專利名稱：用于免疫治療的修飾肽和肽類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于HC gp-39(263-275)的修飾的肽，包含這些肽的藥用組合物，以及這些肽在誘導(dǎo)自身免疫病患者耐受中的用途。
根據(jù)受外來抗原(非自我抗原)和自身抗原(自我抗原，來自個(gè)體本身)的區(qū)別原則建立免疫系統(tǒng)，這通過對自身抗原的內(nèi)在耐受實(shí)現(xiàn)。
免疫系統(tǒng)通過激活特異性細(xì)胞(如T和B淋巴細(xì)胞)并產(chǎn)生可溶性因子(如白介素、抗體和補(bǔ)體因子)保護(hù)個(gè)體免于外來抗原，并對接觸外來抗原起反應(yīng)。免疫系統(tǒng)起反應(yīng)的抗原被抗原遞呈細(xì)胞(APCs)降解，抗原的片段在細(xì)胞表面表達(dá)，與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類糖蛋白結(jié)合。MHC-糖蛋白-抗原-片段復(fù)合物被遞呈給T細(xì)胞，依賴其T細(xì)胞受體識(shí)別與MHC II類蛋白結(jié)合的抗原片段。T細(xì)胞被激活，即，增殖和/或產(chǎn)生白介素，導(dǎo)致在遭受攻擊下針對抗原的激活淋巴細(xì)胞的擴(kuò)充(Grey等人，Sci.Am.，26138-46，1989)。
自身抗原也被連續(xù)加工并作為抗原片段由MHC糖蛋白遞呈給T細(xì)胞(Jardetsky等人，Nature 353326-329，1991)。因此自我識(shí)別是免疫系統(tǒng)所固有的。在正常環(huán)境下，免疫系統(tǒng)耐受自身抗原，避免了這些自身抗原激活免疫應(yīng)答。
當(dāng)對自身抗原的耐受喪失時(shí)，免疫系統(tǒng)對一種或多種自身抗原激活，導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞的激活和自身抗體的產(chǎn)生。這種現(xiàn)象被稱為自身免疫。由于免疫應(yīng)答一般是破壞性的，即，意味著破壞侵入的外來抗原，因此自身免疫反應(yīng)能引起身體自身組織的破壞。
已經(jīng)在幾次研究中確定了T細(xì)胞對于自身免疫病的作用。對于小鼠，實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)由十分有限的一組T細(xì)胞介導(dǎo)，它們由于對與MHCII類分子復(fù)合的髓磷脂堿性蛋白(MBP)單表位的特異性連接。對于Lewis大鼠——對多種自身免疫病高度易感的一個(gè)物種，已經(jīng)顯示疾病由T細(xì)胞介導(dǎo)。對于人類，自身免疫病也被認(rèn)為與自身侵入性T細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)。
許多疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA))涉及破壞性自身免疫反應(yīng)，其中由于存在大量激活的淋巴細(xì)胞和MHCII類表達(dá)細(xì)胞引起的慢性炎癥過程破壞了關(guān)節(jié)軟骨。軟骨的存在對于保持局部炎癥反應(yīng)似乎是必需的曾經(jīng)提出，RA中軟骨降解與軟骨應(yīng)答性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活性有關(guān)(Sigall等人，Clin.Exp.Rheumat.659，1988；Glant等人，Biochem.Soc.Trans.18796，1990；Burmester等人，Rheumatoid arthritis Smolen，Kalden，Maini(編)Springer-Verlag Berlin Heidelberg，1992)。而且，通過手術(shù)從RA患者中除去軟骨可減少炎癥過程(R.S.Laskin，J.Bone JointSurgery(Am)72529，1990)。軟骨蛋白因此被認(rèn)為是能刺激T細(xì)胞的靶自身抗原。這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞的激活導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)展。然而，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)作中起作用的自身抗原成分的鑒定迄今仍不清楚。
導(dǎo)致軟骨破壞的炎癥反應(yīng)能用幾種藥物(如類固醇藥物)治療。但是，這些藥物通常是免疫抑制藥，是非特異性的，并且具有毒副作用。非特異性免疫抑制的缺點(diǎn)使其成為十分不理想的治療。
抗原特異的、無毒的免疫抑制治療是非特異免疫抑制的一種十分有吸引力的代替。這種抗原特異的治療包括用靶自身抗原或來自靶自身抗原的合成T細(xì)胞反應(yīng)性肽治療患者。這些合成肽對應(yīng)于自身抗原的T細(xì)胞表位，能用來誘導(dǎo)對它們自身和對自身抗原的特異性T細(xì)胞耐受。免疫系統(tǒng)的脫敏或免疫耐受基于長期觀察到的一種現(xiàn)象，即，飼養(yǎng)或吸入一種抗原或表位的動(dòng)物當(dāng)通過全身(systemic)途徑導(dǎo)入該抗原或表位時(shí)基本不能發(fā)展對該抗原或表位的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種在HLA-DR4-陽性個(gè)體中常發(fā)生的自身免疫病。該疾病相關(guān)性可表明，DR4分子將自身抗原遞呈給T細(xì)胞。該自身免疫病的靶標(biāo)是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存在一種可產(chǎn)生在基質(zhì)中組織化產(chǎn)物的獨(dú)特細(xì)胞型的關(guān)節(jié)。RA中見到的關(guān)節(jié)破壞被認(rèn)為是由軟骨特異的自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的。軟骨衍生的蛋白質(zhì)——人軟骨gp-39(HC gp-39)最近已被確定為RA中的一種候選自身抗原。HC gp-39蛋白的一種主要表位——包括263-275序列的肽——在RA患者中優(yōu)先識(shí)別，表明該表位是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中自身免疫攻擊的一個(gè)靶標(biāo)。18名RA患者中的8名對該肽起反應(yīng)，而在健康供體組中沒有發(fā)現(xiàn)反應(yīng)者(Verheijden等人，ArthtritisRheum.401115，1997)。因此，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示，該肽或HC gp-39蛋白是關(guān)節(jié)中免疫識(shí)別的一個(gè)靶標(biāo)。
HC gp-39在Balb/c小鼠中的致關(guān)節(jié)炎作用進(jìn)一步證明了它對于關(guān)節(jié)炎的重要性。在胸區(qū)一次注射μg水平的與IFA混合的蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)RA的慢性關(guān)節(jié)炎癥記憶。
通過在用HC gp-39免疫之后，由DRB1*0401-轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生一組DRB1*0401-限制的、肽特異的T-T雜交瘤，進(jìn)一步檢測了對HC gp-39肽263-275的反應(yīng)。確定并比較了肽263-275特異的雜交瘤在DR4(DB1*0401)范圍內(nèi)的精確特異性。結(jié)果，鑒定出3種雜交瘤，它們在識(shí)別由DRB1*0401編碼的分子遞呈的263-275表位方面不同。(當(dāng)用263-275序列內(nèi)的N-端和C-端截短肽刺激不同雜交瘤時(shí)，所用的3種雜交瘤之間表位識(shí)別的差異變得明顯)。發(fā)現(xiàn)5G11雜交瘤對265-275序列有最佳反應(yīng)。相反，8B12雜交瘤的識(shí)別以264-274序列為中心，而14G11雜交瘤對264-275有最佳反應(yīng)性。
HC gp-39(263-275)-反應(yīng)性T細(xì)胞的耐受對于RA患者可能是有利的。本發(fā)明提供基于HC gp-39(263-275)序列的修飾的肽衍生物，它們在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力和致耐受能力上出色。
驚奇地發(fā)現(xiàn)，基于HC gp-39(263-275)的特異性肽修飾對于一組HCgp-39(263-275)肽特異的T細(xì)胞雜交瘤是對抗性的，并且在刺激(在用包括263-275表位序列的肽刺激后產(chǎn)生的)兩種人T細(xì)胞克隆方面優(yōu)越。而且，這些修飾的肽顯示優(yōu)秀的體內(nèi)致耐受能力。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種修飾的肽，其來自H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(通式I；SEQ ID NO1)，具有通式Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-Z(通式II)。在通式II中，A1到A13對應(yīng)于通式I的氨基酸，Q對應(yīng)于H，Z對應(yīng)于OH。根據(jù)本發(fā)明的修飾選自
a)A1-A13中1-6個(gè)、優(yōu)選地1-4個(gè)氨基酸被非天然氨基酸或β氨基酸替換，b)一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵被還原的酰胺鍵或乙烯等排物取代，c)Q和/或Z處的取代。
選自其中一個(gè)或多個(gè)的修飾的數(shù)量可達(dá)1-6個(gè)。另外，氨基酸也可被其它天然氨基酸替換，只要修飾總數(shù)不超過6。
C-端和/或N-端修飾可穩(wěn)定基于通式I的修飾的肽(HC gp-39(263-275))，這將減少外肽酶催化的水解。這些修飾可包括N端?；?例如，乙?；紸c-肽)、C端酰胺引入(例如肽-NH2)、乙?；c酰胺引入的組合(例如Ac-肽-NH2)和，例如，D-氨基酸而不是L-氨基酸的引入。其它修飾集中于內(nèi)肽酶防止水解。
表1.肽鍵 這些修飾的例子有D-氨基酸而不是L-氨基酸的引入、修飾的氨基酸、肽內(nèi)環(huán)化、修飾肽鍵(如還原肽鍵ψ[CH2NH])和類肽(N-烷基化甘氨酸衍生物)的引入。
其它肽類似物可與通式I或通式II的肽有關(guān)，而不是常規(guī)的-NH-C(O)-肽鍵，可以用表1所示的鍵或其任意組合代替各種-NH-C(O)-鍵。如果去除N端氨基酸(例如，通式II中A1＝脫氨基精氨酸)，通式II中的Q對應(yīng)于無原子。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的肽是如下的肽，其中Q是H、(C1-6)烷基、甲酰基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)鏈烯氧基羰基、(C6-14)芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，則不含Q；Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基，(C2-6)鏈烯基、(C6-14)芳基(C1-4)烷基、(C6-14)(C4-13)雜芳基(C1-6)烷基，或NR1R2，其中R1和R2分別選自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基；和任選地，Q和Z還含有緊鄰位置A1和/或A13的總共可達(dá)10個(gè)氨基酸。優(yōu)選地在不超過4個(gè)、更優(yōu)選地不超過2個(gè)位置處進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)其它天然氨基酸對A1-A3的替換。
在根據(jù)本發(fā)明的肽中，通式II的下列替換是優(yōu)選的Q是H、(C1-6)烷基、甲?；?C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)鏈烯氧基羰基、(C6-14)芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)，HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，則不含Q。更優(yōu)選的是以下替換，其中Q為H、(C1-6)烷基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1為H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，則不含Q。更優(yōu)選的是如下的肽，其中Q是H、甲基；乙?；?；羧基亞甲基、甲氧基羰基；CH3(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-、D-1-葡糖基、1-甲基-吡啶鎓-3-羰基或1-甲基-吡啶鎓-4-羰基，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-則不含Q。
A1是L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lys、L-Ala、D-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(R)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)。優(yōu)選地A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)。更優(yōu)選地，A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-。
A2是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)。優(yōu)選地，A2是L-Ser、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)。更優(yōu)選地，A2是L-Ser、L-Ala或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-。
A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)、D-Phe(X)，其中X分別選自(C1-4)烷基、羥基、鹵素、(C1-6)烷基羰基氨基、氨基或硝基、L-Hfe、D-Hfe、L-Thi、D-Thi、L-Cha、D-Cha、L-Pal(3)、D-Pal(3)、L-1-Nal、D-1-Nal、L-2-Nal、D-2-Nal、L-Ser(Bzl)、D-Ser(Bzl)、(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}中的一種或多種。優(yōu)選地，A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)或D-Phe(X)(其中X是鹵素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha、L-Pal(3)、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}。更優(yōu)選地，A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)(其中X是鹵素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha，L-Pal(3)、L-1-Nal，L-2-Nal或L-Ser(Bzl)。
A4是L-Thr、D-Thr、L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly。優(yōu)選地，A4是L-Thr或L-Ala。
A5是L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、L-Val、D-Val-、L-Nva、D-Nva、L-Ala、D-Ala、Gly、(R)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}。優(yōu)選地，A5是L-Leu、L-Ala或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}。
A6是L-Ala、D-Ala或Gly。優(yōu)選地，A6是L-Ala或Gly。
A7是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly。優(yōu)選地，A7是L-Ser或L-Ala。
A8是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly。優(yōu)選地，A8是L-Ser或L-Ala。
A9是L-Glu、D-Glu、L-Asp、D-Asp、L-Ala、D-Ala或Gly。優(yōu)選地，A9是L-Glu或L-Ala。
A10是L-Thr、D-Thr、L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly。優(yōu)選地，A10是L-Thr或L-Ala。
A11是Gly、L-Ala、D-Ala或-NH-CH2-CH2-。優(yōu)選地，A11是Gly、L-Ala或-NH-CH2-CH2-。
A12是L-Val、D-Val、L-Nva、D-Nva、L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、(R)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(RR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(RS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(SR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-或(SS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}。優(yōu)選地，A12是L-Val或(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}。
A13是Gly、L-Ala或D-Ala。優(yōu)選地，A13是Gly或L-Ala。
此外，在根據(jù)本發(fā)明的肽中，Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基、(C2-6)鏈烯基、(C6-14)芳基(C1-4)烷基、(C4-13)雜芳基(C1-6)烷基或NR1R2，其中R1和R2分別選自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基。優(yōu)選地，Z是OR，其中R是H或NR1R2，其中R1和R2分別選自H或(C1-6)烷基。更優(yōu)選地，Z是OH、NH2或NHEt。
根據(jù)本發(fā)明的肽任選地可在N端和C端(即，緊接A1和/或A13)延伸幾個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，它們可延伸達(dá)10個(gè)氨基酸。因此，Q和Z可另外含有緊接位置A1和/或A13的總共可達(dá)10個(gè)氨基酸。
這些肽可在幾個(gè)位置上不同于通式I，但優(yōu)選地，它們在1-4位，更優(yōu)選地在2-3位修飾。
在此使用時(shí)，術(shù)語(C1-6)烷基是指含有1-6個(gè)碳原子的分支或不分支的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基和己基。最優(yōu)選的是含有1-4個(gè)碳原子的烷基。
術(shù)語(C1-4)烷基是指含有1-4個(gè)碳原子的分支或不分支的烷基。
術(shù)語(C2-6)鏈烯基是指含有2-6個(gè)碳原子的分支或不分支的鏈烯基，如乙烯基、2-丁烯基等。(C1-4)鏈烯基是優(yōu)選的，(C1-3)鏈烯基是最優(yōu)選的。
術(shù)語(C1-6)烷基羰基是指與一個(gè)羰基連接的、含有1-6個(gè)碳原子的分支或不分支的烷基，例如乙?；?。最優(yōu)選的是含有1-4個(gè)碳原子的烷基。
術(shù)語羧基-(C1-6)烷基是指與含有1-6個(gè)碳原子的分支或不分支烷基連接的羧基。最優(yōu)選的是含有1-4個(gè)碳原子的烷基。
術(shù)語(C1-6)烷氧基羰基是指與一個(gè)氧基羰基連接的分支或不分支的烷基，例如甲氧基羰基-或叔丁氧基羰基-(Boc-)。最優(yōu)選的是含有1-4個(gè)碳原子的烷基。
術(shù)語(C2-6)鏈烯氧基羰基是指與一個(gè)氧基羰基連接的如前所述含有2-6個(gè)碳原子的分支或不分支的鏈烯基，例如烯丙氧基羰基。(C1-4)鏈烯基是優(yōu)選的，(C1-3)鏈烯基是最優(yōu)選的。
術(shù)語(C1-6)(二)烷基氨基是指含有1-6個(gè)碳原子的二烷基氨基，其烷基部分具有前述相同的含義。優(yōu)選的是含有1-4個(gè)碳原子的烷基。
術(shù)語氨基(C1-6)?；侵赣冒被δ芑暮?-6個(gè)碳原子的酰基。優(yōu)選的是含有1-4個(gè)碳原子的?；?。
術(shù)語(C6-14)芳基是指含有6-14個(gè)碳原子的芳烴基，如苯基、萘基、四氫萘基、茚基、蒽基，它們?nèi)芜x地可在鄰位和/或間位被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，這些取代基例如但不限于羥基、鹵素、硝基、氰基、氨基((C1-6)?；?或(二)(C1-6)烷基氨基，酰基和烷基部分具有前述相同的含義。(C6-10)芳基是優(yōu)選的，苯基是最優(yōu)選的。
術(shù)語(C4-13)雜芳基(C1-6)烷基是指與含有1-6個(gè)碳原子的分支或不分支烷基連接的、含有4-13個(gè)(優(yōu)選地4-9個(gè))碳原子的取代或未取代的芳基，至少含有一個(gè)選自N、O和/或S的雜原子。雜芳基上的取代基可選自對于芳基列出的取代基。含氮雜芳基可通過碳原子或氮原子與烷基連接。對于烷基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基是優(yōu)選的。
術(shù)語(C1-6)烷基(C6-14)芳基是指與前述芳基連接的如前所述的分支或不分支的烷基。(C6-10)芳基是優(yōu)選的，苯基是最優(yōu)選的。對于烷基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基是優(yōu)選的。
術(shù)語(C6-14)芳基(C1-6)烷基是指一種芳基烷基，其中烷基是(C1-6)烷基，芳基是如前所述的(C6-14)芳基，例如芐基-(Bzl)或三苯甲基(Trt)。(C6-10)芳基是優(yōu)選的，苯基是最優(yōu)選的。對于烷基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基是優(yōu)選的。
術(shù)語(C1-6)烷基羰基氨基是指一種烷基羰基氨基，其烷基含有1-6個(gè)碳原子，具有與前述相同的含義。含有1-4個(gè)碳原子的烷基是優(yōu)選的。
術(shù)語(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基是指與烷氧基羰基連接的(C6-14)芳基，其中的烷基是(C1-4)烷基，芳基如前所述，例如是芐氧基羰基-(Z)或芴基甲氧基羰基(Fmoc)。(C6-10)芳基是優(yōu)選的，苯基是最優(yōu)選的。
術(shù)語鹵素是指F、Cl、Br或I。
天然存在的氨基酸用如下縮寫(三字母編碼)表示丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。對于所有氨基酸，立體化學(xué)定義為L-。
非天然氨基酸是任選地Nα-取代的α-氨基酸，其具有不同于天然氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸如Phe(X)(X是位于Phe的苯環(huán)對位的取代基)、hSer(2-氨基-4-羥丁酸)、正亮氨酸(Nle，2-氨基己酸)、正纈氨酸(NVa，2-氨基戊酸)、L-Hfe(L-α-高苯丙氨酸)，D-Hfe(D-α-高苯丙氨酸)、L-Thi(β-噻嗯基-L-丙氨酸)、D-Thi(β-噻嗯基-D-丙氨酸)、L-Cha(β-環(huán)己基-L-丙氨酸)、D-Cha(β-環(huán)己基-D-丙氨酸)、L-Pal(3)(β-3-吡啶基-L-丙氨酸)、D-Pal(3)(β-3-吡啶基-D-丙氨酸)、L-1-Nal(β-1-萘基-L-丙氨酸)、D-1-Nal(β-1-萘基-D-丙氨酸)、L-2-Nal(β-2-萘基-L-丙氨酸)、D-2-Nal(β-2-萘基-D-丙氨酸)、L-Ser(Bzl)(O-芐基-L-絲氨酸)、D-Ser(Bzl)(O-芐基-D-絲氨酸)和N-烷基甘氨酸衍生物，如NVal(N-異丙基甘氨酸)、NArg(N-(3-胍基丙基)甘氨酸)和NhSer(N-(2-羥乙基)甘氨酸)。這組氨基酸中也包括立體化學(xué)被定義為D-的天然存在的氨基酸。
應(yīng)當(dāng)理解，在摻入還原酰胺鍵的肽中，氨基酸的最初的羰基被替換為亞甲基。在摻入乙烯基等排物的肽中，最初的氨甲酰功能基(-C(O)-NR-)被替換為乙烯基(-CH＝CR-)。
術(shù)語序列中兩個(gè)氨基酸殘基之間的ψ[CH2NH]是指這些氨基酸殘基之間的最初的酰胺鍵(-C(O)-NH-)被替換為還原酰胺鍵(-CH2NH-)。
通式I中所指的幾個(gè)氨基酸優(yōu)選地位于通式2的相應(yīng)位置。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是具有通式Q-A1-A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11-A12-Gly-Z(通式III)的修飾肽，其中Q、A1、A2、A3、A11、A12和Z如前所述。通式III中最優(yōu)選的取代是將A1取代為L-Arg、D-Arg、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)，或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-，將A2取代為L-Ser或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-，將A3取代為L-Phe、L-Phe(X)，其中X是鹵素、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)、L-Thi、L-Cha或L-Pal(3)。
更優(yōu)選的是根據(jù)通式III的肽，其中A1是Arg，A3是Phe，A11是Gly，產(chǎn)生通式IVQ-Arg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z，其中位置Q、A2、A12和Z如前所述。
最優(yōu)選的肽選自脫氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、脫氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3-(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-ψ-[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ-[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、H-Arg-Ser-Phe(Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)6-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、(N-甲基-煙酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH。
合成N端修飾的修飾HC gp39(263-275)肽(如通式V所示)的合適的方法由通式VI的衍生物開始。修飾的肽通過常用的固相肽合成(SPPS)法合成(B.Merrifield，“固相肽合成”，《肽》1995，93-169，編者B.Gutte，Academic，San Diego，California，USA；P.Lloyd-Williams，F(xiàn).Albericio，E.Giralt，Tetrahedron 4911065-11133，1993)。根據(jù)使用的接頭的類型，肽鏈通過酯鍵(PAC接頭)或酰胺鍵(PAL接頭)與載體連接。
在使用偶聯(lián)劑如HATU(L.Carpino，A.El-Faham，C.A.Minor，F(xiàn).Albericio，J.CHem.Soc.，CHem.Comm.201-203，1994)或PyBOP(J.Coste，D.Le-Nguyen，B.Castro，Tetrahedron Lett.31205-208，1990)和DiPEA將Fmoc-C端氨基酸鎓定于固體載體上后(m＝1，A-B＝Fmoc)，通過用適當(dāng)保護(hù)的Fmoc-氨基酸衍生物連續(xù)?；?，隨后用自動(dòng)肽合成儀哌啶介導(dǎo)地去除Fmoc保護(hù)基(A-B＝H)，使鏈延長(m＝2-12)。此外，也可使用五氟苯基(Pfp)氨基酸活性酯(A.Dryland，R.C.Sheppard，Tetrahedron 44859-876，1988)實(shí)現(xiàn)縮合。隨后，用相同方法加入N端氨基酸B，去除Fmoc-基團(tuán)。然后使這樣獲得的13-meric肽衍生物(A＝H，B＝N端氨基酸，m＝12)適于N端功能化。在N端加入另一個(gè)酰胺鍵(A＝烷基羰基)可如下實(shí)現(xiàn)與希望的酸(X-OH)進(jìn)行另一次HATU或PyBOP-介導(dǎo)的縮合，或在吡啶存在下與一種酰氯(X-Cl)偶聯(lián)。帶電荷的1-甲基吡啶鎓-4-羰基單位或1-甲基吡啶鎓-3-羰基單位可在從樹脂上切下(見下文)后加入，(即通式V，A＝H，B＝N端氨基酸，Z＝OR，R＝H、烷基，或Z＝NR1R2，R1、R2＝H或烷基)，方法是完全去保護(hù)的肽的游離N端與N-甲基(異)煙酰羥基琥珀酰亞胺活性酯(M.L.Tedjamulia，P.C.Srivastava，F(xiàn).F.Knapp，J.Med.CHem.，281574-1580，1985)在水介質(zhì)中的DiPEA-介導(dǎo)的反應(yīng)(比較通式V中A＝H向A＝N-甲基(異)煙酰的轉(zhuǎn)化)。
N-烷化可通過還原性胺化實(shí)現(xiàn)，方法是在溶于DMF/HOAc(99/1，v/v)的NaBH(OAc)3的存在下，用合適的醛處理固定的肽(通式VI，A＝H轉(zhuǎn)換為A＝烷基)。此外，在DiPEA存在下固定的肽(A＝H)與烷基鹵的反應(yīng)也可產(chǎn)生N-烷基化的肽(例如，與叔丁基溴乙酸反應(yīng))。游離NH2(通式VI中的A＝H)也可用氨甲?；?例如甲氧羰基)通過與相應(yīng)氨甲酰氯在CH2Cl2/DiPEA中反應(yīng)功能化(通式VI中A＝H轉(zhuǎn)化為A＝烷氧羰基)。在從固體載體上切下肽，同時(shí)用TFA/Et3SiH/茴香醚/ROH(R＝H、烷基)除去酸不穩(wěn)定性的保護(hù)基后，通式V的肽(Z＝OR)通過RP-HPLC純化。此外，在從樹脂上切割期間，C端可具有酰胺功能(Z＝NR1R2，R1和R2＝H或烷基)。此時(shí)，在肽鏈(通式VI)與PEG-PS固體載體之間使用不同的接頭(PALB.Merrifield，Peptides，93-169，1995)。如果PAL接頭的游離氨基在與第一個(gè)(C端)氨基酸附著之前烷化，將在從聚合物載體上切下之后形成C端烷基酰胺。
利用相同的Fmoc-SPPS策略，可以獲得含有非天然的但可購得的氨基酸(例如D-氨基酸或取代的苯丙氨酸衍生物)的肽。除此之外，N-烷基甘氨酸衍生物(類肽單體，通式V和VI中的Rn1＝氨基酸側(cè)鏈，Rn2＝H)用文獻(xiàn)報(bào)道的方法(J.A.Kruijtzer，L.J.F.Hofmeyer，W.Heerma，C.Versluis，R.M.J.Liskamp，Chem.Eur.J.41570-1580，1998)首先在溶液中合成。在SPPS之前，也按照已知的方法(H.M.M.Bastiaans，A.E.Alewijnse，J.L.van der Baan，H.C.J.Ottenheijm，Tetrahedron Lett.357659-7660，1994)在溶液中制備修飾的N-端氨基酸β-高-L-精氨酸[B＝NH-CH(CH2CH2CH2NH-CH(＝NH)NH2)-CH2-C(O)]。在用Fmoc保護(hù)基保護(hù)這樣獲得的單體氨基酸中的游離NH2基后，能用SPPS方法將化合物摻入到延伸的肽中(通式VI)。
最后一類修飾的肽包括含有一種或多種還原酰胺鍵的肽(通式V中的Rn3＝H2)。這些衍生物可通過改良SPPS法得到(J.J.Wen，A.R.Spatola，J.Pept.Res.，493-14，1997)，在該方法中，延伸的鏈的游離N-端氨基酸(通式VI中的1＜m＜12)在還原條件下(NaBH3CN，DMF/HOAc，99/1，v/v)用加入的氨基酸醛烷化。需要的N-Fmoc保護(hù)的氨基酸醛可以購得，或者可用文獻(xiàn)報(bào)道的方法獲得(J.J.Wen，C.M.Crews，TetrahedronAsymmetry91855-1858，1998)。這樣延伸的鏈(A-B＝Fmoc，Rn1＝H，Rn2＝氨基酸側(cè)鏈，Rn3＝H2)含有仲氨基功能基(Rn+11＝H)，隨后用Boc基團(tuán)保護(hù)。在除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，可用SPPS方法進(jìn)一步延長肽鏈。 此外，也可在SPPS之前在溶液中合成具有通式VII的二聚體結(jié)構(gòu)。然后用Fmoc保護(hù)的氨基酸醛(Fmoc-NH-CH(Rn2)-C(O)H)還原性烷化(NaBH3CN，DMF/HOAc，99/1，v/v)合適的氨基酸芐酯(H2N-CH(Rn+12)-CO2Bzl)，產(chǎn)生二聚仲胺。在用Boc基團(tuán)(Rn+11＝Boc)保護(hù)氨基功能，隨后氫解芐酯后，形成具有通式VII的化合物，它可用SPPS方法摻入到延伸的鏈中。
根據(jù)本發(fā)明的肽能用作治療物。更具體而言，它們能用于在自身免疫病(特別是關(guān)節(jié)炎)患者中誘導(dǎo)對自身抗原的特異性T細(xì)胞耐受。
基于MHC II類限制的T細(xì)胞表位結(jié)構(gòu)、具有增強(qiáng)的體外刺激活性和增強(qiáng)的體內(nèi)活性的修飾肽可以用周知的技術(shù)選擇。
為了保持特定T細(xì)胞表位的競爭性質(zhì)，不過多地干擾參與結(jié)合相關(guān)MHC分子的殘基，也不過多地影響參與相關(guān)T細(xì)胞TCR契合的殘基被認(rèn)為是重要的。因此，競爭性修飾肽的選擇將包括1)確定修飾肽結(jié)合相關(guān)MHC分子的親和力，并與野生型、未修飾的肽表位的親和力相比較2)用體外試驗(yàn)(照射的抗原遞呈細(xì)胞與肽抗原和特異性T細(xì)胞共溫育)確定修飾肽的刺激活性，并與野生型、未修飾的肽活性相比較。優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)評價(jià)大量具有不同TCR純系(clonotype)型、但可與相同MHC II類分子中的相同表位反應(yīng)的表位特異性、MHC II類限制性T細(xì)胞。為此可使用一系列特異性T細(xì)胞雜交瘤或特異性T細(xì)胞系/克隆。人用修飾表位的選擇優(yōu)選地需要使用人T細(xì)胞系/克隆保護(hù)選擇的修飾表位對于人T細(xì)胞識(shí)別的相關(guān)性。
3)確定修飾肽的體內(nèi)活性(任選地)。為此可使用不同的實(shí)驗(yàn)安排。
a)遲發(fā)性超敏反應(yīng)試驗(yàn)b)體內(nèi)施用抗原(含或不含佐劑)后，離體的T細(xì)胞激活測定c)通過施用修飾的肽抗原對自身免疫病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭屑膊〉恼{(diào)節(jié)優(yōu)選地，將選擇與野生型肽相比具有增強(qiáng)的體外競爭活性或具有增強(qiáng)的體內(nèi)作用的化合物。
在小鼠中可被識(shí)別的各種HC gp-39衍生的肽預(yù)期將在鼻處理后下調(diào)對這些肽的反應(yīng)性。測定這種反應(yīng)性的方法包括用所述肽攻擊動(dòng)物，定量DTH反應(yīng)引起的爪腫脹。Balb/c小鼠的肽免疫產(chǎn)生對HC gp-39肽263-275的免疫應(yīng)答。因此，為了檢測DTH反應(yīng)，能用HC gp-39 263-275攻擊HC gp-39免疫的小鼠。為了描述修飾的肽的體內(nèi)致耐受性，可以每個(gè)鼻孔用不同濃度的HC gp-39 263-275或肽衍生物處理小鼠。在耐受誘導(dǎo)方面具有較好分布圖的修飾的肽衍生物預(yù)計(jì)在比最初肽更低的濃度時(shí)在體內(nèi)測定中有活性。為了能定量檢測用天然肽相比修飾肽衍生物誘導(dǎo)耐受的作用，可測試不同施用方案和劑量。最后，可以在該模型中研究HC gp-39 263-275的修飾形式在下調(diào)HC gp-39 263-275誘導(dǎo)的DTH反應(yīng)方面是否比天然263-275肽更有效。
施用高劑量或低劑量的耐受原或根據(jù)本發(fā)明的肽可實(shí)現(xiàn)耐受。耐受原或肽的量取決于施用途徑、施用時(shí)間、患者年齡以及總體健康狀況和飲食。
通?？墒褂妹縦g體重0.01-1000μg肽或蛋白質(zhì)、優(yōu)選地0.05-500μg、更優(yōu)選地0.1-100μg肽或蛋白質(zhì)的劑量。
本發(fā)明的另一方面在于含有一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽和一種藥學(xué)可接受的載體的藥用組合物。
藥學(xué)可接受的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，包括，例如無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和水。其它載體可以是，例如(如果希望包埋于脂質(zhì)體中時(shí))MHC II類分子。
另外，根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物也可含有一種或多種佐劑。合適的佐劑包括氫氧化鋁、磷酸鋁、amphigen、生育酚、單苯膦基脂類A、胞壁酰二肽和皂甙如Quill A。佐劑的量取決于佐劑本身的性質(zhì)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物也可含有一種或多種穩(wěn)定劑，如碳水化合物，包括山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖；蛋白質(zhì)，如白蛋白或酪蛋白；緩沖液，如堿性磷酸鹽。
合適的施用途徑有肌內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射、口服和鼻內(nèi)施用?？趫?bào)和鼻內(nèi)施用是優(yōu)選的施用途徑。特別是，經(jīng)粘膜(如鼻粘膜)施加抗原可產(chǎn)生抗原特異的調(diào)節(jié)細(xì)胞。粘膜施用抗原已顯示可誘導(dǎo)對該抗原的免疫耐受。
根據(jù)本發(fā)明的肽也極適合于在診斷方法中使用，用以檢測參與關(guān)節(jié)軟骨慢性炎癥的活化自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在。
根據(jù)本發(fā)明的診斷方法包括下列步驟a)從個(gè)體的血樣中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，
b)在合適的條件下培養(yǎng)該P(yáng)BMC，c)在根據(jù)本發(fā)明的自身抗原或其衍生的一種或多種肽存在下，溫育該P(yáng)BMC培養(yǎng)物，和d)檢測T細(xì)胞反應(yīng)，例如增殖反應(yīng)，表明在個(gè)體中存在激活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。
在通過測定自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)檢測應(yīng)答時(shí)，用放射性同位素(如3H-胸苷)的摻入測量增殖。PBMC中存在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的應(yīng)答也能通過用細(xì)胞因子特異的ELISA測定細(xì)胞因子釋放或用51鉻釋放測定細(xì)胞毒性來檢測。另一種檢測方法是通過FACS分析測定激活標(biāo)記物(如Il-2R)的表達(dá)。因此含有一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽和合適的檢測劑的診斷組合物構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。根據(jù)檢測類型，檢測劑可以是放射性同位素、酶或細(xì)胞表面特異的抗體或激活標(biāo)記物。
本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括含有一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽的檢測試劑盒。這些檢測試劑盒適用于根據(jù)本發(fā)明的診斷方法。
因此，根據(jù)本發(fā)明，HC gp-39衍生的修飾肽能用來下調(diào)自身免疫病。
下列實(shí)施例是為了說明本發(fā)明，絕不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。
圖例

圖1用照射的自體PBMC作為APC，在用先導(dǎo)肽或選擇的修飾肽刺激后克隆235的增殖如實(shí)施例15所述測定。檢測這些肽在0、0.4、2、10和50μg/ml濃度時(shí)的刺激活性。顯示了用先導(dǎo)肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(實(shí)心圓形)、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(實(shí)心正方形)、Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(空心圓形)或Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(空心正方形)刺激后235克隆的應(yīng)答。
表2雜交瘤測定(第一組試驗(yàn))+＝化合物以相當(dāng)于或優(yōu)于未修飾的263-275肽的方式刺激所有3種雜交瘤。+*＝1種或2種雜交瘤但不是所有3種雜交瘤所證明的激動(dòng)劑活性。人克隆的反應(yīng)性(克隆235和243的增殖)的效價(jià)(類似物的刺激活性/先導(dǎo)肽的刺激活性；例如HC gp-39(263-275))。-＝效價(jià)＜0.6，+＝效價(jià)0.6-12，++＝效價(jià)＞12-100，+++＝效價(jià)＞100。檢測了Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3(OCH2CH2)3-OCH2C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH結(jié)合HLA-DRB1*0401的親和力，并與先導(dǎo)肽(H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH)的親和力進(jìn)行了比較。最具活性的化合物(Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2)顯示與HLA-DRB1*0401結(jié)合的相對親和力相當(dāng)于最初的肽的親和力。
實(shí)施例實(shí)施例1H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(1)Millipore 9050 PepSynthesizer的反應(yīng)容器加有在N-甲基-吡咯烷酮(NMP)中預(yù)溶脹的0.5g Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS(可從PerSeptiveBiosystems購得，0.20mmol/g)樹脂。用哌啶/DMF(1∶4v/v)在每一偶聯(lián)循環(huán)中去除Fmoc基團(tuán)。通過光譜分析每次延伸步驟后的Fmoc-切割測定偶聯(lián)效率。在每個(gè)偶聯(lián)步驟中使用合適的酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)Fmoc氨基酸的4個(gè)相當(dāng)物。使用合成儀的雙注射器模型，其中一個(gè)注射器含有0.50MHATU的DMF溶液，另一個(gè)注射器含有1.0MDIPEA的DMF溶液。主要洗滌液含有N-甲基-吡咯烷酮與0.1％HOBt。使用類似物合成方案。在除去最后的Fmoc基團(tuán)后，從反應(yīng)容器中取出含有固定肽的樹脂，并用DMF(20mL)、CH2Cl2(20mL)、二乙醚(20mL)、CH2Cl2(20mL)、二乙醚(20mL)、CH2Cl2(20mL)和二乙醚(20mL)順序洗滌。固定的肽真空干燥過夜。然后用10mL混合物TFA(iPr)3SiH/茴香醚/H2O 88/5/5/2v/v/v/v切割肽3小時(shí)。在這一步驟中，也去除所有酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基。溶劑蒸發(fā)后，肽用200mL乙醚沉淀。傾析乙醚層，肽用額外量(2×200mL)的醚洗滌。粗肽然后用氮流干燥，并凍干。肽的純化用PrepPak柱40-100mm Delta-PaKTMC1815μm100A反相柱通過HPLC層析進(jìn)行。流動(dòng)相由20％磷酸緩沖液pH2.1和乙腈梯度和水的混合物組成，如以下分析所示。肽用4‰乙酸水溶液通過HPLC脫鹽。凍干純化的產(chǎn)物。
流動(dòng)相A0.5 moL/L NaH2PO4+H3PO4，pH＝2.1BH2OCCH3CN/H2O＝3/2(v/v)梯度A20％；B80％→20％；C0％→60％40分鐘。
產(chǎn)量68mg；HPLC純度90.1％；MSMW＝1346，這與分子式C55H89ClN16O21一致；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量74.8％；離子層析磷酸鹽0.6％，乙酸鹽0.6％，氯化物3.4％(w/w)。
實(shí)施例2H2N-(CH2)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(2)肽用固相肽化學(xué)合成，如同化合物1的合成中報(bào)道的(見上)。在這種情況中，使用可購得的Fmoc-氨基酸五氟苯基(Pfp)活性酯代替游離Fmoc-氨基酸和HATU/DIPEA。用由6-氨基-己酸獲得的6-Fmoc-氨基-己酸作為N端氨基酸制備化合物，類似于文獻(xiàn)報(bào)道的方法(A.Marston，E.Hecker，Z.Naturforsch.B Anorg.Chem.Org.Chem.，381015-1021，1983)。載體是Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS(0.75g，0.170mmol/g)，使用合適的Pfp酯的3種相當(dāng)物。為了偶聯(lián)6-Fmoc-氨基-己酸，用PyBOP作為偶聯(lián)劑(199mg)。標(biāo)準(zhǔn)方法(實(shí)施例1)中報(bào)道的操作產(chǎn)生168mg粗產(chǎn)物。通過HPLC純化(磷酸鹽系統(tǒng)pH＝2.1，CH3CN-H2O梯度)。產(chǎn)物用5‰乙酸水溶液通過HPLC脫鹽，凍干，得到34mg需要的肽。
HPLC純度99.6％；MSMW＝1268，這與分子式C55H89N13O21一致；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量67.3％；離子層析磷酸鹽10％(w/w)。
實(shí)施例3H2N-(CH2)6-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(3)肽3以與N端同系物2相同的方法制備，使用7-Fmoc-氨基-庚酸(3a，類似于化合物2a制備的A.Marston，E.Hecker，Z.Naturforsch.BAnorg.Chem.Org.Chem.，381015-1021，1983)作為N端氨基酸。載體是Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS(1.0g，0.17mmol/g)。如標(biāo)準(zhǔn)方法(實(shí)施例1)中報(bào)道的操作、HPLC純化和脫鹽產(chǎn)生45mg需要的肽。
HPLC純度95.0％；MSMW＝1282，這與分子式C56H91N13O21一致；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量87.4％；離子層析乙酸鹽0.2％(w/w)。
實(shí)施例4(N-甲基-煙酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(4)在制備肽4之前，用文獻(xiàn)報(bào)道的方法(M.L.Tedjamulia，P.C.Srivastava，F(xiàn).F.Knapp；J.Med.Chem.281574-1580，1985)合成原材料N-琥珀酰亞胺(1-甲基-3-吡啶并)碘甲酸(4a)?；衔?的合成在溶液中進(jìn)行。通過實(shí)施例1的SPPS法制備的肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(4b，26mg，0.02mmol)在DMF/H2O(1/99v/v，10mL)中溶解，加入DIPEA/DMF(1/1，v/v)使pH＝9。然后分兩部分加入N-琥珀酰亞胺(1-甲基-3-吡啶并)碘甲酸(4a，0.056g.0.15mmol)。加入幾滴DIPEA/DMF(1/1，v/v)使pH保持在pH＝9?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?個(gè)小時(shí)，然后用10mL H2O和5mL磷酸緩沖液pH＝2.1稀釋。立即用如前所述(實(shí)施例1)的磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)經(jīng)HPLC純化產(chǎn)物。用5‰乙酸溶液脫鹽和凍干產(chǎn)生14mg需要的肽4。
HPLC純度98.1％；MSMW＝1430；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量56.3％；離子層析氯化物1.4％，磷酸鹽1.0％，三氟乙酸鹽0.8％，乙酸鹽0.3％(w/w)。
實(shí)施例5脫氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(5)肽5按照以上對于化合物1所述的方法合成，使用Fmoc-保護(hù)的氨基酸、HATU、DIPEA和1.0g Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS-樹脂，載體負(fù)載0.17mmol/g。在最后一個(gè)步驟中，脫氨基-Arg(Adoc)2-OH(5a)與固定的肽鏈偶聯(lián)。按照已知的方法制備羧酸5a(R.Presentini，G.Antoni，Int.J.Pept.Protein Res.，27123-126，1986)。操作和純化條件與肽1相同。
產(chǎn)量58mg；HPLC純度91.1％；MSMW＝1296；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量76.2％；離子層析磷酸鹽0.4％，三氟乙酸鹽0.6％，乙酸鹽0.2％(w/w)。
實(shí)施例6脫氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(6)肽6的裝配以類似于前述肽5的方式進(jìn)行，使用PAL-PEG-PS樹脂(0.17mmol/g)代替PAC-PEG-PS作為固體載體。在這種情況中，從可購得的(PerSeptive Biosystems)Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上除去Fmoc基團(tuán)，得到的H-PAL-PEG-PS載體與Fmoc-Gly-OH在HATU/DIPEA的介導(dǎo)下縮合。在與實(shí)施例1所述相同的條件下延長肽鏈并隨后從樹脂上切下后，獲得需要的氨甲酰C端。操作和純化條件與肽1相同。
產(chǎn)量43 mg；HPLC純度91.3％；MSMW＝1295；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量76.5％；離子層析氯化物0.5％，乙酸鹽4.0％(w/w)。
實(shí)施例7CH3(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(7)為了合成肽7，首先按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法(A.H.Haines，P.Karntiang，Carbohydr.Res.，78205-211，1980)制備原材料CH3(OCH2CH2)3-OCH2-CO2H(7a)。保護(hù)的和固定的肽H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(7b)的合成如實(shí)施例2所示用氨基酸Pfp酯進(jìn)行。樹脂上的肽(7b)在NMP中預(yù)溶脹，加入142mg(0.64mmol)CH3(OCH2CH2)3-OCH2CO2H(7a)，以及169mg(0.64mmol)偶聯(lián)劑TFFH(四甲基氟-甲酰氨鎓(formamidinium)六氟磷酸鹽)。合并的試劑在de Pepsynthesizer中循環(huán)60分鐘。從樹脂上的切割和操作如實(shí)施例5所述進(jìn)行。粗肽然后用實(shí)施例1所述的系統(tǒng)和溶劑通過HPLC純化。產(chǎn)物用2.5‰AcOH在HPLC柱上脫鹽。
產(chǎn)量120mg；HPLC純度78％；MSMW＝1515；離子層析氯化物0.1％，磷酸鹽0.3％，三氟乙酸鹽4.0％，乙酸鹽0.3％(w/w)。
實(shí)施例8D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(8)
在裝配N端修飾的肽8之前，根據(jù)實(shí)施例1制備肽H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS(8a)，其具有與肽7b相同的序列，但接頭類型不同(PAC代替PAL)。用NaBH(Oac)3(212mg，1.0mmol)作為還原劑，通過用固定的溶于DMF/HOAc(99/1，v/v，10mL)的肽8a(500mg，0.2mmol/g)過夜處理6-O-三苯甲基-α/β-D-吡喃葡萄糖(8b，422mg，1.0mmol，T.Utamura，K.Kuromatsu，K.Suwa，K.Koizumi，T.Shingu，Tetsuro；Chem.Pharm.Bull.342341-2353，1986)，實(shí)現(xiàn)還原性胺化。然后利用實(shí)施例1所述的條件，從樹脂上切下產(chǎn)生的完全保護(hù)的衍生物(6-O-三苯甲基-D-1-葡糖基)-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS，同時(shí)除去三苯甲基和所有的氨基酸保護(hù)的基團(tuán)，在通過制備HPLC純化并用5‰ HOAc水溶液脫鹽后得到38mg靶肽8。
HPLC純度84.7％；MSMW＝1475；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量61.0％；離子層析氯化物0.1％，乙酸鹽1.7％(w/w)。
實(shí)施例9MeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(9)通過將固定的肽H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS (8a)懸浮在二噁烷中，并冷卻到0℃，開始肽9的合成。向該懸液中加入100μl 4N NaOH水溶液和100μl氯甲酸甲酯。反應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)，隨后用EtOH/H2O、EtOH、CH2Cl2和乙醚洗滌樹脂。真空干燥后，從樹脂上切下產(chǎn)物，如以前肽合成(實(shí)施例1)所述純化。最后，肽用5‰乙酸水溶液經(jīng)HPLC脫鹽，然后凍干，得到肽9。
產(chǎn)量11mg；HPLC純度96.8％；MSMW＝1368；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量60.5％；離子層析氯化物2.0％，磷酸鹽0.2％，乙酸鹽0.4％(w/w)。
實(shí)施例10Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(10)在合成肽10之前，用已知的方法(J.-P.Meyer，P.Davis，K.B.Lee，F(xiàn).Porreca，H.I.Yamamura，V.Hruby，J.Med.Chem.383462-3468，1995)制備需要的氨基酸醛構(gòu)件Fmoc-Leu-H(10a)。使用沒有進(jìn)一步純化的化合物10a。根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，樹脂用一個(gè)8-氨基酸肽鏈功能化，產(chǎn)生H-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(10b)。固定的衍生物(1g，0.2mmol/g)在5mL1％乙酸DMF溶液中懸浮。制備兩種溶液148mg Fmoc-Leu-H(10a)在2.5mL DMF中的溶液和30mg NaCNBH3在2.5mL DMF中的溶液。合并這兩種溶液，加入肽10b的懸液中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜。隨后，用Boc2O和吡啶保護(hù)這樣獲得的中間物Fmoc-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(10c)的新引入的仲胺功能基。將樹脂結(jié)合的肽10c在10mL干CH2Cl2中懸浮，加入35mg(0.16mmol)Boc2O和13μl(0.16mmol)吡啶。pH保持在pH＝8，吡啶和混合物攪拌過夜。操作包括用CH2Cl2、EtOH、CH2Cl2、醚洗滌樹脂并真空干燥。用Fmoc氨基酸和以NMP作為溶劑的HATU/DIPEA方法(實(shí)施例1)通過SPPS繼續(xù)合成。最后一步包括與4-硝基苯乙酸偶聯(lián)，引入N端乙?；?。在如實(shí)施例1所述的操作后，經(jīng)HPLC純化粗肽，用5‰乙酸脫鹽，凍干，得到靶肽10。
產(chǎn)量28mg；HPLC純度76.3％；MSMW＝1339；離子層析三氟乙酸鹽1.2％，乙酸鹽2.0％(w/w)。
實(shí)施例11Ac-Arg-Ser-Phe-ψ[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(11)肽11的合成包括Fmoc-Phe-H(11a，J.-P.Meyer，P.Davis，K.B.Lee，F(xiàn).Porreca，H.I.Yamamura，V.Hruby，J.Med.Chem.，383462-3468，1995)與通過實(shí)施例1所述SPPS方法獲得的樹脂結(jié)合的保護(hù)肽H-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(11b)還原性偶聯(lián)。肽11b(1.0g，0.2mmol/g)和醛11a(200mg)在5mL1％乙酸/DMF中懸浮，立即加入溶于5mL DMF中的30mg(0.48mmol)NaCNBH3。攪拌混合物16小時(shí)，導(dǎo)致Fmoc-Phe-ψ[CH2NH]-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS的形成。然后利用實(shí)施例8所述的HATU/DIPEA SPPS方法用合適的Fmoc-氨基酸和N端乙?；瘎┭娱L肽鏈。操作、HPLC-純化和脫鹽如實(shí)施例1所述進(jìn)行。
產(chǎn)量52mg；HPLC純度97.9％；MSMW＝1338；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量92.4％；離子層析乙酸鹽2.5％(w/w)。
實(shí)施例12Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(12)對于該化合物的合成，在樹脂上用Fmoc-Val-H進(jìn)行還原性烷化是不可能的。因此，在固定于樹脂上之前，在溶液中制備二肽類似物Fmoc-Val-ψ[CH2NH]-Gly-OH(12d)。
Fmoc-Val-ψ[CH2NH]-Gly-Obzl(12c)Fmoc-Val-H(12a，3.16g，10mmol，按照T.Moriwake，S.-I.Hamano，S.Saito，S.Torii，S.Kashino，J.Org.Chem.，544114-4120，1989制備)在EtOH/HOAc(80mL，99/1，v/v)中溶解，加入HCl.H-Gly-Obzl(12b，2.02g，10mmol)，隨后加入NaCNBH3(0.94g，15mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。隨后，加入5％NaHCO3水溶液(20mL)，中和反應(yīng)混合物。然后真空濃縮該混合物，用CH2Cl2抽提殘余物。合并的有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，在Na2SO4上快速干燥，過濾，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生黃色的油。在通過硅膠層析純化后(洗脫液CH2Cl2中的0-4％甲醇)，分離化合物12c，為白色固體。產(chǎn)量1.85g(39％)。分析TLC(硅，CH2Cl2/MeOH 98/2)Rf＝0.45，MSMW＝472。
Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-Obzl(12d)Fmoc-Val-ψ[CH2NH]-Gly-Obzl(12c，0.910g，1.93mmol)、Boc2O(0.420g，1.93mmol)和DIPEA(0.336g，1.93mmol)溶解于無水CH2Cl2(20mL)中。加入DIPEA使pH保持堿性，混合物在室溫下攪拌過夜。然后加入10％KHSO4酸化反應(yīng)混合物。加入水，用CH2Cl2抽提水層。合并的有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，在MgSO4上快速干燥，蒸發(fā)溶劑，得到0.96g(97％)12d。分析TLC(硅，CH2Cl2/MeOH 98/2)Rf＝0.55；MSMW＝572。
Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-OH(12e)Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-Obzl(12d，0.97g，1.70mmol)溶解在MeOH/EtOAc(1/1，v/v，100mL)混合液中，在正常壓力下用10％Pd/C氫化2小時(shí)。過濾掉鈀催化劑，濃縮濾液，得到為淡黃色油的羧酸12e。產(chǎn)量0.661g(81％)。分析TLC(硅，CH2Cl2/MeOH/AcOH 90/9/1)Rf＝0.42；MSMW＝482。
利用HATU/DIPEA雙注射器模式并與HATU/DIPEA雙偶聯(lián)的肽合成儀，將化合物Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-OH(12e)(0.661g，1.37mmol)加到PAL-PEG-PS樹脂上(1.5g，0.15mmol/g，0.225mmol)。取代水平用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc切割方法測定，為0.13mmol/g加樣樹脂(產(chǎn)量87％)。用HATU/DIPEA SPPS法(實(shí)施例1)，經(jīng)過對于每種Fmoc-氨基酸60分鐘的雙濃縮步驟，使得到的肽H-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS(12f)進(jìn)一步延長。類似于肽9和肽11，用4-硝基苯乙酸引入N端乙?；２僮鳌⒓兓兔擕}如實(shí)施例1所述進(jìn)行。
產(chǎn)量17mg；HPLC純度80.1％；MSMW＝1338；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量63.7％；離子層析氯化物1.0％，磷酸鹽0.2％，乙酸鹽0.2％(w/w)。
實(shí)施例13Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(13)為了合成肽13，首先制備必需的類肽單體Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13e)。
Z-2-氨基乙基-叔丁醚(13a)將3.25g MgSO4(27mmol)懸浮于80mL CH2Cl2(干)中。在N2下加入1.5mL濃H2SO4(方法S.W.Wright，D.L.Hageman，A.S.Wright，L.McClure，Tetrahedron Lett.，387345-7348，1997)?；旌衔飻嚢?5分鐘，之后加入溶解于CH2Cl2(20mL)中的叔BuOH(12.9mL)和可購得的Z-2-氨基乙醇(5.28g，27mmol)。攪拌5天后，向反應(yīng)混合物中加入200mL 5％NaHCO3水溶液，攪拌直到所有MgSO4溶解。分離層，CH2Cl2層用鹽水洗滌。有機(jī)層在MgSO4上干燥，過濾，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生5.6g粗13a。產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(洗脫液庚烷/EtOAc 3∶1v/v)。產(chǎn)量為5.00g(78％)。1HNMR(CDCl3)δ1.15(s，9H，tBu)，3.3-3.5(dt，4H，2×CH2)，5.1(bs，2H，CH2Bzl)，7.4(m，5H，Ar).
2-氨基乙基-叔丁醚.HCl(13b)向5.00g芐酯13a在乙酸乙酯(150mL)的溶液中加入225mg 10％Pd/C，用H2鼓泡2小時(shí)。過濾掉催化劑，加入15mL 1M HCl水溶液。蒸發(fā)溶劑，加入小體積的乙醚。過濾出沉淀的產(chǎn)物13b，真空干燥。產(chǎn)量2.35g(77％)。NMR(CDCl3)δ1.20(s，9H，tBu)，3.15(t，2H，CH2)，3.65(t，2H CH2)，8.1-8.4(bs，2H，NH2)N-(2-叔丁氧基乙基)-甘氨酸(H-NhSer(tBu)-OH)(13c)向13b(2.30g，15mmol)在25mL H2O的溶液中加入1.40g(15.2mmol)二羥乙酸.H2O。用1.0M NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)為pH＝6。向該溶液中加入230mg Pd/C，以45psi H2壓力攪拌該反應(yīng)混合物過夜。過濾掉催化劑，用5mL H2O洗滌。在下一步中使用未進(jìn)一步純化的含有13c的濾液。
Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)用1N NaOH使溶解于H2O中的反應(yīng)產(chǎn)物13c達(dá)到pH＝9.5。堿性溶液用25mL丙酮稀釋，逐滴加入溶解于25mL丙酮中的5.40g(16mmol)Fmoc-Osu。用1N NaOH使pH保持在pH＝9.5。在攪拌過夜后，將反應(yīng)混合物濃縮為150mL，用2×50mL乙醚/庚烷(1/1，v/v)洗滌。H2O層用20％檸檬酸酸化為pH＝2.5，并用100mL乙酸乙酯抽提3次。合并有機(jī)層，并在Na2SO4上干燥。蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(硅，CH2Cl2/MeOH5/1，v/v)并凍干。產(chǎn)量5.44 g(91％)。1H NMR(CDCl3)δ1.20(s，9H，tBu)，3.2(dt，2H CH2)，3.6-3.7，(dt，2H，CH2)，4.05(s，2H，CH2CO2H)，4.2(b，1HFmoc)，4.4-4.6(2H，2×d，F(xiàn)moc)，7.3-7.8(m，8H，ArH，F(xiàn)moc).
肽13的合成如前所述(實(shí)施例1)用雙注射器技術(shù)在Pepsynthesizer上進(jìn)行。載體是Fmoc-PAL-PEG-PS(1.0 g，0.15 mmol/g)，用NMP作為溶劑。對所有氨基酸都使用雙偶聯(lián)(偶聯(lián)時(shí)間60分鐘)，包括Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)。用4-硝基苯乙酸引入N端乙酰基。操作和從樹脂上切除和保護(hù)基團(tuán)以標(biāo)準(zhǔn)方法(實(shí)施例1)進(jìn)行。粗肽經(jīng)HPLC純化，并用5‰乙酸水溶液脫鹽。
產(chǎn)量50mg；HPLC純度98.6％；MSMW＝1366；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)需要量的所有氨基酸；肽含量82.1％；離子層析氯化物0.3％，乙酸鹽1.3％(w/w)。
實(shí)施例14Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(14)用HATU/DIPEA方案在Pepsynthesizer上進(jìn)行合成(實(shí)施例1)。前述功能化的樹脂H-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS(12f)和保護(hù)的類肽Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)用作構(gòu)件。如前所述，使用雙注射器技術(shù)和每次偶聯(lián)60分鐘的雙偶聯(lián)。在Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)偶聯(lián)之前終止合成儀上的肽鏈延長，該氨基酸在與固定的肽鏈(H-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-PAL-PEG-PS)偶聯(lián)之前通過超聲處理溶解在DMSO中。通過剩余的(Arg)氨基酸的縮合和利用4-硝基苯乙酸的乙?；瓿珊铣?。肽的操作、純化和脫鹽為標(biāo)準(zhǔn)方法，如實(shí)施例1所述。凍干產(chǎn)生47mg肽14。
HPLC純度72.9％；MSMW＝1352；離子層析三氟乙酸鹽5.5％(w/w)。
實(shí)施例15利用抗原特異的T細(xì)胞雜交瘤對激動(dòng)劑肽的預(yù)選擇(第一組試驗(yàn))為了檢測修飾的肽的激動(dòng)劑活性，使用3種不同的HC gp-39(263-275)-特異性雜交瘤細(xì)胞系(5G11、8B12和14G11)。具有DRB1*0401特異性的5×104個(gè)雜交瘤細(xì)胞和2×105個(gè)照射的(12000 RAD)EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞在圓底微量板孔中以150μl體積中溫育。向雙份孔中加入50μl的肽抗原(HC gp-39(263-275)和修飾的肽)。48小時(shí)后利用使用小鼠IL-2特異的Pharmingen抗體的夾心ELISA測定100μl培養(yǎng)上清液的抗原特異性IL-2的產(chǎn)生。
利用抗原特異性T細(xì)胞克隆對激動(dòng)劑肽的選擇(第二組試驗(yàn))從來自肽263-275的RA反應(yīng)者的肽特異性T細(xì)胞系中分離243 T細(xì)胞克隆(RA患者243)。在DRB1*0401匹配的PBMC的存在下，經(jīng)過用HC gp-39(263-275)肽4次重復(fù)刺激獲得這些克隆。從獲自HLA-DRB1*0401-陽性供體的肽刺激的T細(xì)胞系中分離H235 T細(xì)胞克隆。在DRB1*0401匹配的PBMC的存在下用肽HC gp-39(261-275)2次刺激后，通過PHA克隆獲得這些克隆。發(fā)現(xiàn)克隆243和235在肽抗原識(shí)別方面是HLA-DRB1*0401限制性的。在每次實(shí)驗(yàn)中，在刺激后的第10-14天使用這些細(xì)胞。
通過在平底微量板中在150μl含10％正常人集合血清的培養(yǎng)基中(NHS，CLB，Amsterdam，荷蘭)中，將2×104個(gè)T細(xì)胞與105個(gè)DRB1*0401-匹配的(3,000 Rad照射的)PBMC溫育，測定克隆243或克隆235的增殖反應(yīng)。50μl抗原溶液(含有263-275序列或如述的修飾)分配于三份孔中。在溫育的第2天或第3天加入3H-胸苷。在玻璃纖維濾器上收集細(xì)胞，測定摻入的放射性。
結(jié)果表2所列的大多數(shù)修飾的肽能以相當(dāng)于先導(dǎo)肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH的方式刺激所有3種T細(xì)胞雜交瘤。然而，某些肽不能刺激所有3種雜交瘤，這說明了使用的雜交瘤在特異性上的不同。
當(dāng)檢測這些激動(dòng)劑刺激兩種人T細(xì)胞克隆的能力時(shí)，所測化合物在效價(jià)上的不同變得明顯(表2)。大多數(shù)修飾的化合物誘導(dǎo)克隆235和克隆243的反應(yīng)。一種化合物(Ac-Narg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2)不能誘導(dǎo)任一種克隆的增殖反應(yīng)。三種化合物(H-β高精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-ψ[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2)只對一種克隆(克隆243或235)有活性。三種化合物(H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H-D-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH和CH3OC(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH)可誘導(dǎo)兩種克隆的增殖反應(yīng)，其數(shù)量級(jí)與先導(dǎo)肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH誘導(dǎo)的反應(yīng)相同。7種化合物(Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3(OCH2CH2)3-OCH2C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、(N-甲基-煙酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2)在誘導(dǎo)一種或兩種克隆的增殖反應(yīng)方面優(yōu)秀。最有效的化合物鑒定是Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(表2和圖1)。
實(shí)施例16大約8-10周齡的雌性Balb/c小鼠(德國Charles River或法國CharlesRiver)在第0天用完全弗氏佐劑(IFA；Sigma Chemicals，St.Louis，USA)中的100μl抗原制品(50μg HC gp-39 263-275)免疫。在小鼠胸區(qū)的兩個(gè)部位皮下施以抗原。在第7天，用0.9％NaCl(NPBI，Emmer Compascuum，荷蘭)稀釋的抗原制品(HC gp-39(263-275))攻擊小鼠，體積為50μl 1mg/ml明礬(Pharmacy Donkers-Peterse，Oss，荷蘭)，部位在足墊單側(cè)(左爪)；另一個(gè)(右)足墊注射50μl明礬在0.9％NaCl中的溶液作為對照。在第8天測定遲發(fā)型超敏反應(yīng)(平均％特異腫脹)，方法是用室內(nèi)設(shè)計(jì)的測微計(jì)，測量左后足墊相對于右后足墊的足墊厚度的增加(左側(cè)腫脹(mm)-右側(cè)腫脹(mm)/右側(cè)腫脹(mm)×100％)。
在第0天用含有IFA中的50μg HC gp-39 263-275的100μl抗原制品免疫前(第-5天)，在異氟烷(Forene，Abbott BV，Amstelveen，荷蘭)麻醉下鼻施用抗原制品(50、10、2或0.4μg(或更低濃度的))HC gp-39(263-275)或修飾的肽衍生物。在這些實(shí)驗(yàn)中，用HC gp-39 263-275免疫和攻擊小鼠，并如上所述測定DTH反應(yīng)。
利用上述測定系統(tǒng)，其中Balb/c小鼠用對HC gp-39(263-275)起反應(yīng)的IFA中的HC gp-39(263-275)免疫，能研究鼻施用HC gp-39(263-275)與施用修飾的肽衍生物相比，對耐受誘導(dǎo)的可能作用。用HC gp-39(263-275)預(yù)處理可下調(diào)HC gp-39(263-275)特異的DTH反應(yīng)；這種作用取決于預(yù)處理過程中使用的肽的劑量。利用相對較高的肽濃度(50μg/小鼠)，鼻施用一劑HC gp-39(263-275)可完全消除DTH反應(yīng)，而一劑2μg/小鼠無效。因此，建立一種方法在HC gp-39(263-275)特異的DTH測定系統(tǒng)中區(qū)別肽的有效(致耐受)和無效劑量。假定基于HC gp-39(263-275)的修飾的肽衍生物在比初始肽更低的濃度下可以有活性，這些肽預(yù)計(jì)可在相對較低的肽濃度時(shí)誘導(dǎo)耐受。按照這一假設(shè)，在這一耐受誘導(dǎo)方法中測試了一系列修飾的肽。在該實(shí)驗(yàn)中(其中誘導(dǎo)可靠的HC gp-39(263-275)反應(yīng)，用50μg而不是2μg HC gp-39(263-275)預(yù)處理能下調(diào)這種反應(yīng))，顯示該肽的特異性修飾在誘導(dǎo)耐受中特別有活性，而其它的沒有(見表3)。表2在第一組(雜交瘤測定)和第二組(人克隆增殖測定)試驗(yàn)中獲得的結(jié)果的概述
表3 DTH試驗(yàn)
1)半致耐受劑量DTH反應(yīng)(特殊實(shí)驗(yàn)中的最大DTH)50％抑制的測試劑量。-不致耐受，ND未進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種由H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(通式I)衍生的修飾的肽，其具有通式Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-Z(通式II)，其中A1至A13對應(yīng)于通式I的氨基酸，Q對應(yīng)于H，Z對應(yīng)于OH，其特征在于1-6個(gè)修飾選自以下a、b或c中的一種或多種a)A1-A13中1-6個(gè)、優(yōu)選地1-4個(gè)氨基酸被非天然氨基酸或β氨基酸替換；b)一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵被還原的酰胺鍵或乙烯等排物取代；c)Q和/或Z處的取代；和任選地，d)總共可達(dá)6個(gè)修飾的天然氨基酸的取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中Q是H、(C1-6)烷基、甲?；?、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)鏈烯氧基羰基、(C6-14)芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，則不含Q；Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基、(C2-6)鏈烯基、芳基(C1-4)烷基、(C4-13)雜芳基(C1-6)烷基，或NR1R2，其中R1和R2分別選自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基；和任選地，Q和Z還含有緊鄰位置A1和/或A3的總共達(dá)10個(gè)氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其中在不超過4個(gè)、優(yōu)選地不超過2個(gè)位置處發(fā)生一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸對A1-A3的取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的肽，其中Q是H、(C1-6)烷基、甲酰基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)鏈烯氧基羰基、芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，則不含Q；A1是L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lys、L-Ala、D-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(R)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)；A2是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)；A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)、D-Phe(X)，其中X獨(dú)立地選自(C1-4)烷基、羥基、鹵素、(C1-6)烷基羰基氨基、氨基或硝基、L-Hfe、D-Hfe、L-Thi、D-Thi、L-Cha、D-Cha、L-Pal(3)、D-Pal(3)、L-1-Nal、D-1-Nal、L-2-Nal、D-2-Nal、L-Ser(Bzl)、D-Ser(Bzl)、(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}中的一個(gè)或多個(gè)；A4是L-Thr、D-Thr-L-Ser-、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly；A5是L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、L-Val、D-Val-、L-Nva、D-Nva、L-Ala、D-Ala、Gly、(R)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}；A6是L-Ala、D-Ala或Gly；A7是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly；A8是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly；A9是L-Glu、D-Glu、L-Asp、D-Asp、L-Ala、D-Ala或Gly；A10是L-Thr、D-Thr、L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly；A11是Gly、L-Ala、D-Ala或-NH-CH2-CH2-；A12是L-Val、D-Val、L-Nva、D-Nva、L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、(R)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(RR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(RS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(SR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-，或(SS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}；A13是Gly、L-Ala或D-Ala，和Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基、(C2-6)鏈烯基、(C6-14)芳基(C1-4)烷基、(C4-13)雜芳基(C1-6)烷基或NR1R2，其中R1和R2獨(dú)立地選自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基，任選地Q和Z還含有緊鄰位置A1和/或A3的總共可達(dá)10個(gè)氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的肽，其中Q是H、(C1-6)烷基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，則不含Q；A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)；A2是L-Ser、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)；A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)或D-Phe(X)(其中X是鹵素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha、L-Pal(3)、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}；A4是L-Thr或L-Ala；A5是L-Leu、L-Ala或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}；A6是L-Ala或Gly；A7是L-Ser或L-Ala；A8是L-Ser或L-Ala；A9是L-Glu或L-Ala；A10是L-Thr或L-Ala；A11是Gly、L-Ala或-NH-CH2-CH2-；A12是L-Val或(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}；A13是Gly或L-Ala，和Z是OR，其中R是H或NR1R2，其中R1和R2獨(dú)立地選自H或(C1-6)烷基，任選地，Q和Z還含有緊鄰位置A1和/或A3的總共可達(dá)10個(gè)氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的肽，其中Q是H、甲基；乙?；?；羧基亞甲基、甲氧基羰基；CH3(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-、D-1-葡糖基、1-甲基-吡啶鎓-3-羰基或1-甲基-吡啶鎓-4-羰基，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-則不含Q；A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-；A2是L-Ser、L-Ala或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-；A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)(其中X是鹵素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha、L-Pal(3)、L-1-Nal、L-2-Nal或L-Ser(Bzl)，和Z是OH、NH2或NHEt，任選地Q和Z還含有緊鄰位置A1和/或A3的總共可達(dá)10個(gè)氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的肽，其中通式是Q-A1-A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11-A12-Gly-Z(通式III)。
8.具有1-4個(gè)修飾的根據(jù)權(quán)利要求1-7的肽。
9.具有2-3個(gè)修飾的根據(jù)權(quán)利要求8的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的肽，其中A1是L-Arg、D-Arg、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)，或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-，A2是L-Ser或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-，A3是L-Phe、L-Phe(X)(其中X是鹵素)、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)、L-Thi、L-Cha或L-Pal(3)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的肽，其中通式是is Q-Arg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z(通式IV)。
12.一種選自下列的肽脫氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、脫氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3-(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-ψ-[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ-[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、H-Arg-Ser-Phe(Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)6-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、(N-甲基-煙酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的肽，用作治療物。
14.含有一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-12的肽和一種藥學(xué)可接受的載體的藥用組合物。
15.一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-12的肽在藥劑生產(chǎn)中的用途，該藥劑用于在自身免疫病，更具體地是關(guān)節(jié)炎患者中誘導(dǎo)對自身抗原的特異性T細(xì)胞耐受。
16.含有一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-12任一的肽和一種檢測劑的診斷組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由H－Arg－Ser－Phe－Thr－Leu－Ala－Ser－Ser－Glu－Thr－Gly－Val－Gly－OH衍生的修飾的肽,其具有通式II:Q－A1－A2－A3－A4－A5－A6－A7－A8－A9－A10－A11－A12－A13－Z。在通式II中,A1至A13對應(yīng)于通式I的氨基酸,Q對應(yīng)于H,Z對應(yīng)于OH。根據(jù)本發(fā)明的修飾選自以下a、b或c中的一個(gè)或多個(gè):a)A1－A13中1－6個(gè)、優(yōu)選地1－4個(gè)氨基酸被非天然氨基酸或β氨基酸取代;b)一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵被還原的酰胺鍵或乙烯等排物取代;c)Q和/或Z處的取代,和任選地,d)總共可達(dá)6個(gè)修飾的天然氨基酸的取代。這些肽能用于在自身免疫病患者中誘導(dǎo)耐受。
文檔編號(hào)A61K38/11GK1379786SQ00814418
公開日2002年11月13日 申請日期2000年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月18日
發(fā)明者C·J·范斯塔維倫, C·M·泰米爾斯, P·J·M·戈倫范, R·M·A·尼格特爾, A·M·H·布特斯, A·M·M·米爾滕布爾格 申請人:阿克佐諾貝爾公司