專利名稱：制備含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及制備蛋白質(zhì)的方法，更具體地說(shuō)涉及制備含有不形成二硫鍵的游離半胱氨酸的重組蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
就病人和醫(yī)護(hù)人員而言，對(duì)于開(kāi)發(fā)低成本，長(zhǎng)效，“使用方便”(“user-friendly”)的蛋白質(zhì)療法具有極大興趣。蛋白質(zhì)制備昂貴且不同于其它常規(guī)小分子藥物，它通常不容易被身體吸收。而且如果經(jīng)口服給藥它們會(huì)被消化掉。因此，蛋白質(zhì)一般必須經(jīng)注射給藥。注射后，大多數(shù)蛋白質(zhì)被迅速?gòu)捏w內(nèi)清除，因此必須經(jīng)常，通常是每天，都要進(jìn)行注射。病人不喜歡注射，這樣就導(dǎo)致應(yīng)變性下降并降低藥物效力。有些蛋白質(zhì)，如促紅細(xì)胞生成素(EPO)，當(dāng)不經(jīng)常給藥時(shí)也是有效的，但這是由于該蛋白質(zhì)是糖基化的事實(shí)引起的。糖基化需要使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，但這較昂貴且增加了蛋白質(zhì)藥物的成本。
因此，強(qiáng)烈需要開(kāi)發(fā)降低病人和醫(yī)護(hù)人員對(duì)蛋白質(zhì)藥物花費(fèi)的蛋白質(zhì)傳遞技術(shù)。解決該問(wèn)題的一個(gè)方法是開(kāi)發(fā)延長(zhǎng)蛋白質(zhì)治療劑在體內(nèi)的循環(huán)半衰期的方法使得不需經(jīng)常注射該蛋白質(zhì)。這一解決方法也可滿足病人對(duì)“使用方便”的蛋白質(zhì)療法(即，不需要經(jīng)常注射的蛋白質(zhì)療法)的需要和希望。
已證實(shí)用聚乙二醇(PEG)對(duì)蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)半衰期的有用方法(Abuchowski等，1984；Hershfield，1987；Meyers等，1991)。將PEG共價(jià)附著到蛋白質(zhì)上增加了蛋白質(zhì)的有效大小并降低了從體內(nèi)清除它的速率?？少I到幾種大小的PEG，通過(guò)使用不同大小的PEG可以使得PEG修飾的蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期適應(yīng)于個(gè)體適應(yīng)癥。其它文獻(xiàn)證實(shí)PEG修飾的體內(nèi)益處在于增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的可溶性，穩(wěn)定性(很可能是防止蛋白質(zhì)被蛋白酶消化)和降低蛋白質(zhì)的免疫原性(Katre等，1987；Katre，1990)。
PEG連接蛋白質(zhì)的一個(gè)已知方法是使用諸如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-PEG的化合物將PEG附著列游離胺上，一般是在賴氨酸殘基或在N-末端氨基酸上。該方案的一個(gè)主要的局限性在于蛋白質(zhì)除了N-末端氨基酸外，一般還含有幾個(gè)賴氨酸，PEG部分非特異性地附著到蛋白質(zhì)的任何可接近的游離胺上，產(chǎn)生不同種的產(chǎn)物混合物。許多NHS-PEG化蛋白質(zhì)由于其低比活和異質(zhì)性而不適用于商業(yè)用途。失活是由生物學(xué)活性所需的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基或N-末端氨基酸被共價(jià)修飾或者由于PEG部分靠近蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)的共價(jià)附著而引起的。
與本申請(qǐng)?zhí)貏e相關(guān)的是這樣的發(fā)現(xiàn)，即用包括NHS-PEG試劑的胺反應(yīng)試劑修飾的人生長(zhǎng)激素(hGH)使得蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性降低了超過(guò)10倍(Teh和Chapman，1988；Clark等，1996)。GH是由垂體腺分泌的一種22KD的蛋白質(zhì)。GH刺激骨骼，軟骨和肌肉的代謝并且是兒童時(shí)期刺激軀體生長(zhǎng)的主要激素。重組人GH(rhGH)用于治療由于GH不足引起的軀體矮小癥，特納綜合癥和兒童腎機(jī)能不全癥。GH不被糖基化且當(dāng)在細(xì)菌中生產(chǎn)時(shí)具有完全的活性。該蛋白質(zhì)具有較短的體內(nèi)半衰期且必須每天皮下注射給藥以達(dá)到最大效力(MacGillivray等，1996)。
對(duì)于開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效形式的hGH具有極大的興趣。用胺反應(yīng)性PEG試劑經(jīng)PEG連接蛋白質(zhì)產(chǎn)生長(zhǎng)效形式的hGH的嘗試取得的成功有限，因?yàn)镻EG連接時(shí)生物學(xué)活性明顯下降。而且，該蛋白質(zhì)變成在多個(gè)位點(diǎn)與PEG連接(Clark等，1996)。hGH除了N-末端氨基酸外，含有9個(gè)賴氨酸。這些賴氨酸中有些位于該蛋白質(zhì)已知對(duì)受體結(jié)合關(guān)鍵的區(qū)域(Cunningham等，1989；Cunningham和Wells，1989)。這些賴氨酸殘基的修飾明顯降低了受體結(jié)合和該蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(de la Llosa等，1985；Martal等，1985；Teh和Chapman，1988；Cunningham和Wells，1989)。hGH容易被NHS-PEG試劑修飾，但NHS-PEG蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性嚴(yán)重受損，用5Kda PEG部分修飾的GH蛋白質(zhì)僅占野生型GH生物學(xué)活性的1％(Clark等，1996)。這種多PEG化GH蛋白質(zhì)的EC50為440ng/ml或大約20nM(Clark等，1996)。除了生物學(xué)活性明顯下降外，由于不同數(shù)目的PEG部分附著到蛋白質(zhì)上和在不同的氨基酸殘基上附著，NHS-PEG-hGH具有極大的異質(zhì)性，這也影響了其作為潛在治療劑的有用性。Clark等(1996)表明NHS-PEG-hGH在動(dòng)物中的循環(huán)半衰期相對(duì)于未修飾的GH明顯延長(zhǎng)。盡管體外生物學(xué)活性明顯降低，但在大鼠GH-缺陷模型中NHS-PEG-hGH是有效的且比未修飾的hGH給藥頻率要低(Clark等，1996)。然而，在動(dòng)物模型中需要高劑量的NHS-PEG-hGH(每只大鼠每次注射60-180μg)產(chǎn)生效力，因?yàn)樾揎椀牡鞍踪|(zhì)比活較低。明顯的是需要更好的方法以產(chǎn)生保留更高生物學(xué)活性的PEG化hGH蛋白質(zhì)。還需要開(kāi)發(fā)PEG連接hGH的方法，以這種方式產(chǎn)生同型PEG-hGH產(chǎn)物。
其它幾種商業(yè)上重要的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性也被胺反應(yīng)PEG試劑顯著降低。EPO含有幾個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性關(guān)鍵性的賴氨酸殘基(Boissel等，1993；Matthews等，1996)且EPO中賴氨酸殘基的修飾導(dǎo)致幾乎完全喪失生物學(xué)活性(Wojchowski和Caslake，1989)。用胺反應(yīng)性PEG共價(jià)修飾α-干擾素-2導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失40-75％(Goodson和Katre，1990；Karasiewicz等，1995)。用大型(例如，10KDa)PEG使得生物學(xué)活性喪失最大(Karasiewicz等，1995)。用胺反應(yīng)性PEG共價(jià)修飾G-CSF導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失60％以上(Tanaka等，1991)。用胺反應(yīng)性PEG廣泛修飾IL-2導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失90％以上(Goodson和Katre，1990)。
用于PEG連接蛋白質(zhì)的第二種已知的方法是使用半胱氨酸反應(yīng)性PEG將PEG共價(jià)附著到半胱氨酸殘基上?？梢再I到許多具有不同反應(yīng)基團(tuán)(例如，馬來(lái)酰亞胺，乙烯砜)和不同大小PEG(2-40kDa)的高特異性半胱氨酸反應(yīng)性PEG。在中性pH下，這些PEG試劑選擇性地附著到“游離”半胱氨酸殘基，即，不形成二硫鍵的半胱氨酸殘基上。大多數(shù)蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基參與形成二硫鍵且不可能用于使用半胱氨酸反應(yīng)性PEG的PEG連接。通過(guò)使用重組DNA技術(shù)的體外誘變，可將額外的半胱氨酸殘基導(dǎo)入蛋白質(zhì)的任意位置。這種新添加的“游離”半胱氨酸可用作使用半胱氨酸反應(yīng)性PEG的PEG部分特異性附著位點(diǎn)。該添加的半胱氨酸殘基可取代蛋白質(zhì)中已有的氨基酸，或添加到蛋白質(zhì)的氨基末端之前或蛋白質(zhì)的羧基末端之后，或插入到蛋白質(zhì)的兩個(gè)氨基酸之間。另外，可以刪除天然二硫鍵中涉及的兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或用另一氨基酸取代它，使得天然的半胱氨酸(該蛋白質(zhì)中正常情況下與缺失或取代的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的半胱氨酸殘基)游離并用于化學(xué)修飾。取代該半胱氨酸的氨基酸優(yōu)選是中性氨基酸，如絲氨酸或丙氨酸。生長(zhǎng)激素有兩個(gè)能被碘乙酰胺還原并烷基化而不影響其生物學(xué)活性的二硫鍵(Bewley等，(1969))。4個(gè)半胱氨酸中的每一個(gè)都可以是用于缺失或以另一氨基酸取代的理想靶。
已知一些天然存在的蛋白質(zhì)含有一個(gè)或多個(gè)“游離”的半胱氨酸殘基。這種天然存在的蛋白質(zhì)的例子包括人白細(xì)胞介素(IL)-2，β干擾素(Mark等，1984)，G-CSF(Lu等，1989)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Thompson，1992)。IL-2，G-CSF和β干擾素含有奇數(shù)個(gè)半胱氨酸殘基，而堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子含有偶數(shù)個(gè)半胱氨酸殘基。
然而，含游離半胱氨酸殘基的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)由于游離巰基在生理學(xué)條件下的反應(yīng)性而仍成問(wèn)題。在諸如大腸桿菌的細(xì)菌中作為細(xì)胞內(nèi)蛋白已經(jīng)表達(dá)了一些含有游離半胱氨酸的重組蛋白質(zhì)。其例子包括中性蛋白質(zhì)，如IL-2，β干擾素，G-CSF，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和改造的IL-2半胱氨酸突變蛋白(Goodson和Katre，1990)，IL-3(Shaw等，1992)，腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白(Tuma等，1995)，IGF-I(Cox和Mcdermott，1994)，IGFBP-1(Van DenBerg等，1997)和蛋白酶連接蛋白和相關(guān)蛋白(Braxton，1998)。所有這些蛋白質(zhì)當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)都是不溶性的。這些不溶性蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)進(jìn)行一系列的變性，還原和再折疊過(guò)程可再折疊成天然的構(gòu)象。這些步驟增加了用于在細(xì)菌中生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法的時(shí)間和成本。經(jīng)過(guò)用另一氨基酸，例如絲氨酸，取代游離的半胱氨酸殘基已經(jīng)獲得提高了穩(wěn)定性和產(chǎn)量的IL-2(Mark等，1985)和β干擾素(DeChiara等，1986)。以可溶性，生物學(xué)活性形式表達(dá)重組蛋白以消除這些額外的步驟將是優(yōu)選的。
在細(xì)菌中表達(dá)可溶性重組蛋白的一個(gè)已知方法是將它們分泌進(jìn)周質(zhì)空間或分泌進(jìn)培養(yǎng)基。已知諸如GH的某些重組蛋白當(dāng)它們分泌進(jìn)大腸桿菌周質(zhì)時(shí)以可溶性活性形式表達(dá)，而當(dāng)它們?cè)诖竽c桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)是不可溶的。經(jīng)過(guò)將編碼生長(zhǎng)激素或其它目的蛋白的DNA序列與諸如來(lái)自stII(Fujimoto等，1988)和ompA蛋白(Ghrayeb等，1984)的那些編碼細(xì)菌信號(hào)序列的DNA序列融合可實(shí)現(xiàn)分泌。在細(xì)菌中分泌重組蛋白是所希望的，因?yàn)榭杀Ａ粼撝亟M蛋白的天然N-末端。重組蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)需要在該重組蛋白的氨基末端存在N-末端甲硫氨酸。在許多人類蛋白質(zhì)的成熟形式的氨基末端正常情況下并不存在甲硫氨酸。例如，人生長(zhǎng)激素成熟形式的氨基末端氨基酸是苯丙氨酸。為了在細(xì)菌中有效表達(dá)該蛋白質(zhì)，如果在重組蛋白的氨基末端不存在甲硫氨酸，必須在該位置加上一個(gè)氨基末端甲硫氨酸。一般經(jīng)過(guò)在編碼重組蛋白質(zhì)的DNA序列前加上ATG甲硫氨酸密碼子實(shí)現(xiàn)添加氨基末端甲硫氨酸。加上的N-末端甲硫氨酸通常不能從重組蛋白上去掉，特別是如果重組蛋白是不溶性蛋白時(shí)。hGH就是這種情況，當(dāng)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該蛋白時(shí)，N-末端甲硫氨酸不去掉。加入的N-末端甲硫氨酸產(chǎn)生“非天然”的蛋白質(zhì)，它可潛在地刺激人體免疫反應(yīng)。相反，在使用stII(Chang等，1987)或ompA(Cheah等，1994)信號(hào)序列分泌進(jìn)周質(zhì)空間的hGH上沒(méi)有添加的甲硫氨酸；該重組蛋白以天然氨基末端氨基酸苯丙氨酸為起始氨基酸。由于細(xì)菌酶在stII(或ompA)信號(hào)序列和成熟hGH蛋白起始處之間裂解stII-hGH蛋白質(zhì)(或ompA-hGH蛋白質(zhì))，因此保留了天然的hGH蛋白質(zhì)。盡管據(jù)信周質(zhì)空間是一個(gè)促進(jìn)二硫鍵形成的氧化環(huán)境，但蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶與牛胰腺胰蛋白酶抑制劑的共表達(dá)導(dǎo)致來(lái)自大腸桿菌周質(zhì)的正確折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高6倍(Ostermeier等，(1996))。這一結(jié)果表明周質(zhì)蛋白折疊有時(shí)可能是無(wú)效的且需要改進(jìn)以適用大規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
hGH具有4個(gè)半胱氨酸，形成兩個(gè)二硫鍵。可使用stII或ompA信號(hào)序列將hGH分泌進(jìn)大腸桿菌周質(zhì)中。分泌的蛋白質(zhì)是可溶的且具有生物學(xué)活性(Hsiung等，1986)。hGH的主要分泌形式是一種單體，以十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)得的表觀分子量為22kDa。經(jīng)過(guò)使用滲透壓休克方法可從周質(zhì)空間分離重組hGH(Koshland和Botstein，1980)，其中優(yōu)先釋放周質(zhì)蛋白質(zhì)而不是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)入滲透壓休克緩沖液。然后經(jīng)過(guò)柱層析純化釋放的hGH蛋白質(zhì)(Hsiung等，1986)。
當(dāng)嘗試相似的方法分泌含游離半胱氨酸殘基的hGH變異體(5個(gè)半胱氨酸；2N+1)時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用用于hGH的標(biāo)準(zhǔn)滲透壓休克和純化方法分離時(shí)重組hGH變異體形成多聚體并聚集。在滲透壓體克裂解產(chǎn)物中或在柱層析純化蛋白質(zhì)期間以非還原性SDS-PAGE可檢測(cè)到極少的單體hGH。
α-干擾素(IFN-α2)也含有4個(gè)半胱氨酸殘基，形成兩個(gè)二硫鍵?？墒褂胹tII信號(hào)序列將IFN-α2分泌進(jìn)大腸桿菌周質(zhì)中(Voss等，1994)。分泌的蛋白質(zhì)是可溶的且具有生物學(xué)活性(Voss等，1994)。IFN-α2的主要分泌形式是一種單體，以SDS-PAGE測(cè)得的表觀分子量為19kDa。經(jīng)過(guò)柱層析純化分泌的重組IFN-α2蛋白質(zhì)(Voss等，1994)。
當(dāng)嘗試相似的方法分泌含游離半胱氨酸殘基的IFN-α2變異體(5個(gè)半胱氨酸；2N+1)時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用用于IFN-α2的標(biāo)準(zhǔn)純化方法分離時(shí)重組IFN-α2變異體形成多聚體并聚集。從柱中洗脫的IFN-α2變異體極不同于IFN-α2且使用用于IFN-α2的柱層析方法可純化極少的單體IFN-α2變異體。
合成含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的另一方法是經(jīng)過(guò)與琥珀酰亞胺6-[(3-2-吡啶二硫代)丙酰胺基]己酸(LC-SPDP，可從Pierce化學(xué)公司買到)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)將巰基引入翻譯后的蛋白質(zhì)中。LC-SPDP與賴氨酸殘基反應(yīng)產(chǎn)生游離巰基。使用該試劑結(jié)合馬來(lái)酰亞胺蛋白修飾試劑可制備化學(xué)交聯(lián)二聚體EPO(Sytkowsk等，1998)。由于EPO中各個(gè)賴氨酸殘基的非特異性修飾，純化后回收到化學(xué)交聯(lián)的EPO蛋白質(zhì)的異型混合物。已觀察到化學(xué)交聯(lián)的EPO蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)效價(jià)增強(qiáng)。
已被用于增加蛋白質(zhì)大小并提高其體內(nèi)效價(jià)的另一方法包括使用化學(xué)交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)二聚體化。據(jù)認(rèn)為GH通過(guò)交聯(lián)兩個(gè)GH受體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)。GH-GH二聚體可能有助于增強(qiáng)受體二聚體化并因此放大細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。
Mockridge等(1998)已描述了化學(xué)交聯(lián)的二聚體hGH蛋白質(zhì)。使用水溶性交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)，可隨機(jī)衍化GH以主要產(chǎn)生酰胺連接的二聚體，取決于所用的EDC試劑的濃度也可產(chǎn)生酰胺交聯(lián)的多聚體。盡管觀察到體內(nèi)效價(jià)提高，但由于EDC試劑與蛋白質(zhì)中的各種氨基酸，包括賴氨酸，天冬氨酸和谷氨酸殘基和氨基和羧基末端的非特異性反應(yīng)使得最終的蛋白制品是異型的。由于EDC的毒性和對(duì)蛋白質(zhì)之間形成的非天然酰胺鍵的潛在免疫原性反應(yīng)，將該制品注射進(jìn)人體是不理想的。在生產(chǎn)規(guī)模上產(chǎn)生一致批次的純化蛋白也是困難的。
因此，盡管作出了極大的努力，仍然需求經(jīng)過(guò)增加分子量產(chǎn)生長(zhǎng)效重組蛋白的同型制品的方法。也需要允許以高產(chǎn)量分泌和回收含游離半胱氨酸殘基的重組蛋白的方法。本發(fā)明滿足了這些需要并提供了相關(guān)優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及獲得具有游離半胱氨酸的可溶性蛋白質(zhì)的方法。該方法一般通過(guò)獲得能表達(dá)該可溶性蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，將該宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸，并從該宿主細(xì)胞中分離該可溶蛋白來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)不被宿主細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基中，在半胱氨酸封閉劑存在的條件下破碎宿主細(xì)胞并從破碎的宿主細(xì)胞可溶性部分分離或純化該可溶性蛋白質(zhì)。在另一種其中宿主細(xì)胞將該可溶性蛋白質(zhì)分泌進(jìn)培養(yǎng)基的實(shí)施方式中，在宿主細(xì)胞合成該可溶性蛋白質(zhì)之前，期間或之后將宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸。
合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，酵母，昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的是，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，特別是大腸桿菌。
優(yōu)選的是，以本發(fā)明的方法生產(chǎn)的可溶性蛋白質(zhì)是重組蛋白質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)的半胱氨酸變異體或突變體。該方法用于產(chǎn)生包括，但不限于下列的蛋白質(zhì)，人生長(zhǎng)激素，EPO和干擾素，特別是α干擾素，它們的衍生物或拮抗劑。其它蛋白質(zhì)包括TGF-β超家族的成員，血小板衍生的生長(zhǎng)因子-A，血小板衍生的生長(zhǎng)因子-B，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)(neurotophic)因子，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，或其衍生物或拮抗劑。也包括免疫球蛋白重鏈或輕鏈或其衍生物的半胱氨酸突變蛋白。
有用的半胱氨酸封閉劑包括任何巰基反應(yīng)性化合物，包括例如，胱氨酸，胱胺，二巰基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，碘，過(guò)氧化氫，二氫抗壞血酸，連四硫酸鹽，鄰-亞碘?；郊姿峄蛟诮饘匐x子存在下的氧。
本方法還包括將PEG部分附著到可溶性蛋白上形成PEG化蛋白質(zhì)的各種方法，其中PEG部分通過(guò)游離半胱氨酸附著到可溶性蛋白質(zhì)上。含有兩個(gè)或更多個(gè)可溶性蛋白質(zhì)偶連的更高級(jí)多聚體蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還包括以本文公開(kāi)的方法制備的可溶性蛋白質(zhì)及其衍生物，包括PEG化蛋白質(zhì)。該P(yáng)EG化蛋白質(zhì)包括單PEG化hGH，EPO和α干擾素。
本發(fā)明還提供了以本文描述的方法獲得的PEG化可溶性蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括純化蛋白質(zhì)，用二硫鍵(disulfie)還原劑至少部分還原該蛋白質(zhì)并將該蛋白質(zhì)與半胱氨酸反應(yīng)性部分接觸。任選的是，可從未修飾的蛋白質(zhì)中分離該修飾的半胱氨酸蛋白。
本發(fā)明還包括治療可用生長(zhǎng)激素，EPO和α干擾素治療的癥狀的方法。將可溶性蛋白質(zhì)或其衍生物，包括PEG化衍生物給病人用藥，其中已知生長(zhǎng)激素，EPO或α干擾素對(duì)其所患的癥狀有效。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是通過(guò)重疊延伸進(jìn)行誘變的圖解，其中從一個(gè)靶DNA片段擴(kuò)增兩個(gè)不同的片段。
本發(fā)明的描述本發(fā)明提供了獲得具有游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的新方法。本發(fā)明還提供了以這些新方法生產(chǎn)的新蛋白質(zhì)，特別是重組蛋白質(zhì)以及這些重組蛋白質(zhì)的衍生物。制備這些蛋白質(zhì)的新方法一般通過(guò)下列步驟完成(a)獲得能夠表達(dá)具有游離半胱氨酸的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；(b)將該宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸；和(c)從該宿主細(xì)胞分離該蛋白質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在半胱氨酸封閉劑存在的條件下破碎該宿主細(xì)胞，隨后從破碎細(xì)胞的可溶性部分中分離該蛋白質(zhì)的步驟。
在另一實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)由原核或真核宿主細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基中，該方法包括下列步驟(a)獲得能夠表達(dá)具有游離半胱氨酸的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；(b)在該具有游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的合成期間，或合成之后但在純化之前將該宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸；和(c)從培養(yǎng)基的其它細(xì)胞成份中分離該蛋白質(zhì)。
如上所述，這些方法的第一步是獲得能夠表達(dá)具有游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞?？捎糜诒磉_(dá)重組蛋白質(zhì)的合適的宿主細(xì)胞的例子包括細(xì)菌，酵母，昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞特別有用，特別是大腸桿菌。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“具有游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)”指任意含有2N+1個(gè)半胱氨酸殘基的天然或重組蛋白肽，其中，N可以是0或任意整數(shù)，和含有2N個(gè)半胱氨酸的蛋白質(zhì)或肽，其中兩個(gè)或多個(gè)半胱氨酸在正常情況下不參與形成二硫鍵。因此，本發(fā)明的方法可有效用于增強(qiáng)具有游離半胱氨酸的任意蛋白質(zhì)或肽，特別是具有一個(gè)或多個(gè)游離半胱氨酸和/或具有2個(gè)或多個(gè)在天然情況下形成二硫鍵的半胱氨酸的半胱氨酸添加型重組蛋白質(zhì)變體(本文稱為“半胱氨酸突變蛋白”或“半胱氨酸變異體”)的表達(dá)，回收和純化。盡管可用本發(fā)明的方法增強(qiáng)被其天然宿主細(xì)胞表達(dá)的具有游離半胱氨酸的天然蛋白質(zhì)的表達(dá)，回收和純化，但本文的描述主要是指僅用于說(shuō)明目的的重組蛋白質(zhì)。另外，所述蛋白質(zhì)可來(lái)自任何動(dòng)物種類，包括人類，陪伴(companion)動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物。
因此本發(fā)明包括廣泛的重組蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)包括，但不限于，膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)，TGF-β2，TGF-β3，抑制素A，抑制素B，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)，BMP-4，抑制素α，米勒抑制物質(zhì)(MIS)，OP-1(成骨蛋白1)，它們都是TGF-β超家族的成員。TGF-β超家族的單體亞基有一些共同的結(jié)構(gòu)特征它們一般含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，形成4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。一般第9個(gè)保守的半胱氨酸在蛋白質(zhì)的單體形式中是游離的，但參與單體亞基的同型二聚體化或雜二聚體化期間形成的分子間二硫鍵。TGF-β超家族的其它成員由Massague(1990)，Daopin等(1992)，Kingsley(1994)，Kutty等(1998)和Lawton等(1997)描述，本文引用以供參考。
免疫球蛋白重鏈和輕鏈單體也含有參與分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基以及游離半胱氨酸(Roitt等，1989和Paul，1989)。這些游離半胱氨酸一般僅參與多聚體化事件中形成的二硫鍵，例如，重鏈同型二聚體化，重鏈-輕鏈雜二聚體化，雜二聚體(重鏈-輕鏈)的同型二聚體化，和其它高級(jí)裝配，例如，IgM中雜二聚體(重鏈-輕鏈)的五聚體化。因此，可采用本發(fā)明的方法增強(qiáng)諸如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，分泌型IgA，IgD和IgE等人類免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈(或其各結(jié)構(gòu)域)的表達(dá)，回收和純化。也可同樣表達(dá)，回收和純化來(lái)自其它物種的免疫球蛋白。同樣，也可表達(dá)，回收和純化Chammow & Ashkenazi(1996)中所述的遺傳融合到免疫球蛋白或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域上的蛋白質(zhì)。
本方法也可增強(qiáng)包括生長(zhǎng)激素超家族成員的其它重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，回收和純化。下列蛋白質(zhì)由生長(zhǎng)激素(GH)超基因家族的基因編碼(Bazan(1990)；Bazan(1991)；Mott和Campbell(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996)；Martin等，1990；Hannum等，1994)生長(zhǎng)激素，泌乳素，胎盤(pán)催乳激素，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12(p53亞基)，IL-13，IL-15，制癌蛋白M，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，白血病抑制因子，α干擾素，β干擾素，γ干擾素，Ω干擾素，τ干擾素，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，心臟營(yíng)養(yǎng)蛋白-1(CT-1)，干細(xì)胞因子和flt3/flk2配體(“GH超基因家族”)?？深A(yù)期將來(lái)可通過(guò)基因克隆和測(cè)序鑒定該基因家族中的其它成員。GH超基因家族的成員具有相似的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管事實(shí)上它們一般具有有限的氨基酸或DNA序列相同性。共同的結(jié)構(gòu)特征使得該基因家族的新成員容易被鑒定。
根據(jù)稱為“半胱氨酸結(jié)”的共同結(jié)構(gòu)基序?qū)⒁唤M蛋白質(zhì)分類為結(jié)構(gòu)超家族。半胱氨酸結(jié)由6個(gè)保守的半胱氨酸殘基限定，形成拓?fù)鋵W(xué)上“打結(jié)”的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(McDonald和Hendrickson，1993)。這些蛋白質(zhì)也形成同型二聚體或雜二聚體，且有些但不是所有情況下二聚體化涉及分子間二硫鍵形成。該家族的成員包括TGF-β超家族的成員和其它蛋白質(zhì)，例如，血小板衍生的生長(zhǎng)因子-A(PDGF-A)，PDGF-B，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)，NT-4，和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。胱氨酸和其它半胱氨酸封閉劑也可增強(qiáng)具有該結(jié)構(gòu)基序的蛋白質(zhì)的表達(dá)，回收和純化。
本方法也可增強(qiáng)其它重組蛋白質(zhì)和/或這些蛋白質(zhì)的半胱氨酸添加型變異體的表達(dá)，回收和純化。蛋白質(zhì)的類型包括蛋白酶和其它酶，蛋白酶抑制劑，細(xì)胞因子，細(xì)胞因子拮抗劑，過(guò)敏原，趨化因子，促性腺激素，趨化素(chemotactin)，脂結(jié)合蛋白，垂體激素，生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，免疫球蛋白，白細(xì)胞介素，干擾素，可溶性受體，疫苗和血紅蛋白。蛋白質(zhì)的具體例子包括，例如，leptin，胰島素，胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)，超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶，天冬氨酸酶，尿酸酶，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，精氨酸酶，苯丙氨酸氨(phenylalanine ammonia)，制管張素，內(nèi)抑制素(endostatin)，VIII因子，IX因子，白細(xì)胞介素1受體拮抗劑，蛋白酶連接蛋白和抗凝血酶III。
其它得益于PEG化且因此可作為半胱氨酸添加型修飾的合理候選者的蛋白質(zhì)變異體包括具有微弱可溶性或容易聚集的蛋白質(zhì)或肽，對(duì)蛋白水解易感的蛋白質(zhì)或肽，需要增強(qiáng)機(jī)械穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)或肽，從體內(nèi)迅速清除的蛋白質(zhì)或肽，或具有不需要的免疫原性或抗原性特征的蛋白質(zhì)或肽。
如果需要，一般可使用以定點(diǎn)PCR為基礎(chǔ)的誘變構(gòu)建天然蛋白質(zhì)的突變體，一般按下述文獻(xiàn)的描述進(jìn)行分子生物學(xué)方法第15卷PCR方法常規(guī)(current)方法和應(yīng)用，White，B.A.編(1993)，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ和PCR方法方法和應(yīng)用指南，Innis，M.A.等編，(1990)，學(xué)院出版社，San Diego，CA。通常將PCR引物寡核苷酸設(shè)計(jì)為能在蛋白質(zhì)的編碼序列中摻入核苷酸改變，導(dǎo)致在蛋白質(zhì)特定位置的一個(gè)氨基酸被半胱氨酸殘基取代。也可將這類誘變的寡核苷酸引物設(shè)計(jì)成在蛋白質(zhì)編碼序列的羧基末端或氨基末端摻入一個(gè)額外的半胱氨酸殘基。如果需要的話，在后一種情況下，也可將一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸殘基摻入到所添加的半胱氨酸殘基的氨基末端和/或羧基末端。而且如果需要的話，可將寡核苷酸設(shè)計(jì)成在蛋白質(zhì)編碼序列的特定位置將半胱氨酸殘基作為插入突變而摻入。同樣，也可與半胱氨酸殘基一起插入一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸，這些氨基酸可位于該半胱氨酸殘基的氨基末端和/或羧基末端。
對(duì)誘變型寡核苷酸(oligo)的序列的選擇依賴于所需半胱氨酸將要放入的位置和有用的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的相似性。一般來(lái)說(shuō)，需要在靠近寡核苷酸中央的位置放置突變，即，錯(cuò)配片段以增強(qiáng)寡核苷酸與模板的退火。也需要使該誘變型寡核苷酸跨越一個(gè)特有的限制性位點(diǎn)，以便可裂解PCR產(chǎn)物產(chǎn)生一個(gè)容易被克隆進(jìn)合適載體的片段。一個(gè)例子是可用于表達(dá)突變蛋白或提供用于切下突變基因并容易將其克隆進(jìn)所述表達(dá)載體的常規(guī)限制性位點(diǎn)的寡核苷酸。一般需要采用長(zhǎng)度為80個(gè)堿基以下的誘變型寡核苷酸，更優(yōu)選30-40個(gè)堿基長(zhǎng)度。有時(shí)突變位點(diǎn)和限制性位點(diǎn)分開(kāi)，其距離大于合成性寡核苷酸合成所需的距離。在這種情況下，可采用多輪PCR遞增式延長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，以便它可包括所需有用的限制性位點(diǎn)或可重新改造或重新合成作為誘變的靶的基因以便在合適的位置插入限制性位點(diǎn)。另外，也可采用PCR誘變方法的變化形式構(gòu)建該突變，例如，所謂的“大引物方法”(Barik，S.，分子生物學(xué)方法，第15卷，第277-286頁(yè)；PCR方法常規(guī)方法和應(yīng)用，White，B.A.編輯(1993)Humana出版社，Totowa，NJ)或“通過(guò)重疊延伸實(shí)施的基因剪接”(Horton，R.M.分子生物學(xué)方法，第15卷，第251-261頁(yè)；PCR方法常規(guī)方法和應(yīng)用，White，B.A.編輯(1993)Humana出版社，Totowa，NJ)，均為本文引用以供參考。
接著，將宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該封閉劑在細(xì)胞破碎時(shí)存在，且優(yōu)選在破碎細(xì)胞前加入。細(xì)胞破碎可經(jīng)過(guò)，例如，機(jī)械剪切(例如費(fèi)氏細(xì)胞壓碎器)，酶消化，超聲處理，勻漿，玻璃珠旋轉(zhuǎn)，去污劑處理，有機(jī)溶劑，凍融，用氧化鋁或沙研磨等(Bollag等，1996)。
在另一實(shí)施方案中，在誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)所需蛋白質(zhì)之前，期間或之后將半胱氨酸封閉劑與宿主細(xì)胞接觸。例如，可在半胱氨酸封閉劑存在的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中優(yōu)選表達(dá)將被分泌進(jìn)培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)，如促紅細(xì)胞生成素?；蛘撸谒拗骷?xì)胞接觸半胱氨酸封閉劑之前或期間，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞，或者作為分泌進(jìn)周質(zhì)或培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，或者作為胞質(zhì)蛋白質(zhì)，來(lái)表達(dá)所需蛋白質(zhì)?？筛鶕?jù)細(xì)胞來(lái)源使用本領(lǐng)域已知的方法誘導(dǎo)該細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)或指導(dǎo)分泌，包括，例如，在下面實(shí)施例中所述的方法。已成功使用各種信號(hào)肽將蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)空間。其例子包括原核信號(hào)序列，例如，ompA，stII，PhoA信號(hào)(Denefle等，1989)，OmpT(Johnson等，1996)，LamB和OmpF(Hoffman和Wright，1985)，β-內(nèi)酰胺酶(Kadonaga等，1984)，腸毒素LT-A，LT-B(Morioka-Fujimoto等，1991)，和來(lái)自金黃色葡萄球菌的蛋白A(Abrahmsen等，1986)。幫助某些蛋白質(zhì)分泌的許多非天然的，合成的信號(hào)序列也是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。
對(duì)于分泌進(jìn)周質(zhì)的蛋白質(zhì)，可使用滲透壓休克處理選擇性地破壞宿主細(xì)胞的外膜使得周質(zhì)蛋白質(zhì)釋放。滲透壓休克緩沖液可以是本領(lǐng)域已知的任何滲透壓休克緩沖液，包括，例如，Hsiung等(1986)所述的滲透壓休克緩沖液和方法，或如下面實(shí)施例所述。對(duì)于分泌進(jìn)培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)，優(yōu)選在細(xì)胞表達(dá)和分泌該蛋白質(zhì)時(shí)培養(yǎng)基含有半胱氨酸封閉劑。也可以在蛋白質(zhì)分泌后但在蛋白質(zhì)純化之前向培養(yǎng)基中加入半胱氨酸封閉劑。
向培養(yǎng)基中加入的半胱氨酸封閉劑的濃度范圍是大約0.1μM至大約100mM。優(yōu)選的是，培養(yǎng)基中半胱氨酸封閉劑的濃度是大約50μM至大約5mM。
盡管不希望受任何特定的理論所束縛，但據(jù)信用于本方法的半胱氨酸封閉劑共價(jià)附著到“游離”的半胱氨酸殘基上，形成混合的二硫化物，從而穩(wěn)定游離的半胱氨酸殘基并防止蛋白質(zhì)的多聚體化和聚集。另外，如果在蛋白質(zhì)分泌進(jìn)周質(zhì)空間后發(fā)生不完全復(fù)性，那么在滲透壓休克緩沖液中氧化劑的存在可能擴(kuò)大蛋白質(zhì)的再折疊過(guò)程。然而，如上所述，周質(zhì)蛋白質(zhì)再折疊的效率可能較低(ineffcient)。因此，據(jù)信向滲透壓休克緩沖液中加入胱氨酸也可增加含有偶數(shù)個(gè)半胱氨酸殘基的重組蛋白質(zhì)的回收，即使在正常情況下半胱氨酸形成二硫鍵。另外，本發(fā)明人相信在細(xì)菌生長(zhǎng)期間向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入胱氨酸或類似化合物可能是具有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)橛捎诩?xì)菌外膜的多孔性這些化合物可擴(kuò)散進(jìn)周質(zhì)。蛋白折疊和游離半胱氨酸的封閉可在細(xì)胞回收和裂解前完成。早期的蛋白質(zhì)穩(wěn)定可防止蛋白水解且有助于獲得更高的重組蛋白回收率。
許多巰基反應(yīng)性化合物可用作半胱氨酸封閉劑以穩(wěn)定含有游離半胱氨酸的蛋白質(zhì)。除了胱氨酸外，封閉劑也包括含二硫鍵的試劑，例如，胱胺，二巰基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(Ellman′s試劑)，吡啶二硫化物，R-S-S-CO-OCH3型化合物，胱氨酸的其它衍生物，例如二甲酰胱氨酸，二乙酰胱氨酸，二甘氨酰胱氨酸，二丙氨酰胱氨酸，二谷氨酰胱氨酸，胱氨酰二甘氨酸，胱氨酰二谷氨酰胺，二丙氨酰胱氨酸二酐，胱氨酸苯基乙內(nèi)酰脲，高胱氨酸，二硫代二丙酸，二甲基胱氨酸，或任何二巰基化合物或能進(jìn)行二硫化物交換反應(yīng)的化合物。亞氧硫基鹵化物也可用于制備混合的二硫化物?？捎糜诜€(wěn)定半胱氨酸添加型蛋白變異體的其它巰基封閉劑包括能與游離巰基可逆反應(yīng)的化合物。這些試劑包括某些重金屬鹽或鋅，汞和銀的有機(jī)衍生物。其它硫醇鹽形成劑或可逆性巰基反應(yīng)性化合物如R.Cecil和J.R.McPhee，(1959)和Torchinskii，(1971)所述。
在一般方法的最后一步中，所需的蛋白質(zhì)從可溶性細(xì)胞質(zhì)部分，可溶性周質(zhì)部分或培養(yǎng)基的可溶性部分回收和純化?？墒褂脧呐囵B(yǎng)基，細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)部分回收和純化蛋白質(zhì)的任何方法。這些回收和純化方法是已知的或本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易確定的，包括，例如，離心，過(guò)濾，透析，層析，包括大小排阻層析等方法?；厥蘸图兓璧鞍踪|(zhì)的合適方法部分取決于蛋白質(zhì)的特性和目的用途。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生可溶性干擾素，特別是α干擾素的新方法，導(dǎo)致回收的正確加工的干擾素的百分比顯著提高。該方法包括在大約5到大約6.5，且優(yōu)選大約5.5到大約6.5的pH范圍內(nèi)培養(yǎng)能表達(dá)干擾素的宿主細(xì)胞。已公開(kāi)的報(bào)道(Voss等，(1994))使用更高的pH僅產(chǎn)生50％正確加工的干擾素，而本發(fā)明的新方法在較低的pH下回收到大約80-90％。
已發(fā)現(xiàn)某些單體hGH半胱氨酸變異體在使用層析方法純化這些蛋白質(zhì)時(shí)形成二硫鍵連接的二聚體hGH蛋白質(zhì)。當(dāng)從柱緩沖溶液中去除胱氨酸時(shí)形成二硫鍵連接的hGH二聚體。由于二硫鍵連接的二聚體hGH蛋白質(zhì)在使用柱層析步驟純化該蛋白質(zhì)的過(guò)程中行為不同于單體hGH蛋白質(zhì)，因此開(kāi)發(fā)了純化二硫鍵連接的二聚體hGH蛋白質(zhì)的新方法。意想不到的是，已發(fā)現(xiàn)這些二硫鍵連接的二聚體hGH蛋白質(zhì)在體外生物試驗(yàn)中具有生物學(xué)活性。具有生物學(xué)活性的，同型的，二硫鍵連接的二聚體hGH蛋白質(zhì)是新的。因此，本發(fā)明還涉及這些具有生物學(xué)活性的，同型的，二硫鍵連接的二聚體hGH蛋白質(zhì)。也包含高級(jí)多聚體，包括三聚體，四聚體等，如下面實(shí)施例所述。
如果需要，可進(jìn)一步加工純化的蛋白質(zhì)。例如，該蛋白質(zhì)可用各種半胱氨酸反應(yīng)性PEG試劑在游離半胱氨酸位點(diǎn)被PEG化，并隨后作為單PEG化蛋白質(zhì)純化。術(shù)語(yǔ)“單PEG化”定義為指通過(guò)單個(gè)PEG部分共價(jià)附著到蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)而修飾的蛋白質(zhì)?？墒褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法，包括，例如，下面實(shí)施例，特別是實(shí)施例11中描述的方法。
Braxton(1998)教導(dǎo)了使蛋白質(zhì)的半胱氨酸突變蛋白，特別是GH和促紅細(xì)胞生成素的半胱氨酸突變蛋白PEG化的方法。特別是Braxton(1998)教導(dǎo)了用于PEG化半胱氨酸突變蛋白的緩沖液不應(yīng)含有還原劑。Braxton(1998)提供的還原劑的例子是β巰基乙醇(BME)和二硫蘇糖醇(DTT)。當(dāng)使用相似方法來(lái)PEG化GH，促紅細(xì)胞生成素和α干擾素的半胱氨酸突變蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些半胱氨酸突變蛋白不與PEG連接?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)用還原劑處理純化的半胱氨酸突變蛋白是蛋白質(zhì)與PEG化蛋白質(zhì)所必需的。盡管不希望被任何具體理論所束縛，但本發(fā)明人相信還原劑是還原混合的二硫化物并暴露蛋白質(zhì)中的游離半胱氨酸殘基以便游離的半胱氨酸與PEG試劑反應(yīng)所必需的。因此，本發(fā)明還涉及使GH，促紅細(xì)胞生成素，α干擾素的半胱氨酸突變蛋白和其它含有2N+1個(gè)半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)，含有2N個(gè)半胱氨酸殘基且其中2個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基游離的蛋白質(zhì)，特別是游離半胱氨酸殘基被混合的二硫化物封閉的那些突變體和蛋白質(zhì)PEG化的方法。
本發(fā)明還涉及由本文公開(kāi)的方法產(chǎn)生的純化的，單PEG化蛋白質(zhì)變異體，它們不僅具有生物學(xué)活性，還在蛋白質(zhì)依賴型哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖試驗(yàn)中保持高比活。所述蛋白質(zhì)變異體包括，例如，下列純化的，單PEG化半胱氨酸突變蛋白hGH，EPO和αIFN。例如，單PEG化hGH變異體的體外生物學(xué)活性比使用NHS-PEG試劑PEG化的hGH的生物學(xué)活性高10-100倍。
在單PEG化hGH的一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇附著到hGH的C-D環(huán)上，所得的單PEG化hGH的EC50不到大約110ng/ml(5nM)，優(yōu)選不到大約50ng/ml(2.3nM)。另外，聚乙二醇部分可附著到hGH的靠近螺旋A的區(qū)域，所得的單PEG化hGH的EC50不到大約110ng/ml(5nM)，優(yōu)選不到大約11ng/ml(0.5nM)，更優(yōu)選不到大約2.2ng/ml(0.1nM)。
在單PEG化EPO的一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇附著到EPO的C-D環(huán)上，所得的單PEG化EPO的EC50不到大約1000ng/ml(21nM)，優(yōu)選不到大約100ng/ml(大約6nM)，更優(yōu)選不到大約10ng/ml(0.6nM)，最優(yōu)選不到大約1ng/ml(大約0.06nM)。另外，聚乙二醇分子可附著到EPO的A-3環(huán)上，所得的單PEG化EPO的EC50不到大約100ng/ml(大約5nM)，優(yōu)選不到20ng/ml(大約1nM)，且更優(yōu)選不到大約1ng/ml(大約0.05nM)。
在單PEG化αIFN的一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇附著到αIFN的靠近螺旋A的區(qū)域，所得的單PEG化αIFN的IC50不到大約100pg/ml(大約5pM)，更優(yōu)選不到大約50pg/ml(大約2.5pM)，最優(yōu)選大約22ng/ml(大約1.2pM)。另外，聚乙二醇分子可附著到IFN-α2的C-D環(huán)上，所得的單PEG化IFN-α2的EC50不到大約100pg/ml(大約5pM)。
有25個(gè)以上不同的IFN-α基因(Pestka等，1987)。IFN-α家族的成員具有不同程度的氨基酸同源性且表現(xiàn)出生物學(xué)活性的重疊。通過(guò)將不同IFN-α蛋白質(zhì)的區(qū)域連接起來(lái)產(chǎn)生的非天然重組IFN-α處于臨床開(kāi)發(fā)的各個(gè)階段(Horisberger和DiMarco，1995)。也描述了在IFN-α的各位置摻入最常見(jiàn)氨基酸的非天然“共有”干擾素(Blatt等，1996)。使IFN-α2的半胱氨酸突變蛋白PEG化的合適位置可直接適用于IFN-α基因家族的其它成員和非天然IFN-α。Kinstler等，(1996)描述了單PEG化共有干擾素，其中該蛋白質(zhì)在N-末端，非天然的甲硫氨酸殘基上優(yōu)先與單個(gè)PEG連接。PEG化蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性比未修飾的共有干擾素降低大約5倍(Kinstler等，1996)。
本發(fā)明還提供了互相之間或與化學(xué)基團(tuán)之間能共價(jià)附著或連接以產(chǎn)生高級(jí)多聚體，如二聚體，三聚體和四聚體的蛋白質(zhì)變異體。可按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法或按下面實(shí)施例15所述的方法產(chǎn)生該高級(jí)多聚體。例如，該連接可產(chǎn)生比相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)具有更高分子量的hGH，EPO或αIFN加合物。適用于偶連的化學(xué)基團(tuán)優(yōu)選是非毒性的和非免疫原性的。這些化學(xué)基團(tuán)包括糖類或聚合物，例如多元醇。
用于附著本發(fā)明的半胱氨酸變異體以形成“PEG化”蛋白質(zhì)的“PEG部分”包括任何合適的多聚體，例如，線性或帶支鏈的多元醇。優(yōu)選的多元醇是聚乙二醇，它是由環(huán)氧乙烷單元組成的合成多聚體?？筛淖儹h(huán)氧乙烷單元以便通過(guò)大小排阻層析獲得表觀分子量范圍為大約30-500,000的PEG化蛋白質(zhì)變異體。PEG部分的大小直接影響其循環(huán)半衰期(Yamaoka等，(1994))。因此，可通過(guò)改變PEG部分的大小或結(jié)構(gòu)來(lái)加工具有不同循環(huán)半衰期的蛋白變異體使之用于具體治療應(yīng)用或優(yōu)選的劑量方案。因此，本發(fā)明包含GH蛋白質(zhì)變異體，其以大小排阻層析測(cè)定具有超過(guò)大約30kDa，且更優(yōu)選超過(guò)大約70kDa的表觀分子量，其EC50不到大約400ng/ml(18nM)，優(yōu)選不到10ng/ml(5nM)，更優(yōu)選不到大約10ng/ml(0.5nM)，甚至更優(yōu)選不到大約2.2ng/ml(0.1nM)。本發(fā)明還包含EPO蛋白質(zhì)變異體，其以大小排阻層析測(cè)定具有超過(guò)大約30kDa，且更優(yōu)選超過(guò)大約70kDa的表觀分子量，其EC50不到大約1000ng/ml(21nM)，優(yōu)選不到100ng/ml(6nM)，更優(yōu)選不到大約10ng/ml(0.6nM)，甚至更優(yōu)選不到大約1ng/ml(0.06nM)。本發(fā)明還包含αIFN(IFN-α)蛋白質(zhì)變異體，其以大小排阻層析測(cè)定具有超過(guò)大約30kDa，且更優(yōu)選超過(guò)大約70kDa的表觀分子量，其IC50不到大約1900pg/ml(100pM)，優(yōu)選不到400pg/ml(21pM)，更優(yōu)選不到100pg/ml(5nM)，甚至更優(yōu)選不到大約38pg/ml(2pM)。
用于半胱氨酸修飾的反應(yīng)性PEG末端基團(tuán)包括但不限于乙烯砜，馬來(lái)酰亞胺和碘乙?；鶊F(tuán)。PEG末端基團(tuán)應(yīng)對(duì)游離巰基具有特異性，在不損傷蛋白質(zhì)的條件下發(fā)生反應(yīng)。
也可使用添加了半胱氨酸的變異型GH制備拮抗劑hGH變異體，其中化學(xué)衍化不干擾受體結(jié)合但阻止信號(hào)加工?？傻靡嬗贕H拮抗劑給藥的病癥包括肢端肥大癥，血管性眼病，糖尿性腎病，血管形成術(shù)后的再狹窄和生長(zhǎng)激素反應(yīng)性惡性腫瘤。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”指以本文方法表達(dá)和回收的任何蛋白質(zhì)變異體。這類變異體包括，但不限于，PEG化形式，二聚體或其它高級(jí)變異體，氨基酸變異體，融合蛋白，糖類的改變，磷酸化或在天然蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的其它附著基團(tuán)，以及本文公開(kāi)的任何其它變異體。
本文方法產(chǎn)生的化合物可用于各種體外和體內(nèi)用途。本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其衍生物可用于對(duì)于其野生型，天然的，或以前已知的修飾型對(duì)應(yīng)物已知的研究，診斷或治療目的。體外用途包括，例如，使用該蛋白質(zhì)用于篩選，檢測(cè)和/或純化其它蛋白質(zhì)。
對(duì)于治療用途，技術(shù)人員可容易地確定合適的劑量，給藥頻率和給藥途徑。作出這些決定的因素包括，但不限于，所施用的蛋白質(zhì)的特性，所需治療的病癥，潛在的病人應(yīng)變性，病人的年齡和體重等。本發(fā)明的化合物也可用作傳遞載體用于增強(qiáng)所附著的治療劑的循環(huán)半衰期或指導(dǎo)向體內(nèi)特異性靶的傳遞。
下面的實(shí)施例并不打算限制本發(fā)明，而僅僅是對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案的舉例。
實(shí)施例1人生長(zhǎng)激素體外生物測(cè)定的建立已建立了使用以兔GH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的鼠FDC-P1細(xì)胞系的hGH細(xì)胞增殖測(cè)定(Rowlinson等，1995)。小鼠FDC-P1細(xì)胞系從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心購(gòu)買且按常規(guī)在補(bǔ)充了10％胎牛血清，50μg/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，2mM谷氨酰胺和17-170單位/ml小鼠IL-3的RPMI1640培養(yǎng)基(FDC-P1培養(yǎng)基)中繁殖。
A.克隆編碼兔GH受體的cDNA使用正向引物BB3(5’-CCCCGGATCCGCCACCATGGATCTCTGGCAGCTGCTGTT-3’)(SEQ.ID.NO.1)和反向引物BB36(5’-CCCCGTCGACTCTAGAGCCATTA GATACAAAGCTCT TGGG-3’)(SEQ.ID.NO.2)經(jīng)過(guò)PCR克隆兔GH受體。BB3與編碼受體的起始甲硫氨酸和氨基末端部分的DNA序列退火。BB3含有一個(gè)在起始甲硫氨酸之前的優(yōu)化的KOZAK序列和用于克隆目的的Bam HI位點(diǎn)。BB36與兔GH受體mRNA的3’不翻譯區(qū)退火且含有用于克隆目的的Xba I和Sal I限制性位點(diǎn)。兔肝臟poly(A)+mRNA(從CLONTECH公司購(gòu)買)用作單鏈cDNA第一鏈合成的底物以產(chǎn)生用于PCR擴(kuò)增的模板。使用Boehringer Mannheim公司的用于RT-PCR(AMV)的第一鏈cDNA合成試劑盒完成單鏈cDNA的第一鏈合成。使用隨機(jī)六聚體或BB36作引物進(jìn)行平行的第一鏈cDNA合成。使用第一鏈合成的產(chǎn)物作模板以引物BB3和BB36進(jìn)行隨后的PCR反應(yīng)。在使用隨機(jī)6聚體引發(fā)的或BB36引發(fā)的cDNA作模板的PCR反應(yīng)中觀察到預(yù)期的～1.9kb的PCR產(chǎn)物。用Bam HI和Xba I消化隨機(jī)6聚體引發(fā)的cDNA，產(chǎn)生兩個(gè)片段(～365bp和～1600bp)，因?yàn)橥肎H受體基因含有一個(gè)內(nèi)部Bam HI位點(diǎn)。凝膠純化兩個(gè)片段。然后以兩步克隆全長(zhǎng)兔GH受體cDNA。首先將～1600bp的Bam HI-Xba I片段克隆進(jìn)已用相同的這兩個(gè)酶消化的pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司)中。這些克隆容易以合理的頻率獲得并且以限制性消化和隨后的測(cè)序顯示沒(méi)有缺失。為了完成兔受體cDNA克隆，將含有1600bp Bam HI-Xba I片段的一個(gè)測(cè)序質(zhì)粒用Bam HI消化，用小牛堿性磷酸酶處理，凝膠純化并與含有兔GH受體基因5’部分的凝膠純化的～365bp Bam HI片段連接。挑出連接后的轉(zhuǎn)化子并經(jīng)過(guò)限制性消化和PCR分析以證實(shí)存在～365bp的片段并測(cè)定其相對(duì)于兔GH受體基因遠(yuǎn)端片段的方向。然后證實(shí)全長(zhǎng)克隆的序列。該質(zhì)粒命名為pBBT118，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FDC-P1細(xì)胞。
B.選擇表達(dá)兔GH受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的FDC-P1細(xì)胞使用Qiagen的“無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒純化試劑盒”制備無(wú)內(nèi)毒素的pBBT118DNA用于轉(zhuǎn)染FDC-P1細(xì)胞。從R&D系統(tǒng)購(gòu)買小鼠IL-3。使用從GIBCO購(gòu)買的DMRIE-C陽(yáng)離子化的脂試劑，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明用質(zhì)粒pBBT118轉(zhuǎn)染FDC-P1細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在6孔組織培養(yǎng)盤(pán)中將4μg質(zhì)粒DNA與4-30μl DMRIE-C試劑在1ml的OptiMEM培養(yǎng)基(GIBCO)中混合45分鐘。復(fù)合物形成后，向各孔中加入2×106個(gè)在200μl補(bǔ)充了小鼠IL-3的OptiMEM培養(yǎng)基中的FDC-P1細(xì)胞且混合物在37℃放置4小時(shí)。最終的小鼠IL-3濃度為17單位/ml。向各孔中加入2ml含有15％胎牛血清的FDC-P1培養(yǎng)基并將細(xì)胞在37℃放置過(guò)夜。第二天將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有15ml補(bǔ)充了IL-3(17U/ml)，hGH(5nM)和10％馬血清而非胎牛血清的FDC-P1培養(yǎng)基中。由于有報(bào)道胎牛血清含有對(duì)FDC-P1細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)活性而使用馬血清。3天后離心細(xì)胞并重懸于含有400μg/ml G418，17U/ml IL-3，5nM hGH，10％馬血清的新鮮FDC-P1培養(yǎng)基中并在37℃下培養(yǎng)。每過(guò)幾天更換培養(yǎng)基。將各次轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分進(jìn)含有新鮮培養(yǎng)基以及小鼠IL-3(17U/m1)，或者h(yuǎn)GH(5nM)的T-75組織培養(yǎng)瓶中。從含有IL-3以及含有hGH的培養(yǎng)瓶中都獲得了G418抗性細(xì)胞。用于生物測(cè)定的轉(zhuǎn)化子來(lái)自含有hGH的培養(yǎng)瓶。經(jīng)過(guò)有限稀釋選擇了12個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞系。其中5個(gè)細(xì)胞系(GH-R3，-R4，-R5，-R6和-R9)顯示出對(duì)hGH較好的增殖應(yīng)答。初步實(shí)驗(yàn)表明各個(gè)細(xì)胞系對(duì)于hGH的EC50是相似的，盡管生長(zhǎng)應(yīng)答的大小隨細(xì)胞系發(fā)生變化。對(duì)GH-R4細(xì)胞系進(jìn)行了最詳細(xì)的研究并用于下面提供的測(cè)定。細(xì)胞系按常規(guī)在含有10％馬血清，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，2nM谷氨酰胺，400μg/ml G418和2-5nM垂體hGH或由GH的RPMI 1640培養(yǎng)基中繁殖。
C.使用表達(dá)兔GH受體的FDC-P1建立hGH生物測(cè)定建立Rowlinson等(1995)所述的MTT細(xì)胞增殖測(cè)定的改良形式以測(cè)量hGH的生物學(xué)活性。我們?cè)跍y(cè)定中測(cè)量了染料MTS的吸收和還原，該染料產(chǎn)生可溶性產(chǎn)物，它不同于MTT，MTT產(chǎn)生必須用有機(jī)溶劑溶解的不溶性產(chǎn)物。使用MTS的優(yōu)勢(shì)在于可測(cè)定孔中的吸光度而不需用有機(jī)溶劑裂解細(xì)胞。
用無(wú)酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌GH-R4細(xì)胞三次并以1×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸于測(cè)定培養(yǎng)基(無(wú)酚紅的RPMI 1640，10％馬血清，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，400μg/ml G418)中。向96孔平底組織培養(yǎng)板的孔中加入50微升細(xì)胞懸液(5×103個(gè)細(xì)胞)。在測(cè)定培養(yǎng)基中制備3倍系列稀釋的蛋白質(zhì)樣品并以50μl的體積加入微滴定孔中。產(chǎn)生每孔100μl的最終體積。蛋白質(zhì)樣品以一式三份孔進(jìn)行測(cè)定。平板在濕潤(rùn)的5％CO2組織培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)66-72小時(shí)，此時(shí)向各孔中加入20μl MTS/PES(PES是電子偶合劑)試劑混合物(CellTITER 96 Aqueous One溶液試劑，Promega公司)。2-4小時(shí)后在490nm下測(cè)定孔中的吸光度。計(jì)算一式三份孔中的吸光度平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)照孔含有培養(yǎng)基但無(wú)細(xì)胞。從樣品孔的吸光度值中減去對(duì)照孔的吸光度值(通常為0.06-0.2個(gè)吸光度單位)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)與在吸光度值2以內(nèi)吸光度信號(hào)細(xì)胞數(shù)相關(guān)。所有測(cè)定包括人垂體GH標(biāo)準(zhǔn)品。除了測(cè)定培養(yǎng)基不含G418且用胎牛血清取代馬血清外按上面所述進(jìn)行使用親本FDC-P1細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2克隆和表達(dá)rhGHA.克隆編碼人生長(zhǎng)激素(GH)的cDNA使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和引物BB1和BB2從人垂體單鏈cDNA(從CLONTECH公司，Palo Alto，CA購(gòu)買)擴(kuò)增人GH cDNA。BB1的序列是(5’-GGGGGTCGACCATATGTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3’)(SEQ.ID.NO.4)。BB2的序列是(5’-GGGGGATCCTCACTAGAAGCCACAGCTGCCCTC-3’)(SEQ.ID.NO.4)。引物BB1設(shè)計(jì)成編碼成熟GH的第一個(gè)氨基酸(苯丙氨酸)之前的起始甲硫氨酸和用于克隆目的的SalI和NdeI位點(diǎn)。反向引物BB2含有用于克隆目的的Bam HI位點(diǎn)。PCR反應(yīng)含有各20pmole的各種寡核苷酸引物，1XPCR緩沖液(含有MgCl2的Perkin-Elmer緩沖液)，4種核苷酸dA，dC，dG和dT的濃度各為200μM，2ng單鏈cDNA，2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer)和2.5單位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。PCR反應(yīng)條件為96℃3分鐘，35個(gè)循環(huán)的(95℃，1分鐘；63℃30秒；72℃1分鐘)，接著72℃10分鐘。使用的熱循環(huán)儀是Amplitron II熱循環(huán)儀(Thermolyne)。大約600bp的PCR產(chǎn)物用Sal I和Bam HI消化，凝膠純化并克隆進(jìn)同樣消化的質(zhì)粒pUC19(可從新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，Beverly，MA買到)中。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α中并在含氨芐青霉素的LB平板上選擇轉(zhuǎn)化子。幾個(gè)菌落在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過(guò)夜，使用從Qiagen公司(Valencia，CA)買到的小質(zhì)粒DNA分離試劑盒分離質(zhì)粒DNA。測(cè)定克隆LB6具有正確的DNA序列。
為了在大腸桿菌中表達(dá)，用Nde I和Eco RI消化克隆LB6，凝膠純化大約600bp的片段并克隆進(jìn)已用相同的酶消化并用小牛堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒pCYB1(可從新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，Beverly，MA買到)中。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α中并在含氨芐青霉素的LB平板上選擇轉(zhuǎn)化子。從幾個(gè)轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA并通過(guò)用Nde I和Eco RI消化進(jìn)行篩選。鑒定了一個(gè)正確的克隆并命名為pCYB1wtGH(pBBT120)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株JM109或W3110(可從新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得)中。
B.stII-GH的構(gòu)建使用野生型GH克隆LB6(pUC19野生型GH)作模板以構(gòu)建含有大腸桿菌stII信號(hào)序列的GH克隆。由于其長(zhǎng)度，在連續(xù)兩個(gè)PCR反應(yīng)中加入stII序列。第一個(gè)反應(yīng)使用正向引物BB12和反向引物BB10。BB10具有序列(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(SEQ.ID.NO.5)。BB12具有序列(5’-GCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3’)(SEQ.ID.NO.6)。PCR反應(yīng)按擴(kuò)增野生型GH的所述方法進(jìn)行。使用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)凝膠純化大約630bp的PCR產(chǎn)物，在水中稀釋50倍，取2μl用作第二次PCR反應(yīng)的模板。第二次PCR反應(yīng)使用反義引物BB10和正向引物BB11。BB11具有序列(5’CCCCCTCTAGACATATGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG-3’)(SEQ.ID.NO.7)。引物BB11含有用于克隆目的的XbaI和NdeI位點(diǎn)。PCR條件按第一次反應(yīng)所述進(jìn)行。大約660bp的PCR產(chǎn)物用XbaI和BamHI消化，凝膠純化并克隆進(jìn)同樣酶切的質(zhì)粒pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)中。測(cè)定克隆pCDNA3.1(+)∷stII-GH(5C)或“5C”具有正確的DNA序列。
用NdeI和BamHI裂解克隆“5C”并克隆進(jìn)同樣酶切的pBBT108(pUC19的缺失Pst I位點(diǎn)的衍生物，該質(zhì)粒在下面描述)中。用這些酶消化后鑒定具有正確插入片段的克隆。該克隆命名為pBBT111，用Nde I和Sal I消化該克隆，凝膠純化含有stII-GH融合基因的660bp的片段并克隆進(jìn)用相同酶消化并用小牛堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒表達(dá)載體pCYB1(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)中。用限制性核酸內(nèi)切酶消化鑒定含有stII-GH插入片段的重組質(zhì)粒。選擇一個(gè)這樣的分離物用于進(jìn)一步的研究并命名為pBBT114。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株JM109或W3110(可從新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得)中。
C.構(gòu)建ompA-GH使用野生型GH克隆LB6(pUC19野生型GH)作模板以構(gòu)建含有大腸桿菌ompA信號(hào)序列的GH克隆。由于其長(zhǎng)度，在連續(xù)兩個(gè)PCR反應(yīng)中加入ompA序列。第一個(gè)反應(yīng)使用正向引物BB7(5’GCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG3’)(SEQ.ID.NO.8)和反向引物BB10(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(SEQ.ID.NO.5)。除了使用大約4ng的質(zhì)粒LB6作為模板而不用單鏈cDNA外，按擴(kuò)增野生型GH所述進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR條件為96℃3分鐘，30個(gè)循環(huán)的(95℃，1分鐘；63℃30秒；72℃1分鐘)，接著72℃10分鐘。使用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)凝膠純化大約630bp的PCR產(chǎn)物，在水中稀釋50倍，取2μl用作第二次PCR反應(yīng)的模板。第二次PCR反應(yīng)使用反義引物BB10和正向引物BB6(5’CCCCGTCGACACATATGAAGAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTC3’)(SEQ.ID.NO.9)。PCR條件按第一次反應(yīng)所述進(jìn)行。大約660bp的PCR產(chǎn)物凝膠純化，用Sal I和BamH1消化并克隆進(jìn)用Sal I和BamH1酶切的pUC19(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)中或用Xho I和BamH1酶切(Sal I和Xho I產(chǎn)生相容性單鏈突出端)的pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司)中。當(dāng)測(cè)序幾個(gè)克隆時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有的pUC19(8/8)克隆在ompA序列區(qū)域含有錯(cuò)誤。僅測(cè)序了一個(gè)pCDNA3.1(+)克隆且它在ompA區(qū)域含有序列多義性(ambiguity)。為了產(chǎn)生正確的ompA-GH融合序列，將含有用常規(guī)限制性位點(diǎn)分離的不同錯(cuò)誤的兩個(gè)已測(cè)序克隆的基因片段重組并克隆進(jìn)缺少PstI位點(diǎn)的pUC19衍生物(見(jiàn)下述pBBT108)中。所得的質(zhì)粒稱為pBBT112，它攜帶ompA-GH融合基因，將該基團(tuán)作為NdeI-BamH1片段克隆進(jìn)pBBT108的這些相同位點(diǎn)。該質(zhì)粒命名為pBBT112，用于下面所述的以PCR為基礎(chǔ)的，GH的定點(diǎn)誘變。
D.構(gòu)建Pst I-pUC19(pBBT108)為了促進(jìn)克隆的GH基因的誘變以構(gòu)建選定的半胱氨酸取代和插入突變，按如下構(gòu)建質(zhì)粒pUC19(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)的缺失了Pst I位點(diǎn)的衍生物。用Pst I消化pUC19質(zhì)粒DNA并隨后使用補(bǔ)充了200μM dNTP的賣主提供的反應(yīng)緩沖液用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)在75℃下處理。在這些條件下，聚合酶將消化用Pst I切割產(chǎn)生的3’單鏈突出端但不消化成雙鏈區(qū)，其凈結(jié)果為缺失含有Pst I識(shí)別位點(diǎn)中間4個(gè)堿基的4個(gè)單鏈堿基。所得的分子具有雙鏈末端，即鈍末端。經(jīng)過(guò)這些酶反應(yīng)后，使用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)凝膠純化線型單體。按照賣主的方案用T4 DNA連接酶(新英格蘭實(shí)驗(yàn)室)處理純化的DNA，用Pst I消化并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑出轉(zhuǎn)化子并經(jīng)過(guò)用Pst I和Bam H1限制性消化進(jìn)行分析。挑出的一個(gè)轉(zhuǎn)化子不被Pst I裂解但在其鄰近的Bam H1位點(diǎn)被裂解，將該轉(zhuǎn)化子命名為pBBT108。
E.在大腸桿菌中表達(dá)met-hGH和stII-hGH將編碼met-hGH的pBBT120和編碼stII-hGH的pBBT114轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株W3110中。將親本載體pCYB1也轉(zhuǎn)化進(jìn)W3110中。所得的菌株命名如下BOB130W3110(pCYB1)＝僅含載體BOB133W3110(pBBT120)＝met-hGHBOB132W3110(pBBT114)＝stII-hGH這些菌株在含有100μg/ml氨芐青霉素的Luria肉湯(LB)中37℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。飽和的過(guò)夜培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為大約0.025 O.D并在搖瓶中37℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.達(dá)到大約0.25-0.5時(shí)，加入IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。對(duì)于起始實(shí)驗(yàn)，在誘導(dǎo)后0，1，3，5和大約16小時(shí)時(shí)取培養(yǎng)物樣品。沉淀誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物樣品且需要時(shí)重懸于加入了1％β-巰基乙醇(BME)的SDS-PAGE樣品緩沖液。樣品在預(yù)制的14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上電泳。用考馬斯蘭染色凝膠或經(jīng)過(guò)Western印跡分析。
對(duì)表達(dá)met-hGH的BOB133菌株和表達(dá)stII-hGH的BOB132的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物的考馬斯蘭染色顯示出一條與購(gòu)自Research Diagnostics公司的純化rhGH標(biāo)準(zhǔn)品一起遷移的大約22kDa的帶。誘導(dǎo)過(guò)夜后在誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中rhGH帶是最顯著的。使用購(gòu)自美國(guó)生物學(xué)公司的多克隆兔抗hGH抗血清的Western印跡證實(shí)在誘導(dǎo)后3和16小時(shí)的誘導(dǎo)的BOB132和BOB133培養(yǎng)物裂解產(chǎn)物中均存在rhGH。在誘導(dǎo)后3或16小時(shí)的對(duì)照菌株BOB130(僅含載體)的誘導(dǎo)培養(yǎng)物中經(jīng)過(guò)Western印跡檢測(cè)不到rhGH。
按上述制備誘導(dǎo)的BOB132(表達(dá)stII-hGH)培養(yǎng)物并根據(jù)Koshland和Botstein(1980)的分析方法進(jìn)行滲透壓休克。該方法破裂大腸桿菌的外膜并將周質(zhì)內(nèi)容物釋放進(jìn)周圍的培養(yǎng)基中。隨后的離心分離可溶性周質(zhì)成分(在上清中回收)與細(xì)胞質(zhì)，不溶性周質(zhì)和細(xì)胞相關(guān)成分(在沉淀中回收)。具體地說(shuō)，含有st-IIhGH質(zhì)粒的大腸桿菌菌株W3110在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中37℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。飽和的過(guò)夜培養(yǎng)物在25ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為0.03 O.D并在250ml搖瓶中37℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.達(dá)到大約0.4時(shí)，加入100mM IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。然后將誘導(dǎo)培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜(大約16小時(shí))。當(dāng)誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物在A600下O.D.達(dá)到3.3時(shí)，在Eppendorf 5415C型微量離心機(jī)中4℃下以14,000rpm離心4 O.D.(1.2ml)5分鐘。細(xì)胞沉淀經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)重懸于冰冷卻的20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH8.0中達(dá)到大約10O.D.，加入EDTA pH8.0至最終濃度為17mM。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)10分鐘并按上述離心。所得的沉淀經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)重懸于冰冷卻的水中達(dá)到大約10 O.D.并在冰上培養(yǎng)10分鐘。然后按上述離心重懸的細(xì)胞并經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析所得的上清(可溶性周質(zhì)部分)和細(xì)胞沉淀(不溶性周質(zhì)和細(xì)胞相關(guān)成分)。
發(fā)現(xiàn)BOB132合成的大量rhGH是可溶的且位于周質(zhì)中。周質(zhì)rhGH蛋白質(zhì)與純化的垂體hGH標(biāo)準(zhǔn)品在大小上無(wú)區(qū)別表明stII信號(hào)序列在蛋白分泌期間被除去。
實(shí)施例3
rhGH的純化和生物活性A.野生型rhGH的純化為了大量純化野生型rhGH，根據(jù)Hsiung等(1986)所述的制備方法對(duì)330ml的BOB132培養(yǎng)物(表達(dá)stII-hGH)進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)過(guò)夜并進(jìn)行滲透壓休克。具體地說(shuō)，將含有stII-hGH質(zhì)粒的大腸桿菌菌株W3110在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。飽和的過(guò)夜培養(yǎng)物在2×250ml(500ml總體積)含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為0.03 O.D.并在2L搖瓶中37℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.達(dá)到大約0.4時(shí)，加入100mM IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。然后將誘導(dǎo)培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜(大約16小時(shí))。誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物在A600下O.D.達(dá)到大約3.8，使用Sorval RC-5離心機(jī)和GSA轉(zhuǎn)子4℃下以8,000rpm離心5分鐘。合并細(xì)胞沉淀，經(jīng)研磨重懸于冰冷卻的20％蔗糖，10mMTris-HCl pH8.0中達(dá)到大約47 O.D.，加入EDTA pH8.0至最終濃度為大約25mM。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)10分鐘并在帶有854轉(zhuǎn)子的IEC Centra MP4R離心機(jī)中4℃下以8,500rpm離心7分鐘。所得的沉淀經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)重懸于冰冷卻的水中達(dá)到大約47 O.D.并在冰上培養(yǎng)30分鐘。然后按上述在IEC離心機(jī)中離心重懸的細(xì)胞并經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析所得的上清(可溶性周質(zhì)部分)和細(xì)胞沉淀(不溶性周質(zhì)和細(xì)胞相關(guān)成分)。該凝膠同樣表明所產(chǎn)生的rhGH是可溶的且位于周質(zhì)中，與垂體hGH標(biāo)準(zhǔn)品在大小上無(wú)區(qū)別。
rhGH在根據(jù)Becker和Hsiung(1986)所述的兩步方法中純化。將來(lái)自滲透壓休克的上清上樣到在10mM Tris-HCl pH8.0中平衡的5ml PharmaciaHiTrap Q Sepharose柱上，并用15倍柱體積的50-250mM線型NaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析柱級(jí)分。以大約100-125mM的鹽濃度洗脫的級(jí)分22-25富含hGH，合并這些級(jí)分，濃縮并進(jìn)一步在Superdex 200HR 10/30大小分離柱上分離。來(lái)自Superdex柱的級(jí)分34-36(根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的洗脫曲線代表分子量大約21-22kDA)含有大多數(shù)rhGH，合并且作為冷凍等分試樣貯存于-80℃。以280nm下的吸光度測(cè)定和使用Bradford蛋白測(cè)定試劑盒(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)測(cè)定的rhGH最終產(chǎn)量為大約2mg。以SDS-PAGE分析時(shí)非還原的垂體hGH比還原的垂體hGH以略小的表觀分子量遷移。該分子量變化是正確的二硫鍵形成的指標(biāo)。我們純化的rhGH與垂體hGH在還原和非還原條件下共同遷移表明rhGH正確折疊且形成二硫鍵。下述數(shù)據(jù)表明rhGH的生物學(xué)活性與垂體hGH無(wú)區(qū)別。
B.垂體hGH和rhGH的生物測(cè)定結(jié)果親本FDC-P1細(xì)胞系顯示出對(duì)小鼠IL-3強(qiáng)烈的增殖應(yīng)答，但對(duì)垂體hGH無(wú)應(yīng)答。在沒(méi)有IL-3時(shí)，大多數(shù)FDC-P1細(xì)胞死亡，產(chǎn)生不到0.2的吸光度值。相反，在細(xì)胞數(shù)和吸光度值方面的劑量依賴型增大證明用兔生長(zhǎng)激素受體轉(zhuǎn)化的FDC-P1細(xì)胞應(yīng)答垂體hGH而增殖。在不同的實(shí)驗(yàn)中該效果的EC50(達(dá)到最大刺激的一半所需的蛋白質(zhì)濃度)范圍為0.75-1.2ng/ml垂體hGH(0.03-0.05nM)，與文獻(xiàn)(Rowlinson等，1995)的報(bào)道相似。親本FDC-P1細(xì)胞系與用兔生長(zhǎng)激素受體轉(zhuǎn)化的FDC-P1細(xì)胞之間的明顯差異在于在沒(méi)有IL-3或hGH時(shí)后一種細(xì)胞存活，產(chǎn)生更高的吸光度值(在零生長(zhǎng)因子對(duì)照孔中依賴于測(cè)定和與MTS一起保溫的時(shí)間一般為0.6-1.1)。兔生長(zhǎng)激素受體轉(zhuǎn)化子和分離的所有5個(gè)不依賴生長(zhǎng)激素受體的細(xì)胞系的起始合并物表現(xiàn)出相同的效果。用第二組獨(dú)立分離的兔生長(zhǎng)激素受體轉(zhuǎn)染子獲得了相似的結(jié)果。Rowlinson等，(1995)觀察到相似的效果，表明IL-3/GH的非依賴型存活是轉(zhuǎn)化過(guò)程的后果。盡管生長(zhǎng)激素受體細(xì)胞系的生長(zhǎng)不需要IL-3或hGH，但它們?nèi)匀粚?duì)IL-3和hGH顯示出強(qiáng)烈的增殖應(yīng)答。沒(méi)有hGH時(shí)吸光度值更高的實(shí)際效果是減小了hGH應(yīng)答的“窗口”(最大與最小吸光度值之間的差別)。該窗口的范圍經(jīng)常為零生長(zhǎng)因子值的40-70％，與Rowlinson等，(1995)的報(bào)道相似。
垂體GH和我們制備的野生型rhGH在生物測(cè)定中具有相似的劑量反應(yīng)曲線，在不同的實(shí)驗(yàn)中EC50范圍為0.6-1.2ng/ml(表1)。
表1hGH和hGH半胱氨酸突變蛋白的生物活性
N/A，未應(yīng)用1EC50值來(lái)自各個(gè)實(shí)驗(yàn)。顯示當(dāng)N＞5時(shí)的EC50范圍。
實(shí)施例4構(gòu)建hGH半胱氨酸突變蛋白半胱氨酸取代突變T135C構(gòu)建如下。設(shè)計(jì)誘變型反向寡核苷酸BB28(5’CTGCTTGAAGATCTGCCCACACCG GGGGCTGCCATC’3)(SEQ.ID.NO.10)以便將在氨基酸殘基135處的蘇氨酸密碼子ACT改變成編碼半胱氨酸的密碼子TGT并跨越鄰近的Bgl II位點(diǎn)。在PCR中使用該寡核苷酸以及與ompA-GH融合基因連接區(qū)退火且不具誘變性的BB34(5’GTAGCGCAGGCCTTCCCAACC ATT’3)(SEQ.ID.NO.11)。PCR反應(yīng)在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行，它含有1 X PCR緩沖液(含有1.5mM MgCl2的Perkin-Elmer緩沖液)，4種核苷酸dA，dC，dG和dT的濃度各為200μM，各0.5μM的各種寡核苷酸引物，5pg pBBT112(上述)作模板，1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和0.125單位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)。反應(yīng)在Robocycler Gradient 96熱循環(huán)儀(Stratagene公司)中進(jìn)行。使用的程序限定為95℃3分鐘，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的[95℃60秒；45℃或50℃或55℃75秒；72℃60秒]，接著在6℃保持。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)，表明3種退火溫度均明顯產(chǎn)生大約430bp的預(yù)期產(chǎn)物。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”45℃反應(yīng)并用Bgl II和Pst I消化。凝膠純化所得278bp Bgl II-Pst I片段，它包括推斷的T135C突變，將它連接進(jìn)用Bgl II和Pst I消化過(guò)的pBBT111，即攜帶stII-GH融合基因的pUC19衍生物(上述)并凝膠純化。經(jīng)過(guò)用Bgl II和Pst I消化開(kāi)始篩選來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子，隨后測(cè)序一個(gè)克隆以證實(shí)存在T135C突變且不存在經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)或經(jīng)過(guò)合成寡核苷酸可能導(dǎo)入的任何其它突變。發(fā)現(xiàn)測(cè)序的克隆具有Bgl II-Pst I片段的正確序列。
使用上述用于T135C的方法構(gòu)建取代突變S132C，該方法有下列區(qū)別使用誘變型反向寡核苷酸BB29(5’CTGCTTGAAGATCTGCCCAGTCCGGGGGCAGCCATCTTC’3)(SEQ.ID.NO.12)代替BB28且使用退火溫度為50℃的PCR反應(yīng)用于克隆。發(fā)現(xiàn)測(cè)序的兩個(gè)克隆中的一個(gè)具有正確的序列。
使用類似的方案但采用不同的克隆策略構(gòu)建了取代突變T148C。在PCR中使用誘變型正向寡核苷酸BB30(5＞GGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACTGCAACTCACACAAC＞3)(SEQ.ID.NO.13)和與GH編碼序列最3’端退火且跨越其下游緊鄰的Bam H1位點(diǎn)的非誘變性反向引物BB33(5＞CGCGGTACCCGGGATCCGATTAGAATCCACAGCT＞3)(SEQ.ID.NO.14)。除了使用的退火溫度為46，51和56℃外按上述進(jìn)行PCR。PCR后按上述進(jìn)行凝膠分析，合并46和51℃反應(yīng)物用于克隆。用Bam H1和Bgl II消化該反應(yīng)物，凝膠純化所得的188bp片段并克隆進(jìn)已用Bam H1和Bgl II消化，用小牛堿性磷酸酶(Promega)按賣主方案處理的pBBT111中，并凝膠純化。經(jīng)過(guò)用Bam H1和BglII消化分析來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子以鑒定以正確方向克隆了188bp BamH1-BglII誘變性PCR片段的克隆由于Bam H1和Bgl II產(chǎn)生相匹配的末端，該克隆步驟無(wú)方向特異性。測(cè)試的6個(gè)克隆中有5個(gè)顯示出正確的方向。測(cè)序了其中的一個(gè)且表明含有所需的T148C突變。已證實(shí)在該克隆中188bp BamH1-Bgl II誘變性PCR片段的剩下序列是正確的。
除了下述例外，取代突變S144C的構(gòu)建與T148C的構(gòu)建相同。使用誘變型正向寡核苷酸BB31(5＞GGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACTGCAAGTTCGAC＞3)(SEQ.ID.NO.15)代替BB30。測(cè)試的6個(gè)克隆中有2個(gè)顯示出正確的方向。測(cè)序了其中的一個(gè)且表明含有所需的S144C突變。已證實(shí)在該克隆中188bp BamH1-BglII誘變性PCR片段的剩下序列是正確的。
還構(gòu)建了在GH的天然羧基末端添加半胱氨酸殘基的突變。使用上述用于構(gòu)建T148C突變蛋白的方法但采用不同的寡核苷酸引物構(gòu)建稱為stp192C的該突變體。使用在GH的羧基末端phe殘基密碼子和TAA翻譯終止密碼子之間插入半胱氨酸密碼子TGC并跨越鄰近Bam H1位點(diǎn)的誘變型反向寡核苷酸BB32(5＞CGCGGTACCGGATCCTTAGCAGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC＞3)(SEQ.ID.NO.16)和上述BB34。按上述進(jìn)行PCR和凝膠分析后，使用46℃反應(yīng)物用于克隆。測(cè)試的6個(gè)克隆中有3個(gè)顯示出正確的方向。測(cè)序了其中的一個(gè)且表明含有所需的stp192C突變。已證實(shí)在該克隆中188bp BamH1-Bgl II誘變性PCR片段的剩下序列是正確的。
使用將氨基酸殘基100處的絲氨酸密碼子AGC改變成編碼半胱氨酸的密碼子TGC的誘變型反向寡核苷酸BB25(5＞GTCAGAGGCGCCGTACACCAGGCAGTTGGCGAAGAC＞3)(SEQ.ID.NO.17)構(gòu)建取代突變S100C。BB25也跨越鄰近的Nar I位點(diǎn)。使用BB25和BB34的PCR反應(yīng)采用上述用于構(gòu)建T135C突變的PCR方案進(jìn)行。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠分析后，使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”50℃退火反應(yīng)的產(chǎn)物并用Pst I和Nar I消化。凝膠純化所得的178bp片段，將它連接進(jìn)用Pst I和Nar I消化過(guò)的pBBT111中并凝膠純化。經(jīng)過(guò)用Pst I和Nar I消化以篩選來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子所分離的質(zhì)粒，隨后測(cè)序一個(gè)質(zhì)粒以證實(shí)在178bp的Pst I-Nar I片段中存在S100C突變且不存在任何其它突變。
除了下述區(qū)別外使用上述用于S100C的方法構(gòu)建取代突變A98C誘變性反向寡核苷酸BB26(5＞GTCAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGTTGCAGAAGACACTCCT＞3)(SEQ.ID.NO.18)用于代替BB25進(jìn)行PCR，使用45℃退火溫度進(jìn)行的PCR用于克隆。測(cè)序了一個(gè)克隆并發(fā)現(xiàn)具有正確的序列。
取代突變A34C構(gòu)建如下。設(shè)計(jì)誘變性反向寡核苷酸BB23(5＞GCGCTGCAGGAATGAATACTTCTGTTCCTTTGGGATATAGCATTCTTCAAACTC＞3)(SEQ.ID.NO.19)以便將氨基酸殘基34處的丙氨酸密碼子GCC改變成編碼半胱氨酸的密碼子TGC并跨越Pst I位點(diǎn)。在PCR反應(yīng)中使用該寡核苷酸以及與stII先導(dǎo)序列的編碼序列5’端退火且跨越與起始甲硫氨酸密碼子重疊的Nde I位點(diǎn)的BB11(5＞CCCCCTCTAGACATATGAAGA AGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG＞3)(SEQ.ID.NO.20)。
PCR反應(yīng)在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行，反應(yīng)液為含有1.5mM MgCl2的1 X PCR緩沖液(Promega)，4種核苷酸dA，dC，dG和dT各為200μM，各0.2μM的各種寡核苷酸引物，1ng pBBT111(上述)作模板，0.8單位的Tac DNA聚合酶(Promega)和033單位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)。反應(yīng)在Robocycler Gradient 96熱循環(huán)儀(Stratagene公司)中進(jìn)行。使用的程序限定為96℃3分鐘，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的[95℃60秒；50℃或55℃或60℃75秒；72℃60秒]，接著在6℃保持。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)，表明3種退火溫度均產(chǎn)生大約220bp的預(yù)期產(chǎn)物。合并50和55℃反應(yīng)液，使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”并用Nde I和Pst I消化。凝膠純化所得的207bp Nde I-Pst I片段，它包括推斷的A34C突變，將它連接進(jìn)用Nde I和Pst I消化過(guò)并用堿性磷酸酶處理的pBBT111中并凝膠純化。經(jīng)過(guò)用Nde I和Pst I消化開(kāi)始篩選來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子，隨后測(cè)序一個(gè)克隆以證實(shí)存在A34C突變且不存在經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)或經(jīng)過(guò)合成寡核苷酸可能導(dǎo)入的任何其它突變。發(fā)現(xiàn)測(cè)序的克隆具有Nde I-Pst I片段的正確序列。
使用上述用于A34C的方法構(gòu)建取代突變S43C，該方法有下列區(qū)別使用誘變型反向寡核苷酸BB24(5＞GCGCTGCAGGAAGCAATACTTCTGTTCCTTTGG＞3)(SEQ.ID.NO.21)代替BB23。測(cè)序了一個(gè)克隆且顯示含有正確的序列。
使用連續(xù)兩個(gè)PCR步驟構(gòu)建取代突變T3C。第一步產(chǎn)生所需的突變而第二步延伸第一步反應(yīng)的PCR產(chǎn)物以包含有用的克隆位點(diǎn)。設(shè)計(jì)誘變型正向寡核苷酸BB78(5＞GCATCTATGTTCGTTTICTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATTCCCATGCATTCCCTTATCCAG＞3)(SEQ.ID.NO.22)將氨基酸殘基3處的蘇氨酸密碼子ACC改變成編碼半胱氨酸的密碼子TGC并跨越stII-hGH融合基因連接區(qū)且與之退火。BB78與上述BB33一起用于第一步PCR。
第一步PCR反應(yīng)在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行，反應(yīng)液為含有1.5mM MgCl2的1 X PCR緩沖液(Promega)，4種核苷酸dA，dC，dG和dT各為200μM，各0.2μM的各種寡核苷酸引物，lng pBBT111(上述)作模板，1.5單位的TacDNA聚合酶(Promega)和0.25單位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)。反應(yīng)在Robocycler Gradient 96熱循環(huán)儀(Stratagene公司)中進(jìn)行。使用的程序限定為96℃3分鐘，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的[94℃60秒；60℃75秒；72℃60秒]，接著在6℃保持。乙醇沉淀PCR反應(yīng)物，凝膠純化大約630bp的產(chǎn)物且回收在20μl 10mM Tris-HCl(pH 8.5)中。將該凝膠純化片段的等分試樣稀釋100倍，取2μl稀釋的片段用作第二次PCR步驟的模板。第二次PCR步驟采用寡核苷酸BB11和BB33(均在上文描述)并使用第一步PCR反應(yīng)所用的反應(yīng)條件。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析第二步PCR反應(yīng)，觀察到預(yù)期大約670bp的片段。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”P(pán)CR反應(yīng)物并用Nde I和Pst I消化。凝膠純化所得的207bp Nde I-Pst I片段，它包括推斷的T3C突變，將它連接進(jìn)用Nde I和Pst I消化過(guò)并用堿性磷酸酶處理的pBBT111中并凝膠純化。經(jīng)過(guò)用Nde I和Pst I消化開(kāi)始篩選來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子，隨后測(cè)序一個(gè)克隆以證實(shí)存在T3C突變且不存在經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)或經(jīng)過(guò)合成寡核苷酸可能導(dǎo)入的任何其它突變。發(fā)現(xiàn)測(cè)序的克隆具有Nde I-PstI片段的正確序列。
使用Horton，R.M.在分子生物學(xué)方法第15卷，第251-261頁(yè)P(yáng)CR方法常規(guī)方法和應(yīng)用，White，B.A.編(1993)，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ中一般描述的“通過(guò)重疊延伸實(shí)施誘變”技術(shù)構(gòu)建取代突變A105C。用該技術(shù)靶DNA片段擴(kuò)增了圖1所示的兩個(gè)不同片段。一個(gè)片段是用引物a和b產(chǎn)生的產(chǎn)物AB。第二個(gè)引物對(duì)，c和d，用于產(chǎn)生產(chǎn)物CD。引物b和c分別在產(chǎn)物AB和CD的右側(cè)端和左側(cè)端引入相同的序列改變。產(chǎn)物AB和CD具有一段相同的(突變的)序列片段，即，“重疊”，使得AB的上鏈可與CD的下鏈退火，反之亦然。在隨后的PCR反應(yīng)中使用引物a和d且加入產(chǎn)物AB和CD兩者作模板經(jīng)DNA聚合酶延伸這些退火的重疊片段產(chǎn)生全長(zhǎng)的突變分子AD。
除了使用不同的寡核苷酸引物外，按與上文T3C的構(gòu)建所述相同的方式進(jìn)行A105C構(gòu)建的起始PCR反應(yīng)。所用的引物對(duì)是(BB27+BB33)和(BB11+BB79)。BB11和BB33如上所述。BB27和BB79是互補(bǔ)的誘變型寡核苷酸，它們將氨基酸殘基105處的丙氨酸密碼子GCC改變成編碼半胱氨酸的密碼子TGC。BB27的序列是(5＞AGCCTGGTGTACGGCTGCTCTGACAGCAA CGT C＞3)(SEQ.ID.NO.23)且BB78的序列是(5＞GACGTTGCTGTCAG AGCAGCCGTACACCAGGCT＞3(SEQ.ID，NO.24)。將(BB27×BB33)和(BB11×BB79)的PCR反應(yīng)物乙醇沉淀，凝膠純化并回收在20μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)中。制備型凝膠顯示，各PCR反應(yīng)的主要產(chǎn)物是(BB27×BB33)反應(yīng)產(chǎn)物的預(yù)期大小為大約290bp，(BB11×BB79)反應(yīng)為大約408bp。然后，在隨后的PCR反應(yīng)中這兩個(gè)誘變的片段“剪接”在一起。在該反應(yīng)中，加入1μl來(lái)自起始反應(yīng)的每種凝膠純化的片段作為模板，BB11和BB33用作引物。此外，使用起始(BB27×BB33)和(BB11×BB79)反應(yīng)所用的相同條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析第二次PCR反應(yīng)的等分試樣且獲得預(yù)期的大約670bp的帶。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”批量的PCR反應(yīng)物并用Bgl II和Pst I消化。凝膠純化所得的276bp Bgl II-Pst I片段，它包括推斷的A105C突變，將它連接進(jìn)用Bgl II和Pst I消化的pBBT111中并凝膠純化。經(jīng)過(guò)用Bgl II和Pst I消化開(kāi)始篩選來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子，隨后測(cè)序一個(gè)克隆以證實(shí)存在A105C突變且不存在經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)或經(jīng)過(guò)合成寡核苷酸可能導(dǎo)入的任何其它突變。發(fā)現(xiàn)測(cè)序的克隆具有Bgl II-Pst I片段的正確序列。
為了作為分泌進(jìn)周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)，從pUC-19為基礎(chǔ)的pBBT111衍生物切下大約650bp的Nde I-Xba I片段，它們是編碼11種突變蛋白的stII-hGH基因，將它們亞克隆進(jìn)已用于表達(dá)rhGH的pCYB1表達(dá)載體中。為了進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)，將這些質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌W3110中。
使用類似于此處和實(shí)施例23所述的方法，可構(gòu)建GH的其它半胱氨酸突變蛋白。半胱氨酸突變蛋白可以是用半胱氨酸取代GH編碼序列中天然氨基酸殘基的取代突變，在GH編碼序列的兩個(gè)天然氨基酸之間插入半胱氨酸殘基的插入突變，或在GH編碼序列的第一個(gè)氨基酸，F(xiàn)1，之前加入一個(gè)半胱氨酸殘基，或在GH編碼序列的末端氨基酸殘基，F(xiàn)191，之后加入一個(gè)半胱氨酸殘基的添加突變。半胱氨酸殘基可取代GH編碼序列中任何位置的任何氨基酸殘基或插入任意兩個(gè)氨基酸之間。在GH中取代和插入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點(diǎn)是在螺旋A之前的區(qū)域，A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)和螺旋D的遠(yuǎn)端區(qū)域。
其它優(yōu)選的位點(diǎn)是A，B，C和D螺旋的第一個(gè)和最后三個(gè)氨基酸。在這些區(qū)域產(chǎn)生半胱氨酸取代的優(yōu)選殘基是F1，P2，P5，E33，K38，E39，Q40，Q46，N47，P48，Q49，T50，S51，S55，S57，T60，Q69，N72，N99，L101，V102，Y103，G104，S106，E129，D130，G131，P133，R134，G136，Q137，K140，Q141，T142，Y143，K145，D147，N149，S150，H151，N152，D153，S184，E186，G187，S188和G190。半胱氨酸殘基也可插入緊靠這些氨基酸之前或之后。加入半胱氨酸殘基的一個(gè)優(yōu)選位點(diǎn)是在F1之前，本文稱為*-1C。
也可經(jīng)過(guò)用另一氨基酸取代GH中的一個(gè)天然半胱氨酸殘基以構(gòu)建含有游離半胱氨酸的GH突變體。這樣在正常情況下與取代的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的天然存在的半胱氨酸殘基游離出來(lái)?？捎萌魏纹渌?9種氨基酸取代非必需的半胱氨酸殘基，但優(yōu)選用絲氨酸或丙氨酸。也可經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾天然存在的氨基酸將游離半胱氨酸殘基導(dǎo)入GH，例如，使用Sytkowski等(1998)所述的方法，本文引用以供參考。
使用類似于實(shí)施例1-15所述的方法，可在諸如大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白質(zhì)，純化所述蛋白質(zhì)，PEG化所述蛋白質(zhì)和在體外生物測(cè)定中測(cè)量其生物學(xué)活性。也可使用類似于實(shí)施例16-19所述的方法或本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的有關(guān)方法在諸如昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞中表達(dá)GH突變蛋白。如果需要分泌，可使用天然的GH信號(hào)序列，或另一信號(hào)序列從真核細(xì)胞分泌該蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5添加半胱氨酸提高了半胱氨酸突變蛋白T3C的回收率將含有T3C突變的大腸桿菌菌株W3110在3ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。飽和的過(guò)夜培養(yǎng)物在300ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為0.03 O.D.并在2L搖瓶中37℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.達(dá)到0.420時(shí)，加入1.5ml 100mM IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。然后將誘導(dǎo)培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜(大約16小時(shí))。
誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物在A600下O.D.達(dá)到大約3.6，分成2×135ml的體積并使用帶有GSA轉(zhuǎn)子的Sorval RC-5離心機(jī)在4℃下以8,000rpm離心10分鐘。棄去上清并按下述對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行滲透壓休克處理。將細(xì)胞沉淀重懸于10ml冰冷的緩沖液A[20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5]或緩沖液B[20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5，5.5mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)]中至大約49O.D.。經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)重懸沉淀并加入1ml 0.25M EDTA pH8.0以產(chǎn)生大約25mM的最終濃度。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)30分鐘并在SS-34轉(zhuǎn)子上4℃下以8,500rpm離心10分鐘。棄去上清并經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)將沉淀重懸于10ml冰冷的緩中液C[5mM Tris-HCl pH7.5]或緩沖液D[5mM Tris-HCl pH7.5，5.5mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)]中并在冰上培養(yǎng)30分鐘。然后將重懸的細(xì)胞沉淀在SS-34轉(zhuǎn)子上4℃下以8,500rpm離心10分鐘并回收所得的上清(可溶性周質(zhì)部分)，貯存于-80℃。SDS-PAGE分析各上清揭示，經(jīng)過(guò)在滲透壓休克方法摻入半胱氨酸，在可溶性周質(zhì)部分回收的單體hGH類型的含量顯著提高。在用胱氨酸處理的樣品中，我們觀察到在非還原性SDS-PAGE凝膠上大多數(shù)hGH以大約22kDa的單條帶遷移且該帶與垂體hGH共同遷移。沒(méi)有胱氨酸時(shí)，在單體范圍內(nèi)觀察到許多不同的分子量種類。當(dāng)使用Western印跡顯色凝膠時(shí)可看見(jiàn)更大分子量的蛋白質(zhì)聚集物。
實(shí)施例6表達(dá)和純化GH半胱氨酸添加型變異體的一般方法分離hGH半胱氨酸突變蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法如下。將含有stII-hGH突變體質(zhì)粒的大腸桿菌菌株W3110培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中37℃下生長(zhǎng)至飽和。過(guò)夜培養(yǎng)物一般在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為0.025-0.030 O.D.并在搖瓶中37℃下生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.值達(dá)到A600下為0.300-0.500時(shí)，加入IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)過(guò)在Sorval RC-5離心機(jī)中以8,000-10,000xg在4℃下離心10分鐘沉淀誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物。根據(jù)培養(yǎng)物的大小按Koshland和Botstein(1980)或Hsiung等，(1986)的方法對(duì)所得的沉淀進(jìn)行滲透壓休克。為了進(jìn)行滲透壓休克，將細(xì)胞沉淀以25-50 O.D.重懸于20％蔗糖，10mM Tris-HClpH7.5中。在某些情況下重懸緩沖液中包括5或25mM的EDTA pH8.0和/或5mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)。重懸的沉淀在冰上培養(yǎng)15-30分鐘并按上述離心。棄去上清并將沉淀以A600下25-50 O.D.重懸于5或10mM Tris-HCl pH7.5中。在某些情況下重懸緩中液中包括5mM EDTApH8.0和/或5mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)。重懸的沉淀在冰上培養(yǎng)30分鐘并按上述離心。所得的上清含有可溶性周質(zhì)成分，沉淀由不溶性周質(zhì)和細(xì)胞相關(guān)成分組成。
將胱氨酸加入滲透壓休克緩沖液導(dǎo)致許多半胱氨酸突變蛋白的回收率和穩(wěn)定性顯著提高。存在胱氨酸時(shí)，半胱氨酸突變蛋白主要是單體，而不存在胱氨酸時(shí)，當(dāng)經(jīng)過(guò)非還原性SDS-PAGE和Western印跡分析樣品時(shí)觀察到hGH單體，二聚體和更高級(jí)聚集物的混合物。更高級(jí)聚集物很可能是在蛋白質(zhì)中添加了半胱氨酸殘基的后果，因?yàn)樗鼈冊(cè)谝吧蛂hGH中大量減少或不存在。向滲透壓休充緩沖液中加入胱氨酸主要解決了這一問(wèn)題。我們相信胱氨酸與突變體中的游離半胱氨酸殘基反應(yīng)形成穩(wěn)定的混合二硫化物，從而防止二硫化物移位并聚集。我們也試驗(yàn)了第二種二巰基，即胱胺，且觀察到對(duì)hGH的半胱氨酸突變蛋白具有相似的穩(wěn)定效果。很可能其它的二巰基，例如氧化型谷胱甘肽也導(dǎo)致含有游離半胱氨酸的蛋白質(zhì)的回收率提高。
在所分析的11個(gè)hGH突變蛋白中，6個(gè)的表達(dá)水平足以分離和純化。對(duì)A34C，S43C，A98C，S100C和S132C突變蛋白的滲透壓休克上清進(jìn)行非還原性SDS-PAGE分析表明很少或沒(méi)有以正確分子量存在的蛋白質(zhì)。加入胱氨酸不能明顯提高這些蛋白質(zhì)的回收率。這些突變體相對(duì)較低的表達(dá)水平使得難以觀察到產(chǎn)量提高。對(duì)全細(xì)胞裂解物的初步分析表明這些突變蛋白質(zhì)可以表達(dá)但不可溶。T3C，A105C，T135C，S144C，T148C和stp192C突變體顯示出中等到較好的表達(dá)水平。其中5個(gè)半胱氨酸突變蛋白(T3C，T135C，S144C，T148C和stp192C)當(dāng)在滲透壓休克緩沖液中存在胱氨酸時(shí)顯示出回收率顯著提高。不存在胱氨酸時(shí)，沒(méi)有測(cè)試A105C。一般的蛋白質(zhì)純化方法描述如下。
WT-rhGH以離子交換和凝膠過(guò)濾層析純化。經(jīng)過(guò)層析方法分類純化半胱氨酸突變蛋白，層析方法包括離子交換，疏水相互作用(HIC)，金屬螯合親和層析(IMAC)，大小排阻層析(SEC)或這些技術(shù)的組合。一般來(lái)說(shuō)，使用在20mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的Q-Sepharose快速流動(dòng)樹(shù)脂(Pharmacia)從新鮮的滲透壓休克上清捕獲hGH突變體。用20mM Tris-HCl，pH8.0洗滌柱子并用線型的10倍體積的在20mM Tris-HCl，pH8.0中從0列250mM NaCl遞增的鹽梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western印跡鑒定含有hGH突變體的級(jí)分。合并這些級(jí)分并冷凍貯存?？墒褂闷渌鼧?shù)脂從滲透壓休克混合物中捕獲hGH突變體。它們包括HIC，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂或親和樹(shù)脂。
對(duì)于疏水互相作用層析(HIC)，解凍Q柱合并物至室溫并加入NaCl至2M的最終濃度。將合并物裝填到預(yù)先在2M NaCl，20mM磷酸鈉，pH7.5中平衡的丁基-Sepharose快速流動(dòng)樹(shù)脂上。使用在20mM磷酸鈉，pH7.5中的2M至0M NaCl反向鹽梯度從樹(shù)脂中洗脫hGH突變體。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western印跡鑒定含有hGH突變體的級(jí)分并合并。
在有些情況下，將HIC合并物隨后直接上樣到在10mM磷酸鈉，0.5MNaCl，pH7.5中平衡的鎳螯合樹(shù)脂(Qiagen)上。洗滌步驟后，使用在10mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.5中的0-30mM咪唑梯度回收突變體。hGH對(duì)鎳具有高親和性，很可能是通過(guò)H18，H21和E174形成的二價(jià)金屬結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果，使用金屬螯合柱以高純度形式獲得了hGH(Maisano等，1989)。測(cè)試的所有這些突變體都緊緊結(jié)合到鎳柱上并與野生型rhGH一樣在相似的咪唑濃度(大約15mM)洗脫。
實(shí)施例7T3C的純化將在胱氨酸存在下制備的可溶性周質(zhì)級(jí)分(實(shí)施例5)上樣到在10mMTris-HCl，pH8.0中平衡的1ml HiTrap Q-SEPHAROSE柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上并用20倍柱體積的0-250mM NaCl線型梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)14％SDS-PAGE分析柱上樣和回收的級(jí)分。T3C在大約170-200mM的鹽濃度處洗脫，明顯晚于WT-hGH。令人驚奇的是，當(dāng)上樣到柱上時(shí)T3C突變體以單體形式存在，但在從Q柱上洗脫后主要以穩(wěn)定的二硫鍵連接的同型二聚體形式回收。還原時(shí)，T3C突變體與野生型hGH在SDS-PAGE凝膠上共同遷移。二聚體形成在Q柱純化步驟期間發(fā)生。在Q柱緩沖液或用于其它柱步驟的緩沖液中不存在胱氨酸。T3C二聚體在任何其它的濃度或純化步驟中保持完整。將來(lái)自Q柱的合并液調(diào)節(jié)到0.5M的最終NaCl濃度并上樣到預(yù)先在10mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.5中平衡的1ml Ni-瓊脂糖柱(Qiagen)上。經(jīng)過(guò)洗滌步驟后，使用在10mM磷酸鈉，0.5MNaCl，pH7.5中的0-30mM咪唑梯度回收高度純化的T3C二聚體。T3C二聚體在生物測(cè)定中具有活性(實(shí)施例10和表1)。
A105C，T135C和stp192C突變體作為二硫鍵連接的二聚體從Q柱中回收。一旦去掉胱氨酸，似乎某些突變體很可能通過(guò)添加的半胱氨酸殘基形成穩(wěn)定的二硫鍵二聚體。我們相信經(jīng)過(guò)在所有柱緩沖液中包含胱氨酸或其它二巰基化合物和/或半胱氨酸封閉劑和/或?qū)⒕彌_液的pH維持在7以下以防止二硫鍵重排可穩(wěn)定這些蛋白質(zhì)的單體形式。
實(shí)施例8T148C的純化將表達(dá)T148C突變體的大腸桿菌菌株W3110在3ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。飽和的過(guò)夜培養(yǎng)物在500ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為0.025 O.D.并分成2×250ml體積在2L搖瓶中37℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.達(dá)到大約0.35時(shí)，向每瓶中加入1.25ml100mM IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜(大約16小時(shí))。
誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物在A600下O.D.達(dá)到大約3.5并使用帶有GSA轉(zhuǎn)子的Sorval RC-5離心機(jī)在4℃下以8,000rpm離心10分鐘。棄去上清并按下述對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行滲透壓休克處理。經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)將細(xì)胞沉淀重懸于冰冷的20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5，5.0mM EDTA pH8.0，5.0mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)中至大約43O.D.。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)15分鐘，在帶有SS-34轉(zhuǎn)子的Sorval離心機(jī)中4℃下以8,500rpm離心10分鐘。棄去上清并經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)將沉淀重懸于冰冷的1mM Tris-HClpH7.5，5mMEDTApH8.0，5mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)中至大約43O.D.。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)30分鐘并在SS-34轉(zhuǎn)子中4℃下以8,500rpm離心10分鐘并回收所得的上清(可溶性周質(zhì)部分)，貯存于-80℃。
除了下列例外，以相同的方式制備T148C的第二種培養(yǎng)物1)誘導(dǎo)培養(yǎng)物的體積為200ml且在37℃過(guò)夜培養(yǎng)后在A600下O.D.達(dá)到大約4.0，2)細(xì)胞沉淀的懸液制備成在A600下大約30 O.D.。
合并來(lái)自上述制品的可溶性周質(zhì)部分并在1L 10mM Tris-HCl pH8.0中4℃下透析過(guò)夜。將透析存留物上樣到在10mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的5mlHiTrap Q-SEPHAROSE柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上并用20倍柱體積的0-250mM NaCl線型梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)14％SDS-PAGE(Novex，San Diego，CA.)分析柱級(jí)分。T148C突變體在大約60-80mM的鹽濃度處以一個(gè)尖峰被洗脫。合并相應(yīng)級(jí)分并在Centricon 10濃縮器(Amicon，Inc.，Beverly，MA)中濃縮。將濃縮的合并液進(jìn)一步在20mM磷酸鈉，pH7.5，150mM NaCl中平衡的Superdex 200 HR 10/30柱(PharmaciaBiotech Inc.，Uppsala，瑞典)上純化。同樣經(jīng)過(guò)14％SDS-PAGE分析柱級(jí)分并合并含有T148C突變體的級(jí)分。我們觀察到T148C在從Q-SEPHAROSE柱回收和從Superdex柱洗脫后保持單體形式，分子量相似于野生型hGH。經(jīng)過(guò)Q-SEPHAROSE和大小排阻層析制備的T148C稱為L(zhǎng)ot A。
另外，可將Q-合并液直接上樣到在10mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.5中平衡的鎳螯合樹(shù)脂(Qiagen)上。經(jīng)過(guò)洗滌步驟后，使用在10mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.5中的0-30mM咪唑梯度回收T148C。經(jīng)過(guò)Q-SEPHAROSE和鎳親和層析制備的T148C蛋白質(zhì)稱為L(zhǎng)ot B。
在不存在胱氨酸時(shí)制備滲透壓休克T1548C上清并嘗試在Q-SEPHAROSE柱上純化。除了在滲透壓休克緩沖液中不存在胱氨酸外按照上述相同的方案進(jìn)行。在一個(gè)大的鹽濃度范圍內(nèi)從Q柱洗脫T148C蛋白質(zhì)產(chǎn)物，回收率較低且蛋白質(zhì)制品比胱氨酸處理的T148樣品純度顯著偏低。
實(shí)施例9
S144C的純化將含有S144C突變的大腸桿菌菌株W3110在3ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。飽和的過(guò)夜培養(yǎng)物在250ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為0.03 O.D.并在2L搖瓶中37℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.達(dá)到大約0.3時(shí)，加入1.25ml 100mM IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜(大約16小時(shí))。
誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物在A600下O.D.達(dá)到大約3.3并使用帶有GSA轉(zhuǎn)子的Sorval RC-5離心機(jī)在4℃下以8,000rpm離心10分鐘。棄去上清并按下述對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行滲透壓休克處理。經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)將細(xì)胞沉淀重懸于冰冷的20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5，5.0mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)中至大約33O.D.并加入0.25M EDTA pH8.0至最終濃度為25mM。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)30分鐘，在帶有SS-34轉(zhuǎn)子的Sorval RC-5離心機(jī)中4℃下以8,500rpm離心10分鐘。棄去上清并經(jīng)研磨和旋轉(zhuǎn)將沉淀重懸于冰冷的5mMTris-HCl pH7.5，5mM胱氨酸(pH調(diào)到7.5-8.0)中至大約33O.D.。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)30分鐘并在SS-34轉(zhuǎn)子中4℃下以8,500rpm離心10分鐘并回收所得的上清(可溶性周質(zhì)部分)，貯存于-80℃。
將來(lái)自上述制品的可溶性周質(zhì)部分上樣到在10mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的5ml HiTrap Q-SEPHAROSE柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上并用20倍柱體積的0-250mM NaCl線型梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)14％SDS-PAGE(Novex，San Diego，CA.)分析柱級(jí)分，合并在125-150mM NaCl處收集的含有S144C突變體的級(jí)分并冷凍。S144C突變體是單體。
實(shí)施例10hGH半胱氨酸突變蛋白的生物活性使用實(shí)施例1所述的細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)量純化的T3C，S144C和T148C半胱氨酸突變蛋白的生物學(xué)活性。使用Bradford測(cè)定確定蛋白質(zhì)的濃度。所有這三種突變體具有生物學(xué)活性。所有這些突變體在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)達(dá)到與垂體hGH相同的最大刺激水平。T3C，S144C和T148C突變體的平均EC50類似于垂體hGH和rhGH的(表1)。T148C突變體的兩個(gè)獨(dú)立的樣品和S144C和T3C突變體各一個(gè)樣品(均在有胱氨酸時(shí)制備)測(cè)定了多次(表1)。也測(cè)定了部分純化的A105C，T135C和stp192C突變體且具有生物學(xué)活性。
實(shí)施例11半胱氨酸突變蛋白的PEG化和純化的一般方法GH突變體可使用可買到的各種半胱氨酸反應(yīng)性PEG-馬來(lái)酰亞胺(或PEG-乙烯砜)試劑進(jìn)行PEG化。一般來(lái)說(shuō)，PEG化該蛋白質(zhì)和這些試劑的方法類似于WO9412219(Cox和McDermott)和WO9422466(Cox和Russell)中所述的方法，并略加改良，本文引用這兩篇文獻(xiàn)以供參考。重組蛋白質(zhì)一般用二硫蘇糖醇(DTT)，Tris(2-羧乙基)膦-HCl(TCEP)或一些其它的還原劑進(jìn)行部分還原以實(shí)現(xiàn)游離半胱氨酸的最佳PEG化。游離半胱氨酸與半胱氨酸反應(yīng)性PEG具有極低的反應(yīng)性，除非進(jìn)行所述部分還原步驟。部分還原各突變體所需的還原劑的量使用在不同pH和溫度下的還原劑濃度范圍憑經(jīng)驗(yàn)確定。還原劑濃度一般從0.5等摩爾到10倍過(guò)量。優(yōu)選的溫度是4℃到37℃。pH范圍可從6.5到9.0，但優(yōu)選7.5到8.5。也可根據(jù)還原劑和接觸的時(shí)間改變最佳條件。在合適條件下，首先破壞最不穩(wěn)定的二硫鍵(一般是分子間二硫鍵和混合二硫鍵)而不是熱力學(xué)上更穩(wěn)定的天然二硫鍵。通常5-10倍摩爾過(guò)量的DTT在室溫下處理30分鐘是有效的?？山?jīng)過(guò)在反向柱上蛋白質(zhì)洗脫曲線的輕微移位來(lái)測(cè)定部分還原。對(duì)于二聚體hGH，經(jīng)過(guò)在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析可見(jiàn)分子量的移位。必須注意不能過(guò)分還原該蛋白質(zhì)而暴露其它的半胱氨酸殘基。經(jīng)過(guò)反向-HPLC(過(guò)分還原的蛋白質(zhì)具有類似于完全還原并變性的蛋白的滯留時(shí)間)和經(jīng)過(guò)PEG化反應(yīng)后含兩個(gè)PEG的GH分子的出現(xiàn)(可經(jīng)過(guò)在SDS-PAGE上的分子量改變來(lái)檢測(cè))可檢測(cè)過(guò)分還原。野生型GH可用作對(duì)照，因?yàn)樵诓贿€原天然分子內(nèi)二硫鍵的條件下不應(yīng)發(fā)生PEG化?？山?jīng)過(guò)大小排阻層析或透析在PEG化前去掉過(guò)量的還原劑。在加入PEG化試劑前不必去掉TCEP，因?yàn)樗缓坞x巰基。該部分還原的蛋白質(zhì)可與各種濃度的PEG-馬來(lái)酰亞胺或PEG-乙烯砜(一般PEG蛋白質(zhì)的摩爾比為1∶1，5∶1，10∶1和50∶1)反應(yīng)以測(cè)定兩種試劑的最佳比例。使用SDS-PAGE測(cè)定分子量的改變可監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的PEG化。一般認(rèn)為產(chǎn)生大量單PEG化產(chǎn)物而不產(chǎn)生二PEG化產(chǎn)物的PEG的最低量是最佳的(一般認(rèn)為80％轉(zhuǎn)變成單PEG化產(chǎn)物是較好的)。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)大小排阻，離子交換，親和，反相或疏水相互作用層析從未PEG化蛋白質(zhì)和未反應(yīng)的PEG中純化單PEG化蛋白質(zhì)。也可使用其它的純化方法，例如2-相有機(jī)提取或鹽沉淀?？稍趯?shí)施例1所述的細(xì)胞增殖測(cè)定中測(cè)試純化的PEG化蛋白質(zhì)以測(cè)定其比活。
可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證實(shí)PEG部分在正確的位點(diǎn)附著到蛋白質(zhì)上。經(jīng)過(guò)化學(xué)裂解或蛋白水解消化該蛋白質(zhì)，以大小排阻，離子交換或反相層析純化PEG化肽(它具有較大的分子量)，隨后進(jìn)行氨基酸測(cè)序可完成該實(shí)驗(yàn)。在氨基酸測(cè)序過(guò)程中PEG偶連的氨基酸以空白出現(xiàn)。
實(shí)施例12PEG-T3C的制備和純化進(jìn)行初步滴定實(shí)驗(yàn)以測(cè)定合適的還原劑和PEG試劑的濃度并避免蛋白質(zhì)的過(guò)分還原。我們經(jīng)過(guò)在非還原性SDS-PAGE上將二聚體轉(zhuǎn)變成非還原性單體來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的部分還原。將1μl的純化T3C二聚體與濃度遞增的TCEP在室溫下溫育60分鐘。立即用非還原性SDS-PAGE分析該反應(yīng)。產(chǎn)生大量單體T3C而不過(guò)分還原和變性該蛋白質(zhì)的TCEP的量用于隨后的實(shí)驗(yàn)。TCEP是一種用于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)的常規(guī)還原劑，因?yàn)樗桓蓴_PEG化反應(yīng)；因此在加入PEG前不必透析蛋白質(zhì)TCEP混合物。在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)中優(yōu)選廉價(jià)的還原劑，如DTT用于還原蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，用還原劑處理蛋白質(zhì)適量時(shí)間。然后將反應(yīng)的pH調(diào)節(jié)到6.5或以下以限制二硫鍵的重排。經(jīng)過(guò)透析或液相層析去掉還原劑。然后將pH重調(diào)到高于6.5或優(yōu)選7.5至8.5并加入PEG試劑。
pH7.5下的滴定實(shí)驗(yàn)表明5倍摩爾過(guò)量的TCEP在室溫下處理60分鐘將大部分的T3C二聚體轉(zhuǎn)變成合適的二硫鍵單體而不過(guò)度還原該蛋白質(zhì)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，與預(yù)期一樣，T3C二聚體需要用TCEP還原以進(jìn)行PEG化。然后將這些反應(yīng)條件上升到100μg的反應(yīng)規(guī)模。10分鐘后向T3CTCEP混合物中加入10倍摩爾過(guò)量的5kDa馬來(lái)酰亞胺-PEG(Fluka)并使PEG化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。將樣品快速上樣到在20mM Tris-HCl，pH8.0中平衡過(guò)的1ml Q-SEPHAROSE柱上。柱子用20mM Tris-HCl，pH8.0洗滌并用線型10倍柱體積的在20mM Tris-HCl，pH8.0中從0到250mM NaCl遞增的鹽梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western印跡鑒定含有單PEG化T3C的級(jí)分(單個(gè)PEG部分附著到T3C單體上)。合并這些級(jí)分并冷凍貯存。PEG部分的存在減少了蛋白質(zhì)對(duì)樹(shù)脂的親和力，允許從未PEG化蛋白質(zhì)分離PEG化蛋白質(zhì)。
實(shí)施例13PEG化S144C和其它半胱氨酸突變蛋白按實(shí)施例12對(duì)于T3C所述，對(duì)S144C也進(jìn)行初步滴定實(shí)驗(yàn)以測(cè)定合適的還原劑，PEG試劑的濃度并避免蛋白質(zhì)的過(guò)分還原。使用超出2倍摩爾量的TCEP和超出10倍摩爾量的5kDa馬來(lái)酰亞胺-PEG在pH7.5室溫下進(jìn)行較大規(guī)模的PEG化反應(yīng)2小時(shí)。對(duì)反應(yīng)混合物的SDS-PAGE分析表明存在具有兩個(gè)或多個(gè)PEG的一些類型。按實(shí)施例12所述使用Q-SEPHAROSE柱從單PEG化S144C中分離它們。此外，使用5kDa的乙烯砜-PEG(Fluka)進(jìn)行PEG化反應(yīng)，在相同的還原條件下產(chǎn)生了單PEG化S144C。
我們還對(duì)T148C，stp192C和T135C進(jìn)行了小規(guī)模的PEG化反應(yīng)，用5kDa的馬來(lái)酰亞胺-PEG和/或5kDa的乙烯砜-PEG均產(chǎn)生單PEG化蛋白質(zhì)。
實(shí)施例14PEG-T3C和PEG-S144C hGH蛋白質(zhì)的生物活性在細(xì)胞增殖測(cè)定中測(cè)量PEG-T3C和PEG-S144C蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(實(shí)施例1)。PEG-T3C蛋白質(zhì)與垂體hGH和非PEG化T3C蛋白質(zhì)顯示出相似的劑量應(yīng)答曲線且達(dá)到相同水平的最大刺激。PEG-T3C的平均EC50值為1.6ng/ml(0.07nM)(4個(gè)實(shí)驗(yàn)值為1.3，1.5，1.7，1.8ng/ml)。PEG-T3C蛋白質(zhì)的生物活性比使用非特異性NHS-PEG試劑PEG化的rhGH(Clark等，(1996)所述的EC50值440ng/ml(20nM))至少高100倍。
PEG-S144C的平均EC50值為43ng/ml(2nM)(2個(gè)實(shí)驗(yàn)值為40和45ng/ml)。PEG-S144C蛋白質(zhì)的生物活性比使用非特異性NHS-PEG試劑PEG化的rhGH(EC50值為440ng/ml(20nM)；Clark等，(1996))高大約10倍。
實(shí)施例15構(gòu)建hGH的二硫鍵連接的三聚體和二硫鍵連接的更高級(jí)多聚體可構(gòu)建具有一個(gè)以上“游離”半胱氨酸的其它hGH變異體并用于產(chǎn)生hGH的更高級(jí)二硫鍵連接的多聚體。這些多聚體可包括三聚體，四聚體，五聚體，六聚體，七聚體，八聚體和任何更高級(jí)多聚體。例如，經(jīng)過(guò)使用重組DNA技術(shù)體外重組攜帶單個(gè)“游離”半胱氨酸突變的DNA質(zhì)粒載體可構(gòu)建具有兩個(gè)“游離”半胱氨酸殘基的hGH變異體。另外，可通過(guò)對(duì)hGH的半胱氨酸變異體的誘變以增加一個(gè)額外的“游離”半胱氨酸突變。也可使用這兩種方法中任一種的重復(fù)以構(gòu)建具有3個(gè)或多個(gè)“游離”半胱氨酸的hGH變異體。
可按如下方法使用具有兩個(gè)游離半胱氨酸殘基的hGH變異體產(chǎn)生hGH三聚體和更高級(jí)多聚體?？砂幢疚膶?shí)施例5-9所述在大腸桿菌中表達(dá)該變異體且在滲透壓休克裂解產(chǎn)物的上清中作為單體回收。然后可使用一系列加工步驟誘導(dǎo)二硫鍵形成，例如，按本文實(shí)施例6-9所述的Q瓊脂糖層析法。在該條件下，具有一個(gè)游離半胱氨酸的一些hGH變異體，例如T3C和stp192C基本上定量轉(zhuǎn)變成二硫鍵連接的二聚體。在相同或相似條件下，具有兩個(gè)游離半胱氨酸的hGH變異體，例如，組合T3C和stp192C的雙突變體形成的分子間二硫鍵可導(dǎo)致hGH分子的聚合且該多聚體的鏈長(zhǎng)原則上是沒(méi)有限制的。經(jīng)過(guò)向聚合反應(yīng)中加入僅具有一個(gè)游離半胱氨酸的hGH分子，如T3C變異體和/或stp192C變異體可限制鏈長(zhǎng)并控制到一定程度。在不斷增長(zhǎng)的多聚體和僅具有一個(gè)游離的半胱氨酸的分子間形成的二硫鍵將“封住”新生多聚體中兩個(gè)聚合位點(diǎn)中的一個(gè)或防止其進(jìn)一步延伸。第二個(gè)僅具有一個(gè)游離半胱氨酸的hGH分子與該新生多聚體的另一聚合位點(diǎn)隨后發(fā)生的反應(yīng)終止了聚合且固定了多聚體分子的長(zhǎng)度。經(jīng)過(guò)化學(xué)計(jì)算反應(yīng)物，即具有兩個(gè)游離半胱氨酸的hGH分子與具有一個(gè)游離半胱氨酸的hGH分子的比例可控制多聚體的平均長(zhǎng)度。經(jīng)過(guò)降低比例可有助于形成平均較短的多聚體，經(jīng)過(guò)提高比例可有助于形成平均更長(zhǎng)的多聚體。從包含具有3個(gè)或多個(gè)游離半胱氨酸的hGH變異體與僅具有一個(gè)游離半胱氨酸的hGH變異體的反應(yīng)可構(gòu)建更復(fù)雜的“分支的”多聚體。
隨后經(jīng)過(guò)諸如大小排阻層析，離子交換層析，疏水相互作用層析等層析方法可純化不連續(xù)大小類型的某些多聚體?？墒褂脤?duì)GH所述的相似方法產(chǎn)生EPO和α干擾素的二硫鍵連接的二聚體和更高級(jí)多聚體。
實(shí)施例16桿狀病毒(BV)-表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生成素(rEPO)的克隆，表達(dá)和純化A.克隆編碼EPO的cDNA。
使用正向引物BB45(5＞CCCGGAT CCATGGGGGTGC ACGAATGTCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.25)和反向引物BB47(5＞CCCGA ATTCTATGCCCAGGTGGACACACCTG＞3)(SEQ.ID.NO.26)經(jīng)PCR克隆編碼人EPO的cDNA。BB45與編碼EPO信號(hào)序列的起始甲硫氨酸和氨基末端部分的DNA序列退火且含有用于克隆目的的Bam HI位點(diǎn)(Jacobs等，1985；Lin等，1985)。BB47與緊靠翻譯終止信號(hào)下游的EPO mRNA 3’非翻譯區(qū)退火且含有用于克隆目的的Eco RI限制性位點(diǎn)。在用于PCR的單鏈cDNA第一鏈合成中使用從人肝細(xì)胞系Hep 3B分離的總RNA。
為了制備總細(xì)胞RNA，將Hep3B細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS)的Delbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)用130μM去鐵胺或100μM氯化鈷處理細(xì)胞18小時(shí)誘導(dǎo)EPO的表達(dá)。兩種化合物在Hep 3B細(xì)胞中均顯示出誘導(dǎo)EPO mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)(Wang和Semenza，1993)。使用Rneasy Mini試劑盒(Qiagen，Inc.)按廠商說(shuō)明書(shū)從細(xì)胞中分離RNA。從用氯化鈷處理的1.4×107個(gè)細(xì)胞中分離出大約320μg的總RNA，從用去鐵胺處理的1.4×107個(gè)細(xì)胞中分離出270μg的總RNA。使用來(lái)自Boehringer Mannheim公司的用于RT-PCR(AMV)的第一鏈cDNA合成試劑盒且用隨機(jī)6聚體作引物完成單鏈cDNA的第一鏈合成。使用第一鏈合成的產(chǎn)物作模板用引物BB45和BB47進(jìn)行隨后的PCR反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠時(shí)觀察到預(yù)期的大約600bp的PCR產(chǎn)物。兩種PCR制品均產(chǎn)生一種EPO PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用Bam HI和Eco RI消化并克隆進(jìn)已用Bam HI和Eco RI酶切并用堿性磷酸酶處理的載體pUC19中。DNA測(cè)序鑒定了一個(gè)含有EPO基因的正確編碼序列的克隆。該質(zhì)粒命名為pBBT131且用于經(jīng)過(guò)如實(shí)施例17所述的定點(diǎn)誘變構(gòu)建EPO變異體。
B.BV rEPO在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，修飾pBBT131中EPO cDNA的5’和3’末端。在5’末端，在緊靠起始密碼子ATG的上游加入序列CAAA以增強(qiáng)翻譯。該序列含有認(rèn)定的桿狀病毒共有的翻譯起始序列(Ayres等，1994；Ranjan和Hasnain，1995)。在3’末端，加入編碼8氨基酸FLAG表位序列(asp-tyr-lys-asp-asp-asp-asp-lys)(SEQ.ID.NO.27)的DNA序列以提供純化系統(tǒng)。FLAG表位經(jīng)過(guò)彈性接頭ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser(SEQ.ID.NO.28)與EPO基因融合。使用向EPO序列中插入所需添加的寡核苷酸引物經(jīng)PCR進(jìn)行這些修飾。寡核苷酸引物BB63(5＞CGCGGATCCAAAATGGGGGTGCACGAATGTCCT＞3)(SEQ.ID.NO.29)用于修飾該基因的5’端。BB63在ATG的上游加入CAAA序列，與編碼EPO信號(hào)序列的起始甲硫氨酸和氨基末端部分的DNA序列退火且含有用于克隆目的的Bam HI位點(diǎn)。使用反向引物BB60(5＞GTCTTTGTAGTCCGAGCCTCCGCTTCCGCCCGATCTGTCCCCTGTCCTGCA＞3)(SEQ.ID.NO.30)和BB61(5＞CGCGAATTCTTATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCCGAGCCTCC＞3)(SEQ.ID.NO.31)在兩個(gè)連續(xù)PCR反應(yīng)中加入接頭和FLAG序列。BB60與EPO編碼序列的3’端退火且含有融合肽接頭序列和FLAG序列的一部分。BB61重疊與接頭-FLAG序列的連接區(qū)退火的BB60序列的一個(gè)片段且加入FLAG序列的剩下部分及隨后的翻譯終止密碼子(TAA)和一個(gè)用于克隆目的的EcoRI位點(diǎn)。將修飾的EPO cDNA作為一個(gè)Bam HI-Eco RI片段克隆進(jìn)pUC19且證實(shí)了該構(gòu)建體的DNA序列。所得的質(zhì)粒命名為pBBT132并用于按實(shí)施例17所述構(gòu)建EPO變異體。為了在桿狀病毒中表達(dá)，將“FLAG標(biāo)記的”EPO cDNA作為大約630bp的Bam HI-Eco RI片段從pBBT132中切下，凝膠純化并克隆進(jìn)已用Bam HI和Eco RI酶切并用堿性磷酸酶處理的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBac4.5(Invitrogen)中。挑出一個(gè)克隆備用且命名為pBBT138。
pBBT138 DNA用于與線型化的(Bsu36 I消化的)Bac-N-BlueTM(Invitrogen公司)桿狀病毒DNA一起共轉(zhuǎn)染來(lái)自草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的細(xì)胞系Sf9。加工Bac-N-BlueTM基因組以便形成噬菌斑的病毒顆粒的產(chǎn)生需要在線型Bac-N-BlueTMDNA與pBlueBac4.5載體之間進(jìn)行重組，導(dǎo)致將克隆的EPO基因插入桿狀病毒基因組中。這種專性重組也導(dǎo)致在桿狀病毒基因組中插入了功能性β-半乳糖苷酶基因。使用2×106個(gè)Sf9細(xì)胞按照Invitrogen的“Bac-N-BlueTM轉(zhuǎn)染試劑盒”方案進(jìn)行共轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生大約1ml的上清。在Sf9細(xì)胞上27℃下測(cè)定該上清稀釋液的藍(lán)色(blue)噬菌斑的形成。挑出10個(gè)藍(lán)色噬菌斑并傳代培養(yǎng)。使用各噬菌斑接種在含有5ml補(bǔ)充了10％FBS的Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基的T25瓶中的2.5×106個(gè)Sf9細(xì)胞上。5天后從這些感染的細(xì)胞收集上清(“P1”原種)并經(jīng)過(guò)Western印跡測(cè)定EPO的表達(dá)。在加入了1％β巰基乙醇(BME)的SDS樣品緩沖液中制備10個(gè)所得的上清并在預(yù)制14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(Novex)上電泳。包含未感染的SF9細(xì)胞上清作為陰性對(duì)照。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素膜(Novex)上。硝酸纖維素膜在含有0.05％Tween 20和4％奶粉的Tris緩沖鹽溶液(TBS)(封閉緩沖液)中封閉。抗-FLAG M2小鼠IgG1單克隆抗體(Eastman KODAK)以封閉緩沖液中1∶1500或1∶2500的稀釋度使用，印跡在4℃按常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG1(結(jié)合位點(diǎn)有限公司)在封閉緩沖液中以1∶1000稀釋且印跡在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。使用NBT\BCIP顯色底物(Promega)顯色Western印跡。10個(gè)分離物中有9個(gè)為EPO表達(dá)陽(yáng)性。在還原條件下BV rEPO蛋白質(zhì)的分子量大約為30kDa且在該分子量范圍中并存1個(gè)主帶和1至2個(gè)弱小帶，它與可變糖基化蛋白一致。
在下面實(shí)施例16.D所述的體外EPO生物測(cè)定中測(cè)試了兩種陽(yáng)性上清。兩種上清均以劑量依賴的方式刺激EPO依賴型細(xì)胞系的增殖，表明它們含有活性EPO。將模擬品的上清感染Sf9細(xì)胞，通過(guò)Western印跡證實(shí)EPO表達(dá)為陰性的一個(gè)桿狀病毒上清在EPO生物測(cè)定中顯示出無(wú)可檢測(cè)的活性。
為了生產(chǎn)和純化大量野生型BV rEPO，選擇一個(gè)稱為bvBBT138A的陽(yáng)性重組桿狀病毒用于進(jìn)一步擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)將分離物138A的P1原種在500ml補(bǔ)充了10％FBS的Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中的Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中27℃下傳代培養(yǎng)以制備500ml高滴度病毒原種。Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基含有大約100μM的L-胱氨酸。7天后從該培養(yǎng)物中收獲上清且發(fā)現(xiàn)具有大約108個(gè)噬菌斑形成單位/ml的滴度。該裂解產(chǎn)物(“P2”原種)的等分試樣隨后用于感染500ml培養(yǎng)物以便大規(guī)模生產(chǎn)野生型BV rEPO。500ml在補(bǔ)充了10％FBS的Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)瓶中生長(zhǎng)至1.0×106/ml的滴度，然后以1的感染復(fù)數(shù)用bvBBT138A感染。3天后從該培養(yǎng)物中收獲上清，按實(shí)施例16.C所述純化野生型BV rEPO-138A蛋白質(zhì)。
C.野生型桿狀病毒所產(chǎn)生的rEPO的親和純化經(jīng)過(guò)離心和0.2μM過(guò)濾澄清細(xì)胞上清。經(jīng)過(guò)Western印跡分析證實(shí)野生型BV rEPO的表達(dá)。野生型BV rEPO使用抗-FLAG M2親和凝膠(EastmanKODAK)以一步方法純化。簡(jiǎn)單地說(shuō)，5m1 M2親和凝膠用5倍柱體積的50mM Tris pH7.4，150mM NaCl(TBS)，5倍柱體積的0.1M甘氨酸pH3.5洗滌，然后在TBS中平衡。將澄清的桿狀病毒細(xì)胞上清調(diào)節(jié)到150mM NaCl并加入平衡的樹(shù)脂。在滾瓶培養(yǎng)裝置中使批量裝載物在4℃下持續(xù)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)后，使用Pharmacia XK 16/20 FPLC柱回收樹(shù)脂且用TBS洗滌直到A280達(dá)到基線。用0.1M甘氨酸pH3.5洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)并收集級(jí)分且用1.0M Tris pH9.0中和。需要時(shí)在添加了1％BME的SDS-PAGE樣品緩沖液中制備柱級(jí)分并在預(yù)制14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上電泳。合并含有大多數(shù)BV rEPO的來(lái)自M2親和柱的級(jí)分并在Centricon 10旋轉(zhuǎn)濃縮器(Amicon)中濃縮。使用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(BIO-RAD實(shí)驗(yàn)室，Inc.)并以牛血清白蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定野生型BV rEPO的最終產(chǎn)量大約為360μg。以考馬斯藍(lán)染色SDS凝膠估測(cè)該蛋白質(zhì)的純度大于90％。
D.野生型桿狀病毒rEPO的體外生物活性建立使用人UT7/epo細(xì)胞系(Komatsu等，1991)的細(xì)胞增殖測(cè)定以測(cè)量野生型BV rEPO的生物活性。人UT7/epo細(xì)胞系從哈佛醫(yī)科學(xué)校的F.Bunn博士處獲得。該細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和存活依賴于EPO(Boissel等，1993)。該細(xì)胞在補(bǔ)充了10％FBS，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和1單位/mlrEPO(CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞表達(dá)的；從R&D系統(tǒng)公司購(gòu)買)的Iscove’s改良的Delbecco’s培養(yǎng)基(IMDM)中維持。對(duì)于生物測(cè)定，用IMDM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次并以1×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸于含有10％FBS，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中。50μl(5×103個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸液等分分配進(jìn)平底96孔組織培養(yǎng)平板的各試驗(yàn)孔中。在無(wú)酚紅的含有10％FBS，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中制備待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的3倍系列稀釋液。將50μl稀釋的蛋白質(zhì)樣品加入試驗(yàn)孔中并在濕潤(rùn)的5％CO2組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)平板。蛋白質(zhì)樣品以一式3孔進(jìn)行測(cè)定。60-72小時(shí)后，向各孔中加入20μl CellTiter 96 Aqueous One溶液試劑(Promega公司)且在組織培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)平板1-4小時(shí)。使用微滴板閱讀器在490nm下閱讀各孔的吸光度。對(duì)照孔含有培養(yǎng)基但無(wú)細(xì)胞。從各組一式三份試驗(yàn)孔獲得的平均吸光度值減去一式三份對(duì)照孔獲得的平均吸光度值。平行分析系列稀釋的CHO細(xì)胞表達(dá)型rEPO或野生型BV rEPO。
由細(xì)胞數(shù)和吸光度值的劑量依賴型增加證實(shí)UT7/epo細(xì)胞系顯示出對(duì)rEPO強(qiáng)烈的增殖應(yīng)答。在高達(dá)2.0的值范圍內(nèi)，吸光度與細(xì)胞數(shù)成比例(Promega公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))。不存在rEPO時(shí)，大多數(shù)UT7/epo細(xì)胞死亡，產(chǎn)生的吸光度值小于0.1。CHO細(xì)胞表達(dá)的rEPO商品與我們制備的野生型BV rEPO在測(cè)定誤差范圍內(nèi)達(dá)到相同的最大刺激水平，且在生物測(cè)定中具有大約0.4-0.5ng/ml的相似的平均EC50(表2)。在不同日期進(jìn)行的測(cè)定中這些蛋白質(zhì)的EC50值從0.21到0.65ng/ml不等(表2)。因此，對(duì)蛋白質(zhì)樣品間的比較在同一天分析的樣品上進(jìn)行。這些EC50值與R&D系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)中對(duì)CHO rEPO報(bào)道的值一致(0.05-0.1單位/ml或大約0.4-0.8ng/ml)。
實(shí)施例17EPO半胱氨酸突變蛋白的構(gòu)建，表達(dá)，純化和生物活性A.EPO半胱氨酸突變蛋白的構(gòu)建使用類似于實(shí)施例4所述用于構(gòu)建生長(zhǎng)激素突變體的定點(diǎn)PCR誘變方法構(gòu)建8個(gè)突變的EPO基因(Innis等，1990；Horton等，1993)。我們構(gòu)建了在A-B環(huán)的兩個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)上或其附近的4個(gè)突變體(N24C，T26C，N38C和T40C)，在B-C環(huán)的N-連接的糖基化位點(diǎn)上或其附近的2個(gè)突變體(N83C和S85C)，在C-D環(huán)的O-連接的糖基化位點(diǎn)上的1個(gè)突變體(S126C)和在天然羧基末端R166殘基與由肽接頭和FLAG序列組成的15個(gè)氨基酸羧基末端延伸之間加入一個(gè)半胱氨酸的一個(gè)突變體(*167C)。用于誘變PCR反應(yīng)的模板是質(zhì)粒pBBT131，其中未修飾的EPO基因作為BamHI-EcoRI片段克隆進(jìn)pUC19。用合適的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，凝膠純化并與用相應(yīng)限制性酶切割，且用堿性磷酸酶處理的pBBT132載體DNA連接并凝膠純化。如上所述，pBBT132是攜帶克隆化修飾(FLAG標(biāo)記)型EPO基因的pUC19衍生物。繁殖來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子并分離和測(cè)序質(zhì)粒DNA。測(cè)定完整克隆型誘變PCR片段的序列以證實(shí)存在目的突變，且不存在由PCR反應(yīng)或由合成寡核苷酸引物可能導(dǎo)入的任何其它突變。
半胱氨酸取代突變N24C構(gòu)建如下。誘變型正向寡核苷酸BB64(5＞GAGGCCAAGGAGGCCGAGTGTATCACGACGGGCTGTGCT＞3)(SEQ.ID.NO.32)設(shè)計(jì)成將24位的天冬酰胺密碼子AAT改變成編碼半胱氨酸的TGT且跨越附近的Sty I位點(diǎn)。該寡核苷酸與反向非誘變引物BB47(5＞CCCGAATTCTGGTGGATAT GCCCAGGTGGAC＞3)(SEQ.ID.NO.33)一起用于PCR，該反向引物與EPO編碼序列3′端的DNA序列退火。
PCR反應(yīng)在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行，反應(yīng)液為含有1.5mM MgCl2的1 XPromegaPCR緩沖液，引物各0.2μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP各200μM，lng模板質(zhì)粒pBBT131(實(shí)施例16所述)，1.5單位的Taq聚合酶(Promega)和0.25單位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。反應(yīng)在Robocycler GradieH 96熱循環(huán)儀(Stratagene公司)中進(jìn)行。反應(yīng)程序限定為96℃3分鐘，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的[95℃1分鐘；60℃1.25分鐘；72℃1分鐘]，接著在6℃保持。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)的5μl等分試樣，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大約470bp的預(yù)期大小的單一片段。按照賣主的方案使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”剩下的反應(yīng)物，并按照賣主的方案用Sty I和Bsr GI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化，乙醇沉淀，重懸于20μl 10mM Tris-HCl pH8.5中并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化大約400bp的目的Sty I-Bsr GI片段。該片段與已用Sty I和Bsr GI酶切并用小牛腸堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)處理的pBBT132(實(shí)施例16所述)連接并凝膠純化。該連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序所得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒以鑒定含有N24C突變且在大約400bp的StyI-Bsr GI片段的剩余部分具有正確序列的克隆。
除了使用誘變型正向寡核苷酸BB65(5＞GAGGCCAAGGA GGCCGAGAAATCTGTACGGGCTGTGCT＞3)(SEQ.ID.NO.34)代替BB64外，使用上述用于N24C的方案構(gòu)建取代突變T26C并證實(shí)其序列。
使用實(shí)施例4所述的“通過(guò)重疊延伸實(shí)施誘變”的技術(shù)構(gòu)建取代突變N38C。除了使用不同的寡核苷酸引物外，用于N38C構(gòu)建的起始或“初級(jí)”P(pán)CR反應(yīng)按與上面構(gòu)建N24C所述相同的方法進(jìn)行。使用的引物對(duì)是(BB66+BB47)和(BB67+BB45)。BB47如上所述。正向非誘變引物BB45(5＞CCCGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.35)與編碼EPO前7個(gè)氨基酸的EPO序列退火。BB66和BB67是互補(bǔ)的誘變寡核苷酸，它們將N38的AAT密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT。BB66的序列是(5＞AGCTTGAATGAGTGTCACTGTCCCAGACACC＞3)(SEQ.ID.NO.36)且BB67的序列是(5＞GGTGTCTGGGACAGTGA TACACTCATTCAAGCT＞3)(SEQ.ID.NO.37)。(BB66×BB47)和(BB67×BB45)PCR反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物預(yù)期大小為(BB66×BB47)為大約420bp且(BB67×BB45)為大約220bp。乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，凝膠純化且按上述在20μl 10mM Tris-HCl中回收。然后依次將這兩個(gè)誘變的片段“剪接”在一起，或進(jìn)行“二級(jí)”P(pán)CR反應(yīng)。在該反應(yīng)中，初級(jí)反應(yīng)的凝膠純化的PCR產(chǎn)物各1μl用作模板且BB45和BB47用作引物。其它反應(yīng)條件與初級(jí)反應(yīng)中所用的相同。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析二級(jí)PCR的等分試樣，觀察到大約630bp的預(yù)期帶。按照賣主的方案使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”二級(jí)PCR反應(yīng)物，并按照賣主的方案用Sty I和Bsr GI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化，乙醇沉淀，重懸于20μl 10mM Tris-HClpH8.5中并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。使用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化大約400bp的目的Sty I-Bsr GI片段。該片段與已用Sty I和Bsr GI酶切并用小牛腸堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)處理的pBBT132(實(shí)施例16所述)連接并凝膠純化。該連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序所得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒以鑒定含有N38C突變且在大約400bp的Sty I-Bsr GI片段上具有正確序列的克隆。
除了在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將T40的ACT密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB68(5＞AGCTTGAATGAGAATATCTGTGTCCCAGACACC＞3)(SEQ.ID.NO.38)和BB69(5＞GGTGTCTGGGACACAGATATTCTCATTCAAGCT＞3)(SEQ.ID.NO.39)分別代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案構(gòu)建取代突變T40C并證實(shí)其序列。
除了在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將N83的AAC密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGC的互補(bǔ)誘變引物BB70(5＞GCCCTGTTGGTCTGCTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.40)和BB71(5＞CAGGGGCTCCCACGGCTGGGAAGAGCAGA CCAAC AGGGC＞3)(SEQ.ID.NO.41)分別代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案構(gòu)建取代突變N83C并證實(shí)其序列。初級(jí)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物大小也不相同。(BB70×BB47)反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期的大約300bp的產(chǎn)物，(BB71×BB45)反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期的大約360bp的產(chǎn)物。
除了在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將S85的TCC密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGC的互補(bǔ)誘變引物BB72(5＞GCCCTGTTGGTCAACTCTTGCCAGCCGTGGGAGCCCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.42)和BB73(5＞CAGGGGCTCCCACGGCTGGCAAGAGTTGACC AACAGGGC＞3)(SEQ.ID.NO.43)分別代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案構(gòu)建取代突變S85C并證實(shí)其序列。初級(jí)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物大小也不相同。(BB72×BB47)反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期的大約300bp的產(chǎn)物，且(BB73×BB45)反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期的大約360bp的產(chǎn)物。
除了在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將S126的TCA密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB74(5＞CCAGATGCGGCCTGTGCTGCTCCACTC＞3)(SEQ.ID.NO.44)和BB75(5＞GAGTGGAGCAGCACAGGCCGCATCTGG＞3)(SEQ.ID.NO.45)分別代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案構(gòu)建取代突變S126C。初級(jí)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物大小也不相同。(BB74×BB47)反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期的大約175bp的產(chǎn)物，(BB75×BB45)反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期的大約480bp的產(chǎn)物。
也構(gòu)建了一種在EPO編碼序列的羧基末端氨基酸之后添加一個(gè)半胱氨酸的突變。稱為*167C的該突變構(gòu)建如下。在上述用于N24C突變體構(gòu)建的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，但采用寡核苷酸BB45(見(jiàn)上文)和反向誘變寡核苷酸BB77(5＞TTTGTAGTCCGAGCCTCCGCTTCCGCCCGAACATCTGTCCCCTGTCCTGCA＞3)(SEQ.ID.NO.46)并使用2.5單位的Taq聚合酶和0.5單位的Pfu聚合酶。BB77與EPO編碼序列末端21個(gè)殘基退火且在EPO編碼序列末端氨基酸R166的密碼子AGA之后加入一個(gè)半胱氨酸殘基TGT密碼子。BB77還加入編碼7氨基酸接頭-ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser-(SEQ.ID.NO.27)的序列和FLAG表位序列的一部分。凝膠純化該P(yáng)CR反應(yīng)的大約630bp的產(chǎn)物并用作隨后的PCR反應(yīng)的模板，該P(yáng)CR采用相同的反應(yīng)條件但使用引物BB47和BB61(5＞CGCGAATTCTTATTTATCGTCATCG TCTTTGTAGTCCGAGCCTCC＞3)(SEQ.ID.NO.30)，它添加進(jìn)FLAG表位序列的剩余部分及隨后的TAA終止密碼子和一個(gè)Eco RI克隆位點(diǎn)。按照賣主的方案使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”該P(yáng)CR反應(yīng)物的大約675bp的產(chǎn)物，并按照賣主的方案用Sty I和Eco RI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化，乙醇沉淀，重懸于20μl 10mM Tris-HCl pH8.5中并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化大約86bp的目的Eco RI-Bsr GI片段。該片段與已用Eco RI和Bsr GI酶切并用小牛腸堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)處理的pBBT132(實(shí)施例16所述)連接并凝膠純化。該連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序所得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒以鑒定含有*167C突變且在大約86bp的Eco RI-Bsr GI片段上具有正確序列的克隆。
為了在桿狀病毒中表達(dá)，從pUC19為基礎(chǔ)的pBBT132衍生物中作為大約630bp的Bam HI-Eco RI片段切下編碼8個(gè)突變蛋白的EPO基因并亞克隆進(jìn)用于表達(dá)野生型EPO的pBlueBac4.5桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中。
使用相似于本文所述的方法，可構(gòu)建EPO的其它半胱氨酸突變蛋白。半胱氨酸突變蛋白可以是用半胱氨酸取代EPO編碼序列中天然氨基酸殘基的取代突變，在EPO編碼序列的兩個(gè)天然存在的氨基酸之間插入半胱氨酸殘基的插入突變，或在EPO編碼序列的第一個(gè)氨基酸，A1，之前加入一個(gè)半胱氨酸殘基，或在EPO編碼序列的末端氨基酸殘基，R166，之后加入一個(gè)半胱氨酸殘基的添加突變。半胱氨酸殘基可取代EPO編碼序列中任何位置的任何氨基酸殘基或插入任意兩個(gè)氨基酸之間。在EPO中取代和插入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點(diǎn)是在螺旋A之前的區(qū)域，A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)和螺旋D遠(yuǎn)端的區(qū)域。其它優(yōu)選的位點(diǎn)是A，B，C和D螺旋的第一個(gè)和最后三個(gè)氨基酸。在這些區(qū)域產(chǎn)生半胱氨酸取代的優(yōu)選殘基是A1，P2，P3，R4，L5，D8，S9，I25，T27，G28，A30，E31，H32，S34，N36，I39，D43，T44，K45，N47，Y49，A50，K52，R53，M54，E55，G57，Q58，G77，Q78，A79，S84，Q86，W88，E89，T107，R110，A111，G113，A114，Q115，K116，E117，A118，S120，P121，P122，D123，A124，A125，A127，A128，R131，T132，K154，Y156，T157，G158，E159，A160，T163，G164，D165，R166。半胱氨酸殘基也可插入至緊靠這些氨基酸之前或之后。加入半胱氨酸殘基的另一優(yōu)選位點(diǎn)是在A1之前，我們稱為*-1C。
也可經(jīng)過(guò)用另一氨基酸取代EPO中的一個(gè)天然存在的半胱氨酸殘基以構(gòu)建含有游離半胱氨酸的EPO突變體。這樣在正常情況下與取代的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的天然存在的半胱氨酸殘基游離出來(lái)?？捎萌魏纹渌?9種氨基酸取代非必需的半胱氨酸殘基，但優(yōu)選用絲氨酸或丙氨酸殘基。也可經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾天然存在的氨基酸將游離半胱氨酸殘基導(dǎo)入EPO，例如，使用Sytkowski等(1998)所述的方法。
使用類似于實(shí)施例16-19所述的方法，可在真核細(xì)胞(例如，昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)該蛋白質(zhì)，純化該蛋白質(zhì)，PEG化該蛋白質(zhì)和在體外生物測(cè)定中測(cè)量其生物學(xué)活性。也可使用類似于實(shí)施例1-15所述的方法或本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的有關(guān)方法在諸如大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)EPO突變體。
B.昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)EPO-Cys突變體為了進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)，使用上述用于質(zhì)粒pBBT138的方法將編碼突變EPO基因的8個(gè)質(zhì)粒與線型化的Bac-N-BlueTMDNA一起共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。在Sf9細(xì)胞上測(cè)定轉(zhuǎn)染上清的藍(lán)色噬菌斑形成。對(duì)于各突變，挑出10個(gè)藍(lán)色噬菌斑并按實(shí)施例16所述傳代。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western印跡篩選10個(gè)所得上清中的5個(gè)以檢測(cè)EPO突變體的表達(dá)。使用實(shí)施例16對(duì)野生型EPO所述的方法進(jìn)行Western印跡分析。Western印跡表明從各克隆篩選的5個(gè)上清中至少有3個(gè)含有FLAG標(biāo)記的EPO蛋白質(zhì)。Western印跡結(jié)果還揭示編碼在一個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)防止糖基化的突變體(N24C，T26C，N38C，T40C，N83C和S85C)的質(zhì)粒產(chǎn)生分子量比野生型BV rEPO小大約2,200-2,800道爾頓的蛋白質(zhì)。相反，在O-連接的糖基化位點(diǎn)的S126突變體和*167C(添加C-末端半胱氨酸)產(chǎn)生的EPO蛋白質(zhì)與野生型BV rEPO共同遷移。這些結(jié)果與昆蟲(chóng)細(xì)胞一般進(jìn)行N-連接的糖基化且附著到O-連接的糖基化位點(diǎn)的糖基一般較小并導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子量的微弱增加的觀察結(jié)果一致。已報(bào)道昆蟲(chóng)細(xì)胞可進(jìn)行O-連接的糖基化(Davies，1995)。
為了純化大量的EPO突變體，挑選一個(gè)編碼各突變體的陽(yáng)性重組桿狀病毒分離物用于進(jìn)一步擴(kuò)增。按上文對(duì)野生型分離物所述經(jīng)過(guò)傳代從各突變型P1原種制備500ml高滴度的病毒原種。使用實(shí)施例16中對(duì)野生型EPO所述的方法將這些P2裂解物的等分試樣隨后用于感染500ml培養(yǎng)物以便大規(guī)模產(chǎn)生各種EPO突變體。隨后無(wú)菌過(guò)濾500ml來(lái)自桿狀病毒感染的細(xì)胞的上清并在4℃貯存。使用抗-FLAG M2親和凝膠柱(Eastman Kodak)純化rEPO-Cys突變體，對(duì)于各突變體使用不同批的樹(shù)脂以保證無(wú)交叉污染。5ml樹(shù)脂首先用50mM Tris，150mM NaCl，pH7.4(TBS)，接著用0.1M甘氨酸pH3.0洗滌，最后在TBS中重新平衡。在加入親和樹(shù)脂之前向桿狀病毒培養(yǎng)物濾液中加入氯化鈉至最終濃度為0.15M。將樹(shù)脂分批上樣到滾瓶培養(yǎng)裝置上在4℃過(guò)夜。第二天早晨使用XK 16 Pharmacia柱捕獲樹(shù)脂且用TBS洗滌直到A280達(dá)到基線。用0.1M甘氨酸pH3.0洗脫rEPO-Cys突變體。將級(jí)分(1.5ml)收集進(jìn)含有20μl 1M Tris堿，pH9.0的試管中以中和該溶液。根據(jù)層析和SDS-PAGE分析，合并含有基本上純的rEPO-Cys蛋白質(zhì)的級(jí)分并冷凍。來(lái)自500ml上清培養(yǎng)物的蛋白回收量根據(jù)各突變體從75到800μg之間不等(表2)。
純化的rEPO-Cys突變體在非還原條件下以27-30kDa的表觀分子量遷移，與單體蛋白質(zhì)一致。rEPO-Cys突變體的表觀分子量分成兩類，很可能是由于糖基化的差異。在O-糖基化位點(diǎn)(S126C)和在C-末端(*167C)含有突變的rEPO-Cys蛋白質(zhì)遷移到與野生型BV rEPO相似的位置。含有能阻止N-連接的糖基化位點(diǎn)之一糖基化的突變的蛋白質(zhì)(N24C，T26C，N38C，T40C，N83C和S85C蛋白質(zhì))以27-28kDa的表觀分子量遷移，略小于野生型BV rEPO。令人驚奇的是，S85蛋白質(zhì)在還原和非還原條件下都以雙聯(lián)體遷移；雙聯(lián)體的主要帶是N-連接的糖基化位點(diǎn)之一未糖基化的蛋白質(zhì)的預(yù)期大小，而弱小帶是全部糖基化的野生型BV rEPO的預(yù)期大小。S85C突變體的所有原始重組桿狀病毒噬菌斑分離物均產(chǎn)生以雙聯(lián)體形式遷移的rEPO蛋白質(zhì)，表明雙聯(lián)體是由于在N83(或另一氨基酸)處部分糖基化而不是S85C被野生型BV EPO或S126C或*167C蛋白質(zhì)污染。幾種突變體，例如，S126C，*167C具有少量以45-55kDa的表觀分子量遷移的第二種蛋白質(zhì)，這取決于各突變體。這是二硫鍵連接的rEPO二聚體預(yù)期的分子量。這些帶在Western印跡中與抗-FLAG抗體反應(yīng)且在還原條件下在SDS凝膠中移動(dòng)時(shí)不存在。這些資料表明45-55kDa的帶代表二硫鍵連接的rEPO-Cys二聚體。
C.EPO半胱氨酸突變蛋白的生物活性在實(shí)施例16所述的UT7/epo細(xì)胞增殖測(cè)定中測(cè)量純化的rEPO-Cys突變體的生物學(xué)活性。使用Bradford測(cè)定法確定蛋白質(zhì)的濃度。由于有大量的樣品，將突變體分成兩組用于分析一組包含突變體T26C，T40C，N83C和S126C，第二組包含突變體N24C，N38C，S85C和*167C。同組突變體在同一天分析。野生型BV rEPO和CHO rEPO在同一天平行分析以控制在測(cè)定中不同天之間的可變性。所有的突變體刺激UT7/epo細(xì)胞的增殖且具有野生型rEPO對(duì)照蛋白質(zhì)3倍以內(nèi)的EC50值。N24C，T26C，N83C，S85C，S126和*167C突變體的平均EC50值相似于野生型BV rEPO和CHO rEPO的平均EC50值，平均為0.3-0.8ng/ml(表2)。N38C和T40C蛋白質(zhì)的平均EC50值大約為1ng/ml(表2)。
Bill等，(1995)報(bào)道了EPO半胱氨酸突變蛋白，N24C，N38C和N83C在大腸桿菌中的表達(dá)。與我們的結(jié)果相反，他們報(bào)道了這些半胱氨酸突變蛋白的生物活性相對(duì)于野生型EPO顯著下降。N38C突變體的生物活性比野生型EPO的生物活性下降不超過(guò)20％且N24C和N83C突變體的生物活性比野生型EPO的生物活性下降不超過(guò)5％。沒(méi)有報(bào)道EC50值。Bill等，(1995)推測(cè)半胱氨酸突變蛋白活性下降是由于導(dǎo)入蛋白質(zhì)中的額外半胱氨酸殘基導(dǎo)致形成錯(cuò)誤的二硫鍵而引起了錯(cuò)誤的折疊。他們?cè)谟糜诩兓腚装彼嵬蛔兊鞍椎娜芤褐袥](méi)有采用胱氨酸或其它半胱氨酸封閉劑。
根據(jù)Bill等，(1995)的結(jié)果，令人驚奇的是我們純化的N24C，N38C和N83C突變體具有與野生型EPO相當(dāng)或3倍以內(nèi)的生物學(xué)活性。這些數(shù)據(jù)表明我們表達(dá)和純化EPO半胱氨酸突變蛋白的方法與Bill等，(1995)采用的方法相比產(chǎn)生了具有較高的體外生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。
表2.人EPO半胱氨酸突變蛋白的特性
1來(lái)自各個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。顯示當(dāng)N＞3時(shí)的范圍。
實(shí)施例18EPO半胱氨酸突變蛋白的PEG化A.EPO半胱氨酸突變蛋白的小規(guī)模PEG化檢驗(yàn)了幾種半胱氨酸突變蛋白和野生型EPO用還原劑TCEP(三(2-羧乙基)膦-HCl)處理后與5kDa半胱氨酸反應(yīng)性PEG發(fā)生PEG化能力。用T26C突變體進(jìn)行滴定試驗(yàn)以鑒定用于PEG化的合適的TCEP和PEG試劑濃度，同時(shí)避免蛋白質(zhì)的過(guò)度還原。我們使用野生型BV rEPO作對(duì)照，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的部分還原。在10-40倍摩爾過(guò)量的乙烯砜或馬來(lái)酰亞胺5kDa PEG(Fluka)存在下測(cè)試了遞增濃度的TCEP(0.5M到6.0M過(guò)量)。經(jīng)過(guò)非還原性SDS-PAGE分析反應(yīng)物。平行處理野生型BV rEPO作為對(duì)照以鑒定大量產(chǎn)生單PEG化EPO-Cys突變體(單個(gè)PEG部分附著到EPO-Cys突變體上)，但不與野生型BV rEPO發(fā)生PEG化部分還原條件。TCEP過(guò)量5倍摩爾量且5kDa乙烯砜-PEG過(guò)量30倍摩爾量將產(chǎn)生大量單PEG化T26C蛋白質(zhì)而不與野生型BV rEPO發(fā)生PEG連接。
根據(jù)我們對(duì)T26C突變體的發(fā)現(xiàn)，使用如下條件PEG化幾種其它的半胱氨酸突變蛋白。等分試樣(1-2μg)的純化BV rEPO和EPO-Cys突變體與5倍摩爾過(guò)量的TCEP和30倍摩爾過(guò)量的5kDa乙烯砜PEG在pH8.0下室溫溫育1小時(shí)。經(jīng)過(guò)稀釋進(jìn)SDS樣品緩沖液(不含還原劑)終止反應(yīng)并經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析。新蛋白質(zhì)帶以大約35kDa遷移的現(xiàn)象證明，4種半胱氨酸突變蛋白(N24C，T26C，S126C和*167C)在這些條件下容易發(fā)生單PEG化。35kDa種類是單PEG化EPO預(yù)期的大?。辉谶@些反應(yīng)條件下對(duì)于任何EPO-Cys突變體檢測(cè)不到預(yù)期具有大約40kDa分子量的雙PEG化種類。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明需要用TCEP還原半胱氨酸突變蛋白以便PEG化。野生型BV EPO在相同的部分還原條件下不發(fā)生PEG化。這些數(shù)據(jù)表明PEG部分附著到已導(dǎo)入N24C，T26C，S126C和*167C EPO-Cys突變體的游離半胱氨酸上。
B.制備PEG-T26C和PEG-S126C用于生物活性測(cè)定我們對(duì)大量的T26C和S126C蛋白質(zhì)進(jìn)行PEG化以便純化PEG化蛋白質(zhì)用于生物活性測(cè)量。PEG化反應(yīng)的規(guī)模上升到包括各種蛋白質(zhì)各75μg和與小規(guī)模1μg反應(yīng)中所用相同摩爾比率的TCEP和5kDa-PEG。1小時(shí)后，將PEG化混合物用20mM Tris-HCl，pH8.0，20％甘油(緩沖液A)稀釋10倍并立即上樣到在緩沖液A中平衡的1ml Q-SEPHAROSE柱上。用平衡緩沖液洗滌柱并用線型10倍柱體積的在20mM Tris-HCl，pH8.0，20％甘油中從0到150mM NaCl遞增的鹽梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。PEG部分的存在減小了蛋白質(zhì)對(duì)樹(shù)脂的親和力，允許從未PEG化的蛋白質(zhì)分離出PEG化的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE，隨后以考馬斯藍(lán)染色鑒定含有單PEG化蛋白質(zhì)的級(jí)分。含有PEG-T26C但無(wú)可見(jiàn)的未衍化蛋白質(zhì)的級(jí)分在-80℃冷凍貯存并隨后用于生物測(cè)定。使用相似的方法獲得純化的PEG-S126C。進(jìn)行Western印跡以評(píng)估用于生物測(cè)定的PEG-T26C和PEG-S126C制品的純度。Western印跡按實(shí)施例16所述進(jìn)行。Western印跡在PEG-T26C和PEG-S126C預(yù)期的大小處產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號(hào)，但在未PEG化的S126C和T26C蛋白質(zhì)預(yù)期的位置檢測(cè)不到任何蛋白質(zhì)的遷移。從這些結(jié)果我們推斷在純化的PEG化突變體中很少存在未PEG化蛋白質(zhì)(＜5％)。
C.PEG-T26C和PEG-S126C半胱氨酸突變蛋白的生物活性在實(shí)施例16所述的UT7/epo細(xì)胞增殖測(cè)定中測(cè)量純化的PEG-T26C和PEG-S126C蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。使用人EPO ELSA試劑盒(R&D系統(tǒng))按廠商建議定量PEG-EPO-Cys突變體的蛋白質(zhì)濃度。還經(jīng)過(guò)ELISA定量了未PEG化突變體和野生型BV rEPO的蛋白質(zhì)濃度。所有的蛋白質(zhì)在同一天進(jìn)行ELISA測(cè)定。制備蛋白質(zhì)樣品的3倍系列稀釋液并在生物測(cè)定中分析。各系列稀釋液的未使用的材料在-80℃冷凍貯存并隨后在ELISA中分析以測(cè)定起始材料的精確蛋白質(zhì)濃度。分析各蛋白質(zhì)樣品的幾個(gè)系列稀釋液以保證至少在一個(gè)試驗(yàn)樣品中的蛋白質(zhì)濃度落在標(biāo)準(zhǔn)ELISA曲線的線型范圍內(nèi)，該范圍是0.0025-0.2單位/ml或大約0.02-1.6ng/ml。各樣品至少有兩個(gè)系列稀釋液落在該線型范圍內(nèi)。
PEG-T26C和PEG-S126C突變體的生物學(xué)活性類似于未修飾的T26C和S126C蛋白質(zhì)及野生型BV rEPO。PEG-T26C和PEG-S126C突變體的平均EC50值類似于對(duì)未PEG化T26C和S126C蛋白質(zhì)及野生型BV rEPO所測(cè)定的平均EC50值，范圍為0.48-0.82ng/ml(表3)。具有生物學(xué)活性的PEG化EPO蛋白質(zhì)以前未見(jiàn)描述。
表3.PEG-Cys EPO突變體的生物活性
1數(shù)據(jù)來(lái)自3個(gè)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例19EPO半胱氨酸突變蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)和純化EPO半胱氨酸突變蛋白也可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并從條件培養(yǎng)基中純化。經(jīng)過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞或經(jīng)過(guò)構(gòu)建表達(dá)EPO半胱氨酸突變蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可表達(dá)EPO半胱氨酸突變蛋白。為了在人類的治療應(yīng)用，優(yōu)選不用接頭和FLAG序列表達(dá)EPO半胱氨酸突變蛋白。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法可將猴COS細(xì)胞(可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。許多商品來(lái)源，例如GIBCO/BRL出售脂轉(zhuǎn)染試劑并提供可用于經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)EPO半胱氨酸突變蛋白的詳細(xì)方案。使用表達(dá)該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞可生產(chǎn)野生型EPO用于人類。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系廣泛用于高水平地表達(dá)重組蛋白質(zhì)(Geisse等，1996；Trill等，1995)。在CHO細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)基因擴(kuò)增可實(shí)現(xiàn)染色體整合的異源基因的高水平表達(dá)。一般目的基因與可篩選擴(kuò)增子的標(biāo)記基因連接。已描述了提供擴(kuò)增選擇的各種基因(Kaufman，1990)，但鼠二氫葉酸還原酶(dhfr)最常用。該基因的擴(kuò)增提供對(duì)葉酸類似物氨甲蝶呤(MTX)的抗性且抗性水平隨dhfr基因拷貝數(shù)的增加而增加(Alt等，1978)。dhfr缺陷型CHO細(xì)胞系的可獲得性增強(qiáng)了MTX篩選的應(yīng)用性(Urlaub和Chasin，1980)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可將鼠dhfr基因插入可買到的pCDNA3.1表達(dá)載體(Invitrogen)來(lái)構(gòu)建EPO半胱氨酸突變蛋白的表達(dá)載體，所述載體包含抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)基因。鼠dhfr表達(dá)載體pdhfr2.9可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(目錄號(hào)37165)。該dhfr基因可在dhfr-CHO細(xì)胞系中選擇并可經(jīng)過(guò)標(biāo)淮的MTX抗性篩選來(lái)擴(kuò)增(Crouse等，1983)。dhfr編碼序列可從pdhfr2.9中作為大約900bp的BglII片段切下并克隆進(jìn)表達(dá)載體pREP4(Invitrogen)中多接頭的唯一Bam HI位點(diǎn)。該構(gòu)建體將基因放在已知在CHO細(xì)胞中發(fā)揮功能的強(qiáng)RSV啟動(dòng)子(Trill等，1995)的下游，且在來(lái)自SV40的多聚腺苷化位點(diǎn)的上游。然后可從pREP4作為Sal I片段切下dhfr表達(dá)盒，因?yàn)镾al I位點(diǎn)緊靠啟動(dòng)子和polyA添加位點(diǎn)。使用寡核苷酸接頭，可將該SalI片段克隆進(jìn)pCDNA3.1的唯一Bgl II位點(diǎn)。
為了在諸如COS或CHO細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，EPO半胱氨酸突變蛋白的cDNA可經(jīng)過(guò)PCR為基礎(chǔ)的誘變進(jìn)行修飾。在5’端，可在翻譯起始密碼子ATG之前加入一個(gè)Kozak共有序列以增強(qiáng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的翻譯。在3’端，可去掉接頭和FLAG序列并恢復(fù)天然編碼序列和翻譯終止信號(hào)。然后將這些修飾的EPO cDNA作為Bam HI-Eco RI片段克隆進(jìn)pCDNA3.1的多接頭用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)或克隆進(jìn)pCDNA3.1∷dhfr載體的多接頭用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，編碼半胱氨酸突變蛋白的突變EPO基因在5’端修飾以在緊靠翻譯起始密碼子ATG之前插入一個(gè)Kozak共有序列(GCCACC)以便增強(qiáng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的翻譯。在3’端，可去掉接頭和FLAG序列并恢復(fù)天然編碼序列。以本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的各種誘變技術(shù)可實(shí)現(xiàn)這些修飾?？刹捎酶鶕?jù)實(shí)施例4和17所述的PCR-為基礎(chǔ)的誘變方法。PCR引物BB302(5＞CGCGGATCCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCT＞3)(SEQ.ID.NO.47)和BB303(5＞CGCGAATTCTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGCC＞3)(SEQ.ID.NO.48)可用于PCR，克隆在pUCl9或pBlueBac4.5中的突變EPO基因作為模板。正向引物BB302與編碼EPO分泌信號(hào)前7個(gè)氨基酸的EPO基因序列退火，在緊靠翻譯起始密碼子TGA之前加入一個(gè)Kozak共有序列，GCCACC，且包含一個(gè)用于克隆目的的Bam HI位點(diǎn)。反向引物BB303與EPO編碼序列中編碼羧基末端7個(gè)氨基酸的序列退火，在EPO編碼序列之后加入一個(gè)AGT翻譯終止密碼子，且包含一個(gè)用于克隆目的的Eco RI位點(diǎn)。使用這些引物和在這兩個(gè)引物之間有一個(gè)突變，例如在成熟EPO編碼序列的氨基酸1到159發(fā)生氨基酸取代的任何突變EPO基因模板進(jìn)行的各PCR反應(yīng)的產(chǎn)物將產(chǎn)生可被純化，用Bam HI和Eco RI消化并克隆進(jìn)諸如pCDNA3.1(+)(Invitrogen)等適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體中的PCR產(chǎn)物。PCR引物302和303也可用于修飾EPO半胱氨酸突變蛋白，其中，在成熟EPO編碼序列的第一個(gè)氨基酸，A1，之前，但遠(yuǎn)離EPO信號(hào)序列加入一個(gè)半胱氨酸。在編碼羧基末端7個(gè)氨基酸的EPO序列中的突變，或?qū)嵤├?7中所述的*167C突變需要使用另一反向引物代替BB303。這些引物可分別設(shè)計(jì)成包含突變的半胱氨酸密碼子，與模板靶精確配對(duì)的寡核苷酸3’端至少21個(gè)核苷酸，并含有用于克隆目的的Eco RI位點(diǎn)。例如反向引物BB304(5＞CGCGAATTCTCAACATCTGTCCCCTGTCCTGCAGCC＞3)(SEQ.ID.NO.49)和BB302可用于以克隆在pUC19或pBlueBac4.5中的突變的EPO*167C基因作模板的PCR反應(yīng)，以產(chǎn)生適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的編碼*167C突變體的修飾的突變型EPO基因。
無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA優(yōu)選用于轉(zhuǎn)染諸如COS或dhfr-CHO細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞。dhfr-CHO細(xì)胞系可從許多來(lái)源獲得，例如哥倫比亞大學(xué)L.Chasin博士(CHO K1 DUKX B11)或從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CHO duk，ATCC號(hào)CRL-9096)獲得。該細(xì)胞在補(bǔ)充了10％FBS，谷氨酰胺，甘氨酸，次黃嘌呤和腺苷的F12/DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Lucas等，1996)。經(jīng)過(guò)電穿孔或經(jīng)過(guò)使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)染試劑，例如LipofectAMINE(GibcoBRL)，使用賣主方案和/或文獻(xiàn)所述的方法(Kaufman，1990)進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？稍谘a(bǔ)充了7％已透析的FCS且缺乏谷氨酰胺，甘氨酸，次黃嘌呤和腺苷的F12/DMEM(Lucas等，1996)中選擇dhfr+轉(zhuǎn)染子。另外，可選擇G418抗性(由pCDNA3.1的NPT基因編碼)并隨后篩選dhfr+表型的轉(zhuǎn)染子?？稍谶x擇培養(yǎng)基上擴(kuò)增dhfr+克隆并使用可買到的EPO ELISA試劑盒(可從R&D系統(tǒng)獲得)或經(jīng)過(guò)使用抗-EPO抗血清(可從R&D系統(tǒng)獲得)進(jìn)行Western印跡篩選培養(yǎng)物上清的EPO半胱氨酸突變蛋白的生產(chǎn)。然后合并表達(dá)EPO半胱氨酸突變蛋白的克隆并按Kaufman(1990)所述在遞增藥物濃度下進(jìn)行多輪MTX抗性篩選。每輪MTX選擇后，可測(cè)試各克隆的EPO半胱氨酸突變蛋白生產(chǎn)。這些方法在文獻(xiàn)中已充分描述且已被用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)各種異源性蛋白質(zhì)(在Kaufman，1990中綜述)。
優(yōu)選的是，可供表達(dá)EPO半胱氨酸突變蛋白的CHO細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)的培養(yǎng)基應(yīng)含有半胱氨酸或另一種半胱氨酸封閉劑?？墒褂妙愃朴贗mai等，(1990)所述的方法從CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化EPO半胱氨酸突變蛋白。離心去掉CHO細(xì)胞后，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)經(jīng)過(guò)柱層析可從上清純化EPO半胱氨酸突變蛋白。用于純化EPO半胱氨酸突變蛋白的柱層析步驟可包括Blue Sepharose，羥基磷灰石，反相，疏水相互作用，大小排阻和離子交換層析。
實(shí)施例20IFN-α2的克隆，表達(dá)和純化A.克隆編碼IFN-α2的DNA序列有至少25種不同的IFN-α基因編碼具有70％或更大氨基酸相同性的蛋白質(zhì)(Blatt等，1996)。由于在IFN-α類型之間的高度DNA序列同源性，以兩步法克隆IFN-α2基因。首先，使用相應(yīng)于IFN-α2基因上游和下游特有序列的引物從人基因組DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增IFN-α2基因?？寺≡揚(yáng)CR產(chǎn)物并測(cè)序以證實(shí)其編碼IFN-α2基因。隨后，經(jīng)過(guò)PCR修飾IFN-α2編碼序列并進(jìn)行亞克隆以便在大腸桿菌中表達(dá)并定點(diǎn)誘變。從人基因組DNA(CLONTECH)經(jīng)PCR擴(kuò)增編碼IFN-α2的DNA。用BB93(5＞CGCGAATTCGGATATGTAAATAGATACACAGTG＞3)(SEQ.ID.NO.50)和BB94(5＞CGCAAGCTTAAAAGATTTAAATCGTGTCATGGT＞3)(SEQ.ID.NO.51)進(jìn)行PCR反應(yīng)。BB93與IFN-α2編碼序列上游(即5’端)大約300bp的基因組序列退火且含有用于克隆目的的Eco RI位點(diǎn)。BB94與IFN-α2編碼序列下游(即3’端)大約100bp的基因組序列退火且含有用于克隆目的的Hind III位點(diǎn)。用Eco RI和Hind III消化所得的大約1kb PCR產(chǎn)物并克隆進(jìn)同樣消化并用堿性磷酸酶處理的pCDNA3.1(+)(Invitrogen)中。鑒定了一個(gè)具有IFN-α2正確DNA序列(Henco等，1985)的克隆并命名為pBBT160。
為了在大腸桿菌中進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，將pBBT160的克隆的IFN-α2基因經(jīng)過(guò)PCR修飾以便在成熟的IFN-α2蛋白質(zhì)緊靠第一個(gè)殘基(C1)之前插入一個(gè)甲硫氨酸密碼子。在羧基末端殘基E165之后加入一個(gè)TAA終止密碼子。同時(shí)，加入Xba I和Sal I位點(diǎn)并刪除一個(gè)Bgl II位點(diǎn)以便提供方便的限制性位點(diǎn)用于隨后誘變。在該反應(yīng)中，pBBT160用作模板并使用引物BB99(5＞CGCAAGCTTCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTTCTAGAAGGACCTTGATGCTC＞3)(SEQ.ID.NO.52)和BB100(5＞CGCGAATTCTTATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTCGACAAAGAAAAGGATCTCATGAT＞3)(SEQ.ID.NO.53)進(jìn)行擴(kuò)增。BB99與成熟IFN-α2編碼序列的5’端退火且在成熟IFN-α2第一個(gè)氨基酸之前編碼一個(gè)起始甲硫氨酸。BB99在起始密碼子ATG下游大約30bp處導(dǎo)入一個(gè)Xba I位點(diǎn)，但不改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的氨基酸序列。此外還包含用于克隆目的的Hind III位點(diǎn)和Nde I位點(diǎn)，它們覆蓋ATG。反向引物BB100與編碼序列3’端退火且加入了一個(gè)TAA終止密碼子。BB100在TAA密碼子下游大約30bp處導(dǎo)入一個(gè)Sal I位點(diǎn)并刪除了位于更下游大約15bp處的一個(gè)天然存在的Bgl II位點(diǎn)。結(jié)果，位于起始密碼子ATG下游大約185bp的天然存在的Bgl II位點(diǎn)變成唯一位點(diǎn)。這些變化均不改變氨基酸序列。在緊靠終止密碼子下游加入一個(gè)Eco RI位點(diǎn)用于克隆目的。用Hind III和Eco RI消化大約520bp的PCR產(chǎn)物，凝膠純化并克隆進(jìn)同樣消化的質(zhì)粒pCDNA3.1(+)中。測(cè)定了一個(gè)克隆具有正確的DNA序列。該質(zhì)粒命名為pBBT164。為了在大腸桿菌中進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，將pBBT164的大約520 bp Nde I-Eco RI片段克隆進(jìn)同樣消化的表達(dá)載體pCYB1(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)。質(zhì)粒載體pCYB1允許基因作為非融合蛋白質(zhì)或作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)；該載體可構(gòu)建成使得該蛋白質(zhì)以非融合蛋白質(zhì)形式表達(dá)。所得的質(zhì)粒稱為pBBT170且編碼met-IFN-α2。含有pBBT164的met-IFN-α2序列的Nde I-Eco RI片段也亞克隆進(jìn)Nde I-EcoRI消化的pUC18中以產(chǎn)生質(zhì)粒pBBT168。
IFN-α2也可以經(jīng)過(guò)分泌進(jìn)周質(zhì)空間而在大腸桿菌中以活性形式表達(dá)(Voss等，1994)。分泌型IFN-α2缺乏N-末端甲硫氨酸且具有與天然存在的IFN-α2相同的氨基酸序列。為了表達(dá)IFN-α2的分泌形式，將大腸桿菌熱穩(wěn)定性腸毒素(STII)基因的先導(dǎo)序列(Picken等，1983)經(jīng)過(guò)PCR融合到成熟IFN-α2的編碼序列上。由于其長(zhǎng)度，在連續(xù)兩個(gè)PCR反應(yīng)中加入ST II序列。第一個(gè)反應(yīng)使用正向引物BB101(5＞GCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATGTGATCTGCCTCAAACCCACAGC＞3)(SEQ.ID.NO.54)和反向引物BB100并用pBBT164(上述)作模板。BB101的3’末端(21bp)與成熟IFN-α2的編碼序列5’端退火。BB101的5’片段(39個(gè)核苷酸)編碼STII先導(dǎo)肽的一部分。凝膠純化該反應(yīng)的大約550bp PCR產(chǎn)物并用作第二PCR反應(yīng)的模板。第二PCR反應(yīng)使用反向引物BB100和正向引物BB11(5’-CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG-3’)(SEQ.ID.NO.7)。BB11加入STII先導(dǎo)肽的剩余部分且含有與STII先導(dǎo)序列起始密碼子ATG重疊的Nde I位點(diǎn)。用Nde I和Xba I消化該反應(yīng)的大約590bp的產(chǎn)物。凝膠純化含有STII先導(dǎo)序列和IFN-α2氨基末端大約30bp的大約100bp的Nde I-Xba I片段并與已用Nde I和Xba I消化且用堿性磷酸酶處理的pBBT168[pUC18∷met-IFN-α2]連接并凝膠純化。在該步驟中，用PCR產(chǎn)生的STII-IFN-α2 PCR產(chǎn)物的大約100bp的Nde I-Xba I氨基末端片段代替met-IFN-α2基因的大約30bp的Nde I-Xba I氨基末端片段。證實(shí)所得的pUC18∷STII-IFN-α2構(gòu)建體的序列且該質(zhì)粒命名為pBBT177。為了在大腸桿菌中表達(dá)，用Nde I和Eco RI消化pBBT177且凝膠純化含有STII-IFN-α2基因的大約570bp的片段并克隆進(jìn)表達(dá)載體pCYB1中置于tac啟動(dòng)子控制下。所得的質(zhì)粒命名為pBBT178。
B.rIFN-α2在大腸桿菌中的表達(dá)將編碼met-IFN-α2的pBBT170和親本載體pCYB1轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109中。用這些菌株進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致表達(dá)met-IFN-α-2。分泌的IFN-α2優(yōu)選是胞質(zhì)met-IFN-α2，其中分泌的IFN-α2與天然存在的IFN-α2具有相同的氨基酸序列。
為了表達(dá)分泌型r IFN-α2，將pBBT178[pCYB1∷STII-IFN-α2]和親本載體pCYB1轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌W3110中。所得的菌株命名為BOB202W3110(pBBT178)和BOB130W3110(pCYB1)。我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)在起始pH為5.0到7.0范圍的磷酸鹽或MES緩沖的LB培養(yǎng)基中試驗(yàn)BOB202的生長(zhǎng)和r IFN-α2表達(dá)。飽和的過(guò)夜培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中稀釋至A600下為大約0.025 O.D并在搖瓶中37℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的O.D.達(dá)到大約0.3-0.5時(shí)，加入IPTG至最終濃度為0.5mM以誘導(dǎo)r IFN-α2的表達(dá)。對(duì)于起始實(shí)驗(yàn)，在誘導(dǎo)后0，1，3，5和大約16小時(shí)時(shí)取培養(yǎng)物樣品。在預(yù)制的14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE并經(jīng)考馬斯亮蘭染色分析誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物樣品。除了表達(dá)預(yù)期大約19kDa的IFN-α2的加工形式外，我們還觀察到比預(yù)期分子量更高的蛋白質(zhì)形式(大約21.5kDa)。更高分子量形式可能由缺乏對(duì)STII先導(dǎo)肽的蛋白裂解而產(chǎn)生；先導(dǎo)肽的分子量與該假設(shè)一致。我們的結(jié)果表明較低的pH值增強(qiáng)正確大小的rIFN-α2帶的積累。我們觀察到在pH6.5或以上時(shí)，21.5kDa是主要形式，而在pH6.0或以下時(shí)，與大腸桿菌表達(dá)的r IFN-α2標(biāo)準(zhǔn)品(Endogen公司)共遷移的大約19kDa的帶是主要的蛋白質(zhì)形式。在pH6.0或以下時(shí)，19kDa的帶占大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)的IFN-α2的至少80％且很可能占90％以上。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，使用以100mM MES緩沖到pH5.5的LB培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)實(shí)驗(yàn)。Voss等，(1994)也報(bào)道了使用STII先導(dǎo)序列將IFN-α2分泌進(jìn)大腸桿菌周質(zhì)中。他們還觀察到培養(yǎng)物pH維持在6.7時(shí)與維持在7.0相比，21.5kDa帶中r IFN-α2的比例降低，19kDa中的比例增加。在pH7.0時(shí)，Voss等，(1994)報(bào)道了10-30％的STIIIFN-α2融合蛋白質(zhì)被加工成19kDa的成熟IFN-α2蛋白質(zhì)。大腸桿菌在pH6.7生長(zhǎng)時(shí)正確加工的19kDa IFN-α2蛋白質(zhì)的百分比可增加到50-60％。然而，即使在該pH下，大量(40-50％)的STIIIFN-α2融合蛋白質(zhì)仍未加工，減少了正確加工的19kDa IFN-α2的產(chǎn)量。Voss等，(1994)認(rèn)為，為了使19kDa的分泌型IFN-α2的含量最大化，pH6.7是最佳的。Voss等，(1994)改變了一些生長(zhǎng)參數(shù)以嘗試將正確加工的19kDa IFN-α2蛋白質(zhì)的百分比增加到超過(guò)50-60％，但沒(méi)有成功。我們的數(shù)據(jù)表明將pH降低到6.5以下，且優(yōu)選5.5至6.0，可使裂解(19kDa)與未裂解(21.5kDa)的r IFN-α2產(chǎn)物的比率最大化。在這些較低pH值下，正確加工的19kDa IFN-α2的百分比增加到該細(xì)胞合成的總IFN-α2的至少80％且很可能到90-100％。
根據(jù)Koshland和Botstein(1980)的方法對(duì)表達(dá)r IFN-α2的培養(yǎng)物進(jìn)行滲透壓休克。該方法破裂大腸桿菌的外膜并將周質(zhì)內(nèi)容物釋放進(jìn)周圍的培養(yǎng)基中。隨后的離心分離可溶性周質(zhì)成分(在上清中回收)與細(xì)胞質(zhì)，不溶性周質(zhì)和細(xì)胞相關(guān)成分(在沉淀中回收)。在上清中回收到BOB202合成的大約25-50％的19kDa rIFN-α2。在可溶性周質(zhì)部分中沒(méi)有觀察到rIFN-α2的21.5kDa形式。
C.rIFN-α2在大腸桿菌中的大規(guī)模表達(dá)和純化為了純化野生型rIFN-α2蛋白質(zhì)，將新鮮飽和的BOB202過(guò)夜培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB 100mM MES(pH5.5)中接種至A600下為大約0.02 O.D。一般來(lái)說(shuō)，將325ml培養(yǎng)物在2L搖瓶中37℃下在旋轉(zhuǎn)(gyrotory)搖床水浴中以大約160-200rpm培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的密度達(dá)到大約0.3-0.4 O.D.時(shí)，加入IPTG至最終濃度為0.5mM。然后將誘導(dǎo)培養(yǎng)物培養(yǎng)大約16小時(shí)。按照Hsuing等(1986)的方法對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行滲透壓休克。離心沉淀細(xì)胞并以大約25 OD/ml重懸于冰冷卻的20％蔗糖，10mM Tris-HCl(pH8.0)中。重懸的細(xì)胞在冰上培養(yǎng)15分鐘并以9500xg離心10分鐘。沉淀重懸于冰冷卻的10mM Tris-HCl(pH8.0)中并在冰上培養(yǎng)15分鐘，以9500xg離心10分鐘。所得的上清(滲透壓休克裂解物)立即加工或貯存于-80℃。
rIFN-α2純化如下。將來(lái)自滲透壓休克的上清的pH調(diào)節(jié)到3，離心去掉任何沉淀并上樣到在20mM MES pH5.0(緩沖液A)中平衡的5ml PharmaciaHiTrap S-Sepharose柱上。用0-100％緩沖液B(500mM NaCl，20mM MES，10％乙二醇)的線型鹽梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)非還原性SDS-PAGE分析柱級(jí)分。rIFN-α2在大約225-235mM NaCl處洗脫。合并富集rIFN-α2的級(jí)分并進(jìn)一步在預(yù)先用40mM磷酸鈉pH6.0，1M NaCl，0.1％Tween 20中平衡的1ml Cu++IMAC(固定化金屬親和層析)Hi Trap柱中分離。用在40mM磷酸鈉，1M NaCl，0.1％Tween 20中從5.5到4.1的反向pH梯度洗脫rIFN-α2。在梯度達(dá)到100％緩沖液B后，洗脫液的pH最終達(dá)到pH4.1時(shí)洗脫rIFN-α2。合并含有純化的，正確折疊的rIFN-α2的來(lái)自Cu++IMAC柱的級(jí)分并作為等分試樣凍存在-80℃。在某些早期洗脫級(jí)分中可檢測(cè)到少量rIFN-α2變異體。這種由于不完全二硫鍵形成所產(chǎn)生的且具有生物學(xué)活性的變異體以前已有描述(Khan和Rai，1990)。含有該變異體的級(jí)分不加入純化rIFN-α2的最終合并液中。經(jīng)過(guò)在280nm下的吸光度和經(jīng)過(guò)Bradford分析測(cè)定的rIFN-α2最終產(chǎn)量為從250ml培養(yǎng)物中得到大約400μg。用SDS-PAGE分析時(shí)還原的IFN-α2比非還原的IFN-α2以略大的表觀分子量遷移(Morehead等，1984)。該表觀分子量的改變是由于在IFN-α2中天然二硫鍵的還原產(chǎn)生的。我們的rIFN-α2在還原和非還原條件下都與商品化rIFN-α2標(biāo)準(zhǔn)品共遷移。
D.野生型r IFN-α2的體外生物活性使用體外抗病毒試驗(yàn)或細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)測(cè)量IFN-α的生物活性。我們建立了測(cè)量野生型r IFN-α2生物活性的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。人Daudi B細(xì)胞系(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)對(duì)IFN-α的生長(zhǎng)抑制特性敏感且通常用于測(cè)量IFN-α的生物活性(Horoszewicz等，1979；Evinger和Pestka，1981)。Daudi細(xì)胞在補(bǔ)充了10％FBS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中維持。為了進(jìn)行生物測(cè)定，用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次并以4×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸于含有10％FBS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將50μl(2×104個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞懸液等分分配進(jìn)平底96孔組織培養(yǎng)板的各試驗(yàn)孔中。在含有10％FBS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中制備待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的3倍系列稀釋液。將50μl的稀釋的蛋白質(zhì)樣品加入試驗(yàn)孔中并在濕潤(rùn)的5％CO2組織培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)平板。蛋白質(zhì)樣品以一式3孔進(jìn)行測(cè)定。4天后，向各孔中加入20μl CellTiter 96 Aqueous One溶液試劑(Promega公司)且在組織培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)平板1-4小時(shí)。使用微滴板閱讀器在490nm下讀取吸光度。對(duì)照孔含有培養(yǎng)基但無(wú)細(xì)胞。從各組一式三份試驗(yàn)孔獲得的平均吸光度值減去一式三份對(duì)照孔獲得的平均吸光度值。平行分析系列稀釋的大腸桿菌表達(dá)的r IFN-α2(Endogen公司)。計(jì)算各樣品的IC50值(最大生長(zhǎng)抑制的一半所需的蛋白質(zhì)濃度)并用于比較蛋白質(zhì)的生物活性。
由吸光度值的劑量依賴型減小證實(shí)Daudi細(xì)胞系的增殖受到r IFN-α2的強(qiáng)烈抑制。商品r IFN-α2(Endogen公司)與我們制備的野生型r IFN-α2在測(cè)定誤差范圍內(nèi)達(dá)到相同的最大生長(zhǎng)抑制水平，且具有大約13-16pg/ml的相似的平均IC50值(表4)。在不同日期進(jìn)行的測(cè)定中這些蛋白質(zhì)的IC50值從7到29pg/ml不等(表4)。因此，蛋白質(zhì)之間的比較對(duì)同一天分析的樣品進(jìn)行。
實(shí)施例21IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的構(gòu)建，表達(dá)，純化和生物活性A，IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的構(gòu)建使用類似于實(shí)施例4所述的定點(diǎn)PCR為基礎(chǔ)的誘變方法構(gòu)建17個(gè)突變的IFN-α2基因。我們構(gòu)建了在靠近螺旋A的氨基末端區(qū)域中的1個(gè)突變體[Q5C]；在A-B環(huán)中的6個(gè)突變體[N45C，Q46C，F(xiàn)47C，Q48C，A50C和43C44(在殘基43和44之間插入一個(gè)半胱氨酸)]；在短的兩個(gè)殘基的BC環(huán)中的1個(gè)突變體[D77C]；在CD環(huán)中的4個(gè)突變體[Q101C，T106C，E107C和T108C]；在E螺旋遠(yuǎn)端的羧基末端區(qū)域中的3個(gè)突變體[S163C，E165C和*166C(在天然羧基末端加入一個(gè)半胱氨酸殘基)]。我們還構(gòu)建了突變體C1S和C98S，它們刪除了天然存在的，但非必須的C1-C98二硫鍵(Lydon等，1985；Morehead等，1994)。在靠近螺旋A的氨基末端區(qū)域中的C1S取代在C螺旋中產(chǎn)生了一個(gè)游離半胱氨酸(C98)，而在C螺旋中的C98S取代在靠近螺旋A的區(qū)域產(chǎn)生了一個(gè)游離半胱氨酸(C1)。
為了進(jìn)行誘變，將PCR引物寡核苷酸設(shè)計(jì)成可摻入核苷酸改變，其導(dǎo)致在IFN-α2編碼序列中的選定位置插入一個(gè)半胱氨酸殘基。如果可行，也可將誘變寡核苷酸設(shè)計(jì)成跨越鄰近的可用于將誘變的PCR片段克隆進(jìn)合適質(zhì)粒的限制性位點(diǎn)。當(dāng)沒(méi)有有用的限制性位點(diǎn)足夠靠近突變位點(diǎn)時(shí)，可采用“通過(guò)重疊延伸實(shí)施誘變”的技術(shù)(Horton等，1993)。用于誘變PCR反應(yīng)的模板是質(zhì)粒pBBTl77(實(shí)施例20所述)，其中STII-IFN-α2基因作為NdeI-EcoRI片段克隆進(jìn)pUC18。用合適的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，凝膠純化并與用那些相同的限制性酶切割，且用堿性磷酸酶處理的pBBT177載體DNA連接并凝膠純化。繁殖來(lái)自該連接的轉(zhuǎn)化子并分離和測(cè)序質(zhì)粒DNA。測(cè)定完整克隆化誘變PCR片段的序列以證實(shí)存在目的突變，且不存在由PCR反應(yīng)或由合成寡核苷酸引物可能導(dǎo)入的任何其它突變。
使用實(shí)施例4所述的“通過(guò)重疊延伸實(shí)施誘變”的技術(shù)構(gòu)建取代突變Q5C。用于Q5C構(gòu)建的起始，或“初級(jí)”P(pán)CR反應(yīng)在50μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，反應(yīng)液為含有1.5mM MgCl2的1 X Promega PCR緩沖液，引物各0.2μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP各200μM，1ng模板質(zhì)粒pBBT177(實(shí)施例20所述)，1.5單位的Taq聚合酶(Promega)和0.25單位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。反應(yīng)在Robocycler Gradient 96熱循環(huán)儀(Stratagene公司)中進(jìn)行。反應(yīng)程序限定為96℃3分鐘，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的[95℃1分鐘；60℃1.25分鐘；72℃1分鐘]，接著在6℃保持。使用的引物對(duì)是[BB125×BB130]和[BB126×BB129]。BB125(5＞CTATGCGGCATCAGAGCAGATA＞3)(SEQ.ID.NO.55)與克隆的IFN-α2序列上游大約20bp處的pUC18載體序列退火。BB126(5＞TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC＞3)(SEQ.ID.NO.56)與克隆的IFN-α2序列下游大約40bp處的pUC18載體序列退火。BB129和BB130是將Q5的CAA密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變寡核苷酸。BB129的序列是(5＞TGTGATCT GCCTTGTACCCACAGCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.57)，BB130的序列是(5＞CAGGCTGTGGGTACAAGGCAGATCACA＞3)(SEQ.ID.NO.58)。[BB125×BB130]和[BB126×BB129]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB130]為大約140bp，[BB126×BB129]為大約560bp。按照賣主的方案使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”P(pán)CR產(chǎn)物，在2％瓊脂糖凝膠上電泳，使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化并在20μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)中回收。然后依次將這兩個(gè)誘變的片段“剪接”在一起，或進(jìn)行“二級(jí)”P(pán)CR反應(yīng)。在該反應(yīng)中，初級(jí)反應(yīng)的凝膠純化的PCR產(chǎn)物各2μl用作模板且BB125和BB126用作引物。反應(yīng)體積為100μl并使用2.5單位的Taq聚合酶和0.5單位的Pfu聚合酶。其它反應(yīng)條件與初級(jí)反應(yīng)中所用的相同。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析二級(jí)PCR的等分試樣且觀察到大約670bp的預(yù)期帶。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”大批二級(jí)PCR反應(yīng)物，并按照賣主的方案用NdeI和Xba I(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化，使用QIAquick PCR純化試劑盒“清理”并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化大約100bp的目的Nde I-Xba I片段。該片段與已用Nde I和Xba I酶切并用小牛腸堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)處理的pBBT177(實(shí)施例20所述)連接并凝膠純化。該連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序所得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒以鑒定含有Q5C突變且在大約100bp的NdeI-XbaI片段上具有正確序列的克隆。
除了在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將C1的TGT密碼子改變成絲氨酸密碼子TCT的互補(bǔ)誘變引物BB128(5＞AGGCAGATCAGATGCGTAAGC＞3)(SEQ.ID.NO.59)和BB127(5＞GCTTACGCATCTGATCTGCCT＞3)(SEQ.ID.NO.60)分別代替BB130和BB129外，使用上述用于Q5C的方案構(gòu)建取代突變C1S并證實(shí)其序列。[BB125×BB128]和[BB126×BB127]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB128]為大約120bp，[BB126×BB127]為大約570bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于Q5C的方案構(gòu)建取代突變N45C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將N45的AAC密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGC的互補(bǔ)誘變引物BB134(5＞CTTTTGGAACTGGCAGCCAAACTCCTC＞3)(SEQ.ID.NO.61)和BB133(5＞GAGGAGTTTGGCTGCCAGTTCCAAAAG＞3)(SEQ.ID.NO.62)分別代替BB130和BB129。[BB125×BB134]和[BB126×BB133]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB134]為大約255bp，[BB126×BB133]為大約440bp。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”二級(jí)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，并按照賣主的方案用Bgl II和Xba I(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化，使用QIAquick PCR純化試劑盒“清理”并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化大約155bp的目的Bgl II-Xba I片段。該片段與已用Bgl II和Xba I酶切并用小牛腸堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)處理的pBBT177連接并凝膠純化。該連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序所得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒以鑒定含有N45C突變且在大約155bp的Bgl II-Xba I片段上具有正確序列的克隆。
除了下述區(qū)別外使用上述用于N45C的方案構(gòu)建取代突變F47C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將F47的TTC密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGC的互補(bǔ)誘變引物BB136(5＞TTCAGCCTTTTGGCACTGGTTGCCAAA＞3)(SEQ.ID.NO.63)和BB135(5＞TTTGGCAACCAGTGCCAAAAGGCTGAA＞3)(SEQ.ID.NO.64)分別代替BB134和BB133。[BB125×BB136]和[BB126×BB135]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB136]為大約260bp，[BB126×BB135]為大約435bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于N45C的方案構(gòu)建插入突變43C44并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用在編碼氨基酸殘基43和44的密碼子之間插入一個(gè)半胱氨酸密碼子TGC的互補(bǔ)誘變引物BB132(5＞TTCAGCCTTTTGGCACTGGTTGCCAAA＞3)(SEQ.ID.NO.65)和BB131(5＞TTTGGCAACCAGTGCCAAAAGGCTGAA＞3)(SEQ.ID.NO.66)分別代替BB134和BB133。[BB125×BB132]和[BB126×BB131]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB132]為大約250bp，[BB126×BB131]為大約445bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于N45C的方案構(gòu)建取代突變Q46C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將Q46的CAG密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB154(5＞AGCCTTTTGGAAACAGTTGCCAAACTC＞3)(SEQ.ID.NO.67)和 BB153(5＞GAGTTTGGCAACTGTTTCCAAAAGGCT＞3)(SEQ.ID.NO.68)分別代替BB134和BB133。在Perkin-ElmerGeneAmpPCR系統(tǒng)2400熱循環(huán)儀中進(jìn)行初級(jí)反應(yīng)。反應(yīng)程序限定為95℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)的[95℃30秒；62℃30秒；72℃1分鐘]，接著在72℃7分鐘并在4℃保持。[BB125×BB154]和[BB126×BB153]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB154]為大約260bp，[BB126×BB153]為大約440bp。第二PCR反應(yīng)也在Perkin-Elmer GeneAmpPCR系統(tǒng)2400熱循環(huán)儀中進(jìn)行。反應(yīng)程序限定為96℃5分鐘，25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒；60℃30秒；72℃1分鐘]并在4℃保持。用Bgl II和Xba I消化后，在連接前使用QIAquickPCR純化試劑盒清理該反應(yīng)的產(chǎn)物，但不進(jìn)行凝膠純化。
除了下述區(qū)別外使用上述用于Q46C的方案構(gòu)建取代突變Q48C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將Q48的CAA密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB156(5＞GGTTTCAGCCTTACAGAACTGGTTGCC＞3)(SEQ.ID.NO.69)和BB155(5＞GGCAACCAGTTCTGTAAGGCTGAAACC＞3)(SEQ.ID.NO.70)分別代替BB154和BB153。[BB125×BB156]和[BB126×BB155]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB156]為大約265bp，[BB126×BB155]為大約435bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于Q46C的方案構(gòu)建取代突變A50C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將A50的GCT密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB158(5＞AGGGATGGTITCACTTTTGGAACTG＞3)(SEQ.ID.NO.71)和BB157(5＞CAGTTCCAAAAGTGTGAAACCATCCCT＞3)(SEQ.ID.NO.72)分別代替BB154和BB153。[BB125×BB158]和[BB126×BB157]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB158]為大約270bp，[BB126×BB157]為大約440bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于Q5C的方案構(gòu)建取代突變D77C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將D77的GAT密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB138(5＞TAGGAGGGTCTCACACCAAGCAGCAGA＞3)(SEQ.ID.NO.73)和BB137(5＞TCTGCTGCTTGGTGTGAGACCCTCCTA＞3)(SEQ.ID.NO.74)分別代替BB130和BB129。[BB125×BB138]和[BB126×BB137]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB138]為大約350bp，[BB126×BB137]為大約345bp。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”二級(jí)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，并按照賣主的方案用Bgl II和Sal I(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化，使用QIAquick PCR純化試劑盒“清理”并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化大約275bp的目的Bgl II-Sal I片段。該片段與已用Bgl II和Sal I酶切并用小牛腸堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)處理的pBBT177連接并凝膠純化。該連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序所得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒以鑒定含有D77C突變且在大約275bp的Bgl II-Sal I片段上具有正確序列的克隆。
除了下述區(qū)別外使用上述用于D77C的方案構(gòu)建取代突變T106C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將T106的ACA密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB140(5＞CAGGGGAGTCTCACACACCCCCACCCC＞3)(SEQ.ID.NO.75)和BB139(5＞GGGGTGGGGGTGTGTGAGACTCCCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.76)分別代替BB138和BB137。[BB125×BB140]和[BB126×BB139]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB140]為大約435bp，[BB126×BB139]為大約260bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于D77C的方案構(gòu)建取代突變T108C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將T108的ACT密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB142(5＞CTTCATCAGGGGACACTCTGTCACCCC＞3)(SEQ.ID.NO.78)和BB141(5＞GGGGTGACAGAGTGTCCCCTGATGAAG＞3)(SEQ.ID.NO.79)分別代替BB138和BB137。[BB125×BB142]和[BB126×BB141]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB142]為大約440bp，[BB126×BB1419]為大約250bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于D77C的方案構(gòu)建取代突變Q101C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將Q101的CAG密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB162(5＞CACCCCCACCCCACATATCACACAGGC＞3)(SEQ.ID.NO.80)和BB161(5＞GCCTGTGTGATATGTGGGGTGGGGGTG＞3)(SEQ.ID.NO.81)分別代替BB138和BB137。在Perkin-ElmerGeneAmpPCR系統(tǒng)2400熱循環(huán)儀中進(jìn)行初級(jí)反應(yīng)。反應(yīng)程序限定為95℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)的[95℃30秒；62℃30秒；72℃1分鐘]，接著在72℃7分鐘并在4℃保持。[BB125×BB162]和[BB126×BB161]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB162]為大約425bp，[BB126×BB161]為大約275bp。第二PCR反應(yīng)也在Perkin-Elmer GeneAmpPCR系統(tǒng)2400熱循環(huán)儀中進(jìn)行。反應(yīng)程序限定為96℃5分鐘，25個(gè)循環(huán)的[95℃30秒；60℃30秒；72℃1分鐘]并在4℃保持。該反應(yīng)的產(chǎn)物用Bgl II和Sal I消化后，在連接前使用QIAquick PCR純化試劑盒清理，但不進(jìn)行凝膠純化。
除了下述區(qū)別外使用上述用于Q101C的方案構(gòu)建取代突變E107C并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將E107的GAG密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT的互補(bǔ)誘變引物BB164(5＞CATCAGGGGAGTACATGTCACCCCCAC＞3)(SEQ.ID.NO.81)和BB163(5＞GTGGGGGTGACATGTACTCCCCTGATG＞3)(SEQ.ID.NO.82)分別代替BB162和BB161。[BB125×BB164]和[BB126×BB163] PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB164]為大約440bp，[BB126×BB163]為大約255bp。
除了下述區(qū)別外使用上述用于Q101C的方案構(gòu)建取代突變C98S并證實(shí)其序列。在初級(jí)PCR反應(yīng)中使用將C98的TGT密碼子改變成絲氨酸密碼子TCT的互補(bǔ)誘變引物BB160(5＞CCCCTGTATCACAGAGGCTTCCAGGTC＞3)(SEQ.ID.NO.83)和BB159(5＞GACCTGGAAGCCTCTGTGATACAGGGG＞3)(SEQ.ID.NO.84)分別代替BB162和BB161。[BB125×BB160]和[BB126×BB159]PCR反應(yīng)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，[BB125×BB160]為大約415bp，[BB126×BB159]為大約285bp。
半胱氨酸取代突變體S163C構(gòu)建如下。誘變型反向寡核苷酸BB143(5＞CGCGAATTCTTATTCCTTACATCTTAAACTTTC＞3)(SEQ.ID.NO.85)設(shè)計(jì)成將163位的絲氨酸密碼子AGT改變成編碼半胱氨酸的TGT并跨越附近的Eco RI位點(diǎn)。該寡核苷酸與正向，非誘變引物BB125一起用于PCR。PCR反應(yīng)在50μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，反應(yīng)液為含有1.5mM MgCl2的1 X Promega PCR緩沖液，各0.2μM的各引物，dATP，dGTP，dTTP和dCTP各200μM，lng模板質(zhì)粒pBBT131，1.5單位的Taq聚合酶(Promega)和0.25單位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。反應(yīng)在Robocycler Gradient 96熱循環(huán)儀(Stratagene公司)中進(jìn)行。反應(yīng)程序限定為96℃3分鐘，25個(gè)循環(huán)的[95℃1分鐘；60℃1.25分鐘；72℃1分鐘]，接著在6℃保持。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)的5μl等分試樣，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生預(yù)期大約610bp的單個(gè)片段。按照賣主的方案使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)“清理”剩下的反應(yīng)產(chǎn)物，并按照賣主的方案用Sal I和Eco RI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化，乙醇沉淀，重懸于20μl 10mM Tris-HCl pH8.5中并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照賣主方案凝膠純化大約42bp的目的Sal I-Eco RI片段。該片段與已用Sal I和Eco RI酶切并用小牛腸堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)處理的pBBT132連接并凝膠純化。該連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序所得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒以鑒定含有E107C突變且在大約42bp的Sal I-Eco RI片段上具有正確序列的克隆。
還構(gòu)建了在IFN-α2編碼序列羧基末端氨基酸后加入一個(gè)半胱氨酸的突變。除了下述區(qū)別外使用上述用于S163C構(gòu)建的方案來(lái)構(gòu)建稱為*167C的該突變體。在E165的GAA密碼子與TAA終止密碼子之間加入一個(gè)半胱氨酸密碼子TGT且跨越附近的Eco RI位點(diǎn)的誘變型反向寡核苷酸BB144(5＞CGCGAATTCTTAACATTCCTTACTTCTTAAACTTTC＞3)(SEQ.ID.NO.86)用于在PCR反應(yīng)中代替BB143。
除了下述區(qū)別外使用上述用于S163C的方案構(gòu)建取代突變E165C并證實(shí)其序列。將E165的GAA密碼子改變成半胱氨酸密碼子TGT且跨越附近的Eco RI位點(diǎn)的誘變型反向寡核苷酸BB165(5＞CGCGAATTCTTAACACTTACTTCTTAAACT＞3)(SEQ.ID.NO.87)用于在PCR反應(yīng)中代替BB143。PCR反應(yīng)在Perkin-Elmer GeneAmpPCR系統(tǒng)2400熱循環(huán)儀中進(jìn)行。反應(yīng)程序限定為95℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)的[95℃30秒；62℃30秒；72℃1分鐘]，接著在72℃7分鐘并在4℃保持。用Eco RI和Sal I消化后，使用QIAquickPCR純化試劑盒清理該反應(yīng)的產(chǎn)物。
為了作為分泌進(jìn)周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)，從pUC-18為基礎(chǔ)的pBBT177衍生物以大約590bp的Nde I-Eco RI片段切下編碼17種突變體的STII-IFN-α2基因并亞克隆進(jìn)已用于表達(dá)野生型STII-IFN-α2的pCYB1表達(dá)載體中。為了進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)，將這些質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌W3110中。
使用類似于此處所述的方法，可構(gòu)建IFN-α2的其它半胱氨酸突變蛋白。半胱氨酸突變蛋白可以是用半胱氨酸取代IFN-α2編碼序列中天然氨基酸殘基的取代突變，在IFN-α2編碼序列的兩個(gè)天然存在的氨基酸之間插入一個(gè)半胱氨酸殘基的插入突變，或在IFN-α2編碼序列的第一個(gè)氨基酸，C1，之前加入一個(gè)半胱氨酸殘基，或在IFN-α2編碼序列的末端氨基酸殘基，E165，之后加入一個(gè)半胱氨酸殘基的添加突變。半胱氨酸殘基可取代IFN-α2編碼序列中任何位置的任何氨基酸殘基或插入任意兩個(gè)氨基酸之間。在IFN-α2中取代和插入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點(diǎn)是在螺旋A之前的區(qū)域，A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)，D-E環(huán)和螺旋E遠(yuǎn)端的區(qū)域。其它優(yōu)選的位點(diǎn)是A，B，C，D和E螺旋的第一個(gè)和最后三個(gè)氨基酸。在這些區(qū)域產(chǎn)生半胱氨酸取代的優(yōu)選殘基是D2，L3，P4，T6，H7，S8，Q20，R22，K23，S25，F(xiàn)27，S28，K31，D32，R33，D35，G37，F(xiàn)38，Q40，E41，E42，F(xiàn)43，G44，K49，T52，N65，S68，T69，K70，D71，S72，S73，A74，A75，D77，E78，T79，Y89，Q90，Q91，N93，D94，E96，A97，G102，V103，G104，V105，P109，M111，K112，E113，D114，S115，K131，E132，K133，K134，Y135，S136，A139，S152，S154，T155，N156，L157，Q158，E159，S160，L161，R162和K164。半胱氨酸殘基也可插入緊靠這些氨基酸之前或之后的位置。加入半胱氨酸殘基的另一優(yōu)選位點(diǎn)是在Cl之前，本文稱為*-1C。
也可經(jīng)過(guò)用另一氨基酸取代IFN-α2中的一個(gè)天然存在的半胱氨酸殘基以構(gòu)建含有游離半胱氨酸的IFN-α2突變體。這樣在正常情況下與被取代的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的天然存在的半胱氨酸殘基游離出來(lái)?？捎萌魏纹渌?9種氨基酸取代非必需的半胱氨酸殘基，但優(yōu)選用絲氨酸或丙氨酸。也可經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾天然存在的氨基酸將游離半胱氨酸殘基導(dǎo)入IFN-α2，例如，使用Sytkowski等(1998)所述的方法。
使用類似于實(shí)施例20-22所述的方法，可在大腸桿菌中表達(dá)所述蛋白質(zhì)，純化所述蛋白質(zhì)，PEG化所述蛋白質(zhì)和在體外生物測(cè)定中測(cè)量其生物學(xué)活性。也可使用類似于實(shí)施例16-20所述的方法或本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的有關(guān)方法在諸如昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的真核細(xì)胞中表達(dá)IFN-α2突變體。
B.rIFN-α2半胱氨酸突變蛋白的大腸桿菌表達(dá)為了評(píng)估表達(dá)，培養(yǎng)r IFN-α2突變體的培養(yǎng)物并按上文對(duì)野生型rIFN-α2所述進(jìn)行誘導(dǎo)。一般來(lái)說(shuō)，45ml培養(yǎng)物在250ml搖瓶中37℃下在旋轉(zhuǎn)搖床水浴中以大約180-200rpm培養(yǎng)。我們觀察到搖瓶培養(yǎng)物的劇烈通氣導(dǎo)致滲透壓休克裂解物上清中的IFN-α2蛋白質(zhì)水平降低。因此我們使用對(duì)通氣為亞最佳但對(duì)于可溶性r IFN-α2和r IFN-α2突變體生產(chǎn)是優(yōu)選的常規(guī)條件。培養(yǎng)已誘導(dǎo)的培養(yǎng)物大約16小時(shí)并收獲，除了向用于滲透壓休克方法的緩沖液中加入胱氨酸至5mM的最終濃度外按上文對(duì)野生型r IFN-α2所述進(jìn)行滲透壓休克。向滲透壓休克緩沖液中加入胱氨酸導(dǎo)致所分析的前兩個(gè)突變體，Q5C和S163C的層析特性明顯改進(jìn)。未用胱氨酸處理的干擾素突變體作為寬帶從S-SEPHAROSE柱中連續(xù)洗脫為寬帶，當(dāng)以非還原性SDS-PAGE分析時(shí)在預(yù)期的單體分子量處和附近顯示出多個(gè)分子量類型。這些類型很可能代表錯(cuò)誤折疊或不完全折疊的干擾素變異體。相反，在滲透壓休克過(guò)程期間用胱氨酸處理的干擾素突變體從S-SEPHAROSE柱中洗脫為窄帶，當(dāng)以非還原性SDS-PAGE分析時(shí)，僅由一個(gè)與干擾素野生型標(biāo)準(zhǔn)品共遷移的干擾素類型組成。當(dāng)在滲透壓休克緩沖液中包含胱氨酸時(shí)，來(lái)自S-SEPHAROSE柱的純化干擾素突變體的回收率也提高1.5到2倍。根據(jù)這些結(jié)果，向滲透壓休克緩沖液中加入5mM胱氨酸用于純化所有的半胱氨酸突變蛋白。
對(duì)突變蛋白的滲透壓休克上清的SDS-PAGE分析表明大多數(shù)具有水平下降(與野生型相比)的19kDa rIFN-α2帶。兩個(gè)突變體，Q5C和S163C以相當(dāng)于野生型干擾素的水平表達(dá)，這些突變體每種均可按下面的詳細(xì)描述容易地純化幾百微克。8個(gè)突變體(C1S，43C44，N45C，Q46C，Q48C，A50C，D77C和T108C)在滲透壓休克上清中基本上檢測(cè)不到。剩下的7個(gè)突變體(F47C，C98S，Q101C，T106C，E107C，E165C，*166C)在滲透壓休克上清中檢測(cè)到其水平不同程度地下降(與野生型相比)。從滲透壓休克上清中純化了一些突變體(T106C，C98S，E107C和Q101C)，但僅回收到少量的純蛋白質(zhì)。某些突變體，C98S，Q101C，T106C，E107C和*166C以相當(dāng)高的水平表達(dá)但主要為不溶性形式，很可能在周質(zhì)中積累。這些蛋白質(zhì)在還原條件下與野生型rIFN-α2標(biāo)準(zhǔn)品共遷移表明STII先導(dǎo)序列已被去掉。突變體相對(duì)表達(dá)水平的定性評(píng)估在表4中概括。
C.rIFN-α2半胱氨酸突變蛋白的純化為了純化rIFN-α2突變體，一般來(lái)說(shuō)，將在2升搖瓶中的325ml培養(yǎng)物，或在2升帶擋板搖瓶中的500ml培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)搖床水浴(New BrunswickScientific)中以大約170-220rpm的轉(zhuǎn)速在37℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)物按實(shí)施例20所述生長(zhǎng)，誘導(dǎo)，收獲并進(jìn)行滲透壓休克。所得的滲透壓休克上清立即加工或貯存于-80℃。
按上文對(duì)野生型rIFN-α2純化的詳細(xì)描述使用S-SEPHAROSE和Cu++IMAC層析純化滲透壓休克上清中的可溶性IFN-α2突變體。所有待測(cè)突變體緊密結(jié)合到銅柱上且在相似于野生型rIFN-α2的條件下洗脫。該結(jié)果表明半胱氨酸突變蛋白的構(gòu)象至少在包括金屬結(jié)合袋的區(qū)域中類似于天然rIFN-α2。
對(duì)純化的Q5C，C98S，Q101C，T106C，E107C，S163C和*166C半胱氨酸突變蛋白的非還原性SDS-PAGE分析表明突變體主要以單體回收，以大約19kDa的預(yù)期分子量遷移。C98S由于缺少天然Cysl-Cys-98二硫鍵比其它rIFN-α2突變體以略高的分子量遷移。有些純化的突變體含有少量的二硫鍵連接的rIFN-α2二聚體。該二聚體類型的分子量為大約37-38kDa。
D.rIFN-α2半胱氨酸突變蛋白的生物活性在實(shí)施例20所述的Daudi生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中測(cè)量純化的Q5C和S163CrIFN-α2半胱氨酸突變蛋白的生物活性。使用Bradford或BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Bio-Rad Laboratories and Pierce)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。野生型rIFN-α2商品和我們制備的rIFN-α2在同一天平行分析以控制不同日期間測(cè)定的可變性。突變體與野生型rIFN-α2對(duì)照蛋白質(zhì)在測(cè)定誤差范圍內(nèi)以相同的程度抑制Daudi細(xì)胞的增殖。Q5C突變體的平均IC50值為13pg/ml，類似于野生型rIFN-α蛋白質(zhì)的平均IC50值。S163C蛋白質(zhì)的平均IC50值為27pg/ml。這些數(shù)據(jù)在表4中概括。
表4IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的表達(dá)和體外生物活性
1在全細(xì)胞提取物中IFN-α2蛋白質(zhì)的相對(duì)積累2以SDS-PAGE凝膠估測(cè)的滲透壓休克上清中的IFN-α2蛋白質(zhì)部分3單個(gè)實(shí)驗(yàn)的IC50值4野生型rIFN-α2商品(Endogen公司)
5Bolder生物技術(shù)公司制備的野生型r IFN-α26突變?cè)贑-螺旋中產(chǎn)生游離半胱氨酸(C98)7突變?cè)贜-末端區(qū)域產(chǎn)生游離半胱氨酸(C1)實(shí)施例22PEG-Q5C和PEG-S163C的PEG化，純化和生物活性A.IFN-α半胱氨酸突變蛋白的PEG化用純化的r IFN-α2半胱氨酸突變蛋白進(jìn)行小規(guī)模PEG化實(shí)驗(yàn)以鑒定允許蛋白質(zhì)在游離半胱氨酸殘基處進(jìn)行單PEG化的條件。以非還原性SDS-PAGE監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的過(guò)度還原，尋找由于蛋白質(zhì)未折疊而導(dǎo)致的比預(yù)期表觀分子量更高的漂移，或?qū)ふ矣捎谔烊欢蜴I還原使多個(gè)PEG化類型出現(xiàn)。用Q5C蛋白質(zhì)進(jìn)行起始滴定實(shí)驗(yàn)。室溫下在100mM Tris，pH8.5中在各種含量的過(guò)量5kDa馬來(lái)酰亞胺-PEG存在下用遞增濃度的TCEP[三(2-羧乙基)膦]-HCl溫育1μg等分試樣的純化Q5C。60分鐘后，終止反應(yīng)并立即以非還原性SDS-PAGE進(jìn)行分析。能產(chǎn)生大量單PEG化Q5C蛋白質(zhì)(以非還原性SDS-PAGE得到的分子量為大約28kDa)而不修飾野生型rIFN-α2的TCEP和PEG試劑的含量用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。滴定實(shí)驗(yàn)表明10倍摩爾過(guò)量的TCEP和20倍摩爾過(guò)量的5kDa馬來(lái)酰亞胺PEG產(chǎn)生大約60％單PEG化蛋白質(zhì)而檢測(cè)不到雙或三PEG化的蛋白質(zhì)或?qū)σ吧蛂IFN-α2的修飾。
這些條件也用于對(duì)幾個(gè)其它的rIFN-α2突變體進(jìn)行PEG化。室溫下用10倍摩爾過(guò)量的TCEP和20倍摩爾過(guò)量的5kDa馬來(lái)酰亞胺PEG在pH8.5溫育1μg等分試樣的純化野生型和rIFN-α2突變體(Q5C，T106C，E107C，S163C)1小時(shí)。根據(jù)對(duì)反應(yīng)混合物的SDS-PAGE分析4種突變體發(fā)生不同程度的單PEG化(估計(jì)30-60％)。野生型rIFN-α2表現(xiàn)為在這些條件下檢測(cè)不到PEG化。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明Q5C，T106C，E107C和S163C半胱氨酸突變蛋白需要用TCEP還原以進(jìn)行PEG化。這些數(shù)據(jù)表明PEG部分附著到已導(dǎo)入Q5C，T106C，E107C和S163C蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基上。
B.PEG-Q5C IFN-α2和PEG-S163C的制備和純化PEG化大量的Q5C和S163C突變體以便可測(cè)量PEG化蛋白質(zhì)的生物活性。對(duì)于Q5C蛋白質(zhì)，將用于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)的PEG化條件的規(guī)模上升到140μg蛋白質(zhì)以產(chǎn)生足夠的物質(zhì)用于純化和鑒定。在室溫下進(jìn)行大規(guī)模PEG化反應(yīng)1小時(shí)，用10倍的20mM MES，pH5.0稀釋，調(diào)節(jié)到pH3.0，然后迅速上樣到使用相似于rIFN-α2突變體起始純化的條件的S-SEPHAROSE柱上。PEG部分的存在降低了蛋白質(zhì)對(duì)樹(shù)脂的親和力，允許從非PEG化蛋白質(zhì)分離PEG化蛋白質(zhì)。S-SEPHAROSE柱的層析顯示出在大約190mMNaCl和230mM NaCl處洗脫的兩個(gè)主要蛋白質(zhì)峰。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE確定較早洗脫的主要峰(在大約190mM NaCl處洗脫)是單PEG化Q5C。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE確定的單PEG化Q5C的表觀分子量是大約28kDa。后來(lái)洗脫的主要峰(在大約230mM NaCl處洗脫)確定為未反應(yīng)的Q5C蛋白質(zhì)。合并含有主要PEG-Q5C的早期洗脫峰級(jí)分并用于生物活性測(cè)量。
使用基本上相同于PEG-Q5C的方案以90μg的規(guī)模PEG化S163C半胱氨酸突變蛋白并純化。
C.PEG-Q5C和PEG-S163C半胱氨酸突變蛋白的生物活性以實(shí)施例20所述的Daudi細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)量純化的PEG-Q5C蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。使用Bradford染料結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。PEG-Q5C蛋白質(zhì)與野生型rIFN-α2和未修飾的Q5C蛋白質(zhì)顯示出相似的劑量-反應(yīng)曲線且在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)達(dá)到相同的最大生長(zhǎng)抑制水平。PEG-Q5C突變體的平均IC50值為大約22pg/ml，在同一天分析的野生型IFN-α2和未修飾的Q5C蛋白質(zhì)所測(cè)定的IC50值的2倍以內(nèi)(表5)。PEG-Q5C蛋白質(zhì)的生物活性明顯大于用非特異性氨反應(yīng)性PEG試劑進(jìn)行了PEG化的rIFN-α2。后一蛋白質(zhì)在Daudi細(xì)胞試驗(yàn)中具有164pg/ml的IC50值(Monkarsh等，1997)。這些數(shù)據(jù)在表5中概括。
也對(duì)PEG-S163C蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物活性實(shí)驗(yàn)。PEG-S163C蛋白質(zhì)也具有生物學(xué)活性且在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)以與野生型rIFN-α2相同的程度抑制Daudi細(xì)胞增殖。PEG-S163C蛋白質(zhì)的平均IC50值為大約42pg/ml，比氨-PEG化的IFN-α更好。
表5.PEG-Q5C IFN-α的生物活性
1數(shù)據(jù)來(lái)自3個(gè)實(shí)驗(yàn)。
2由Bolder生物技術(shù)公司制備的rIFN-α2。
3數(shù)據(jù)來(lái)自Monkarsh等，(1997)。
實(shí)施例23在垂體摘除(HYPOX)的大鼠中試驗(yàn)PEG化GH半胱氨酸突變蛋白的體內(nèi)效力。這是一種充分鑒定的GH缺陷型模型(Cox等，1994；Clark等，1996)。在HYPOX大鼠中GH刺激體重增長(zhǎng)和骨骼及軟骨的生長(zhǎng)(Cox等，1994；Clark等，1996)。垂體摘除的Sprague-Dawley大鼠可從諸如CharlesRiver(Wilmington，MA)等商家購(gòu)買。一般來(lái)說(shuō)，大鼠在40-50天齡期間和體重大約120g時(shí)進(jìn)行垂體摘除。各8只大鼠的組以特定的間隔接受rhGH，PEG-Cys-GH或安慰劑(載體溶液)的皮下注射并在10天期間每天測(cè)量體重增長(zhǎng)。大鼠每天應(yīng)在同一時(shí)間稱重以消除與喂食相關(guān)的可能變化。除了總體重增長(zhǎng)外，可測(cè)量骨骼生長(zhǎng)(脛骨骺寬度)。處死大鼠時(shí)，取出靠近脛骨骺的左右側(cè)并固定在福爾馬林中。可在羽狀三輻骨針(saggital)平面近端斷裂固定的脛骨，用硝酸銀染色且暴露于強(qiáng)光中(Greenspan等，1949)。可使用裝配有目鏡測(cè)微尺的立體顯微鏡測(cè)量軟骨骺板的寬度。對(duì)每個(gè)骺應(yīng)進(jìn)行10次測(cè)量并計(jì)算左右脛骨組合值的平均值+/-SEM。使用用于單項(xiàng)比較的student T檢驗(yàn)和用于多項(xiàng)比較的方差單向分析進(jìn)行各組間的比較。P＜0.05可認(rèn)為顯著。
經(jīng)過(guò)每天，每隔一天，每隔3天，每隔4天給大鼠施用蛋白質(zhì)或在單次注射后測(cè)試用10kDa或20kDa PEG修飾的GH半胱氨酸突變蛋白的效力。經(jīng)過(guò)皮下注射每天兩次施用5μg非PEG化hGH(10μg BID)在HYPOX大鼠模型中產(chǎn)生強(qiáng)烈的生長(zhǎng)應(yīng)答(Cox等，1994；Clark等，1996)。在起始實(shí)驗(yàn)中，不同組的大鼠接受0.08，0.4，2，10或50μg PEG化Cys-GH蛋白質(zhì)/次注射/大鼠的皮下注射。對(duì)照大鼠僅接受載體溶液。其它的對(duì)照組用與PEG化Cys-GH蛋白質(zhì)相同的劑量方案接受非PEG化rhGH(10μg/BID)和10μg非PEG化hGH。給HYPOX大鼠施用PEG化GH半胱氨酸突變蛋白導(dǎo)致與載體處理組相比體重增長(zhǎng)和脛骨骺寬度加大。
也可在惡病質(zhì)嚙齒類模型中試驗(yàn)PEG化GH半胱氨酸突變蛋白的效力。可給大鼠施用地塞米松(DEX)以誘導(dǎo)體重下降。正常Sprague-Dawley大鼠組(220-225g)每天接受地塞米松的皮下注射(200μg/大鼠；大約1mg/kg)。該地塞米松量在8天期間應(yīng)誘導(dǎo)大約5-6g的體重下降。在不同實(shí)驗(yàn)中給大鼠施用載體或各種劑量的PEG化GH半胱氨酸突變蛋白一次，每天一次，每隔一天一次，每隔3天或每隔4天一次。不同組的大鼠接受0.08，0.4，2，10或50μg PEG化Cys-GH蛋白質(zhì)/次注射/大鼠的皮下注射。其它對(duì)照應(yīng)包括不接受DEX或注射的一組大鼠，接受DEX和非PEG化rhGH(10μg/BID)的一組大鼠和接受DEX和非PEG化rhGH(根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)每天，每隔一天，每隔3天或每隔4天接受10μg，即施用PEG化GH半胱氨酸突變蛋白的頻率)的一組大鼠。動(dòng)物應(yīng)每天稱重。每天監(jiān)測(cè)食物和水的消費(fèi)。處死時(shí)，稱重體內(nèi)器官。按對(duì)HYPOX大鼠試驗(yàn)所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用PEG化GH半胱氨酸突變蛋白處理的動(dòng)物比載體處理的動(dòng)物體重下降要小。
經(jīng)過(guò)證實(shí)與載體處理的動(dòng)物相比，蛋白質(zhì)刺激血細(xì)胞比容(hemocnt)和紅細(xì)胞生成的增加，可在正常大鼠中測(cè)量PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白的體內(nèi)效力。當(dāng)每天用藥時(shí)EPO刺激大鼠血細(xì)胞比容的顯著增加(Matsumoto等，1990；Vaziri等，1994；Baldwin等，1998)。Sprague-Dawley大鼠可從諸如Charles River(Wilmington，MA)等商家購(gòu)買。各5只大鼠的組以最多5天的特定間隔接受BV rEPO，PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白或安慰劑(載體溶液)的皮下注射。在第6天處死動(dòng)物，收集血樣用于血細(xì)胞比容并完成可由商業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)分析。收集造血組織(肝臟和脾臟)，稱重并在福爾馬林中固定用于組織病理學(xué)分析以尋找紅細(xì)胞生成增加的證據(jù)。從各種長(zhǎng)骨和胸骨中取出骨髓用于單位顆粒制備(unit particlepreparations)和組織病理學(xué)分析以尋找紅細(xì)胞生成增加的證據(jù)。使用用于單項(xiàng)比較的Student T檢驗(yàn)和用于多項(xiàng)比較的方差單向分析進(jìn)行各組間的比較。P＜0.05可認(rèn)為顯著。與注射載體的動(dòng)物相比，PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白在大鼠中刺激血細(xì)胞比容和紅細(xì)胞生成的增加。當(dāng)施用一次，每隔一天或每隔3天施用一次時(shí)可試驗(yàn)用10kDa或20kDa PEG修飾的PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白的效力。當(dāng)經(jīng)過(guò)皮下注射每天一次施用100IU/kg(～800ng/kg)的非PEG化EPO時(shí)導(dǎo)致血細(xì)胞比容顯著增加(Matsumoto等，1990；Vaziri等，1994；Baldwin等，1998)。在起始實(shí)驗(yàn)中，不同組的大鼠接受0.32，1.6，8，40或160ngPEG化EPO半胱氨酸突變蛋白的皮下注射。對(duì)照大鼠僅接受載體溶液。另一對(duì)照組使用與PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白相同的劑量方案接受非PEG化rEPO(160ng/SID)和160ng非PEG化rEPO。
也可在化療誘導(dǎo)的貧血模型中試驗(yàn)PEG化EPO突變體的效力。順式鉑氨誘導(dǎo)的貧血是一種充分鑒定的化療誘導(dǎo)型貧血的嚙齒類模型且與人類臨床設(shè)定(setting)直接相關(guān)。當(dāng)以100單位/kg的日劑量用藥時(shí)rEPO逆轉(zhuǎn)該模型中的貧血(Matsumoto等，1990；Vaziri等，1994；Baldwin等，1998)。在第0天以腹膜內(nèi)注射順式鉑氨(3.5mg/kg)處理Sprague-Dawley大鼠(～200g)以誘導(dǎo)貧血并隨機(jī)分成各處理組。當(dāng)一次(第1天)，每隔一天或每隔3天一次施用時(shí)可試驗(yàn)用10kDa或20kDa PEG修飾的PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白的效力。不同組的大鼠接受0.32，1.6，8，40或160ng/次注射的PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白的皮下注射。用待測(cè)化合物注射大鼠達(dá)到8天。一個(gè)大鼠對(duì)照組每天接受rEPO(100單位/kg)的皮下注射。另一對(duì)照組不接受起始順式鉑氨注射但使用與PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白相同的劑量方案接受鹽水注射。在第9天處死大鼠，獲得血液和組織樣品用于綜合CBC和組織病理學(xué)分析。與注射載體的對(duì)照組相比，PEG化EPO半胱氨酸突變蛋白刺激大鼠中血細(xì)胞比容和紅細(xì)胞生成的增加。
IFN-α的生物學(xué)活性具有相對(duì)物種特異性，限制了可研究的臨床前動(dòng)物模型的范圍?？捎糜跍y(cè)量PEG化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的體內(nèi)效力的一個(gè)模型是無(wú)胸腺裸鼠中人腫瘤異種移植物生長(zhǎng)的抑制。人IFN-α2對(duì)小鼠細(xì)胞沒(méi)有活性且裸鼠中人腫瘤異種移植生長(zhǎng)的抑制通過(guò)對(duì)人腫瘤細(xì)胞的直接抗增殖效應(yīng)產(chǎn)生。IFN-α2在無(wú)胸腺小鼠中抑制各種原發(fā)性人腫瘤異種移植物和人腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)(Balkwill等，1985；Balkwill，1986；Johns等，1992；Lindner和Borden，1997)。研究的終點(diǎn)是在處理的小鼠中的腫瘤體積。我們預(yù)期發(fā)現(xiàn)相對(duì)于載體處理的動(dòng)物，施用PEG化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白抑制小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)(如腫瘤體積所指示)。無(wú)胸腺裸鼠可從諸如Charles River等商家買到。各小鼠在第0天用2×106個(gè)NIH-OVCAR-3或MCF-7腫瘤細(xì)胞(該細(xì)胞系可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得)注射并隨機(jī)分成由各10只小鼠組成的試驗(yàn)組。腫瘤細(xì)胞注射進(jìn)最靠近腋的乳腺表層的真皮中。不同試驗(yàn)組以特定的間隔每天(SID)，每隔一天(EOD)或每隔3天(ETD)接受各種劑量的野生型rIFN-α2，10kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白，20kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白或安慰劑(載體溶液)的皮下注射。按Linder和Borden(1997)所述通過(guò)用卡鉗測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)度和寬度以4天的間隔測(cè)定腫瘤體積。處死時(shí)，切下腫瘤并稱重。對(duì)各取樣點(diǎn)計(jì)算各試驗(yàn)組的平均腫瘤體積+/-SEM。使用用于單項(xiàng)比較的Student T檢驗(yàn)和用于多項(xiàng)比較的方差單向分析進(jìn)行各組間的比較。每天一次皮下注射5μg的非PEG化IFN-α2時(shí)，6周后在無(wú)胸腺小鼠中抑制NIH-OVCAR-3細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)80％(Linder和Borden，1997)。這些試驗(yàn)可使用任一細(xì)胞系。NIH-OVCAR-3細(xì)胞系(可從ATCC獲得)的生長(zhǎng)不需要雌激素，和MCF-7細(xì)胞一樣。用MCF-7細(xì)胞進(jìn)行的異種移植實(shí)驗(yàn)需要對(duì)小鼠摘除卵巢并用雌激素片移植(Linder和Borden，1997)。在起始實(shí)驗(yàn)中，不同組的小鼠使用每天，每隔一天或每隔3天的劑量方案接受每次注射1或5μg的rIFN-α2，10kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白或20kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的皮下注射。在腫瘤細(xì)胞注射進(jìn)小鼠后的第2天開(kāi)始用藥。對(duì)照小鼠僅接受載體溶液。在每隔一天和每隔3天用藥的實(shí)驗(yàn)中，另一陽(yáng)性對(duì)照組每天接受5μg未修飾的rIFN-α2的皮下注射。
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盡管已詳細(xì)描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但很明顯本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行修改和適應(yīng)。然而應(yīng)特別理解的是，這些修改和適應(yīng)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.獲得具有游離半胱氨酸的可溶性蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟(a)獲得能表達(dá)該可溶性蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；(b)將該宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸；和(c)從宿主細(xì)胞分離可溶性蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在半胱氨酸封閉劑存在下破裂宿主細(xì)胞并從破碎的宿主細(xì)胞可溶性部分分離該蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在宿主細(xì)胞合成可溶性蛋白質(zhì)之前，期間或之后將宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸且其中可溶性蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞分泌。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，酵母，昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
7.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述的可溶性蛋白質(zhì)是重組蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的重組蛋白質(zhì)是生長(zhǎng)激素超基因家族成員，其衍生物或拮抗劑的半胱氨酸突變體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的成員是生長(zhǎng)激素。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的成員是促紅細(xì)胞生成素。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述的干擾素是α干擾素(IFN-α)。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述的α干擾素是干擾素α2(IFN-α2)。
13.權(quán)利要求7的方法，其中所述的重組蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員，血小板衍生的生長(zhǎng)因子-A，血小板衍生的生長(zhǎng)因子-B，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，或其衍生物或拮抗劑的半胱氨酸突變蛋白。
14.權(quán)利要求7的方法，其中所述的重組蛋白質(zhì)是免疫球蛋白重鏈或輕鏈或其衍生物的半胱氨酸突變體。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述的半胱氨酸封閉劑是巰基反應(yīng)性化合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的巰基反應(yīng)性化合物是半胱氨酸，胱胺，二巰基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，碘，過(guò)氧化氫，二氫抗壞血酸，連四硫酸鹽，鄰-亞碘酰基苯甲酸鹽或在金屬離子存在下的氧。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述的巰基反應(yīng)性化合物是半胱氨酸。
18.權(quán)利要求1-3的方法，進(jìn)一步包括將半胱氨酸反應(yīng)性部分附著到所述的分離蛋白上以形成半胱氨酸修飾的蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求1-3的方法，進(jìn)一步包括將聚乙二醇附著到所述的分離蛋白上形成PEG化蛋白質(zhì)。
20.PEG化人生長(zhǎng)激素(hGH)或其衍生物，它具有不超過(guò)大約110ng/ml的EC50。
21.權(quán)利要求20的PEG化hGH，其中PEG部分附著到所述hGH的C-D環(huán)或靠近螺旋A的區(qū)域。
22.PEG化促紅細(xì)胞生成素(EPO)或其衍生物，它具有不超過(guò)大約1000ng/ml的EC50。
23.權(quán)利要求22的PEG化EPO，其中PEG部分附著到EPO的C-D環(huán)或A-B環(huán)上。
24.PEG化α干擾素(IFN-α2)或其衍生物，它具有不超過(guò)大約100pg/ml的EC50。
25.權(quán)利要求24的PEG化IFN-α2，其中PEG部分附著到IFN-α2的靠近螺旋A的區(qū)域或C-D環(huán)上。
26.一種多聚體蛋白質(zhì)，包括具有游離半胱氨酸的至少兩個(gè)蛋白質(zhì)且其中所述的蛋白質(zhì)通過(guò)所述的游離半胱氨酸附著。
27.一種治療可用生長(zhǎng)激素，EPO或α干擾素治療的癥狀的方法，包括給需要該治療的病人施用有效量的生長(zhǎng)激素，EPO或α干擾素的半胱氨酸變異體或其衍生物以治療所述的癥狀。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的衍生物是生長(zhǎng)激素，EPO或α干擾素的PEG化半胱氨酸變異體。
29.共價(jià)修飾根據(jù)權(quán)利要求1-3產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟(a)純化該可溶性蛋白質(zhì)；(b)用二硫鍵還原劑還原該蛋白質(zhì)；和(c)將該蛋白質(zhì)與半胱氨酸反應(yīng)性部分接觸以獲得半胱氨酸修飾的蛋白質(zhì)。
30.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括從未修飾的蛋白質(zhì)分離半胱氨酸修飾的蛋白質(zhì)。
31.權(quán)利要求29的方法，其中半胱氨酸反應(yīng)性部分是聚乙二醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備含游離半胱氨酸的可溶性蛋白質(zhì)的新方法,其中將宿主細(xì)胞與半胱氨酸封閉劑接觸。然后可修飾以該方法生產(chǎn)的可溶性蛋白質(zhì)以增強(qiáng)其效力。所述修飾包括附著PEG部分以形成PEG化蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1355842SQ00808841
公開(kāi)日2002年6月26日 申請(qǐng)日期2000年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月14日
發(fā)明者喬治·N·考克斯, 丹尼爾·H·多爾蒂, 瑪麗·S·羅森達(dá)爾 申請(qǐng)人:博爾德生物技術(shù)公司