專利名稱：新型生物活性糖蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備和技術(shù)生物化學(xué)并涉及生物活性化學(xué)組合物的獲取。本發(fā)明能用于細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)。
在先技術(shù)水平糖蛋白為共軛蛋白，含有蛋白部分和有機(jī)或無機(jī)的非蛋白組分，其能共價(jià)、極性或配價(jià)地與多肽鏈和存在于水解產(chǎn)物中的氨基酸相連。糖蛋白的非朊基部分以中性糖(半乳糖、甘露糖和海藻糖)或氨基糖(N-乙酰葡糖胺或酸性單糖衍生物)為代表(H.-D.Jacubke，X.Ashkite《Amino acids，peptides，proteins》Moscow，Mir 1985，p.345)。
糖蛋白廣泛分布于自然界中。血清的主要成分(免疫球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等)、血液的基團(tuán)物質(zhì)、不同病毒(感冒病毒和麻疹病毒等)抗原、某些激素、凝集素和酶等都屬于糖蛋白。
凝集素代表了一大組別的糖蛋白。它們分子的蛋白部分其特征是缺少絲氨酸和蘇氨酸，而絲氨酸和蘇氨酸負(fù)責(zé)將凝集素分子中的碳水化合物組分與多肽鏈相連。凝集素中碳水化合物的平均含量約為5％。碳水化合物的組成基本限定于半乳糖、甘露糖、海藻糖和N-乙酰葡糖胺(H.-D.Jacubke，X.Ashkite《Amino acids，peptides，proteins》Moscow，Mir 1985，p.428-429)。現(xiàn)有方法描述從GB 2078229，1982中得知具有免疫抑制能力的糖蛋白。提取糖蛋白方法是將采自人類或溫血?jiǎng)游锏难寤蚋顾入娋劢?，接著用等電點(diǎn)(pI)在pH2.6-3.6間分級(jí)選擇。該糖蛋白用于經(jīng)受移植的病人以抑制異物反應(yīng)。
專利GB 2095260，1982公開了一種生物活性物質(zhì)——分子量為3000-5000的糖蛋白。其具有在同源和異源細(xì)胞中抑制弓形蟲繁殖的能力。
從專利GB 2117385，1982中得知具有抗癌活性的糖蛋白。該糖蛋白的分子量為7000-90000；糖含量為8-45％，包括6-28％的己糖、1-11％的己糖胺和1-6％的唾液酸。其在pH2.0、7.0或11.0的水溶液中4℃穩(wěn)定24小時(shí)或更多，在pH7.0的水溶液中60℃穩(wěn)定3小時(shí)或更多。該糖蛋白選擇性地影響癌細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞。
從專利CH 634334，1983中得知免疫糖蛋白。其含有蛋白部分89±4％，碳水化合物部分11.1±2.2％，己糖5.3±1.1％，己糖胺的N-乙酰殘基2.8±0.5％，神經(jīng)氨糖酸的N-乙酰殘基2.9±0.5％。該糖蛋白分子量為32000±6000；pI為4.3±0.3；沉降系數(shù)S20n為3.2±0.3。
從專利RU 2136695，1999中得知分子量為12.5千道爾頓(kDa)的血清糖蛋白。其在低劑量時(shí)具有生物活性并含有大約50％的碳水化合物。等電點(diǎn)位于pH4.6-4.7間。
從專利EP 000134，1978中得知新糖蛋白。其含有α-氨基酸75±6％，碳水化合物部分24.6±5.2％，己聚糖2.9±2％，己糖胺的N-乙酰殘基7.1±1.5％，海藻糖0.2±0.2％和神經(jīng)氨糖酸的N-乙酰殘基8.4±1.5％。該糖蛋白的分子量為65000±10000，pI為3.4±0.4。
從FVO和Ceneva P.falciparum中提取并研究了分子量為56kDa的同源糖蛋白。其等電點(diǎn)為pH5.5。該糖蛋白的碳水化合物部分含有N-乙酰半乳糖胺和甘露糖(專利US 4835259，分類號(hào)為C07K15/15，1989)。
與該發(fā)明最近的糖蛋白分子量為5-300kDa，等電點(diǎn)位于pH2.5-5.0間，蛋白和碳水化合物部分的重量比為50∶50-80∶20，碳水化合物部分含有海藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡糖胺，蛋白部分含有天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸(US 4683438，分類號(hào)為C07K15/14，1987)。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明涉及在超低劑量下具有生物活性的糖蛋白，其能用于醫(yī)藥工業(yè)中。
另一方面，本發(fā)明涉及在超低劑量下具有生物活性糖蛋白的提取方法和其作為醫(yī)藥制劑的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)就是獲取在超低劑量下具有生物活性的糖蛋白(10-12-10-29mol/L和更低)。
這種具體的技術(shù)結(jié)果由新糖蛋白獲得，這些新糖蛋白利用等電聚焦從胞間隙、血清、膽汁和采自不同脊椎動(dòng)物(人和動(dòng)物)器官的組織中抽提出來。它們?nèi)芙庥诹蛩徜@的飽和(100％)溶液中；表觀分子量為10-45kDa，并在超低劑量下具有生物活性。濃度為10-12-10-18mol/L的糖蛋白溶液經(jīng)過多次凍融甚至100℃加熱10分鐘仍能完全保存生物活性。
糖蛋白的分子量依據(jù)Lemly方法(參見應(yīng)用技術(shù))采用聚丙烯酰胺(PAAG)和十二烷基硫酸鈉(SDS)電泳法已經(jīng)估測(cè)。LKB公司制備的一套蛋白作為分子量標(biāo)記使用。它包括6種蛋白分子量從94kDa到14.4kDa。采自血清pI位于pH4.65-5.1的糖蛋白(SG)表觀分子量依據(jù)PAAG電泳為35-37kDa，而依據(jù)凝膠色譜數(shù)據(jù)則為25-27kDa。采自肝臟的中性糖蛋白(NGL)(pI為pH6.8-7.2間)的表觀分子量相應(yīng)為15kDa和22kDa。就采自肝臟的酸性糖蛋白(AGL)而言，其表觀分子量為17kDa，只能通過凝膠過濾法測(cè)定(由于酸性糖蛋白部分不能染色，分子量不可能采用PAAG電泳法測(cè)定)。
對(duì)于聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用垂直電泳裝置ABGE-1(Himifil，USSR)。依據(jù)Lemly方法，變性條件使用洗滌劑SDS。膠厚度為0.75mm，大小為115×115mm，最多條帶數(shù)13。
分離膠(12.5％)的制備采用下列組分蒸餾水(6.7ml)、1.5MpH8.8的Tris-HCl(5.0ml)、10％SDS溶液(0.2ml)、30％丙烯酰胺/N，N′-雙亞甲基丙烯酰胺(8.0ml)、TEMED(10μl)、10％過硫酸銨(100μl)。
濃縮膠(4％)的制備采用下列組分蒸餾水(6.1ml)、0.5MpH6.8的Tris-HCl(2.5ml)、10％SDS溶液(0.1ml)、30％丙烯酰胺/N，N′-雙亞甲基丙烯酰胺(1.3ml)、TEMED(10μl)、10％過硫酸銨(50μl)。
電極緩沖液pH8.3 Tris-甘氨酸和0.1％SDS。冷干樣品溶解(約0.1mg/ml)在下列溶液中蒸餾水(4.0ml)、0.5M pH6.8 Tris-HCl(1.0ml)、甘油(0.8ml)、10％SDS溶液(1.6ml)、2-巰基乙醇(0.4ml)、0.05％溴酚蘭溶液(0.2ml)。然后在加到凝膠之前，樣品于100℃溫育3-5分鐘。10-15μl的樣品加到每一道膠的進(jìn)樣孔上。200V恒壓進(jìn)行電泳。當(dāng)通過濃縮膠后，電壓使用100V。
LKB公司制備的一套蛋白作為分子量標(biāo)記使用。它包括磷酸化酶b(94kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、雞蛋白蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、大豆胰蛋白酶抑制劑(20kDa)和雞融菌酶(14.4kDa)。
凝膠采用膠體銀或Kumassy染料G-250染色。對(duì)膠體銀染色的凝膠先用蒸餾水洗滌，然后浸泡在5％乙醇和5％乙酸的水溶液中不少于3小時(shí)。凝膠用蒸餾水很快洗滌(5分鐘)并放置在10％的戊二醛溶液中。未反應(yīng)的戊二醛經(jīng)3-5次漂洗后(每次30分鐘)去除。然后將凝膠放在二硫蘇糖醇溶液(5mg/L)中溫育30分鐘，并用水充分漂洗。將洗滌過的凝膠放置于AgNO3溶液(0.1g/l)中30分鐘，然后再次用水充分漂洗，并放置于顯色劑中直到出現(xiàn)清晰的條帶。顯色劑為3％Na2SO3水溶液中37％的福爾馬林溶液(50-100μl福爾馬林/100ml溶液)。加入3-5ml檸檬酸中斷顯色。
當(dāng)采用Kumassy染料G-250染色時(shí)，凝膠用下列混合物固定三氯乙酸/甲醇/水(10∶40∶50)。用3.5％高氯酸中的0.04％Kumassy染料G-250溶液進(jìn)行染色。
通常，5分鐘內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色蛋白帶。為減少背景染色，凝膠可放置于乙酸/甲醇/水(10∶40∶50)的溶液中1-3小時(shí)。
糖蛋白分子量采用凝膠-滲透HPLC法在柱TSK G3000SW(300×7.5mm)上測(cè)定。洗脫在pH7用100mM NaH2PO4進(jìn)行。使用下列蛋白用于校準(zhǔn)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(78kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、雞蛋白蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、大豆胰蛋白酶抑制劑(20kDa)、肌紅蛋白(17.2kDa)和雞融菌酶(14.3kDa)。這些制品由Serva公司(德國)和Sigma公司(美國)制造。本發(fā)明還測(cè)定了糖蛋白的氨基酸組成和碳水化合物組成以及糖基化存在。氨基酸組成定義氨基酸組成的定義用氨基酸分析儀Hitachi 835在A.Beloserskiy物理化學(xué)生物研究所(Institute of Physical-Chemical Biology)進(jìn)行。分離在色譜柱用2613標(biāo)記的硫代聚苯乙烯陽離子進(jìn)行。檢測(cè)采用分光光度法在水合茚三酮衍生物中進(jìn)行(波長(zhǎng)570和440nm)。在分析前，用12N HCl/濃縮三氟乙酸(2∶1)加入0.005％的巰基乙醇155℃水解1小時(shí)。碳水化合物組成定義碳水化合物組成的定義用碳水化合物分析儀Biotronic LC 2000(德國)在有吸附劑Durrum DAX 8-11(美國)的柱上70℃采用pH8.0 0.4M硼酸緩沖液進(jìn)行。柱大小為3.7×75mm。檢測(cè)采用銅2，2′-bicinchonine溶液在570nm處進(jìn)行。在定義前，1ml被測(cè)試物質(zhì)(0.1mg/ml)在10ml的2M三氟乙酸100℃水解3小時(shí)。糖基化存在定義為定義糖基化存在，將5μl的0.1M pH4.6乙酸緩沖液加入到50μl的蛋白水溶液(0.1mg/ml)，然后加入相同緩沖液中的高碘酸鈉溶液(5-10μl)，使得反應(yīng)混合物中的高碘酸鹽濃度為1-2mM。溶液放置室溫30分鐘。未反應(yīng)的高碘酸鹽在顏色消失前用0.5M的硫代硫酸鈉水溶液中和。然后加入二甲亞砜(DMSO)中的二硝基苯肼(DNPH)溶液直到反應(yīng)混合物中的DNPH濃度變?yōu)?.5-5mM。然后將溶液放置室溫30分鐘。
此外，所得的Shiff堿采用DMSO中的硼烷鈉溶液(0.1mg/ml)還原。
產(chǎn)物分析采用凝膠-滲透色譜方法在TSK 2000 PW(5.6×300mm)柱上依靠高效液相色譜的幫助進(jìn)行。洗脫液為pH4.5的50mM醋酸緩沖液；速率為0.5ml/分鐘；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為365nm。估測(cè)下列特征DNPH、完整糖蛋白(280nm吸收)和修飾DNPH糖蛋白的保留時(shí)間(假如365nm處存在吸收峰，大約等于未修飾糖蛋白的保留時(shí)間)。
下列糖蛋白作為模型糖蛋白使用雞蛋白蛋白、卵類粘蛋白、S-羧基甲基化粘液素、來自蛋黃的視紫質(zhì)結(jié)合糖蛋白。本發(fā)明的糖蛋白糖基化定義對(duì)已知結(jié)構(gòu)的模型糖蛋白測(cè)試后，該方法應(yīng)用到提取的蛋白。結(jié)果證實(shí)所有這些物質(zhì)都是糖蛋白。所研究的糖蛋白峰可見在色譜圖上，并且還可見到未反應(yīng)的DNPH峰。修飾糖蛋白出現(xiàn)的時(shí)間與天然糖蛋白稍有區(qū)別，但仍能預(yù)料到。
例如，對(duì)SG的純化樣品碳水化合物組成分析顯示該蛋白是強(qiáng)烈糖基化的。其重量含有40-55％的碳水化合物。從碳水化合物中測(cè)定出N-乙酰葡糖胺和甘露糖比率為2∶5。糖蛋白合成的生物途徑允許假設(shè)SG主要含有N-結(jié)合的富含甘露糖的寡糖鏈。
本發(fā)明的其它方面是所述糖蛋白在制備各種藥物組合物中的應(yīng)用(滴劑、軟膏、醫(yī)藥乳劑和凝膠等)。
本發(fā)明的藥物組合物含有有效量的糖蛋白，在超低劑量下具有生物活性并作為本發(fā)明的一個(gè)方面，以及含有可藥用載體(實(shí)施例15-17)。
可藥用載體能是有機(jī)載體、聚合體載體(碳水化合物和纖維素)以及無機(jī)載體。選擇載體首先由藥物組合物應(yīng)用方法(處方)所決定。
實(shí)施例15描述了藥物組合物，其在上皮組織和連接組織中是修復(fù)過程的生物調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的糖蛋白從下列組織中提取肝臟、肺、胸腺、脾、心臟、腎臟、胰腺、乳腺、甲狀腺、腸、睪丸、卵巢、腦、骨髓、眼組織和來自血清和膽汁。
本發(fā)明具體的糖蛋白提取方法包括下列步驟a)從各種人和動(dòng)物器官中獲取抽提物；b)從組織抽提物中將蛋白鹽析出來；
c)采用等電聚焦方法抽提(分離和純化)糖蛋白自身；d)收集級(jí)分并進(jìn)行糖蛋白鑒定，確定生物活性和生物效果。
我們所鑒定的糖蛋白按條件劃分成三組酸性蛋白向陽極遷移；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI位于pH4.6-8.5間(微酸性、中性和微堿性)；堿性蛋白向陰極遷移。
等電聚焦的方法是生物聚合物抽提和純化(分離)傳統(tǒng)方法之一。本發(fā)明的糖蛋白屬于生物聚合物。該方法用于物理和分析化學(xué)。即外部電場(chǎng)創(chuàng)造了一個(gè)穩(wěn)定的pH梯度，并且pH值從陽極到陰極增加。在該系統(tǒng)中，每個(gè)蛋白的方向移動(dòng)依據(jù)其陽性或陰性電荷直到該蛋白到達(dá)與其等電點(diǎn)(pI)相一致的pH值區(qū)域。在該區(qū)域由于電荷為0此蛋白在電場(chǎng)下終止進(jìn)一步移動(dòng)。
所使用的電場(chǎng)支持穩(wěn)定的pH梯度，防止區(qū)帶擴(kuò)散。為了創(chuàng)造一個(gè)穩(wěn)定的梯度pH，使用稱為安福靈(ampholine)的特殊物質(zhì)。在蔗糖梯度下采用LKB-440柱(LKB，瑞典)和pH范圍3.5-10.0的安福靈(Serva，瑞典)4℃等電聚焦100小時(shí)，電壓為500-1500V。上清液以溶液形式進(jìn)入重梯度溶液中的量不超過100mg總蛋白。級(jí)分檢測(cè)在280nm處用分光光度計(jì)進(jìn)行。等電聚焦后在纖維素膜制成的透析袋中對(duì)蒸餾水透析級(jí)分。收集下列級(jí)分1.向正極遷移的酸性糖蛋白；2.pI位于pH4.6-8.5間的糖蛋白(微酸性、中性和微堿性)；3.向負(fù)極遷移的堿性糖蛋白。
三個(gè)特定組別的糖蛋白從下列器官的組織中抽提出來肝臟、肺、胸腺、脾、心臟、腎臟、胰腺、乳腺、甲狀腺、腸、睪丸、卵巢、腦、骨髓、晶狀體、角膜、眼色素上皮、視網(wǎng)膜，以及還來自血清和膽汁。
所有經(jīng)鑒定的糖蛋白在超低劑量濃度為10-12到10-29mol/L和更低時(shí)展示了生物活性。
生物效果(Ea)用于定義本發(fā)明抽提的糖蛋白。其計(jì)算例如按下列公式Ea＝200％-Nt/Nc×100％這里Ea表示由糖蛋白導(dǎo)致的生物效果，Nt和Nc表示相應(yīng)從1mg測(cè)試組織(帶有糖蛋白的組織培養(yǎng)物)和對(duì)照組織(沒有糖蛋白的組織培養(yǎng)物)中釋放出來的細(xì)胞核數(shù)量。
細(xì)胞核的計(jì)算在限定的Goryaev室體積中進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理采用斯氏標(biāo)準(zhǔn)的方差統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行。組織培養(yǎng)物制備程序含有下列步驟動(dòng)物(小鼠雜種CBA/C57BI，雄性，16-18g)斬首后，將肝室溫下放置在199培養(yǎng)基中。大小1-1.5mm2的組織片段從大肝葉的中央部分切除，但大肝葉的邊緣和帶有大血管的區(qū)域不取出。
將培養(yǎng)物放置到青霉素瓶中，每個(gè)瓶5個(gè)組織培養(yǎng)物，其營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基組成如下1ml 199培養(yǎng)基+0.2ml牛血清或馬血清+0.1ml所研究的某濃度的糖蛋白溶液。在對(duì)照瓶中加入0.1ml Ringer溶液代替糖蛋白溶液。所有瓶在37℃溫育2小時(shí)。為了估測(cè)描述肝細(xì)胞細(xì)胞膜的黏彈性特征參數(shù)，每個(gè)組織片段用過濾紙干燥，然后放在特殊的玻璃勻漿器內(nèi)，其間隙為50微米，完成后加入0.1ml用Ringer溶液制備的0.1％臺(tái)盼蘭溶液，最后分散溶液，旋轉(zhuǎn)勻漿器(研杵)25-30次。計(jì)算分散液中所產(chǎn)生的單個(gè)細(xì)胞核量。糖蛋白的生物效果由上述公式計(jì)算。
三個(gè)特定組別的糖蛋白影響肝細(xì)胞細(xì)胞膜的黏彈性特征，這些糖蛋白從下列器官的組織抽提出來肝臟、肺、胸腺、脾、心臟、腎臟、胰腺、乳腺、甲狀腺、腸、睪丸、卵巢、腦、骨髓、晶狀體、角膜、眼色素上皮、視網(wǎng)膜，以及還來自血清和膽汁。
經(jīng)鑒定的糖蛋白Ea值當(dāng)濃度10-12到10-29mol/L和更低時(shí)為125-150％(

圖1，2)。
發(fā)明實(shí)施方案詳述本發(fā)明的糖蛋白在超低劑量下展示了生物活性，采用上述步驟從胞間隙、血清、膽汁以及取自不同器官的組織中抽提出來肝臟、肺、胸腺、脾、心臟、腎臟、胰腺、乳腺、甲狀腺、腸、睪丸、卵巢、腦、骨髓、晶狀體、角膜、眼色素上皮、視網(wǎng)膜。
下列實(shí)施例說明但決不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1來自哺乳動(dòng)物肝臟的糖蛋白1.1獲取肝抽提物試驗(yàn)采用Wistar系大鼠進(jìn)行，雄性和雌性，體重150-180g。將動(dòng)物斬首。在30-40秒內(nèi)將每個(gè)動(dòng)物的肝臟通過門經(jīng)脈洗去血。
這采用灌輸溶液流進(jìn)行(0.15mol/L NaCl；0.04mol/L KCl；0.001mol/L CaCl2)，流速為5-7ml/分鐘。肝臟切成重量為1.5-2.0g的片段并置于帶有上述組成的溶液中4℃2小時(shí)(每個(gè)肝15-20ml溶液)。
收集獲得的抽提物。該組織用新鮮生理溶液溢流并抽提1小時(shí)以上。將獲得的抽提物組合在一起。為消除血細(xì)胞和損傷的肝細(xì)胞，組織抽提物5000g離心20分鐘，然后傾倒出用于進(jìn)一步純化。1.2從組織抽提物中鹽析出蛋白在獲得飽和鹽溶液前將干硫酸銨逐漸加入到組織抽提物中，劇烈攪拌(4℃，pH8.0-8.5)。將所形成的混合蛋白沉淀35000g離心30分鐘沉降出來。收集上清液并采用俄國國產(chǎn)纖維素膜(GOST 7730-89)對(duì)蒸餾水長(zhǎng)時(shí)間透析。透析過程中反復(fù)用新鮮蒸餾水替換。完全消除銨離子后，上清液采用冷凍干燥方法將體積濃縮到100ml，并在相同條件下重復(fù)鹽析程序。在銨離子完全消除前，將所獲得的二次上清液也相似地對(duì)水透析，然后采用等電聚焦方法分離。
組織抽提物上清液的等電聚焦按上述技術(shù)進(jìn)行。實(shí)施例2來自哺乳動(dòng)物胸腺的糖蛋白試驗(yàn)采用Wistar系大鼠進(jìn)行，雄性和雌性，體重150-180g。將動(dòng)物斬首。切出胸腺，在生理溶液(0.15mol/L NaCl；0.04mol/L KCl；0.001mol/L CaCl2)中充分漂洗，并在含有上述組成的溶液中4℃抽提2小時(shí)(每個(gè)胸腺3-4ml抽提溶液)。收集獲得的抽提物。胸腺用新鮮生理溶液溢流并抽提1小時(shí)以上。將獲得的抽提物組合在一起。為消除血細(xì)胞和損傷的胸腺細(xì)胞，組織抽提物5000g離心20分鐘，然后傾倒出用于進(jìn)一步純化。組織抽提物的鹽析和等電聚焦按上述技術(shù)進(jìn)行。等電聚焦后，采用如分離肝抽提物的相同方式，收集三種蛋白級(jí)分酸性、pI為pH4.6-8.5間和堿性糖蛋白。所有經(jīng)鑒定的胸腺糖蛋白在超低劑量濃度為10-12到10-29mol/L和更低時(shí)展示了生物活性。實(shí)施例3來自眼組織的糖蛋白從新鮮牛眼(30只)中抽提下列組織晶狀體、角膜、色素上皮、視網(wǎng)膜。在生理溶液(0.15mol/L NaCl；0.04mol/L KCl；0.001mol/LCaCl2)中充分漂洗，切成大塊并分開在含有上述組合物溶液中4℃抽提2小時(shí)。獲得的抽提物3000g離心15分鐘，然后傾倒出用于進(jìn)一步純化。組織抽提物的鹽析和等電聚焦按上述技術(shù)進(jìn)行。等電聚焦后，收集每個(gè)組織的三種蛋白級(jí)分晶狀體、角膜、色素上皮、視網(wǎng)膜中的酸性、pI為pH4.6-8.5間和堿性糖蛋白。
所有經(jīng)鑒定的眼組織糖蛋白在超低劑量濃度為10-12到10-29mol/L和更低時(shí)展示了生物活性。實(shí)施例4從牛血清中抽提pI為pH4.65-5.1間的糖蛋白在獲得飽和鹽溶液前將干硫酸銨逐漸加入到組織抽提物中(4℃，pH8.0-8.5)。將形成的沉淀過濾除去并將過濾液10000g離心15分鐘。然后去除蛋白沉淀。收集上清液并對(duì)蒸餾水長(zhǎng)時(shí)間透析直到銨離子完成消除。冷干并再次溶解于蒸餾水中使體積達(dá)到0.5L。將干硫酸銨攪拌加入到此溶液中直到飽和。將該混合液4℃放置4天，然后10000g離心15分鐘。在銨離子完全消除前，將上清液對(duì)水透析。然后冷干并再次溶解于50ml的蒸餾水中。依據(jù)上述技術(shù)采用等電聚焦方法進(jìn)行進(jìn)一步分離。
等電聚焦后，收集pH4.65-5.1間的級(jí)分，對(duì)蒸餾水透析并冷干。得到0.55mg樣品。所獲得的樣品是均一糖蛋白的細(xì)分粉末，稍染色成奶油顏色。糖蛋白含有40-55％的碳水化合物。D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺的摩爾比為5∶2到3∶2，糖蛋白濃度為10-12到10-29mol/L和更低時(shí)的生物活性(體外對(duì)肝細(xì)胞細(xì)胞膜和黏彈性特征的影響)與對(duì)照比較不低于125％。
相似地，糖蛋白從大鼠血清、狗血、馬血和人血中抽提出來。所有從血清中抽提的糖蛋白具有等電點(diǎn)在pH4.65-5.1間，表觀分子量按照聚丙烯酰胺凝膠SDS電泳為35-37kDa，按照凝膠色譜為25-27kDa。它們?cè)诔蛣┝繚舛葹?0-12到10-29mol/L和更低時(shí)都具有生物活性。商業(yè)應(yīng)用下列實(shí)施例(5-17)、附圖(1-29)和表(1-8)都說明了本發(fā)明討論的糖蛋白的生物活性和生物效果。實(shí)施例5糖蛋白對(duì)體外肝細(xì)胞細(xì)胞膜黏彈性特征的影響采用在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中多種器官培養(yǎng)重為1-1.5mg的肝組織部分進(jìn)行研究，在培養(yǎng)基中加入一定體積所研究的糖蛋白溶液。對(duì)每一個(gè)糖蛋白定義了濃度間隔，其中展示了生物活性。為此目的，對(duì)初始樣品(濃度為0.1mg蛋白/ml)用10倍、100倍和1000倍等系列連續(xù)稀釋到10-15mg蛋白/ml。在對(duì)照瓶中加入相同體積的Ringer溶液，代替所研究的樣品。在一個(gè)試驗(yàn)中所研究的所有移出物(explantats)都是取自一個(gè)動(dòng)物肝臟。每一單個(gè)試驗(yàn)中不少于5個(gè)組織部分被取出用于考慮每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(糖蛋白溶液的合適濃度)。不少于進(jìn)行3-4個(gè)試驗(yàn)以確定每個(gè)糖蛋白的生物活性。
生物效果的計(jì)算采用上述公式，并在圖1-2中說明。實(shí)施例6胸腺堿性糖蛋白對(duì)延遲型超敏性反應(yīng)的影響堿性胸腺糖蛋白(BTG)施用給四組小鼠，每組5只體重為20g的C57BL/6 spf小鼠。每只動(dòng)物從以2×108劑量的綿羊紅血球小鼠腹膜下免疫那一刻起，三日內(nèi)腹膜下三次導(dǎo)入劑量為2×10-6、2×10-12、2×10-16、2×10-18g的BTG。免疫5天后，1×108的綿羊紅血球以50μl皮下在后腿足施用給受體。又一天后，采用Kitamura方法與后側(cè)面四肢比較確定水腫強(qiáng)度，脾抗體形成細(xì)胞的數(shù)目采用Jerne方法確定。結(jié)果在表1中顯示。
表1胸腺堿性糖蛋白對(duì)小鼠C57BL/6系抗體形成和延遲型超敏性反應(yīng)的影響
結(jié)果代表算術(shù)平均值±平均誤差**與對(duì)照可靠的差異，P＜0.001*P＜0.05
從表中可看出脾臟中樣品對(duì)抗體形成細(xì)胞的形成不產(chǎn)生重大影響。同時(shí)每只動(dòng)物樣品導(dǎo)入2×10-12g的劑量導(dǎo)致了高度可靠的延遲型超敏性反應(yīng)的增強(qiáng)。
因此，我們顯示每只動(dòng)物施用2×10-12g劑量的BTG樣品刺激延遲型超敏性反應(yīng)的能力，由I型T淋巴輔助細(xì)胞的活性引起，負(fù)責(zé)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)展。
Jerne N.，Nordin A.(1963)瓊脂中單個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞的噬菌斑形成。Science，V.140，P.405。
Kitamura K.(1980)足墊重量分析評(píng)價(jià)小鼠中延遲型超敏性。J.Immunol.Meth.，V.39，P.277-283。實(shí)施例7胸腺堿性糖蛋白對(duì)胸腺瘤EL4小鼠存活的影響B(tài)TG已用來研究建立是否具有刺激抗腫瘤免疫的活性。為此目的，C57BL/6(KbIbDb)小鼠以1×103、1×104和1×105劑量接受一針來自相同系的小鼠胸腺瘤EL4細(xì)胞。自從免疫那天起，樣品在一周內(nèi)每天以2×10-6g、2×10-12g和2×10-16g的劑量導(dǎo)入給每只動(dòng)物(9個(gè)測(cè)試組和3個(gè)對(duì)照組，每組5-7只動(dòng)物)。與對(duì)照受體的合適組比較，依據(jù)各種腫瘤細(xì)胞劑量的受體的生命期望，評(píng)價(jià)樣品的效果。結(jié)果顯示在圖3-5中。圖3顯示與對(duì)照(點(diǎn)線)比較2×10-12g劑量樣品施用給每只動(dòng)物的保護(hù)作用(粗線)。在該測(cè)試組中，10分之一受體保持存活，而在對(duì)照組中，所有動(dòng)物都因以腹水形式腫瘤生長(zhǎng)導(dǎo)致死亡。圖4與對(duì)照(點(diǎn)線)比較2×10-6g劑量樣品施用給每只動(dòng)物顯示出低的保護(hù)作用(粗線)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞劑量為1×105時(shí)，似乎不可能看出樣品的效果(圖5)。提交的數(shù)據(jù)顯示每只小鼠施用劑量為2×10-12g的BTG導(dǎo)致了接受最低劑量腫瘤細(xì)胞(1×103)的測(cè)試動(dòng)物組生命期望統(tǒng)計(jì)學(xué)上可靠的增加。
盡管由BTG展示的生物效果不顯著是事實(shí)，但下列原因應(yīng)考慮胸腺瘤細(xì)胞復(fù)制的時(shí)間超過有抗腫瘤效應(yīng)子活性T淋巴細(xì)胞復(fù)制時(shí)間幾倍。除此以外，作為一條規(guī)則，只有當(dāng)插入的腫瘤用遺傳結(jié)構(gòu)修飾用于細(xì)胞因子生產(chǎn)時(shí)，腫瘤細(xì)胞刺激細(xì)胞免疫，或在用抑制細(xì)胞生長(zhǎng)相組合的治療下，觀察到完全拒絕插入的腫瘤細(xì)胞。
Sumimoto H.，Tani K.，Nakazaki Y.，Tanabe T.，Hibino H.，Wu M.S.，Izawa K.，Hamada H.，Asano S.(1998)白介素-12-傳導(dǎo)的鼠肺癌細(xì)胞比GM-CSF或B7-1(CD80)轉(zhuǎn)染子用于同源免疫活性小鼠中治療抗腫瘤免疫的優(yōu)越性。Cancer Gene Ther V.5，N1，P.29-37。
Ehrke M.J.，Verstovsek S.，Pocchiari S.K.，Krawczyk C.M.，UjhazyP.，Zaleskis G.，Maccubbin D.L.，Meer J.M.，Mihich E.(1998)小鼠中胸腺抗腫瘤效應(yīng)子由環(huán)磷酰胺和TNF-α療法治療淋巴瘤初始腫瘤接種后直到20個(gè)月的表型和功能特征。Iht.J.Cancer，V.76，N.4，P.579-586。實(shí)施例8胸腺酸性糖蛋白對(duì)延遲型超敏性反應(yīng)的影響酸性胸腺糖蛋白(ATG)施用給四組小鼠，每組5只體重為20g的C57BL/6 spf小鼠。每只動(dòng)物從以2×108劑量的綿羊紅血球小鼠腹膜下免疫那一刻起，三日內(nèi)腹膜下三次導(dǎo)入劑量為2×10-6、2×10-12、2×10-16、2×10-18g的ATG。免疫5天后，1×108的綿羊紅血球以50μl皮下在后腿足施用給受體。又一天后，采用Kitamura方法與后側(cè)面四肢比較確定水腫強(qiáng)度，脾抗體形成細(xì)胞的數(shù)目采用Jerne方法確定。結(jié)果在表2中顯示。
從表中可看出脾臟中樣品對(duì)抗體形成細(xì)胞的形成不產(chǎn)生重大影響。同時(shí)每只動(dòng)物樣品導(dǎo)入2×10-12g的劑量導(dǎo)致了高度可靠的抑制延遲型超敏性反應(yīng)。
因此，我們顯示每只動(dòng)物施用2×10-12g劑量的BTG樣品降低延遲型超敏性反應(yīng)的能力，表2胸腺酸性糖蛋白對(duì)小鼠C57BL/6系抗體形成和延遲型超敏性反應(yīng)的影響
結(jié)果代表算術(shù)平均值±平均誤差*與對(duì)照可靠的差異，P＜0.001實(shí)施例9來自哺乳動(dòng)物胸腺的糖蛋白在神經(jīng)纖維脫髓鞘下對(duì)興奮傳導(dǎo)的影響作為研究目的，已經(jīng)取出草蛙(Rana tamporaria)的髓鞘神經(jīng)。為進(jìn)行體內(nèi)神經(jīng)焦點(diǎn)脫髓鞘，使用了溶血卵磷脂(LL)，其在手術(shù)(腔內(nèi)注射)時(shí)導(dǎo)進(jìn)青蛙髓鞘坐骨神經(jīng)中。已知該行為啟動(dòng)了神經(jīng)脫髓鞘，其中的幾個(gè)階段對(duì)應(yīng)了自身免疫脫髓鞘。髓鞘質(zhì)條件在手術(shù)后一天首先觀察到變化，并在6-12天髓鞘質(zhì)完全“揭開了”神經(jīng)纖維的節(jié)間部分。在手術(shù)后3-4周觀察到新髓鞘質(zhì)形成。
堿性和酸性糖蛋白對(duì)脫髓鞘和脫髓鞘后再生的過程的影響，對(duì)其研究進(jìn)行兩個(gè)試驗(yàn)體外對(duì)分離神經(jīng)的研究以及體內(nèi)將LL導(dǎo)入動(dòng)物一周后的研究。LL和所研究的胸腺糖蛋白同時(shí)施用給動(dòng)物。當(dāng)進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，采用了下列測(cè)試1.LL和胸腺糖蛋白對(duì)神經(jīng)電生理學(xué)參數(shù)的影響的評(píng)價(jià)。
2.LL和胸腺糖蛋白組合作用的效果的測(cè)定。
對(duì)照動(dòng)物不暴露給LL和胸腺糖蛋白的影響，但在全部試驗(yàn)時(shí)間過程中都置于相同條件下。在體外試驗(yàn)中，使用了膜電位和動(dòng)作電位(AD)胞外記錄的標(biāo)準(zhǔn)方法。其幫助測(cè)定1.在LL作用、胸腺糖蛋白作用和它們的組合作用下AD波幅的動(dòng)力學(xué)變化，傳導(dǎo)的開始和AD傳導(dǎo)速率以及分離神經(jīng)節(jié)律回應(yīng)的最高頻率。
2.在LL和胸腺糖蛋白組合導(dǎo)入動(dòng)物后一周AD波幅的動(dòng)力學(xué)變化，傳導(dǎo)的開始和AD傳導(dǎo)速率以及分離神經(jīng)節(jié)律回應(yīng)的最高頻率。
來自胸腺的糖蛋白以濃度10-14mol/L、10-18mol/L和10-24mol/L進(jìn)行研究。
分離的神經(jīng)先放在下列組合物(mM)的生理溶液中至少30分鐘NaCl-111.2 KCl-1.88；CaCl2-1.08；pH-7.2；18-20℃。為制備生理溶液和糖蛋白溶液，所述特定組合物的生理溶液制備使用重蒸餾水。
為了評(píng)價(jià)細(xì)胞膜結(jié)合的鈣水平的變化，在本研究中，我們使用了熒光分光光度計(jì)法以及固定在質(zhì)膜Ca2+結(jié)合的探針-氯四環(huán)素，其能與鈣離子形成復(fù)合體。對(duì)神經(jīng)的試驗(yàn)在一個(gè)特別設(shè)計(jì)的室中進(jìn)行，能同時(shí)記錄神經(jīng)熒光和AD波幅的水平。在整個(gè)試驗(yàn)過程中來自相同神經(jīng)部分或分離纖維的發(fā)光都記載下來。神經(jīng)熒光依靠Lumam I-3(LOMO)發(fā)光顯微鏡的幫助記錄下來。氯四環(huán)素的熒光刺激由鹵燈KGM9×70以及過濾器PS-1-6和SZS21-2組合引起。使用光度計(jì)管口和干擾光過濾器在最大光傳播波長(zhǎng)490nm和550nm處進(jìn)行記錄。神經(jīng)部分光度計(jì)的直徑為50微米，物鏡倍數(shù)×10。
在LL作用和神經(jīng)脫髓鞘下，節(jié)律神經(jīng)性能(RN)的一些電生理參數(shù)發(fā)生了顯著變化，在本發(fā)明研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)堿性和酸性胸腺糖蛋白以研究劑量補(bǔ)償在神經(jīng)脫髓鞘中RN參數(shù)的變化(表3、4和5)。
必須注意單獨(dú)注射糖蛋白溶液在髓鞘神經(jīng)性能中不產(chǎn)生可靠的變化。
表3溶血卵磷脂和胸腺糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)RN組合影響的研究(糖蛋白濃度為10-14M)
在單個(gè)試驗(yàn)中對(duì)整個(gè)動(dòng)物在注射低濃度(10-18M和10-24M)的胸腺糖蛋白后神經(jīng)性能的恢復(fù)進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示在表4和表5中。
表4溶血卵磷脂和胸腺糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)RN組合影響的研究(糖蛋白濃度為10-18M)
人們熟知破壞髓鞘質(zhì)會(huì)導(dǎo)致AD廣延性速率降低。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)在LL作用下，分離神經(jīng)的AD傳導(dǎo)速率降低了，并在LL和所研究的胸腺糖蛋白的組合作用下，這些變化的特征下降了(圖6和7)。在胸腺糖蛋白溶液最高稀釋(至10-24M)下，僅觀察到在LL和糖蛋白溶液溫育的頭7-15個(gè)孔中傾向恢復(fù)(但沒有可靠差異)。因此神經(jīng)在胸腺糖蛋白和LL溶液中的長(zhǎng)期溫育只有在10-14mol/L濃度情況下導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)上AD傳導(dǎo)速率可靠的恢復(fù)。
表5溶血卵磷脂和胸腺糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)RN組合影響的研究(糖蛋白濃度為10-24M)
在下列系列試驗(yàn)中，研究了LL和胸腺糖蛋白作用下AD波幅的變化(圖8)。可確定在試驗(yàn)(LL作用)時(shí)間過程中，觀察到了這種RN參數(shù)顯著的變化(頻率100Hz)。在LL和胸腺糖蛋白(10-14M)組合作用下，AD波幅變化恢復(fù)了。
在下列系列試驗(yàn)中胞內(nèi)鈣的再分布進(jìn)行了研究，記載了探針-氯四環(huán)素的熒光，其揭示出細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的定域和變化。研究了神經(jīng)熒光以及溫育在LL溶液中的神經(jīng)纖維和在LL和胸腺糖蛋白組合作用下的纖維。
早先顯示當(dāng)神經(jīng)與氯四環(huán)素溫育時(shí)，熒光的最大值-和細(xì)胞膜結(jié)合Ca2+水平成比例的參數(shù)從細(xì)胞膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)中記載(軸突和施萬細(xì)胞質(zhì)膜以及髓鞘質(zhì))。在LL作用下，細(xì)胞膜結(jié)合的鈣水平增加了，但在LL和胸腺糖蛋白組合作用下，結(jié)合值增加更多(圖9-11)。正如從所獲得結(jié)果得知，鈣結(jié)合的最大值在LL和濃度為10-14M的胸腺糖蛋白作用下發(fā)生了明顯變化。當(dāng)胸腺糖蛋白濃度降至10-18M，最高的與膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)結(jié)合的鈣水平降低，但高于對(duì)照(LL作用)。90分鐘過程中胸腺糖蛋白濃度下降到10-24M產(chǎn)生結(jié)合鈣水平的微小變化。得到的數(shù)據(jù)顯示了糖蛋白在所研究的“虛擬”溶液中改變細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的能力。
研究已揭示出幾種參數(shù)的變化，這些參數(shù)在神經(jīng)脫髓鞘情況下描述了RN，以及還揭示出在體內(nèi)和體外胸腺糖蛋白作用下存在特有的RN改組。
Kols O.P.，Maksimov G.V.，Radenovich Ch.N.Biophysics ofrhythmic neurility，Moscow，Moscow State University，206，1993。
Maksimov G.V.，Orlov S.N.Transport of calcium ions while nervefiber functioningmechanisms and regulation.Moscow State University，88，1994。
Waxman S.G.，Kocsis J.D.，Stys P.K.The axon Structure，functionand pathophysiology.Oxford Univ.Press，NY-Oxford，325，1995。實(shí)施例10來自哺乳動(dòng)物血清糖蛋白(pI為pH4.65-5.1間)對(duì)脫髓鞘神經(jīng)纖維中興奮傳導(dǎo)的影響試驗(yàn)按實(shí)施例9中所述技術(shù)進(jìn)行。
在LL作用和神經(jīng)脫髓鞘下，一些節(jié)律神經(jīng)性能(RN)的電生理參數(shù)發(fā)生了顯著變化。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)劑量為10-14mol/L的血清糖蛋白(SG)在神經(jīng)脫髓鞘中補(bǔ)償了RN參數(shù)變化(表6)。必須留意的是僅注射糖蛋白溶液不會(huì)導(dǎo)致髓鞘質(zhì)神經(jīng)性能的可靠變化。
表6體內(nèi)溶血卵磷脂和血清糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)RN的組合影響的研究
可確定在組合LL和SG對(duì)神經(jīng)的影響下，由引入LL所導(dǎo)致的變化特征下降了(圖12和13)。當(dāng)SG溶液稀釋到濃度10-18mol/L時(shí)，生物效果不顯著，但與對(duì)照比較數(shù)據(jù)具有可靠的差異。因此，神經(jīng)在濃度為10-14mol/L和10-18mol/L的SG和LL溶液中長(zhǎng)期溫育會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)上可靠的AD傳導(dǎo)速率恢復(fù)。
在下列系列試驗(yàn)中，對(duì)LL和SG作用下的AD波幅變化進(jìn)行了研究(圖14)?？纱_定的是在試驗(yàn)(LL作用)時(shí)間過程中，觀察到這種RN參數(shù)顯著的變化(頻率為100Hz)。在LL和SG(10-14M)組合作用下，恢復(fù)了AD波幅所揭示的變化。
在下列系列試驗(yàn)中對(duì)胞內(nèi)鈣的再分布進(jìn)行了研究，記載了探針-氯四環(huán)素的熒光，其揭示出細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的定域和變化。研究了神經(jīng)熒光以及溫育在LL溶液中的神經(jīng)纖維和在LL和SG組合作用下的纖維。
在LL作用下，細(xì)胞膜結(jié)合的鈣水平增加了，但在LL和SG組合作用下，結(jié)合值增加更多(圖15-17)。正如從所獲得結(jié)果得知，鈣結(jié)合的最大值在LL和濃度為10-14M的SG作用下發(fā)生了明顯變化。當(dāng)SG濃度降到10-24M，細(xì)胞膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)的最大鈣結(jié)合水平下降。得到的數(shù)據(jù)顯示了SG在所研究的“虛擬”溶液中改變細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的能力。
研究已揭示出幾種參數(shù)的變化，這些參數(shù)在神經(jīng)脫髓鞘情況下描述了RN，以及還揭示出在體內(nèi)和體外血清糖蛋白作用下存在特有的RN改組。實(shí)施例11來自牛視網(wǎng)膜的堿性糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)纖維興奮傳導(dǎo)的影響試驗(yàn)按實(shí)施例9中所述技術(shù)進(jìn)行。
在LL作用和神經(jīng)脫髓鞘下，一些節(jié)律神經(jīng)性能(RN)的電生理參數(shù)發(fā)生了顯著變化。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)劑量為10-14mol/L和10-18mol/L來自牛視網(wǎng)膜的堿性糖蛋白(BRG)補(bǔ)償了RN參數(shù)變化(表7)。必須留意的是僅注射糖蛋白溶液不會(huì)導(dǎo)致髓鞘質(zhì)神經(jīng)性能的可靠變化。
表7體內(nèi)溶血卵磷脂和來自牛視網(wǎng)膜堿性糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)RN的組合影響的研究
可確定在組合LL和BRG對(duì)神經(jīng)的影響下，由引入LL所導(dǎo)致的變化特征下降了(圖18和19)。當(dāng)BRG溶液稀釋到濃度10-18mol/L時(shí)，生物效果值與對(duì)照比較具有可靠的差異。因此，神經(jīng)在濃度為10-14mol/L和10-18mol/L的BRG和LL溶液中長(zhǎng)期溫育會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)上可靠的AD傳導(dǎo)速率恢復(fù)。
在下列系列試驗(yàn)中，對(duì)LL和BRG作用下的AD波幅變化進(jìn)行了研究(圖20)?？纱_定的是在試驗(yàn)(LL作用)時(shí)間過程中，觀察到這種RN參數(shù)顯著的變化(頻率為100Hz)。在LL和BRG(10-14M)組合作用下，恢復(fù)了AD波幅所揭示的變化。
在下列系列試驗(yàn)中對(duì)胞內(nèi)鈣的再分布進(jìn)行了研究，記載了探針-氯四環(huán)素的熒光，其揭示出細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的定域和變化。研究了神經(jīng)熒光以及溫育在LL溶液中的神經(jīng)纖維和在LL和BRG組合作用下的纖維。
在LL作用下，細(xì)胞膜結(jié)合的鈣水平增加了，但在LL和BRG組合作用下，結(jié)合值增加更多(圖21-23)。正如從所獲得結(jié)果得知，鈣結(jié)合的最大值在LL和濃度為10-14M的BRG作用下發(fā)生了明顯變化。當(dāng)BRG濃度降到10-24M，細(xì)胞膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)的最大鈣結(jié)合水平下降。得到的數(shù)據(jù)顯示了BRG在所研究的“虛擬”溶液中改變細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的能力。
研究已揭示出幾種參數(shù)的變化，這些參數(shù)在神經(jīng)脫髓鞘情況下描述了RN，以及還揭示出在體內(nèi)和體外來自牛視網(wǎng)膜堿性糖蛋白作用下存在特有的RN改組。實(shí)施例12來自牛眼色素上皮的堿性糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)纖維中興奮傳導(dǎo)的影響試驗(yàn)按實(shí)施例9中所述技術(shù)進(jìn)行。
在LL作用和神經(jīng)脫髓鞘下，一些節(jié)律神經(jīng)性能(RN)的電生理參數(shù)發(fā)生了顯著變化。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)劑量為10-14mol/L來自牛眼色素上皮的堿性糖蛋白(BPEG)補(bǔ)償了神經(jīng)脫髓鞘下的RN參數(shù)變化(表8)。必須留意的是僅注射糖蛋白溶液不會(huì)導(dǎo)致髓鞘質(zhì)神經(jīng)性能的可靠變化。
表8體內(nèi)溶血卵磷脂和來自牛眼色素上皮堿性糖蛋白對(duì)脫髓鞘神經(jīng)RN的組合影響的研究
可確定在組合LL和BPEG對(duì)神經(jīng)的影響下，由引LL所導(dǎo)致的變化特征下降了(圖24和25)。神經(jīng)在濃度為10-14mol/L的BPEG和LL溶液中長(zhǎng)期溫育會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)上可靠的AD傳導(dǎo)速率恢復(fù)。
在下列系列試驗(yàn)中，對(duì)LL和BPEG作用下的AD波幅變化進(jìn)行了研究(圖26)?？纱_定的是在試驗(yàn)(LL作用)時(shí)間過程中，觀察到這種RN參數(shù)顯著的變化(頻率為100Hz)。在LL和BPEG(10-14M)組合作用下，恢復(fù)了AD波幅所揭示的變化。
在下列系列試驗(yàn)中對(duì)胞內(nèi)鈣的再分布進(jìn)行了研究，記載了探針-氯四環(huán)素的熒光，其揭示出細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的定域和變化。
研究了神經(jīng)熒光以及溫育在LL溶液中的神經(jīng)纖維和在LL和BPEG組合作用下的纖維。
在LL作用下，細(xì)胞膜結(jié)合的鈣水平增加了，但在LL和BPEG組合作用下，結(jié)合值增加更多(圖27-29)。正如從所獲得結(jié)果得知，鈣結(jié)合的最大值在LL和濃度為10-14M的BRG作用下發(fā)生了顯著變化。當(dāng)BPEG濃度降到10-18M和10-24M，細(xì)胞膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)的最大鈣結(jié)合水平下降。得到的數(shù)據(jù)顯示了BPEG在“虛擬”溶液(10-14mol/L)中改變細(xì)胞膜結(jié)合鈣水平的能力。
研究已揭示出幾種參數(shù)的變化，這些參數(shù)在神經(jīng)脫髓鞘情況下描述了RN，以及還揭示出在體內(nèi)和體外來自牛眼色素上皮堿性糖蛋白作用下存在特有的RN改組。實(shí)施例13酸性肝糖蛋白對(duì)肝細(xì)胞質(zhì)膜通透性和體外蛋白合成強(qiáng)度的影響試驗(yàn)在多個(gè)器官肝培養(yǎng)物上進(jìn)行，這些肝采自Wistar系、雄性、體重180g的大鼠。共進(jìn)行5個(gè)試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)使用25-30只肝。在一個(gè)試驗(yàn)中所有研究的移出物取自一個(gè)動(dòng)物的肝。將移出物采用微孔過濾器(Synpor，直徑0.6mm)培養(yǎng)在液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和空氣界面上。37℃培養(yǎng)14-16小時(shí)。培養(yǎng)后，一組移出物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中10分鐘，該培養(yǎng)基含有標(biāo)記的3H-亮氨酸，劑量為25μCu。蛋白合成強(qiáng)度的評(píng)價(jià)依據(jù)蛋白中包含的亮氨酸參照相同樣品中標(biāo)記的亮氨酸組進(jìn)行。用于標(biāo)記前體的細(xì)胞通透性由非標(biāo)記的氨基酸組測(cè)定。酸性肝糖蛋白(ALG)的影響以其溶液濃度為10-14mol/L確定。將ALG溶液在與標(biāo)記的亮氨酸溫育前2小時(shí)加入到測(cè)試瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基中，然后將其轉(zhuǎn)移到含有ALG和特定濃度的標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中10分鐘。
發(fā)現(xiàn)ALG影響下的蛋白合成強(qiáng)度與對(duì)照比較降低很多，大約二分之一(在對(duì)照中，標(biāo)記亮氨酸包含在該制備前體組中的比率例如為0.42±0.09，而在測(cè)試中則為0.21±0.04)。在ALG存在下，肝細(xì)胞膜的通透性大量增加(在對(duì)照中，例如制備的非標(biāo)記氨基酸組為1120±50imp./分鐘，而測(cè)試瓶中對(duì)應(yīng)的為2180±30)。
來自測(cè)試器官培養(yǎng)物的移出物形態(tài)學(xué)與對(duì)照比較沒有變化。
研究結(jié)果表明在保留肝組織結(jié)構(gòu)的條件下，超低劑量的ALG影響肝細(xì)胞中蛋白合成的強(qiáng)度和質(zhì)膜的通透性。實(shí)施例14來自哺乳動(dòng)物血清糖蛋白(pI為pH4.65-5.1間)對(duì)肝細(xì)胞質(zhì)膜通透性和體外蛋白合成強(qiáng)度的影響試驗(yàn)在多個(gè)器官肝培養(yǎng)物上進(jìn)行，這些肝采自Wistar系、雄性、體重180g的大鼠。共進(jìn)行5個(gè)試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)使用25-30只肝。在一個(gè)試驗(yàn)中所有研究的移出物取自一個(gè)動(dòng)物的肝。將移出物采用微孔過濾器(Synpor，直徑0.6mm)培養(yǎng)在液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和空氣界面上。37℃培養(yǎng)14-16小時(shí)。培養(yǎng)后，一組移出物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中10分鐘，該培養(yǎng)基含有標(biāo)記的3H-亮氨酸，劑量為25μCu。蛋白合成強(qiáng)度的評(píng)價(jià)依據(jù)蛋白中包含的亮氨酸參照相同樣品中標(biāo)記的亮氨酸組進(jìn)行。用于標(biāo)記前體的細(xì)胞通透性由非標(biāo)記的氨基酸組測(cè)定。血清糖蛋白(SG)的影響以其溶液濃度為10-14mol/L確定。將SG溶液在與標(biāo)記的亮氨酸溫育前2小時(shí)加入到測(cè)試瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基中，然后將其轉(zhuǎn)移到含有SG和特定濃度標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中10分鐘。
發(fā)現(xiàn)SG影響下的蛋白合成強(qiáng)度與對(duì)照比較降低很多，大約二分之一(在對(duì)照中，標(biāo)記亮氨酸包含在該制備前體組中的比率例如為0.42±0.09，而在測(cè)試中則為0.17±0.05)。在SG存在下，肝細(xì)胞膜的通透性大量增加(在對(duì)照中，例如制備的非標(biāo)記氨基酸組為1120±50imp./分鐘，而測(cè)試瓶中對(duì)應(yīng)的為2980±30)。
來自測(cè)試器官培養(yǎng)物的移出物形態(tài)學(xué)與對(duì)照比較沒有變化。
研究結(jié)果表明在保留肝組織結(jié)構(gòu)的條件下，超低劑量的SG影響肝細(xì)胞中蛋白合成的強(qiáng)度和質(zhì)膜的通透性。
下列實(shí)施例(15-17)描述了基于本發(fā)明糖蛋白的藥物組合物。實(shí)施例15基于來自哺乳動(dòng)物血清的糖蛋白(pI為pH4.65-5.1間)的組合物以超低劑量具有藥理學(xué)作用組合物血清糖蛋白1×10-10g氯化鈉 8.8g氯化鈣 0.001g水 至1升是上皮和連接組織中修復(fù)過程的生物調(diào)節(jié)劑。
當(dāng)用作滴眼劑時(shí)，該特定的組合物在機(jī)械創(chuàng)傷或燒傷后有助于角膜痊愈。其導(dǎo)致中度疤痕形成，同時(shí)限制疤痕組織的過度生長(zhǎng)。其在角膜成形術(shù)、治療角膜炎和一些結(jié)膜炎方面特別有效。應(yīng)用該組合物治療角膜穿透?jìng)趯?dǎo)致炎癥反應(yīng)期的降低、傷口邊緣脫離的快速清理、損傷表面上皮形成加速、前室的較早再生、并發(fā)癥頻率的降低(纖維蛋白和眼前房積膿的滲出)、新傷疤組織的加速修復(fù)再生和重建，其導(dǎo)致形成更緊密和高度組織化的傷疤，普遍具有增生組分但沒有主動(dòng)形成角膜血管。細(xì)胞水平上可見下列上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成角膜細(xì)胞(keratoblasts)的加速遷移、白細(xì)胞滲透的降低、內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)層的早期形成而在傷口溝中沒有脫皮的癥狀，最終導(dǎo)致上皮-纖維組分快速填滿傷口溝，傷口邊緣的較早和準(zhǔn)確閉合、纖維蛋白的主動(dòng)再吸收和其為成角膜細(xì)胞增生替代，其合成新的膠原纖維。當(dāng)使用該組合物時(shí)，發(fā)生了下列事件膠原板更緊密的排列和上述細(xì)胞增生的纖維組分占有優(yōu)勢(shì)，其決定了疤痕組織的質(zhì)量。更溫和、更緊密和無血管的疤痕的形成導(dǎo)致了角膜透明度和折射較小的變化。在眼灼傷的情況下，特定組合物的治療效果至第14天逐漸顯示出來并由下列效果組成纖維原細(xì)胞元件的顯著增生、受傷角膜組織的滲透以及增生細(xì)胞矢量定向引起角膜板結(jié)構(gòu)模仿初始形態(tài)學(xué)的組織結(jié)構(gòu)。
當(dāng)使用注射方式時(shí)，該特定的組合物刺激四肢骨折的骨組織再生，包括頸和臂的骨折。這對(duì)于用來治療嚴(yán)重的與結(jié)構(gòu)和功能軟骨組織異常相關(guān)的關(guān)節(jié)病，用來治療關(guān)節(jié)膝蓋軟骨機(jī)械損傷以及用來治療關(guān)節(jié)病和滑膜炎都是有效的。組合物的引入抑制損傷軟骨組織的再生過程。當(dāng)用于治療損傷關(guān)節(jié)軟骨時(shí)，該組合物提供了快速積累年幼軟骨細(xì)胞和它們的分化，導(dǎo)致在損傷部位替代的軟骨組織形成和甚至是關(guān)節(jié)面的重建都比對(duì)照更快，因而其在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的恢復(fù)中發(fā)揮了主要作用。年幼軟骨細(xì)胞填充了損傷部位，軟骨組織以確定方式再生，因?yàn)槠湎蟪跏纪该鬈浌且粯影l(fā)生了表層分化。當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)引入組合物時(shí)，在注射藥物2-3次后就可觀察到疼痛癥狀的減少。假如特定組合物的應(yīng)用效率與最知曉的軟骨保護(hù)劑比較，如“Zeel”，在用于治療運(yùn)動(dòng)員關(guān)節(jié)膝蓋軟骨創(chuàng)傷的情況下，可能留意到在使用本發(fā)明平均7-10天疼痛癥狀和滑膜炎終止，而在使用“Zeel”的情況下需要14-17天。
因此，運(yùn)動(dòng)結(jié)果恢復(fù)到以前水平要比使用“Zeel”快2-2.5倍。
各種組合物以各種藥劑形式(凝膠、藥膏、栓劑和溶液)包含作為活性組分的血清糖蛋白，濃度為1×10-10g糖蛋白/L(或kg)組合物，具有傷口治愈活性以及有效用于皮膚損傷治療，包括灼傷和褥瘡的治療及其預(yù)防。它們?cè)谳椛鋼p傷后刺激皮膚修復(fù)過程，輻射損傷出現(xiàn)在腫瘤病人放療后。這些組合物在腸胃病學(xué)(潰瘍、胃炎和胃十二指腸炎)、直腸病學(xué)(直腸病)、婦科病學(xué)(宮頸糜爛)、心臟病學(xué)(心肌梗塞后的恢復(fù)期)都是有效的。實(shí)施例16基于來自牛視網(wǎng)膜酸性肝糖蛋白的組合物以超低劑量具有藥理學(xué)作用組合物來自視網(wǎng)膜的酸性糖蛋白1×10-10g氯化鈉 8.8g氯化鈣 0.001g水 直至1L是修復(fù)過程的生物調(diào)節(jié)劑，幫助恢復(fù)視網(wǎng)膜受損的功能，預(yù)防外科介入時(shí)的視網(wǎng)膜脫落。
該特定的組合物刺激視網(wǎng)膜中負(fù)責(zé)實(shí)現(xiàn)視力的基本酶系統(tǒng)的功能，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞膜中脂質(zhì)的過氧化。該組合物是有效的生物調(diào)節(jié)劑，其負(fù)責(zé)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞位置分布和細(xì)胞分裂。其幫助恢復(fù)損傷或病理過程發(fā)展后視網(wǎng)膜組織空間上的功能結(jié)構(gòu)。本發(fā)明組合物在近視、各種病因?qū)W的視網(wǎng)膜退化以及眼穿透?jìng)诤蟮臓顩r方面具有治療效果。實(shí)施例17基于來自牛眼色素上皮酸性糖蛋白的組合物以超低劑量具有藥理學(xué)作用組合物來自眼色素上皮的酸性糖蛋白 1×10-10g氯化鈉 8.8g
氯化鈣 0.001g水 直至1L是生物調(diào)節(jié)劑，幫助恢復(fù)眼色素上皮受損的功能。
至今還未出現(xiàn)這樣的藥劑，其應(yīng)用將導(dǎo)致在各種病因?qū)W視網(wǎng)膜炎和黃斑病發(fā)展的初始階段抑制病理過程。本發(fā)明特定的組合物能有效治療黃斑病和各種病因?qū)W視網(wǎng)膜炎。
權(quán)利要求
1.糖蛋白，其是借助于等電聚焦方法從采自人和動(dòng)物不同器官的組織胞間隙、血清和膽汁中抽提出來的，其溶于飽和(100％)硫酸銨溶液中，具有表觀分子量10-45kDa并在超低劑量10-12到10-29mol/L和更低時(shí)具有生物活性。
2.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求1的糖蛋白和可藥用載體。
3.權(quán)利要求1的糖蛋白作為藥劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物活性化學(xué)組合物,更特異性地涉及蛋白質(zhì)并能用在醫(yī)藥、獸醫(yī)和細(xì)胞生物學(xué)中。本發(fā)明的糖蛋白采用等電聚焦從脊椎動(dòng)物(人和動(dòng)物)不同器官、血清和膽的組織胞間隙抽提出來。所述糖蛋白在超低劑量濃度范圍從10
文檔編號(hào)A61K35/12GK1379680SQ00814480
公開日2002年11月13日 申請(qǐng)日期2000年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月13日
發(fā)明者維克托利亞·彼得羅夫娜·亞姆斯科瓦, 伊戈?duì)枴啔v山德羅維奇·亞姆斯科夫, 阿列克謝·瓦西里耶維奇·雷科夫 申請(qǐng)人:“愛多法姆”生產(chǎn)聯(lián)合企業(yè)股份有限公司