專利名稱：用于免疫刺激的ihnv g蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的用于預(yù)防傳染病的疫苗的用途，尤其是一類新的在魚類中預(yù)防傳染病的疫苗的用途。本發(fā)明還涉及這樣的疫苗，其包含一部分編碼彈狀病毒如IHNV(傳染性造血組織壞死病毒(InfectiousHaematopoietic Necrosis Virus))G蛋白的核酸序列和一部分編碼第二種肽的核酸序列，其中所述的第二種肽來自病原體。
背景技術(shù)：
有時在人類和獸類醫(yī)學(xué)中使用重組疫苗作為基于滅活或減毒病原體的較傳統(tǒng)方法的替代。以這種方式系統(tǒng)遞送到身體的多種外源抗原只能激活免疫系統(tǒng)的一條途徑，即通過刺激體液免疫反應(yīng)由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類途徑產(chǎn)生抗體。然而，理想的疫苗應(yīng)該也能誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，其通過激活MHC I類途徑破壞受感染細(xì)胞。后一反應(yīng)通過對感染細(xì)胞中的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行胞質(zhì)降解，從而這些外源物質(zhì)的片段與MHC I類分子相結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面以呈遞給CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)而實(shí)現(xiàn)。
核酸疫苗(NAVs)是相對新型的技術(shù)形式，對病原體抗原尤其是病毒抗原的遞送很有用。由于疫苗編碼的病毒蛋白質(zhì)是通過宿主的細(xì)胞器原位表達(dá)的，理論上暗示其會引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)能保護(hù)受攻擊動物。然而結(jié)果卻是多種多樣的在魚類中，表達(dá)傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)G蛋白(表面糖蛋白)的NAVs，和表達(dá)病毒性出血性敗血癥病毒(viralhaemorrhagic septicaemia virus)G蛋白的NAVs分別對IHNV和VHSV感染有效。然而，使用基于其他病毒抗原的NAVs難以令人確信地顯示出對魚類的保護(hù)。
本發(fā)明的目的是提供對由病原體感染引起的多種魚類和其他動物疾病具有更高效用的疫苗。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了這樣的表達(dá)載體，其包含一部分編碼IHNV G蛋白的核酸序列，并進(jìn)一步包含一部分編碼來自非IHNV病原生物的第二種蛋白質(zhì)序列，條件是所述的第二種蛋白質(zhì)不為全部或部分的VHSV M基因所編碼。一部分編碼IHNV G蛋白的序列任選地為IHNV G蛋白經(jīng)分離的前導(dǎo)序列。第二種蛋白質(zhì)優(yōu)選的為來自魚類病原體的抗原，其中所述的魚類病原體任選地為病毒。一部分編碼IHNV G蛋白的序列可與第二種蛋白質(zhì)的編碼序列融合。
本發(fā)明第二方面提供了包含DNA表達(dá)載體及可藥用載體的核酸疫苗，其中所述DNA表達(dá)載體包含一部分編碼彈狀病毒G蛋白的序列，并且還在同一載體上包含一部分編碼非所述彈狀病毒病原生物的第二種蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明還提供了這樣的疫苗組合物，其包含攜帶一部分編碼IHNV G蛋白的核酸序列的第一種表達(dá)載體，并進(jìn)一步包含在所述的第一種表達(dá)載體或第二種表達(dá)載體上攜帶一部分編碼非IHNV抗原的第二種抗原的核酸序列，且還包含可藥用載體。在一個實(shí)施方案中，疫苗組合物包含佐劑。
第四方面，本發(fā)明提供了用于分開地、依次地或同時施用的疫苗組分包(kit of parts)，其包含(i)分離或純化的部分IHNV G蛋白或包含一部分編碼IHNV G蛋白序列的表達(dá)載體，和(ii)分離或純化的部分來自非IHNV病毒的第二種蛋白質(zhì)或包含一部分編碼非VHSV G蛋白的第二種蛋白質(zhì)序列的DNA表達(dá)載體。
另一方面，本發(fā)明提供了組合物在生產(chǎn)用于預(yù)防或治療動物的傳染性疾病的藥物中的用途，其中所述的組合物包含第一種表達(dá)載體，此表達(dá)載體包含一部分彈狀病毒G蛋白的編碼序列，還進(jìn)一步包含所述第一種表達(dá)載體或第二種表達(dá)載體上攜帶的一部分第二種蛋白質(zhì)的編碼序列，第二種蛋白質(zhì)來自能引起所述傳染性疾病的病原生物，其中所述的彈狀病毒不為傳染性疾病的病原體。第一種表達(dá)載體可以缺乏來自彈狀病毒非G蛋白部分的序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了組合物在生產(chǎn)用于預(yù)防或治療魚類非IHNV引起的傳染性疾病的藥物中的用途，其中所述的組合物包含第一種表達(dá)載體，此表達(dá)載體包含一部分IHNV G蛋白的編碼序列，還任選地包含所述第一種表達(dá)載體或第二種表達(dá)載體上攜帶的一部分第二種蛋白質(zhì)的編碼序列，第二種蛋白質(zhì)來源于能引起所述傳染性疾病的病原生物。
另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療動物傳染性疾病的方法，包括對所述動物施用包含DNA表達(dá)載體且還包含可藥用載體的核酸疫苗，其中所述DNA表達(dá)載體包含一部分彈狀病毒G蛋白的序列，并在同一載體上包含一部分來源于非所述彈狀病毒病原體蛋白的序列。在一個實(shí)施方案中，動物為魚類，彈狀病毒為IHNV或VHSV。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于這樣的觀察，即自核酸疫苗表達(dá)的IHNV G蛋白或其前導(dǎo)序列(也稱為信號序列)與第二種抗原的串聯(lián)存在能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)，從而提高針對產(chǎn)生第二種抗原的病原體的保護(hù)作用。對這種效應(yīng)的解釋尚未闡明，但其可能與G蛋白上存在免疫刺激基序(motif)相關(guān)。也可能抗原性蛋白質(zhì)與G蛋白或其前導(dǎo)序列的融合導(dǎo)致抗原移位到細(xì)胞表面，這樣增加了肽對宿主免疫系統(tǒng)的暴露。作為一種選擇，保護(hù)的增加可能是由于通過這些效應(yīng)的聯(lián)合協(xié)同作用。
已經(jīng)使用重組形式的IHNV G蛋白作為接種魚類抵抗IHNV的基礎(chǔ)(US 5,534,555)。目前已知G蛋白的氨基酸序列和核酸序列，例如Koener等，(1987)J.Virol.611342-1349，其在此引用作為參考。
IHNV是彈狀病毒科的一員，此科都具有“G”糖蛋白。彈狀病毒包括水皰性病毒(如水皰性口炎病毒(VSV))、狂犬病毒屬(如狂犬病毒)、短時熱病毒屬((ephemoviruses)(如牛流行熱病毒)和novirhabdoviruses。在本說明書中無論何處提及一部分IHNV G蛋白時，本發(fā)明均延伸至任一彈狀病毒且尤其是任一novirhabdovirus的一部分G蛋白的用途。Novirhabdoviruses的例子包括病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、蛇頭彈狀病毒(SHRV)、比目魚(hirame)彈狀病毒、對蝦彈狀病毒、鯉魚春季毒血癥病毒。VHSV G蛋白尤其可以替代本發(fā)明的IHNV G蛋白。
彈狀病毒G蛋白序列的免疫增強(qiáng)效應(yīng)可以在任何同時具有體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的動物中應(yīng)用于治療或預(yù)防疾病。這樣的動物包括所有種類的哺乳動物(包括人類)、魚類、鳥類和爬行動物。
我們報(bào)告了這樣一個實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例1)，其中IHNV G蛋白和IPNV(傳染性胰腺壞死病毒)VP2抗原在一個DNA質(zhì)粒上以融合蛋白的形式在魚體內(nèi)共同表達(dá)。重組IPNV VP2以前在如大腸桿菌(E.coli)的生物中表達(dá)過。并用于接種魚類抵抗IPNV，這在某種程度是獲得了成功。US 5,165,925涉及到包含VP2多肽的用于抵抗IPNV的疫苗。
如實(shí)施例1中所述將此復(fù)合核酸疫苗(NAV)注射到魚體內(nèi)，并隨后用IPNV攻擊。我們觀察到，與使用傳統(tǒng)的病毒制劑即油輔佐的滅活病毒進(jìn)行的免疫接種相比存活率顯著提高。實(shí)際上，G蛋白-VP2融合蛋白NAV的相對存活百分率(RPS)與PBS陰性對照相比超過50％，然而滅活病毒的RPS約為25％。
攜帶IPNV VP2蛋白而沒有IHNV G蛋白的構(gòu)建體造成相對于PBS陰性對照的平均RPS只有31％。因此，在構(gòu)建體中包括IHNV G蛋白具有增強(qiáng)對IPNV VP2免疫反應(yīng)的作用從而比單獨(dú)VP2蛋白質(zhì)的保護(hù)水平強(qiáng)67％。
第二個實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例2)證實(shí)了IHNV G蛋白的免疫刺激作用，其中IHNV G蛋白的前導(dǎo)序列與ISAV血凝素(HA)基因的5′端在DNA表達(dá)載體上融合，在攻擊試驗(yàn)中使用此載體接種魚類以抵抗ISAV感染。IHNV G蛋白前導(dǎo)序列的存在大大增強(qiáng)了DNA疫苗中ISAV HA抗原的保護(hù)作用。
本發(fā)明包含核酸疫苗和基于重組抗原的疫苗。重組抗原疫苗包含分離或純化的IHNV G蛋白(或其一部分)和分離或純化的來自非IHNV魚類病原體中的第二種抗原。部分IHNV G蛋白和部分第二種抗原任選地以融合蛋白的形式共同提供。
在備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物可包含分離的或純化的部分IHNV G蛋白，和包含一部分第二種蛋白編碼序列的DNA表達(dá)載體；或包含一部分IHNV G蛋白編碼序列的DNA表達(dá)載體和分離或純化的部分第二種蛋白質(zhì)。第二種蛋白質(zhì)優(yōu)選地為來源于魚類病原體的抗原。“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)定義為基本上不含其來源細(xì)胞或組織的細(xì)胞成分或其他污染蛋白質(zhì)，或基本上不含化學(xué)合成時的化學(xué)前體物質(zhì)或其他化學(xué)物質(zhì)。
優(yōu)選的疫苗為在同一DNA表達(dá)載體上攜帶一部分IHNV G蛋白基因和一部分來自非IHNV病原體的第二種基因的核酸疫苗。備選地，這兩個基因可在兩個不同載體上共同施與動物。當(dāng)G蛋白和第二種基因在同一載體上時，它們可以以不同的基因形式表達(dá)或以基因串聯(lián)/基因融合的形式表達(dá)。當(dāng)以基因串聯(lián)/基因融合形式表達(dá)時，編碼部分G蛋白或其片段和第二種抗原或其片段的核酸序列按閱讀框架融合。
當(dāng)基因按閱讀框架融合時，其意思是指核酸序列中為tRNA所識別的三聯(lián)體密碼記錄與天然存在的基因的記錄一致，所以翻譯得到的氨基酸序列為包含一部分IHNV G蛋白和一部分第二種肽的肽。這兩個基因或基因片段優(yōu)選地為直接融合，不含任何插入序列。當(dāng)IHNV G蛋白和第二種蛋白質(zhì)的基因序列或其部分串聯(lián)融合時，IHNV G蛋白序列或其部分可以位于第二種蛋白質(zhì)序列的5′端、第二種蛋白質(zhì)序列的3′端或嵌入序列內(nèi)部。
為了本發(fā)明的目的，“一部分”蛋白質(zhì)理解為指任何這樣的肽分子，其具有所引用蛋白質(zhì)的至少7個，任選地至少15個，或至少25個，或至少50個，或至少100個連續(xù)的氨基酸?！耙徊糠帧被蚧蚝怂嵝蛄袨榛蛐蛄械娜魏我徊糠?，其包含全部編碼序列的至少20個，任選地至少50個，或至少100個，或至少200個連續(xù)的核苷酸。“一部分”基因或蛋白質(zhì)可以為全長基因序列或氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的一部分IHNV G蛋白包含G蛋白的外膜導(dǎo)向前導(dǎo)序列，或其編碼核苷酸序列。此部分任選地包含前導(dǎo)序列而不包含G蛋白其他部分。完整的前導(dǎo)序列(從N-端開始閱讀)為MDTMITTPLILILITCGANS(SEQ ID NO1)。前導(dǎo)序列的截短但有功能的形式可以用于替代完整前導(dǎo)序列。
當(dāng)談及IHNV G蛋白或第二種蛋白質(zhì)或其分別的編碼序列時，應(yīng)理解為此術(shù)語包含具有基本同源的蛋白質(zhì)或編碼序列?！盎就础痹诒疚闹幸馑际沁@樣的序列，當(dāng)與參考序列比較時，與參考序列具有至少60％同源性，優(yōu)選的至少70％同源性，更優(yōu)選的至少80％同源性，更優(yōu)選的至少90％同源性，最優(yōu)選的至少95％同源性。
為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同源性百分比，為獲得最佳比對效果進(jìn)行序列比對(例如在第一種氨基酸或核酸序列中引入缺口以能與第二種氨基酸或核酸序列進(jìn)行最佳比對，并且缺口中插入的非同源性序列為比對效果可以忽略)。
當(dāng)?shù)谝环N(參考)序列中的某個位點(diǎn)被第二種序列對應(yīng)位點(diǎn)處相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，這兩種分子在該位點(diǎn)同源(例如在所述位點(diǎn)具有同一性)。在核酸序列比對的情況下，如果在比對的兩分子中由于遺傳密碼的簡并性，三聯(lián)體密碼包括編碼相同氨基酸的核苷酸，則在特定位點(diǎn)同樣具有同源性。
兩序列間的同源性百分比為序列共有的同源性位點(diǎn)數(shù)量的函數(shù)(即％同源性＝同源性位點(diǎn)數(shù)量/總位點(diǎn)數(shù)量)。序列的比對和同源性百分比的確定可任選地使用數(shù)學(xué)運(yùn)算法則完成。適當(dāng)?shù)倪\(yùn)算法則包含在Altschul等((1990)J.Mol.Biol 215430-10)的NBLAST和XBLAST程序中。
此外，具有相同電荷的氨基酸可以互相取代。例如賴氨酸和精氨酸可以互相取代。谷氨酸和天冬氨酸可以互相取代。谷氨酸酯和天冬氨酸酯也可以互相取代。蛋白質(zhì)中氨基酸的此類電荷相互變化在本領(lǐng)域中是認(rèn)可的并且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)仍包括在本發(fā)明中。
IHNV和其他病原體存在多種不同的地理分離株。這些病原體的核酸序列及其表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列存在一定程度的變異。本發(fā)明中使用的IHNV G蛋白和第二種蛋白質(zhì)并不限定于任何特定的分離株來源。當(dāng)為特殊地理區(qū)域設(shè)計(jì)疫苗時，可以方便地將第二種蛋白質(zhì)變體與此地理區(qū)域中流行的分離株相匹配。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案中提供了這樣的DNA表達(dá)載體，其中IHNV G蛋白和第二種蛋白質(zhì)的核酸序列可操縱地與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列連接，還提供了包含DNA表達(dá)載體和可藥用載體的核酸疫苗。IHNV G蛋白和第二種蛋白質(zhì)的核酸序列可以連接到一起以在相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制下表達(dá)，或者可以在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制下互相獨(dú)立的表達(dá)。正如在此使用的，術(shù)語“DNA表達(dá)載體”指能轉(zhuǎn)運(yùn)另一個與其連接的核酸的核酸分子。優(yōu)選的DNA表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。一類載體為“質(zhì)?！?，指能連接入其他DNA片斷的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體為病毒載體，其中其他DNA片段能連接入病毒基因組。在重組表達(dá)載體中，“可操縱地連接”意思是目的核苷酸序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式與調(diào)節(jié)序列連接。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括啟動子和聚腺苷酸化序列?？墒褂闷渌怂嵝蛄刑岣呙庖叻磻?yīng)，如具有非甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸，或者編碼其他抗原性蛋白質(zhì)或輔助性細(xì)胞因子的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列在多種類型宿主細(xì)胞中組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的序列，和那些只指導(dǎo)核苷酸序列在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)的序列(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。DNA可以以裸DNA形式存在或者可與利于細(xì)胞攝入的制劑(例如脂質(zhì)體或陽離子脂類)共同施用。DNA接種技術(shù)例如在WO 90/11092中進(jìn)行了綜述，在此引用作為參考。
為了在魚體內(nèi)最佳表達(dá)，可優(yōu)選地選擇對欲接種魚而言為內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。例如，可以考慮內(nèi)源細(xì)胞因子或肌動蛋白基因啟動子，或其他來源于魚類DNA病毒的調(diào)節(jié)序列。US 5,780,448中更詳細(xì)地解釋了應(yīng)用于魚類的DNA接種，在此引用作為參考。
使用包含組成型和誘導(dǎo)型啟動子的載體，已經(jīng)在多種生物中(包括大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))成功表達(dá)了重組IHNV和其他病原體蛋白質(zhì)。在重組疫苗中，純化的IHNV G蛋白和第二種蛋白質(zhì)可混合到一起共同施用。作為一種選擇，包含這兩個基因部分融合的載體可通過常規(guī)的技術(shù)構(gòu)建并在宿主細(xì)胞中表達(dá)以制備純化的重組融合蛋白質(zhì)?？墒褂玫鞍踪|(zhì)純化的常規(guī)方法來制備用于疫苗的重組蛋白質(zhì)。表達(dá)重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞裂解物任選地可用于代替經(jīng)過進(jìn)一步純化步驟的重組蛋白質(zhì)。
基于在此展示的結(jié)果，我們要求在動物中治療或預(yù)防傳染性疾病的方法，如在魚類中治療或預(yù)防傳染性疾病的方法，包括給動物施用這樣的組合物，其包含IHNV G蛋白一部分核苷酸序列(或所編碼的蛋白質(zhì)序列)，并包含引起傳染性疾病病原體的第二種抗原的一部分核苷酸序列(或所編碼的蛋白質(zhì)序列)。我們還要求組合物在制備治療或預(yù)防動物(如魚類)傳染性疾病的藥物(疫苗)中的用途，其中所述傳染性疾病由所述的病原體生物引起，和/或我們還要求組合物用于治療或預(yù)防所述病原體生物感染中的用途，所述組合物包含一部分IHNV G蛋白或其編碼核苷酸序列和來自病原體生物的一部分第二種蛋白質(zhì)或其編碼核苷酸序列。
本發(fā)明的“第二種”(異源的)蛋白質(zhì)可以為來源于非IHNV魚類病原體的蛋白質(zhì)(或肽或抗原)。第二種蛋白質(zhì)可以來源于引起傳染性疾病綜合征的真菌、病毒、原生動物或細(xì)菌性魚類病原體。第二種蛋白質(zhì)任選地來源于非彈狀病毒或非VHSV的病毒。例如，第二種蛋白質(zhì)可來源于傳染性鮭魚貧血性病毒(Infectious Salmon Anaemia Virus，ISAV)、傳染性胰腺壞死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV)、虹彩病毒(Iridovirus)、神經(jīng)壞死病毒(Nervous Necrosis Virus，NNV)、鮭魚胰腺疾病病毒(Salmon Pancreas Disease Virus，SPDV)、鯉魚春季毒血癥病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)、病毒性出血性敗血癥病毒(ViralHemorrhagic Septicemia Virus，VHSV)、沙氏腎桿菌(Renibacteriumsalmoninarum(細(xì)菌性腎病致病體))、鮭類立克次氏體病(Piscirickettsiasalmonis)(鮭類立克次氏體敗血癥致病體)、弧菌屬中的某些種(Vibriospp)、氣單胞菌屬中的某些種(Aeromonas spp)、魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckerii)、諾卡氏菌屬中的某些種(Nocardia spp.)、假單胞菌屬中的某些種(Pseudomonas spp.)、海鱺發(fā)光菌(Photobacterium damselae)等等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二種蛋白質(zhì)為病毒來源。已經(jīng)有大量并且越來越多的來自這些和其他病原體生物的多肽得到純化和/或克隆和表達(dá)，其可在疫苗組合物中與IHNV G蛋白或其編碼序列連接來獲得或提供。優(yōu)選的例子包括IPNV蛋白質(zhì)VP1、VP2、VP3、NS及其編碼核苷酸序列；WO01/10469中公布的ISAV蛋白質(zhì)，包括血凝素、核衣殼、聚合酶和片段7P4、P5蛋白質(zhì)及其編碼核苷酸序列；WO 01/68865中公布的鮭類立克次氏體病(P.salmons)蛋白質(zhì)，包括OspA、IcmE及其編碼核苷酸序列；野田村病毒蛋白質(zhì)，如核衣殼；SPDV的結(jié)構(gòu)多肽及其編碼核苷酸序列(在WO99/58639中公布)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選疫苗組合物包含這樣的DNA載體，其攜帶與一部分IPNV VP2序列按閱讀框架融合的一部分IHNV G蛋白核苷酸序列或其攜帶與一部分ISAV血凝素序列按閱讀框架融合的一部分IHNV G蛋白前導(dǎo)序列。
接受本發(fā)明疫苗的首選魚類為鮭魚類，包括鮭魚和鱒魚，尤其是銀鮭魚(Oncorhynchus kisutch)、溪紅點(diǎn)鮭(Salvelinus fontinalis)、褐鱒魚(Salmotruffa)、切努克鮭魚(Oncorhynchus tshawytscha)、馬蘇大馬哈魚(Oncorhyncus masou)、細(xì)鱗鮭魚(Oncorhynchus gorbuscha)、彩虹鮭魚(Oncorhynchus mykiss)、北極嘉魚(Salvelinus alpinus)和大西洋鮭魚(Salmosalar)。然而對傳染性疾病敏感的其他任何魚類也可受益，如觀賞魚類、錦鯉、金魚、鯉魚、鯰魚、黃獅魚、海鯛、黑鱸、梭子魚、大比目魚、黑斑鱈魚、羅非魚、大菱鲆、wolfish等等。
本發(fā)明第二種(異源性)蛋白質(zhì)也可以為非魚類的動物病原體抗原，尤其是哺乳動物如人類的病原體抗原。第二種蛋白質(zhì)可來源于引起動物傳染性疾病綜合征的真菌、病毒、原生動物和細(xì)菌性病原體?？赡懿≡w的非限制性例子包括肝炎病毒(如HBV、HCV)、HIV和其他的免疫缺陷病毒基因、感冒病毒、麻疹病毒、冠狀病毒、皰疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、輪狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、漢坦病毒、細(xì)小病毒和特殊病毒牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛皰疹病毒(BHV)、口蹄疫病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感3型病毒(PI3)、傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)、豬呼吸和生殖綜合征病毒(PRRSV)；梨形鞭毛蟲屬(Giardia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、利什曼蟲(Leishmania)、阿米巴蟲(Amoeba)、內(nèi)阿米巴蟲屬(Entamoeba)、錐蟲屬(Trypanosoma)、弓形體屬(Toxoplasma)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、隱胞菌屬(Cryptosporidia)、假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、粗球孢子菌(Coccidioides)、芽生菌屬(Blastomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、肺炎球菌屬(Pneumococcus)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、利斯特氏小菌屬(Listeria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chlamydia)、艾美蟲屬(Eimeria)、梭菌屬(Clostridia)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、分歧桿菌(Brachyspira)、沙門氏菌屬(Salmonella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)、支原體屬(Mycoplasma)(如牛支原體、豬肺炎支原體)、密螺旋體屬(Treponema)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、埃利希氏體屬(Ehrlichia)、立克次氏體(Rickettsia)、布魯氏菌(Brucella)、Neospora、梭桿菌屬(Fusobacterium)、大腸桿菌(Ecoli)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、微粒孢子蟲屬(Anaplasma)等等。
任何脊椎動物都可以用本發(fā)明的疫苗免疫。尤其要提到的是人類、農(nóng)田動物的主要物種即牛、馬、羊、豬、家禽和寵物。
本發(fā)明兩種成分的疫苗可以在單一疫苗組合物中制備在一起，或可以分別制備用來分別施用或共同施用。每一種成分任選地以試劑盒形式提供用來分開、依次或同時施用。兩種成分可在施用前立即混合到一起。
對魚類來說，施用本發(fā)明疫苗的優(yōu)選途徑為肌肉注射(尤其是注射到軸后肌肉)。可替代的選擇為注射到腹腔(用于較大的魚類)、經(jīng)口飼喂、或浸入海水或淡水中。推薦體重2g或2g以上的魚類通過注射施用本發(fā)明的疫苗，優(yōu)選地為10g或以上的魚類。對浸入或經(jīng)口施用來說，優(yōu)選的為體重至少0.1g的魚類，任選的為至少0.5g，通常為至少2g。
在魚類之外的動物中，疫苗尤其是核酸疫苗經(jīng)常通過肌肉注射遞送或通過粘膜遞送；遞送技術(shù)包括下列但不局限于電穿孔、皮下或透皮注射、顯微注射、噴射注射、磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體融合、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、病毒感染、微顆粒、細(xì)菌載體和生物彈(如使用基因槍的粒子轟擊)。
本發(fā)明的疫苗可以為預(yù)防或治療的目的給動物施用。疫苗能誘導(dǎo)對目標(biāo)感染疾病的長期保護(hù)。在為魚類的情況下，“長期”保護(hù)的意思是接種后長于7天的保護(hù)性免疫反應(yīng)，更優(yōu)選的為長于20天，最優(yōu)選的為長于70天。
疫苗的有效劑量可以依受試對象的大小和種類并根據(jù)施用方式而變化。最佳的劑量可以通過醫(yī)生、獸醫(yī)和水產(chǎn)專家的反復(fù)試驗(yàn)確定。對魚類來說，疫苗在單劑量中可包含0.01-0.5g的重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選的為約0.05-0.2g的重組蛋白質(zhì)。核酸疫苗適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鸀樽畹推た藬?shù)量級或最高毫克數(shù)量級，但通常為每單位劑量約0.01-100微克，優(yōu)選的為每單位劑量0.1-50微克，更優(yōu)選的為每單位劑量約1-20微克，最優(yōu)選的為每單位劑量約5微克-10微克。由于魚類對接種的反應(yīng)所經(jīng)受的脅迫，疫苗優(yōu)選地以單劑量形式作為單次注射疫苗提供。對可注射疫苗來說，單劑量單位的體積適當(dāng)?shù)貫?.025-0.5毫升，優(yōu)選的為0.05-0.2毫升，任選的為約0.1毫升。
疫苗一般地制成液體溶液、乳劑或懸浮液以注射或在水中遞送。也可以制成適于在施用前溶解于或懸浮于液體媒介物，或與固體食物混合的固體形式(如粉末)。疫苗可為凍干的、用無菌稀釋劑重構(gòu)的即用形式，任選的為冷凍干燥的。例如，凍干疫苗可以在0.9％的生理鹽水中重構(gòu)(任選地作為成套疫苗產(chǎn)品的一部分提供)。由于核酸分子的穩(wěn)定性和長的貯存期限，核酸疫苗尤其適合凍干。作為一種選擇，疫苗可以在鹽溶液中提供。在加入圍欄、槽子和養(yǎng)殖室通過浸沒給魚類施用前，疫苗的液體或重構(gòu)形式可進(jìn)一步在小體積水中稀釋(如1-10體積)。本發(fā)明的藥用疫苗組合物可以立即釋放或慢速釋放的形式施用。
可藥用載體或媒介物包括常規(guī)的賦形劑并可以為例如溶劑類，如水、油或鹽水、葡萄糖、甘油、蔗糖、三卡因(tricaine)、著濕劑或乳化劑、填充劑、包衣劑、粘合劑、填料、崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、pH緩沖劑；或常規(guī)的佐劑如胞壁酰二肽、阿夫立定、氫氧化鋁、油類、皂苷類、嵌段共聚物和其他本領(lǐng)域已知的物質(zhì)。在為核酸疫苗的情況下，DNA表達(dá)載體可以裸DNA形式遞送，或以陽離子脂-DNA復(fù)合體、脂質(zhì)體、磷酸鈣共沉淀物、被吸附于微粒子上等形式提供。
在一些情況下可能希望將針對傳染性病原體的本發(fā)明疫苗和常規(guī)疫苗(滅活病原體或重組病原體抗原疫苗或病原體核酸疫苗)組合在組合疫苗中，或組合在包含這兩種成分的試劑盒中用于分開、依次或同時施用，以治療或預(yù)防病原體引起的傳染性疾病。
實(shí)施例1在大西洋鮭魚Salmo salar中評估針對傳染性胰腺壞死病毒的核酸疫苗接種疫苗8℃溫度下，將大西洋鮭魚幼魚(體重9-26g)放在盛有淡水的兩個直徑1米的圓形槽子中，并在接種前饑餓24小時。為了接種疫苗，將魚在濃度為約0.5g/升的3-氨基苯甲酸乙酯(MS222，Sigma，Poole，UK)中麻醉。核酸疫苗在左背側(cè)背鰭下的區(qū)域通過肌內(nèi)注射施用(10μg DNA/50μl劑量)。油輔佐的滅活I(lǐng)PNV疫苗和PBS對照通過腹腔內(nèi)注射(100μl)施用。每一處理組有40條魚，對6種疫苗中的每一種疫苗重復(fù)兩次。
測試組接受下列組合物(1)pUK載體攜帶卡那霉素抗性基因、CMV立即早期啟動子、多克隆位點(diǎn)和牛生長激素聚腺苷酸化信號(BGH polyA)的克隆載體。
(2)pUK+VP2在載體的多克隆位點(diǎn)中連入IPNV VP2全部編碼序列的pUK載體。
(3)pUK+IHNG在載體的多克隆位點(diǎn)中連入IHNV G蛋白全部編碼序列的pUK載體。
(4)pUK+IHNG+VP2在載體的多克隆位點(diǎn)中連入按閱讀框架與IHN病毒糖蛋白(G)融合的IPNV VP2蛋白質(zhì)全部編碼序列的pUK載體，這樣G蛋白質(zhì)位于VP2的5’端。
(5)IPNV+油IPN病毒的滅活制品，用油輔佐。
(6)PBS(陰性對照)。
接種疫苗后6周，用5天的時間使所述魚適應(yīng)海水。流入魚槽的海水逐漸增加而淡水減少，這樣在5天結(jié)束時魚就在完全濃度的海水中了。
同居攻擊實(shí)驗(yàn)807度日(degree days)接種疫苗后，IPN病毒“Cole-Deep”株冷凍的2次傳代(a frozen pass 2)上清在無菌PBS中稀釋5倍以達(dá)到終濃度1×107TCID50/ml。魚在MS222中麻醉并通過腹腔內(nèi)注射100μl的病毒懸液成批攻擊，這樣每一條魚接受106TCID50劑量。攻擊時海水的溫度約為11℃，每個槽子中的水流速度約為5升每分鐘。
最初觀察時每天兩次移出死亡的魚。攻擊后8周結(jié)束試驗(yàn)。
結(jié)論
基于在腹膜內(nèi)注射的兩歲大西洋鮭魚中同居的攻擊實(shí)驗(yàn)是成功的腹膜內(nèi)注射的同居者中累積死亡率達(dá)到平均41.25％，這能在4個攻擊槽中很接近地重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)差為3.95％。
油輔佐的滅活I(lǐng)PNV疫苗的性能通過與PBS接種對照的關(guān)系評價。滅活疫苗能提供相對存活百分率(RPS)比PBS接種對照高25％的保護(hù)。
核酸疫苗的性能或者與空質(zhì)粒比較，或者與包含IHNV G蛋白基因的質(zhì)粒比較。對照質(zhì)粒與假接種PBS對照比較以確定空質(zhì)?；虬琁HNV G蛋白的質(zhì)粒是否具有保護(hù)作用。質(zhì)粒載體pUK表現(xiàn)不顯著的保護(hù)作用。當(dāng)載體中包括IPNV VP2蛋白時，與PBS接種對照相比表現(xiàn)顯著的保護(hù)(31％RPS)。當(dāng)載體中包括IHNV G蛋白而沒有IPNV基因時，與PBS相比的保護(hù)作用總計(jì)為17％RPS。
性能最顯著的疫苗為包含與IPNV VP2串聯(lián)的IHNV G蛋白基因的NAV。此疫苗接種的魚表現(xiàn)出與PBS接種對照相比52％RPS的相對存活百分率。
總之，在此試驗(yàn)中帶有油佐劑的標(biāo)準(zhǔn)滅活病毒制品已足夠可行，但是包含VP2的NAVs的性能要高的多。尤其是，包含與IHNV G蛋白串聯(lián)的VP2的NAV是最有效的。
實(shí)施例2評價抗ISAV的核酸疫苗平均重10g的大西洋鮭魚幼魚(＜6月齡)在12±1℃以2.5L/分鐘速度流動的水中適應(yīng)至少7天。以每天1.5％體重的比率給魚飼喂商售粒狀飼料。
接種疫苗前魚在30mg/l的苯佐卡因中麻醉。核酸疫苗在背鰭前的軸后肌中通過肌肉內(nèi)注射施用(10μg DNA/50μl劑量)。油乳劑疫苗通過腹腔內(nèi)注射施用(150μl)。每一個重復(fù)的疫苗組有55條魚，對5種疫苗中的每一種疫苗重復(fù)兩次。
測試組接受下列組合物(1)pUK載體攜帶卡那霉素抗性基因、CMV立即早期啟動子、多克隆位點(diǎn)和牛生長素聚腺苷酸化信號(BGH polyA)的克隆載體。
(2)pUK-HA在多克隆位點(diǎn)中連入ISAV血凝素蛋白全部編碼序列的pUK載體。
(3)pUK-IHNg在多克隆位點(diǎn)中連入IHNV G蛋白全部序列的pUK載體。
(4)pUK-HA-IHNg在多克隆位點(diǎn)中連入ISAV血凝素蛋白全部編碼序列并在其5’端與IHNV G蛋白前導(dǎo)序列融合的pUK載體。
(5)ISAV+油ISA病毒的滅活制品，用油輔佐。
于850.5度日對魚進(jìn)行攻擊。使用同居攻擊，其中相同血統(tǒng)的鮭魚剪短脂肪鰭，腹膜內(nèi)注射0.1ml培養(yǎng)的ISAV(約每條魚104TCID50)并放入每一個處理過魚的槽子中。
每個槽子中的魚每天兩次監(jiān)測死亡率，共31天。如下計(jì)算相對存活百分率RPS＝1-(％疫苗死亡率/％pUK對照死亡率)×100結(jié)果陰性對照組(pUK質(zhì)粒)的累積死亡率為94％。注射陽性對照即單價滅活I(lǐng)SAV疫苗能引起最佳保護(hù)(94％RPS)。注射pUK-IHNg質(zhì)粒作為陰性對照引起某種非特異的保護(hù)(RPS 26％)。pUK-HA給予了高水平的保護(hù)(RPS 49％)。這種保護(hù)作用能通過在3’端加入IHNV G蛋白前導(dǎo)序列(pUK-HA-IHNg)顯著地增強(qiáng)(RPS 60％)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了在核酸疫苗中包括IHNV G蛋白序列(或至少其前導(dǎo)序列)以增強(qiáng)對其他IHNV傳染性疾病免疫性的好處。G蛋白的前導(dǎo)序列可能在魚類中引導(dǎo)異源性抗原靶向細(xì)胞表面，或者蛋白質(zhì)中存在特異的基序，其非特異地刺激魚類的免疫系統(tǒng)。
權(quán)利要求
1.DNA表達(dá)載體，其包含一部分IHNV G蛋白編碼序列并且還包含一部分來源于非IHNV的病原體生物的第二種蛋白質(zhì)編碼序列，條件是所述的第二種蛋白質(zhì)編碼序列不為VHSV M基因的一部分序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA表達(dá)載體，其中所述的第二種蛋白質(zhì)編碼序列來源于魚類病原體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA表達(dá)載體，其中所述的第二種蛋白質(zhì)編碼序列來源于非彈狀病毒的魚類病原體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的DNA表達(dá)載體，其包含IHNVG蛋白的前導(dǎo)序列。
5.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA表達(dá)載體，其包含全部IHNV G蛋白的編碼序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的DNA表達(dá)載體，其中部分IHNV G蛋白編碼序列和部分第二種蛋白質(zhì)編碼序列按閱讀框架融合到一起。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA表達(dá)載體，其中第二種蛋白質(zhì)來源于選自ISAV、IPNV、VHSV、NNV、虹彩病毒、SVCV、SPDV、沙氏腎桿菌(Renibacterium salmoninarum)、鮭類立克次氏體病(Piscirickettsiasalmonis)、弧菌屬中的某些種(Vibrio spp)、氣單胞菌屬中的某些種(Aeromonas spp)、魯氏耶爾森氏菌(Yersinia ruckerii)、假單胞菌屬中的某些種(Pseudomonas spp.)、諾卡氏菌屬中的某些種(Nocardia spp.)、和海鱺發(fā)光菌殺魚亞種(Photobacterium damselae subsp.Piscicida)的病原體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的DNA表達(dá)載體，其中第二種蛋白質(zhì)為IPNV的VP2蛋白或ISAV的血凝素蛋白。
9.包含DNA表達(dá)載體和可藥用載體的核酸疫苗，其中所述DNA表達(dá)載體包含一部分彈狀病毒G蛋白并且在同一載體上還包含一部分來自非所述彈狀病毒的病原體生物的第二種蛋白質(zhì)編碼序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸疫苗，其中所述病原體生物為魚類病原體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的核酸疫苗，其中所述彈狀病毒為IHNV或VHSV。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸疫苗，其包含權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的DNA表達(dá)載體。
13.包含第一種DNA表達(dá)載體和第二種DNA表達(dá)載體并包含可藥用載體的核酸疫苗，其中所述第一種DNA表達(dá)載體包含一部分IHNV G蛋白編碼序列，第二種DNA表達(dá)載體包含一部分非VHSV G蛋白的第二種蛋白質(zhì)編碼序列。
14.融合蛋白，其包含一部分IHNV G蛋白和一部分來源于非IHNV的魚類病原體生物的第二種蛋白質(zhì)。
15.組合物，其包含分離或純化的部分IHNV G蛋白，并且還包含來自非IHNV的魚類病原體生物的分離或純化的部分第二種蛋白質(zhì)。
16.組合物，其包含分離或純化的部分IHNV G蛋白以及含有一部分第二種蛋白質(zhì)編碼序列的DNA表達(dá)載體。
17.組合物，其包含含有一部分IHNV G蛋白編碼序列的DNA表達(dá)載體以及分離或純化的部分第二種蛋白質(zhì)。
18.疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求15-17中任意一項(xiàng)所述的組合物和可藥用載體。
19.用于分開、依次或同時施用的疫苗組分包，其包含(i)分離或純化的部分IHNV G蛋白或包含一部分IHNV G蛋白編碼序列的DNA表達(dá)載體，和(ii)分離或純化的來源于非IHNV的病毒的一部分第二種蛋白質(zhì)或包含一部分非VHSV G蛋白的第二種蛋白質(zhì)編碼序列的DNA表達(dá)載體。
20.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸疫苗的用途，用于制備預(yù)防或治療哺乳動物病原性感染的藥物。
21.根據(jù)權(quán)利要求9、13和18中任意一項(xiàng)所述的疫苗或根據(jù)權(quán)利要求19所述的疫苗組分包的用途，用于制備預(yù)防或治療魚類細(xì)菌、病毒、真菌或原生動物感染的藥物。
22.根據(jù)權(quán)利要求9、13和18中任意一項(xiàng)所述的疫苗或根據(jù)權(quán)利要求19所述的疫苗組分包的用途，用于制備預(yù)防或治療魚類傳染性疾病的藥物。
23.組合物在制備預(yù)防或治療魚類非IHNV引起的傳染性疾病的藥物中的用途，其中所述的組合物包含DNA表達(dá)載體，所述DNA表達(dá)載體包含一部分IHNV G蛋白編碼序列，還任選地在同一載體上包含一部分來源于非IHNV的魚類病原體生物的第二種蛋白質(zhì)編碼序列。
全文摘要
疫苗包含魚類病原體一部分IHNV G蛋白和一部分第二種蛋白質(zhì)或包含它們各自的核酸編碼序列。IHNV G蛋白的存在增強(qiáng)對第二種蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致對第二種蛋白質(zhì)所來源的魚類病原體感染的保護(hù)作用。
文檔編號A61K39/145GK1681530SQ03822041
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月17日
發(fā)明者N·C·西馬德, L·M·布特蘭德 申請人:諾瓦提斯公司