專利名稱：持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和生物工程技術(shù)。特別是獲得經(jīng)藻酸鹽包裹編碼vasostatin和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1/-2因子的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成微囊化物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。
血管生成(angiogenesis)是指從已存在的血管系統(tǒng)生成新的血管的過(guò)程。血管生成是正常組織生長(zhǎng)與發(fā)育所必需的過(guò)程，而在成年人中，除了女性的生殖系統(tǒng)及機(jī)體的修復(fù)過(guò)程(如傷口愈合)有血管生成外，其它組織則少見(jiàn)，且其過(guò)程一般較短暫并受機(jī)體嚴(yán)格調(diào)控。與之相反，在某些病理性疾病中，如腫瘤、Kaposi肉瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增生性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、硬皮病等，常發(fā)生無(wú)控制的血管發(fā)生。受機(jī)體嚴(yán)格調(diào)控的及不受嚴(yán)格調(diào)控的血管生成是以相似的方式進(jìn)行的。毛細(xì)血管是由基底膜包裹內(nèi)皮細(xì)胞和外膜細(xì)胞形成的。當(dāng)血管生成開(kāi)始時(shí)，由內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞釋放的金屬蛋白水解酶逐步侵蝕基底膜，然后位于血管腔內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞伸出基底膜。在血管生長(zhǎng)因子的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)受侵蝕的基底膜遷移。遷移的內(nèi)皮細(xì)胞從母血管分岔形成“新芽”，內(nèi)皮細(xì)胞在這里開(kāi)始有絲分裂和增殖。內(nèi)皮細(xì)胞新芽彼此合并形成毛細(xì)環(huán)，從而產(chǎn)生新的血管。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)雖然血管生成抑制劑(如血管抑素、內(nèi)皮抑素)的重組蛋白能抑制腫瘤生長(zhǎng)(見(jiàn)O’Reilly MS，Holmgren L，Shing Y，Chen C，Rosenthal RA，Moses M，Lane WS，Cao Y，Sage EH，F(xiàn)olkman J.An-giostatinA novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metas-tases by a Lewis Lung Carcinoma.Cell，1994，79315-328以及O’Reilly MS，Boehm T，Shing Y，F(xiàn)ukai N，Vasios G，Lane WS，F(xiàn)lynn E，Birkhead JR，Olsen BR，F(xiàn)olkman J.EndostatinAn endogenous inhibitor of angiogenesis andtumor growth.Cell，1997，88277-285)，但它們的臨床應(yīng)用卻受到許多限制，如用血管抑素治療小鼠腫瘤時(shí)，在兩周的皮下注射治療中，小鼠每20克體重，治療第一天需要給24微克重組蛋白，此后每天需要給12微克的藥，才能達(dá)到抑制腫瘤的作用；用內(nèi)皮抑素治療時(shí)，每公斤體重小鼠每天需要高達(dá)10-20毫克的重組蛋白才能在15天的治療中起作用。因此，重組蛋白治療需要長(zhǎng)期反復(fù)給藥、所需劑量大又無(wú)疑會(huì)增加成本、純化過(guò)程復(fù)雜使生產(chǎn)具有一定困難、大劑量應(yīng)用給病人帶來(lái)高額費(fèi)用等。因此，有必要尋找一種新的方法來(lái)長(zhǎng)期釋放血管生成抑制因子、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合促血管形成因子的可溶性受體、或促血管形成因子的下調(diào)因子，達(dá)到有效治療腫瘤的目的。
本發(fā)明正是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和生物工程技術(shù)，經(jīng)制備獲得經(jīng)藻酸鹽微囊化的兩種抗新生血管形成因子的微囊物質(zhì)，將其移植入機(jī)體后，能長(zhǎng)期釋放這兩種抑制劑，持續(xù)產(chǎn)生相應(yīng)蛋白，直接抑制新生血管形成?？朔送庠葱缘鞍字委煏r(shí)存在的使用劑量大、作用時(shí)間不持久、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。
本發(fā)明根據(jù)Vasostatin是內(nèi)源性血管生成抑制劑，可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1(sFLT-1)是目前僅知的內(nèi)源性表達(dá)的VEGF抑制劑，對(duì)治療腫瘤具有一定的價(jià)值。發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容用藻酸鹽包裹編碼人vasostatin和人sFLT-1基因的載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞形成藻酸鹽圓珠，載體為真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pSecTag2B，并分別能表達(dá)人sFLT-1和人vasostatin蛋白，形成的圓珠直徑約300-500μm，每ml藻酸鹽中含2×105-2×107細(xì)胞。人vasostatin來(lái)源于人鈣網(wǎng)蛋白N端1-180位氨基酸，蛋白大小約為21千道爾頓(kDa)；人sFLT-1來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞因子受體-1的胞外段1-6個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，蛋白大小約為110千道爾頓(kDa)。
本發(fā)明的制備方法如下利用骨骼肌cDNA文庫(kù)和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別合成人vasostatin cDNA片段和人sFLT-1 cDNA片段后，構(gòu)建入過(guò)渡質(zhì)粒pU C18和PCR2.1-TOPO TA中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列，再分別構(gòu)建入哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)載體pSecTag2B和pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或A549細(xì)胞后，檢測(cè)蛋白表達(dá)和活性，用藻酸鹽包裹。其流程見(jiàn)

圖1。
本發(fā)明所制備的持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)的應(yīng)用，是將其作為長(zhǎng)期釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞抑增生制劑，直接用于抑制新生血管中的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，當(dāng)4粒這種微囊物質(zhì)被移植入機(jī)體皮下后，6周內(nèi)能釋放人vasostatin和人sFLT-1因子，產(chǎn)生相應(yīng)蛋白，直接抑制新生血管形成，其作用時(shí)間持久、使用劑量低，成本低，從而克服外源性蛋白治療時(shí)存在的使用劑量大、作用時(shí)間不持久、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。用于預(yù)防和治療多種與血管生成相關(guān)的疾病，如Kaposi肉瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增生性視網(wǎng)膜病以及能抑制多種腫瘤(尤其是實(shí)體瘤)的生長(zhǎng)、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)經(jīng)制備獲得經(jīng)藻酸鹽微囊化的兩種抗新生血管形成制劑的微囊物質(zhì)，將其移植入機(jī)體后，能長(zhǎng)期釋放人vasostatin和人sFLT-1基因，持續(xù)產(chǎn)生相應(yīng)蛋白，直接抑制新生血管形成，可應(yīng)用于多種與血管生成相關(guān)的疾病的治療；可用于抑制多種腫瘤(尤其是實(shí)體瘤)的生長(zhǎng)、發(fā)展和轉(zhuǎn)移?？朔送庠葱缘鞍字委煏r(shí)存在的需要長(zhǎng)期反復(fù)給藥、所需使用劑量大，增加高額治療成本，以及純化過(guò)程復(fù)雜使生產(chǎn)具有一定困難、增加病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的缺點(diǎn)。
以下是本發(fā)明說(shuō)明書(shū)附圖的圖面說(shuō)明圖1是本發(fā)明顯示持續(xù)釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞增生抑制劑人vasostatin和人可溶性VEGF受體-1的微囊化流程。
圖2是本發(fā)明PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析后的照片，顯示獲得人va-sostatin基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析的結(jié)果。
圖中序號(hào)說(shuō)明MDNA的分子量標(biāo)準(zhǔn)。1模板來(lái)自人骨骼肌的cDNA文庫(kù)。vaso合成的人vasostatin基因的位置。
圖3是本發(fā)明人vasostatin的基因序列和相應(yīng)蛋白的氨基酸序列。
圖4是本發(fā)明人sFLT-1的基因序列和相應(yīng)蛋白的氨基酸序列。
圖5是本發(fā)明顯示用Western Blot檢測(cè)的重組質(zhì)粒p2B-vaso在真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞293細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。
圖中序號(hào)說(shuō)明e-p轉(zhuǎn)染空載體pSecTag2B的上清。vaso轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p2B-vaso載體的上清。saline轉(zhuǎn)染生理鹽水的上清圖6是本發(fā)明顯示用Western Blot檢測(cè)的重組質(zhì)粒pc3.1-sflt在真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞293細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。
圖中序號(hào)說(shuō)明E-p轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的上清。sFLT-1轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pc3.1-sflt載體的上清。saline轉(zhuǎn)染生理鹽水的上清。
圖7是本發(fā)明A，B，C，顯示藻酸鹽珠植入小鼠治療腫瘤中，治療組與對(duì)照組的腫瘤體積與時(shí)間的關(guān)系。橫坐標(biāo)表示治療時(shí)間(天數(shù))，縱坐標(biāo)表示腫瘤的體積(mm3)。D，E，F(xiàn)顯示治療組與對(duì)照組小鼠的生存曲線比較。橫坐標(biāo)表示治療時(shí)間(天數(shù))，縱坐標(biāo)表示生存率(％)。(A，D)Meth A纖維肉瘤細(xì)胞(B，E)LL/2Lewis肺癌細(xì)胞(C，F(xiàn))MMT乳腺癌細(xì)胞其中，●表示治療組，■表示空載體組，△表示生理鹽水組。
本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例和說(shuō)明附圖作進(jìn)一步詳述實(shí)施例1來(lái)源于人vasostatin基因的獲得在圖3中顯示了編碼人vaso-statin的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白的氨基酸序列。選擇人骨骼肌的cDNA文庫(kù)作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物，上游引物為5’-ATCGAATTCATGGAGCCCGCCGTCTA-3’，下游引物為5’-CAAAGCTTCTATTCCAAGGAGCCGGAC-3’。利用PCR合成人的vasostatin cDNA片段，得到片段的大小與預(yù)計(jì)的相同，約540bp，見(jiàn)圖2?；厥誔CR產(chǎn)物片段后，插入載體pUC18(購(gòu)自Invitrogen公司)，得到重組質(zhì)粒pUC18-vaso，通過(guò)Perkin-Elmer公司的DNA測(cè)序儀對(duì)其測(cè)序，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的序列與人vasostatin基因序列一致，見(jiàn)圖3，證明得到了來(lái)源于人的vasostatin基因。
實(shí)施例2.來(lái)源于人sFLT-1基因的獲得在圖4中顯示了編碼人sFLT-1的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白的氨基酸序列。選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物，上游引物為5’-GCTCACCATGGTCAGCTA-3’，下游引物為5’-CTGCTATCATCTCC-GAACTC-3’，利用PCR合成人的sFLT-1 cDNA片段，合成條件為；94℃變性1分鐘后，以94℃ 45秒、58℃ 2分鐘、72℃ 4分鐘作30循環(huán)，得到片段的大小與預(yù)計(jì)的相同約為2.2Kb。回收PCR產(chǎn)物片段后，插入載體PCR2.1-TOPO TA(購(gòu)自Invitrogen公司)，得到重組質(zhì)粒p2.1-sflt，通過(guò)Perkin-Elmer公司的DNA測(cè)序儀對(duì)其測(cè)序，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的序列與人sFLT-1基因序列一致(圖4)，證明得到了來(lái)源于人的sFLT-1基因。
實(shí)施例3人vasostatin和人sFLT-1的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)使用pSecTag 2B(購(gòu)自Invitrogen公司)作為表達(dá)載體，它具有真核基因表達(dá)調(diào)控序列CMV啟動(dòng)子、鼠的Igκ信號(hào)肽序列、牛生長(zhǎng)因子加尾信號(hào)，使目的基因能在真核細(xì)胞中分泌表達(dá)。將編碼人vasostatin的基因片段克隆到pSecTag2B的雙酶(EcoR I/Hind III)位點(diǎn)中，得到重組質(zhì)粒p2B-vaso，反應(yīng)條件為酶切反應(yīng)體積均為20μl，DNA與限制性內(nèi)切酶的比例為1μg∶5單位，反應(yīng)時(shí)間為1-2小時(shí)不等，連接反應(yīng)的目的基因Vaso-cDNA與質(zhì)粒載體DNA的比例為4∶1，連接反應(yīng)均在16℃水浴中進(jìn)行，連接時(shí)間為過(guò)夜。使用pcDNA3.1(購(gòu)自Invitrogen公司)作為表達(dá)載體，將編碼人sFLT-1的基因片段克隆到pcD-NA3.1(+)的EcoRI位點(diǎn)中，反應(yīng)條件條件同上，得到重組質(zhì)粒pc3.1-sflt。
實(shí)施例4.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞通過(guò)脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒p2B-vaso、pc3.1-sflt導(dǎo)入真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞——293或A549細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)液。具體步驟如下(以p2B-vaso為例，pc3.1-sflt的方法相似)1)將2×105-2×107的293胞接種于六孔板培養(yǎng)皿中。
2)在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)，使細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿表面積的60％。
3)在無(wú)菌玻璃試管中配制下列溶液溶液A(μl)試劑 重組質(zhì)粒 空載體 對(duì)照p2B-vaso 4μg - -pSecTag2B-4μg-培養(yǎng)基(μl) 96 96 100合計(jì)(μl)100 100 100
溶液B(μl)將4μl Lipofectin-Reagent加入96μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻、室溫放置30-40分鐘。
4)將A液、B液輕輕混勻，室溫放置15分鐘。
5)用無(wú)血清培養(yǎng)液2ml洗滌細(xì)胞一次。
6)在A、B混合液中加入0.8ml無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液，混勻后小心滴加至細(xì)胞上。
7)37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。
8)棄去轉(zhuǎn)染液，加2ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并收集細(xì)胞上清液。
實(shí)施例5.藻酸鈉包裹上述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，獲得藻酸鈉珠。具體操作如下1)在37℃、無(wú)菌操作下，將被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞按2×105-2×107細(xì)胞/ml藻酸鈉的比例懸浮在1.5％藻酸鈉中，并將混合液加入0.25M CaCl2液體中，形成300-500μl大小的園珠。
2)生理鹽水洗上述園珠3次。
3)用生理鹽水4℃懸浮園珠備用。
實(shí)施例6.免疫印跡法即Western Blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)將細(xì)胞培養(yǎng)液作十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳，以購(gòu)自Santa Cruz Biotechnique公司的羊抗鈣網(wǎng)蛋白N端抗體和購(gòu)自Sigma Chemical Co.的抗FLT-1單克隆抗體分別作1∶200稀釋后作為一抗并4℃過(guò)夜，以生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG和羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。
實(shí)施例7.人vasostatin和人sFLT-1抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生將細(xì)胞培養(yǎng)液作內(nèi)皮細(xì)胞增生抑制實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下1)取1×103HUVEC細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，以培養(yǎng)液作對(duì)照，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。
2)棄細(xì)胞上清，每孔加入40μl脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞或A549細(xì)胞上清液，20分鐘后加入60μl全培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)。
3)用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞后計(jì)數(shù)細(xì)胞。
4)使用下列公式計(jì)算血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制率 結(jié)果表明只有人vasostatin基因和人sFLT-1轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞上清液有vasostatin和sFLT-1蛋白的表達(dá)，而且所表達(dá)的vasostatin具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生的生物學(xué)活性，細(xì)胞抑制率大于70％，而對(duì)照組和生理鹽水組的細(xì)胞抑制率均小于5％。
實(shí)施例8.應(yīng)用——人vasostatin和人sFLT-1抑制小鼠實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)將6-8周齡的雌雄各半的Balb/c小鼠分為三組治療組、生理鹽水組、對(duì)照組，且每組10只。在小鼠的背部皮下分別接種1×106個(gè)纖維肉瘤Meth A細(xì)胞，6天后當(dāng)腫瘤大小為100-200mm3時(shí)，每只小鼠皮下植入藻酸鈉珠4粒治療組植入的藻酸鈉珠含重組質(zhì)粒，對(duì)照組植入的藻酸鈉珠含空質(zhì)粒，生理鹽水組植入的藻酸鈉珠含生理鹽水。每4天觀察一次，共4周。觀察小鼠生存情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的大小。用同樣的方法對(duì)小鼠分別進(jìn)行Lewis肺癌LL/2細(xì)胞和乳腺癌MMT細(xì)胞的荷瘤及藻酸鹽治療、觀察。將小鼠的腫瘤體積對(duì)時(shí)間作曲線，結(jié)果見(jiàn)圖7(A，B，C)。小鼠的生存曲線見(jiàn)圖7(D，E，F(xiàn))?？梢钥闯?，荷瘤小鼠經(jīng)人vasostatin和人sFLT-1的藻酸鹽微囊化進(jìn)行細(xì)胞移植治療后，小鼠的腫瘤生長(zhǎng)得到控制，荷瘤小鼠的生存期延長(zhǎng)。小鼠腫瘤大小和生存期與對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.01)。
權(quán)利要求
1.一種持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)，其特征在于用藻酸鹽包裹編碼人vasostatin和人sFLT-1基因的載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞形成藻酸鹽圓珠，載體為真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pSecTag2B，并分別能表達(dá)人sFLT-1和人vasostatin蛋白，形成的圓珠直徑300-500μm，每ml藻酸鹽中含2×105-2×107細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)，其特征在于所說(shuō)的人vasostatin來(lái)源于人鈣網(wǎng)蛋白N端1-180位氨基酸，蛋白大小為21千道爾頓(kDa)；人sFLT-1來(lái)源于人血管內(nèi)皮細(xì)胞因子受體-1的胞外段第1-6個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，蛋白大小為110千道爾頓(kDa)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)，其特征在于所說(shuō)的藻酸鹽可以是藻酸鈉。
4.制備權(quán)利要求1、2和3持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)的方法，其特征在于4.1人vasostatin基因片段的獲得選擇人骨骼肌的cDNA文庫(kù)作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物，上游引物為5’-ATC-GAATTCATGGAGCCCGCCGTCTA-3’，下游引物為5’-CAAAGCTTC-TATTCCAAGGAGCCGGAC-3’，利用PCR合成人的vasostatin cDNA片段，回收PCR產(chǎn)物片段后，插入載體pUC18，得到重組質(zhì)粒pUC18-vaso；4.2人sFLT-1基因片段的獲得選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物，上游引物為5’-GCTCAC-CATGGTCAGCTA-3’，下游引物為5’-CTGCTATCATCTCCGAACTC-3’，利用PCR合成人的sFLT-1cDNA片段，并插入載體PCR2.1-TOPO TA，得到重組質(zhì)粒p2.1-sflt；4.3人vasostatin和人sFLT-1的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)使用pSecTag2B、pcDNA3.1(+)作為表達(dá)載體，使目的基因能在真核細(xì)胞中分泌表達(dá)；將編碼人vasostatin的基因片段克隆到pSecTag2B的雙酶EcoRI/HindIII位點(diǎn)中，得到重組質(zhì)粒p2B-vaso；將編碼人sFLT-1的基因片段克隆到pcD-NA3.1(+)載體中，得到重組質(zhì)粒pc3.1-sflt；通過(guò)脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒p2B-vaso、pc3.1-sflt導(dǎo)入真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞293或A549肺癌細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液并收集上清，直到6周；將細(xì)胞上清液作十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳，以羊抗鈣網(wǎng)蛋白N端抗體和抗FLT-1單克隆抗體作為一抗，用免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況；4.4人vasostatin和人sFLT-1抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生將被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞上清液滴加在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上后，內(nèi)皮細(xì)胞增生受到抑制；4.5藻酸鹽包裹上述被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞，獲得藻酸鹽珠即微囊物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3和4所制備的持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于用于長(zhǎng)期釋放血管增生抑制劑，直接用于抑制新生血管中的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，特別是抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。
全文摘要
本發(fā)明提供一種經(jīng)藻酸鹽包裹編碼vasostatin和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體－1/－2基因的遺傳工程細(xì)胞形成微囊化物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。所制備的微囊物質(zhì)皮下植入體內(nèi)后能持續(xù)釋放這兩種因子而發(fā)揮抑制新生血管形成的作用?？捎糜谥委煻喾N與血管生成相關(guān)的疾病和多種腫瘤(尤其是實(shí)體瘤)。克服了外源性蛋白治療時(shí)存在的需要長(zhǎng)期反復(fù)給藥、所需使用劑量大、治療成本高、增加病人費(fèi)用以及純化過(guò)程復(fù)雜使生產(chǎn)具有一定困難的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1431017SQ0213354
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2002年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月30日
發(fā)明者魏于全, 肖飛, 趙霞, 楊莉 申請(qǐng)人:四川大學(xué)