本發(fā)明涉及到一種中藥組合物的含量測定方法，屬于藥品的質(zhì)量控制方法領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

中藥是中醫(yī)防病治病的最重要物質(zhì)手段。我國自“九五”以來開展實施的中藥現(xiàn)代化是推動中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大舉措。而中藥的質(zhì)量控制和評價是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵問題之一，也是中藥研究的難點和熱點。中藥質(zhì)量控制的目的是保證中藥的有效性和安全性。中藥質(zhì)量控制就是監(jiān)測中藥的藥效物質(zhì)、有毒物質(zhì)及其變化規(guī)律，是依據(jù)一系列質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對中藥生產(chǎn)過程中的每一個環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量檢測與控制。而中藥質(zhì)量評價的技術(shù)、方法和策略的研究是制訂科學(xué)、合理、先進(jìn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。液相色譜具有很高的分離度，可把復(fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行分離而形成高低不同的峰組成一張色譜圖，這些色譜峰的高度和峰面積分別代表了各種不同化學(xué)成分和其含量，其含量的大小可以有效的反應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量及其穩(wěn)定性。目前含量測定方法中以單一成分為主，很少有一種方法同時測定多個有效成分的含量測定方法。

本發(fā)明要求保護(hù)一種中藥組合物的含量測定方法，該中藥組合物由以下藥材組成：連翹、金銀花、板藍(lán)根、苦杏仁、薄荷腦、魚腥草、大黃、廣藿香、綿馬貫眾、紅景天、麻黃、甘草、石膏，該含量測定方法，同時測定了新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡?？鼘幩帷㈤纹ぼ蘸透什菟崞邆€成分的含量，可以有效的節(jié)約能源，降低分析成本，而現(xiàn)有技術(shù)中并沒有公開該技術(shù)內(nèi)容。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種中藥組合物的含量測定方法。該方法可以同時測定所述中藥組合物中多種有效成分。

該中藥組合物由如下重量份的原料藥制成：連翹200-300、麻黃60-100、大黃40-60、魚腥草200-300、金銀花200-300、板藍(lán)根200-300、廣藿香60-100、綿馬貫眾200-300、紅景天60-100、薄荷腦5-9、苦杏仁60-100、甘草60-100、石膏200-300，含量測定方法如下：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇或甲醇25ml，超聲或者回流提取30分鐘，過濾，得濾液，蒸干，殘渣用乙醇或甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸；色譜柱為c18色譜柱；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

本發(fā)明所述的中藥組合物優(yōu)選的重量份原料藥為：連翹200、金銀花300、板藍(lán)根200、大黃40、廣藿香60、綿馬貫眾300、紅景天100、薄荷腦9、麻黃60、苦杏仁100、魚腥草200、甘草100、石膏200。

本發(fā)明所述的中藥組合物優(yōu)選的重量份原料藥為：連翹300、金銀花200、板藍(lán)根300、大黃60、廣藿香100、綿馬貫眾200、紅景天60、薄荷腦5、麻黃100、苦杏仁60、魚腥草300、甘草60、石膏300。

本發(fā)明所述的中藥組合物優(yōu)選的重量份原料藥為：連翹278、金銀花294、板藍(lán)根285、大黃55、廣藿香95、綿馬貫眾290、紅景天87、薄荷腦8.5、麻黃88、苦杏仁80、魚腥草284、甘草95、石膏277。

本發(fā)明所述的中藥組合物優(yōu)選的重量份原料藥為：連翹255、金銀花255、板藍(lán)根255、大黃51、廣藿香85、綿馬貫255、紅景天85、薄荷腦7.5、麻黃85、苦杏仁85、魚腥草255、甘草85、石膏255。

本發(fā)明所述的中藥組合物制劑的制備方法為：

(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；

(2)廣藿香碎斷，加10倍量水提取揮發(fā)油，提油時間8小時，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘渣棄去，濾液備用；

(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小時，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；

(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小時，提取液合并過濾，所得濾液與步驟（2）廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60℃時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；

(5)將步驟（4）所得清膏與步驟（3）所得醇提液合并，濃縮至在60℃時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；

(6)將步驟（5）所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；

(7)將薄荷腦、步驟（2）所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟（6）所得顆粒，密閉，混勻，壓片或者裝膠囊、或者裝袋。

本發(fā)明所述的含量測定方法優(yōu)選為：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%乙醇25ml，超聲提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加50%乙醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用50%乙醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩幔簧V柱：acquityuplc^?hsst3(1.8μm，2.1×100mm)；柱溫為35℃；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

本發(fā)明所述的含量測定方法還優(yōu)選為：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25ml，超聲提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加50%甲醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用50%甲醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?；色譜柱為acquityuplc^?csh^tmc18；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

本發(fā)明所述的含量測定方法還優(yōu)選為：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25ml，回流提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加甲醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用甲醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡?？鼘幩帷㈤纹ぼ?、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?；色譜柱為acquityuplc^?behc18；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

本發(fā)明所述含量測定方法還優(yōu)選為：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇25ml，超聲提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加乙醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用乙醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?；色譜柱為acquityuplc^?behc18；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

用實施例1制備的樣品，對本發(fā)明含量測定方法，從多個方面評價該方法的可行性，評價方法如下：

1.儀器、試劑與試藥

1.1儀器

美國watersacquityuplch-class超高效液相色譜儀（tuv檢測器，empower3.0色譜工作站），循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），kq250db型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），瑞士mettlertoledoal204型電子分析天平，瑞士mettlertoledoab135-s型電子分析天平，上海精科ja2603b電子天平。

1.2試劑

乙醇（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），磷酸（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），乙腈（色譜純，美國fisher公司），甲醇（色譜純，美國fisher公司），新綠原酸（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：13112712，純度≥98%），綠原酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314，純度，96.6%）、隱綠原酸（上海源葉生物科技有限公司，批號：zf0226ba14，純度≥98%）、異連翹酯苷a（上海源葉生物科技有限公司，批號：ya0817hb14，純度≥98%）、4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：111894-201102，純度，94.1%）、槲皮苷（hwianalytikgmbhpharmasolutions，批號：hwi01112，純度，91.7%）、甘草酸銨（councilofeurope-edqm，批號：1.1，純度≥98%）。

1.3試藥：本發(fā)明中藥組合物

2.色譜條件

2.1檢測波長的選擇

根據(jù)待測成分的對照品溶液的uv光譜圖，選擇327nm、250nm處的最大吸收峰作為檢測波長，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?，250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，以盡量減少其它成分的干擾。

2.2流動相的選擇

考察了不同比例的乙腈-甲醇-0.1%磷酸流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明，按下表梯度洗脫所得色譜峰分離度好，基線平穩(wěn)，待測色譜峰周圍沒有明顯雜質(zhì)干擾。

梯度洗脫表

2.3色譜條件的確定

以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，按上表進(jìn)行梯度洗脫。檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?；色譜柱：acquityuplc^?hsst3(1.8μm，2.1×100mm)；柱溫為35℃。

3.1提取溶劑的考察

取本發(fā)明中藥組合物適量，研細(xì)，取8份，每份0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每兩份分別加入25ml甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇，超聲處理（功率500w，頻率40khz）30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再分別加入25ml甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇，超聲處理30分鐘，過濾，用各提取溶劑洗滌藥渣4次，每次5ml，合并洗滌液及兩次濾液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，作為供試品溶液。

分別吸取供試品溶液2μl，注入液相色譜儀，測定供試品中待測成分的峰面積，結(jié)果見表1。

表1不同提取溶劑考察的實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明：用50%乙醇作為提取溶劑時，待測成分的提取率最高。

3.2提取方法的考察

取本發(fā)明中藥組合物適量，研細(xì)，取4份，每份0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入50%乙醇25ml，每2份分別采用回流提取2小時和超聲處理30分鐘（2次）兩種不同的提取方法提取，將提取液過濾，用50%乙醇洗滌藥渣4次，每次5ml，將洗滌液與濾液合并，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，作為供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定供試品溶液中待測成分的峰面積，結(jié)果見表2。

實驗結(jié)果表明，回流提取比超聲提取峰面積略高，均可作為本發(fā)明中藥組合物的提取方式。

3.3提取次數(shù)的考察

分別考察超聲提取1次、2次和3次，比較不同提取次數(shù)的提取效果，考察結(jié)果見下表：

實驗結(jié)果表明提取3次時，待測成分提取效率最高，但是提取3次時，提取效率僅比提取2次提高了1~2%，表明提取2次和提取3次所得結(jié)果差別不大。

3.4供試品溶液制備方法的確定

取本發(fā)明中藥組合物適量，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%乙醇25ml，超聲處理（功率500w，頻率40khz）30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加50%乙醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用50%乙醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得。

對照品溶液的制備

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡?？鼘幩帷㈤纹ぼ?、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得（甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）。

線性關(guān)系考察

分別精密稱取15.56mg新綠原酸與15.66mg隱綠原酸置于10ml容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度作為對照品母液1；分別精密稱取15.35mg綠原酸與11.24mg異連翹酯苷a置于10ml容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度作為對照品母液2；分別精密稱取15.88mg4,5-二-o-咖啡?？鼘幩崤c12.24mg槲皮苷對照品置于10ml的容量瓶中用50%甲醇溶解并稀釋至刻度作為對照品母液3，分別精密稱取10.69mg甘草酸銨對照品置于10ml的容量瓶中用50%甲醇溶解并稀釋至刻度作為對照品母液4，再分別從對照品母液1、2、3、4中精密吸取1ml、3ml、1ml、2ml置于10ml容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度作為對照品的儲備液，再分別從儲備液中精密吸取0.1、0.2、0.5、1、2、4ml置于10ml的容量瓶中，用50%的甲醇定容至刻度，得到不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液。

分別精密吸取含新綠原酸1.56μg/ml、3.12μg/ml、7.78μg/ml、15.56μg/ml、31.12μg/ml和62.24μg/ml，含綠原酸4.45μg/ml、8.90μg/ml、22.24μg/ml、44.48μg/ml、88.97μg/ml和177.94μg/ml，含隱綠原酸1.57μg/ml、3.13μg/ml、7.83μg/ml、15.66μg/ml、31.32μg/ml、62.64μg/ml，含異連翹酯苷a3.37μg/ml、6.74μg/ml、16.86μg/ml、33.72μg/ml、67.44μg/ml、134.88μg/ml，含4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸1.49μg/ml、2.99μg/ml、7.47μg/ml、14.94μg/ml、29.89μg/ml、59.77μg/ml，含槲皮苷1.12μg/ml、2.24μg/ml、5.61μg/ml、11.22μg/ml、22.45μg/ml、44.90μg/ml，含甘草酸2.09μg/ml、4.19μg/ml、10.47μg/ml、20.95μg/ml、41.89μg/ml、83.79μg/ml的系列對照品溶液各2μl，分別注入超高效液相色譜儀，按擬定的色譜條件測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得新綠原酸回歸方程：y=20628x-1699.7（r2=0.9999），結(jié)果表明新綠原酸在1.56μg/ml～62.24μg/ml范圍內(nèi)線性良好；綠原酸回歸方程：y=19778x+8305.9（r2=0.9999），結(jié)果表明綠原酸在4.45μg/ml～177.94μg/ml范圍內(nèi)線性良好；隱綠原酸回歸方程：y=14319x-933.94（r2=0.9999），結(jié)果表明隱綠原酸在1.57μg/ml～62.64μg/ml范圍內(nèi)線性良好；異連翹酯苷a回歸方程：y=7951.8x-2304.5（r2=0.9999），結(jié)果表明異連翹酯苷a在3.37μg/ml～134.88μg/ml范圍內(nèi)線性良好；4,5-二-o-咖啡?？鼘幩峄貧w方程為：y=20148x-2422.8（r2=0.9999），結(jié)果表明4,5-二-o-咖啡?？鼘幩嵩?.49μg/ml～59.77μg/ml范圍內(nèi)線性良好；槲皮苷回歸方程：y=13288x-3121.6（r2=0.9999），結(jié)果表明槲皮苷在1.12μg/ml～44.90μg/ml范圍內(nèi)線性良好；甘草酸回歸方程為：y=2731.3x+810.9（r2=0.9999），結(jié)果表明甘草酸在2.09μg/ml～83.79μg/ml范圍內(nèi)線性良好。實驗結(jié)果見表4。

5.檢測限和定量限的確定

將待測成分的混合對照品溶液稀釋成一系列濃度的溶液，進(jìn)行uplc檢測，記錄信號強度與噪音強度的比值，將信號強度和噪音強度之比等于3時的濃度作為檢測限，將信號強度和噪音強度之比等于10時的濃度作為定量限。最終確定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、槲皮苷、4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、甘草酸的檢測限分別為0.051μg/ml、0.049μg/ml、0.052μg/ml、0.111μg/ml、0.037μg/ml、0.049μg/ml和2.095μg/ml；定量限分別為0.156μg/ml、0.147μg/ml、0.157μg/ml、0.337μg/ml、0.112μg/ml、0.149μg/ml和6.200μg/ml。

精密度考察

取對照品溶液（濃度為：新綠原酸31.12μg/ml；綠原酸88.97μg/ml；隱綠原酸31.32μg/ml；異連翹酯苷a67.44μg/ml；4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?9.89μg/ml；槲皮苷22.45μg/ml；甘草酸41.89μg/ml）連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算各色譜峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）來考察儀器精密度，結(jié)果見表8。

待測成分峰面積的rsd均小于2%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性考察

取同一批本發(fā)明中藥組合物適量，分別按“供試品溶液的制備”中取樣量的80%、100%、120%取樣，每個取樣量各制備3份，依法測定。根據(jù)每一份所含待測成分的含量，計算rsd，結(jié)果見表9。

由測定結(jié)果可知，待測成分含量的rsd均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性考察

精密吸取供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8和12小時時進(jìn)樣一次，分別記錄待測成分的峰面積，并計算峰面積的rsd，對穩(wěn)定性進(jìn)行考察，測定結(jié)果見表10。

由測定結(jié)果可知，待測成分的峰面積的rsd均在3%以內(nèi)，表明供試品溶液12h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率考察

按取樣量0.5g的二分之一，即0.25g，稱取本品，精密稱定，平行9份，分為3組，分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的待測成分對照品溶液，按“供試品溶液制備方法”制備待測溶液，依法測定，對回收率試驗進(jìn)行考察。結(jié)果見表11。

從表11測定結(jié)果可知，新綠原酸的平均加樣回收率為99.44%，rsd為2.71%，符合要求。

從表12測定結(jié)果可知，綠原酸的平均加樣回收率為99.82%，rsd為2.67%，符合要求。

從表13測定結(jié)果可知，隱綠原酸的平均加樣回收率為97.61%，rsd為1.64%，符合要求。

從表14測定結(jié)果可知，異連翹酯苷a的平均加樣回收率為97.17%，rsd為1.63%，符合要求。

從表15測定結(jié)果可知，槲皮苷的平均加樣回收率為99.19%，rsd為2.89%，符合要求。

從表16測定結(jié)果可知，4,5-二-o-咖啡?？鼘幩岬钠骄訕踊厥章蕿?00.46%，rsd為1.92%，符合要求。

從表17測定結(jié)果可知，甘草酸的平均加樣回收率為100.32%，rsd為0.97%，符合要求。

系統(tǒng)耐用性試驗

10.1流速變化對多成分含量測定的影響

取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別在流速為0.25ml/min、0.3ml/min和0.35ml/min進(jìn)行測定，并按各個成分的對照品做對照，分別計算待測成分的含量，比較流速變化對測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表18。

由上述結(jié)果可知，流速變化后，隱綠原酸，槲皮苷和甘草酸的rsd大于3%，表明流速的微小變化，對樣品中這3個成分的影響較大。

10.2波長變化對待測成分的含量測定的影響

取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別在波長322、245nm，327、250nm和332、255nm進(jìn)行測定，并以各個待測成分對照品做對照，分別計算待測成分的含量，比較波長變化對測定結(jié)果的影響。結(jié)果見表19。

由上述結(jié)果可知，波長變化后，隱綠原酸，槲皮苷和4,5-二-o咖啡?？鼘幩岷繙y定結(jié)果的rsd值大于3%，表明波長的微小變化，對樣品中這3個成分含量測定結(jié)果影響較大。

10.3柱溫變化對待測成分的含量測定的影響

取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別在柱溫30℃、35℃和40℃進(jìn)行測定，并以各個待測成分的對照品做對照，分別計算待測成分的含量，比較柱溫變化對測定結(jié)果的影響。

由上述結(jié)果可知，柱溫變化后，隱綠原酸，4,5-二-o咖啡?？鼘幩幔什菟岷繙y定結(jié)果的rsd值均大于3%，表明柱溫的微小變化，對樣品中這3個成分的含量測定結(jié)果影響較大。

10.4不同色譜柱對待測成分的含量測定的影響

取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別用acquityuplc^?csh^tmc18(1.7μm，2.1×100mm)、acquityuplc^?behc18(1.7μm，2.1×100mm)、acquityuplc^?behshieldrp18(1.7μm，2.1×100mm)和acquityuplc^?hsst3(1.8μm，2.1×100mm)等四種不同的色譜柱進(jìn)行測試，比較不同色譜柱對待測成分峰形以及分離度的影響。結(jié)果表明均可用于本發(fā)明中藥組合物四種成分的含量測定，使用hsst3柱時，待測成分峰形以及分離度最好。

中間精密度

按照已確定的含量測定方法，分別由不同的分析人員在不同的時間、分別用兩臺不同的uplc儀器測定同一批次本發(fā)明中藥組合物待測成分的含量，每次試驗平行操作3份供試品，對中間精密度進(jìn)行考察。結(jié)果見表21-25。

由上述試驗結(jié)果可知，由不同人員在不同時間、不同儀器測定同一批次本發(fā)明中藥組合物待測成分含量的rsd值均小于5%，表明該方法中間精密度良好。

三批本發(fā)明中藥組合物七種成分含量測定

用所制定的含量測定方法，對3批本發(fā)明中藥組合物待測成分的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表26。

本發(fā)明建立了本發(fā)明中藥組合物的四種藥材中七種成分的含量測定方法，通過方法學(xué)研究結(jié)果表明，本方法測定連翹、金銀花、魚腥草和甘草四種藥材中的有效成分具有良好的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可以有效的控制該中藥組合物的質(zhì)量及安全。

附圖說明

圖1：327nm下對照品色譜圖，其中1為新綠原酸，2為綠原酸，3為隱綠原酸，4為異連翹酯苷a，5為4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸

圖2：供試品溶液在327nm下色譜圖

圖3：250nm下對照品色譜圖，其中6為槲皮苷，7為甘草酸

圖4：供試品溶液在250nm下色譜圖

圖5：實施例1色譜圖譜：a圖為327nm下對照品色譜圖，其中1為新綠原酸，2為綠原酸，3為隱綠原酸，4為異連翹酯苷a，5為4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?；b圖為327nm下供試品色譜圖；c圖為250nm下對照品色譜圖，其中6為槲皮苷，7為甘草酸；d圖為250nm下供試品色譜圖。

圖6：實施例2色譜圖譜：a圖為327nm下對照品色譜圖，其中1為新綠原酸，2為綠原酸，3為隱綠原酸，4為異連翹酯苷a，5為4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸；b圖為327nm下供試品色譜圖；c圖為250nm下對照品色譜圖，其中6為槲皮苷，7為甘草酸；d圖為250nm下供試品色譜圖。

圖7：實施例3色譜圖譜：a圖為327nm下對照品色譜圖，其中1為新綠原酸，2為綠原酸，3為隱綠原酸，4為異連翹酯苷a，5為4,5-二-o-咖啡?？鼘幩幔籦圖為327nm下供試品色譜圖；c圖為250nm下對照品色譜圖，其中6為槲皮苷，7為甘草酸；d圖為250nm下供試品色譜圖。

圖8：實施例4色譜圖譜：a圖為327nm下對照品色譜圖，其中1為新綠原酸，2為綠原酸，3為隱綠原酸，4為異連翹酯苷a，5為4,5-二-o-咖啡?？鼘幩幔籦圖為327nm下供試品色譜圖；c圖為250nm下對照品色譜圖，其中6為槲皮苷，7為甘草酸；d圖為250nm下供試品色譜圖。

具體實施方式

實施例1

按比例稱取：連翹200g、金銀花300g、板藍(lán)根200g、大黃40g、廣藿香60g、綿馬貫眾300g、紅景天100g、薄荷腦9g、麻黃60g、苦杏仁100g、魚腥草200g、甘草100g、石膏200g，按照以下工藝提?。?/p>

(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；

(2)廣藿香碎斷，加10倍量水提取揮發(fā)油，提油時間8小時，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘渣棄去，濾液備用；

(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小時，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；

(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小時，提取液合并過濾，所得濾液與步驟（2）廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60℃時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；

(5)將步驟（4）所得清膏與步驟（3）所得醇提液合并，濃縮至在60℃時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；

(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；

(7)將薄荷腦、步驟（2）所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，裝膠囊，即得。

含量測定方法：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%乙醇25ml，超聲提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加50%乙醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用50%乙醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡?？鼘幩帷?1.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩幔簧V柱：acquityuplc^?hsst3(1.8μm，2.1×100mm)；柱溫為35℃；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

結(jié)論：結(jié)果令人滿意，可以用于控制該中藥組合物的質(zhì)量。

實施例2

按比例稱取：連翹300g、金銀花200g、板藍(lán)根300g、大黃60g、廣藿香100g、綿馬貫眾200g、紅景天60g、薄荷腦5g、麻黃100g、苦杏仁60g、魚腥草300g、甘草60g、石膏300g，按照以下工藝提?。?/p>

(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；

(2)廣藿香碎斷，加10倍量水提取揮發(fā)油，提油時間8小時，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘渣棄去，濾液備用；

(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小時，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；

(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小時，提取液合并過濾，所得濾液與步驟（2）廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60℃時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；

(5)將步驟（4）所得清膏與步驟（3）所得醇提液合并，濃縮至在60℃時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；

(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；

(7)將薄荷腦、步驟（2）所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，壓片，即得。

含量測定方法：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25ml，超聲提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加50%甲醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用50%甲醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸；色譜柱為acquityuplc^?csh^tmc18；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

結(jié)論：結(jié)果令人滿意可以用于控制該中藥組合物的質(zhì)量。

實施例3

原料藥配方為：連翹278g、金銀花294g、板藍(lán)根285g、大黃55g、廣藿香95g、綿馬貫眾290g、紅景天87g、薄荷腦8.5g、麻黃88g、苦杏仁80g、魚腥草284g、甘草95g、石膏277g，按照以下工藝提?。?/p>

(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；

(2)廣藿香碎斷，加10倍量水提取揮發(fā)油，提油時間8小時，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘渣棄去，濾液備用；

(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小時，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；

(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小時，提取液合并過濾，所得濾液與步驟（2）廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60℃時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；

(5)將步驟（4）所得清膏與步驟（3）所得醇提液合并，濃縮至在60℃時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；

(6)將步驟（5）所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；

(7)將薄荷腦、步驟（2）所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟（6）所得顆粒，裝袋，即得。

含量測定方法：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25ml，回流提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加甲醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用甲醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡?？鼘幩帷?1.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩?；色譜柱為acquityuplc^?behc18；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

結(jié)果：結(jié)果令人滿意可以用于控制該中藥組合物的質(zhì)量。

實施例4

原料藥配方為：按比例稱取：連翹200g、金銀花300g、板藍(lán)根200g、大黃60g、廣藿香60g、綿馬貫眾300g、紅景天60g、薄荷腦9g、麻黃60g、苦杏仁100g、魚腥草200g、甘草100g、石膏200g，按照以下工藝提?。?/p>

(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；

(2)廣藿香碎斷，加10倍量水提取揮發(fā)油，提油時間8小時，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘渣棄去，濾液備用；

(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小時，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；

(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小時，提取液合并過濾，所得濾液與步驟（2）廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60℃時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；

(5)將步驟（4）所得清膏與步驟（3）所得醇提液合并，濃縮至在60℃時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；

(6)將步驟（5）所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；

(7)將薄荷腦、步驟（2）所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟（6）所得顆粒，裝膠囊，即得。

含量測定方法：

供試品溶液制備：取所述中藥組合物0.5g研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇25ml，超聲提取，功率500w，頻率40khz，提取30分鐘，過濾，得濾液，將濾紙連同殘渣一起加入具塞錐形瓶中，再加乙醇25ml，超聲處理30分鐘，過濾，用乙醇洗滌藥渣4次，每次5ml，合并兩次濾液及洗滌液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25ml，即得；

對照品溶液的制備：取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a、4,5-二-o-咖啡?？鼘幩帷㈤纹ぼ?、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含34.4μg新綠原酸、76.7μg綠原酸、34.2μg隱綠原酸、56.2μg異連翹酯苷a、14.9μg4,5-二-o-咖啡酰奎寧酸、11.2μg槲皮苷和42.8μg甘草酸銨的混合溶液，即得，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207；

色譜條件：以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，洗脫比例如下表：

檢測波長分別為327nm和250nm；250nm下檢測槲皮苷和甘草酸，327nm下檢測新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷a和4,5-二-o-咖啡?？鼘幩幔簧V柱為acquityuplc^?behshieldrp18；

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

結(jié)論：結(jié)果令人滿意可以用于控制該中藥組合物的質(zhì)量。