專利名稱：提高生物活性分子傳遞的方法和組合物的制作方法
有關的申請本申請要求2000年10月31日遞交、標題為“提高生物活性分子傳遞的方法和組合物”的美國臨時申請序號60/244,499的優(yōu)先權，該申請的內容通過引用結合到本文中。
背景技術：
相對于給予藥物本身來講，用生物可降解的聚合物微球體和納米球體包封的藥物可延長維持治療藥物的水平。依據(jù)劑型和包封的活性分子而定，緩釋可最高延至數(shù)月?？墒窃S多生物活性分子，尤其是蛋白質被用聚合載體包封它們所需的操作過程所破壞或使其不穩(wěn)定。另外，許多蛋白質的帶電荷的、極性的性質可限制用聚合藥物載體包封的程度，并且可導致當?shù)谝淮谓o藥時所包封的生物活性分子部分的迅速丟失(“爆發(fā)釋放(burst)”)。
當患者服藥時一直采用生物可降解的聚合物傳遞體系包封的生物活性分子的方法刺激免疫反應(見Gombotz等，U.S.Pat.No.5,942,253)。在某些情況下這是理想的，但當目的是為了傳遞治療用途的生物活性分子時，卻不理想。因此降低免疫系統(tǒng)對用生物可降解的聚合物傳遞的生物活性分子的識別應該有利于治療的進行。
生物活性分子，尤其是治療性的蛋白質(藥物)，可用親水性聚合物如聚乙二醇修飾(通稱為“聚乙二醇化(pegylation)”的方法)，以共價鍵連接到一個或多個氨基酸側鏈上(如見Davis等，U.S.Pat.No.4,179,337；Harris，U.S.Pat.No.5,446,090；Delgado等，U.S.Pat.No.5,880,255.)。雖然本領域眾所周知此類連接可導致分子量明顯增加并可降低修飾后的治療性蛋白質的血液清除率(如見Camble等，U.S.Pat.No.5,320,840)，但是先有技術沒有說明使用聚乙二醇化的蛋白可降低免疫原性或可延長從生物可降解的聚合藥物傳遞系統(tǒng)中釋放的持續(xù)時間。先有技術沒有說明相對于未聚乙二醇化的藥物，聚乙二醇化的藥物可增加藥物在生物可降解的藥物傳遞系統(tǒng)中的可達到的裝載量，也沒有說明相對于未聚乙二醇化的藥物，聚乙二醇化的部分可減少藥物的爆發(fā)釋放。
發(fā)明概述本發(fā)明提供控制、延長生物活性分子如治療性蛋白質、肽和低(聚)核苷酸釋放的新制劑。所述制劑以生物可降解的聚合物如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及其共聚物聯(lián)合形成的微?；蚣{米粒為基礎。將生物活性分子連接到親水性的聚合物如聚乙二醇或聚丙二醇中，然后與固體微?；蚣{米粒制成能提供控釋的制劑。該控釋制劑可通過注射給藥、吸入給藥、鼻內或口服給藥。
因此，作為本發(fā)明的部分，其發(fā)現(xiàn)親水性聚合物連接到生物活性分子(如藥物和治療性蛋白質)上有幾個有益的作用，包括在用藥物載體包封條件下提供保護使其免受降解或變性。另外，相對于未修飾的蛋白質，增加了可以被包封的修飾蛋白質的量，因此提供較低的原料總劑量，對患者和生產者均有益。
另外，本發(fā)明進一步以以下發(fā)現(xiàn)為基礎，發(fā)現(xiàn)相對于在載體中的非聚乙二醇化的生物活性分子，降低了被生物可降解的聚合物藥物傳遞載體包封的聚乙二醇化的生物活性分子的免疫原性，特別是通過皮下或肌內注射或吸入或粘膜傳遞(如口或鼻傳遞)給藥時。當口腔傳遞使用生物可降解的聚合物時，被降低的免疫原性具有特別的優(yōu)勢，因為這是粘膜接種疫苗的一種典型的方法。
在另一方面，本發(fā)明以下述發(fā)現(xiàn)為基礎，發(fā)現(xiàn)通過以生物可降解的聚合物系統(tǒng)，具體地說以納米球給藥時，能使通常不能被胃腸道吸收的聚乙二醇化的蛋白質、肽、低聚糖和低聚核苷酸成為生物可利用的。當在此使用時，術語“生物可利用的”指在對一個主體給藥后進入血流的生物活性分子部分。當口服給藥時，本發(fā)明的控釋制劑可增加生物活性分子的生物利用度，特別是此處所述的納米球制劑。例如，在單劑量口服給予納米球包封的聚乙二醇化的生物活性分子后，血液水平可維持數(shù)天。另外，在形成納米球過程中聚乙二醇鏈保護該生物活性分子免受降解和變性，促使活性分子的截留增加并減少“爆發(fā)釋放”作用。
因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種控制、延緩釋放并增加生物活性分子的生物利用度的藥用組合物，它包括一種連接包封到納米球中的治療劑的聚合物(如PEG)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，口服給予所述組合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物活性分子選自α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬酰胺酶、腺苷、脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節(jié)素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆的抗體、多克隆的抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。
因此，本發(fā)明的組合物可用于在多個方面改善治療性的生物活性分子的體內傳遞。詳細地說，本發(fā)明提供降低免疫原性、增加生物利用度、增加持續(xù)時間、增加穩(wěn)定性、減少爆發(fā)釋放并控制、延緩生物活性分子的體內釋放的優(yōu)勢。
本發(fā)明詳述I.生物活性分子當在此使用時，術語“生物活性分子”指給予主體如人或其它的哺乳動物的任意的治療性蛋白質、肽、多糖、核酸或其它的生物活性化合物。用于本發(fā)明的合適的治療性蛋白質包括，但不限于，α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬酰胺酶、腺苷脫氨酶和胰島素。
適宜的治療性肽也包括激素，如ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節(jié)素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin和泌乳刺激素。
另外適宜的治療性蛋白質包括單克隆和多克隆的抗體、單鏈抗體、其它抗體片段、類似物和衍生物。治療性聚核苷酸，包括反義寡核苷酸、阿普塔默和治療基因，也可用本發(fā)明的方法和組合物傳遞。
抗凝血治療劑，如肝素和低分子量肝素，也可用本發(fā)明的方法和組合物傳遞。其它適宜用于本發(fā)明的治療性蛋白質包括小的生物活性分子，如抗癌藥，如紫杉醇、泰索帝、阿霉素和道諾霉素、長春新堿、順鉑、卡鉑、喜樹堿和喜樹堿類似物、抗生素、安定藥、抗抑郁藥、糖尿病和心血管疾病的小分子藥物。
II.生物活性分子與親水性聚合物的連接術語“親水性聚合物”指任意的水溶性直鏈或支鏈聚合物，包括但不限于聚乙二醇和聚丙二醇和類似的直鏈和支鏈聚合物。優(yōu)選聚合物的分子量在約500道爾頓到50,000道爾頓的范圍內。用于本發(fā)明的親水性聚合物一般具有一個反應基團，其通過氨基、羧基、硫氫基、磷酸酯或羥基官能團，將該聚合物引入連接到所述的生物活性分子中。
可根據(jù)標準方案制備用于本發(fā)明的親水性聚合物如聚乙二醇，將一個末端加有甲氧基基團而激活另一端以易于連接到生物活性分子的活性基團上。例如，美國專利序號6,113,906描述了聚乙二醇上的琥珀酰胺琥珀酸酯或氨基甲酸酯活性基團與蛋白質上的氨基基團的反應的用途。美國專利序號5,446,090描述了聚乙二醇的砜衍生物與蛋白質的硫氫基形成穩(wěn)定的鍵的用途。美國專利序號5,880,255描述了tresyl衍生物與蛋白質的氨基基團反應形成一種簡單的、穩(wěn)定的仲胺鍵的用途。這些專利的所有內容通過引用全部結合到本文中。N-羥基琥珀酰胺也可作為反應基團引入。
III.結合聚合物的生物活性分子的控釋制劑術語“控釋”指控制本發(fā)明的藥物傳遞制劑傳遞的生物活性分子的速率和/或數(shù)量?？蒯尶梢允沁B續(xù)的或不連續(xù)的，和/或線性的或非線性的。為了產生所需的效果，可用一種或多種類型的聚合物成分、藥物載體、賦形劑的內含物或降解增強劑、或其它修飾劑，進行單獨給藥、聯(lián)合或連續(xù)給藥來實現(xiàn)。
零級釋放或線性釋放通常解釋為在所需的時間期限內，一定時間釋放的生物活性分子的量作為量/單位時間的函數(shù)保持相對恒定?！岸嘞?Multi-phasic)”通常解釋為釋放出現(xiàn)一個以上的“爆發(fā)釋放”。
A.微粒在一個實施方案中，為了控制結合聚合物的生物活性分子的釋放，本發(fā)明采用生物可降解的微粒。當在此使用時，“微?！敝竷?yōu)選具有小于1.0mm，而更優(yōu)選具有在1.0和100.0微米之間的直徑的粒子。微粒包括微球，其一般為固體球形微粒。微粒也包括微囊，其通常是具有不同的聚合物、藥物或組合物的核心的球形微粒。
用于本發(fā)明的微?？捎酶鞣N控釋制劑所用的生物可降解的聚合物制備，這在本領域是眾所周知的。例如，適宜的聚合物包括，但不限于，包括聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物的聚(羥基酸)、聚酐、聚原酸酯和某些類型的蛋白質和多糖聚合物。當在此使用時，術語“生物可侵蝕的”或“生物可降解的”指當暴露到pH在大約6-8之間的生理溶液中并在大約25℃-38℃之間的溫度下，在一段時期內溶解或降解的聚合物，所述一段時間在所需要的應用(通常在體內治療中)中是可以接受的，一般大約不到五年，更優(yōu)選不到一年。
優(yōu)選的聚合物包括聚(羥基酸)，尤其是乳酸-乙醇酸共聚物(lacticacid-co-glycolic acid)(“PLGA”)，其在暴露到機體的水環(huán)境中后通過水解降解。然后該聚合物水解產生乳酸和乙醇酸單體，它們是細胞代謝的正常的副產物。所述聚合物分解的速率可在幾周到一年的一段時間內變化，這取決于幾個因素，所述因素包括聚合物的分子量、聚合物鏈中乳酸與乙醇酸單體的比率和單體亞單位的立構規(guī)整性(L和D立體異構體混合物破壞聚合物的結晶性，從而增強聚合物降解)。微球可含有兩種或兩種以上的分子量不同和/或單體比率不同的生物可降解的聚合物混合物。
衍生化的生物可降解的聚合物也適宜用于本發(fā)明，包括連接到PLGA等上的親水性聚合物。詳細地說，為了形成微球，可使用本領域中已知的各種技術。例如，這些技術包括在移除溶劑后的單乳化或雙乳化步驟。移除溶劑可通過其它方法之中的萃取、蒸發(fā)或噴霧干燥完成。
在溶劑萃取方法中，將所述聚合物溶解于至少部分溶于萃取溶劑(如水)的有機溶劑中。然后，將以溶解形式或以細小粒子分散形式的生物活性分子加入到聚合物溶液中，之后將該混合物分散進入含有表面活性劑如聚(乙烯醇)的水相中。將產生的乳化液加入到更大體積的水中，將有機溶劑從聚合物/生物活性劑中移除，形成硬化的微粒。
在溶劑蒸發(fā)方法中，將所述聚合物溶解于揮發(fā)性有機溶劑中。將以溶解形式或以細小粒子分散形式的生物活性分子加入到聚合物溶液中，之后將該混合物懸浮在一種含有表面活性劑如聚(乙烯醇)的水相中。攪拌所產生的乳化液，直到大部分有機溶劑蒸發(fā)，留下固體微球。
在噴霧干燥方法中，將所述聚合物溶解于適宜的溶劑中，如二氯甲烷(如0.04g/ml)中。然后將已知量的生物活性分子(藥物)懸浮(如果不溶)或共溶(如果可溶)在該聚合物溶液中。隨后將該溶液或分散液噴霧干燥?？梢垣@得直徑范圍在1-10微米之間的微球，其形態(tài)取決于聚合物的選擇。
其它已知的方法，如相分離法和凝聚法以及以上方法的變化在本領域是眾所周知的，并且也可用于本發(fā)明。
B.納米粒在另一個實施方案中，本發(fā)明采用生物可降解的納米?？刂七B接生物活性分子的聚合物的釋放，特別是口服給藥。當在此使用時，術語“納米粒”指具有優(yōu)選在大約20納米和大約2.0微米之間的直徑的粒子，典型地是在大約100納米和1.0微米之間的直徑的粒子。
除了使用高速混合或勻化以便將聚合物/生物活性劑乳化液的粒徑減少到2.0微米以下，優(yōu)選在1.0微米以下之外，基本上可按照以上微米粒所述，獲得納米粒制劑，例如，WO 97/04747中說明了制備納米粒的適宜技術，該申請全部內容結合到本發(fā)明中作為參考。
實施例I.傳遞leu-腦啡肽的制劑的制備和特征實施例1-聚乙二醇綴合的leu-腦啡肽(PEG-leu-腦啡肽)的制備如下制備用聚乙二醇共價修飾的leu-腦啡肽將25mg leu-腦啡肽溶解于500μL含有50μL TEA的無水DMSO中。將250mgmPEG(5000)-SPA溶解于1.5mL無水DMSO中，并通過直接注射加入到所述肽溶液中。讓該反應在室溫下進行2小時或直到＞90％的肽轉化為其被PEG-修飾的形式。通過在EtOH中重結晶(2x)，從反應物中分離出產物，mPEG(5000)-leu-腦啡肽。該反應產物為＞95％聚乙二醇化的白色固體(通過RP-HPLC分析)。
實施例2-含有l(wèi)eu-腦啡肽的常規(guī)(w1/o/w2)微粒的制備和特征如下制備含有l(wèi)eu-腦啡肽的常規(guī)w1/o/w2微粒將leu-腦啡肽溶解于1∶9 DMSO∶PBS混合物中，使終濃度為35mg/mL(其在PBS中的最大溶解度)。將PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16L/g)溶解于二氯甲烷中，使終濃度為200mg/mL。通過以10,000rpm速度，將200μL的肽溶液與3mL的聚合物溶液勻化3分鐘，制成初乳化液(w/o)。將該初乳化液傾入到100mL 0.5％PVA溶液中，并以750rpm攪拌3-6小時。在溶劑已經(jīng)蒸發(fā)并且微粒已經(jīng)變硬后，過濾收集，并在分析前于真空中干燥。該粒子的核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和它們的內容物的最初釋放量(IR)的特征如下。結果見表1。
通過溶解10mg微球在50％乙腈中，隨后離心以沉淀不溶的聚合物，進行微球核心裝載量的測量。通過RP-HPLC分析部分樣品，并與在50％乙腈中制備的有代表性的標準品比較。通過懸浮20mg樣品在2mL含有0.02％吐溫20和25％EtOH的PBS(50mM，pH 7.2)中，測量微球的最初釋放量。將該懸浮液渦流振蕩，并在37℃下孵育。1小時后，移去等份樣品，過濾并通過RP-HPLC分析釋放量。表明1小時時的加速釋放與1天以后在沒有EtOH的PBS中的活性釋放量相關。
實施例3-含有PEG-leu-腦啡肽綴合物的常規(guī)(w1/o/w2)微粒的制備和特征如下制備含有PEG-leu-腦啡肽的常規(guī)w1/o/w2微粒將PEG-leu-腦啡肽溶解于1∶9 DMSO∶PBS混合物中，使終濃度為50mg/mL。將PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16L/g)溶解于二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10,000rpm速度將200μL的肽溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，制成初乳化液(w/o)。將該初步乳化液傾入到100ml0.5％PVA溶液中，并以750rpm攪拌3-6小時。在溶劑已經(jīng)蒸發(fā)并且微粒已經(jīng)變硬后，過濾收集，并在分析前于真空中干燥。如實施例2所述，該粒子具有核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和它們的內容物的最初釋放量(IR)的特征。這些數(shù)據(jù)示于表1中。
實施例4-含有l(wèi)eu-腦啡肽的單相微粒的制備和特征如下制備含有未修飾的leu-腦啡肽的單相微粒將10mg leu-腦啡肽溶解于1ml含有30μL TFA的二氯甲烷中。然后將90mgPLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61 L/g)溶解于該有機的肽溶液中。通過使該溶液與2.5ml 2.5％PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液(o/w)。使用強制通氣(forced air)(15分鐘)并攪拌(6-8小時)，蒸發(fā)溶劑并硬化微粒。在硬化后，通過過濾收集所述微粒，并在分析前于真空中干燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數(shù)據(jù)示于表1中。
實施例5-含有PEG-leu-腦啡肽綴合物的單相微粒的制備和特征如下制備含有PEG-leu-腦啡肽的單相微粒將50mg PEG-leu-腦啡肽和150mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61 L/g)溶解于2ml二氯甲烷中。通過使該有機肽/聚合物溶液與5ml 2.5％PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液(o/w)。通過攪拌/真空蒸發(fā)2小時，從該微粒中移去有機溶劑。在微粒變硬后，通過過濾收集所述微粒，并在分析前于真空中干燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數(shù)據(jù)示于表1中。
實施例6-聚乙二醇化的leu-腦啡肽增加的藥物裝載量表1的數(shù)據(jù)顯示PEG 5000與leu-腦啡肽的共價結合對于雙乳化技術可增加藥物的裝載量(CL)達0.07％到0.36％，對于單相方法可增加0.3％到3.95％。對兩種方法而言，聚乙二醇化也導致包封效率的極大改善。聚乙二醇化的最初釋放量(“爆發(fā)釋放”)比通過單相制備的未聚乙二醇化的肽的最初釋放量稍低(更好)，并且對于聚乙二醇化的肽，其藥心裝載量超過10倍。藥心裝載量越高，為了達到所需的藥物劑量而給予患者的生物可降解的藥物傳遞體系的劑量就越小。
表1、leu-腦啡肽和PEG-leu-腦啡肽微粒的特征
理論裝載量(活性物的重量/活性物和聚合物的總重量)CL-核心裝載量(在微粒中單獨的活性物的重量百分比Wt％)EE-包封效率(在制備過程中包封的活性物的％)PS-平均粒徑(從SEM估計)IR-從37℃下的含有0.02％吐溫20和25％EtOH的PBS(50mM，pH7.2)中，體外分解1小時時的最初釋放量ND-未能檢測出II.傳遞Biphalin的制劑的制備、特征和給藥方法實施例7-聚乙二醇化的Biphalin增加的藥物裝載量和減少的爆發(fā)釋放Biphalin是一種在哺乳動物中具有止痛活性的合成肽。與兩個PEG2000鏈連接，使其在靜脈內給藥后比未聚乙二醇化的肽具有更長的止痛作用持續(xù)時間?？砂凑找韵聦嵤├?，比較Biphalin和聚乙二醇化的Biphalin在PLGA微粒包封中的行為。如表2所示，聚乙二醇化的Biphalin比未聚乙二醇化的肽具有更高的藥心裝載量、更高的包封效率和更低的最初釋放水平(爆發(fā)釋放)。
實施例8-含有biphalin的常規(guī)(w1/o/w2)微粒的制備和特征如下制備含有PEG-biphalin的常規(guī)w1/o/w2微粒將Biphalin溶解于PBS∶DMSO∶乙酸(5∶1∶1.5)的三重混合物中，使終濃度為35mg/ml。將PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16L/g)溶解于二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200μL的肽溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，制成初乳化液(w/o)。將該初乳化液傾入到100ml 0.5％PVA溶液中，并以750rpm攪拌3小時。在溶劑已經(jīng)蒸發(fā)并且微粒已經(jīng)變硬后，用水洗滌該微粒，通過過濾收集，并在分析前于真空中干燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數(shù)據(jù)見表2中所示。
實施例9-含有PEG-biphalin綴合物的常規(guī)(w1/o/w2)微粒的制備和特征如下制備含有PEG-biphalin的常規(guī)w1/o/w2微粒將PEG-biphalin溶解于PBS中，使終濃度為50mg/ml。將PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；酸末端基團；固有粘度0.16 L/g)溶解于二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200μL的肽溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，制成初乳化液(w/o)。將該初乳化液傾入到100ml 0.5％PVA溶液中，并以750rpm攪拌3小時。在溶劑已經(jīng)蒸發(fā)并且微粒已經(jīng)變硬后，用水洗滌該微粒，通過過濾收集，并在分析前于真空中干燥。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數(shù)據(jù)示于表2中。
實施例10-含有biphalin的單相微粒的制備和特征如下制備含有未修飾的biphalin的單相微粒將20mg biphalin和180mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解于2ml 1∶3的乙酸∶二氯甲烷混合物中。通過使該油相與5ml 1％PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過在攪拌下真空蒸發(fā)4小時，從最初的o/w乳化液中移去有機溶劑。在移除溶劑后，通過過濾收集變硬的微粒，并用蒸餾的去離子水洗滌數(shù)次以便移除任何非特異性結合的PVA或biphalin。最后在分析前，于真空中干燥該微粒。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數(shù)據(jù)示于表2中。
實施例11-含有PEG-biphalin綴合物的單相微粒的制備和特征如下制備含有PEG-biphalin的單相微粒將180mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)和20mg PEG-biphalin溶解于2ml二氯甲烷中。通過使該聚合物/肽溶液與5ml 2.5％聚乙烯醇(PVA，80-85％水解)渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過在攪拌下真空蒸發(fā)4小時，從該初乳化液(o/w)中移去有機溶劑。通過過濾收集變硬的微粒，并用蒸餾水洗滌數(shù)次以便移除任何非特異性結合的PVA或PEG-biphalin。最后，在分析前，于真空中干燥該微粒。核心裝載量(CL)、包封效率(EE)、粒徑(PS)和內容物最初釋放量(IR)的數(shù)據(jù)示于表2中。
實施例12-給予生物可降解的微球中的聚乙二醇化的biphalin后對哺乳動物的止痛作用為了評估按照本發(fā)明給藥biphalin在體內傳遞的改善，如下進行一個比較研究聚乙二醇化的biphalin PLGA微球可按照實施例9所述，通過雙乳化方法制備。將所述微球懸浮在帶有0.5％Tween-20的羧甲基纖維素(5％)水溶液的媒介物中。然后皮下給予Spragur-Dawley大鼠一個有效劑量，并且通過，例如，擺尾(tail-flick)試驗測量止痛作用。包封的PEG-biphalin微球比未包封的PEG-biphalin對照注射劑具有持續(xù)更長的止痛作用。該實驗可用通過實施例11的單相方法制備的PLGA-包封的PEG-biphalin重復進行，結果類似。
表2、Biphalin和PEG-Biphalin微粒的特征
a理論裝載量(活性物的重量/活性物和聚合物的總重量)CL-核心裝載量(在微粒中單獨的活性物的重量百分比Wt％)EE-包封效率(在制備過程中包封的活性物的％)PS-平均粒徑(從SEM估計)IR-從37℃下的含有0.02％吐溫20和25％EtOH的PBS(50mM，pH7.2)中，體外分解1小時時的最初釋放量ND-未能檢測出III傳遞胰島素的制劑的制備、特征和給藥方法實施例13-聚乙二醇-共軛的人胰島素(PEG-胰島素)的制備按如下方法用聚乙二醇共價修飾人胰島素將116mg重組人胰島素溶解于4ml含有200μL TEA的無水DMSO中。將1gmPEG(5000)-SPA溶解于10ml無水DMSO中，并通過直接注射加入到所述胰島素溶液中。讓該反應在室溫下進行過夜(6-10小時)或直到＞90％的蛋白質聚乙二醇化。通過從Et2O中沉淀(2x)，分離未反應的PEG和聚乙二醇化的胰島素。終產物為＞95％聚乙二醇化的白色顆粒固體(通過RP-HPLC分析)。
實施例14-含有人胰島素的常規(guī)(w1/o/w2)微粒的制備和特征如下制備含有人胰島素的常規(guī)w1/o/w2微粒將重組人胰島素溶解于DMSO∶0.1N HCl(1∶1)中，使終濃度為50mg/ml，并將PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61 L/g)溶解于二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200μL的所述蛋白質溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，制成初乳化液(w/o)。將初乳化液加入到100ml 0.5％PVA溶液中，并在真空下攪拌3-6小時。移除有機溶劑，過濾微粒，用水洗滌數(shù)次，并在分析前于真空中干燥。該微粒的特征示于表3中。
實施例15-含有PEG-胰島素綴合物的常規(guī)(w1/o/w2)微粒的制備和特征如下制備含有PEG-胰島素的常規(guī)w1/o/w2微粒將PEG-胰島素溶解于DMSO∶H2O(1∶2)的混合物中，使終濃度為50mg/ml，并將PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61 L/g)溶解于二氯甲烷中，使終濃度為200mg/ml。通過以10000rpm的速度，將200μL的所述蛋白質溶液與3ml的聚合物溶液勻化3分鐘，制成初乳化液(w/o)。將初乳化液加入到100ml 0.5％PVA溶液中，并在真空下攪拌3-6小時。移除有機溶劑，過濾微粒，用水洗滌數(shù)次，并在分析前于真空中干燥。該微粒的分析結果示于表3中。
實施例16-含有人胰島素的單相微粒的制備和特征如下制備含有人胰島素的單相微粒將20mg重組人胰島素(Zn2+-胰島素鹽)溶解于2ml乙酸∶二氯甲烷(1.4∶1)混合物中。將180mgPLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61 L/g)溶解于該有機的肽溶液中。通過使該有機肽/聚合物溶液與5ml 1％PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過在攪拌下真空蒸發(fā)2小時，移去有機溶劑。將部分變硬的微粒加入到含有100ml水的燒杯中，再攪拌2小時以便徹底移除所有的有機溶劑。過濾收集微粒、用水洗滌數(shù)次，并在分析前于真空中干燥。該微粒的分析結果示于表3中。
實施例17-含有PEG-胰島素綴合物的單相微粒的制備和特征如下制備含有PEG-胰島素的單相微粒將63mg PEG-胰島素和137mg PLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；月桂基末端基團；固有粘度0.61L/g)溶解于2ml二氯甲烷中。通過使該油相與5ml 1％PVA渦流振蕩3分鐘，形成初乳化液。通過真空蒸發(fā)2小時，隨后在環(huán)境溫度下攪拌1小時完成有機溶劑的移除。通過過濾收集變硬的微粒，用水洗滌數(shù)次，并在分析前于真空中干燥。該微粒的分析結果示于表3中。
實施例18-聚乙二醇化的胰島素增加的藥物裝載量和包封效率表3的數(shù)據(jù)顯示聚乙二醇化的胰島素可增加通過單相和雙乳化方法制備的PLGA微球中的藥物裝載量。聚乙二醇化的胰島素還具有較高的包封效率，當使用高生物活性肽和蛋白質時，這是一個主要的優(yōu)勢。
表3、胰島素和PEG-胰島素微粒的特征
a理論裝載量(活性物的重量/活性物和聚合物的總重量)CL-核心裝載量(在微粒中單獨的活性物的重量百分比Wt％)EE-包封效率(在制備過程中包封的活性物的％)PS-平均粒徑(從SEM估計)實施例19-PLGA-包封的PEG-胰島素的降血糖作用將PEG-胰島素PLGA微球和等劑量的游離胰島素皮下給予正常的大鼠。定時抽取血液并防止凝血。通過標準試驗測量血液的葡萄糖水平。如表4顯示，與未修飾胰島素所觀察到的數(shù)據(jù)相比，使用在PLGA微球中的PEG-胰島素顯著抑制血糖中最初的降低。另外，這些數(shù)據(jù)很重要地顯示PEG-胰島素微球制劑以生物活性的形式釋放其藥物，在體內動物模型中，能夠有效地降低血糖水平，而沒有未修飾的、常規(guī)制劑的“爆發(fā)釋放”作用。
表4、胰島素和PEG-胰島素微粒的體內研究
a％BGL表示將所示的葡萄糖值標準化為基礎水平的百分率IV、傳遞GM-CSF的制劑的制備和特征實施例20-聚乙二醇綴合的GM-CSF的制備按如下方法將GM-CSF共價連接到聚乙二醇(PEG)上在室溫下，將100mg GM-CSF溶解于10ml pH7.5的磷酸鹽緩沖液中。然后加入100mg tresyl-單甲氧基-聚乙二醇(MW＝5000道爾頓)，攪拌該混合物1小時。通過凝膠色譜層析，將未反應的GM-CSF和聚乙二醇化的GM-CSF部分從未反應的tresyl-單甲氧基-聚乙二醇分離出來。然后將聚乙二醇化的GM-CSF透析到100mM Tris緩沖液中，并調節(jié)到50mg/ml的濃度。
實施例21-包封的聚乙二醇化的GM-CSF的微粒制備如下制備包封的聚乙二醇化的GM-CSF的微粒將6.0gPLGA(50∶50丙交酯∶乙交酯；固有粘度0.35 L/g)溶解于2ml乙酸乙酯中。加入1ml實施例20的聚乙二醇化的GM-CSF，并用勻漿器以10,000rpm快速攪拌，制成油包水乳化液。然后抽吸該聚合物/藥物/乙酸乙酯乳化液通過一個靜力攪拌器與泵出的含有1％聚乙烯醇(PVA)的水流結合。該作用制成一種w/o/w乳化液，隨后攪拌下，將其加入到1升5C的水中。在2小時后，在一個25微米篩網(wǎng)上收集含有聚乙二醇化的GM-CSF的變硬的PLGA微球，干燥。所產生的微球粒徑范圍將在25-200μm之間。
實施例22-包封的聚乙二醇化的GM-CSF的納米粒制備如下制備包封的聚乙二醇化的GM-CSF的納米粒將3.0gmPLGA(與實施例21相同的材料)溶解于5ml二氯甲烷和5ml丙酮中。加入0.5ml來自實施例20的聚乙二醇化的GM-CSF，并用勻化器以10,000rpm攪拌該混合物。將該混合物加入到200ml含有5％PVA的水中。然后以15,000rpm勻化該混合物，勻化時間要求能形成直徑小于1.0微米的納米粒。通過真空移除有機溶劑，從水中回收納米球，干燥。
等價物只是使用常規(guī)的實驗方法，本領域的技術人員將能識別，或能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等價物。以下權利要求將囊括此類等價物。另外，此中引用的所有專利和出版物的全部內容通過引用結合到本文中。
權利要求
1.一種控制生物活性分子釋放的藥物制劑，該制劑包含一種與生物活性分子和親水性聚合物的綴合物結合的生物可降解的聚合物。
2.權利要求1的藥物制劑，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。
3.權利要求1的藥物制劑，其中所述生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。
4.權利要求3的藥物制劑，其中所述生物可降解的聚合物選自聚酐、聚原酸酯和多糖聚合物。
5.權利要求1的藥物制劑，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。
6.權利要求1的藥物制劑，其中所述生物可降解的聚合物被配制成包封所述綴合物的微?；蚣{米粒。
7.權利要求1的藥物制劑，其中所述生物活性分子選自α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬酰胺酶、腺苷脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節(jié)素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。
8.一種控制生物活性分子系統(tǒng)性傳遞給患者的方法，該方法包括給予患者一種含有與生物活性分子和親水性聚合物的綴合物結合的生物可降解聚合物的組合物。
9.權利要求8的方法，其中所述組合物經(jīng)口服給予。
10.權利要求8的方法，其中所述組合物通過吸入或粘膜傳遞給藥。
11.權利要求8的方法，其中所述組合物通過注射給藥。
12.權利要求11的方法，其中所述注射為皮下或肌內注射。
13.權利要求8的方法，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。
14.權利要求8的方法，其中生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。
15.權利要求8的方法，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。
16.權利要求8的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配制成包封所述綴合物的微?；蚣{米粒。
17.權利要求8的方法，其中所述活性分子選自α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬酰胺酶、腺苷脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節(jié)素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。
18.一種增加生物活性分子的生物利用度的方法，該方法包括使所述生物活性分子與親水性聚合物綴合，將該綴合的生物活性分子與生物可降解的聚合物配制成制劑，然后將得到的制劑給予患者。
19.權利要求18的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配制成包封所述綴合物的納米粒。
20.權利要求18的方法，其中所述制劑經(jīng)口服給予。
21.權利要求18的方法，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。
22.權利要求18的方法，其中所述生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。
23.權利要求18的方法，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。
24.權利要求18的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配制成包封所述綴合物的微粒或納米粒。
25.權利要求18的方法，其中所述活性分子選自α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬酰胺酶、腺苷脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節(jié)素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。
26.一種降低生物活性分子免疫原性的方法，該方法包括使所述生物活性分子與一種親水性聚合物綴合，將該綴合的生物活性分子與生物可降解的聚合物配制成制劑，然后將得到的制劑給予患者。
27.權利要求26的方法，其中所述組合物通過口服給予。
28.權利要求26的方法，其中所述生物活性分子和親水性聚合物是共價連接的。
29.權利要求26的方法，其中所述生物可降解的聚合物選自聚羥基酸、聚乳酸、聚乙醇酸和它們的共聚物。
30.權利要求26的方法，其中所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇和它們的直鏈和支鏈衍生物。
31.權利要求26的方法，其中所述生物可降解的聚合物被配制成包封所述綴合物的微?；蚣{米粒。
32.權利要求26的方法，其中所述活性分子選自α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素1、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素12、天門冬酰胺酶、腺苷脫氨酶、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、副甲狀腺激素、色素激素、生長調節(jié)素、促黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、biphalin、泌乳刺激素、單克隆抗體、多克隆抗體、反義寡核苷酸、阿普塔默、治療基因、肝素、低分子量肝素和小的生物活性分子。
全文摘要
本發(fā)明開發(fā)了控制、延長生物活性分子如治療性蛋白質、肽和低聚核苷酸釋放的制劑。這些制劑以生物可降解的、合成的聚合物如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及其它們的共聚物聯(lián)合形成的微?；蚣{米粒為基礎。將生物活性分子偶合到親水性的聚合物如聚乙二醇或聚丙二醇中，并制成能提供控制釋放的制劑。相對于未偶合到親水性聚合物上的相同的生物活性分子，所述生物活性分子更穩(wěn)定、免疫原性更低并且改善了釋放速率，具有更低的爆發(fā)水平并增加了藥物的裝載量。所述控釋制劑可通過注射、吸入、鼻內或口服給藥。
文檔編號A61K47/48GK1507357SQ01821388
公開日2004年6月23日 申請日期2001年10月31日 優(yōu)先權日2000年10月31日
發(fā)明者D·路易斯, D 路易斯, P·施密德特, 艿綠, K·欣德斯, 濾 申請人:Pr藥品有限公司