專利名稱：用于確定生物活性分子之間結(jié)合的磁性粒子的使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了用于確定微生物實(shí)體諸如病毒、原生動(dòng)物、細(xì)菌、其細(xì)胞器、脂質(zhì)體與諸如蛋白質(zhì)或DNA的生物活性分子之間的相互作用的方法、設(shè)備和工具。本發(fā)明特別提供了辨別諸如生物活性分子的微生物實(shí)體與另一個(gè)實(shí)體之間的無(wú)特異性(a-specific)和特異性(specific)結(jié)合的解決方案。本發(fā)明具有在生物化學(xué)和醫(yī)療診斷測(cè)定(assay)諸如蛋白質(zhì)微陣列(microarray)的設(shè)計(jì)和使用中的應(yīng)用。
生物感應(yīng)的難題是用高濃度的背景材料(例如，m摩爾/升的白蛋白)檢測(cè)復(fù)雜混合物(例如，血液)中的小濃度特異性目標(biāo)分子(例如，在p摩爾/升范圍和更低范圍中的腫瘤標(biāo)記物)。最普通的生物感應(yīng)方法是以捕捉分子(例如，抗體、核酸等)涂層表面。這些分子捕捉隨后被檢測(cè)的該目標(biāo)?？梢允褂没虿皇褂脴?biāo)記執(zhí)行目標(biāo)分子的檢測(cè)。該標(biāo)記步驟可以發(fā)生在該表面上的捕捉之前或之后。該標(biāo)記可以直接地耦合到該目標(biāo)，或間接地，例如通過(guò)另一個(gè)生物活性分子。檢測(cè)最經(jīng)常使用的是光學(xué)標(biāo)記，例如熒光分子。
生物感應(yīng)的重要問(wèn)題是檢測(cè)標(biāo)記或目標(biāo)分子到生物傳感器的該表面或該捕捉分子的非特異性(non-specific)結(jié)合。這產(chǎn)生了背景信號(hào)，該信號(hào)降低了該生物傳感器的分析靈敏度和特異性。在診斷測(cè)定中，可以使用嚴(yán)格步驟降低非特異性結(jié)合。嚴(yán)格性步驟的目的是放棄不想要的無(wú)特異性吸附結(jié)合，并只保留捕捉分子和(標(biāo)記的)目標(biāo)分子之間的該特異性相互作用。最普通的嚴(yán)格性方法是洗滌步驟。仔細(xì)調(diào)節(jié)該洗滌液的成分和溫度來(lái)降低給定測(cè)定的背景。
集中于多重分析檢測(cè)正日益增加，其中在稱為生物芯片或(微)芯片的單一表面上同時(shí)測(cè)量許多不同的分子。該生物芯片表面由許多點(diǎn)組成(“捕捉點(diǎn)”)，每個(gè)點(diǎn)包含一個(gè)不同的捕捉分子或多個(gè)分子。難以開發(fā)多重分析傳感器的嚴(yán)格性整體芯片洗滌步驟，因?yàn)樾枰种贫鄠€(gè)可能的背景信號(hào)，同時(shí)不同特異性相互作用的范圍必須保持未受干擾，并且必須保持不同目標(biāo)和捕捉分子的自然狀態(tài)。其結(jié)果是較低的分析靈敏度和較低的分析特異性。該多重分析的嚴(yán)格性問(wèn)題對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)是非常嚴(yán)重的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是非常異質(zhì)性的，并且某個(gè)洗滌步驟對(duì)蛋白質(zhì)變性和對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的影響可以是非常明顯的。
在Macbeatch和Schreiber(2000)發(fā)表在科學(xué)雜志第289期第1760-1763頁(yè)的文章中已經(jīng)意識(shí)到蛋白質(zhì)陣列或微陣列的這個(gè)主要缺陷，其描述了在顯微玻璃玻片上的自然蛋白質(zhì)的應(yīng)用。通過(guò)在該捕捉分子與目標(biāo)分子結(jié)合之前添加BSA(胎牛血清)到該捕捉分子上，降低無(wú)特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合。關(guān)于蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的2002年12月(Macbeath(2002)發(fā)表在自然遺傳學(xué)(Nature Genetics)第32期第526-532頁(yè))的綜述性文章提出了評(píng)估特異性問(wèn)題作為蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的關(guān)鍵特征，而沒(méi)有建議可能的解決方案。到目前為止，蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的最成功應(yīng)用在免疫學(xué)領(lǐng)域獲得?？乖涂贵w之間的高結(jié)合強(qiáng)度允許嚴(yán)格性洗滌條件來(lái)克服抗原和抗體的無(wú)特異性相互作用。
處理該嚴(yán)格性問(wèn)題的化學(xué)方式是通過(guò)設(shè)計(jì)能夠與該目標(biāo)更加強(qiáng)烈地和更加特異性地相互作用的捕捉分子。一個(gè)例子是光適體，能夠攜帶光反應(yīng)基的合成捕捉分子，光反應(yīng)基能夠在該目標(biāo)分子(在Brody和Gold(2000)發(fā)表在生物工藝學(xué)第7期第5-13頁(yè)的文章中所綜述的)的特定點(diǎn)交聯(lián)。當(dāng)包含光適體的捕捉表面被暴露于該樣本，并且應(yīng)用光激活步驟時(shí)，適合該適體結(jié)合點(diǎn)的分子成為到那的共價(jià)鍵。隨后，可以應(yīng)用嚴(yán)格性的洗滌步驟來(lái)去除還沒(méi)有光反應(yīng)的分子。該光適體方法的缺點(diǎn)是它需要針對(duì)每個(gè)目標(biāo)的新的光適體設(shè)計(jì)，需要光激活步驟，光交聯(lián)步驟本身不能辨別特異性和無(wú)特異性結(jié)合的分子，并且它是終點(diǎn)檢測(cè)方法。
美國(guó)申請(qǐng)第2002/0001855號(hào)(Prentiss申請(qǐng))描述了檢測(cè)兩個(gè)分子之間結(jié)合強(qiáng)度的方法，其中將一個(gè)分子耦合到第一表面并將該分子與被磁性標(biāo)記的另一個(gè)分子接觸。然后將該第一表面接近于具有磁場(chǎng)的第二表面，該磁場(chǎng)將對(duì)該磁性標(biāo)記施加推力，并且依賴于該兩分子之間的結(jié)合強(qiáng)度，該磁場(chǎng)導(dǎo)致它們的分離。這個(gè)系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是該第二表面和該磁性標(biāo)記(提供在第一表面上)之間的物理距離，其限制該測(cè)定的靈敏度。該第二表面是在其產(chǎn)生磁場(chǎng)梯度的裝置。該裝置被制作為小磁體的柵極。結(jié)果，該裝置具有接近于柵極表面的高磁場(chǎng)梯度區(qū)域。局部梯度的幅度和該高梯度區(qū)域延伸到該裝置外的距離由組成該柵極的磁元的元件和尺寸產(chǎn)生的磁場(chǎng)確定。該裝置的缺點(diǎn)是場(chǎng)梯度作為距離的函數(shù)快速下降。這樣，高梯度只存在于非常接近該柵極表面的地方。因此，該裝置不得不被放在非常接近于該生物結(jié)合表面的地方，而由于在該生物結(jié)合表面上面的樣本液體的存在和帶有蓋板的液室的存在，這通常是不可能的。
需要用于確定微生物實(shí)體例如生物活性分子之間的相互作用或結(jié)合的改進(jìn)方法、設(shè)備和工具的設(shè)計(jì)，特別是需要其中可以在不同強(qiáng)度的結(jié)合諸如特異性和無(wú)特異性結(jié)合之間進(jìn)行區(qū)分的方法。利用多重分析傳感器辨別特異性和無(wú)特異性結(jié)合是特別需要的，這里它能夠同時(shí)適用于大范圍的捕捉和目標(biāo)分子。需要蛋白質(zhì)多重分析傳感器，因?yàn)橹荒軌蛟诤苷南薅葍?nèi)修改緩沖條件來(lái)改善該多重分析傳感器上的嚴(yán)格性。而且，為了該方法在微陣列結(jié)構(gòu)中是實(shí)用的，需要在不丟失靈敏度的情況下縮小規(guī)模。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可替換的方法、設(shè)備和工具，用于確定微生物實(shí)體諸如生物活性分子，例如蛋白質(zhì)或DNA之間的相互作用，或生物活性分子和微生物實(shí)體諸如病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物、脂質(zhì)體或其中的片段特別是那些滿足如上所述的至少一個(gè)需要的實(shí)體之間的相互作用。
因此本發(fā)明公開了測(cè)定方法以及工具和設(shè)備，用于使用至少一個(gè)其為磁性的粒子或微載體例如珠子或微生物實(shí)體和也可以是微載體的第二粒子(例如第二珠子或微生物實(shí)體)，確定生物活性分子或其它微生物實(shí)體之間的相互作用。至少該第一粒子或微載體是磁性的。當(dāng)使用兩個(gè)珠子并且兩個(gè)珠子都為磁性時(shí)，該珠子優(yōu)選地在它們磁矩的大小上不同。提供裝置以允許在液體中的環(huán)境，促進(jìn)生物活性分子之間或生物活性分子和其它微生物實(shí)體之間或微生物實(shí)體之間的結(jié)合，和使得該結(jié)合處于機(jī)械應(yīng)力下以由此辨別不同強(qiáng)度的結(jié)合。一方面，例如，使用該第二珠子(具有較大磁矩)來(lái)磁性地去除聯(lián)接到具有較小磁矩的珠子上的目標(biāo)分子，該珠子被微弱地約束到捕捉分子上(捕捉分子本身通常耦合到移動(dòng)或不移動(dòng)的表面)。依照其它的實(shí)施例，機(jī)械摩擦力例如由流體流動(dòng)引起的力被施加到該至少一個(gè)粒子上，從而由此降低在該結(jié)合中的機(jī)械應(yīng)力。依賴于該實(shí)施例，該第一個(gè)珠子和/或第二個(gè)粒子可以被用于檢測(cè)目的。
明顯地，該第一和/或第二個(gè)粒子可以是單獨(dú)的粒子，但它也可以是粒子集合的一部分，例如一束粒子或一串粒子。
在存在磁場(chǎng)的情況下，成串的粒子容易形成。這些成串的粒子被容易地轉(zhuǎn)移到液體中。而且，所述成串粒子在它們的末端具有強(qiáng)的場(chǎng)梯度，其對(duì)于緊急特性有利。
一方面，本發(fā)明提供一種方法，其在磁場(chǎng)中使用第一和第二個(gè)粒子辨別在液體中的微生物實(shí)體之間的結(jié)合的不同強(qiáng)度，至少其中的一個(gè)粒子是磁性的，該使用包含提供在該液體中可移動(dòng)的第一粒子和第一微生物實(shí)體之間的復(fù)合體(complex)，為該第一微生物實(shí)體和第二微生物實(shí)體之間的結(jié)合提供在該液體內(nèi)的環(huán)境；將在該液體中可移動(dòng)的第二個(gè)粒子接近于該復(fù)合體；并且作用于該第一和/或第二粒子以施加機(jī)械應(yīng)力到該第一和第二微生物實(shí)體之間的該結(jié)合，同時(shí)施加該磁場(chǎng)以由此破壞第一強(qiáng)度的結(jié)合而不破壞第二更大強(qiáng)度的結(jié)合。在本發(fā)明的實(shí)施例中，將力直接施加到該第一和第二粒子以產(chǎn)生該粒子之間的相對(duì)推力。然后這個(gè)相對(duì)推力產(chǎn)生或引起該結(jié)合中的機(jī)械應(yīng)力。該第一和第二粒子應(yīng)該具有機(jī)械硬度，因此在粒子之間產(chǎn)生的該相對(duì)推力不會(huì)破壞該粒子而是破壞該結(jié)合。因此，該粒子可以包含剛性核心、支架或基體(matrxi)。結(jié)合強(qiáng)度的辨別可以用于辨別特異性和無(wú)特異性結(jié)合。該第一個(gè)微生物實(shí)體可以是目標(biāo)分子，并且該第二個(gè)微生物實(shí)體是捕捉分子，例如，當(dāng)兩者都在液體中時(shí)，捕捉分子能夠捕捉該目標(biāo)。第一和第二粒子都可以是磁性粒子，或只有一個(gè)需要是磁性的?？梢詫⒃摰谝淮判粤Ｗ玉詈系轿⑸飳?shí)體，而不需要將該第二磁性粒子耦合到微生物實(shí)體?？梢詫⒃摰谝淮判粤Ｗ玉詈系侥繕?biāo)微生物實(shí)體?？梢詫⒃摰谝淮判粤Ｗ拥脑摯盘匦杂糜诩性撃繕?biāo)，例如，通過(guò)施加場(chǎng)梯度到該液體，和將結(jié)合到該目標(biāo)的該磁性粒子吸引到特定位置。該第一和/或第二磁性粒子可以是順磁性的或任何其它磁性形式。
該第一磁性粒子可以具有較小的磁矩，例如，比該第二磁性粒子的磁矩小10倍?？商鎿Q地，該第一和第二粒子都是磁性的，并且具有相同的磁矩。該第一磁性粒子的尺寸可以小于該第二磁性粒子的尺寸。該第一磁性粒子優(yōu)選地具有在1nm到1μm范圍內(nèi)的直徑，例如，在10nm和200nm之間。該第二磁性粒子可以具有至少100nm的直徑。
該第一或第二微生物實(shí)體可以是任何適當(dāng)?shù)膶?shí)體，但在一些實(shí)施例中蛋白質(zhì)或肽是優(yōu)選的。典型地，多于一個(gè)的第一微生物實(shí)體和/或多于一個(gè)的第二微生物實(shí)體在該樣本中出現(xiàn)?？梢詫⒃摰谝换虻诙⑸飳?shí)體布置在陣列的捕捉點(diǎn)上。這對(duì)于檢測(cè)目的來(lái)說(shuō)是方便的。例如，該陣列可以包含至少10個(gè)在不同的捕捉點(diǎn)上的不同的捕捉微生物實(shí)體。捕捉點(diǎn)可以占據(jù)0、1和104μm2的空間。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，該第一和該第二粒子都被耦合到微生物實(shí)體。例如，該第一粒子可以被耦合到目標(biāo)微生物實(shí)體，然后該第二粒子被耦合到捕捉微生物實(shí)體。可替換地，該第一粒子可以被耦合到第一目標(biāo)微生物實(shí)體，該第二粒子可以被耦合到第二目標(biāo)微生物實(shí)體。該第一或第二微生物實(shí)體可以是抗體。單克隆抗體可以提供高水平的特異性到某些蛋白質(zhì)。
另一方面，只有該第一和第二粒子中的一個(gè)是磁性的，而另一個(gè)是非磁性的。該非磁性粒子可以大于該磁性粒子。本發(fā)明包括施加液體摩擦力到該第一或第二微生物實(shí)體。在這種情況下，由于尺寸的差異施加到該第二粒子上的該液體摩擦力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于施加到該第一粒子上的液體摩擦力。為了辨別結(jié)合的不同強(qiáng)度，可以使用不同尺寸的非磁性粒子。
施加的磁場(chǎng)可以在1.10-4到10特斯拉之間，例如，在0.01到0.1特斯拉之間。在該第一和第二粒子是磁性的情況下，該磁場(chǎng)可以在該第一和該第二粒子之間產(chǎn)生吸引力或排斥力，或變化的、振蕩的或交變的力。
本發(fā)明還包括將該結(jié)合的第一和第二微生物實(shí)體與第三磁性粒子接觸，其中該第三磁性粒子的磁矩大于該第一或第二磁性粒子的磁矩。
本發(fā)明還提供了一種方法，其使用第一和第二粒子辨別在諸如捕捉和目標(biāo)生物活性分子的捕捉和目標(biāo)微生物實(shí)體之間的第一和第二結(jié)合，該第一結(jié)合具有與該第二結(jié)合不同的強(qiáng)度，其中至少一個(gè)粒子是磁性的，該方法包含將帶有至少一個(gè)捕捉微生物實(shí)體的樣本與耦合到第一粒子的至少一個(gè)目標(biāo)微生物實(shí)體接觸，提供允許捕捉和目標(biāo)微生物實(shí)體之間結(jié)合的條件，在未耦合的捕捉微生物實(shí)體的情況下，將該樣本與未耦合的第二粒子接觸或?qū)⒃摌颖九c耦合到微生物實(shí)體的第二粒子接觸，施加磁場(chǎng)，辨別該目標(biāo)和該捕捉微生物實(shí)體之間的該結(jié)合是第一還是第二結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種設(shè)備或工具，用于辨別液體中微生物實(shí)體之間的不同強(qiáng)度的結(jié)合，該工具包含第一粒子和第二粒子，至少其中的一個(gè)是磁性的，第一和第二粒子在液體中都是可移動(dòng)的；裝置，其作用于該第一和第二粒子，并由此施加機(jī)械應(yīng)力到該第一和第二微生物實(shí)體之間的結(jié)合上并且辨別不同強(qiáng)度的結(jié)合，該施加機(jī)械應(yīng)力的裝置包含至少磁場(chǎng)發(fā)生器。該施加機(jī)械應(yīng)力的裝置可以包括施加液體摩擦力到該第一或第二粒子上的裝置。該工具可以進(jìn)一步包含布置在基板捕捉點(diǎn)上的微生物實(shí)體的陣列。該工具還可以包含用于產(chǎn)生勵(lì)磁的裝置，該勵(lì)磁推動(dòng)該粒子相對(duì)于該陣列的橫向移動(dòng)。
該工具可以用于特異性結(jié)合的生物活性分子的識(shí)別、分離、提純。該工具優(yōu)選地制造為微流體設(shè)備。
從屬權(quán)利要求限定了本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例。
現(xiàn)在將參考下列附圖描述本發(fā)明。


圖1-4示出了本發(fā)明的不同實(shí)施例，而圖5-6指的是現(xiàn)有技術(shù)。在所有的圖中，通過(guò)開圓(1)和密閉涂滿的圓(2)表示珠子。捕捉分子(C)被劃上點(diǎn)，目標(biāo)分子(T)被劃上線。所示出的配置指的情形是捕捉和目標(biāo)分子彼此結(jié)合并且珠子已經(jīng)移動(dòng)到近得足以施加分裂力到該目標(biāo)捕捉混合物上。
圖1根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例表示微陣列的細(xì)節(jié)，其中第二磁性珠子(2)施加吸引力到與目標(biāo)分子耦合的該磁性珠子(1)上。
圖2-4根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例表示結(jié)合到捕捉分子的目標(biāo)分子，其中第二珠子(2)施加排斥力到磁性珠子(1)上。在圖2和圖3中，分別是一個(gè)和兩個(gè)目標(biāo)分子被結(jié)合到捕捉分子。在圖4中該第二珠子(2*)是非磁性的，而該排斥力是磁性力和液體摩擦力(以*表示)。
圖5是依據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例能夠執(zhí)行圖1或2的方法的設(shè)備示意圖。
圖6是依據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例能夠執(zhí)行圖4的方法的設(shè)備示意圖。
相對(duì)于特定實(shí)施例，并參考某些附圖將描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此，而僅僅限于權(quán)利要求書。所描述的附圖只是示意性的和非限制性的。在該附圖中，為了說(shuō)明目的，一些元件的尺寸被放大，并且沒(méi)有按比例繪制。在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中使用屬于術(shù)語(yǔ)“包含”的地方，不排除其它的元件或步驟。當(dāng)指單數(shù)名詞時(shí)使用不定冠詞或定冠詞例如“a”或“an”的地方，這包括那個(gè)名詞的復(fù)數(shù)，除非專門聲明一些其它情況。
而且，在該說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語(yǔ)第一、第二、第三和類似的術(shù)語(yǔ)是用于區(qū)分相似的元件，而不是必須來(lái)描述有順序的次序或年月日次序。能夠理解，如此使用的術(shù)語(yǔ)在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下是可互換的，并且在此描述的本發(fā)明的實(shí)施例能夠在除在此描述和說(shuō)明的順序之外的其它順序中操作。
而且，在該說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語(yǔ)頂部、底部、在上方、在下方和類似的術(shù)語(yǔ)是為了描述性的目的而使用的，對(duì)于描述相對(duì)位置不是必須的。能夠理解，如此使用的術(shù)語(yǔ)在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下是可互換的，并且在此描述的本發(fā)明的實(shí)施例能夠在除在此描述和說(shuō)明的方位之外其它方位中操作。
本發(fā)明是以觀察為基礎(chǔ)的，該觀察在通常情況下是針對(duì)微生物實(shí)體之間(例如，在病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和諸如抗體的生物活性分子之間。該相互作用將通常是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或肽-肽相互作用)或生物活性分子之間(例如，肽-肽或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)的相互作用的檢測(cè)，特別是針對(duì)多重分析傳感器，通過(guò)物理(緊迫)力去除微弱地或非特異性地結(jié)合的分子是有優(yōu)勢(shì)的，該物理力獨(dú)立于該捕捉分子-目標(biāo)相互作用的精確物理化學(xué)本性。更一般地，本發(fā)明的目的是辨別生物活性分子或微生物實(shí)體之間的弱的和強(qiáng)的相互作用，或者辨別第一相互作用和第二較弱相互作用。
該方法應(yīng)該能夠施加的最小力可以從F_min＝E_min/w_max估計(jì)出，其中E_min是相互作用的最低能量，w_max是相互作用的最大長(zhǎng)度規(guī)(length scale)。E_min由熱能給定，在該熱能上生物活性分子或其它微生物實(shí)體之間的相互作用發(fā)生。w_max的值由生物學(xué)相互作用(例如，離子鍵(ionic)、范德華力(van der Waals)、氫鍵(hydrogenbond)、疏水鍵(hydrophobic)/親水鍵(philic)、空間(storic))的最大相互作用范圍確定。以E_min＝kbT，T＝300K和w_max＝40nm，結(jié)果為0.1pN的最小力，該結(jié)果是由本發(fā)明的實(shí)施例獲得的。
本發(fā)明提供物理方法來(lái)抑制多重分析生物芯片中的背景信號(hào)。涉及兩種類型的粒子，例如，在它們的磁矩上相差巨大的兩種類型的磁性粒子，例如，一個(gè)或多個(gè)數(shù)量級(jí)(i)第一珠子或微生物實(shí)體諸如類鐵蛋白磁性蛋白質(zhì)或作為檢測(cè)標(biāo)記一部分的在尺寸上較小的一些磁體；和(ii)第二珠子或微生物實(shí)體諸如類鐵蛋白磁性蛋白質(zhì)或一些磁體或磁單元諸如磁螺旋磁體結(jié)構(gòu)(magnetospirrillummagnetotac-tum)。例如，當(dāng)使用珠子時(shí)，該第二珠子可以在尺寸上較大以吸引和傳送小珠子。該大和小粒子之間的力在皮可牛頓范圍內(nèi)，足以在強(qiáng)的和弱的生物分子相互作用之間進(jìn)行辨別。該方法可應(yīng)用于大范圍的檢測(cè)原理和設(shè)備設(shè)計(jì)?；瘜W(xué)的和物理的嚴(yán)格方法可以與本發(fā)明結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，施加物理力的實(shí)踐方式依賴于至少一個(gè)磁性的或順磁性的粒子或微載體，例如，珠子或微生物實(shí)體。依據(jù)本發(fā)明，粒子或微載體可以是任何形狀，例如，以球形、圓柱形、桿狀形、立方形、橢圓形等的形式，或可以具有變化的形狀諸如細(xì)菌、磁小體(magnetosome)、脂質(zhì)體或原生動(dòng)物。當(dāng)磁性微載體或粒子被耦合到生物活性分子時(shí)，可以經(jīng)由磁場(chǎng)梯度施加力。施加到磁性微載體或粒子上的該力F等于F=▿(m.B)≅m▿B]]>方程式(1)m是該微載體或粒子的磁矩，B是該磁場(chǎng)。該右手邊的近似值應(yīng)用于由例如磁性飽和引起的常量粒子力矩。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，使用第一微載體或粒子(例如諸如珠子的標(biāo)記)和諸如第二珠子的第二微載體或粒子(例如第二磁性或非磁性珠子)的結(jié)合產(chǎn)生該磁力，可以將該第二磁性或非磁性珠子與該第一磁性珠子很近地接觸。
接下來(lái)將主要參考珠子的使用描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不限于該珠子的使用。下面參考“第一珠子”和“第二珠子”，但對(duì)“第一”或“第二”還有術(shù)語(yǔ)“珠子”的解釋都不應(yīng)該有限制。在這個(gè)發(fā)明中所使用的“珠子”不意味著該珠子在形狀上是球形的，而可以是任何適當(dāng)?shù)男螤?，例如，以球形、圓柱形或桿狀形、立方形、橢圓形等的形式，或可以沒(méi)有限定或恒定的形狀。而且，盡管在下面使用了術(shù)語(yǔ)“珠子”，但本發(fā)明包括諸如微生物實(shí)體的粒子的使用，例如，磁小體、細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)混合物，作為上述珠子的等價(jià)物，它們是磁性的或非磁性的。例如，磁小體是在磁性的細(xì)菌中自然產(chǎn)生并從那里分離的磁性粒子，并且可以起磁性珠子的作用，然而，脂質(zhì)體是典型的合成粒子，其可以用作為非磁性珠子。
相似的考慮適用于術(shù)語(yǔ)“生物活性分子”。在下面，將主要參考生物活性分子，然而，本發(fā)明包括微生物實(shí)體的使用，諸如磁小體、細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、脂質(zhì)體、或它們中任何一個(gè)的片段，還有蛋白質(zhì)混合物，作為上述分子的等價(jià)物。術(shù)語(yǔ)“微生物實(shí)體”應(yīng)該被廣義解釋。它包括生物活性分子，諸如蛋白質(zhì)、肽、RNA、DNA、脂質(zhì)、磷脂和碳水化合物或相似物。該術(shù)語(yǔ)生物活性分子還包括細(xì)胞片段，諸如細(xì)胞膜的部分，特別是能夠包含受體的細(xì)胞膜部分。該術(shù)語(yǔ)生物活性分子還涉及到小的化合物，其能夠潛在地結(jié)合生物活性分子。這里的例子是配合體、促效劑(agonist)、對(duì)抗劑、抑制劑、或調(diào)諧劑。該生物活性分子可以是分離的或合成的分子。合成分子可以包括非自然產(chǎn)生的化合物，諸如被修改的氨基酸或核苷酸?？商鎿Q地，該生物活性分子可以出現(xiàn)在溶菌產(chǎn)物、細(xì)胞片段、細(xì)胞器、完整細(xì)胞或生物體(例如，病毒或細(xì)菌)內(nèi)。該生物活性分子還可以出現(xiàn)在諸如血液或血清或其它體液或分泌物的介質(zhì)內(nèi)，或任何其它包含諸如血液、水標(biāo)本和其它的生物活性分子的標(biāo)本。該術(shù)語(yǔ)“微生物實(shí)體”還可以包括病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和其它細(xì)胞生物體，或它們的片段、或部分或諸如磁小體的細(xì)胞生物體器官、或諸如脂質(zhì)體的合成的微生物體。
分子之間的相互作用指的是結(jié)合，并包括弱結(jié)合(通常是無(wú)特異性或非特異性)和強(qiáng)結(jié)合(通常是特異性結(jié)合)。該術(shù)語(yǔ)“弱的”、“無(wú)特異性的”和“強(qiáng)的”、“特異性的”結(jié)合不是必需涉及一定程度的或絕對(duì)強(qiáng)度的結(jié)合，而是限定相對(duì)的關(guān)系，也就是說(shuō)該“強(qiáng)的”或“特異性的”結(jié)合比該“弱的”或“非特異性的”或無(wú)特異性的結(jié)合強(qiáng)。將生物活性分子之間的弱結(jié)合理解為其力低于0.1pN的結(jié)合。
在本發(fā)明中確定的稱為“目標(biāo)”和“捕捉分子”的生物活性分子之間的相互作用可以是在任何所提到的所列舉的生物活性分子之間，并包括但不限于受體/配合體、受體/抑制體、酶/基底、抗體/抗原、DNA/RNA、RNA/RNA、病毒/分子、細(xì)菌/分子、脂質(zhì)體/分子等組合。所確定的優(yōu)選類型的相互作用是那些其中目標(biāo)或捕捉分子中的至少一個(gè)是蛋白質(zhì)或肽的相互作用。更優(yōu)選的類型的相互作用是那些其中目標(biāo)和捕捉分子都是蛋白質(zhì)或肽的相互作用。
依據(jù)本發(fā)明應(yīng)該給出涉及至少一個(gè)結(jié)合的分子和/或生物實(shí)體之間的相互作用以寬泛的解釋。下列復(fù)合體僅作為例子給出-結(jié)合到捕捉分子上的目標(biāo)分子，-結(jié)合到與第二目標(biāo)分子相結(jié)合的捕捉分子上的第一目標(biāo)分子，-結(jié)合到病毒的捕捉分子，-結(jié)合到與第二捕捉分子相結(jié)合的病毒上的第一捕捉分子，-病毒/細(xì)胞分子復(fù)合體。
通過(guò)為其中的一個(gè)粒子是磁性的兩個(gè)粒子系統(tǒng)選擇該恰當(dāng)?shù)沫h(huán)境，可以獲得靈敏度的提高。使用磁性珠子來(lái)分離和集中生物活性分子是眾所周知的(例如，B.Sinclair，“To bead or not to beadApplications of magnetic bead technology(到珠子或不到珠子磁性珠子技術(shù)的應(yīng)用)”，Scientist 12(13)，第17頁(yè)，1998年6月22日；或“The Immunoassay Handbook(免疫測(cè)定手冊(cè))”，DavidWild編寫，(倫敦自然出版社，2001年，ISBN 1-56159-270-6)；或Urs Hfeli等編寫的“Scientific and Clinical Applications ofMagnetic Carriers(磁性載體的科學(xué)和臨床應(yīng)用)”，紐約Plenum出版社，1997年，ISBN0-306-45687-7)。在這些應(yīng)用中，將捕捉分子耦合到磁性珠子，然后，施加磁力來(lái)去除或集中該結(jié)合的目標(biāo)。通常以具有1μm或更大尺寸的珠子執(zhí)行這些實(shí)驗(yàn)，該珠子顯著大于蛋白質(zhì)的10nm的平均尺寸。雖然在本發(fā)明的上下文中用到這些珠子，但由于位阻現(xiàn)象它們的尺寸會(huì)在微陣列結(jié)構(gòu)中提供明顯的缺陷。位阻現(xiàn)象限制了感應(yīng)的動(dòng)態(tài)范圍和捕捉點(diǎn)規(guī)模的縮減。規(guī)模的縮減對(duì)于捕捉點(diǎn)來(lái)說(shuō)是所需要的，因?yàn)榫哂休^高濃度的捕捉分子的較小捕捉點(diǎn)將引起每單位面積較高的目標(biāo)集中，并提供該感應(yīng)的更大信噪比。從而，這將允許在微陣列中獲得所需的靈敏度。
一方面，將至少該第一珠子附著到生物活性分子，并且不將該第二珠子附著到生物活性分子。然而，根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例，可以將生物活性分子附著到該第一和第二珠子。更加優(yōu)選地，在這種情況下，該生物活性分子將是不同的。
至少其中之一是磁性的或順磁性的珠子以這樣一種方式被使用，即磁場(chǎng)或其它類型的力場(chǎng)的應(yīng)用將導(dǎo)致移去在目標(biāo)-捕捉分子相互作用中的非特異性結(jié)合的目標(biāo)。術(shù)語(yǔ)“磁性”包括任何適當(dāng)形式的磁性粒子，例如，磁性的，順磁性的，超順磁性的，鐵磁的，即在磁場(chǎng)中產(chǎn)生永久性或暫時(shí)性磁偶極子的任何形式的磁性。對(duì)于執(zhí)行本發(fā)明，在該珠子的形狀上沒(méi)有限制，但球形粒子是目前以可靠方式最容易和最便宜地加工的。為了改善該磁引力，可以提供帶有磁性不規(guī)則的珠子，例如加到該表面上的高彎曲率粒子、突出、針等。珠子也可以具有例如由于非球形形狀的永久磁矩。本發(fā)明的優(yōu)選磁性珠子是超順磁性的粒子。這些粒子通常由一個(gè)或多個(gè)小的鐵磁材料的球形核心(3-30nm)組成。由于它們的小尺寸，這些核心由單一磁疇組成。在超順磁性珠子的情況下，磁矩由外部場(chǎng)產(chǎn)生。由于球形形狀，該磁矩可以容易地在該粒子內(nèi)旋轉(zhuǎn)。超順磁性粒子具有的優(yōu)點(diǎn)是，它們的磁矩在缺少施加場(chǎng)的情況下消失，其然后最小化磁聚集。具有非球形形狀和/或較大核心的粒子的優(yōu)點(diǎn)是該磁矩通常很大，其便于磁性操縱。可以通過(guò)應(yīng)用諸如交變磁場(chǎng)的勵(lì)磁方法消除粒子的聚集。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，兩個(gè)珠子都是磁性珠子，最優(yōu)選地是帶有不同磁矩的珠子。其中一個(gè)珠子是非磁性的(磁矩＝0)的一組珠子也被包括在本發(fā)明的這個(gè)方面內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例(如在例子中所描述的)，這兩個(gè)珠子可以具有相同的磁矩。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，將該相互作用的分子之一耦合到磁性珠子。優(yōu)選地，將該目標(biāo)鏈接到本發(fā)明的第一珠子。然而，能夠理解在本發(fā)明范圍內(nèi)也設(shè)想了一些布置，其中將該捕捉分子耦合到該磁性珠子之一，或者其中將不同的捕捉分子每個(gè)都耦合到磁性珠子。
根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，該第一珠子可以具有小于、等于或甚至大于該第二珠子的尺寸。然而優(yōu)選的是，當(dāng)將該第一珠子附著到目標(biāo)生物分子時(shí)，為了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)該第一珠子小于該第二珠子，該優(yōu)點(diǎn)將進(jìn)一步詳細(xì)地解釋。該第一和第二珠子可以具有相同的組成。在這種情況下，該能夠獲得的磁矩與該珠子的尺寸相關(guān)。然而，可以設(shè)想某些實(shí)施例，其中第一和第二珠子的組成是不同的。在這種情況下，尺寸和磁矩之間的相關(guān)性被分開。
該第一和第二珠子的尺寸本質(zhì)上不是本發(fā)明的限制因素。然而，為了檢測(cè)生物芯片上的相互作用，小尺寸化的珠子將有優(yōu)勢(shì)。當(dāng)微米尺寸的珠子被用作標(biāo)記時(shí)，它們限制規(guī)模的縮減，因?yàn)槊總€(gè)標(biāo)記占據(jù)至少1μm2的面積?？梢匀缦鹿烙?jì)所得到的生物芯片尺寸在每個(gè)捕捉點(diǎn)上，需要收集至少1000個(gè)粒子來(lái)得到3％(N-1/2)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算偏差。為了獲得1000的動(dòng)態(tài)范圍，每個(gè)點(diǎn)需要至少1000×1000＝106μm2的面積。1000叢生物芯片將需要針對(duì)該捕捉點(diǎn)的1000×106μm2＝10cm2的總面積，加上這些點(diǎn)之間的開放面積等。這對(duì)于生物芯片來(lái)說(shuō)是非常大的，為了具有成本效益，其必須在mm2范圍內(nèi)而不是在cm2范圍內(nèi)。進(jìn)一步地，對(duì)于將通常在該表面上產(chǎn)生高于每平方微米一個(gè)的目標(biāo)濃度的測(cè)定條件(例如，目標(biāo)濃度，捕捉探測(cè)吸引力，該表面上的捕捉探測(cè)密度)，由于位阻現(xiàn)象微米尺寸的珠子不適合作為標(biāo)記。而且，小粒子具有更好的擴(kuò)散特性，并且通常顯示比大粒子更低的沉降趨勢(shì)。
根據(jù)本發(fā)明，該第一珠子優(yōu)選地處于1和500納米之間的尺寸范圍，更優(yōu)選地處于5和100納米之間。根據(jù)本發(fā)明，該第二珠子優(yōu)選地處于50nm和5微米之間的尺寸范圍。然而，兩個(gè)珠子可以具有在3nm到5微米范圍的相同尺寸。
依據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，在使用磁性或順磁性珠子的地方，磁場(chǎng)的施加能夠?qū)е略摰谝缓驮摰谝恢樽?其中兩個(gè)珠子都是磁性的)之間的排斥和/或吸引，或由于磁場(chǎng)梯度導(dǎo)致該珠子之一移動(dòng)。本發(fā)明的被用來(lái)構(gòu)成珠子的粒子可以由磁化的或可磁化的材料組成，但也可以是實(shí)心的或多孔的材料諸如聚合物，磁性粒子可以被附著到或被結(jié)合到該材料上。在珠子中與另一種材料合成的磁性粒子的使用使得分離該珠子的磁矩和尺寸之間的直接關(guān)系成為可能。珠子中磁性粒子復(fù)合體的使用還允許該珠子重量的修正。珠子中磁性粒子復(fù)合體的使用還允許結(jié)合官能團(tuán)，用于與蛋白質(zhì)和/或檢測(cè)標(biāo)記反應(yīng)，例如，發(fā)色團(tuán)。包含磁性材料的珠子的眾所周知的例子是DynabeadsTM。DynabeadsTMM450(直徑4.5微米)可以被涂上單體環(huán)氧化物，導(dǎo)致環(huán)氧基和羥基的混合物。Dynabeads M-280(直徑2.8微米)是具有羥基的聚苯乙烯珠子，該羥基可以通過(guò)與p甲苯磺酰氯化物反應(yīng)被轉(zhuǎn)換成tosyloxy(甲苯磺?；?。
磁性珠子被廣泛用于生物分析中，例如用于高生產(chǎn)量的臨床免疫測(cè)定儀器、樣本提純、細(xì)胞萃取等。幾個(gè)診斷公司(Roche、Bayer、Johnson&Johnson、Abbott、BioMerieux等)制造和銷售帶有磁性珠子的試劑，例如用于免疫測(cè)定、核酸萃取和樣本提純。磁性珠子以各種尺寸在商業(yè)上可利用，范圍從納米到微米。為了本發(fā)明中將該珠子附著或結(jié)合到該生物活性分子，該珠子可以攜帶官能團(tuán)，諸如羥基、羧基、醛基或氨基。這些官能團(tuán)的提供通常是，例如，通過(guò)處理未涂層的單分散性的、超順磁性的珠子從而提供聚合物的表面涂層，該聚合物攜帶這些官能團(tuán)之一，例如，聚氨酯結(jié)合聚乙二醇來(lái)提供羥基，或纖維素衍生物來(lái)提供羥基，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚體來(lái)提供羧基，或乙?；被?aminoalkylated)聚合物來(lái)提供氨基。美國(guó)專利4654267描述了許多這些表面涂層的介紹。根據(jù)美國(guó)專利4336173、4459378和4654267，可以通過(guò)這些珠子的修改準(zhǔn)備其它的涂層粒子。例如，以HNO3處理從苯乙烯-二乙烯基苯和以3.15μm的直徑準(zhǔn)備的大網(wǎng)格多孔聚合物粒子，從而在該孔的表面引進(jìn)亞硝酸(-NO2)基。然后該粒子在Fe2+的水溶液中被分散。該Fe2+被亞硝酸基氧化，該亞硝酸基導(dǎo)致不能溶解鐵和氫氧根的化合物在該孔中的沉淀。在加熱之后，該鐵作為磁鐵氧化物的精細(xì)劃分的顆粒存在于整個(gè)多孔粒子的容量中。該亞硝酸基通過(guò)與Fe2+反應(yīng)被降低為NH2基。為了填滿該孔和在該表面引進(jìn)所需的官能團(tuán)，使不同的單體聚合在該孔中和在該表面。在優(yōu)選類型粒子的情況下，該表面攜帶通過(guò)-(CH2CH2O)的8-10個(gè)鍵連接到該聚合主鏈的-OH基。其它優(yōu)選例攜帶通過(guò)甲基苯烯酸的聚合獲得的-COOH基。例如，最初存在于該珠子中的NH2氨基可以與二環(huán)氧化物反應(yīng)，如在美國(guó)專利4654267中所描述的，接下來(lái)與甲基丙烯酸反應(yīng)來(lái)提供終端乙烯基。與甲基丙烯酸的溶液共聚合產(chǎn)生攜帶終端羧基的聚合物涂層，正如在下參考的R452珠子中。類似地，通過(guò)使二胺與上述與二環(huán)氧化物反應(yīng)的產(chǎn)品反應(yīng)，可以引入氨基，同時(shí)與諸如氨基甘油酯(aminoglycerol)之類的羥胺的反應(yīng)引入羥基。
通過(guò)使用聯(lián)結(jié)分子用于粒子和生物活性分子之間的交聯(lián)，生物活性分子到珠子的耦合可以是不可逆的但也可以是可逆的。這種聯(lián)結(jié)的例子包括帶有某一蛋白分解識(shí)別部位的肽，用于某一限制性酶的帶有識(shí)別部位的寡核苷酸序列，或如那些包含可還原的二硫化物基的化學(xué)可逆交聯(lián)基。各種可逆交聯(lián)基可以從Pierce生物技術(shù)公司(羅克福德市，IL，美國(guó))獲得。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)該粒子的特性，完成目標(biāo)和捕捉分子之間的特異性相互作用的檢測(cè)(即，在去除非特異性結(jié)合的分子和/或標(biāo)記之后)，該粒子被連接到該生物分子上，并且根據(jù)本發(fā)明大部分實(shí)施例該粒子為第一粒子。優(yōu)選根據(jù)第一粒子的磁特性來(lái)完成所述檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，將磁場(chǎng)施加到包含本發(fā)明的第一和第二珠子的樣品上?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方式施加磁場(chǎng)，從而提供對(duì)磁性珠子的不同效果，如在本發(fā)明中所描述的。磁場(chǎng)應(yīng)當(dāng)大到足以在一個(gè)或兩個(gè)粒子中產(chǎn)生該磁矩的方位，優(yōu)選地使兩個(gè)粒子中磁矩飽和。所需要的場(chǎng)依賴于粒子的類型(例如，超順磁性的，鐵磁的，球形的或非球形的)。根據(jù)本發(fā)明，該場(chǎng)處于1.10-4特斯拉到10特斯拉的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在0.01到1特斯拉之間的范圍內(nèi)。磁場(chǎng)可以由永久磁鐵或由電磁鐵例如螺線管產(chǎn)生。變化的場(chǎng)可以通過(guò)變化磁鐵線圈中的電流產(chǎn)生，但也可以通過(guò)磁性材料(硬磁或軟磁)的機(jī)械移動(dòng)產(chǎn)生。
磁場(chǎng)梯度可以接近于電流電線產(chǎn)生，但也可以通過(guò)在磁性材料中具有彎曲的或尖銳的形狀產(chǎn)生。施加到該磁性粒子的場(chǎng)梯度的范圍從0.01T/m到105T/m，優(yōu)選地在0.1T/m和104T/m之間。
結(jié)合的目標(biāo)分子的檢測(cè)或磁性珠子的檢測(cè)可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒▽?shí)現(xiàn)，例如，磁性地。例如，該檢測(cè)的執(zhí)行可以通過(guò)使用磁阻傳感器或通過(guò)磁感應(yīng)方法等，通過(guò)機(jī)械方法(表面波或體聲波、石英微量天平、振動(dòng)膜等)，光學(xué)方法(表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振、光干涉、衍射、表面加強(qiáng)的共振喇曼散射、光散射等)，電子方法(傳導(dǎo)、借助于該粒子的化學(xué)顯影等)，或者甚至使用其它的分析工具諸如質(zhì)譜分析。該珠子為合成檢測(cè)標(biāo)記的一部分屬于本發(fā)明的范圍，例如，包含附加的光學(xué)活性成分、附加的電活性成分等。檢測(cè)可以光學(xué)地(例如，通過(guò)熒光、漸消失場(chǎng)引起的熒光、熒光偏振、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、表面加強(qiáng)的喇曼散射等)、電子地(例如，經(jīng)由傳導(dǎo)、通過(guò)氧化還原電流等)、機(jī)械地等產(chǎn)生。特別的標(biāo)記設(shè)計(jì)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，諸如
-帶有金屬覆蓋層的磁芯，例如用于加強(qiáng)的穩(wěn)定性、傳導(dǎo)特性、光學(xué)特性(例如，散射、細(xì)胞質(zhì)基因組共振)等。
-被光學(xué)活性成份圍繞的一個(gè)或多個(gè)磁芯。
-被(生物)化學(xué)活性分子例如酶類、氧化還原分子、氧化還原酶圍繞的一個(gè)或多個(gè)磁芯。
-涂覆有有機(jī)層例如生物活性和/或其它官能化合物被耦合到其上的右旋糖酐(dextrane)的一個(gè)或多個(gè)磁芯。
-被封裝在聚合物球體例如聚苯乙烯(通常稱為橡膠)、PMMA內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)磁芯。在該聚合物矩陣中其它的信號(hào)分子(例如，熒光團(tuán))可以被嵌入或被共聚合。
-生物活性磁性粒子諸如鐵蛋白。
-帶有磁性和/或檢測(cè)成分例如磁小體、脂質(zhì)體的囊泡。
磁性納米粒子(nanoparticle)和技術(shù)的應(yīng)用的例子也可以在最近的參考文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，諸如“Bioconjugated nanoparticles in mo-lecular diagnostics and therapy”，2003年5月22-24日，耶拿(德國(guó))。參見www.ipht-jena.de/BEREICH_3/molnano/nanopar-ticles2003/和“2nd internation meeting on the diagnosticsapplications of magnetic microspheres(關(guān)于磁性微球的診斷應(yīng)用的第二次國(guó)際會(huì)議)”，2003年6月12-13日，法國(guó)，巴黎。
在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一珠子可以攜帶用于檢測(cè)的附加標(biāo)簽，諸如，但不限制于抗原、生色團(tuán)、親和標(biāo)記。當(dāng)該珠子用于與檢測(cè)標(biāo)簽反應(yīng)的附加的官能團(tuán)，正如對(duì)于聚合物金屬珠子的情況的時(shí)候，可以容易地將用于檢測(cè)的標(biāo)簽應(yīng)用到磁性珠子上。在本領(lǐng)域中已知幾項(xiàng)技術(shù)來(lái)耦合標(biāo)簽到珠子，例如，直接通過(guò)官能團(tuán)，或間接通過(guò)交聯(lián)劑或系鏈，或者使用中間分子諸如生物素/抗生蛋白鏈菌素。
第一實(shí)施例根據(jù)圖1示意性示出的本發(fā)明的第一實(shí)施例，執(zhí)行生物分子之間相互作用的檢測(cè)，由此該生物分子之一C(優(yōu)選地指該捕捉分子)被直接地耦合到表面5，例如，當(dāng)該表面5包含諸如該捕捉分子結(jié)合到其上的聚合物的材料時(shí)，或者間接地通過(guò)聯(lián)結(jié)分子3耦合到表面5。如在此使用的表面5涉及適合用生物分子直接(例如，通過(guò)交聯(lián))或間接地涂層的固定基底、基質(zhì)或網(wǎng)格，諸如玻璃、塑料、有機(jī)晶體或無(wú)機(jī)晶體(例如，硅)、無(wú)定形有機(jī)或無(wú)定形無(wú)機(jī)材料(例如，氮化硅、氧化硅、氮氧化硅、氧化鋁)。適當(dāng)?shù)谋砻娌牧虾吐?lián)結(jié)化學(xué)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并且被描述在例如“Diagnostic BiosensorPolymers(診斷生物傳感器聚合物)”，作者A.M.Usmani和N.Akmal，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)，1994年專題討論會(huì)圖書系列556，美國(guó)華盛頓DC，1994年，“Protein Architecture，Interfacing Molecular Assembliesand Immobilization Biotechnoloty(蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分界面分子組合和固定生物技術(shù))”，Y.Lvov和H.Mhwald編輯(Marcel Dekker，紐約，2000年)，“The Immunoassay Handbook(免疫測(cè)定手冊(cè))”，作者David Wild(倫敦自然出版社，2001年，ISBN 1-56159-270-6)或“Handbook of Biosensors and Electronic Noses.Medicine，F(xiàn)oodand the Environment(生物傳感器和電子鼻子手冊(cè)。醫(yī)學(xué)、食物和環(huán)境)”，Kress-Rogers(ISBN 0-8493-8905-4)。
本發(fā)明可以在平面?zhèn)鞲衅鞅砻?例如，平面玻璃生物芯片)上執(zhí)行，而且可以在流體通過(guò)的系統(tǒng)中執(zhí)行(例如，由包含微珠子的多孔氧化鋁、多孔硅或多孔圓柱組成的流體通過(guò)傳感器)。
根據(jù)第一實(shí)施例的一個(gè)方面，將每個(gè)具有不同磁矩的兩個(gè)珠子1、2用于調(diào)節(jié)，例如最小化捕捉分子-目標(biāo)分子相互作用的檢測(cè)中的非特異性結(jié)合，如圖1示意性示出的。包含已知或一個(gè)(或多個(gè))假定目標(biāo)T的生物分子之一或混合物被聯(lián)結(jié)(直接或間接地)到該第一珠子1。該第一珠子1具有比該第二珠子2小的磁矩。用一個(gè)或優(yōu)選地選擇的捕捉分子C涂層該表面5。該涂層的表面與該目標(biāo)/混合物接觸，并伴有或之前添加具有較大磁矩的該第二珠子2，該第二珠子本身沒(méi)有被耦合到生物分子。施加充分的磁場(chǎng)M(該圖表示平面外的磁場(chǎng)，但這不是必需的)將導(dǎo)致吸引該第一珠子1到該第二珠子2。選擇該第一和第二珠子1、2的磁矩和該磁場(chǎng)M的強(qiáng)度，使得標(biāo)記生物分子T與該捕捉分子C或與該表面5的較弱或非特異性的相互作用導(dǎo)致該分子T的去除，即，該目標(biāo)和捕捉分子T、C之間結(jié)合的破壞。另一方面，選擇該第一和第二珠子1、2的磁矩和該磁場(chǎng)M的強(qiáng)度，使得較強(qiáng)的例如特異性的目標(biāo)-捕捉分子的相互作用將不會(huì)被該兩個(gè)珠子1、2之間的磁引力破壞，并能夠被檢測(cè)到。
這個(gè)實(shí)施例的幾個(gè)應(yīng)用被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，將已知配合體的結(jié)構(gòu)相關(guān)的類似物的集合或大量小化合物(捕捉分子)的集合應(yīng)用到表面，由此將單一蛋白質(zhì)(目標(biāo)分子)用來(lái)測(cè)定該蛋白質(zhì)到配合體類似物的弱、中和強(qiáng)的結(jié)合。這使得發(fā)現(xiàn)被測(cè)定蛋白質(zhì)的顯效劑和對(duì)抗劑的假定導(dǎo)向化合物?？梢砸詭讉€(gè)蛋白質(zhì)使用相似的測(cè)定。這里，弱或強(qiáng)地結(jié)合的蛋白質(zhì)將給出可能副作用的指示。
可以執(zhí)行相似的測(cè)定，其中將蛋白質(zhì)成份連接到表面，并且該小的化合物處于溶液中，這依賴于是否容易地聯(lián)結(jié)小的化合物到該表面或到該磁性珠子。
本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例也可以用于蛋白質(zhì)工程。被引導(dǎo)的或隨機(jī)誘變處理的蛋白質(zhì)位置的集合定位在網(wǎng)格表面，用于篩選某一化合物(小分子或其它單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì))的結(jié)合。以這種布置，蛋白質(zhì)可以被確定與它的標(biāo)準(zhǔn)配合體具有小的或修改的結(jié)合親合力，但也會(huì)顯示突變體，其表示修改的結(jié)合特性或修改的配合體特異性。根據(jù)在前例子的教導(dǎo)，可以為蛋白質(zhì)和DNA、RNA、碳水化合物、類脂、磷脂、其它細(xì)胞成分之間的相互作用設(shè)計(jì)相似的實(shí)驗(yàn)。也可以檢測(cè)細(xì)胞、囊泡、病原體和其它生物體。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例適合檢測(cè)生物活性分子，但也可以用于生物活性分子的分離和提純。
依據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例，所確定的優(yōu)選類型的相互作用是那些該捕捉和目標(biāo)分子都是蛋白質(zhì)的相互作用。關(guān)于這個(gè)的應(yīng)用是所謂的蛋白質(zhì)陣列，其中已知蛋白質(zhì)(捕捉分子)的集合被耦合到網(wǎng)格。包含目標(biāo)分子的生物樣本被該第一磁性珠子標(biāo)記，并被測(cè)定用于目標(biāo)分子和捕捉分子之間的結(jié)合。然后將該第二粒子用來(lái)識(shí)別或去除那些更加微弱地例如無(wú)特異性地結(jié)合到該捕捉分子的目標(biāo)分子。
為了辨別特異性結(jié)合和無(wú)特異性結(jié)合，本發(fā)明允許在不需要改變緩沖條件的情況下執(zhí)行這個(gè)方法。
當(dāng)在蛋白質(zhì)微陣列中工作時(shí)，該第一磁性珠子的尺寸是重要的。微米尺寸的磁性珠子可以被用作陣列傳感器中的標(biāo)記(例如，Baselt D.R.和Lee G.U.等，“A biosensor based on magnetroresistancetechnology(基于磁阻技術(shù)的生物傳感器)”，Biosensor and Bio-electronics 13(1998)，731-739)。盡管由于大的磁矩，可以容易地將磁力施加到大的珠子，但在諸如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)微陣列的實(shí)驗(yàn)中大珠子具有許多重大的缺陷-為了具有結(jié)合到該表面的良好機(jī)會(huì)，該標(biāo)記需要在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間周期內(nèi)與該傳感器表面相互作用。該珠子與該表面的相互作用效率相當(dāng)一部分是由該標(biāo)記的分散速度確定的。微米尺寸的粒子的分散是非常慢的(D～10-12m2/s，大約1秒內(nèi)1μm)，其增加了整個(gè)測(cè)定時(shí)間。
-該慢的分散速度、與該表面長(zhǎng)的相互作用時(shí)間和該粒子大的接觸面積增加了該大珠子以非特異的方式粘到該表面的機(jī)會(huì)。
-微米尺寸的粒子顯示對(duì)該測(cè)定有害的沉淀速度。
-微米尺寸的粒子對(duì)于流體流動(dòng)是敏感的。在測(cè)定期間，溶液經(jīng)常被補(bǔ)充或被攪拌(例如，在潛伏期)，并且不同的流體可以被連續(xù)應(yīng)用。當(dāng)大珠子被用作標(biāo)記時(shí)，通過(guò)這樣的流體運(yùn)動(dòng)它們可以以一種不可控的方式從該傳感器中裂開。結(jié)果，微米尺寸的標(biāo)記只能用作終點(diǎn)檢測(cè)，并且即使如果是那樣的話，流體操縱需要小心翼翼地執(zhí)行。
-小珠子可以以比大珠子更高的濃度分散在流體中(按照每單位體積內(nèi)的珠子數(shù)目)。這樣，小珠子產(chǎn)生較高的與該目標(biāo)分子和傳感器表面的相互作用速率。
這樣，使用具有低于微米尺寸的珠子是有優(yōu)勢(shì)的。這樣，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，使用亞微米磁性第一珠子，尺寸在500納米下至幾個(gè)納米的范圍。
當(dāng)使用小的粒子時(shí)，珠子的磁矩降低的問(wèn)題產(chǎn)生。該磁矩與該珠子的體積成比例，也與該珠子半徑的三次冪成比例。例如，尺寸為35nm和磁芯大約為10nm的超順磁性珠子具有大約10-18A.m2數(shù)量級(jí)的磁矩。即使以103T/m大的外部梯度，只能獲得1fN[方程式(1)]的力。這遠(yuǎn)不足以將生物活性分子之間的弱結(jié)合從強(qiáng)結(jié)合中分開。因此，這些小的粒子只有當(dāng)該場(chǎng)梯度有力地增加時(shí)被使用。
增加該磁性梯度的已知方式是通過(guò)使用具有非常強(qiáng)的彎曲或尖銳形狀的磁性材料。例如，頂點(diǎn)曲率為100微米的磁針在頂點(diǎn)產(chǎn)生大約1T/100微米＝104T/m的場(chǎng)梯度(假定磁性材料的飽和磁化值大約為1T)。然而，這個(gè)梯度快速下降，特別是當(dāng)從該頂點(diǎn)進(jìn)一步移動(dòng)超過(guò)100微米時(shí)。換句話說(shuō)，高的場(chǎng)梯度總是空間不均勻的，并且僅僅被局部應(yīng)用。因此，應(yīng)當(dāng)將產(chǎn)生該場(chǎng)梯度的該磁性材料盡可能接近需要被激活的該第一珠子。同時(shí)，該梯度產(chǎn)生方法不應(yīng)該擾亂在該傳感器兩端的該流體流動(dòng)(流體槽典型地具有50微米和更高的高度)和允許及時(shí)對(duì)該場(chǎng)的尺寸和方位以及該場(chǎng)梯度進(jìn)行簡(jiǎn)單地控制。
本發(fā)明在一方面提出了施加磁力到第一珠子的新方法，即通過(guò)該流體內(nèi)的第二磁性珠子動(dòng)態(tài)接近該第一珠子。該第二珠子的磁矩在該第一珠子上局部產(chǎn)生大的磁場(chǎng)梯度。這轉(zhuǎn)化成該第一和第二珠子之間強(qiáng)的磁相互作用。同時(shí)，由于它們較大的磁矩，可以以相對(duì)小的場(chǎng)梯度磁性激活該第二珠子，或者可以通過(guò)不同的方法激活它們。
該粒子的磁矩將確定該珠子之間的力和因此確定嚴(yán)格性。為了以捕捉和目標(biāo)分子之間漸增的結(jié)合強(qiáng)度逐步去除被標(biāo)記的捕捉分子，可以以帶有至少一種類型的第三磁性粒子的連續(xù)洗滌步驟執(zhí)行本發(fā)明的該方法，該第三磁性粒子具有漸增磁矩，這些磁矩大于第二磁性珠子的磁矩。這個(gè)逐步的洗滌也使得能夠在較窄的范圍內(nèi)評(píng)估捕捉和目標(biāo)分子之間的結(jié)合強(qiáng)度。產(chǎn)生漸增結(jié)合強(qiáng)度的逐步去除的另一方式，是通過(guò)在使用其磁矩隨著該施加場(chǎng)增加的珠子的同時(shí)連續(xù)施加較大的外部場(chǎng)。
根據(jù)上述實(shí)施例，有可能重新使用該第二珠子?？梢詫⑺鼈兘咏摰谝恢樽樱缓笕コ⑷醯亟Y(jié)合的第一珠子，然后從接近的初始點(diǎn)移開，接下來(lái)重新使用它們來(lái)去除該表面上其他地方的微弱地結(jié)合的第一珠子。
根據(jù)上述實(shí)施例，也有可能重新使用聯(lián)結(jié)到那些生物活性分子的第一珠子，該生物活性分子沒(méi)有被特異性地結(jié)合，并且通過(guò)結(jié)合到該第二珠子被去除。
可以以幾種方式設(shè)計(jì)根據(jù)上述實(shí)施例的目標(biāo)檢測(cè)-通過(guò)在該目標(biāo)結(jié)合到該傳感器表面之前將它們與小的磁性珠子耦合可以標(biāo)記該目標(biāo)?？梢砸云胀ǖ姆绞?例如，該珠子在它們的表面具有普通的蛋白質(zhì)結(jié)合化學(xué)性質(zhì))或以對(duì)捕捉分子(例如，攜帶磁性珠子的抗體)具有特異性結(jié)合的生物活性分子執(zhí)行該預(yù)標(biāo)記。
-在這些目標(biāo)已經(jīng)結(jié)合到該傳感器表面上之后可以再次以普通或特殊的方式將小的磁性珠子連接到該目標(biāo)。
-該測(cè)定可以是結(jié)合測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定、置換測(cè)定等。磁力施加到多分子復(fù)合體增加了分子分裂的機(jī)會(huì)。這可以幫助提高置換測(cè)定的速度，由于捕捉分子的高親和力和低分裂率該置換測(cè)定的速度通常是很低的。
第一實(shí)施例的例子1磁性珠子之間力的確定。
可能有幾種珠子的結(jié)合。需要在該珠子的尺寸(越小越好)和磁性特性(磁矩、磁性弛豫)之間尋找好的平衡。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例這個(gè)例子提供了對(duì)兩對(duì)粒子的不同參數(shù)的對(duì)比研究。
下面我們將考慮兩種情形。
在下面的例子中，該第一和第二珠子在尺寸上不同因此磁矩也不同。為了實(shí)踐原因，本發(fā)明的第一珠子和第二珠子稱為“小”和“大”珠子。
例子A.
第一(小)珠子直徑100nm，m＝10-16A.m2，超順磁性的。
第二(大)珠子直徑1-μm，m＝10-13A.m2，超順磁性的。
例子B.
第一(小)珠子直徑35nm，m＝10-18A.m2，超順磁性的。
第二(大)珠子直徑100nm，m＝10-15A.m2，高密度磁性材料在數(shù)例中，m表示該珠子的飽和磁矩。該例子已被選擇使得該第二珠子能夠在該第一珠子上產(chǎn)生大的場(chǎng)梯度，同時(shí)在該兩個(gè)珠子之間產(chǎn)生高于0.1pN的力。在下面的計(jì)算中，該粒子接近球形。
大和小珠子之間的力為了計(jì)算第一和第二珠子之間的吸引力，兩個(gè)磁化的珠子之間的力由磁矩的大小、磁矩的相對(duì)定位和該珠子的相對(duì)位置確定。對(duì)于沿著從外部施加的磁場(chǎng)方向的珠子到珠子的接近(磁極到磁極的接近)，該吸引的偶極-偶極力由下式給定F=μ04π6m1m2x4]]>方程式(2)其中m1和m2是各個(gè)珠子的磁矩，x是中心-中心的距離。
當(dāng)該珠子處于最近接觸時(shí)第二珠子能夠施加最大磁力到第一珠子上。
對(duì)于例子A，對(duì)于50nm(x＝0.6μm)的表面-表面距離計(jì)算出吸引力為46pN，在接觸的情況下(x＝0.55μm)吸引力為66pN。
對(duì)于例子B，對(duì)于10nm(x＝77.5nm)的表面-表面距離計(jì)算出吸引力為17PN，在接觸的情況下(x＝67.5nm)吸引力為29pN。
從而，根據(jù)這個(gè)實(shí)施例的方法提供了辨別具有幾十皮可牛頓數(shù)量級(jí)的極限力的較強(qiáng)和較弱生物分子的相互作用的可能性。
大珠子的速度由于它們的大磁矩，可以通過(guò)外部施加的磁場(chǎng)梯度在該流體內(nèi)操縱該第二珠子。使用針對(duì)在粘性介質(zhì)中球形粒子的流阻的方程式可以估算第二粒子(大珠子)的操縱速度F＝6πηrv 方程式(3)其中η為該流體的粘性度，r為該粒子的半徑，v為關(guān)于遠(yuǎn)離該珠子的周圍流體的粒子速度。
以103T/m的梯度，該例子A的第二珠子經(jīng)受100pN的力[方程式(2)]和10mm/s的速度[方程式(3)]。在相同的梯度，例子B的該第二珠子具有1pN的力和1mm/s的速度。這意味著，當(dāng)施加磁場(chǎng)時(shí)可以將在100nm到1μm范圍內(nèi)的該第二珠子快速地(mm/s)移向該傳感器表面和從該傳感器表面移開。而且，可以利用尺寸和磁矩的這個(gè)范圍來(lái)獲得力，該力在本發(fā)明的該方法中(也參見實(shí)施例2和3)足以實(shí)現(xiàn)辨別較弱和較強(qiáng)的例如特異性和無(wú)特異性的結(jié)合。
重復(fù)的嚴(yán)格性能夠顯示，當(dāng)它們都存在于溶液中時(shí)，溶液中的第一和第二珠子幾乎彼此沒(méi)有影響(i)在該兩個(gè)給定的情形，該第一和第二珠子的磁矩之比是10或更大，例如103。結(jié)果，各個(gè)分離的珠子上的磁力和它們的速度也相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)。這意味著當(dāng)溶液中的該第一珠子幾乎不能被激活時(shí)，可以將該第二珠子磁性地移向該傳感器和從該傳感器移開。
(ii)僅當(dāng)?shù)诙樽臃浅＝咏鼤r(shí)該第一珠子感受到有效的粒子-粒子力[該力如同方程式(2)中的x-4下降]。在該第一珠子被固定的表面容易地實(shí)現(xiàn)如此近的接近，但當(dāng)兩個(gè)珠子都在溶液中時(shí)具有非常低的概率。
結(jié)果，可以重復(fù)該兩珠子的嚴(yán)格性步驟，定期從該表面去除寬松結(jié)合的第一珠子。然后，該傳感器狀態(tài)可以被定期監(jiān)控而不是僅在該測(cè)定的終點(diǎn)被檢驗(yàn)。在該傳感器上動(dòng)態(tài)和動(dòng)力的最終記錄給出了該生物測(cè)量的改進(jìn)的可靠性、精度度和速度的優(yōu)點(diǎn)。
大珠子的橫向操縱到現(xiàn)在為止，已經(jīng)假定將該第二珠子以它們的軌道基本垂直于該表面移向該傳感器表面和從該傳感器表面移開?？梢酝ㄟ^(guò)在傳感器表面之上再創(chuàng)建該第二珠子的橫向移動(dòng)提高效率，第二珠子以該效率拾取微弱結(jié)合的第一珠子?？梢酝ㄟ^(guò)任何適當(dāng)?shù)募羟辛黧w流動(dòng)的工具裝置創(chuàng)建該橫向移動(dòng)，聲激勵(lì)或磁激勵(lì)僅是例子。后者可以通過(guò)外部場(chǎng)梯度和通過(guò)在該芯片上創(chuàng)建的梯度，例如將電流通過(guò)芯片內(nèi)電流電線來(lái)產(chǎn)生。芯片內(nèi)電流電線具有該梯度以非常小的能量消耗被產(chǎn)生以非常接近該結(jié)合表面的優(yōu)點(diǎn)。在芯片內(nèi)電流電線周圍產(chǎn)生的磁場(chǎng)梯度等于dBdR=μ0I2πr2]]>方程式(4)其中I是穿過(guò)該電線的電流，r是相距該電線的距離。作為例子，在10μm的距離10mA的電流產(chǎn)生20T/m的場(chǎng)梯度。假定該珠子被外部施加的均勻磁場(chǎng)磁性飽和，并且附加的非均勻場(chǎng)由芯片內(nèi)電流電線創(chuàng)建。20T/m的梯度對(duì)于例子A的大珠子給出0.2mm/s的速度，對(duì)于情形B的第二珠子給出21μm/s的速度。當(dāng)該傳感工具有10μm的寬度時(shí)，該第二珠子能夠每秒鐘許多次或幾次移動(dòng)越過(guò)該傳感器。這個(gè)橫向移動(dòng)可以增加了傳感器表面受該第二珠子的影響，并且增加拾取微弱結(jié)合的第一珠子的機(jī)會(huì)。
大珠子的聚合這個(gè)兩珠子嚴(yán)格性的實(shí)施例相對(duì)來(lái)說(shuō)不受磁性聚合的影響，出于兩個(gè)原因(i)具有較低磁矩的該第一例如小珠子可能在磁場(chǎng)中具有小的聚合趨勢(shì)。
(ii)固定的第一珠子上的該嚴(yán)格性力由單個(gè)最接近的第二珠子[參看方程式(2)中的x-4]確定。距離珠子更遠(yuǎn)的力是可以忽略的，所以第二珠子的潛在群集不會(huì)改變施加到該第一珠子上的力。
然而，優(yōu)選地可以避免該第二珠子(具有更高的磁矩)非常大的聚合，因?yàn)樵摼酆峡赡芫哂械皆搨鞲衅鞅砻娼档偷目蛇_(dá)性。聚合的降低可以通過(guò)部分時(shí)間切斷該磁場(chǎng)，通過(guò)使用具有非常低的殘余磁矩的珠子(例如，由于緊的磁性弛豫、小的磁疇、超順磁性)，通過(guò)使用抗粘附的涂層，通過(guò)流體剪切力，通過(guò)使用中等濃度的第二珠子，和通過(guò)改變?cè)摯艌?chǎng)的方位(例如，使用變化的磁場(chǎng)大小和方向)。
注意到該檢測(cè)的執(zhí)行是在該目標(biāo)分子上或在該第一珠子上。為了避免可能存在于該靈敏檢測(cè)區(qū)的來(lái)自第二珠子的錯(cuò)誤信號(hào)，該第二珠子優(yōu)選地在測(cè)量期間不產(chǎn)生信號(hào)影響。例如，通過(guò)具有熒光標(biāo)簽的第一珠子完成該檢測(cè)，而那些標(biāo)簽不存在在該第二珠子上。
例子2將參考圖5描述根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的嚴(yán)格性步驟。
圖5的設(shè)備可以作為微流體設(shè)備而實(shí)現(xiàn)。
1.將具有較低磁矩和隨意較小尺寸的第一珠子1連接到目標(biāo)分子，并提供在源11中。在閥1和泵13的控制下將那些第一珠子1引入測(cè)量室15，在該測(cè)量室中有帶有捕捉點(diǎn)即耦合到基底16的傳感器表面的捕捉分子的基底16?？梢约訌?qiáng)珠子朝向該表面的傳送，例如，通過(guò)流體流動(dòng)，攪拌，或通過(guò)施加磁場(chǎng)梯度。
2.連接到該目標(biāo)分子的該第一珠子1通過(guò)它們到捕捉分子的結(jié)合被固定到該傳感器表面上。這個(gè)實(shí)施例的修改是在生物芯片16上提供在生物活性分子之間具有不同強(qiáng)度相互作用的不同捕捉點(diǎn)。因此，可能有利的是，為具有微弱生物分子相互作用的捕捉點(diǎn)選擇具有稍微較低磁矩的第一珠子1，并且為具有強(qiáng)的相互作用的捕捉點(diǎn)選擇具有稍微較高磁矩的第一珠子1。
3.通過(guò)操作閥2和泵13從源10提供具有較大磁矩的第二珠子2。該第二珠子可以具有比該第一珠子1隨意較大的尺寸。將第二珠子2移向該第一珠子1被固定的該傳感器表面。該移動(dòng)由例如由諸如一個(gè)或多個(gè)永久磁鐵或電磁鐵的磁場(chǎng)發(fā)生器14產(chǎn)生的磁力驅(qū)動(dòng)。也可以通過(guò)操作閥3和泵13從源12提供液體流。為了該第二珠子2軌道的最優(yōu)控制，應(yīng)當(dāng)優(yōu)先考慮和同步在該傳感器表面之上的磁力和該流體的強(qiáng)制流動(dòng)。
4、當(dāng)該第二珠子2接近該第一珠子1時(shí)，該第一珠子1經(jīng)受朝向該第二珠子2的吸引磁力。從該傳感器表面分離的微弱結(jié)合的第一珠子1被吸向該第二珠子2，并且被磁性連接到那里。強(qiáng)結(jié)合到該傳感器表面的第一珠子1停留在該傳感器表面上。
5、由于磁引力有可能形成第一珠子-第二珠子的復(fù)合體，但是該兩珠子復(fù)合體不會(huì)立刻從該傳感器表面移開。在該情況下，可以施加附加的激勵(lì)來(lái)從該表面去除該復(fù)合體，例如從該表面拖開該形成的復(fù)合體的磁場(chǎng)梯度，沿著該傳感器表面產(chǎn)生剪切力的剪切流，超聲波激勵(lì)等。這些激勵(lì)去除復(fù)合體，其中該第一珠子微弱地結(jié)合到該表面。
6、將帶有或不帶有連接的第一珠子1的該第二珠子2從該傳感器表面移開到出口19，例如通過(guò)使用源12中的該流體洗滌。結(jié)果，最初微弱地結(jié)合到該傳感器表面的該第一珠子1現(xiàn)在被從該傳感器去除。
7、可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)檢測(cè)現(xiàn)在保持連接到該捕捉分子的該第一磁性珠子1，例如，通過(guò)使用傳感器電路18定位在該基底16下面的磁傳感器17。如果以光學(xué)活性材料例如染料或熒光材料標(biāo)記該第一珠子1，那么可以光學(xué)地檢測(cè)該第一珠子1的存在。如果以改變電化學(xué)電壓或使得電化學(xué)電荷轉(zhuǎn)移的材料標(biāo)記該第一珠子1，那么可以通過(guò)使用合適的電極檢測(cè)該第一珠子的存在。如果該珠子包含放射性材料，那么可以通過(guò)放射性發(fā)射檢測(cè)它們。
可以以相同組的第二珠子2重復(fù)上述序列幾次。該方法可以在井盤(例如微滴定盤)中或者在微流體盒中實(shí)施。井盤高度適合自動(dòng)化的高生產(chǎn)量應(yīng)用；盒能夠?qū)崿F(xiàn)該傳感器周圍的高次函數(shù)積分和流體小型化。
第二實(shí)施例根據(jù)在圖2中示意性地示出的本發(fā)明的第二實(shí)施例，使用了兩個(gè)珠子1、2，該兩珠子的每一個(gè)被耦合到生物活性分子。該珠子1、2隨意地具有相同的磁矩。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置中，該兩珠子1、2可以分別被耦合到目標(biāo)T和捕捉C分子。在一個(gè)可替換的裝置中，該兩珠子1、2被耦合到兩個(gè)不同的目標(biāo)分子T1、T2，該兩個(gè)目標(biāo)分子結(jié)合到捕捉分子C的不同部分(參見圖3)。例如，該兩個(gè)不同的目標(biāo)分子T1、T2可以是抗體，每一個(gè)是單克隆或多克隆的，指向?yàn)椴蹲椒肿拥耐豢乖牟煌乖瓫Q定基。
在兩個(gè)裝置中，將該捕捉分子C，其或者被涂層在表面上或者處于溶液中，與一個(gè)或兩個(gè)耦合珠子的目標(biāo)分子T1、T2接觸，該目標(biāo)分子T1、T2將結(jié)合到它們各自的結(jié)合位點(diǎn)或抗原決定基。然而，珠子1、2的其它結(jié)合也可以因?yàn)榉翘禺愋越Y(jié)合而被創(chuàng)建。帶有磁矢量方向快速變化的磁場(chǎng)M的施加將引起該兩個(gè)珠子1、2之間的磁排斥或磁吸引，例如，依賴于該瞬時(shí)磁場(chǎng)是垂直于將該兩珠子結(jié)合的軸，還是與之平行。選擇該兩個(gè)珠子1、2的磁矩大小和變化的磁場(chǎng)M的幅度，以使得在該目標(biāo)分子T1、T2之一或兩個(gè)沒(méi)有特異性結(jié)合的情況下，該吸引力和排斥力導(dǎo)致該分子T1、T2的去除，即，該珠子-珠子相互作用被破壞。還要選擇該兩珠子1、2的磁矩大小和該變化的磁場(chǎng)M的幅度，以使得在一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)分子T1、T2特異性結(jié)合的情況下，例如兩個(gè)多克隆或單克隆抗體特異性結(jié)合到它們備自的抗原決定基，它們將不會(huì)被去除?？梢岳绻鈱W(xué)地檢測(cè)緊密靠近在一起的兩個(gè)珠子1、2的存在。由于如果兩個(gè)選擇性結(jié)合存在的情況下兩個(gè)緊密靠近的珠子的結(jié)合才發(fā)生的事實(shí)，例如，通過(guò)施加該變化的磁場(chǎng)的兩個(gè)抗體結(jié)合加上嚴(yán)格性的控制，緊密結(jié)合的珠子1、2的存在是該捕捉分子C存在的清楚指示。特別地，當(dāng)使用多克隆抗體時(shí)，無(wú)特異性結(jié)合或到其它抗原決定基的可交叉反應(yīng)的機(jī)會(huì)增加，并且可以使用該施加的變化磁場(chǎng)和由此在該結(jié)合上的力來(lái)消除與所需的結(jié)合不同特異性的結(jié)合。因此，在使用如目標(biāo)分子T1、T2的兩個(gè)被耦合的抗體的情況下，可以獲得抗原(捕捉分子C)的特異性檢測(cè)，不需要提純的單克隆抗體，即，不需要高水平的特異性。
該磁場(chǎng)可以導(dǎo)致吸引力，即將兩個(gè)珠子1、2推向彼此，或者可以是排斥性的，使兩個(gè)珠子1、2彼此遠(yuǎn)離。當(dāng)兩個(gè)珠子1、2經(jīng)由該目標(biāo)和捕捉分子T1、T2、C耦合到一起時(shí)，它們非常接近地在一起，并且當(dāng)產(chǎn)生垂直于該兩珠子的軸的磁場(chǎng)時(shí)，該珠子1、2彼此抵制。由于該磁性珠子1、2在磁場(chǎng)中趨向?qū)R，并且最初在液體中通常具有隨機(jī)取向，因此該磁場(chǎng)必須經(jīng)常地改變以保持排斥性。通過(guò)旋轉(zhuǎn)的磁場(chǎng)來(lái)改變?cè)摯攀噶康姆较?，例如，通過(guò)為彼此正交的三個(gè)線圈提供電流控制器用于控制在該線圈中AC電流的相位和振幅，從而產(chǎn)生在三維中快速旋轉(zhuǎn)或隨機(jī)或偽隨機(jī)移動(dòng)的磁場(chǎng)。這個(gè)磁場(chǎng)應(yīng)當(dāng)大到足以在兩個(gè)珠子1、2中產(chǎn)生該磁矩的定位，優(yōu)選地使在該珠子中的磁矩飽和。所需要的場(chǎng)M依賴于粒子的類型(例如，超順磁性的、鐵磁性的、球形或非球形珠子)。兩個(gè)磁性珠子1、2之間的偶極相互作用的勢(shì)能U由下式給出U=μ04πm→1m→2-3(m→1.r→)(m→2.r→)r3]]>方程式(5)其中 分別表示每個(gè)珠子的磁矩，r＝該兩珠子中心之間的距離。
該珠子到珠子的力F由該能量的梯度給出F＝-U 方程式(6)該磁力依賴于該珠子磁矩(其受該外部施加場(chǎng)的影響)和該珠子到珠子的軸的相對(duì)定位。當(dāng)該珠子磁矩相互對(duì)齊并且定位在垂直于該珠子到珠子的軸上時(shí)，有如下大小的相互排斥力F=μ04π3|m1||m2|r4]]>方程式(7)當(dāng)該珠子磁矩相互對(duì)齊，并且同時(shí)定位與該珠子到珠子的軸平行時(shí)，那么存在如下大小的相互吸引力F=μ04π6|m1||m2|r4]]>方程式(8)上述實(shí)施例可以用于需要從身體去除捕捉分子的測(cè)定。一個(gè)例子就是從口中去除蛋白質(zhì)。將標(biāo)記有第一磁性珠子的目標(biāo)分子T1引入口中，并將其與在口腔中的蛋白質(zhì)合成。然后使用磁鐵將這些復(fù)合體從口中去除來(lái)清除所有的珠子。然后將標(biāo)記有另一個(gè)目標(biāo)分子T2的第二磁性珠子添加到該回收的第一珠子，并且允許形成該兩個(gè)珠子之間的復(fù)合體。然后施加快速旋轉(zhuǎn)的磁場(chǎng)，以便破壞沒(méi)有被牢固地結(jié)合在一起的第一珠子-第二珠子復(fù)合體。剩余的兩個(gè)珠子的復(fù)合體具有特異性的結(jié)合。然后可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)难b置例如光學(xué)地確定剩余第一和第二珠子復(fù)合體的存在。
第三實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施例，使用了兩個(gè)珠子1、2，其中只有其中的一個(gè)具有磁矩-參見圖4。兩個(gè)生物活性分子C、T之間的無(wú)特異性結(jié)合被兩個(gè)力的結(jié)合破壞，該兩個(gè)力為(1)在該非磁性珠子2上產(chǎn)生的流體力，將該非磁性珠子2通過(guò)置于流體流F中而被連接到一個(gè)分子上(或者C或者T，但在圖4中所示的是捕捉分子C)和(2)作用到該磁性珠子上相反的磁力，該磁性珠子通過(guò)施加磁場(chǎng)梯度MG被連接到另一個(gè)分子上。這種應(yīng)用也允許在溶液中執(zhí)行本發(fā)明，不需要將捕捉分子C連接到諸如微陣列的固體基底上。
非磁性珠子在商業(yè)上是可以得到的?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆谴判圆牧?，例如，固體的或半固體的材料。例子包括橡膠、聚苯乙烯、交叉右旋糖苷、甲基苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺。
例如，以半徑為0.5μm的非磁性珠子2，流體為粘性度η＝1.10-3Pa.s的水，并且水流v＝大約1mm/s，將9，4pN的流體摩擦力施加到該非磁性珠子2上。其中m＝1.10-15Am2的磁性珠子和為dB/dz＝1.104T/m的磁場(chǎng)梯度MG，施加10pN的磁力到該磁性珠子1上(假定該磁性珠子非常小，并且不受該流體流動(dòng)的影響)。因此，通過(guò)操縱該珠子1的磁矩、磁性和非磁性珠子1、2的大小和該流體的流動(dòng)，可以創(chuàng)建其中對(duì)抗的流體力和磁力處于平衡的情形。當(dāng)該生物活性分子T、C之間的結(jié)合是強(qiáng)壯的(例如，特異性的)時(shí)，該復(fù)合體將保持在該流體流中的同一位置。對(duì)于弱(例如無(wú)特異性的)結(jié)合的情況，該結(jié)合將由該反向力引起的張力破壞，并且該生物活性分子C、T或者將沿著該磁場(chǎng)移動(dòng)，或者將隨著該流體流而漂浮。
也可以以生物細(xì)胞、病毒或其它生物體例如脂質(zhì)體或囊泡執(zhí)行這個(gè)測(cè)定。這些生物體可以是被置于壓力或張應(yīng)力下的部分生物復(fù)合體，或者這些生物體起第二珠子的作用。因此，依據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，不需要使用珠子但使用的珠子可以由包括生物體的任何合適的粒子組成。
可以例如光學(xué)地確定或測(cè)量在流體流中結(jié)合的捕捉和目標(biāo)分子C、T復(fù)合體的準(zhǔn)確位置。一個(gè)例子是在該磁性和/或非磁性珠子上使用發(fā)色團(tuán)，其允許光學(xué)地檢測(cè)在該裝置中特定位置的該珠子的存在?？梢孕薷牧骱?或磁場(chǎng)，以便在該流體流中保持該復(fù)合體在固定位置，或者沿某一方向以某一速度移動(dòng)該復(fù)合體。以這個(gè)實(shí)施例，有可能提純和/或豐富具有特異性結(jié)合的捕捉-目標(biāo)分子復(fù)合體。
可替換地，可以使用該系統(tǒng)分餾包含耦合到磁性和非磁性珠子1、2上的捕捉和目標(biāo)分子C、T的樣品。由于選擇的該尺寸，大的非磁性珠子將遇到比較小的磁性珠子1更大的流體力。在將樣品與耦合的目標(biāo)和捕捉分子C、T接觸之后，施加磁場(chǎng)梯度，該磁場(chǎng)梯度吸引結(jié)合的和非結(jié)合的目標(biāo)分子，而其它的分子保持在適當(dāng)?shù)奈恢?，并且能夠被除去。?dāng)后來(lái)施加漸增的相反的流體力時(shí)，首先將破壞無(wú)特異性捕捉和目標(biāo)結(jié)合，并且將用該流體流動(dòng)去除捕捉分子，其次將用該流體流動(dòng)去除特異性結(jié)合的復(fù)合體，而非結(jié)合的目標(biāo)分子將保持被該磁場(chǎng)所吸引。
在這個(gè)實(shí)施例的修改版本中，使用了不同類型的捕捉分子，每一個(gè)具有不同大小的非磁性珠子。操縱流速和/或磁場(chǎng)，以便根據(jù)該非磁性珠子的大小分離該目標(biāo)-捕捉分子復(fù)合體。
可以在任何系統(tǒng)中執(zhí)行上述結(jié)合分子的識(shí)別和/或提純，其中可以產(chǎn)生流體流動(dòng)和磁場(chǎng)；磁場(chǎng)可以在外部或內(nèi)部產(chǎn)生(例如，線圈或磁性材料)。使用例如在美國(guó)專利5,866,345中所描述的中等規(guī)模的流動(dòng)系統(tǒng)，可以將樣品的容量降低到其檢測(cè)范圍容量降到1nl的微升范圍。
第三實(shí)施例的例子將參照?qǐng)D6描述第三實(shí)施例的例子，其可以作為微流體裝置實(shí)現(xiàn)。在區(qū)域28中提供磁流體動(dòng)力瓶子。使得來(lái)自源20的流體流動(dòng)，例如，通過(guò)可控制的泵21，穿過(guò)區(qū)域27、28、29，并從30中流出。修整區(qū)域27和29的形狀，以致與在區(qū)域28中的流速相比分別提高和降低該流動(dòng)。通過(guò)適當(dāng)?shù)拇艌?chǎng)發(fā)生器24，例如一個(gè)或多個(gè)永久磁體或電磁體，在區(qū)域27-29中提供磁場(chǎng)梯度。該磁場(chǎng)沿著在圖6中朝左的方向吸引磁性珠子。來(lái)自源20的該流體流動(dòng)趨向于朝圖6中的右方驅(qū)動(dòng)珠子。以目標(biāo)分子標(biāo)記第一磁性珠子1(典型地在尺寸上比該第二非磁性珠子2小得多)，并將其與標(biāo)記有捕捉分子的該第二非磁性珠子2接觸。結(jié)果是珠子1、2的混合物，一些混合物通過(guò)生物分子結(jié)合而結(jié)合在一起。當(dāng)將該力平衡時(shí)，經(jīng)至少一個(gè)生物分子連接到彼此的第一和第二珠子的組合體保持固定，例如，在區(qū)域28中，其中可以通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)系統(tǒng)例如光學(xué)的或磁性的系統(tǒng)檢測(cè)到它們。在25將珠子和生物分子的混合物注入例如區(qū)域27中。最初，來(lái)自源20的流體流動(dòng)可能是低的或者該流體可能是靜止的。該磁場(chǎng)梯度的效果將會(huì)是拖動(dòng)該磁性第一珠子1朝向圖6中的左方。為了防止該珠子1、2離開太遠(yuǎn)，可以提供可選擇的過(guò)濾器23。然后激勵(lì)該泵21來(lái)緩慢地提高該流速。最初，未耦合到該第一珠子1的非磁性珠子2和其它碎片將經(jīng)由出口30被驅(qū)逐出系統(tǒng)。當(dāng)珠子1、2組合體的流體流動(dòng)力達(dá)到足夠高的水平時(shí)，這些組合體將移動(dòng)到右方。如果它們進(jìn)入?yún)^(qū)域29，那么該流速降低并且由該磁場(chǎng)梯度產(chǎn)生的力將控制防止該珠子到達(dá)出口30。如果該流速稍微太低，該磁場(chǎng)梯度將趨向于移動(dòng)一些該珠子組合體1、2朝向圖6中的左方。然而，由于在區(qū)域27中存在較高的流速，該流體流動(dòng)力將控制和防止該組合體進(jìn)一步流向遠(yuǎn)處。結(jié)果是結(jié)合的珠子1、2的組合體將被誘入磁流體動(dòng)力瓶28中。這里，珠子1和/或珠子2之間的結(jié)合將被置于由該對(duì)抗的磁力和流體力產(chǎn)生的壓力下。如果該結(jié)合是非特異性的，那么該結(jié)合將被破壞，并且該磁性第一珠子1將朝向該過(guò)濾器23移動(dòng)，非磁性粒子將從該系統(tǒng)流出。因此，保留在磁流體動(dòng)力瓶28中的珠子組合體將具有特異性結(jié)合。
權(quán)利要求
1.第一和第二粒子在磁場(chǎng)中用于辨別液體中的微生物實(shí)體之間結(jié)合的不同強(qiáng)度的使用，第一和第二粒子中的至少一個(gè)是磁性的，該使用包含-提供在該液體中可移動(dòng)的第一粒子和第一微生物實(shí)體之間的復(fù)合體，-在該液體中為該第一微生物實(shí)體和第二微生物實(shí)體之間的結(jié)合提供條件；-將在該液體中可移動(dòng)的第二粒子帶到該復(fù)合體附近；和-作用于該第一和/或第二粒子，以施加機(jī)械應(yīng)力到該第一和第二微生物實(shí)體之間的結(jié)合上，同時(shí)施加磁場(chǎng)，從而破壞第一強(qiáng)度的結(jié)合，而不破壞第二更大強(qiáng)度的結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用，其中，該結(jié)合強(qiáng)度的辨別用于辨別特異性和無(wú)特異性結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的使用，其中，該第一微生物實(shí)體是目標(biāo)分子，該第二微生物實(shí)體是捕捉分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任意一個(gè)所述的使用，其中，第一和第二粒子都是磁性粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任意一個(gè)所述的使用，其中，第一粒子被耦合到微生物實(shí)體，并且其中第二磁性粒子沒(méi)有被耦合到微生物實(shí)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任意一個(gè)所述的使用，其中，該第一和該第二粒子都被耦合到微生物實(shí)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的使用，其中，該第一粒子被耦合到目標(biāo)微生物實(shí)體，該第二粒子被耦合到捕捉微生物實(shí)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的使用，其中，該第一粒子被耦合到第一目標(biāo)微生物實(shí)體，并且其中該第二粒子被耦合到第二目標(biāo)微生物實(shí)體。
9.根據(jù)權(quán)利要求4到8中任意一個(gè)所述的使用，其中，該第一和/或第二磁性粒子是順磁性的。
10.根據(jù)權(quán)利要求4到9中任意一個(gè)所述的使用，其中，該第一磁性粒子具有比該第二磁性粒子的磁矩小10倍的磁矩。
11.根據(jù)權(quán)利要求4到10中任意一個(gè)所述的使用，其中，該第一磁性粒子的尺寸小于該第二磁性粒子的尺寸。
12.根據(jù)權(quán)利要求4到11中任意一個(gè)所述的使用，其中，該第一磁性粒子具有1nm和1μm之間的直徑，更優(yōu)選地在10nm和200nm之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求4到12中任意一個(gè)所述的使用，其中，該第二磁性粒子具有至少100nm的直徑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任意一個(gè)所述的使用，其中，將該第一或第二微生物實(shí)體布置在陣列上的捕捉點(diǎn)上。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任意一個(gè)所述的使用，其中，該第一和第二粒子中只有一個(gè)是磁性的，另一個(gè)粒子是非磁性的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的使用，其中，該非磁性粒子大于該磁性粒子。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到16中任意一個(gè)所述的使用，進(jìn)一步包含施加流體摩擦力到該第一或第二微生物實(shí)體上的步驟。
18.一種用于辨別微生物實(shí)體之間不同強(qiáng)度的結(jié)合的工具，該工具包含-第一粒子和第二粒子，其中至少一個(gè)是磁性的，-作用于該第一和第二粒子從而施加機(jī)械應(yīng)力到該第一和第二微生物實(shí)體之間的結(jié)合上并辨別不同強(qiáng)度的結(jié)合的裝置，該用于施加機(jī)械應(yīng)力的裝置包含至少一個(gè)磁場(chǎng)發(fā)生器。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的工具，其中，第一和第二粒子都是磁性的，或者該第一粒子是磁性的，而該第二粒子是非磁性的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的工具，其中，該第一和/或第二粒子被耦合到微生物實(shí)體上。
21.根據(jù)權(quán)利要求18到21中任意一個(gè)所述的工具，其中，該微生物實(shí)體是諸如蛋白質(zhì)或肽的生物活性分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求18到21中任意一個(gè)所述的工具，其中，該用于施加機(jī)械應(yīng)力的裝置包括用于施加流體摩擦力到該第一或第二粒子上的裝置。
23.根據(jù)權(quán)利要求18到22中任意一個(gè)所述的工具，進(jìn)一步包含布置在基底的捕捉點(diǎn)上的微生物實(shí)體的陣列。
24.根據(jù)權(quán)利要求18到23中任意一個(gè)所述的工具，進(jìn)一步包含用于產(chǎn)生推動(dòng)該粒子相對(duì)于該陣列的橫向移動(dòng)的激勵(lì)的裝置。
25.根據(jù)權(quán)利要求18到24中任意一個(gè)所述的工具用于特異性結(jié)合的生物活性分子的識(shí)別、分離、提純的的使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測(cè)定和工具以及因此也公開了一種設(shè)備，用于使用至少第一粒子或微載體例如珠子和也可以為微載體的第二粒子例如第二珠子，確定諸如生物活性分子的微生物實(shí)體之間的相互作用。至少第一微載體是磁性的。當(dāng)使用兩個(gè)珠子并且兩個(gè)珠子都是磁性時(shí)，該珠子優(yōu)選地在它們的磁矩大小上不同。本發(fā)明提供一種裝置，用于將生物活性分子之間的結(jié)合置于機(jī)械應(yīng)力下，來(lái)由此辨別不同強(qiáng)度的結(jié)合。一方面，使用該第二珠子(具有較大磁矩)用來(lái)磁性地去除聯(lián)結(jié)到具有較小磁矩的珠子上的目標(biāo)分子，該目標(biāo)分子微弱地結(jié)合到捕捉分子上(捕捉分子本身通常耦合到可移動(dòng)的或不可移動(dòng)的表面)?？商鎿Q地，可以施加流體摩擦力到其中一個(gè)該粒子上來(lái)破壞微弱的結(jié)合。依賴于該實(shí)施例，該第一珠子和/或第二粒子可被用于檢測(cè)目的。
文檔編號(hào)G01N35/00GK1829916SQ200480022161
公開日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者M·W·J·普林斯 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司