專利名稱：包含西妥昔單抗和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的液體制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含抗表皮生長因子受體(EGF受體)的嵌合單克隆抗體C225(西妥昔單抗，Cetuximab)的穩(wěn)定的液體藥物制劑。
各種體外和體內(nèi)研究已表明用抗體阻斷EGF受體可例如通過抑制腫瘤細胞增殖、減少腫瘤介導(dǎo)的血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和增強放射治療和常規(guī)化療的毒性作用而在各種水平發(fā)揮抗腫瘤作用。Cetuximab是一種非常有前景的可與EGF受體結(jié)合的抗體。Cetuximab或C225是由各種類型的DNA重組而得，并且首次被Naramura等人述及(CancerImmunol.Immunotherapy37，343-349，1993)。關(guān)于Cetuximab的制備，可參見所述科技文獻。
象其它抗體一樣，Cetuximab是以用于治療用途的溶液形式經(jīng)胃腸外施用的。含抗體溶液的一個特殊問題是它們的聚集傾向和形成蛋白質(zhì)多聚體的傾向。就可還原多聚體而言，這種傾向可歸因于通過鄰近部分之間的相互作用而在不經(jīng)意間形成了分子間二硫橋鍵。疏水相互作用和相關(guān)的不可還原多聚體的形成也是可能的。此外，可發(fā)生脫酰胺反應(yīng)，導(dǎo)致隨后的蛋白降解反應(yīng)。
由于所述的聚集傾向，在抗體溶液貯藏時可出現(xiàn)產(chǎn)品沉淀，因而能否從含有溶液的容器中重現(xiàn)性地除去沉淀遭到了質(zhì)疑。另外，在經(jīng)胃腸外施用含微粒的溶液時可形成栓塞。這導(dǎo)致這樣一種結(jié)果不能保證重現(xiàn)性地向患者施用各種情況下所需的劑量，并且所述施用不具有必要的安全性。盡管在注射前通過過濾可阻止聚集，但這種方法需要進行額外的步驟并因此復(fù)雜化，不十分適用于臨床實踐。劑量重現(xiàn)性的問題仍然未能解決，因為在各種情況下自溶液中分離出的抗體的比例是未知的，并且過濾后的微粒形成繼續(xù)帶來了安全風險。
用于穩(wěn)定單克隆抗體的常規(guī)方法是對含有抗體和助劑的溶液進行凍干。然而，凍干法非常耗時且耗能，因而費用高昂。凍干產(chǎn)品在施用前還必須重構(gòu)。
EP 0073371描述了可經(jīng)靜脈施用的免疫球蛋白組合物，并且為了保持穩(wěn)定性，所述免疫球蛋白組合物的pH為3.5至5.0。然而，這種低pH可在注射部位導(dǎo)致不良的不耐受反應(yīng)。
US 6,171,586 B1公開了pH為4.48至5.5的醋酸鹽緩沖劑、表面活性劑和多元醇在抗體液體制劑中的用途，其中不包括用于確保等滲的NaCl。由于pH較低且缺乏等滲性，所以同樣可在注射部位出現(xiàn)不耐受反應(yīng)。
在這方面，其它含有特定抗體的制劑的例子可參見EP 0280358、EP0170983和US 5,945,098。
其中，EP 0280358描述了向抗某些激素的抗體溶液中加入葡聚糖以達到穩(wěn)定的目的，其穩(wěn)定性可達9個月以上。
EP 0170983描述了通過與水解的卵白蛋白同時加熱而使熱不穩(wěn)定單克隆抗體穩(wěn)定的方法，其使抗體在45℃下貯藏7天后仍保持穩(wěn)定。但是，向預(yù)計用于胃腸外施用的可施用制劑中加入來源于其它物種的蛋白質(zhì)的結(jié)果卻令人失望，這是因為與其相關(guān)的問題，特別是它們的可能的抗原性。
US 5,945,098公開了甘氨酸、聚山梨酸酯80和聚乙二醇用于穩(wěn)定免疫球蛋白G的液體制劑的用途。
本發(fā)明的目的是找到一種特別用于Cetuximab的液體制劑，所述液體制劑適于經(jīng)胃腸外施用、耐受性良好且在室溫下貯藏可穩(wěn)定至少一年。該制劑應(yīng)當具有簡單的組成且不應(yīng)包含任何從毒理學觀點認為可疑的助劑。
令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)了可滿足這些要求的溶液形式的制劑，其除了包含Cetuximab外，還包含pH范圍為約6至約8的磷酸鹽緩沖劑和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。本發(fā)明因此涉及一種穩(wěn)定的液體藥物組合物，其含有pH范圍為6至8的磷酸鹽緩沖劑和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。pH優(yōu)選為6.5至7.5，尤其優(yōu)選pH為約7.2。
可使用的磷酸鹽緩沖劑是磷酸單和/或二鈉鹽及單和/或二鉀鹽(如磷酸氫二鈉或磷酸二氫鉀)以及鈉鹽和鉀鹽的混合物(如例如磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的混合物)的溶液。本發(fā)明制劑中磷酸鹽緩沖劑的濃度可以是2mM至100mM。優(yōu)選的濃度為5mM至20mM，特別優(yōu)選約10mM。
本發(fā)明制劑中Cetuximab的濃度可以是0.1mg/ml至25mg/ml。優(yōu)選的濃度為2mg/ml至10mg/ml，特別優(yōu)選約5mg/ml。
聚乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的商品名也被稱為“吐溫”。本發(fā)明的制劑尤其可包含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單棕櫚酸酯和聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單硬脂酸酯。優(yōu)選使用聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯和聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯，其中特別優(yōu)選聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯。制劑中聚乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的濃度可以是0.001％至1.0％。優(yōu)選的濃度為0.005％至0.1％，特別優(yōu)選約0.01％。
本發(fā)明的制劑優(yōu)選額外包含確保等滲所需濃度的等滲劑，優(yōu)選生理學上耐受的鹽如例如氯化鈉或氯化鉀，或生理學上耐受的多元醇如例如葡萄糖或甘油。因此，本發(fā)明涉及包含Cetuximab、pH約6至約8的磷酸鹽緩沖劑、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯和確保等滲所需濃度的等滲劑的液體制劑。所述制劑優(yōu)選包含氯化鈉作為等滲劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案，液體制劑包含約5mg/ml的Cetuximab、約10mM的pH約7.2的磷酸鹽緩沖劑、約145mM的氯化鈉和約0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯。
本發(fā)明的制劑可通過將所述組分加至含有Cetuximab的溶液中而制備。為此，優(yōu)選將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的所述其它組分的儲備溶液加入至所制備的具有規(guī)定濃度的Cetuximab的溶液中，并且將混合物在適當時用水稀釋至預(yù)先計算的濃度?；蛘?，可將所述組分以固體形式加至含有Cetuximab的初始溶液中。如果Cetuximab是固體的形式，例如凍干物的形式，則本發(fā)明的制劑可通過首先將Cetuximab溶解于水或含有一種或多種其它組分的水溶液中，隨后加入各種情況下所需量的包含其它組分的儲備溶液、固體形式的其它組分和/或水。也可優(yōu)選地直接將Cetuximab溶解于含有所有其它組分的溶液中。本發(fā)明制劑中存在的一種或多種組分可優(yōu)選地早在Cetuximab制備過程中或制備結(jié)束時被加入。這可優(yōu)選地通過在Cetuximab制備后進行的純化的最后步驟中將Cetuximab直接溶解于含有一種、幾種或全部其它組分的水溶液中而進行。為制備本制劑，各種其它組分因而只能必須以各種情況下較小的量加入和/或根本不加入。這種做法在將各種組分在其制備后進行的純化最后步驟中用含有全部其它組分的水溶液直接溶解時尤其優(yōu)選，以便直接獲得本發(fā)明的制劑。
實施例用以解釋本發(fā)明，并非對其進行限制。
實施例1水溶液，其包含5mg/ml的Cetuximab10mM的pH7.2的磷酸鈉緩沖劑45mM的氯化鈉以重量計0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯。
通過將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各個組分的水溶液混合而制備。使用了下列溶液溶液A(活性成分溶液)包含9.7mg/ml的Cetuximab10mM的pH7.2的磷酸鈉緩沖劑(由2.07g/l的磷酸氫二鈉七水合物和0.31g/l的磷酸二氫鈉一水合物組成)145mM的氯化鈉。
(本溶液是通過在活性成分制備后進行的色譜純化的最后步驟中用溶液B自柱中將活性組分洗脫而獲得。)溶液B(緩沖劑/鹽溶液)與溶液A相似，但不含活性組分。
溶液C(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯溶液)與溶液B相似，但額外包含以重量計1％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯。
為制備本發(fā)明的制劑，將10ml溶液A、9.8ml溶液B和0.2ml溶液C彼此混合。
用無菌過濾器將所制備的溶液過濾，然后移至小瓶中。每只瓶用移液管填充2ml溶液。隨后用塞子密封并卷邊。
實施例2(對比制劑)水溶液，其包含5mg/ml的Cetuximab10mM的pH7.2的磷酸鈉緩沖劑145mM的氯化鈉為制備對比制劑，將實施例1中所述的溶液A和溶液B各10ml彼此混合。
實施例3水溶液，其包含2mg/ml的Cetuximab以重量計0.1％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯20mM的磷酸氫二鈉以重量計5％的葡萄糖通過將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各個組分的水溶液混合而制備。使用了下列溶液溶液A水溶液，其包含
4mg/ml的Cetuximab20mM的磷酸氫二鈉。
(本溶液是通過在活性成分制備后進行的色譜純化的最后步驟中用溶液B自柱中將活性組分洗脫而獲得。)溶液B(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯/葡萄糖溶液)以重量計0.2％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯以重量計10％的葡萄糖20mM的磷酸氫二鈉。
為進行制備，將10ml溶液A和10ml溶液B彼此混合。
用無菌過濾器將所制備的溶液過濾，然后移至小瓶中。每只瓶用移液管填充2ml溶液。隨后用塞子密封并卷邊。
實施例4通過負載試驗(stress test)對本發(fā)明制劑的穩(wěn)定性進行測試。為此，將含有實施例1的溶液的小瓶和用于對比的含有實施例2的溶液的小瓶在40℃和75％相對空氣濕度下貯藏。在貯藏前和規(guī)定的貯藏時間后，在每種情況下均取3個小瓶，在冷光源直接照明下進行目視評價，并且測定溶液在350nm和550nm處的吸收度，作為濁度的量度。此外，在所有情況下均取3個小瓶，通過HPLC凝膠過濾法分析Cetuximab及分解產(chǎn)物的含量。
在凝膠過濾HPLC中，用pH7.2的磷酸鹽緩沖劑作為流動介質(zhì)。色譜柱Toso Haas TSKgel G 3000 SWXL(內(nèi)徑7.8mm，長度30cm)，流速0.5ml/min。于280nm處進行檢測。
穩(wěn)定性研究的結(jié)果見表1。
表1
結(jié)果清楚地顯示與對比溶液相比，本發(fā)明制劑的穩(wěn)定性顯著增強。
權(quán)利要求
1.液體藥物制劑，其包含Cetuximab、pH為6至8的磷酸鹽緩沖劑和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。
2.權(quán)利要求1的液體藥物制劑，其特征在于所述液體藥物制劑的pH為6.5至7.5。
3.權(quán)利要求2的液體藥物制劑，其特征在于所述液體藥物制劑的pH為約7.2。
4.權(quán)利要求1至3的其中一項或多項的液體藥物制劑，其特征在于磷酸鹽緩沖劑的濃度為2mM至100mM。
5.權(quán)利要求4的液體藥物制劑，其特征在于磷酸鹽緩沖劑的濃度為5mM至20mM、優(yōu)選10mM。
6.權(quán)利要求1至5的其中一項或多項的液體藥物制劑，其特征在于其中的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯為聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。
7.權(quán)利要求1至6的其中一項或多項的液體藥物制劑，其特征在于聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的濃度為0.005％至0.1％、特別是約0.01％。
8.權(quán)利要求1至7的其中一項或多項的液體藥物制劑，其特征在于還含有確保等滲所需濃度的等滲劑。
9.權(quán)利要求8的液體藥物制劑，其特征在于含有氯化鈉作為等滲劑。
10.權(quán)利要求1至9的其中一項或多項的液體藥物制劑，其特征在于所述液體藥物制劑包含約5mg/ml的Cetuximab、約10mM的pH約7.2的磷酸鹽緩沖劑、約145mM的氯化鈉和約0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含西妥昔單抗(Cetuximab
文檔編號A61K39/395GK1527724SQ02814105
公開日2004年9月8日 申請日期2002年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月13日
發(fā)明者H-C·馬勒, R·米勒, U·馬丁尼-馬爾, U·哈斯, C·巴赫曼, ∧ 馬爾, H-C 馬勒, 章 申請人:默克專利有限公司