專利名稱：4－(苯基－(哌啶－4－基)－氨基)－苯甲酰胺衍生物及其在治療疼痛、焦慮癥或胃腸病 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新化合物、其制備方法、用途以及包含新化合物的藥用組合物。此新化合物用于治療目的，尤其用于治療疼痛、焦慮癥和功能性胃腸病。
背景技術(shù)：
δ受體被確認在許多身體機能如循環(huán)系統(tǒng)和疼痛系統(tǒng)中起作用。因而δ受體配體可能具有止痛藥物和/或抗高血壓藥物的潛在用途。還證實δ受體配體有免疫調(diào)節(jié)活性。
目前充分鑒定了至少三種不同的阿片受體(μ、δ和κ)，顯然三種阿片受體存在于包括人類在內(nèi)的許多物種的中樞系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)。當(dāng)在各種動物模型中激活一種或多種上述受體時，可觀察到痛覺缺失。
目前可應(yīng)用的選擇性阿片樣物質(zhì)δ配體本質(zhì)上幾乎無一例外地是肽，不適于經(jīng)全身途徑給藥。一個非肽類δ激動劑的例子是SNC80(Bilsky E.J.等，Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics，273(1)，pp.359-366(1995))。但是仍然需要選擇性提高而副作用減少的選擇性δ-激動劑。
因此，本發(fā)明要解決的問題是尋找與目前的μ激動劑相比，不僅止痛效果增強而且副作用減少以及提高全身性作用的新止痛藥物。
已經(jīng)鑒定和現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域已有的止痛藥物存在許多缺點，它們的藥代動力學(xué)差，當(dāng)全身途徑給藥時沒有止痛作用。同時，有資料證明，現(xiàn)有技術(shù)中的優(yōu)選δ激動劑化合物全身給藥時表現(xiàn)出明顯的驚厥作用。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些化合物在多種特性上表現(xiàn)出驚人改善，即在δ-激動劑效力、體內(nèi)效力、藥代動力學(xué)、生物利用度、體外穩(wěn)定性方面增強和/或毒性降低。
發(fā)明概述本發(fā)明的新化合物用以下結(jié)構(gòu)式I定義 其中R1選自以下任意一個基團(i)苯基； (ii)吡啶基 (iii)噻吩基 (iv)呋喃基
(v)咪唑基 (vi)三唑基 (vii)吡咯基 (viii)噻唑基 (ix)吡啶基-N-氧化物 其中各R1苯環(huán)和R1雜芳族環(huán)可任選并獨立地被選自以下的1、2或3個取代基進一步取代直鏈和支鏈C1-C6烷基、NO2、CF3、C1-C6烷氧基、氯、氟、溴和碘。苯環(huán)和雜芳族環(huán)上的取代可發(fā)生在所述環(huán)系的任何位置。
當(dāng)R1苯環(huán)和R1雜芳族環(huán)被取代時，優(yōu)選的取代基選自CF3、甲基、碘、溴、氟和氯中任何一個基團。
本發(fā)明的另一個實施方案是這樣的式I化合物，其中R1同上定義，各個R1苯環(huán)和R1雜芳族環(huán)可以獨立被甲基進一步取代。
本發(fā)明的又一個實施方案是這樣的式I化合物，其中R1為苯基、吡咯基、吡啶基、噻吩基或呋喃基，R1苯環(huán)或R1雜芳族環(huán)上任選含有1個或2個優(yōu)選取代基。
本發(fā)明的再一個實施方案是這樣的式I化合物，其中R1為苯基、吡咯基或吡啶基，R1苯環(huán)或R1雜芳族環(huán)上任選含有1個或2個優(yōu)選取代基。
本發(fā)明的又一個實施方案是這樣的式I化合物，其中R1為噻吩基或呋喃基，R1雜芳族環(huán)上任選含有1個或2個優(yōu)選取代基。
式I化合物的鹽和對映異構(gòu)體，包括對映異構(gòu)體的鹽也屬于本發(fā)明范圍。
流程1的反應(yīng)步驟b(見下頁)如下進行用鈀催化劑如三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)[Pd2(dba)3]，在堿(例如叔丁醇鈉)和膦配體(例如雙-二苯基膦烷基-二甲基-9H-氧雜蒽(xantphos)存在下，使通式II中間體化合物 其中PG為氨基甲酸乙酯保護基團(例如Boc和CBZ)，或為芐基或取代的芐基保護基團(例如2，4-甲氧基芐基)；與N，N-二乙基-4-溴苯甲酰胺反應(yīng)得到通式III化合物，
然后1)在標準條件下脫去保護，2)在堿性條件下水解，3)用以下任意一組化合物烷基化得到通式I化合物i)通式為R1-CH2-X的化合物[其中R1同上定義，X為鹵素，優(yōu)選溴或氯]以及合適的堿，或者ii)通式為R1-CHO的化合物[其中R1同上定義]以及合適的還原劑。
用于標準烷基化步驟i)的合適堿包括但不限于三乙胺和碳酸鉀。
用于標準還原步驟ii)的合適還原劑包括但不限于氰基硼氫化鈉和三乙酰氧基硼氫化鈉。
本發(fā)明新化合物可用于治療目的，尤其是用于治療各種疼痛，例如慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛、急性疼痛、癌痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎性疼痛、偏頭痛、內(nèi)臟痛等。但上列類型疼痛不應(yīng)解釋為對疼痛的完全列舉。
本發(fā)明化合物可用作免疫調(diào)節(jié)劑，尤其可用于自身免疫疾病(如關(guān)節(jié)炎)；皮膚移植、器官移植及類似的外科需要；膠原性疾?。桓鞣N變態(tài)反應(yīng)；用作抗腫瘤藥和抗病毒藥。
本發(fā)明化合物可用于所述范例中存在或涉及阿片受體退變或功能障礙的疾病。包括在診斷技術(shù)和成像如正電子發(fā)射斷層成像(PET)中應(yīng)用同位素標記形式的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物可用于治療腹瀉、抑郁癥、焦慮癥和壓力性疾病(例如創(chuàng)傷后壓力癥、恐慌癥、廣泛性焦慮癥、社交恐懼癥和強迫癥)、尿失禁、各種精神疾病、咳嗽、肺水腫、各種胃腸病(例如便秘、功能性胃腸病如腸易激綜合征和功能性消化不良)、帕金森氏病和其它運動障礙、創(chuàng)傷性腦損傷、中風(fēng)、心肌梗塞后心臟保護、脊柱損傷和藥物成癮(包括酒精、尼古丁、阿片樣物質(zhì)和其它藥物濫用)以及交感神經(jīng)系統(tǒng)疾病如高血壓。
本發(fā)明化合物可用作在全身麻醉和監(jiān)控麻醉護理時使用的止痛藥物。常常聯(lián)合使用不同特性的藥物，以達到維持麻醉狀態(tài)(例如記憶缺失、痛覺缺失、肌肉松弛和鎮(zhèn)靜)所需的平衡作用。聯(lián)合用藥包括吸入麻醉劑、安眠藥、抗焦慮藥、神經(jīng)肌肉阻滯劑和阿片樣物質(zhì)。
應(yīng)用任何上式I化合物生產(chǎn)用于治療上述任何疾病的藥物也屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明再一方面是治療患有任何上述疾病的患者的治療方法，其中對需要這種治療的患者給予有效量的上式I化合物。
本發(fā)明另一方面是通式II和III的中間體， 其中PG為氨基甲酸乙酯保護基團如Boc和CBZ，或為芐基或取代的芐基保護基團如2，4-二甲氧基芐基。
本發(fā)明的再一實施方案是式X中間體，
其中R1同上式I中的定義。
在另一種替代合成途徑中，流程2中反應(yīng)步驟b(見下文)如下進行用鈀催化劑如三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)[Pd2(dba)3]，在堿(例如叔丁醇鈉)和膦配體(例如雙-二苯基膦烷基-二甲基-9H-氧雜蒽(xantphos)存在下，使通式IV中間體化合物 其中PG為氨基甲酸乙酯或芐基樣保護基團如Boc，與N，N-二乙基-4-溴苯甲酰胺反應(yīng)得到通式V化合物， 然后1)在標準條件下脫去保護，2)在堿性條件下水解，3)用以下任意一組化合物烷基化得到通式I化合物
i)通式為R1-CH2-X的化合物[其中R1同上定義，X為鹵素，優(yōu)選溴或氯]以及合適的堿，或者ii)通式為R1-CHO的化合物[其中R1同上定義]以及合適的還原劑。接著在標準條件下經(jīng)由以下反應(yīng)將酮縮醇官能團轉(zhuǎn)化為伯酰胺i)將酮縮醇水解為醛(式VI)，ii)然后將醛氧化為相應(yīng)的羧酸(式VII)，iii)接著用氯化銨將其酰胺化為伯酰胺得到通式I化合物。
可用于標準水解步驟(i)的合適水解條件包括但不限于含鹽酸水溶液的四氫呋喃。
氧化步驟(ii)的合適條件包括但不限于在過量2-甲基-2-丁烯存在下，在磷酸二氫鈉水溶液和亞氯酸鈉中于0℃下攪拌。
酰胺化步驟(iii)的合適條件包括但不限于在偶合劑如苯并三唑-1-基氧基-三磷鎓六氟磷酸鹽(下文稱為Py-BOP)存在下，用過量氯化銨處理。
制備方法實施例現(xiàn)在通過以下流程和實施例更詳細地描述本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
流程1合成用于還原性胺化的中間體胺(化合物3) 方法1A(化合物1)3-(1-芐基哌啶-4-基氨基)-4-氟-苯甲腈在裝有3-溴-4-氟苯甲腈(6.56g，1eq)的干燥燒瓶中加入無水甲苯(100mL)、4-氨基-1-芐基哌啶(1.2eq)、外消旋BINAP(612mg，0.03eq)、醋酸鈀(220mg，0.02eq)和叔丁醇鈉(4.4g，1.4eq)。將反應(yīng)物在惰性氣氛下加熱至80℃ 20h。冷卻反應(yīng)物，用乙酸乙酯(200mL)稀釋，用水(100mL)洗滌。合并的有機物用硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮。用快速色譜法提純，用含3％甲醇的二氯甲烷洗脫得到黃色固體胺(1)(6.655g，66％)。
方法1B(化合物2)[(1-芐基-哌啶-4-基)-(5-氰基-2-氟-苯基)-氨基]-N，N-二乙基-苯甲酰胺胺(1)(3.50g，1eq.)的無水甲苯(50mL)溶液中加入芳基溴(4.35g，1.5eq)、xantphos(393mg，0.06eq)、Pd2(dba)3(331mg，0.03eq)和叔丁醇鈉(1.52g，1.4eq)。將反應(yīng)物加熱至回流14h，然后冷卻，用乙酸乙酯(100mL)稀釋。溶液用水(100mL)洗滌，有機物用硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮。用快速色譜法提純，用65％乙酸乙酯∶35％己烷洗脫，升至70％乙酸乙酯∶30％己烷洗脫得到橙色油狀胺(2)(3.568g，65％收率)。
方法1C(化合物3)[(5-氰基-2-氟-苯基)-哌啶-4-基-氨基]-N，N-二乙基-苯甲酰胺在0℃，向胺(2)(3.564g，1eq)的1，2-二氯乙烷(65mL)溶液中加入氯甲酸1-氯乙酯(920μL，1.15eq)。在0℃，1h后，將反應(yīng)物加溫至室溫，然后加熱至70℃ 90min。冷卻反應(yīng)物，然后濃縮。將殘余物溶于甲醇(60mL)，然后加熱至70℃ 1h。然后將溶液冷卻、濃縮。用快速色譜法提純，用含10％甲醇的二氯甲烷洗脫，升至用含40％甲醇的二氯甲烷洗脫得到黃色泡沫狀胺(2.786g，96％)。
流程2經(jīng)由中間體7的替代合成法
中間體4(1-芐基-哌啶-4-基)-(5-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基-2-氟-苯基)-胺在裝有2-(3-溴-4-氟苯基)-1，3-二氧戊環(huán)(1.0eq)和胺(1.2eq)的無水甲苯溶液的干燥燒瓶中加入BINAP(0.03eq)、醋酸鈀(0.02eq)和叔丁醇鈉(1.4eq)。在80℃、氮氣氛下加熱反應(yīng)物。在約24h后，將溶液冷卻，用乙酸乙酯稀釋，用水洗滌一次。有機物用無水硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮。殘余物用快速色譜法提純，用含甲醇的二氯甲烷梯度洗脫。
中間體5[(1-芐基-哌啶-4-基)-(5-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基-2-氟-苯基)-氨基]-N，N-二乙基-苯甲酰胺在裝有胺4的無水甲苯(約6mL/mmol4)溶液的干燥燒瓶中加入芳基溴(1.4eq)、xantphos(0.06eq)、Pd2(dba)3(0.03eq)和叔丁醇鈉(1.4eq)。將反應(yīng)物在氮氣氛下加熱至110℃。在約24h后將溶液冷卻，用乙酸乙酯稀釋，用水洗滌一次。有機物用無水硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮。殘余物用快速色譜法提純，用含甲醇的二氯甲烷梯度洗脫。
中間體6[(1-芐基-哌啶-4-基)-(2-氟-5-甲酰基-苯基)-氨基]-N，N-二乙基-苯甲酰胺縮醛5的四氫呋喃溶液中加入2N HCl溶液(2.0eq)。在室溫下16h后，加入二氯甲烷，水層用飽和碳酸氫鈉水溶液中和。移出有機層，水層用二氯甲烷萃取兩次。合并的有機萃取液用硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮，殘余物用快速色譜法提純，用含乙酸乙酯的己烷梯度洗脫。
中間體7[(1-芐基-哌啶-4-基)-(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-氨基]-4-氟-苯甲酸醛6(1.0eq)的叔丁醇溶液中加入2-甲基-2-丁烯(10.0eq)，將溶液冷卻至0℃。加入磷酸二氫鈉(9eq)和亞氯酸鈉(9eq)的水溶液，將反應(yīng)物在0℃攪拌30min。除去叔丁醇，反應(yīng)混合物用二氯甲烷萃取。合并的有機萃取液用硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮，殘余物用快速色譜法提純，用甲醇/二氯甲烷梯度洗脫。
實施例1[(1-芐基-哌啶-4-基)-(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-氨基]-4-氟-苯甲酰胺(替代合成法)酸7(1.0eq)的DMF溶液中加入pyBOP(1.5eq)、HOBt(1.5eq)、二異丙基乙胺(4.0eq)和氯化銨(2eq)。在室溫下16-24h后濃縮反應(yīng)物。將殘余物溶于乙酸乙酯，用水洗滌兩次，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌一次。有機層用硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮，殘余物用快速色譜法提純，用含甲醇的二氯甲烷梯度洗脫。
另外的實施例經(jīng)由以下常規(guī)步驟合成。
A.還原性胺化中間體3 胺3的無水四氫呋喃(THF)或1，2-二氯乙烷溶液中加入醛(1-1.5eq.)，接著加入三乙酰氧基硼氫化鈉(1-1.6eq.)。將反應(yīng)物在室溫、氮氣氛下長時間(6-48h)攪拌，確保反應(yīng)完全。然后使反應(yīng)物進行標準后續(xù)步驟和標準提純處理。THF或1，2-二氯乙烷用量并非決定性的。優(yōu)選相當(dāng)于約1mL/30mg的用量。
以下合成實施例2的步驟2A為典型的例子。
B.水解中間體氰基化合物 氰基中間體的叔丁醇溶液中加入經(jīng)研磨的氫氧化鉀(KOH)(2.5eq.)，將所得混合物加熱至回流約2h。然后冷卻混合物至室溫，將其用標準后續(xù)步驟和標準提純法處理。叔丁醇用量并非決定性的。優(yōu)選相當(dāng)于約1mL/30mg的用量。
以下合成實施例2的步驟2B為典型的例子。
實施例2[(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-4-氟-苯甲酰胺 2A[(5-氰基-2-氟-苯基)-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-N，N-二乙基-苯甲酰胺胺(370mg)的無水四氫呋喃(10mL)溶液中加入吡啶-2-甲醛(116μL；1.3eq)和三乙酰氧基硼氫化鈉(279mg；1.4eq)。將反應(yīng)物在室溫、氮氣氛下攪拌。在24h后反應(yīng)物用二氯甲烷稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。水溶液用二氯甲烷萃取兩次，合并的有機物用無水硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮。殘余物用快速色譜法提純，用含4％甲醇的二氯甲烷洗脫。獲得無色泡沫狀產(chǎn)物(317.5mg；70％收率)。
2B[(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-4-氟-苯甲酰胺腈(317mg)的叔丁醇(10mL)溶液中加入經(jīng)研磨的氫氧化鉀(92mg；2.5eq)，將反應(yīng)物加熱至回流。在90min后將溶液冷卻，用二氯甲烷稀釋，用水洗滌一次。移出有機物，水溶液用2M鹽酸中和，用二氯甲烷萃取兩次。合并的有機物用無水硫酸鎂干燥，過濾，然后濃縮。殘余物用快速色譜法提純，用含5％甲醇的二氯甲烷洗脫，升至含7％甲醇的二氯甲烷洗脫。獲得無色泡沫狀產(chǎn)物(164.0mg；50％收率)。將泡沫產(chǎn)物溶于含有部分二氯甲烷的乙醚(8mL)中，加入1NHCl/乙醚(1.0mL；～3.0eq)，在1h后，濃縮溶液，高真空干燥固體。
其它實施例按類似方法制備。合成的實施例的分析數(shù)據(jù)在隨后幾頁的表1中列出。
表1各合成的實施例的分析數(shù)據(jù)
表1(續(xù))各合成的實施例的分析數(shù)據(jù)
表1(續(xù))各合成的實施例的分析數(shù)據(jù)
藥用組合物本發(fā)明的新化合物可口服、舌下、肌內(nèi)、皮下、局部、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、硬膜外、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)給藥及注射入關(guān)節(jié)給藥。
優(yōu)選給藥途徑為口服、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給藥。為具體患者確定最佳個體給藥方案和劑量水平時，其劑量取決于給藥途徑、疾病嚴重性、患者的年齡和體重以及主治醫(yī)師通?？紤]的其它因素。
為了用本發(fā)明化合物制備藥用組合物，藥學(xué)上可接受的惰性載體既可為固體也可為液體。固體制劑包括粉劑、片劑、可分散顆粒劑、膠囊劑、扁囊劑和栓劑。
固體載體可以為能起稀釋劑、調(diào)味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑或片劑崩解劑作用的一種或多種物質(zhì)；也可為包囊材料。
為粉劑時，載體為磨成細粉的固體，它可與磨成細粉的活性成分混合。為片劑時，活性成分與具有必要粘合性的載體按適當(dāng)比例混合，并壓制成需要的形狀和規(guī)格。
為了制備栓劑組合物，首先熔解低熔點蠟如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物，并通過例如攪拌將活性成分分散于其中。然后將熔融的均勻混合物傾入常用規(guī)格模型中，使其冷卻固化。
合適的載體有碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、乳糖、糖、果膠、糊精、淀粉、西黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可脂等。
鹽包括但不限于藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明范圍的藥學(xué)上可接受的鹽的實例包括乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙酸鈣、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、丙酸酯十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、glucaptate、葡萄糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰阿散酸鹽、己基間苯二酚鹽、哈胺(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥基萘甲酸鹽、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、溴代甲烷、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽(撲酸鹽)、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽、8-氯茶堿鹽、三乙基碘和苯乍生。
本發(fā)明范圍中藥學(xué)上不可接受的鹽的實例包括氫碘酸鹽、高氯酸鹽、四氟硼酸鹽。由于在物理和/或化學(xué)特性方面的優(yōu)點(例如結(jié)晶性)，藥學(xué)上不可接受的鹽也可能是有用的。
藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選為鹽酸鹽、硫酸鹽和酒石酸氫鹽。特別優(yōu)選鹽酸鹽和硫酸鹽。
術(shù)語組合物包括所述活性成分與作為載體的包囊材料的制劑，在包囊材料提供的膠囊中活性成分(與或不與其它載體一起)被所述載體所包圍，由此使載體與活性成分結(jié)合。同樣，扁囊劑也包括在術(shù)語組合物內(nèi)。
片劑、粉劑、扁囊劑和膠囊劑可用作適于口服給藥的固體劑型。
液體組合物包括溶液、懸浮液和乳液。適于胃腸外給藥的液體制劑實例有所述活性化合物的無菌水溶液或水-丙二醇溶液。也可將液體組合物制成聚乙二醇水溶液。
通過將活性組分溶解于水中并根據(jù)需要加入適當(dāng)?shù)闹珓?、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑和增稠劑，可制備口服給藥的水溶液劑。通過將微細活性組分和粘性原料如天然合成樹膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和藥用制劑領(lǐng)域已知的其它懸浮劑分散于水中，可制備口服用藥的水性懸浮液。
優(yōu)選的藥用組合物是單位劑型。為單位劑型時，所述組合物分成含適量活性組分的單位劑量。所述單位劑型可為有包裝的制劑，包裝中包含離散量的單位制劑，例如有包裝的片劑、膠囊劑以及用小瓶或安瓿包裝的粉劑。單位劑型也可為膠囊劑、扁囊劑或片劑本身，或者它可為適當(dāng)數(shù)量的任何上述包裝形式。
生物學(xué)評價體外模型細胞培養(yǎng)A.在37℃、5％CO2下，在含有無鈣DMEM、10％FBS、5％BCS、0.1％Pluronic F-68和600μg/ml遺傳霉素的振搖瓶中，懸浮培養(yǎng)表達克隆的人μ、δ和κ受體和新霉素抗性的人293S細胞。
B.稱量小鼠和大鼠的大腦重量，用冰冷的PBS(含有2.5mMEDTA，pH7.4)清洗。在冰冷的裂解緩沖液中(50mM Tris，pH7.0，2.5mMEDTA，臨用前用0.5M苯甲磺酰氟的DMSO乙醇母液加入至0.5mM)用polytron對大腦勻化15秒(小鼠)或30秒(大鼠)。
膜制備沉淀細胞，將其重新懸浮于裂解緩沖液中(50mM Tris，pH7.0，2.5mM EDTA，臨用前用0.1M PMSF的乙醇母液加入至0.1mM)，在冰上溫育15分鐘，然后用polytron勻化30秒。在4℃下以1000g(最大)離心該懸浮液10分鐘。將其上清液收集于冰上，重新懸浮沉淀后如上離心。將兩次離心所得的上清液混合，以46,000g(最大)離心30分鐘。將沉淀物重新懸浮于冷Tris緩沖液(50mM Tris/Cl，pH7.0)中，再離心。將最終的沉淀物重新懸浮于膜緩沖液(50mM Tris、0.32M蔗糖、pH7.0)中。聚丙烯管中的等份物(1ml)用干冰/乙醇冷凍并在-70℃貯存待用。用SDS通過改良的Lowry測定法檢測蛋白濃度。
結(jié)合測定于37℃解凍膜，并用冰冷卻，通過25-號針頭三次，稀釋入結(jié)合緩沖液(50mM Tris、3mM MgCl2、1mg/ml BSA(Sigma A-7888)，pH7.4，稀釋液經(jīng)0.22m濾紙過濾，并向其中加入5μg/ml抑肽酶、10μM苯丁抑制素、10μM diprotin A(無DTT)后在4℃貯存)。將100μl等份液加入冰凍的裝有100μl適當(dāng)放射性配體和100μl各種濃度的受試化合物的12×75mm聚丙烯管中。分別測定包含和不含10μM納洛酮的總的結(jié)合(TB)和非特異性(NS)結(jié)合。將所述試管渦旋并于25℃溫育60-75分鐘，之后，快速真空-過濾內(nèi)容物，以約12ml/管的冰冷洗滌緩沖液(50mMTris、pH7.0、3mMMgCl2)通過GF/B濾紙(Whatman)(在0.1％聚環(huán)乙亞胺中預(yù)浸漬至少2小時)洗滌。將濾紙在包含6-7ml閃爍液的微管中浸漬至少12小時后，用β計數(shù)器測量保留在濾紙上的放射性(dpm)。如果所述測定在96-位深孔板中進行，用96位PEI-浸漬的單濾紙(96-place PEI-soaked unifilters)過濾，將所述單濾紙用3×1ml洗滌緩沖液洗滌并于55℃烤箱中干燥2小時。加入50μl MS-20閃爍液/孔后，濾板用TopCount(Packard)計數(shù)。
功能分析通過檢測化合物受體復(fù)合物刺激GTP與偶合受體的G-蛋白結(jié)合的程度來測量本化合物的激動劑活性。在GTP結(jié)合分析中，GTP[γ]35S與受試化合物以及來自表達克隆的人阿片受體的HEK-293S細胞的細胞膜或來自于勻化的大鼠和小鼠大腦的細胞膜相混合。激動劑刺激GTP[γ]35S結(jié)合在這些膜上。各化合物的EC50值和Emax值根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線確定。δ拮抗劑納屈吲哚引起的劑量反應(yīng)曲線右移用來驗證激動劑活性是通過δ受體介導(dǎo)的。
用于大鼠大腦GTP的方法于37℃解凍大鼠大腦細胞膜，通過25-號鈍針頭三次，稀釋入GTPγS結(jié)合液(50mM Hepes，20mM NaOH，100mM NaCl，1mMEDTA，5mM MgCl2，pH7.4，加入新的1mM DTT，0.1％BSA)。將120μM GDP最后加入膜稀釋液。各化合物的EC50和Emax用10點劑量-反應(yīng)曲線評價，10點劑量-反應(yīng)曲線是用每孔300μL含有適當(dāng)量的膜蛋白(20μg/孔)以及100000-130000dpm GTPγ35S(0.11-0.14nM)獲得的。檢測不存在以及存在3μM SNC-80時的基礎(chǔ)和最大刺激結(jié)合作用。
數(shù)據(jù)分析特異性結(jié)合(SB)計算為TB-NS，存在各種受試化合物時的SB表示為對照SB的百分比。用分對數(shù)圖或曲線擬合程序例如Ligand、GraphPad Prism、SigmaPlot或ReceptorFit計算在置換特異性結(jié)合放射性配體中各配體的IC50值和Hill系數(shù)(nH)。用Cheng-Prussoff方程計算Ki值。用至少三個置換曲線報告受試配體的IC50、Ki和nH的平均值±S.E.M。本發(fā)明化合物的生物學(xué)活性數(shù)據(jù)列于下表2中。
表2生物學(xué)數(shù)據(jù)
受體飽和實驗用濃度為0.2-5倍于估計Kδ的適當(dāng)放射性配體(如果所需放射配體量適宜的話，可高達10倍)對細胞膜進行結(jié)合試驗，從而測定放射性配體Kδ值。特異性放射性配體結(jié)合表示為pmole/mg膜蛋白。由各個試驗的特異性結(jié)合(B)的放射性配體對nM游離(F)的放射性配體的單位點非線性擬合獲得各實驗的Kδ值和Bmax值。
用Von Frey試驗測定機械性異常性疼痛用Chaplan等(1994)介紹的方法在08:00至16:00進行試驗。將大鼠置于Plexiglas籠的金屬絲網(wǎng)底(可通過網(wǎng)底接觸到大鼠爪)上，讓其適應(yīng)10-15分鐘。試驗區(qū)域為左后爪的足底中部，避開較不敏感的足墊部分。用一系列剛度呈對數(shù)遞增(0.41、0.69、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51和15.14克；Stoelting，Ill，USA)的8 Von Frey細絲接觸其爪。從網(wǎng)狀底板的下面，垂直于足底表面使用Von Frey細絲，對爪用足夠的力使Von Frey細絲產(chǎn)生輕微彎曲并保持約6-8秒。如爪急劇縮回則為陽性反應(yīng)。細絲一移開立即退縮也認為是陽性反應(yīng)。走開是不明確的反應(yīng)，需要重復(fù)刺激。
試驗方案FCA處理組在手術(shù)后第一天對大鼠進行試驗。用Dixon(1980)的增減法確定50％縮回閾值。用2.04g(處于中等大小的細絲)細絲開始試驗。無論刺激強度是增強或減弱，采用連續(xù)刺激方式。爪對最初選定的細絲刺激無回縮反應(yīng)時，就逐漸增強刺激；若爪回縮，則選擇更弱的刺激。應(yīng)用這種方法計算最優(yōu)閾值需要6個接近50％閾值的反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)發(fā)生第一個變化時，例如首次超過閾值時，才開始計數(shù)這6個反應(yīng)。如果閾值落在刺激范圍之外，閥值分別指定為15.14(正常敏感度)或0.41(最大異常性疼痛)。按照常規(guī)(X＝未縮回；O＝縮回)對所得陽性和陰性反應(yīng)特征制表，用以下公式內(nèi)推出50％收縮閥值50％閾值(g)＝10(Xf+kδ)/10,000其中Xf＝最后使用的Von Frey細絲值(對數(shù)單位)；k＝陽性/陰性反應(yīng)特征的表格數(shù)值(Chaplan等(1994)；而δ＝刺激的平均差值(對數(shù)單位)。此處δ＝0.224。
根據(jù)Chaplan等(1994)，將Von Frey閾值轉(zhuǎn)化為最大可能作用的百分比(％MPE)。下列方程用于計算％MPE
受試化合物的給藥在Von Frey試驗前將受試物質(zhì)注射(皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或口服)給予大鼠，受試化合物給藥與Von Frey試驗時間間隔取決于受試化合物的性質(zhì)。
扭體試驗小鼠腹膜內(nèi)給予后，乙酸會引起腹部收縮。然后呈現(xiàn)典型的機體伸展。用了止痛藥后，較少觀察到所述運動，則該藥選作潛在的良好侯選物。
只有出現(xiàn)下列情況才認為是完全典型的扭體反射所述動物未運動；后背略微降低；雙爪足底表面可觀察到。在該測定時，口服給予1-100μmol/kg本發(fā)明化合物后，證實其明顯抑制扭體反應(yīng)。
(i)溶液制備乙酸(AcOH)將120μl乙酸加入19.88ml的蒸餾水中以得到最終體積為20ml、最終濃度為0.6％的AcOH。再將該溶液混合(渦旋)以備注射用。
化合物(藥物)根據(jù)標準方法制備各化合物并溶解于最適當(dāng)?shù)娜苊街小?br> (ii)溶液劑的給藥在試驗前20、30或40分鐘(根據(jù)化合物的種類及其特性)，以10ml/kg(考慮小鼠平均體重)將所述化合物經(jīng)口、腹膜內(nèi)(i.p.)、皮下(s.c.)或靜脈內(nèi)(i.v.)給藥。當(dāng)所述化合物中樞性給藥時腦室內(nèi)(i.c.v.)或鞘內(nèi)(i.t.)給藥，給藥量為5μl。
臨試驗前以10ml/kg(考慮小鼠平均體重)AcOH在兩側(cè)腹膜內(nèi)(i.p.)給藥。
(iii)試驗觀察所述動物(小鼠)20分鐘，記錄(扭體反射)發(fā)生次數(shù)，實驗結(jié)束時進行數(shù)據(jù)整理。將小鼠放置在帶接觸襯墊的單個“鞋盒”狀籠中。通常同時觀察4只小鼠一只為對照，三只分別給予三種劑量的藥物。
關(guān)于焦慮癥和焦慮癥樣的適應(yīng)癥，化合物效能已經(jīng)在大鼠的geller-seifter沖突試驗中證實。
關(guān)于功能性胃腸病適應(yīng)癥，化合物效能可以按照Coutinho SV等[American Journal of Physiology-Gastrointestinal & Liver Physiology。282(2)G307-16，2002年2月]介紹的評價方法用大鼠證實。
權(quán)利要求
1.一種式I化合物及其鹽， 其中R1選自以下任意一個基團(i)苯基； (ii)吡啶基 (iii)噻吩基 (iv)呋喃基 (v)咪唑基 (vi)三唑基 (vii)吡咯基 (viii)噻唑基 (ix)吡啶基-N-氧化物 其中各R1苯環(huán)和R1雜芳族環(huán)可獨立被選自以下的1、2或3個取代基進一步取代直鏈和支鏈C1-C6烷基、NO2、CF3、C1-C6烷氧基、氯、氟、溴和碘。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中各R1苯環(huán)和R1雜芳族環(huán)可獨立被選自以下的1、2或3個取代基進一步取代甲基、CF3、氯、氟、溴和碘。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中各R1苯環(huán)和R1雜芳族環(huán)可獨立被甲基進一步取代。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R1是吡啶基、吡咯基、噻吩基或呋喃基。
5.權(quán)利要求1的化合物，它選自以下任何一種化合物1[(1-芐基-哌啶-4-基)-(4-二乙基-氨基甲?；?苯基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，2[(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，3[(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-(1-噻吩-3-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，4[(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-(1-呋喃-3-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，5[(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-(1-噻吩-2-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，6[[1-(2，4-二氯-芐基)-哌啶-4-基]-(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-氨基]-氟苯甲酰胺，7[(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-(1-噻唑-2-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，8[[1-(4-溴-芐基)-哌啶-4-基]-(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，9[(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-(1-呋喃-2-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，10[(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-(1-吡啶-4-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，11[[1-(4-氯-芐基)-哌啶-4-基]-(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，12[(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-(1-吡啶-3-基甲基-哌啶-4-基)-氨基]-氟-苯甲酰胺，13{(4-二乙基氨基甲?；?苯基)-[1-(3H-咪唑-4-基甲基)-哌啶-4-基]-氨基}-氟-苯甲酰胺，14{(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-[1-(1H-咪唑-2-基甲基)-哌啶-4-基]-氨基}-氟-苯甲酰胺，15{(4-二乙基氨基甲酰基-苯基)-[1-(1H-吡咯-2-基甲基)-哌啶-4-基]-氨基}-氟-苯甲酰胺。
6.任一項前述權(quán)利要求的化合物，它為其鹽酸鹽、二鹽酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、二三氟乙酸鹽或檸檬酸鹽的形式。
7.一種制備式I化合物的方法，該方法包括用鈀催化劑如Pd2(dba)3，在堿如叔丁醇鈉存在下，使通式II化合物 其中PG為氨基甲酸乙酯保護基團如Boc和CBZ，或為芐基或取代的芐基保護基團如2，4-二甲氧基芐基；與N，N-二乙基-4-溴苯甲酰胺反應(yīng)得到通式III化合物， 然后在標準條件下脫去保護，在還原條件下用通式為R1-CHO的化合物烷基化得到通式I化合物。
8.用于治療目的的權(quán)利要求1的化合物。
9.權(quán)利要求1的式I化合物在制備用于治療疼痛、焦慮癥或功能性胃腸病的藥物中的應(yīng)用。
10.一種藥用組合物，該組合物包含作為活性成分的權(quán)利要求1的式I化合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
11.一種治療疼痛的方法，該方法將有效量的權(quán)利要求1的式I化合物給予需要治療疼痛的患者。
12.一種治療功能性胃腸病的方法，該方法將有效量的權(quán)利要求1的式I化合物給予患有所述功能性胃腸病的患者。
13.一種治療脊髓損傷的方法，該方法將有效量的權(quán)利要求1的式I化合物給予患有所述脊髓損傷的患者。
14.一種通式III化合物， 其中PG為氨基甲酸乙酯保護基團如Boc和CBZ，或為芐基或取代的芐基保護基團如2，4-二甲氧基芐基。
15.一種通式X化合物， 其中R1選自苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、三唑基、吡咯基、噻唑基或吡啶基-N-氧化物中任意一個基團，其中PG為氨基甲酸乙酯保護基團如Boc和CBZ，或為芐基或取代的芐基保護基團如2，4-二甲氧基芐基。
全文摘要
本申請公開并要求保護通式(I)化合物R
文檔編號A61K31/4545GK1620435SQ02814170
公開日2005年5月25日 申請日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月18日
發(fā)明者W·布朗, A·格里芬, C·瓦爾波爾 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司