōu)選地，長度為至少15個氨基酸。優(yōu)選地，抗體誘導片段或肽與至少一部分靶多肽(例如，CTGF)的氨基酸序列完全相同。也可以將模擬至少一部分天然存在的靶多肽序列的肽或片段與另一種蛋白質(例如，匙孔血藍蛋白(KLH))融合，并且能夠產生針對嵌合分子的抗體。
用于產生抗體的方法為本領域公知。例如，用靶多肽或任何致免疫片段或其肽注射，可以免疫多種宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠、人類及其它。依據(jù)宿主的種類，可以使用多種佐劑以增強免疫應答。這樣的佐劑包括但不限于弗氏佐劑、無機凝膠(諸如氫氧化鋁)和表面活性物質，諸如溶血卵磷脂(lysolecithin)、多聚醇(pluronic polyols)、聚陰離子(polyanions)、肽、乳化油、KLH和二硝基苯酚。在用于人的佐劑當中，特別優(yōu)選BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
使用任何由培養(yǎng)中的連續(xù)細胞系產生抗體分子技術都可以制備單克隆和多克隆抗體。用于體內和體外的產生技術為本領域所公知。參見，例如，Pound，J.D.，1998，免疫化學方法(Immunochemical Protocols)，Humana Press，Totowa，NJ；Harlow，E和D.Alane，1988，抗體實驗室手冊(Antibodies，A Laboratorv Mannual)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。嵌合抗體的產生也是眾所周知，單鏈抗體的產生也是如此。參見，例如，Morrison，S.L.等人，1984，美國國家科學院院刊，816851-6855；Neuberger，M.S.等人，1984，自然，312604-608；Taketa，S.等人，1985，自然，314452-454。具有相關特異性但獨特個體遺傳型組成的抗體可以由，例如，來自隨機組合免疫球蛋白文庫的鏈交換產生。參見，例如，Burton，D.R.，1991，美國國家科學院院刊，8811120-11123。
抗體也可以通過體內誘導在淋巴細胞群中產生或者用高特異性結合試劑通過篩選免疫球蛋白文庫或系列而產生。參見，例如，Orlandi，R.等人，1989，美國國家科學院院刊，863833-3837；Winter，G.和C.Milstein，1991，自然，349293-299。也可以產生含有針對靶多肽的特異性結合位點的抗體片段。這樣的抗體片段包括但不限于F(ab’)2片段(能夠由胃蛋白酶消化抗體分子產生)和Fab片段(能夠由還原F(ab’)2片段的二硫橋產生)?；蛘撸梢詷嫿‵ab表達文庫，以允許快速和容易地鑒定具有所希望特異性的單克隆Fab片段。參見，例如，Huse，W.D.等人，1989，科學，2541275-1281。
使用本領域公知的多種方法能夠檢測抗體抗靶多肽的活性。有多種可用于篩選(以鑒定具有所希望的特異性的抗體)的技術，包括多種免疫測定(諸如酶聯(lián)免疫測定(ELISA)，包括直接和配體捕獲ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫印跡和熒光激活的細胞分選(FACS)。許多用于競爭性結合或者免疫放射性測定的方法(使用確定特異性的多克隆或者單克隆抗體)為本領域所公知。參見，例如，Harlow和Lane。這樣的免疫測定一般包括測定靶多肽與特異性抗體間形成復合物。優(yōu)選雙位點、基于單克隆抗體的免疫測定(使用能與靶多肽上非干擾的雙表位反應的單克隆抗體)，但是也可以使用其它測定，諸如競爭性結合測定。參見，例如，Maddox，D.E.等人，1983，實驗醫(yī)學雜志(J Exp Med)，1581211。
本發(fā)明設計使用與CTGF多肽或其片段特異性地反應的抗體，該抗體中和本發(fā)明之CTGF片段的生物學活性。在本方法中所施用的抗體可以是完整的抗體或者其抗原結合片段，諸如Fab、F(ab’)2和Fv片段，它們能夠結合表位的抗原決定簇。在本方法中所使用的抗體可以是多克隆抗體，或者更優(yōu)選地，單克隆抗體。具有不同表位特異性的單克隆抗體是通過本領域公知的方法，從含有蛋白質片段的抗原制造的。參見，例如，Kohler等人，自然，256494；Ausubel等人，同上。
在本發(fā)明中，治療應用包括使用導向CTGF或其片段的“人”或“人源化”抗體的那些治療應用。人源化抗體為具有與親代抗體相同結合特異性的抗體或抗體片段，一般源自小鼠，但提高了其人源特性。人源化抗體可以，例如，由鏈交換或者由噬菌體展示技術獲得。例如，將包含非人抗體的重鏈或輕鏈可變結構域、特異性地針對CTGF的多肽與人互補(輕或重)鏈可變結構域的所有組成部分組合。將特異性地針對目的抗原的雜合配對選擇出來。所選配對中的人鏈可接著與人的互補可變結構域(輕或重)之所有組成部分組合，并可選擇出與抗原特異結合的人源化抗體多肽二聚體。能夠用于本發(fā)明的方法、描述產生人源化抗體的技術，公開在例如，美國專利5565332、5585089、5694761和5693762中。而且，在例如美國專利5545806和5569825中描述了在轉基因小鼠中產生人抗體的技術。
反義寡核苷酸本發(fā)明提供這樣的治療方法，它直接干擾CTGF信使，具體地全長CTGF信使(其中，該全長蛋白質接著被切割形成本發(fā)明的CTGF片斷)或者CTGF片斷(統(tǒng)稱“CTGF mRNA”)翻譯為蛋白質。更具體地，本發(fā)明提供這樣的方法，其中使用反義核酸或核酶結合或切割CTGF mRNA。反義RNA或DNA分子特異性地與靶基因的RNA信使結合，阻斷該基因蛋白質產物的表達。反義鏈結合信使RNA，形成不能夠被細胞翻譯的雙鏈分子。另外，化學反應基團，諸如結合鐵的乙二胺四乙酸(EDTA-Fe)能夠結合到反義寡核苷酸上，引起雜交位點處RNA的切割。反義方法抑制基因翻譯的這些和其它用途為本領域公知。參見，例如，Marcu-Sakura，1988，分析生物化學(Anal.Biochem)，177278。
更具體地，在本發(fā)明的一個實施方案中，用于抑制CTGF mRNA表達的反義多核苷酸的序列能夠通過比較直向同源基因的序列(在不同種類間保存的序列)或者通過直向同源基因的轉錄本并鑒定這些序列中的高度保守區(qū)而獲得。核酸序列的相似性可以由本領域公知的方法和規(guī)則系統(tǒng)確定。這樣的方法和規(guī)則系統(tǒng)包括，例如，BLAST程序(Basic LocalAlignment Search Tool atthe National Center for Biological Information)、ALIGN、AMAS(多重排列的序列分析，Analysis of Multiple Aligned Sequences)和AMPS(蛋白質多重序列排列對比，Protein Multiple Sequence Alignment)。
對于一段給定的多核苷酸，在選擇優(yōu)選的長度時，應考慮多種因素以達到最佳特性。一方面，本發(fā)明的多核苷酸長度為至少15個堿基對(bp)；優(yōu)選地長度為大約15bp至大約100bp；更優(yōu)選地，多核苷酸長度為大約15bp至大約80bp；甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸長度為大約15bp至大約60bp。較短的多核苷酸，諸如10至低于15聚體，在提供較高的細胞穿透作用的同時，卻具有較低的基因特異性。與此相反，較長的多核苷酸(20-大約30bp)提供較好的特異性，卻顯示減低的吸收進細胞動力學。參見，Stein等人，“寡脫氧核苷酸基因表達的反義抑制劑”，Cohen編著，McMillan出版社，倫敦(1988)。對轉錄本RNA靶序列的可及性也是重要的，因而，位于靶向RNA中的成環(huán)區(qū)和直向同源序列提供有價值的靶子。在本發(fā)明的公開內容中，術語“多核苷酸”既涵蓋自然界中存在的那種寡聚體核酸部分(諸如DNA和RNA的脫氧核苷酸和核苷酸結構)又涵蓋能夠與自然界中存在的核酸結合的人造類似物。本發(fā)明的多核苷酸可以是基于由磷酸二酯鍵連接的核苷酸或脫氧核苷酸單體，或者是基于由甲基磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵或其它鍵連接的類似物。它們也可以包含改變了堿基結構或者其它修飾的單體部分，但是它們仍保留與天然存在的轉錄本RNA結構結合的能力。這樣的多核苷酸可以通過本領域公知的方法制備，例如，使用有商業(yè)供應的儀器和試劑(諸如能從Perkin-Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)得到的那些)來制備。例如，根據(jù)標準方法學，合成特異性地靶向轉錄本的多核苷酸。硫代磷酸酯修飾的DNA多核苷酸一般在自動化的DNA合成儀(可從多個制造商獲得)上自動化合成DNA。這些儀器能夠合成長度達100bp、納摩爾量的多核苷酸。由現(xiàn)代儀器合成的較短多核苷酸通常不需進一步純化就適于使用。如果需要，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向色譜可以純化多核苷酸。參見，Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二卷，第11章，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
磷酸二酯鍵連接的多核苷酸對血清中或細胞內核酸酶的作用尤其敏感，所以，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸為硫代磷酸酯或甲基磷酸酯連接的類似物，已發(fā)現(xiàn)這些類似物抗核酸酶。本領域普通技術人員能夠容易地選擇其它連接鍵用于本發(fā)明。也可以設計這些修飾，目的是改善細胞對多核苷酸的吸收和穩(wěn)定。
用于施用多核苷酸的合適的載體可以包括，例如，載體、抗體、藥學組合物、結合或尋靶蛋白質，或病毒傳送系統(tǒng)，使序列進入靶細胞或組織中富集。可以本發(fā)明的多核苷酸與，例如，識別內皮細胞或腫瘤細胞的結合蛋白質偶聯(lián)。施用后，本發(fā)明的多核苷酸能夠靶向受體細胞或組織，這樣就使例如細胞因子、轉錄因子、G-蛋白偶聯(lián)受體、腫瘤抑制蛋白和細胞凋亡起始蛋白可以獲得增強的表達。
使用重組表達載體諸如嵌合病毒或膠體分散系統(tǒng)，能夠傳送反義分子等等。如本發(fā)明所述，能夠用于基因治療的多種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘病毒或優(yōu)選地RNA病毒諸如逆病毒。許多已知的逆病毒能夠轉移或結合用于選擇標記的基因，這樣就能夠對轉導細胞進行鑒定和繁殖。通過將目的多核苷酸序列插入到病毒載體中(例如)編碼配體(而其受體位于特異的靶細胞上)的另一個基因旁邊，載體將是靶特異性的。通過將(例如)編碼糖、糖脂或蛋白質的多核苷酸插入到逆病毒載體，能夠將其構建為靶特異性的。用抗體靶向逆病毒載體，實現(xiàn)優(yōu)選的靶向性。本領域技術人員將知道或者可以容易地，而不需要不適當?shù)膶嶒灒_定特定的多核苷酸序列，可以將這些多核苷酸序列插入到逆病毒基因組以允許含有反義多核苷酸的逆病毒載體靶特異性傳送。
由于重組的逆病毒是缺陷型的，所以它們需要協(xié)助以產生感染性載體顆粒。這些協(xié)助可通過，例如，使用含有編碼逆病毒所有結構基因(它們由LTR內的調節(jié)序列控制)的質粒的輔助細胞系提供。這些質粒丟失了這樣的核苷酸序列，它們能夠使包裝機制識別用于包衣殼作用的RNA轉錄本。包裝信號有缺失的輔助細胞系包括但不限于ψ2、PA317和PA12。這些細胞系產生空的病毒粒，這是由于其中沒有包裝基因組。如果將逆病毒載體引入到這樣的細胞中，其中的包裝信號是完整的、但結構基因被其它目的基因取代，則能夠將載體包裝并且產生載體病毒粒。
或者，用編碼逆病毒結構基因gag、pol和env的質粒，通過常規(guī)的磷酸鈣轉染法可直接轉染NIH3T3或其它組織培養(yǎng)細胞。接著，用含有目的基因的載體質粒轉染這些細胞。所得細胞釋放逆病毒載體到培養(yǎng)基中。
反義分子的另一個靶向傳送系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復合物、納諾膠囊、微球體、珠和基于脂質的系統(tǒng)(包括油浸水乳濁液、膠束、混合膠束和脂質體)。本發(fā)明的優(yōu)選膠體系統(tǒng)為脂質體。脂質體是人工的膜囊，它們被用作體內和體外的傳送系統(tǒng)。已經證實，巨大單片層囊(LUV)(大小范圍在0.2-4.0μm)能夠包被顯著比例的含有大量大分子的水性緩沖液。RNA、DNA和完整的病毒粒可被膠囊化地包被在水性內部并以有生物學活性的形式傳送到細胞中。脂質體要成為有效的基因轉移媒介物，應具備以下特性(1)目的基因高效率地膠囊化包被而不犧牲其生物學活性；(2)與非靶細胞相比，優(yōu)先地并顯著地結合靶細胞；(3)高效率地將囊泡中的水性內容物傳送到靶細胞細胞質；和(4)遺傳信息的準確有效表達。
小分子抑制物本發(fā)明進一步提供這樣的方法，其中對抑制本發(fā)明的CTGF片段活性的小分子進行了鑒定并使用。
可通過多種篩選技術，對抑制CTGF片段活性的小分子進行鑒定。用于篩選化合物的測定將提供與化合物結合到蛋白質或細胞靶位相關的可檢測信號。依據(jù)測定的性質，可檢測信號可以是光吸收或發(fā)射、空斑形成或者其它方便的信號。結果可以是定性的或定量的。
篩選具有特異性結合的化合物，可以使用多種免疫測定法，檢測結合到細胞的人(或靈長類)抗體。因而，可以使用標記的抗人免疫球蛋白，例如，抗人IgM、IgG或其組合，檢測特異性結合到人抗體半乳糖基表位的人抗體。可使用多種標記，諸如放射性同位素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑、顆粒等等。有許多商業(yè)供應的試劑盒，提供標記的抗人免疫球蛋白，可以根據(jù)制造商提供的方法來使用。
有多種方法可用于篩選化學化合物文庫。在某種程度上，要依賴化合物制備物的性質選擇合適的方法。例如，化合物可以結合到一個個顆粒、針、膜等等上面，其中每一個化合物都是隔開的。另外，化合物的含量將根據(jù)構建文庫所使用的方法而變化。而且，依據(jù)化合物與支持物結合的性質，可以做到釋放等分量化合物，以完成一系列的測定。另外，對已表明有活性的化合物的鑒定能力將影響化合物的測定方式。
當化合物一個個地在網格的表面上，而且知道在網格的每一個位點上是什么組成，如此則能夠提供這樣的細胞樣平層，其構造與網格相似，并可將每一個結合到固體表面的化合物的位置注冊。一旦將平層和固體底物注冊，就可以依據(jù)化合物的結合方式將化合物從表面釋放。在給予化合物足夠時間以結合到位于細胞樣表面的蛋白質后，可沖洗細胞樣平層以去除非特異性結合的化合物?？赡苄枰淮位蚨啻螞_洗，其中，根據(jù)所需要的親和力程度，可用沖洗提供變化的嚴謹度。沖洗完畢后，此時可以加入哺乳動物血液或血漿并溫育足夠的時間用于細胞毒性。接著可以將血漿或血液去除并觀察空斑，其中化合物的性質可以根據(jù)其在網格中的位置確定。當然，血漿或血液不應該含有能夠天然地殺死平層細胞的任何組分。
由于可以重復制備過程，所以可以制備多份固體底物，其中在可比位點上制備出相同的化合物，這樣就能夠用相同或不同的細胞重復篩選，確定一個個化合物的活性。在某些情況下，可通過核酸標簽，聚合酶鏈反應擴增標簽確定化合物的身份(參見，例如，WO93/20242)。在這種情況下，通過取出裂解物并將裂解物引入到含有對核酸標簽特異的引物的聚合酶鏈反應介質中，可以確定活性化合物。關于擴增，可以對核酸標簽測序或者由其它手段確定其序列，其結果將表明用于制備化合物的合成步驟。
或者，可以獲得這樣的加標簽顆粒，其標簽可從顆粒釋放出來并提供二元密碼子，描述化合物結合到顆粒上的合成步驟。參見，例如，Ohlmeyer等人，美國國家科學院院刊(1993)，9010922。這些標簽可以方便地是烯化化合物的同源系列，它們可通過氣相色譜-電子捕捉檢測。依據(jù)連接基團的性質，可使其從顆粒中部分釋放，這樣，在鑒定特定的化合物之前，能使用顆粒2至3次。
對于絕大部分已討論的文庫，只要能夠將CTGF的表位連接到每一個化合物，就可以對任何巨大的化合物組進行類似的篩選。因而，也可以對天然和合成的不同來源化合物，包括大環(huán)內酯物、寡肽、核酸、dendrimers等等用相似的方式篩選。
在測定中形成空斑證實文庫中的成員結合到細胞，通常是表面蛋白質上，并不干擾CTGF表位結合抗體，并且免疫復合物足夠穩(wěn)定以啟動補體級聯(lián)，而且該成員對靶子具有高親和力。
其它用于獲得調制本發(fā)明之CTGF片段活性的小分子篩選方法，公開在PCT公開文件WO9813353中。
藥物配方和施用方式為了鑒定用于本方法通過調制CTGF的活性和表達，用于治療或預防腎臟障礙的小分子和其它試劑，可將CTGF和其生物學活性片段用于，在多種篩選技術的任何之一中，篩選治療化合物。在這些篩選試驗中所使用的片段可以是游離于溶液中、固定在固體支持物上、加載到細胞表面或者定位于細胞內。生物學活性的阻斷或還原，或者CTGF與待試驗介質間結合復合物的形成，可通過本領域中可用的方法測量。
用于藥物篩選的其它技術，其中可以對與CTGF或者用于調制、調節(jié)或抑制CTGF的表達和/或活性的另一個靶多肽具有適當結合親和力的化合物進行高通量篩選，為本領域公知。例如，使用本領域中可用的方法，可以對攜帶試驗化合物的微矩陣進行制備、使用和分析。參見，例如，Shalton，D等人，1995，PCT申請WO95/35505 Baldeschweiler等人，1995，PCT申請WO95/251116；Brennan，T.M.等人，1995，美國專利5474796；Heller，M.J.等人，1997，美國專利5,605,662。
通過多種其它篩選技術，也能夠對調制CTGF活性的小分子進行鑒定，這些小分子也可用于鑒定抗體和與CTGF相互作用的其它化合物，并可被用作本方法的藥物和治療劑。參見，例如，Enna，S.J.等人編著，1998，藥理學中的當代方法(Current Protocols inPharmacologv)，John Wiley and Sons。在測定中，通常提供化合物與蛋白質或細胞靶子結合相關的可檢測信號?？赏ㄟ^例如熒光團、酶軛合和本領域公知的其它可檢測標記檢測結合。參見，例如，Enna等人。結果可以是定性的或定量的。
為篩選具有特異性結合的化合物，可以使用多種免疫測定法，用于檢測例如人或靈長類的結合到細胞的抗體。因而，可以使用標記的抗人免疫球蛋白例如，抗人IgM、抗人IgG或其組合，檢測特異性地結合到人抗體半乳糖基表位的人抗體?？梢允褂枚喾N標記，諸如放射性同位素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑、顆粒等等。有許多商業(yè)供應的試劑盒，提供標記的抗人免疫球蛋白，可以根據(jù)制造商提供的方案來使用。
可以使用廣泛多種方案，篩選有細胞毒效應的化合物，以確保獲得所希望的活性。通常使用細胞，它可以是天然存在的或經修飾的、細胞系或其它等等。細胞可以是真核細胞或原核細胞。例如，如果對病原體感興趣，而不在乎化合物結合物結合到哪一個表位，那么，在存在抗體依賴的細胞毒系統(tǒng)中，就可以將病原細胞與每一個化合物組合，確定細胞毒效應。可以在確定各種候選化合物對將使用于該宿主的宿主細胞的效應之前或者之后，進行這樣的測定。通過這種方式，就可以獲得對病原靶子的親和力和對可能遇到的宿主細胞(基于施用方式)的親和力二者之間的差異分析。
在某些情況下，人們可能對在自體免疫疾病、移植等中可能存在于T細胞中的特定的細胞狀態(tài)，諸如激活狀態(tài)感興趣。在這種情況下，應首先篩選化合物以確定能與靜息細胞結合的那些化合物，至于那些不與靜息細胞結合的化合物，通過對激活細胞的細胞毒性對剩余的候選化合物進行篩選。這時，可對化合物可能遇到的存在于宿主中的其它細胞進行篩選，確定它們的細胞毒效應?；蛘?，還可以使用癌細胞和正常細胞以確定其中的任何化合物，相對于正常細胞而言，是否對癌細胞具有更高的親和力。再者，還可以通過與正常細胞的結合，篩選化合物文庫，并確定其效應。對正常細胞沒有細胞毒的那些化合物可以接著用于篩選它們對癌細胞的細胞毒效應。即使對正常細胞存在一定的細胞毒性，但對癌細胞具有足夠的細胞毒活性差異，在這種情況下，可能會愿意容忍其對正常細胞的低細胞毒性，而該化合物已表明對癌細胞有效。
可以使用已通過重組技術修飾的細胞，而不是天然獲得的細胞。所以，可以使用這樣的細胞，其能夠被培養(yǎng)生長，其通過特定基因的高調節(jié)(upregulate)或低調節(jié)(downregulate)可被修飾。如此則可獲得這樣的細胞，它們僅在單單一種位于表面的蛋白質上有所不同。針對文庫中的成員對存在或者不存在該特定蛋白質的細胞的效應，這時就可以對文庫進行差異性測定。通過這種方式，就能夠確定化合物對特定的表面膜蛋白質，而不是對存在于表面膜上的任何蛋白質，是否具有特異的親和力。
通過使用與特定表面膜蛋白質結合的抗體，例如，通過使用不同種、同型或其組合的抗體可以區(qū)分不同的細胞，其中該抗體不啟動補體依賴的細胞毒效應。通過將抗體、封阻抗血清或單克隆抗體加到一部分細胞中，將使那些細胞不具有用于結合文庫成員的可用的靶蛋白質。這樣就制造出可比細胞，基于在一組細胞中，無法利用某單一蛋白質，它們在應答方面有區(qū)別，雖然抗體通常是最方便使用的試劑，但可以使用提供相同功能的其它特異性結合物質。
可以使用抗體依賴的細胞毒性系統(tǒng)，用于在測定中確定結合?？梢允褂煤铣傻慕M分混合物，其中只含有對于細胞毒性效應必需的那些成分。希望如此的原因是血液或血漿中的成分可能會對測定的結果產生負面影響。
另外，雖然細胞樣平層是極為方便的篩選大量候選化合物的方式，但還可以使用其它技術。這些技術包括多孔板的使用和用于制備組合文庫的多種裝置，諸如針、茶葉袋等等?？梢苑珠_培養(yǎng)細胞，這要參考各種裝置的性質，其中使裝置與細胞接觸或者讓細胞在裝置上生長。可以將裝置浸在合適的培養(yǎng)基中，接種細胞，或者另外為細胞與候選化合物間提供接觸。在加入細胞毒介質后，可以多種方式分析裂解物。例如，F(xiàn)ACS可用于區(qū)別活的和死的細胞，可以使用上清液中51Cr的釋放，或者在上清液中細胞內化合物的檢測，可用于檢測活性化合物。
另外，也許希望知道化合物是否具有興奮劑或拮抗劑活性。受治療者測定技術為確定存在于文庫中、與靶蛋白質結合的那些化合物提供快速的方法。一旦將候選化合物的數(shù)量顯著地減少，就可以使用更為復雜的測定法，用于檢測化合物本身的活性。用這種方式，先進行快速篩選以確定結合親和力和特異性，隨后進行更深入細致的篩選以確定活性。用于確定活性的技術有多種，其中的細胞可以是經修飾過的，這樣標記基因將被激活，從而提供可檢測信號。信號可以很方便地與顏料的產生相關聯(lián)、信號可以是表面膜蛋白質的產生，而該蛋白能夠用標記抗體檢測出，或者蛋白質的分泌可通過多種技術，在上清液中檢測出來。例如，被表達的基因可能是蟲熒光素酶，它經修飾后含有引導序列，這樣可使其分泌，通過使用適當?shù)牡孜?，就可以將其中的上清液用于篩選光產生的形成。
有多種方法可用于篩選化學化合物文庫。在某種程度上，這要依賴化合物制備物的性質。例如，化合物可以結合到一個個顆粒、針、膜等等上面，其中每一個化合物都是隔開的。另外，化合物的含量將根據(jù)構建文庫所使用的方法而變化。而且，依據(jù)化合物與支持物結合的性質，可以做到釋放等分量化合物，以完成一系列的測定。另外，對已表明具有活性的化合物的鑒定能力將影響化合物的測定方式。
當化合物一個個地在網格的表面上，而且知道在網格的每一個位點上是什么組成，如此則能夠提供這樣的細胞樣平層，其構造與網格相似，并可將每一個結合到固體表面的化合物的位置注冊。一旦將平層和固體底物注冊，就可以依據(jù)化合物的結合方式將化合物從表面釋放。在給予化合物足夠時間以結合到位于細胞樣表面的蛋白質后，可沖洗細胞樣平層以去除非特異性結合的化合物。可能需要一次或多次沖洗，其中，根據(jù)所需要的親和力程度，可用沖洗提供變化的嚴謹度。沖洗完畢后，此時可以加入哺乳動物血液或血漿并溫育足夠的時間用于細胞毒性。接著可以將血漿或血液去除并觀察空斑，其中化合物的性質可以根據(jù)其在網格中的位置確定。血漿或血液不能含有可以天然地殺死平層細胞的任何組分。
由于可以重復制備過程，所以可以制備多份固體底物，其中在可比位點上制備出相同化合物，這樣就能夠用相同或不同的細胞重復篩選，確定一個個化合物的活性。在某些情況下，使用聚合酶鏈反應擴增標簽，確定出化合物的身份。參見，例如，PCT申請WO93/20242。在這種情況下，通過取出裂解物并將裂解物引入到含有對核酸標簽特異的引物的聚合酶鏈反應介質中，可以確定活性化合物。關于擴增，可以對核酸標簽測序或者由其它手段確定其序列，其結果將顯示用于制備化合物的合成步驟。
或者，可以獲得這樣的加標簽顆粒，其標簽可從顆粒釋放出來并提供二元密碼子，描述化合物結合到顆粒上的合成步驟。參見，例如，Ohlmeyer等人，美國國家科學院院刊(1993)，9010922)。這些標簽可以方便地是烯化化合物的同源系列(其能夠由氣相色譜-電子捕捉檢測)。依據(jù)連接基團的性質，可使其從顆粒中部分釋放，這樣，在鑒定特定的化合物之前，能使用顆粒2至3次。
對于絕大部分已討論的文庫，只要能夠將CTGF的表位連接到每一個化合物，就可以對任何巨大的化合物組進行類似的篩選。因而，也可以對不同的天然和合成來源的化合物包括大環(huán)內酯物、寡肽、核酸、dendrimers等等用相似的方式篩選。
在測定中形成空斑證實文庫中的成員結合到細胞，通常是表面蛋白質，并不干擾CTGF表位結合抗體，并且免疫復合物足夠穩(wěn)定以啟動補體級聯(lián)，而且該成員對靶子具有高親和力。
可將受治療者方法學用于任何需要將細胞靶子殺死的情況，尤其是，那些具有低的或沒有CTGF表位的細胞靶子。所以，細胞靶子可以是有致病性的原核細胞。多種生物體包括，例如微細菌(microbacterium)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)、蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoea)、鏈球菌屬(Streptococcus)、流感嗜血菌(Hemophilus influenza)等等。其它致病原包括真核細胞，尤其是真菌諸如白念菌屬(Candida)、組織胞漿菌(Histoplasma)等等，和原生動物例如賈弟蟲(Giardia)。另外，用于在感染細胞中提供表面膜蛋白質的病毒，也可以是受治療者化合物的靶子，其中被篩選的細胞已被非常嚴重地感染。
宿主細胞也可用作為靶子，其中的細胞是非正常的或者以不利的方式作用于宿主或宿主的治療。例如，能夠與正常組織區(qū)別開的癌性組織可用作受治療者化合物的靶子。與自體免疫疾病相關或者與GVHD或移植排斥相關的T或B細胞也可用作靶子。異常細胞，不管其性質如何，只要能將其與正常細胞區(qū)分開，也可以用作靶子。因而，銀屑病病灶，淋巴瘤細胞，被細菌、真菌、寄生蟲或病毒感染的細胞，可以作為受治療者化合物的靶子。
另外，當希望切除一部分細胞而不除去所有細胞諸如表達分化標記的細胞(諸如，T細胞亞類、激活的血小板、內皮細胞、激素或細胞因子受體表達細胞)時，可以應用受治療者化合物。
用于獲得調制CTGF活性的小分子的其它篩選方法，可在例如PCT申請WO981335中見到。
化合物/分子通過調制、調節(jié)或抑制CTGF活性，本發(fā)明提供用于治療和預防與腎臟纖維化相關的障礙的方法。這些方法可包括施用治療有效量的化合物封阻結合反應或封阻參與CTGF信號轉導途徑的酶。更具體地，通過施用對誘導CTGF可進行封阻的化合物，本發(fā)明提供用于抑制CTGF活性的方法。
在本發(fā)明的方法中，調制CTGF基因表達和/或CTGF活性的化合物包括引起細胞中環(huán)核苷酸水平升高的介質。根據(jù)本發(fā)明的方法，對誘導CTGF可進行封阻的化合物，通過使用上述篩選方法可對其進行鑒定。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供化合物或介質(agent)的鑒定方法。它能夠調制例如，如圖3的外顯子2和3編碼的片段等CTGF片段的活性，例如，細胞外基質蛋白質的產生、肌成纖維細胞分化的誘導、膠原合成的誘導，該方法包括諸如肽、小分子、多肽、peptidomimetic等目的試劑與(例如，成纖維細胞等)細胞和已知具有所希望活性，例如，膠原的產生的CTGF片段接觸，以及通過本領域技術人員公知的任何手段(參見實施例)測量細胞產生膠原的能力。接著，將細胞產生膠原的能力與在介質或化合物不存在的情況下合適的對照細胞群體產生膠原的能力進行比較。
術語“介質(agent)”或“化合物”，正如本文所用，描述具有能夠影響如本文所述的CTGF片段活性能力的任何分子，例如蛋白質、多肽或藥物。介質可以是任何已知的或懷疑能夠影響細胞的物質。介質包括CTGF多肽的肽片段。介質包括合成的化學介質、生化介質、細胞、提取物、勻漿物和條件培養(yǎng)基。試驗介質也可以是用于篩選復份化合物的組合文庫。通過通常應用于檢測特異DNA序列的任何方法，諸如PCR、寡聚體限制性酶切(Saiki等人，Bio/Technology，31008-1012，1985)、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針分析(Conner等人，美國國家科學院院刊，80278，1983)、寡核苷酸連接測定法(OLA)(Landegren等人，科學，2411077，1988)等等，可以對在本發(fā)明的方法中所鑒定的化合物，于溶液中或者結合到固體支持物后，進行進一步的評價、檢測、克隆、測序等等。已對用于DNA分析的分子技術進行了綜述(Landegren等人，科學，242229-237，1988)。
候選介質涵蓋許多類化學品。它們可以是有機分子，優(yōu)選地有機小分子化合物(分子量大于50并小于大約2500道爾頓)，候選介質包括與蛋白質在結構方面相互作用(尤其是氫鍵的形成)所必需的功能基團，并且一般包含至少一個氨基、羰基、羥基或羧基基團，優(yōu)選地至少兩個功能性的化學基團。候選介質通常包含被上述的一個或多個功能性基團取代的碳環(huán)或雜環(huán)結構和/或芳香環(huán)或多芳香環(huán)結構。在生物分子中也發(fā)現(xiàn)有候選介質，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、甾類化合物、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組合。候選介質可以是多肽，或者由定位誘變或隨機誘變合成的或天然存在的核酸序列產生的多肽。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，其中的方法提供用于這樣的分子施用，它干擾全長CTGF的翻譯后修飾或者封阻無活性CTGF前體的激活。正如本文所討論，血管系膜細胞暴露于TGF-β，導致在28-30kDa處出現(xiàn)新的顯著條帶，其大小與全長CTGF分子的羧基末端半分子和氨基末端半分子相當。正如上面所公開，用TGF-β處理導致能夠切割全長分子的蛋白酶或其它因子的產生。通過使用本文提供的篩選方法，可以鑒定抑制CTGF活性的分子。
藥物配方和施用途徑使用途徑可以將包含CTGF調制子，即，如本文所述的抗體、反義寡核苷酸、小分子和其它化合物的組合物施用于人類患者本身，或者在藥物組合物中包含合適的載體或賦形劑。本發(fā)明設計了治療方法，其中將調制或調節(jié)CTGF或其片段活性或表達的介質，以適于治療或預防CTGF片段活性或表達的量，施用于所需患者。本治療和預防方法包括將有效量的介質施用于受治療者，優(yōu)選地哺乳動物受治療者，最優(yōu)選地人受治療者。在優(yōu)選的實施方案中，受治療者哺乳動物和所施用的介質是相同來源的。最優(yōu)選地，受治療者和所施用的介質源自人。
有效施用量可以容易由日常實驗確定，最有效和最方便的施用途徑以及最合適的配方也能如此確定。在本領域中有多種可用的配方和藥物傳送系統(tǒng)(參見，例如，Gennaro，A.R.編著，1990，Remington’s藥物科學，第18版，Mack出版公司，Easton PA)。合適的施用途徑可以包括，例如，口、直腸、跨粘膜，或腸道施用和包括肌內、皮下、髓內注射以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射等非腸道傳送。組合物可采用局部而不是系統(tǒng)方式施用。
本發(fā)明的藥物組合物可以由任何本領域公知的方法，諸如由常規(guī)的混合、溶解、顆粒化、糖衣化、研磨、乳化、膠囊化、包封或冷干方法制備。正如上面所指出，本發(fā)明的組合物可包括一種或多種生理可接受的載體，諸如對加工活性分子為藥物用途的制備物有促進作用的賦形劑和輔助劑。恰當?shù)呐浞揭蕾囉谒x擇的施用途徑。
例如，注射用的組合物可以在水性溶液中配制，優(yōu)選地在生理相容的緩沖液諸如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理鹽水緩沖液中配制。對于跨粘膜施用，可以在配方中使用針對待透過屏障的合適的滲透劑。這樣的滲透劑一般為本領域公知。對于口部施用，通過使活性化合物與本領域公知的藥物可接受載體結合，可以容易地配制化合物。這樣的載體可以使本發(fā)明的化合物配制為片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等等，由受治療者口服。也可以將化合物配制為直腸施用的組合物，諸如栓劑或滯留灌腸劑，例如，含有常規(guī)栓劑基質諸如可可奶油或其它甘油酯。
口服使用的藥物制劑可加入固體賦形劑后得到，任選碾磨所得混合物，并加工顆?；旌衔铮诩尤脒m當?shù)妮o助劑后，如果需要，制成片劑或糖丸劑核。填加劑例如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇等的糖、纖維素制備物諸如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是特別合適的賦形劑。如果需要，可以加入分裂介質，諸如，交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或者藻酸或藻酸鹽，例如藻酸鈉。
為糖丸劑核提供合適的包衣。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，其中可任選地包括阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbolpol凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、紫膠漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物?？梢詫⑷玖匣蛏丶拥狡瑒┗蛱峭鑴┑陌轮校澡b別或區(qū)分活性化合物劑量的不同組合。
用于口服使用的藥物制劑包括由明膠組成的推合式(push-fit)膠囊以及由明膠和諸如甘油或山梨糖醇等增塑劑組成的密封軟膠囊。推合式膠囊中的混合物可含有活性組分，混合物中又帶有填充劑諸如乳糖、黏合劑(諸如淀粉)和/或潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)和，任選地，穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，可將活性化合物溶解或懸浮于諸如，脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇等合適的液體中。另外，可加入穩(wěn)定劑。口服所有配方的劑量應該適于這種使用。
對于通過吸入使用，從加壓的包裝或霧化劑中，將根據(jù)本發(fā)明而使用的化合物通過氣溶膠噴霧遞送的形式容易地傳送，同時使用了合適的推進劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或任何其它合適的氣體。在加壓氣溶膠情況下，通過提供閥門，傳送經計量的量，可確定合適的劑量單位?？梢耘渲朴糜谖胝呋虼等肫?，例如，明膠膠囊和藥筒。它們一般含有化合物與適合的粉末基質，諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
通過注射，例如，通過大丸劑注射或連續(xù)輸注等為非腸道施用而配制的組合物，可配成單位劑量的形式，例如，在安瓿中或者在多劑量容器中，并加入防腐劑。組合物可以采用例如懸浮液、溶液或者在油性或水性媒介物中乳濁液的形式存在，并且可以含有配制介質，諸如懸浮、穩(wěn)定和/或分散介質。用于非腸道施用的配方包括影響CTGF或其片段活性的介質之水性溶液，以可采用溶于水的形式。
可以將活性化合物的懸浮液制備適當?shù)挠托宰⑸鋺腋∫?。合適的親脂溶劑或媒介物包括脂肪油，諸如芝麻油和合成的脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯等或脂質體。水性注射懸浮液可含有提高懸浮液粘度的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖，可以選擇的是，懸浮液也可含有提高化合物可溶性的合適的穩(wěn)定劑或介質，以便制備高濃縮溶液。或者，活性組分可以粉末形式，以便與合適的媒介物，諸如，滅菌的無致熱原水在使用前混合。
也可以將本發(fā)明的組合物配制為貯存制劑。這樣的長效配制物可通過植入(例如，皮下或肌內)或通過肌內注射施用。所以，舉例來講，可以將化合物與合適的多聚體或疏水物質(例如，在可接受的油中形成乳濁液)或者離子交換樹脂配制在一起，或者配制為微溶的衍生物，例如，微溶鹽形式。
用于本發(fā)明的疏水分子的藥物載體可包括包含如，苯甲醇，它是一種非極性表面活性物質、可與水混溶的有機多聚體和水相的共溶劑系統(tǒng)。該共溶劑系統(tǒng)可以是VPD共溶劑系統(tǒng)。VPD是用無水乙醇配制的溶液，其中含有3％(重量/體積)苯甲醇、8％(重量/體積)多聚山梨酸酯80，它是一種非極性表面活性物質和65％(重量/體積)聚乙二醇300。該VPD共溶劑系統(tǒng)(VPD5W)由VDP與5％右旋糖水溶液按1∶1比例稀釋組成。該共溶劑系統(tǒng)能夠有效地溶解疏水性化合物并且在系統(tǒng)性地施用時產生的毒性低。當然，可以顯著地改變共溶劑系統(tǒng)的比例而不破壞其溶解性和毒性特性。而且，也可以改變共溶劑系統(tǒng)的組分的同一性。例如，可以用其它低毒性的非極性表面活性物質取代多聚山梨酸酯80，也可以改變聚乙二醇的分級大小，也可以用其它生物相容的多聚體，例如，聚乙烯吡咯烷酮取代聚乙二醇，并且可以用其它糖或多糖取代右旋糖。
或者，可以使用針對疏水分子的其它傳送系統(tǒng)。脂質體和乳濁液是眾所周知的疏水性藥物傳送媒介物或載體的例子。也可以使用某些有機溶劑，諸如二甲基亞砜，盡管這樣做通常會以更大的毒性為代價。另外，化合物的傳送，可以使用持續(xù)釋放系統(tǒng)，諸如含有效劑量待施用組合物的半滲透性的固體疏水性多聚體基質。已建立多種持續(xù)釋放物質，并可為本領域技術人員所用。持續(xù)釋放膠囊，依據(jù)它們的化學性質，可以釋放化合物幾周至超過100天。依據(jù)治療劑的化學性質和生物學穩(wěn)定性，可以采用穩(wěn)定蛋白質的附加策略。
有效劑量對用于本治療方法的任何組合物，通過使用本領域公知的多種技術可以首先對治療有效劑量進行估計。例如，在細胞培養(yǎng)物測定中，使用動物模型可以算出循環(huán)濃度范圍達到將在細胞培養(yǎng)物中測定出的IC50包括在內時的劑量值。在需要抑制CTGF活性時，例如，可確定所試驗化合物達到半數(shù)最大抑制CTGF活性的濃度。可通過使用從細胞培養(yǎng)物測定和其它動物研究中所獲得的數(shù)據(jù)，確定受治療者為人的適合的劑量范圍。
治療有效劑量指這樣的分子數(shù)量，其導致受治療者的癥狀改善或者存活期延長。在細胞培養(yǎng)物或實驗動物中，通過標準的藥物學方法，可以確定這樣的分子的毒性和治療有效性，例如，通過確定LD50(使50％群體死亡的劑量)和ED50(有效治療50％群體的劑量)。毒性與療效的劑量之比為治療指數(shù)，可將其表達為LD50/ED50的比值。優(yōu)選具有高治療指數(shù)的分子。
優(yōu)選地，劑量落在這樣的循環(huán)濃度范圍內，其包括在幾乎沒有毒性或沒有任何毒性的ED50內。依據(jù)所使用的劑量形式和所采用的施用途徑，可在該范圍內變動劑量。要參考受治療者的具體情況，選擇精確的配方、施用途徑和劑量。
可以單獨地調整劑量值和施用間隔，以提供這樣的活性組分血漿水平，它的最低有效濃度，MEC足以根據(jù)需要調制或調節(jié)CTGF活性。MEC將隨每一種化合物而變化，但是可以從諸如，使用本文中所描述的測定法，達到50-90％CTGF活性以誘導骨髓生長所需要的濃度等體外數(shù)據(jù)估計MEC。
達到MEC所需要的劑量將依賴個體特性和施用途徑。應使用這樣的方案施用組合物，它使組合物的血漿水平在MEC之上維持大約10-90％治療期，優(yōu)選地大約30-90％治療期，并且最優(yōu)選地介于50-90％治療期。在局部施用或選擇性吸收的情況下，藥物的有效局部濃度不一定與血漿濃度相關。
當然，組合物的施用量將依賴于多種因素，包括但不限于，特定受治療者的體重、疾病的嚴重程度、施用方式和處方醫(yī)生的判斷。
包裝如果需要，可將組合物裝入這樣的包裝袋或配藥裝置中，其中可以含有一個或者多個含活性組分的單位劑量形式。包裝袋可以包含金屬或塑料箔，諸如發(fā)泡包裝。在包裝袋或配藥裝置中可以附上使用說明書。也可以將含有本發(fā)明的化合物的組合物配制于相容的藥物載體中制備、放置于合適的容器中，標上治療的明確內容。標簽上所明確的合適的治療內容可包括治療的障礙或疾病，其中希望為誘導軟骨或骨、愈合傷口、保護神經、腎臟纖維化、糖尿病或等等。
實施例提供以下實施例僅僅是為了闡明要求保護的發(fā)明。然而，不能將本發(fā)明限于實施例的范圍內，實施例的目的在于僅僅作為對本發(fā)明之單一方面的闡明，并且功能上等同的方法也在本發(fā)明的范圍內。的確，除了本文中所描述的那些修飾外，根據(jù)前面的描述和附圖，對本發(fā)明所進行多種修飾對本領域的技術人員而言將是顯而易見的。旨在將這樣的修飾落在附加的權利要求書范圍內。
實施例1 CTGF片段刺激細胞外基質的合成為制備CTGF片段，用胰凝乳蛋白酶消化人的重組CTGF(全長)，產生一個CTGF片段。通過表達CTGF的外顯子2和外顯子3中的任意一個或者全部二者，也可產生重組CTGF片段。經培養(yǎng)的正常大鼠腎臟(NRK)成纖維細胞的連續(xù)細胞系(指定為克隆NRK-49F)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，以用于產生細胞培養(yǎng)物。從移植培養(yǎng)物建立了人包皮成纖維細胞。細胞培養(yǎng)物被保存在含有2.5％胎牛血清和2.5％Nu-SerumI(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)的Dulbecco’s modified eaglemedium(DME)中，在細胞匯合前傳代。
為檢驗成纖維細胞膠原合成，將細胞接種于含有2.5％胎牛血清/Nu-Serum的DME(在48孔板子上，10000個細胞/孔)中并讓細胞生長至匯合(在5-7天內)，制備生長抑制的單層NRK和人包皮成纖維細胞。接著將單層成纖維細胞在含有25mM HEPES和ITS預混物(Collaborative Biomedical)的DME中，血清饑餓培養(yǎng)1-8天。接著加入抗壞血酸(50mg/ml)和生物介質(CTGF片段)。通過使用定量測定法，測量48小時治療中的末端24小時3H-脯氨酸摻入到抗胃蛋白酶、鹽析沉淀的細胞外/細胞表面相關膠原，估計膠原合成。正如在圖2中所示，在存在1ng/ml TGF-b時，含有CTGF之外顯子2和3的CTGF片段刺激NRK成纖維細胞中的膠原合成。與此相反，羧基末端的CTGF不刺激膠原合成。
實施例2CTGF片段誘導肌成纖維細胞分化按如上所述，制備CTGF片段和細胞培養(yǎng)物。為檢驗CTGF片段對肌成纖維細胞的誘導，按如上所述制備和處理生長抑制的包皮成纖維細胞NRK的單層細胞。隨處理后，在進行免疫組織學檢測α-平滑肌之前，將48孔板上的單層細胞用TBS沖洗兩次并將其在甲醇中于-20℃固定10分鐘。實施免疫組織學檢測。將單層細胞固定后，用TBS沖洗兩次并用含10％馬血清/2％牛奶的TBS封阻30分鐘。接著，將細胞與按1∶200稀釋于馬血清/牛奶/TBS的單克隆鼠抗α-平滑肌肌動蛋白IgG(Clone 1A4，Sigma Chemical)混合并溫育1小時。用TBS沖洗三次，隨后將單層細胞與按1∶200稀釋于馬血清/牛奶/TBS的生物素?；R抗-鼠IgG(Vector Labs，Burlingame，CA)混合并溫育1小時。接著，用堿性磷酸軛合的鏈親和素-生物素復合物(Dako，Glostrup，Denmark)沖洗并溫育單層細胞30分鐘。隨沖洗后，在有1mM左旋嘧唑存在下，用快紅底物(Vector Red，Vector Labs)顯現(xiàn)堿性磷酸酶。接著，將處理后的單層細胞在顯微鏡下檢驗紅染的α-平滑肌肌動蛋白陽性肌成纖維細胞，并計數(shù)每孔中肌成纖維細胞數(shù)以及選擇顯微鏡視野進行照相。
正如在圖1中所示，成肌細胞誘導測定反映了成纖維細胞膠原合成的測定結果。具體地，本發(fā)明之CTGF片段，與羧基末端的CTGF片段(其不能夠誘導成肌細胞分化)相比，能夠誘導成肌細胞分化。
實施例3中和性抗-CTGF抗體封阻TGF-β誘導的DNA合成、膠原合成和肌成纖維細胞誘導培育特定的抗-CTGF抗體，其通過使用本領域公知的方法，在桿狀病毒表達系統(tǒng)中產生抗有生物學活性的重組的人CTGF。在山羊中制備抗體，直接地或者通過在NRK成纖維細胞中對TGF誘導的DNA或膠原合成，測試其對CTGF的中和活性。在測定對TGF-β作用的中和作用中，山羊抗體表現(xiàn)出活性。在這些測定中，山羊抗-CTGF抗體能夠封阻DNA合成。另外，正如在圖5中所證實，CTGF抗體能夠封阻由TGF-β誘導的膠原合成和肌成纖維細胞形成。要指出的是，封阻膠原合成所需要的抗體量非常顯著地小于封阻DNA合成所需要的量。Western印跡測定和競爭性ELISA測定均顯示該制備物中的大部分抗體抗CTGF的N-末端結構域。這就提示這兩個結構域可能負責刺激不同的生物學活性。
實施例4特異性地針對CTGF N-末端結構域的抗-CTGF抗體選擇性地封阻膠原合成通過使用純化的CTGF N-末端或C-末端結構域，由親和色譜制備對結構域特異的抗-CTGF抗體。通過胰凝乳蛋白酶有限消化完整的CTGF制備這些結構域。通過肝素-瓊脂糖親和色譜將這些結構域彼此分開。N-末端結構域不與肝素結合，而CTGF C-末端結構域含有肝素結合活性因而被保留在肝素瓊脂糖上。這些結構域是純的，根據(jù)Western印跡分析，其中含有不到0.1％的完整CTGF污染物。接著將每一種結構域以大約0.5mg/ml凝膠的濃度與Affigel 10偶聯(lián)。接著，將抗-CTGF總IgG(山羊)吸附到親和樹脂，并洗脫特異結合的抗體。接著，在Western印跡中測試這些抗體，確定它們的反應特異性。通過使用本領域公知的技術，將只與N-末端結構域或只與C-末端結構域反應的IgG＝s從總庫中分離出來。接著，在中和作用測定中，使用CTGF對抗體進行測試。這些研究的結果顯示，抗CTGF N-末端結構域的抗體選擇性地抑制膠原合成但不抑制DNA合成，正如在圖6中所證實。與此相反，抗CTGF C-末端結構域的抗體選擇性地抑制DNA合成但不抑制膠原合成。這些數(shù)據(jù)顯示CTGF分子的不同區(qū)域可能負責傳導不同的生物學活性信號。為證實和引伸這些結果，以下對所分離的結構域的生物學活性與完整的CTGF以及TGF-β的生物學活性進行了比較。
實施例5CTGF N-末端結構域刺激細胞外基質產生使用本領域公知的技術，制備CTGF N-末端和C-末端結構域。第一種方法，如上所述，使用胰凝乳蛋白酶，通過蛋白水解消化具有生物學活性的完整CTGF制備純的N-末端和C-末端結構域，這是因為胰凝乳蛋白酶幾乎專一性地產生完整的N-末端結構域和C-末端結構域，而不產生任何較小的片段。生成純的C-末端和N-末端結構域的第二種方法，需要只表達CTGF開放閱讀的有限區(qū)域，它只編碼C-末端結構域或者只編碼N-末端結構域。這是通過PCR擴增開放閱讀框架中的部分，并在無半胱氨酸區(qū)引入一個終止密碼子以僅僅產生N-末端結構域，或者只將開放閱讀框架中開始于無半胱氨酸區(qū)的AYRLED序列，直至桿狀病毒穿梭載體GP67內的，編碼C-末端結構域的部分克隆引入而實現(xiàn)的。這就產生了這樣一種嵌合蛋白質，它含有指導所需要的重組蛋白質(或片段)合成到內質網，因而確保分泌的，來自GP67病毒基因的信號肽。在純化后，將由多種方法產生的獨立的結構域在用NRK成纖維細胞的生物測定中進行比較。這些研究結果證實了以前對含有結構域特異性的抗-CTGF抗體的觀察。通過蛋白水解消化完整的CTGF或者通過直接的重組表達而產生的N-末端結構域，作為膠原合成和肌成纖維細胞誘導如在圖7和圖8中所示的誘導物，均具有完全的活性。相反地，由上述兩種方法中的任一方法所產生的C-末端結構域，在DNA合成測定中也具有完全的活性。這些數(shù)據(jù)證明CTGF單獨的結構域保留有完全的生物學活性，并且能夠彼此獨立地刺激靶細胞產生特定的生物學效應。在最適濃度時，單獨的結構域所誘導的生物應答與完整的CTGF或TGF-β有可比性。這就強烈地顯示TGF-β的促有絲分裂(DNA合成)和促基質合成(細胞外基質合成，諸如膠原合成)活性是通過CTGF和其相應的結構域介導的。
其它生長因子可與本發(fā)明的CTGF片段一起使用，提高CTGF對細胞外基質產生的誘導活性。例如，評價了肽生長因子IGF-2對膠原和對CTGF的肌成纖維細胞表型誘導活性的效應。在有CTGF存在時，濃度為2ng/ml或更高的IGF-2導致膠原合成以及肌成纖維細胞表型的大量增加，正如圖9所示。
對本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的多種修飾和變化，而不脫離本發(fā)明的范圍和精神，對本領域的技術人員而言將是顯而易見的。盡管將本發(fā)明與特定的優(yōu)選實施方案聯(lián)系在一起進行描述，但是應該理解并不應當將發(fā)明，正如權利要求書所述，不適當?shù)叵拗圃谶@樣的特定實施方案。確實，旨在將那些為實施本發(fā)明而對所述方式的多種修飾(其對于分子生物學或相關領域的技術人員而言是顯而易見的)包括在隨后的權利要求書的范圍內。本文所引用的所有參考文獻，本文全文引用作為參考。
權利要求
1一種能夠誘導細胞外基質合成、膠原合成、和/或肌成纖維細胞分化的結締組織生長因子(CTGF)多肽的片段。
2根據(jù)權利要求1中所述的片段，它包含由至少如圖3所示的外顯子2編碼的氨基酸序列。
3根據(jù)權利要求1中所述的片段，它包含由至少如圖3所示的外顯子3編碼的氨基酸序列。
4根據(jù)權利要求1中所述的片段，它包含由至少如圖3所示的外顯子2和3編碼的一段氨基酸序列。
5一種編碼如權利要求1所述片段的多核苷酸。
6一種特異性地結合權利要求1所述CTGF片段的抗體。
7一種結合編碼如權利要求1所述CTGF片段的核酸序列的反義分子。
8一種用于治療CTGF相關疾病或障礙的方法，包含對患有CTGF相關的疾病或障礙或者有患CTGF相關的疾病或障礙風險的受治療者施用如權利要求6所述的抗體。
9根據(jù)權利要求8中所述的方法，其中所述的疾病或障礙是纖維增殖性疾病/障礙。
10根據(jù)權利要求8中所述的方法，其中所述的疾病或障礙選自腎臟纖維化、硬皮病、肺臟纖維化、肝臟纖維化、關節(jié)炎、肥大性結疤、動脈粥樣硬化、糖尿病型的腎病和視網膜病、高血壓、腎臟障礙、與血管生成相關的障礙、皮膚纖維化障礙和心血管障礙。
11一種用于治療CTGF-相關的疾病或障礙的方法，包括對患有CTGF-相關的疾病或障礙或者處于患CTGF-相關的疾病或障礙風險的受治療者施用如權利要求7所述的反義分子。
12一種鑒定調制CTGF N-末端片段活性的介質或化合物的方法，包括肌成纖維細胞與試驗介質以及與N-末端CTGF片段在允許這些組分相互作用的條件下接觸；并且比較細胞在介質存在時的分化能力與細胞在介質不存在時的分化能力，其中的細胞分化能力差異提示調制CTGF片段的分化活性的介質或化合物。
13根據(jù)權利要求12中所述的方法，其中所述的調制為活性的抑制。
14根據(jù)權利要求12中所述的方法，其中所述的調制為活性的刺激。
15一種鑒定調制CTGF N-末端片段活性的介質或化合物的方法，包括細胞與試驗介質以及與N-末端CTGF片段在允許這些組分相互作用的條件下接觸；并且比較化合物或介質在介質存在時調制細胞外基質產生的能力與一種介質或化合物在介質不存在時調制細胞外基質產生的能力，其中在細胞外基質產生上差異提示調制CTGF片段的活性的介質或化合物。
16根據(jù)權利要求12中所述的方法，其中所述的調制為活性的抑制。
17根據(jù)權利要求12中所述的方法，其中所述的調制為活性的刺激。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有至少外顯子2或外顯子3并且具有誘導細胞外基質合成,尤其是膠原合成和肌成纖維細胞分化能力的CTGF片段。本發(fā)明進一步涉及使用所述CTGF片段鑒定能調制所述CTGF片段活性的組合物的方法以及所鑒定的組合物。本發(fā)明也涉及治療與細胞外基質的過量產生相聯(lián)系的CTGF－相關的障礙和疾病的方法。
文檔編號A61P17/02GK1334820SQ99815874
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月14日 優(yōu)先權日1998年12月14日
發(fā)明者G·R·哥羅恩達思特 申請人:邁阿密大學