專利名稱：新的臨床療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及N-乙酰-L-半胱氨酸或其二聚體形式的用途，用于臨床治療哺乳動物上皮來源的瘤形成細胞。
腫瘤或贅生物包含新生組織，其中的細胞增殖失控并且是進行性的。并非所有的異常生長類型都是惡性的；非惡性即認為是良性腫瘤。與惡性生長相反，良性腫瘤由有序生長的細胞組成，往往與其正常對應(yīng)物相同或非常相近。
但是，癌癥的特征在于增殖失控，以及受侵襲的細胞生長紊亂。根據(jù)顯微鏡觀察，伴隨其無限制生長的能力，癌細胞及其組成的組織喪失正常形態(tài)，并呈現(xiàn)功能異常。癌細胞是侵襲性的，侵襲周圍組織，波及遠處部位，最后殺死宿主。1994年，癌癥導(dǎo)致美國全部死亡的近四分之一。
腫瘤，不論惡性或良性，都是基于其組成細胞的結(jié)構(gòu)和功能特性及其生物學(xué)行為。惡性腫瘤的細胞和組織與其起源的組織不同。它們生長更為迅速，并呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的變化。惡性腫瘤細胞的特性適于加強和支持其增殖，并擴張到全身組織和器官。相反，良性腫瘤的細胞和組織傾向于生長較為緩慢，一般非常類似于其起源的正常組織。如果良性腫瘤細胞的結(jié)構(gòu)與功能與正常細胞在形態(tài)和功能上難以區(qū)別，那么生長為腫瘤團是表現(xiàn)其致瘤本質(zhì)的唯一特征。
本領(lǐng)域公認，可以描述連續(xù)增殖細胞的生長和復(fù)制周期開始于一個新的小細胞，它經(jīng)過第一個生長期(G1)。G1期之后是DNA合成期，每個染色體獲得一份拷貝(S期)。然后繼之以第二個生長期，合成所有蛋白質(zhì)、膜、細胞器等的拷貝，這是為了從母細胞獲得兩個細胞所必需的(G2期)。在G2期，細胞的大小增加。有絲分裂期(M期)完成實際的細胞分裂，得到兩個新細胞，細胞周期再次開始。
化療能夠治愈某些形式的癌癥，已經(jīng)使用了在有絲分裂期間(即G2期之后)干擾細胞周期的化療劑。這種外源性物質(zhì)干擾細胞骨架蛋白質(zhì)(例如微管蛋白纖維)的聚集和解聚動力學(xué)。這種物質(zhì)以長春花生物堿(例如紫杉醇)為例。
然而，大多數(shù)癌癥藥物的使用受到限制。難題之一在于，任一時刻只有某一比例的細胞在分裂，而大多數(shù)癌癥藥物只能破壞進行分裂的那部分細胞群體。另一難題在于，除了損害癌細胞，癌癥藥物也損害正常細胞和組織。為了克服這些困難，在各種治療程序中，同時或依次使用以不同方式作用于細胞的化療劑組合。
已經(jīng)假定細胞總的氧化還原狀態(tài)與增殖調(diào)節(jié)有關(guān)。據(jù)若干觀察報道，如果轉(zhuǎn)為氧化，則誘導(dǎo)細胞增殖，如果補充還原劑，則細胞傾向于分化。處于各種來源氧化應(yīng)激(即UV輻射、電離輻射和化學(xué)劑)之下的細胞，常常表現(xiàn)出增殖反應(yīng)。自由基和過氧化氫殘基產(chǎn)生氧化應(yīng)激，在大多數(shù)情況下，利用抗氧化劑和自由基清除劑進行預(yù)處理，可以減低或完全消除增殖反應(yīng)。
N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是包含巰基的化合物，可以防止或減低氧化作用。它因而具有若干藥學(xué)和實驗用途。盡管未經(jīng)最后證明，其特性與巰基殘基(-SH)相當有關(guān)。由于其抗氧化劑特性，也有報道NAC對抗炎癥的副產(chǎn)物-自由基的作用，而用作抗炎藥物。
WO 97/29759將NAC用于阿霉素的藥物組合物中，以抑制癌瘤形成。在這種情況下，NAC的抗氧化劑活性抵消了阿霉素的心臟毒性。
在細胞增殖(Cell Proliferation)(1998)，31(5/6)，217-229中，評價了表現(xiàn)抗氧化劑特性的含巰基化合物，用于細胞保護和化學(xué)預(yù)防。將N-乙酰-L-半胱氨酸(L-NAC)及其非代謝的活性立體異構(gòu)體N-乙酰-D-半胱氨酸(D-NAC)與藥物巰甲丙脯酸和二硫赤蘚糖醇(DTT)一起進行研究，評價其對細胞周期進展的影響。拓撲異構(gòu)酶IIa的活性下降與G2期積聚的細胞相對數(shù)目增加6倍有關(guān)。
NAC的其它藥學(xué)和臨床用途包括常見的粘液溶解作用，以及治療經(jīng)撲熱息痛和相關(guān)化合物治療之后的暴發(fā)性肝衰竭。臨床使用時，即使大劑量NAC，例如10g/天，未產(chǎn)生明顯副作用。這與其它有害的含巰基化合物(例如巰基乙醇和二硫蘇糖醇)相反。此外，NAC的清除相對迅速。
由于N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)具有體外對抗骨髓瘤型腫瘤細胞的抗癌活性，JP08040888將其用作抗癌劑，治療骨髓瘤型腫瘤，獲得了腫瘤增殖抑制活性。
與骨髓瘤型腫瘤相反，上皮來源的大多數(shù)實體組織的細胞生長和細胞更新可以描述為，一個干細胞復(fù)制成一個末期細胞和一個具有持續(xù)生長潛能的細胞。該末期細胞然后進入分化途徑，執(zhí)行各種組織功能，其壽命有限。
進入分化途徑的細胞表現(xiàn)出細胞-細胞接觸顯著增強，該過程通常也表示為接觸抑制。若干證據(jù)表明，細胞進入分化終點的信號來自細胞-細胞接觸的自身成分。細胞-細胞粘附也負責(zé)在細胞之間傳播信號。
可以認為癌細胞是喪失接觸抑制并連續(xù)增殖的分化細胞。因此，癌細胞喪失了響應(yīng)分化信號的能力。在這點上，癌細胞是永生的，而不具有分化細胞的有限壽命。
本發(fā)明的目的在于制備藥物，用作上皮組織分化功能失常相關(guān)疾病的治療劑。
為達此目的，已經(jīng)賦予了本發(fā)明方法如權(quán)利要求1所述的特征。
人們驚奇發(fā)現(xiàn)，N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)及其二硫化物二聚體N，N’-二乙酰-L-胱氨酸(di-NAC)是回復(fù)性物質(zhì)，可使上皮來源的瘤形成細胞的異常增殖回復(fù)到正常途徑，包括阻斷增殖、分化以及有限的細胞壽命，而沒有毒性作用。N-乙酰-L-半胱氨酸的其它二聚體形式以及類似結(jié)構(gòu)，例如4，4’-(異亞丙基-二硫)雙[2，6-二-叔丁基酚]，也表現(xiàn)出這些作用。
在這方面，瘤形成細胞是指形成贅生物的細胞，即在不會引起或停止正常細胞增殖的條件下進行性增殖的細胞。這種良性或惡性的細胞過度增殖包括組織轉(zhuǎn)化(metaplasia)，即組織中的細胞類型改變?yōu)樵摻M織的非正常形式；退行性變化(anaplasia)，即喪失細胞分化及彼此的定位；進行性分化(prosoplasia)，即組織分化異常；以及退行性化生(retroplasia)，即組織或細胞退化為更原始的類型。
NAC或di-NAC的回復(fù)作用涉及細胞的常規(guī)分化，公認的形態(tài)不均一性分化發(fā)生于細胞周期G1-G0期之后，而非G2期。
根據(jù)本發(fā)明，當一個細胞進行分化-而不再進一步分裂時，通過使用N-乙酰-L-半胱氨酸或其二聚體形式，該細胞顯示其最終的正常形態(tài)。上皮來源的細胞和組織的腫瘤性增殖行為，在新DNA合成之前，即S期之前開始回復(fù)。然后細胞從G1期進入G0期(零生長)，從此開始分化期(D期)。該期合成并組裝表征組織中最終分化及功能性活性細胞所需的全部成分，形成適當?shù)男螒B(tài)。
本發(fā)明利用NAC或di-NAC處理瘤形成細胞，增加了細胞-細胞粘附結(jié)構(gòu)，獲得了良好分化細胞典型的、每種細胞類型各不相同的若干其它結(jié)構(gòu)和功能(如下實施例所述)，以及停止了增殖，證明其分化正常。其它的生物化學(xué)分化標志為早期轉(zhuǎn)錄因子。
例如，如果用高濃度NAC或di-NAC處理腫瘤，獲得的細胞-細胞粘附包含位于相鄰細胞之間或者細胞和基底的細胞外基質(zhì)之間的若干粘附結(jié)構(gòu)。顯微鏡下所見為緊密連接和粘附連接、以及橋粒和間隙連接，每個由蛋白質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)組成，通常由重復(fù)亞基組成。這些接觸橫跨細胞膜，具有細胞外、跨膜和細胞質(zhì)位點。這些多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的細胞質(zhì)位點依次連接細胞骨架蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，而細胞外位點與鄰近細胞或基底的細胞外基質(zhì)相連。
例如，利用NAC或di-NAC處理原發(fā)的正常人表皮角質(zhì)細胞(NHEK)以及人結(jié)腸癌細胞系(CaCo2)，兩種細胞類型均在3天內(nèi)分化。這些細胞在局部濃度大約1mM獲得最大增殖抑制(表明不生長)。較低劑量也具有抗增殖作用，但并非如此之大。由于NAC和di-NAC的抗氧化劑特性，極低劑量具有輕微的增殖作用。因此，根據(jù)本發(fā)明，獲得高于最大增殖抑制(即絕對不生長)所需濃度的有效量的N-乙酰-L-半胱氨酸或其二聚體形式，使上皮來源的哺乳動物瘤形成細胞回復(fù)到正常分化，從而使該異常增殖的細胞回復(fù)到正常途徑。所以，抑制增殖并不意味著回復(fù)為本來的瘤形成細胞，而只是伴隨分化。
在這些較高劑量的NAC和di-NAC下，大多數(shù)細胞骨架蛋白質(zhì)發(fā)生破壞。NAC和di-NAC也防止破壞的細胞骨架自然恢復(fù)。細胞骨架段裂時，獲得更強的細胞-細胞接觸以及更多的細胞-細胞連接，即，細胞連接之間的相互作用強度增加，這種連接的數(shù)目增多。這可能由于細胞-細胞連接與細胞骨架網(wǎng)絡(luò)相連，可使該連接保持供細胞增殖的正確距離。一旦足夠濃度的NAC或di-NAC破壞了該網(wǎng)絡(luò)，連接將會瓦解，得到更為緊密的細胞-細胞接觸。這種所謂的接觸抑制導(dǎo)致增殖停止，并意外地開始分化，就腫瘤細胞來說，即為腫瘤回復(fù)。因此，通過增加細胞-細胞接觸，獲得對這些細胞的生長控制，誘導(dǎo)功能失調(diào)的上皮來源的哺乳動物細胞回復(fù)到正常分化。
因此，本發(fā)明提出NAC或di-NAC的用途，用于分別在高或低的濃度下，通過抑制或穩(wěn)定相應(yīng)疾病，臨床治療上皮來源的瘤形成細胞。本發(fā)明使用的瘤形成細胞的類型不受限制，可以是退行性變化細胞、組織轉(zhuǎn)化細胞、進行性分化細胞或退行性化生細胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的用途包含抗癌治療，其中上皮來源腫瘤的增殖(包括良性和惡性過度增殖)回復(fù)到分化途徑。NAC或di-NAC可以迫使良性腫瘤細胞回到正常分化，以表皮腫瘤細胞和類風(fēng)濕細胞為例。惡性腫瘤可以是肺癌、乳腺癌、前列腺癌或人結(jié)腸癌。根據(jù)本發(fā)明，可以回復(fù)到正常途徑的惡性細胞和腫瘤，其更全面的非限制性名單包括CNE2人上皮腫瘤細胞系、A431細胞系、66-kDa Shc食管癌細胞系、HepG2人腫瘤細胞系、包含人乳頭瘤病毒16型的癌細胞系、Merkel細胞癌細胞系、頭頸癌細胞系、食管癌細胞系、以及膠質(zhì)母細胞瘤細胞、視網(wǎng)膜母細胞瘤、人視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞、肝細胞癌細胞、SH-SY5Y細胞、Ehrlich腹水腫瘤細胞、肝上皮腫瘤細胞、胸腺樣分化的紡錘形上皮腫瘤(SETTLE)、絨毛膜上皮細胞間皮瘤、上皮細胞卵巢癌、外陰上皮內(nèi)瘤形成、人腸系膜動脈瘤形成、間皮瘤形成、上皮內(nèi)瘤形成、非小細胞肺癌、管囊腫明細胞腺癌、結(jié)腸腺癌細胞、肝色素沉著細胞腺瘤、非鱗狀散在腺瘤、Barrett’s食管及相關(guān)腺癌、直腸陰道隔腺癌、前列腺癌、胰腺癌、垂體嗜酸性干細胞腺瘤、唾液腺樣囊性癌、膽囊內(nèi)分泌腺細胞癌、胰腺巨囊漿液性囊腺瘤、腺鱗癌或柱狀細胞瘤形成、鱗狀細胞癌、子宮頸鱗狀細胞癌、神經(jīng)母細胞瘤、播散性掌跖汗孔角化病損傷所致鱗狀細胞癌、子宮頸鱗狀細胞癌、胰腺實體假乳頭瘤、有或無桿狀特征的腎細胞癌、肝細胞癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、小細胞癌、小細胞肺癌、小細胞乳腺癌、乳腺癌、乳腺導(dǎo)管癌、指環(huán)狀細胞小葉癌、粘液癌、基底細胞癌細胞、甲狀腺退行發(fā)育癌、Waldeyer’s環(huán)狀區(qū)域癌、肝細胞-膽管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤和星形細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、粘液乳頭室管膜細胞瘤、胰腺癌細胞、人前列腺癌細胞、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌細胞、腎癌細胞、非黑色素瘤皮膚癌、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白質(zhì)和皮膚癌、人喉部乳頭瘤細胞、口腔腺泡細胞癌、甲狀腺Hurthle細胞瘤、卵巢癌、膀胱細胞癌、結(jié)腸直腸癌、腸嗜鉻樣細胞、人星形細胞瘤細胞、人腎明細胞癌、轉(zhuǎn)移性腎細胞癌、舌癌、頭頸腺病、胰腺大腺泡細胞癌、門膽管癌、乳頭狀甲狀腺癌、dent、人前列腺癌細胞、明細胞″糖″瘤、鐮狀韌帶/圓韌帶肌黑素細胞瘤(血管周上皮狀明細胞家族成員)以及輸尿管移行細胞癌。
此外，NAC或di-NAC可以有效治療角化癥皮膚，例如銀屑病和棘細胞層水腫性皮炎。同樣，NAC或di-NAC可以糾正表皮向性，重建與血管損傷一起形成的糖尿病損害的內(nèi)皮細胞。
已經(jīng)表明，di-NAC抑制WHHL兔子的動脈硬化。同樣，在中度及顯著的小動脈性腎硬化(40％)的腎中，腎上皮細胞瘤較之沒有或最輕微的小動脈性腎硬化(8％)的腎更為常見(Budin RE，McDonnell PJ.Arch Pathol Lab Med 1984 Feb；108(2)138-40)。在高于或低于60歲的患者中均發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)系。腎上皮細胞瘤的形成與腎瘢痕有關(guān)；并非獨立的年齡相關(guān)現(xiàn)象。
50％的動脈硬化細胞回復(fù)到正常途徑，應(yīng)該與細胞角蛋白(cytokeratin)表達有關(guān)。據(jù)認為，細胞角蛋白(CK)的表達是上皮細胞分化狀態(tài)的標志。CK也存在于某些血管平滑肌細胞(VSMC)中，這意味著與較少分化的表型有關(guān)。在處于應(yīng)激、有絲分裂或凋亡的上皮細胞中，顯示存在CK的翻譯后修飾。
最近研究了人VSMC的CK磷酸化模式(Bar H，Bea F，BlessingE，Watson L，Wende P，Kreuzer J，Kubler W，Jahn L.，BasicRes Cardiol 2001 Feb；96(1)50-8)。
利用細胞角蛋白8和18特定細胞角蛋白磷酸化位點的特異性抗體，通過免疫熒光顯微術(shù)，以Ki-67抗原為增殖標志并利用切口末端標記(TUNEL)檢測凋亡，評價正常外周和冠狀動脈、動脈硬化損傷和臍帶血管的組織樣品。所有樣品均包含細胞角蛋白陽性的VSMC，但其磷酸化模式各不相同。在冠狀動脈損害的絕大多數(shù)表達CK的VSMC中，細胞角蛋白8的C端絲氨酸431(CK8Ser-431)磷酸化。這些細胞只有一部分顯示CK18Ser-33的磷酸化，或者CK8Ser-73的磷酸化程度甚至更低。
DNA段裂主要發(fā)生于包含CK8Ser-431磷酸化結(jié)構(gòu)域細胞的樣品中。相反，閉塞的外周損害顯示很少或沒有磷酸化。臍帶血管中新生的VSMC包含大量的磷酸化CK結(jié)構(gòu)域，再次以CX8Ser-431為主，但也有CK18Ser-33。此外，發(fā)現(xiàn)只有單個細胞增殖或包含DNA段裂。因此，在動脈硬化損傷的VSMC中，CK的大量磷酸化提示對細胞應(yīng)激的特異性功能性反應(yīng)，并可能與凋亡有關(guān)。
根據(jù)定義，所有的化療劑必定是抗增殖的。因此，根據(jù)本發(fā)明，為獲得NAC或di-NAC的回復(fù)作用所需劑量高于僅僅抑制增殖所需的劑量。與報道的毒性強、副作用大的所有其它化學(xué)治療劑相反，NAC可以在相應(yīng)疾病的嚴重期和進行期，根據(jù)治療的細胞類型，按局部濃度0.1-50mM用于治療瘤形成細胞。
優(yōu)選濃度0.2-40mM的NAC沒有毒性作用。例如，為了解救撲熱息痛中毒后的自殺，15分鐘內(nèi)靜脈內(nèi)注射10克劑量的NAC，隨后的30分鐘內(nèi)注射一半劑量，根本沒有報道任何副作用。
當然，完全阻斷增殖所需的NAC或di-NAC的絕對最高或最低劑量，取決于所治療的細胞類型。例如，為促進正常角質(zhì)細胞分化所需最低劑量為0.5mM，而角質(zhì)細胞在1mM完全分化。然而，濃度1mM的NAC或di-NAC誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞回復(fù)，5mM則結(jié)腸癌完全分化。
此外，直接顯現(xiàn)對結(jié)腸癌細胞和正常角質(zhì)細胞獲得的分化作用，也就是說，在僅僅補充一次NAC或di-NAC之后。
可以制備包含有效量NAC或di-NAC以及合適載體的藥物和獸用組合物。該載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。NAC或di-NAC可以直接或以組合物形式給予人或動物受試者。
本發(fā)明的回復(fù)劑可以通過偶聯(lián)靶向分子(例如指向作用部位附近表位的抗體)，而被有意引到特定的作用部位。此外，NAC或di-NAC可以按這種方式結(jié)合指向特異性上皮組織的抗體，以使回復(fù)活性靶向上皮細胞來源的瘤形成細胞，并與其結(jié)合。
可以根據(jù)所治療疾病的類型及其階段，局部及全身性補充NAC或di-NAC，通過口服、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)等給予。例如，對于表皮腫瘤，局部應(yīng)用足以。另一方面，對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，需要關(guān)節(jié)內(nèi)注射。適當?shù)慕o藥途徑也取決于所治療的疾病類型。例如，NAC已經(jīng)有效用于局部治療銀屑病，全身以及局部治療銀屑病關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
NAC或di-NAC的治療可以間隔重復(fù)幾次，該物質(zhì)也可以連續(xù)補充。既然這種治療并不殺死腫瘤細胞，疾病明顯回復(fù)的時間間隔取決于所治療細胞類型的特定壽命。例如對于表皮細胞壽命大約30天的表皮腫瘤，腫瘤塊在該時間之后應(yīng)該呈現(xiàn)明顯減小。本發(fā)明治療銀屑病時，在治療幾天至3-4周以后，癥狀消失，幾個月后可能必須進行重復(fù)治療。
本發(fā)明使用的NAC或di-NAC，不僅通過恢復(fù)細胞-細胞接觸，誘導(dǎo)功能失調(diào)細胞的生長控制，從而引起分化(就腫瘤細胞而言，即腫瘤回復(fù))。在這些濃度下，NAC和di-NAC也顯示較低濃度下獲得的接觸抑制，導(dǎo)致細胞停止增殖。此外，本發(fā)明使用的NAC和di-NAC也具有抗氧化劑作用。
實施例現(xiàn)將參照以下實施例，進一步描述和說明本發(fā)明。然而應(yīng)當指出，這些實施例不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1.NAC和di-NAC對人結(jié)腸癌細胞的作用。
使用建立的人結(jié)腸癌細胞系(CaCo2)。CaCo2是增殖的人結(jié)腸癌細胞系，形態(tài)不規(guī)則，形成缺乏微絨毛結(jié)構(gòu)以及細胞間隙較大的多細胞層。
長期培養(yǎng)大約14天以后，細胞逐漸獲得典型的分化細胞形態(tài)，i)基側(cè)極性增加，ii)在細胞上表面出現(xiàn)凸出的絨毛狀結(jié)構(gòu)(刷狀緣)，iii)細胞上部和基部的肌動蛋白細胞骨架纖維(連接到與相鄰細胞新建立的緊密連接)局部化。
iv)細胞核重定位到基膜附近。
利用2-10mM各種毫摩爾濃度的NAC處理CaCo2細胞。細胞接種后24小時，將NAC加入培養(yǎng)基中。在NAC存在下培養(yǎng)3天后，分析細胞的下列標志參數(shù)-細胞骨架結(jié)構(gòu)觀察到肌動蛋白纖維結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)應(yīng)力纖維。細胞上部的肌動蛋白纖維重定位，維持刷狀緣微絨毛，以及細胞基部的細胞角蛋白纖維重定位。細胞角蛋白纖維也稀疏地出現(xiàn)段裂。
-表面形態(tài)觀察到細胞表面適當數(shù)量的微絨毛狀結(jié)構(gòu)，具有終端分化細胞的形態(tài)。
-細胞-細胞粘附觀察到各種細胞粘附結(jié)構(gòu)的數(shù)目增加。細胞內(nèi)空間也顯著減少。
-微管蛋白表達和聚合NAC處理使微管蛋白的表達出現(xiàn)大大下降。有絲分裂中期的細胞常常缺少有絲分裂紡錘體。
-增殖細胞增殖以劑量依賴方式下降，2mM NAC作用最強。
-毒性細胞生活力不受加入的各種劑量NAC處理的影響。未觀察到凋亡和壞死。
利用di-NAC處理CaCo2細胞，同樣誘導(dǎo)細胞的形態(tài)和生物化學(xué)變化。例如獲得細胞厚度、頂端基側(cè)的極性增加、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達提高、刷狀緣和緊密連接形成，以及增殖降低。di-NAC處理有時比NAC處理更為有效。
總之，利用NAC或di-NAC處理，誘導(dǎo)CaCo2細胞回復(fù)到分化途徑，而沒有任何可檢測的毒副作用。由于分化，CaCo2細胞的增殖也降低了。
實施例2.NAC或di-NAC對人表皮角質(zhì)細胞的作用。
原發(fā)的正常人表皮角質(zhì)細胞(normal human epidermalkeratinocytes，NHEK)得自Clonetics Inc.(San Diego，CA，USA)，在廠商提供的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該細胞的培養(yǎng)壽命有限，大約15天，經(jīng)歷表皮角質(zhì)細胞的正常分化過程，最后去核并脫落。接種后，細胞獲得細胞-細胞粘附的多角形形態(tài)。細胞骨架形態(tài)組織很好，主要位于細胞邊緣。
利用1-10mM各種毫摩爾濃度的NAC或di-NAC處理NHEK細胞。接種后24小時，將這些物質(zhì)加入培養(yǎng)基中。在2mM NAC或di-NAC存在下培養(yǎng)3天后，分析細胞的下列標志參數(shù)-細胞骨架結(jié)構(gòu)觀察到肌動蛋白纖維結(jié)構(gòu)破壞，分散出現(xiàn)于細胞質(zhì)中，并出現(xiàn)若干應(yīng)力纖維。細胞角蛋白纖維顯著段裂。利用電泳也觀察到細胞骨架段裂。處理后得到若干條帶，而未處理的細胞只看見一條寬帶。
-表面形態(tài)細胞表面喪失代表增殖角質(zhì)細胞的細小微絨毛結(jié)構(gòu)而顯得平滑。伴隨初期角化包膜的出現(xiàn)，觀察到很多去核細胞。
-細胞-細胞連接觀察到連接數(shù)增加，細胞內(nèi)空間顯著減少。E-鈣粘蛋白的濃度也增加了。
-微管蛋白表達和聚合該處理似乎降低了微管蛋白的表達。觀察到有絲分裂中期細胞形成有絲分裂紡錘體的百分比略微減少。
-分化通過western印跡確定，角質(zhì)細胞增殖狀態(tài)的標志消失。
-增殖細胞增殖以劑量依賴方式下降，2mM NAC或di-NAC完全抑制細胞增殖。
-毒性細胞生活力不受各種劑量NAC處理(即，直至10mM)的影響。未觀察到凋亡和壞死。
應(yīng)當指出，分離的角質(zhì)細胞是在絕對沒有淋巴細胞的情況下進行NAC處理。
總之，利用NAC或di-NAC處理NHEK細胞，可誘導(dǎo)回復(fù)以及分化加快3-4倍，而沒有毒副作用。誘導(dǎo)的分化還導(dǎo)致NHEK增殖停止。
實施例3.NAC或di-NAC對銀屑病的作用。
銀屑病是慢性皮膚病，以細胞良性過度增殖、產(chǎn)生細胞因子、積聚炎癥細胞、角質(zhì)化異常以及血管化增強而著稱。
利用包含10-20重量百分比的NAC或di-NAC的膏劑，對表現(xiàn)局部銀屑病斑的五位有知識的自愿者進行局部治療。每晚施用膏劑，進行不同時間(幾周-幾個月)，上或不上封閉的繃帶。每日治療之間正常清洗患者的皮膚。不同時使用其它藥物。
治療1-2次以后，已經(jīng)觀察到迅速改善，鱗屑減少，皮膚平滑。延長治療引起所有癥狀完全緩解。根據(jù)個體反應(yīng)以及疾病的嚴重性，完全緩解所需治療時間有所不同。最經(jīng)常報道的副作用與局部連結(jié)有關(guān)，移動封閉的繃帶即可消失。一個病例還報告有膨脹。
治療中止以后，只有一名患者在4個月后出現(xiàn)新的小銀屑病斑，進一步治療幾天后消失。
因此，消除了銀屑病角質(zhì)細胞的異常增殖及缺乏分化。
實施例4.NAC對大腸腫瘤的作用。
利用1，2-二甲基肼(DMH)處理雄性Sprague-Dawley大鼠，誘導(dǎo)腸腫瘤，研究每日或間斷的NAC治療對腸腫瘤的作用。
與相應(yīng)的對照組相比，NAC間斷治療組大鼠的大腸腫瘤負擔(dān)顯著降低(分別為11和1個腫瘤/處理組，p＝0.001)。NAC治療組的大腸腫瘤塊指數(shù)同樣顯著低于對照組(分別為1.93和0.04，p＜0.001)。每日NAC治療的大鼠結(jié)腸中沒有腺癌存在。
結(jié)論為，NAC減少DMH誘導(dǎo)的雄性Sprague-Dawley大鼠的大腸腫瘤，就顯著抑制大鼠結(jié)腸內(nèi)腫瘤來看，NAC具有保護作用。
實施例5. NAC對結(jié)腸腺癌的作用。
在此實驗?zāi)Ｐ椭?，將BD-IX大鼠分成4組G1和G2組定為″腫瘤組″，用于研究NAC對結(jié)腸癌進展的作用，G3和G4組定為″毒性組″，用于研究該處理對代謝過程和實質(zhì)(parenchyma)的作用。G1和G2組動物的胸部皮下注射DHD/K12-PROb細胞。接種后1-13周，G2和G4組的動物每周接受NAC注射。G1和G3組動物不經(jīng)處理。
另外，使用動物和人結(jié)腸腺癌細胞系(DHD/K12-PROb和HT-29)進行體外分析，以檢查NAC的細胞毒性。
在此實驗研究中發(fā)現(xiàn)，利用NAC長期治療大鼠結(jié)腸腺癌導(dǎo)致壽命延長。此外，經(jīng)NAC治療的雌性及雄性大鼠的腫瘤生長顯著減慢。
實施例6.NAC對結(jié)腸癌的作用，化學(xué)預(yù)防機制。
既然NAG抗結(jié)腸癌的功效顯著，在氧化偶氮甲烷(AOM)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌模型中，研究結(jié)腸粘膜和腫瘤組織中的蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)和二酰甘油激酶(DGK)的活性以及8-異前列腺素的水平，以探索抑制結(jié)腸癌發(fā)生的機制。
7周齡時，相應(yīng)組大鼠s.c.注射氧化偶氮甲烷(AOM；15mg/kg體重，每周一次，進行兩周)，繼續(xù)各種實驗，直到第二次AOM處理后38周為止。然后處死大鼠，評價結(jié)腸粘膜以及腫瘤樣品的PKC、TPK、DGK和8-異前列腺素水平。
給予NAC顯著抑制了結(jié)腸粘膜和腫瘤的Ca2+依賴性和非依賴性PKC活性(P＜0.01)。給予NAC也顯著抑制結(jié)腸粘膜和腫瘤的TPK活性(P＜0.01)。相反，接受NAC的大鼠顯示DGK活性顯著提高(P＜0.01)。另外，NAC處理大鼠的結(jié)腸腫瘤比對照的8-異前列腺素水平低。
這些發(fā)現(xiàn)提示，NAC化學(xué)預(yù)防結(jié)腸癌的機制涉及通過誘導(dǎo)PKC和TPK活性下調(diào)以及DGK活性上調(diào)，調(diào)節(jié)蛋白激酶C、酪氨酸蛋白激酶和二酰甘油激酶的活性。因此，這些事件可能在某種程度上導(dǎo)致抗結(jié)腸癌發(fā)生的化學(xué)預(yù)防活性。此外，這些結(jié)果暗示，NAC增強結(jié)腸中PKC、TPK和DGK活性的調(diào)節(jié)。
實施例7. NAC或di-NAC對口部角化細胞腫瘤及其轉(zhuǎn)移性傳播的作用。
將4NQO誘導(dǎo)的大鼠惡性口部角質(zhì)細胞克隆群原位移植到無胸腺小鼠，檢測NAC或di-NAC對其轉(zhuǎn)移能力的作用。多角形細胞和紡錘形細胞在所有動物的接種部位(口腔底部)分別形成分化良好的鱗狀細胞癌(角蛋白陽性及波形蛋白(vimentin)陰性)和未分化的紡錘狀細胞腫瘤(角蛋白陰性及波形蛋白陽性)。
以高細胞密度移植5×106任一細胞類型的細胞，引起大約50％的動物形成肺轉(zhuǎn)移。
未分化的紡錘形細胞系表達轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)，原位移植以后根據(jù)本發(fā)明進行處理，盡管幾乎所有的移植動物均形成原發(fā)性腫瘤，但形成肺轉(zhuǎn)移的動物較少。
此結(jié)果提示，NAC或di-NAC誘導(dǎo)的TGF-β1可以作為該細胞類型的腫瘤抑制劑。外源性NAC顯著抑制多角形細胞克隆，也抑制紡錘形細胞。此結(jié)果還提示，經(jīng)過NAC或di-NAC處理，分化的大鼠惡性口部角質(zhì)細胞的侵襲性較小，較之未處理的對應(yīng)物其轉(zhuǎn)移潛能下降。在未分化的紡錘形細胞對應(yīng)物中觀察到類似發(fā)現(xiàn)。TGF-β及其受體特征的作用可以部分解釋以下發(fā)現(xiàn)，即NAC或其二聚體形式減少了惡性口部角質(zhì)細胞腫瘤及其轉(zhuǎn)移性傳播。
實施例8.組織靶向。
流感病毒顆粒(重組的流感病毒包膜)可以靶向卵巢癌細胞(OVCAR-3)，而保存融合活性。這通過將聚(乙二醇)(PEG)衍生的脂質(zhì)引入病毒核蛋白顆粒的膜中而實現(xiàn)。(Mastro-battista E，SchoenP，Wilsohut J，Crommelin DJ，Storm G.FEBS Lett 2001 Nov30；509(1)7176)。
將單克隆抗體(mAb)323/A3(抗上皮細胞糖蛋白-2)的Fab’片段偶聯(lián)到PEG脂質(zhì)的遠端。該PEG層作為遮蔽，防止病毒血凝素與無所不在的唾液酸殘基的相互作用，并作為抗體附著的空間錨位。從而獲得特異性結(jié)合病毒顆粒的OVCAR-3細胞。抗體重定向的病毒顆粒以pH依賴性方式，與OVCAR-3細胞的膜融合。
利用這種方法，(Mastrobattista E，Schoen P，Wilschut J，Crommelin DJ，Storm G.，F(xiàn)EES Lett 2001 Nov 30；509(1)71-76)可以將NAC和di-NAC偶聯(lián)mAb 323/A3的Fab’片段，附著于病毒顆粒。
這些實驗證明，NAC和DiNAC可用于組織靶向。
實施例9.通過NAC處理抑制PPAR合成。
過氧化物酶體增殖因子活化受體(PPARs)是屬于核受體家族的配基活化的轉(zhuǎn)錄因子(Chinetti G.，F(xiàn)ruchart J.-C.，Staels B.，Inflammation Research Abstract Volume 49 Issue 10(2000)，pp497-505)。這些受體行使脂質(zhì)和脂蛋白代謝以及葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑功能，并影響細胞增殖、分化和凋亡。PPAR-α在諸如肝、肌肉、腎和心組織中高表達，促進脂肪酸的β-氧化降解。PPAR-δ主要在腸和脂肪組織中表達。PPAR-γ引起脂肪細胞分化，并促進脂質(zhì)貯存。降脂肪藥氯貝特和抗糖尿病藥格列酮分別是PPAR-α和PPAR-γ的合成配基。此外，脂肪酸和類二十烷酸是天然的PPAR配基PPAR-α由白三烯B4活化，而前列腺素J2是PPAR-γ的配基。
此外，PPAR-α缺陷的小鼠顯示對炎癥刺激物的反應(yīng)延長。PPAR活化劑也顯示通過負干擾NF-κ、STAT和AP-1信號途徑，抑制炎癥反應(yīng)基因(例如IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α和金屬蛋白酶)的活化。PPAR活化劑在表達PPARs的不同免疫學(xué)和血管壁細胞類型中(例如單核細胞/巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞和平滑肌細胞)發(fā)揮這些抗炎活性。
因此，有效濃度的NAC(參見上述)通過抑制PPARs，表現(xiàn)出不僅控制代謝，而且控制炎癥。
可能的治療應(yīng)用為炎癥相關(guān)疾病，例如動脈粥樣硬化和炎癥性腸部疾病。
權(quán)利要求
1.有效劑量的N-乙酰L-半胱氨酸或其二聚體形式用于制備藥物的用途，所說的藥物可使哺乳動物上皮來源的瘤形成細胞回復(fù)到正常分化，從而使該瘤形成細胞的異常增殖回復(fù)到正常途徑。
2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于該瘤形成細胞是退行性變化的細胞。
3.權(quán)利要求2的用途，其特征在于該退行性變化的細胞是良性腫瘤細胞。
4.權(quán)利要求3的用途，其特征在于該良性腫瘤細胞是表皮腫瘤細胞。
5.權(quán)利要求4的用途，其特征在于該表皮腫瘤細胞是銀屑病細胞。
6.權(quán)利要求5的用途，其特征在于該良性腫瘤細胞是類風(fēng)濕細胞。
7.權(quán)利要求2的用途，其特征在于該退行性變化的細胞是惡性腫瘤細胞。
8.權(quán)利要求7的用途，其特征在于該惡性腫瘤細胞是肺癌、乳腺癌、前列腺癌或人結(jié)腸癌。
9.權(quán)利要求1的用途，其特征在于該瘤形成細胞是組織轉(zhuǎn)化細胞。
10.權(quán)利要求9的用途，其特征在于該組織轉(zhuǎn)化細胞是角化病細胞。
11.權(quán)利要求10的用途，其特征在于該角化病細胞是銀屑病細胞。
12.權(quán)利要求9的用途，其特征在于該組織轉(zhuǎn)化細胞是表現(xiàn)糖尿病損傷的細胞。
13.權(quán)利要求1的用途，其特征在于該瘤形成細胞是進行性分化細胞。
14.權(quán)利要求1的用途，其特征在于該瘤形成細胞是退行性化生細胞。
15.權(quán)利要求1-14中任一項的用途，其特征在于N-乙酰-L-半胱氨酸或其二聚體形式的有效劑量為局部0.1-50mM。
16.權(quán)利要求15中任一項的用途，其特征在于N-乙酰-L-半胱氨酸或其二聚體形式的有效劑量為局部0.25-40mM。
17.可使哺乳動物上皮來源的瘤形成細胞回復(fù)到正常分化，從而使該瘤形成細胞的異常增殖回復(fù)到正常途徑的組合物，其特征在于治療有效量的N-乙酰-L-半胱氨酸、或其二聚體形式、以及藥學(xué)可接受的載體。
18.權(quán)利要求17的組合物，其特征在于組織靶向分子附加到N-乙酰-L-半胱氨酸或其二聚體形式上。
19.權(quán)利要求18的組合物，其特征在于該組織靶向分子是
全文摘要
本發(fā)明涉及有效劑量的N－乙酰L－半胱氨酸或其二聚體形式的制藥用途，所制造的藥物可以使哺乳動物上皮來源的瘤形成細胞回復(fù)到正常分化，從而使該瘤形成細胞的異常增殖回復(fù)到正常途徑。
文檔編號A61P43/00GK1482906SQ0182150
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月27日
發(fā)明者T·倫德貝里, T 倫德貝里, M·孔切塔羅馬諾, 興 蘼砼 申請人:納克蒂魯斯股份公司