專利名稱：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)臨床體液標(biāo)本中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子含量的分析方法，尤其涉及一種使用酶免疫分析方法檢測(cè)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)是CCN(CTGF，CEFL0/CYR61，NOV)家族成員之一，該蛋白為肝素結(jié)合型，含349個(gè)氨基酸，分子量36～38kD，富含半胱氨酸，其38個(gè)保守的半胱氨酸殘基分成兩個(gè)節(jié)段，其中22個(gè)在N末端區(qū)，16個(gè)在C末端區(qū)。分為4個(gè)主要的蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白區(qū)，von Willebrand因子C型重復(fù)區(qū)，血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)1型重復(fù)區(qū)以及生長(zhǎng)因子半胱氨酸群，這些區(qū)域都由獨(dú)立的外顯子編碼。CTGF基因?qū)偌纯淘缙诨?，編碼的蛋白具明顯的絲裂原性和趨化性，可由成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌。成年哺乳動(dòng)物心，腦，腎，肺，肝以及胎盤中均有表達(dá)?？烧T導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增生，分化，胚胎發(fā)育以及傷口愈合。
研究表明，當(dāng)機(jī)體損傷和纖維化發(fā)生時(shí)，TCF-β高表達(dá)，CTGF作為它的下游作用因子介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)生成，刺激膠原合成。它與皮膚瘢痕形成、動(dòng)脈粥樣硬化，肝、肺、腎等器官的纖維化以及創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān)。CTGF的檢測(cè)方法通常為RT-PCR及Westen-Blot，國(guó)內(nèi)外尚未有簡(jiǎn)便、快速的商品化試劑盒研制成功的報(bào)道。纖維化疾病的治療在于早期診斷，目前臨床主要依賴膠原(I，II，III)和前膠原含量的檢測(cè)，而CTGF體液內(nèi)的變化能反應(yīng)纖維化發(fā)生的進(jìn)程，早于血清內(nèi)膠原的變化，因此建立一種靈敏、特異的CTGF檢測(cè)方法對(duì)纖維化疾病的診斷及早期治療具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、快捷且具高特異、高靈敏性的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子測(cè)定方法，本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案解決其技術(shù)問題一種結(jié)締組織生長(zhǎng)因子測(cè)定方法首先，用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入至少5種不同濃度的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，再加入親和素-生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值(A)，以CTGF的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后，用CTGF單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入待測(cè)標(biāo)本后，與標(biāo)本中的CTGF結(jié)合，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，再加入親和素-生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值(A)，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中CTGF的濃度。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明從血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR方法擴(kuò)增CTGF基因，插入表達(dá)載體，通過誘導(dǎo)制備CTGF融合蛋白。用純化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠和新西蘭白兔，獲得單克隆和多克隆抗體，抗體純化后標(biāo)記生物素，用“方陣滴定”法確定最佳單抗包被濃度及最佳生物素標(biāo)記的二抗?jié)舛龋⑸锼?親和素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
a.由于CTGF在生物體內(nèi)含量極低，通過從生物材料中提取CTGF極其困難，用DNA重組技術(shù)可大規(guī)模制備高純度的CTGF抗原和標(biāo)準(zhǔn)品。
b.本方法的檢測(cè)標(biāo)本為體液，克服了由于穿刺臟器而引起的組織損傷。
c.本方法實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快捷，可短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模檢測(cè)臨床各種體液標(biāo)本。
d.由于引入了生物素-親和素系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)的放大作用使檢測(cè)靈敏度大幅度提高。
e.標(biāo)本中CTGF的量與A450成正比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可定量計(jì)算CTGF的含量。
具體實(shí)施例方式
一種結(jié)締組織生長(zhǎng)因子測(cè)定方法首先，用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入至少5種不同濃度的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，再加入親和素-生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值(A)，以CTGF的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)施例可以選用加入5、6、9、21、40或更多種不同濃度的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度可選擇大于或等于0的不同濃度，例如濃度為0ng/ml、80ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、600ng/ml、980ng/ml、450ng/ml、1120ng/ml、880ng/ml或其它具體濃度；然后，用CTGF單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入待測(cè)標(biāo)本后，與標(biāo)本中的CTGF結(jié)合，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，再加入親和素-生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值(A)，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中CTGF的濃度。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施過程1、CTGF抗原的制備人內(nèi)皮細(xì)胞用組織貼壁法在含20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)并傳代后，用50mmol/L葡萄糖修飾的牛血清白蛋白干預(yù)8h，0.125％胰蛋白酶消化后用Trizol法提取總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為通用引物，M-Mulv為逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。設(shè)計(jì)特異引物p15’CCCACTGAGGAAGCGGACCTAGAG-3’及p25’CCCCTCGAGTGCCATGTCTCCGTG-3’，(下劃線分別為SpeI和XhoI酶切位點(diǎn))用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序獲得CTGF C區(qū)基因。PCR產(chǎn)物用SpeI+XhoI雙酶切，與相同酶切并純化的pKM質(zhì)粒連接。陽(yáng)性質(zhì)粒用測(cè)序方法鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞，用終濃度為1mmol/L的乳糖37℃誘導(dǎo)6h，超聲破碎細(xì)胞后用HIS-SelectTM親和層析和Sephedex G-200凝膠層析純化獲得CTGF抗原，SDS/PAGE鑒定蛋白純度。
2、CTGF單抗及多抗的制備6-8周齡的BALB/c小鼠5只，按每只50μg CTGF抗原，與弗氏完全佐劑(CFA，complete freund′s adjuvant)混合，充分乳化后，0.2ml/只腹腔注射進(jìn)行初次免疫，每間隔3周以每只25μg CTGF抗原與弗氏不完全佐劑(IFA，incomplete freund′sadjuvant)乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后3天，用ELISA方法測(cè)定抗體滴度。加強(qiáng)免疫3次后取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)以1∶9融合，融合劑為PEG1400。用“有限稀釋法”獲得分泌CTGF單克隆抗體的細(xì)胞株。用免疫競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行抗原表位分析。細(xì)胞株按1×105個(gè)細(xì)胞/只腹腔注射用0.5ml/只降植烷處理1周的BALB/c小鼠，10天后收獲腹水，-20℃保存。
雄性新西蘭白兔2只，體重1.5Kg左右，按每公斤體重1mg CTGF抗原，用弗氏完全佐劑充分乳化后，行耳后及背部脊柱兩側(cè)皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫，每間隔3周以每公斤體重0.5mg CTGF抗原與弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3次免疫后乙醚麻醉，行頸動(dòng)脈插管放血，室溫使血塊自然收縮，4000r/min離心收集血清，-20℃保存。
3、抗體的純化和鑒定DEAE-23纖維素50g，用NaOH-HCl-NaOH順序處理后，用pH7.4、0.01mol/L PBS平衡過夜，負(fù)壓抽濾并盡可能除去水分。兔血清或腹水用蒸餾水稀釋1倍，按每毫升樣本需濕重5g DEAE-23的比例，加已處理的DEAE-23，充分混合后室溫平衡1h，間或攪拌2～3次。傾入布氏漏斗抽濾并用20ml pH7.4、0.01mol/L PBS洗濾，收集濾液，按0.5倍濾液體積加入飽和硫酸銨溶液，室溫磁力攪拌1h后，12000r/min離心5min，沉淀用適量pH7.4、0.01mol/L PBS溶解，瓊脂糖電泳鑒定純度。純化后的抗體系列稀釋，用ELISA方法測(cè)定滴度。
4、抗體的生物素標(biāo)記水溶性長(zhǎng)臂生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)15mg溶于500μl DMSO，取16μl加入10mg/500μl(pH7.4、0.01mol/L PBS)的CTGF多抗溶液中，室溫反應(yīng)30min，4℃透析過夜獲得生物素化CTGF抗體。
5、復(fù)合物的制備取5ml 0.1M的PBS(pH7.4)，加入45μl Avidin和45μl Biotin-HRP，混勻，室溫反應(yīng)30min，得到親和素(Avidin)-生物素(Biotin)-辣根過氧化物酶(HRP)復(fù)合物。
6、檢測(cè)方法的建立用“方陣滴定”法確定最佳單抗包被濃度及最佳生物素標(biāo)記的二抗?jié)舛?。?0μl系列稀釋的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本加入已包被CTGF單抗并用含2％酪蛋白的0.1mol/LpH7.4PBS封閉的酶標(biāo)板中，37℃孵育1h，洗板3次后加入50μl生物素化二抗，37℃孵育30min，洗板3次后加入事先配置的親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(ABC)50μl，37℃孵育30min，洗板3次后加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及H2O2各50μl，37℃反應(yīng)20min，加50μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上掃描測(cè)定A450nm的吸光度值。上述用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板方法為將CTGF單抗稀釋至2.5μg/ml，每孔100μl加入96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，4℃過夜。用含1％Tween-20的PBS(0.1mol/LpH7.4)洗滌3次，吹干后4℃干燥密封保存。
7、方法學(xué)評(píng)價(jià)靈敏度取CTGF(0，1，2，4，8，…ng/ml)平行管各5支，測(cè)定其OD值，CTGF濃度在1ng/ml時(shí)均值減去2×SD仍大于空白，因此，1ng/ml為本法的檢測(cè)下限。
批內(nèi)及批間精密度取高(100ng/ml)、中(25.0ng/ml)、低(4.0ng/ml)三個(gè)濃度，各作5次平行測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)為8.36％，8.10％和3.55％。三個(gè)不同濃度的樣品每間隔2周測(cè)定一次，共4次，計(jì)算批間變異系數(shù)為14.39％，10.84％和7.02％。
回收實(shí)驗(yàn)樣品中加入不同量的CTGF(1～50ng/ml)，測(cè)定CTGF的濃度，計(jì)算回收率為99.48％。
干擾實(shí)驗(yàn)將血紅蛋白，膽紅素，甘油三脂加入混合血清中，觀察對(duì)CTGF測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示；血紅蛋白濃度在0～100nmol/L，總膽紅素在0～25μmol/L，甘油三脂在0～2.0mmol/L對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。
8、臨床應(yīng)用臨床標(biāo)本149例，其中慢性乙型肝炎血標(biāo)本25例，急性心肌梗死病人血標(biāo)本64例，正常體檢血標(biāo)本7例，糖尿病腎病尿標(biāo)本43例，正常人尿標(biāo)本10例，按以上操作程序編程，在ALISEI全自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)。結(jié)果顯示慢性乙型肝炎組及急性心肌梗死組與正常對(duì)照組差異顯著(p＜0.05)，糖尿病腎病尿標(biāo)本與正常人尿標(biāo)本比較差異顯著(p＜0.05)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)締組織生長(zhǎng)因子測(cè)定方法，其特征在于首先，用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入至少5種不同濃度的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，再加入親和素-生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值(A)，以CTGF的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后，用CTGF單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入待測(cè)標(biāo)本后，與標(biāo)本中的CTGF結(jié)合，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，再加入親和素-生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值(A)，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中CTGF的濃度。
全文摘要
一種結(jié)締組織生長(zhǎng)因子測(cè)定方法用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入至少5種不同濃度的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，加入親和素－生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值(A)，以CTGF的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；用CTGF單克隆抗體包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入待測(cè)標(biāo)本后，與標(biāo)本中的CTGF結(jié)合，洗去未結(jié)合的CTGF，加入生物素標(biāo)記的CTGF多抗，再加入親和素－生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺顯色，加入終止液后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中CTGF的濃度。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1916635SQ20061008611
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月31日
發(fā)明者劉乃豐, 吳國(guó)球 申請(qǐng)人:東南大學(xué)