專利名稱：：中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素的治療性單克隆抗體的制作方法中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素的治療性單克隆抗體與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求享有2005年1月27日提交的USSN60/648,256的優(yōu)先權(quán)和利益，其內(nèi)容在這里為所有目的整體引作參考。關(guān)于在聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)下作出的發(fā)明的權(quán)3'J的聲明本發(fā)明在國立衛(wèi)生研究院(NationalInstituteofHealth)4受予的基金號AI53389和AI56493以及國防部(DepartmentofDefense)基金DAMD17-03-C-0076和DAMD17-98-C-8030的政府支4寺下完成。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素(辨如，BoNT/A)的抗體和它們在治療肉毒中毒中的用途。發(fā)明背景肉毒中毒是由梭菌屬(C/oW/^//ww)的成員分泌的肉毒桿菌神經(jīng)毒素造成的，且其特征在于弛緩性麻痹，其如果沒有立即致命，則需要長期在重病監(jiān)護(hù)病房中住院治療和機(jī)械換氣。天然產(chǎn)生的肉毒中毒發(fā)生在胃腸道被梭菌細(xì)菌定居的嬰兒或成年人中(嬰兒或腸肉毒中毒)，在攝食被污染的食物產(chǎn)品后(食物肉毒中毒)，或在厭氧傷口感染中(傷口肉毒中毒)(CenterforDiseaseControl(1998)BotulismintheUnitedStates,1899-1998.Handbookforepidemiologists,clinicians,andlaboratoryworkers.Atlanta,GeorgiaU.S.DepartmentofHealthandHumanServices,PublicHealthService:下載地址是"www.bt.cdc.gov/agent/botulism/index.asp")。肉毒中毒神經(jīng)毒素(BoNT)也被疾病控制中心(CentersforDiseaseControl)(CDC)歸入生物恐怖主義的6種最高危險的威脅因子("A類因子")之一，這是由于它們的巨大效力和致死率、容易生產(chǎn)和運輸、和需要長期重癥監(jiān)護(hù)(Arnon爭(2001)285:1059-1070)。伊拉克和前蘇聯(lián)都生產(chǎn)了用作武器的BoNT(UnitedNationsSecurityCouncil(1995)Tenthreportoftheexecutivecommitteeofthespecialcommissionestablishedbythesecretary-generalpursuanttoparagraph9(b)(1)ofsecuritycouncilresolution687(1991)，andparagraph3ofresolution699(1991)ontheactivitiesoftheSpecialCommision;Bozheyeva等(1999)FormersovietbiologicalweaponsfacilitiesinKazakhstan:past,present,andfuture.CenterforNonproliferationStudies,MontereyInstituteofInternationalStudies),且日本宗教奧姆真理教(AumShinrikyo)嘗試使用BoNT進(jìn)行生物恐怖主義(Arnon爭(2001)同上)。作為這些威脅的結(jié)果，需要用于預(yù)防和治療中毒的特異性藥物試劑。沒有存在特異性的小分子藥物可以用于預(yù)防或治療肉毒中毒，但是從CDC可以得到用于研究的五價類毒素疫苗(Siegel(1988),C//".M/cro^W.26:2351-2356),且重組疫苗正在開發(fā)中(Smith(1998)rox/co"36:1539-1548)。無論如何，由于疾病或暴露的稀少，和接種疫苗將阻止BoNT的隨后的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的事實，大規(guī)模平民或軍人接種疫苗是不可能的。由于疾病的快速發(fā)作，暴露后的接種疫苗是無用的。毒素中和抗體(Ab)可以用于暴露之前或之后的預(yù)防，或用于治療(Franz爭(1993)Pp.473-476InB.R.DasGupta(編)，BotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects.PlenumPress,NewYork)。存在小量的馬抗毒素和人肉毒桿菌免疫球蛋白，且其目前分別用于治療成年人(Black和Gunn.(1980)Jm.丄，69:567-570;Hibbs爭(1996)C//".23:337-340)和嬰兒肉毒中毒(Arnon(1993).Clinicaltrialofhumanbotulismimmuneglobulin,,p.477-482.InB.R.DasGupta(編)，BotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects.PlenumPress,NewYork)。重組單克隆抗體(mAb)可以無限地提供抗毒素，其沒有感染性疾病危險，且不需要人供體進(jìn)行血漿去除術(shù)。鑒于BoNT的極端致死率，mAb必須是高效力的，以在合理的成本提供足夠數(shù)目的劑量。這樣的mAb的開發(fā)，已經(jīng)成為國家變態(tài)反應(yīng)和傳染病研究所(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases)的最高優(yōu)先的研究目標(biāo)。盡管迄今為止尚未描述一種非常有效的mAb，但我們最近報道了，組合2-3種mAb，可以產(chǎn)生非常有效的BoNT中和(Nowakowski爭(2002)戶roc.淑/.ytec/.t/SA99:11346-50)。存在至少7種BoNT血清型(A-G)的事實，使肉毒中毒的mAb療法的開發(fā)變得復(fù)雜(Hatheway(1995)Cr./mmw"o/,I95:55-75.)，所述血清型即使有的話，也表現(xiàn)出微弱的抗體交叉反應(yīng)性。盡管僅僅4種BoNT血清型常規(guī)造成人疾病(A、B、E和F),但已經(jīng)出現(xiàn)了由BoNTC造成的嬰兒肉毒中毒的一個報道病例(Oguma爭(1990)Z^"c"336:1449-1450)，與BoNTD有關(guān)的一次食物傳播的肉毒中毒爆發(fā)(Demarchi,爭(1958)Sm〃.^cadA^f.A/et/.，142:580-582)，以及其中分離出BoNTG的幾個可疑死亡病例(Sonnabend爭(1981)D".，143:22-27)。還已經(jīng)表明，氣溶膠化的BoNT/C、D和G通過吸入途徑，在靈長類動物中產(chǎn)生肉毒中毒(Middlebrook和Fmnz(1997)BotulinumToxins,chapter33.InF.R.Sidell，E.T.Takafuji，D.R.Franz(編),MedicalAspectsofChemicalandBiologicalWarfare.TMMpublications,Washington,D.C.),且最可能也影響人類。因而，7種BoNT血清型中的任一種都可能用作生物威脅因子。還已經(jīng)報道了血清型中的BoNT基因和蛋白序列的變異性，且有證據(jù)表明，這樣的變異性可以影響單克隆抗體與BoNT/A的結(jié)合(Kozaki等(1998)/mmim.，66:4811-4816;Kozaki等(1995)M/cra6/o/./wm簡o/.，39:767-774)。現(xiàn)在尚不清楚不同血清型內(nèi)的這種毒素變異性的程度，也不清楚它對單克隆抗體組的結(jié)合和中和能力的影響。發(fā)明概述本發(fā)明涉及結(jié)合和中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素的抗體。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用高親和力地結(jié)合特定神經(jīng)毒素血清型的2種或更多種亞型的中和抗體，可以特別有效地中和肉毒中毒神經(jīng)毒素(BoNT)血清型。盡管這可以通過使用針對每種亞型的2種或更多種不同抗體來實現(xiàn)，但在某些實施方案中，通過使用一種或多種抗體，其中每種抗體可與至少2種BoNT亞型交叉反應(yīng)，可以達(dá)到甚至更有效的中和。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含可以高親和力地結(jié)合2種或更多種BoNT亞型(辨如，BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3爭)的中和抗體。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了中和哺乳動物(辨如，乂)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法。該方法通常包含，給所述哺乳動物施用BoNT血清型的至少2種不同中和抗體，其中2種抗體中的至少一種以大于約10nM的親和力結(jié)合所述BoNT血清型(辨如，BoNT/A、BoNT/B、BoN丁/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F爭)的至少2種不同亞型。在某些實施方案中，至少一種抗體結(jié)合選自下述的至少2種不同亞型BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4，分別以大于約10nM的親和力。在某些實施方案中，至少一種抗體結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2，分別以大于約10nM的親和力。在某些實施方案中，兩種抗體同時結(jié)合至少一種、優(yōu)選至少2種亞型。在某些實施方案中，所述抗體各自包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個選自下述的CDR:RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CRlVLCDR1、CRlVLCDR2、CRlVLCDR3、CR1VHCDR1、CRlVHCDR2、CRlVHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2和ING2VHCDR3(參i，辨如，圖18和26,表2和/或表13爭)。在各種實施方案中，所述抗體各自包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDR1、CDR2和CDR3,所述VH結(jié)構(gòu)域選自RAZ1VH結(jié)構(gòu)域、CRlVH結(jié)構(gòu)域、ING1VH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域。在各種實施方案中，所述抗體各自包含均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZ1VL結(jié)構(gòu)域、CR1VL結(jié)構(gòu)域、CR2VL結(jié)構(gòu)域、ING1VL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述抗體各自包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDR1、CDR2和CDR3,所述VH結(jié)構(gòu)域選自RAZ1VH結(jié)構(gòu)域、CR1VH結(jié)構(gòu)域、CR2VH結(jié)構(gòu)域、ING1VH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域；和均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZ1VL結(jié)構(gòu)域、CR1VL結(jié)構(gòu)域、CR2VL結(jié)構(gòu)域、ING1VL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，至少一種所述抗體包含選自下述抗體的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3:RAZ1、CR1、ING1和ING2。在各種實施方案中，至少一種抗體是單鏈Fv(scFv)、IgG、IgA、IgM、Fab、(Fab')2或(scFv')2。在某些實施方案中，至少一種所述抗體選自RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、2G11、3D12和5G4。在各種實施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗體，其特異性地結(jié)合被選自下述的抗體特異性地結(jié)合的表位C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WR1(T)、3腸1、3-8、3-10、ING1、CR1、CR2、RAZ1和/或ING2。在某些實施方案中，所述抗體結(jié)合和中和一種、或優(yōu)選2種或更多種肉毒桿菌神經(jīng)毒素亞型(辨如，BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3爭)。所述抗體實際上可以是任意哺乳動物類型(辨如小鼠、人、山羊、兔)或嵌合的(斧/如人源化的)，但是最優(yōu)選地是人或人源化的。在一個實施方案中，所述抗體包含至少1個(更優(yōu)選至少2個、且最優(yōu)選至少3個)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表l3和/或圖26中列出的可變重鏈(VH)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或其保守置換。在另一個實施方案中，所述抗體包含至少1個(更優(yōu)選至少2個、且最優(yōu)選至少3個)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或圖26中列出的可變輕鏈(VO互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或其保守置換。在另一個實施方案中，所述抗體包含至少1個(更優(yōu)選至少2個、且最優(yōu)選至少3個)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或圖26中列出的可變重鏈(VH)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或其保守置換，和至少1個(更優(yōu)選至少2個、且最優(yōu)選至少3個)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或圖26中列出的可變輕鏈(Vt)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR或其保守置換，和/或1、2或3個在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或圖26中列出的VL或VH構(gòu)架區(qū)。某些優(yōu)選抗體包括，但不限于C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WR1(T)、3畫1、3-8、3-10、ING1、CR1、RAZ1、ING2、1D11、2G11、3D12和/或5G4。某些優(yōu)選抗體包括IgG、單鏈Fv(scFv)，而其它優(yōu)選抗體包4舌，但不限于IgG、IgA、IgM、Fab、(Fab')2、(scFv')2等。在某些實施方案中，所述抗體可以是多價的。所述抗體可以包括包含2個scFv片^:的融合蛋白。本發(fā)明也提供了組合物，其包含在藥理學(xué)賦形劑中的一種或多種本文所述的肉毒桿菌神經(jīng)毒素-中和抗體。本發(fā)明也提供了BoNT-中和表位。某些優(yōu)選表位包括被C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、CR2、RAZ1、ING2、1D11、2G11、3D12和/或5G4特異性地結(jié)合的BoNT/AHc表位。某些優(yōu)選多肽不是全長BoNT，且更特別優(yōu)選的多肽不是全長BoNTHc片段。因而，最優(yōu)選的表位是BoNT/AHc子序列或片段，其中優(yōu)選子序列的長度為至少4，優(yōu)選至少6,更優(yōu)選至少8且最優(yōu)選至少10、12、14或甚至15個氨基酸。在這方面，注意到HuC25和它的衍生物(AR1、2、3、4和CR1)結(jié)合N-末端的HC結(jié)構(gòu)域，而3D12/RAZ1結(jié)合C-末端的HC結(jié)構(gòu)域。這些表位都不是線性的。定義"BoNT多肽"指肉毒桿菌神經(jīng)毒素多肽(例如，BoNT/A多肽、BoNT/B多肽、BoNT/C多肽等)。BoNT多肽可以指全長多肽或其片段。因而，例如，術(shù)語"BoNT/A多肽，，指全長BoNT/A(由A型血清型肉毒梭菌(C7oWWc//Mm生成的神經(jīng)毒素)或其片段(辦如He片段)。Hc片段是BoNT/A的約50DaC-末端片段(殘基873-1296)(Lacy和Stevens(1999)編.291:1091-1104)。"BoNT"血清型指標(biāo)準(zhǔn)的已知的BoNT血清型之一(辨如BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F爭)。BoNT血清型彼此的差異為在氨基酸水平少至約35%(辦如，BoNT/E和BoNT/F之間)，到在氨基酸水平最高至約66%(辨如，BoNT/A對BoNT/C或D)。因而，BoNT血清型彼此的差異在氨基酸水平是約35-66%。術(shù)語"BoNT亞型，，(辨如，BoNT/AlA亞型)指特定血清型(斧/如，A、C、D、F爭)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素基因序列，它們彼此充分不同，以產(chǎn)生有差別的抗體結(jié)合。在某些實施方案中，所述亞型彼此的差異在氨基酸水平是至少2.5%，優(yōu)選至少5%，或10%，更優(yōu)選至少15%或20%。在某些實施方案中，所述亞型彼此的差異在氨基酸水平是不過35%，優(yōu)選不過31.6%,更優(yōu)選不過30%，或25%,更優(yōu)選低于約20%或16%。在某些實施方案中，BoNT亞型彼此的差異在氨基酸水平是至少2.6%,更優(yōu)選至少3%,且最優(yōu)選至少3.6%。BoNT亞型彼此的差異在氨基酸水平通常是低于約31.6%,更優(yōu)選低于約16%。"中和"指肉毒桿菌神經(jīng)毒素(^如，BoNT/A)毒性的可測量的降低。當(dāng)關(guān)于抗體使用時，術(shù)語"高親和力"指該抗體以至少約1(T8M、優(yōu)選至少約10—9M、更優(yōu)選至少約10—1QM、且最優(yōu)選至少約10—"M的親和力(Ko)，特異性地結(jié)合其靶。在某些實施方案中，"高親和力"抗體具有約1nM-約5pM的KD。在本文中使用下面的縮寫AMP,氨節(jié)青霉素；BIG,肉毒桿菌免疫球蛋白；BoNT，肉毒桿菌神經(jīng)毒素；BoNT/A，BoNTA型；CDR,互補(bǔ)性決定區(qū)；ELISA,酶聯(lián)免疫吸附測定；GLU,葡萄糖；HBS，HEPES-緩沖鹽水(10mMHEPES,150mMNaCl[pH7.4]);Hc,BoNT重鏈的c-末端結(jié)構(gòu)域(結(jié)合結(jié)構(gòu)域)；HN,BoNT重鏈的N-末端結(jié)構(gòu)域(易位結(jié)構(gòu)域)；IgG，免疫球蛋白G;IMAC，固定化金屬親和層析；IPTG,異丙基-P-D-處喃型硫代半乳糖苷；KAN，卡那霉素；Kd，平衡常數(shù)；k。ff，解離速率常數(shù)；k。n,結(jié)合速率常數(shù)；MPBS，溶于PBS中的脫脂奶粉；NTA，次氮基三乙酸；PBS,磷酸緩沖鹽水(25mMNaH2P04,125mMNaCl[pH7.0];RU,共振單位；scFv,單鏈Fv抗體片段；TPBS,溶于PBS中的0.05%(vol/vol)吐溫20;TMPBS,溶于MPBS中的0.05%(vol/vol)吐溫20;TU,轉(zhuǎn)導(dǎo)單位；VH,免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；VK,免疫球蛋白K輕鏈可變區(qū)；VL免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；wt,野生型。術(shù)語"多肽"、"肽"或"蛋白"在本文中可互換地用于指，通過鄰近殘基的a-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接到一起的氨基酸殘基的線性系列。氨基酸殘基優(yōu)選地是天然"L"異構(gòu)體形式。但是，"D"異構(gòu)體形式的殘基可以置換任意L-氨基酸殘基，只要該多肽保留所需的功能性質(zhì)。另外，除了20種"標(biāo)準(zhǔn)"氨基酸以外，所述氨基酸還包括修飾的和罕見的氨基酸，它們包括，但不限于在37CFR(1.822(b)(4)中列出的那些。此外，應(yīng)當(dāng)指出，在氨基酸殘基序列的開始或結(jié)束處的破折號，表示與一個或多個氨基酸殘基的另一個序列的肽鍵，或與叛基或鞋基末端基團(tuán)的共價鍵。本文使用的"抗體"指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的一種或多種多肽組成的蛋白。公知的免疫球蛋白基因包括k、x、a、y、5、e和fi恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為k或人。重鏈分為y、p、a、5或s,它們又分別限定了免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知一般的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個四聚體由2個相同的多肽鏈對組成，每對具有一條"輕鏈，，(約25kD)和一條"重鏈"(約50-70kD)。每條鏈的N-末端限定了約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)，后者主要負(fù)責(zé)抗原識別。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈?？贵w作為完整免疫球蛋白或用各種肽酶消化產(chǎn)生的許多充分表征的片段存在。因而，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵以下消化抗體，以產(chǎn)生F(ab)'2，即Fab的二聚體，所述Fab本身是通過二硫鍵連接到VH-CH1上的輕鏈。在溫和條件下可以還原F(ab)'2，以破壞鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，從而將(Fab')2二聚體轉(zhuǎn)化成Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區(qū)的部分的Fab(關(guān)于其它抗體片段的更詳細(xì)的描述，參1，F(xiàn)冊c/"総wto//附附w朋/ogy，W.E.Paul,編，RavenPress,N.Y.(1993))。盡管就消化完整抗體而言定義了各種抗體片段，但技術(shù)人員會明白，可以化學(xué)地或通過使用重組DNA方法，從頭合成這樣的Fab'片段。因而，本文使用的術(shù)語抗體也包括通過修飾完整抗體產(chǎn)生的或使用重組DNA方法從頭合成的抗體片段。優(yōu)選的抗體包括Fab，2、IgG、IgM、IgA和單鏈抗體，更優(yōu)選單鏈Fv(scFv)抗體，其中可變重鏈和可變輕鏈連接到一起(直接地或通過肽接頭)，以形成連續(xù)多肽。"抗原結(jié)合部位"或"結(jié)合部分"指免疫球蛋白分子的參與抗原結(jié)合的部分?？乖Y(jié)合部位由重鏈("H")和輕鏈("L")的N-末端可變("V")區(qū)的氨基酸殘基形成。在重鏈和輕鏈的V區(qū)內(nèi)的3個高度趨異的序列段稱作"高變區(qū)"，它們插入在稱作"構(gòu)架區(qū)"或"FR"的更保守的側(cè)接序列段之間。因而，術(shù)語"FR"指在免疫球蛋白的高變區(qū)之間和附近天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的3個高變區(qū)和重鏈的3個高變區(qū)在三維空間上彼此相對地布置，以形成抗原結(jié)合"表面"。該表面介導(dǎo)靶抗原的識別和結(jié)合。每條重鏈和輕鏈的3個高變區(qū)稱作"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"CDR",且表征在例如Kabat爭Se《認(rèn)wce5o//n3/e/m。//附ww"o/og/t，cf/〖w/^"eW,4thed.U.S.Dept.HealthandHumanServices,PublicHealthServices,Bethesda，MD(1987)。S25抗體指由克隆S25表達(dá)的抗體，或以其它方式合成，但是與所述克隆25表達(dá)的抗體具有相同的CDR，和優(yōu)選但非必需的相同的構(gòu)架區(qū)的抗體。類似地，抗體C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WRl(T)、3-1、3-8、3-10、INGl、CR1、RAZ1或ING2指由對應(yīng)克隆表達(dá)的抗體，和/或以其它方式合成，但是與所參考的抗體具有相同的CDR，和優(yōu)選但非必需的相同的構(gòu)架區(qū)的抗體。本文使用的術(shù)語"免疫結(jié)合"和"免疫結(jié)合性質(zhì)"指發(fā)生在免疫球蛋白分子和該免疫球蛋白特異性的抗原之間的類型的非共價相互作用?？梢愿鶕?jù)相互作用的解離常數(shù)(Kd)，表達(dá)免疫結(jié)合相互作用的強(qiáng)度或親和力，其中更小的Ki代表更大的親和力。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，可以定量選擇的多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)。一種這樣的方法需要測量抗原結(jié)合部位/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中這些速率取決于復(fù)合物配偶體的濃度、相互作用的親和力和相等地影響兩個方向的速率的幾何參數(shù)。因而，通過計算濃度以及結(jié)合和解離的實際速率，可以確定"結(jié)合速率常數(shù)"(K。。和"解離速率常數(shù)，，(K。ff)。K。ff/K。n的比，能夠取消與親和力無關(guān)的所有參數(shù)，并因而等于解離常數(shù)Kd。一般地#1Davies爭J朋iv.腸c/zew.，59:439-473(1990)。"BoNT-中和抗體"指結(jié)合一種或多種肉毒桿菌神經(jīng)毒素(例如，BoNT/Al、BoNT/A2爭)，并通過這樣的結(jié)合減少該BoNT神經(jīng)毒素的毒性的抗體。因而，例如本文使用的術(shù)語"BoNT/A-中和抗體"指這樣的抗體，其特異性地結(jié)合BoNT/A多肽(辨如BoNT/Al多肽)，在某些實施方案中，結(jié)合BoNT/A多肽的Hc結(jié)構(gòu)域，并通過這樣的結(jié)合減少該BoNT/A多肽的毒性。減少的毒性可以測量為本文所述的發(fā)展麻痹的時間的增加和/或致死劑量(辨如LD50)。源自BoNT-中和抗體的抗體包括，但不限于，在本文中特別提供其序列的抗體。源自BoNT-中和抗體的抗體優(yōu)選地具有約1.6x10—8或更好的結(jié)合親和力，且可以通過篩選在噬菌體或酵母上展示的單鏈Fv片段文庫來衍生，所述單鏈Fv片段文庫從用肉毒桿菌類毒素、毒素或BoNT片段免疫的哺乳動物(包括小鼠和人)得到的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因構(gòu)建。抗體也可以通過篩選噬菌體或酵母展示文庫來衍生，其中已知的BoNT-中和可變重鏈(vh)與大量可變輕鏈(VO組合地表達(dá)，或者相反地，已知的BoNT-中和可變輕鏈與大量可變重鏈(vh)組合地表達(dá)。BoNT-中和抗體也包括通過向本文所述的可變重鏈或可變輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR1、CDR2或CDR3)導(dǎo)入突變產(chǎn)生的那些抗體。最后，BoNT-中和抗體包括由應(yīng)用于本文所述的BoNT-中和抗體和它們的衍生物上的這些修飾方法的任意組合產(chǎn)生的那些抗體。中和表位指被中和抗體特異性地結(jié)合的表位。單鏈Fv("scFv"或"scFv")多肽是共價連接的VH::VL異源二聚體，其可以由核酸表達(dá)，所述核酸包括直接連接的或通過肽編碼接頭連接的Vh-和VL-編碼序列。Huston,爭(1988)爿cm/.5W,OS^，85:5879-5883。許多結(jié)構(gòu)將來自抗體V區(qū)的天然聚集的、但是化學(xué)上分離的輕和重多肽鏈轉(zhuǎn)化成scFv分子，所述scFv分子將折疊成基本上類似于抗原結(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)。參^，辨如美國專利號5,091,513和5,132,405和4,956,778。在一類實施方案中，重組設(shè)計方法可以用于開發(fā)用于將來自抗體可變區(qū)的2個天然結(jié)合的、但是化學(xué)上分離的重和輕多肽鏈轉(zhuǎn)化成將折疊成基本上類似于天然抗體結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)的scFv分子的合適化學(xué)結(jié)構(gòu)(接頭)。設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)包括，確定跨一條鏈的C-末端和另一條鏈的N-末端之間的距離的適當(dāng)長度，其中接頭通常由小親水氨基酸殘基形成，其不傾向于巻曲或形成二級結(jié)構(gòu)。這樣的方法已經(jīng)記載在本領(lǐng)域中。f,辨如，Huston等的美國專利號5,091,513和5,132,405;和Ladner等的美國專利號4,946，778。在這方面，接頭設(shè)計的第一個一般步驟包含，鑒別要連接的似乎合理的位點。每個Vh和VL多肽結(jié)構(gòu)域上的適宜連接位點包括將導(dǎo)致來自多肽結(jié)構(gòu)域的殘基的最少損失，且使包含與分子穩(wěn)定性的需要相一致的最小數(shù)目殘基的接頭成為必需的那些。一對位點限定了要連接的"缺口"。連接一個結(jié)構(gòu)域的C-末端和下一個結(jié)構(gòu)域的N-末端的接頭通常包含親水氨基酸，其在生理溶液中呈現(xiàn)無組織的構(gòu)型，且優(yōu)選地不含有具有可能妨礙Vh和Vl鏈正確折疊的大側(cè)基的殘基。因而，在本發(fā)明中合適的接頭通常包含甘氨酸和絲氨酸殘基的交替集合的多肽鏈，且可以包括為增加溶解度而插入的谷氨酸和賴氨酸殘基。本發(fā)明中一種具體的接頭具有氨基酸序列[(Gly)4Ser]3(SEQIDNO:1)。另一種特別優(yōu)選的接頭具有包含2或3個[(Ser)4Gly](SEQIDNO:2)重復(fù)的氨基酸序列，例如[(Ser)4Gly]3(SEQIDNO:3)等。使用本領(lǐng)域已知的各種寡核苷酸合成技術(shù)，可以容易地提供編碼這樣的接頭部分的核普酸序列。參^，辨如，Sambrook，同上。當(dāng)提及抗體時，短語"特異性地結(jié)合蛋白"或"與……特異性地免疫反應(yīng)"指結(jié)合反應(yīng)，它在有異源蛋白群體和其它生物制品存在下，是蛋白存在的決定因素。因而，在指定的免疫測定條件下，指定的抗體結(jié)合特定蛋白，且不以顯著量結(jié)合在樣品中存在的其它蛋白。在這樣的條件下與蛋白的特異性結(jié)合，可能需要針對其對特定蛋白的特異性而選擇的抗體。例如，可以針對BoNT/A蛋白產(chǎn)生BoNT/A-中和抗體，其特異性地結(jié)合BoNT/A蛋白，且不結(jié)合在組織樣品中存在的其它蛋白。許多種免疫測定形式可以用于選擇可與特定蛋白特異性地免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常規(guī)地用于選擇與蛋白特異性地免疫反應(yīng)的單克隆抗體。關(guān)于免疫測定形式的描述和可以用于確定特異性的免疫反應(yīng)性的條件，參見Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork。術(shù)語"保守置換"用于指蛋白或肽，以反映基本上沒有改變該分子的活性(特異性或結(jié)合親和力)的氨基酸置換。通常，保守的氨基酸置換包含，用一種氨基酸置換具有類似化學(xué)性質(zhì)(辦如電荷或疏水性)的另一種氨基酸。下面的6組各自含有彼此是一般的保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。附圖簡述圖1解釋了使用噬菌體文庫體外生產(chǎn)抗體的策略。從脾細(xì)胞制備mRNA，制備第一鏈cDNA，并通過PCR擴(kuò)增抗體Vh和Vl基因。使用PCR,將Vh和Vl基因隨機(jī)地剪接到一起，以生成scFv基因譜。將所述scFv基因語與編碼噬菌粒小外殼蛋白(pin)的基因(gIII)符合讀框地克隆進(jìn)噬菌粒載體中。在產(chǎn)生的噬菌體抗體文庫中的每個噬菌體都在它的表面上表達(dá)scFv-pIII融合蛋白，且在內(nèi)部含有編碼scFv的基因。通過固定化的抗原的親和層析，可以將結(jié)合特定抗原的噬菌體抗體與非結(jié)合的噬菌體抗體分離。單輪選擇以20-10,000的系數(shù)增加結(jié)合抗原的噬菌體抗體的數(shù)目，這取決于抗體的親和力。洗脫的噬菌體抗體用于感染大腸桿菌(Eco//),后者然后生產(chǎn)更多的噬菌體抗體，以用于下一輪選擇。重復(fù)的選擇輪次，使得分離最初以低于1/10億的頻率存在的結(jié)合抗原的噬菌體抗體成為可能。圖2中的圖A和圖B顯示的傳感器圖(sensorgram)解釋了用于對結(jié)合BoNT/AHc的scFv進(jìn)行表位作圖的技術(shù)。通過在BIAcore中使用表面等離振子共振，利用成對研究的scFv,進(jìn)行表位作圖。將每種scFv注射進(jìn)BIAcore,并使其結(jié)合偶聯(lián)在傳感器芯片表面上的BoNT/AHc,直到達(dá)到飽和。將每種單獨的scFv結(jié)合的量(以RU為單位)與當(dāng)混合兩種scFv并一起注射時結(jié)合的量相比較。點a顯示了基線，隨后開始注射。點b,和b2顯示了初始結(jié)合階4S:。點q和c2顯示了解離的開始。點a和c之間的差異(以RU為單位)等于結(jié)合BoNT/AHc的scFv的量。圖A顯示了識別不同表位的兩種scFv(C25和C9)。一起注射的兩種scFv結(jié)合的量(C9/C25，點c2),是單獨注射的兩種scFv的和(c!)。圖B顯示了識別相同表位的兩種scFv(C39和C25)。一起注射的兩種scFv結(jié)合的量(C25/C39;點c),與單獨注射的兩種scFv的(c)相同。點b,和c,之間、b2和C2之間、和b！和c之間的巨大差異(以RU為單位)是由于scFv和電泳緩沖液之間折射率的差異。圖3顯示了在小鼠半膈模型中scFv中和BoNT/A的評價。在加入20pMBoNT/A(對照)，20pMBo麗A+20nMscFvS25、C25、1C6或1F3(分別代表表位1-4)、或各自終濃度為20nM的S25和C25的組合之前(-30至0分鐘)和之后，測量電刺激小鼠半膈后發(fā)展的顫搐張力。將結(jié)果表達(dá)為穩(wěn)態(tài)顫搐張力(在0分鐘)相對于時間的分?jǐn)?shù)。scFv1C6和1F3沒有改變達(dá)到50%顫搐減少的時間，而scFvC25和S25明顯延長所述時間。與單獨的C25或S25相比，S25和C25的組合明顯延長達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間。圖4顯示了mAb、mAb對和寡克隆(oligockmal)Ab的體外毒素中和。在分離的小鼠半膈中測量達(dá)到50%顫搐減少的時間，并針對只有毒素的對照，單一mAb(C25、S25或3D12)，mAb對(C25S25、C25+3D12或3D12+S25),和寡克隆Ab(C25+3D12+S25)進(jìn)^亍才艮道。與只有毒素相比，單一mAb明顯延長達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間。與單一mAb相比，mAb對明顯延長達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間。圖5A和5B顯示了mAb(圖5A)和mAb對(圖5B)的體內(nèi)毒素中和。將共50微克Ab與20或100只小鼠LD50的毒素相混合，并腹膜內(nèi)注射(i.p.)。確定達(dá)到死亡的時間和存活小鼠的數(shù)目。單一mAb都沒有表現(xiàn)出抗20LDso的顯著保護(hù)。當(dāng)給予任意mAb對時，所有小鼠都在100LD5Q攻擊后存活。圖6顯示了mAb、mAb對和寡克隆Ab的體內(nèi)毒素中和。以遞增的毒素攻擊劑量，測定mAb、mAb對和寡克隆Ab的體內(nèi)毒素中和。單一mAb都沒有表現(xiàn)出顯著保護(hù)。相反地，所有mAb對都中和了至少100LD5Q，就最有效的對(C25屮3D12)而言，約50%的小鼠在1,500LD5Q的毒素攻擊后存活。寡克隆Ab甚至更有效，約50%的小鼠在20,000LD5Q的毒素攻擊后存活。圖7顯示了抗體的溶液平衡解離常數(shù)(Kd)。通過測量隨著遞增的BoNTHc毒素而變化的存在的游離Ab的量，在流式熒光計中測量單一mAbC25和3D12的溶液Kd。以等摩爾量組合C25和3D12mAb,使C25Kd降低超過100倍。加入第三種Ab(S25),使Kd另外降低4倍，達(dá)到18pM。圖8A和8B顯示了可溶scFv抗體的ELISA表征。通過固定化涂布到聚苯乙烯平板上的每種指示的BoNT血清型BoNT/AHC和BoNT/AHN,進(jìn)行測定。圖8A:用過氧化物酶-綴合的mAb抗-E抗體(1:2500),檢測可與涂布的抗原反應(yīng)的、細(xì)菌表達(dá)的源自免疫文庫的scFv抗體。圖8B:用9E10抗體(1:500)、隨后用過氧化物酶-綴合的抗-小鼠-Fc抗體，檢測可與涂布的抗原反應(yīng)的、細(xì)菌表達(dá)的源自未免疫文庫的scFv抗體。將測定的結(jié)果顯示為在405nm的吸光度，其尚未對蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化。圖9A和9B顯示了對結(jié)合BoNT/AHc的scFv進(jìn)行表位作圖的傳感器圖。點'a，注射起始，點'b，注射終止，和點'c，結(jié)合的scFv的量。點b和c之間的差異(以RU為單位)是由于scFv和電泳緩沖液之間折射率的差異。圖9A:scFv3A6和3D12識別相同的表位，如當(dāng)混合2種scFv時結(jié)合的RU沒有增加所表明的。圖9B:scFv2A9和2A1識別不同的表位，如當(dāng)混合2種scFv時結(jié)合的RU幾乎加性的增加所表明的。圖10A和10B顯示了耙向BoNT/AHC結(jié)構(gòu)域的scFv抗體的單獨作用和組合作用。圖10A:在加入20pMBoNT/A(對照)，20pMBoNT/A+20nMI聚蔟成員(3D12)、II聚蔟成員(3F10)、C25或S25之前(-30至0分鐘)和之后，測量電刺激小鼠半膈后發(fā)展的顫搐張力。scFv3F10沒有改變達(dá)到50%顫搐減少的時間，而scFvC25、S25或3D12明顯延長達(dá)到50%顫搐減少的時間。圖10B:C25與S25或3D12(聚簇I)的組合，明顯延長達(dá)到50%顫搐減少的時間。圖11顯示了公開的肉毒桿菌神經(jīng)毒素基因的系統(tǒng)樹。使用VectorNTI軟件，從公開的梭菌神經(jīng)毒素基因的DNA序列，構(gòu)建該系統(tǒng)樹。圖12A和12B顯示了BoNT/A基因序列的分析。圖12A:BoNT/A基因的系統(tǒng)樹揭示了2個聚簇，Al和A2。圖12B:BoNT/Al和BoNT/A2之間的氨基酸側(cè)鏈差異模型。BoNT/A重鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域是白色的，在圖的頂部，推定的神經(jīng)節(jié)苦脂結(jié)合殘基是藍(lán)色的，且神經(jīng)節(jié)普脂是紅色的。重鏈易位結(jié)構(gòu)域是橙色的，且輕鏈?zhǔn)前咨模趫D的底部。BoNTAl和A2毒素之間的側(cè)鏈差異顯示為綠色。圖13顯示了BoNT/B基因序列的分析。BoNT/B基因的系統(tǒng)樹揭示了4個聚簇BoNT/Bl、BoNT/B2、非蛋白水解的BoNT/B和二價BoNT/B。聚簇之間的百分比差異是3.6-7.7%。關(guān)于BoNT/A，在重鏈中觀察到最大差異。圖14顯示了通過捕獲ELISA測得的BoNT/AHc單克隆抗體(C25、B4、S25和3D12)與BoNT/Al和BoNT/A2毒素的結(jié)合。給孔涂布指示的mAb，隨后涂布可變濃度的純的或復(fù)合的BoNT/Al或BoNT/A2。使用多克隆馬BoNT/A抗血清，檢測毒素結(jié)合。Al毒素用實心正方形表示；A2毒素用空心圓表示。純毒素是實線；毒素復(fù)合物是虛線。圖15顯示了通過捕獲ELISA測得的BoNT/A易位結(jié)構(gòu)域和輕鏈單克隆抗體與BoNT/Al和BoNT/A2毒素的結(jié)合。方法與圖14所述相同。圖16解釋了mAb對的保護(hù)用BoNT/Al毒素攻擊的小鼠的能力。將一定范圍的小鼠LDso的BoNT/Al毒素復(fù)合物與50ug等摩爾比的指示的mAb相混合，并腹膜內(nèi)地注射混合物。表示小鼠存活數(shù)目對攻擊劑量的關(guān)系。圖17A和17B解釋了mAb三聯(lián)體保護(hù)用BoNT/Al或BoNT/A2毒素攻擊的小鼠的能力。將一定范圍的小鼠LDso的BoNT/Al毒素復(fù)合物(圖卩A)或BoNT/A2毒素復(fù)合物(圖HB)與50ug等摩爾比的指示的mAb相混合，并腹膜內(nèi)地注射混合物。表示小鼠存活數(shù)且對攻擊劑量的關(guān)系。圖18.突變的和選擇的抗體的序列(HU-C25(SEQIDNO:4)、AR1(SEQIDNO:5)、AR2(SEQIDNO:6)、AR3(SEQIDNO:7)、AR4(SEQIDNO:8)、CRl(SEQIDNO:9))。石皮折號表示j呆守的殘基。字母表示突變的殘基。圖19A和19B.突變的和選擇的抗體的序列。圖19A:3D12(SEQIDNO:10)和RAZ1(SEQIDNO:ll))。圖19B:ING1(SEQIDNO:12)、1D11(SEQIDNO:13)、2G11(SEQIDNO:14)、5G4(SEQIDNO:15)、ING2(SEQIDNO:16)。破折號表示保守的殘基。字母表示突變的殘基。圖20A和20B顯示了用于HuC25(圖20A)和3D12(圖20B)scFv的親和力成熟的方案，其中使用酵母展示。圖21A至21D顯示了野生型和親和力成熟的酵母展示的scFv的親和力。圖21A:HuC25和ARl;圖21B:AR1和AR2;圖21C:AR2和AR4;圖21D:3D12和RAZ1。圖22解釋了使用野生型和親和力成熟的抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BoNT/A。圖23A和23B顯示了野生型和親和力成熟的抗體中和BoNT/A的效力。圖23A:100只小鼠LD50攻擊。圖23B:200只小鼠LD50攻擊。圖24A24B顯示了野生型和親和力成熟的抗體對中和BoNT/A的效力。圖24A:500只小鼠LDs。攻擊。圖24B:5000只小鼠LD50攻擊。圖25解釋了抗體組合對BoNT/A2的中和。圖26顯示了Hu-C25語系抗體(HU-C25(SEQIDNO:17)、AR1(SEQIDNO:18)、AR2(SEQIDNO:19)、AR3(SEQIDNO:20)、AR4(SEQIDNO:21)、CR1(SEQIDNO:22)和CR2(SEQIDNO:23))的比對。詳述本發(fā)明提供了新的抗體，其特異性地結(jié)合和中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型，且在某些實施方案中，特異性地結(jié)合和中和其它肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型(辨如，B、C、D、E、F爭)。肉毒桿菌神經(jīng)毒素由厭氧細(xì)菌肉毒梭菌產(chǎn)生。肉毒桿菌神經(jīng)毒素中毒(肉毒中毒)在許多背景下產(chǎn)生，包括但不限于，食物中毒(食物傳播的肉毒中毒)、感染的傷口(傷口肉毒中毒)和因攝食孢子和毒素在嬰兒腸內(nèi)產(chǎn)生引起的"嬰兒肉毒中毒"。肉毒中毒是一種麻痹性疾病，其通常從腦神經(jīng)受累開始，并最終發(fā)展成牽連肢體。在急性情況下，肉毒中毒可以是致命的。肉毒中毒神經(jīng)毒素(BoNT)也被疾病控制中心(CDC)歸入生物恐怖主義的6種最高危險的威脅因子("A類因子")之一，這是由于它們的巨大效力和致死率、容易生產(chǎn)和運輸、和需要長期重癥監(jiān)護(hù)(Arnon爭(2001)JJA"285:1059-1070)。伊拉克和前蘇聯(lián)都生產(chǎn)了用作武器的BoNT(UNSecurityCouncil(1995)同上；Bozheyeva(1999)同上)，且曰本宗教奧姆真理教嘗試使用BoNT進(jìn)行生物恐怖主義(Arnon爭(2001)同上)。作為這些威脅的結(jié)果，需要用于預(yù)防和治療中毒的特異性藥物試劑。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，存在各種BoNT血清型的多種亞型。此外，我們還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多結(jié)合例如BoNT/Al亞型的抗體不結(jié)合BoNT/A2亞型等。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用高親和力地結(jié)合特定BoNT血清型的2種或更多種亞型的中和抗體，可以特別有效地中和肉毒中毒神經(jīng)毒素(BoNT)亞型。盡管這可以通過使用針對每種亞型的2種或更多種不同抗體來實現(xiàn)，^旦這是^f氐效率的、無效的且不實際的。應(yīng)合定BoNT的高毒性，希望BoNT治療劑是非常有效的。因為已經(jīng)必須使用多種抗體來以所需效力中和給定BoNT血清型(參見下面和圖5、6、16和17),所以如果必須使用每種亞型的不同抗體，那么從生產(chǎn)觀點看，所需抗體的數(shù)目將是難以接受的。增加混合物中抗體的數(shù)目，也降低效力。因而，例如，如果在4種抗體的混合物中，2種中和A1，且2種中和A2毒素，則僅僅50%抗體將中和給定毒素。相反地，二者都中和A1和A2毒素的2種抗體的混合物，對任一種毒素都將具有100%活性，且更容易生產(chǎn)。例如對于兩種BoNT/A亞型(A1、A2)，可以用2-3種抗體實現(xiàn)有效的中和。如果BoNT/Al和BoNT/A2中和需要不同抗體，則需要4-6種抗體。對于額外的亞型，復(fù)雜性進(jìn)一步增加。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了高親和力地結(jié)合2種或更多種BoNT亞型(,/如，BoNT/Al、BoNT/A2爭)的中和抗體。高親和力地結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2的抗體的實例包括、但不限于，本文所述的CR1、RAZ1、ING1和ING2。還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人們開始組合中和抗體時，抗體組合的效力急劇增加。該增加使得生成用于治療用途所需效力的肉毒桿菌抗體成為可能。還令人驚奇地，當(dāng)人們開始組合2和3種單克隆抗體時，識別的特定BoNT表位變得不太重要。因而，例如，如實施例5所表明的，結(jié)合BoNT的易位結(jié)構(gòu)域和/或催化結(jié)構(gòu)域的抗體具有中和活性，當(dāng)相互組合時，或當(dāng)與識別BoNT受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HC)的mAb組合時，都可以有效地中和BoNT活性。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明預(yù)期組合物，其包含至少2種、更優(yōu)選至少3種結(jié)合BoNT上的非重疊表位的高親和力抗體。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明預(yù)期組合物，其包含2種或更多種、優(yōu)選3種或更多種選自下述的不同抗體3D12、RAZ1、CR1、ING1、ING2和/或包含一個或多個來自這些抗體的CDR的抗體，和/或一種或多種包含自這些抗體的突變體的抗體，例如ING1的1D11、2G11或5G4突變體(參^,辨如，圖19B)。如上所指出的，在某些實施方案中，本發(fā)明提供的抗體結(jié)合和中和一種或多種肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型(BoNT/A)亞型。在本上下文中，中和指BoNT/A毒性的可測量的降低。通過許多本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，可以體外測量這樣的毒性的降低。一種這樣的測定包含，測量在半膈制劑中達(dá)到給定百分比(辨如50%)顫搐張力減少的時間?？梢泽w內(nèi)測量毒性，例如作為在有一種或多種推定的中和抗體存在下，試驗動物(辨如小鼠)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型的LD5q。在施用之前，可以將中和抗體與肉毒桿菌神經(jīng)毒素相組合，或可以在施用神經(jīng)毒素之前、同時或之后，給動物施用所述抗體。由于本發(fā)明的抗體起中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型的作用，所以它們可以用于治療與肉毒桿菌神經(jīng)毒素中毒有關(guān)的病理學(xué)。所述治療如減輕或消除)BoNT中毒癥狀的量的一種或多種中和抗體。在急性情況下，例如，肺活量低于預(yù)期的30-40%、和/或麻痹快速發(fā)展、和/或存在具有絕對或相對高碳酸血的低氧血時，這樣的治療是最需要的和有效的。這些抗體也可以用于治療具有比指示的癥狀更參與損害路線的士兵預(yù)期的應(yīng)用)。使用中和抗體的治療，可以作為其它治療的附件而提供(辦如抗生素治療)。本發(fā)明提供的抗體也可以用于快速檢測/診斷肉毒中毒(A型毒素)，并從而補(bǔ)充和/或替代以前的實驗室診斷。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了被肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型中和抗體特異性地結(jié)合的表位。這些表位可以用于分離和/或鑒別和/或篩選本文所述的其它抗體BoNT/A中和抗體。I.肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)-中和抗體的效力不受特定理論的約束，認(rèn)為用于治療肉毒中毒(馬和人)的現(xiàn)有抗毒素具有約5000只小鼠LD50/mg(人)和55，000只小鼠LD50mg(馬)的效力?；谖覀兊挠嬎?，我們認(rèn)為商業(yè)上需要的抗毒素將具有大于約10,000-100,000LD50/mg的效力。本文所述抗體的組合(辨如，2或3種抗體)滿足該效力。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了抗體和/或抗體組合，其中和至少約10,000只小鼠LD50/mg抗體，優(yōu)選至少約15,000只小鼠LD50/mg抗體，更優(yōu)選至少約20,000只小鼠LD50/mg抗體，且最優(yōu)選至少約25,000只小鼠LD50/mg抗體。II.肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)-中和抗體在某些優(yōu)選實施方案中，選擇結(jié)合1種、但是更優(yōu)選地結(jié)合至少2種或BoNT亞型的BoNT中和抗體。對于每種BoNT血清型，已知許多亞型。因而，例如，BoNT/A亞型包括，^f旦不限于，BoNT/Al、BoNT7A2、BoNT/A3等(參f，辨如，圖11)。還注意到，例如，BoNT/Al亞型包括，但不限于，62A、NCTC2916、ATCC3502和Hallhyper(HallAllergan),且是相同的(在氨基酸水平99.9-100%同一性)，且已經(jīng)歸入亞型Al(圖12A)。BoNT/A2序歹'J(Kyoto-F和FRI-A2H)(Willems,爭(1993)to.Mcra6,W.144:547-556)在氨基酸水平是100%同一的。另一種BoNT/A亞型(我們稱作A3)由稱作LochMaree的品系生成，該品系在蘇格蘭的爆發(fā)中殺死了許多人。我們的數(shù)據(jù)表明，與A1和A2毒素交叉反應(yīng)的本文所述的3種抗體(^^表l)，也與A3毒素交叉反應(yīng)(它們是CR1、ING1和RAZ1)。我們已經(jīng)鑒別出的另一種BoNT/A毒素稱作A4。它由生產(chǎn)B和A毒素的二價梭菌品系生產(chǎn)。類似地，如圖11所示，也已知血清型B、C、E和F的許多亞型。使用本文所述的方法，發(fā)現(xiàn)可以生產(chǎn)(例如，選擇/工程改造)與一種血清型內(nèi)的2種或更多種亞型交叉反應(yīng)的高親和力抗體。此外，不受特菌神經(jīng)毒素，尤其當(dāng)與一種或多種不il中^抗體組合使用時。A在表2和圖18和19中，解釋了許多原型上"交叉反應(yīng)的"抗體的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)結(jié)構(gòu)域的序列。如上所指出的，抗體CR1、RAZ1、ING1和ING2是與BoNT/Al和BoNT/A2亞型交叉反應(yīng)的，而抗體CR1、ING1和RAZ1另外是與BoNT/A3亞型交叉反應(yīng)的。通過人源化的C25(HuC25)(即AR2的衍生物)的突變和選擇，生產(chǎn)抗體CR1,辨如，如實施例4所述。在A1和A2亞型上突變和選擇抗體。類似地，抗體3D12的突變(參^，辨乂實施例2)產(chǎn)生RAZ1。酵母上選擇免疫scFv文庫，產(chǎn)生ING1和ING2。表l.工程改造的抗體的結(jié)合數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表2和圖18和19提供了交叉反應(yīng)的抗體RAZ1、CR1、ING1和ING2的VH和VL區(qū)的氨基酸序列信息。提供了關(guān)于特異性地結(jié)合BoNT/Al亞型的抗體AR2和AR3的類似信息。另外，在本文中提供了S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8和/或3-10的序列信息(參f，辨如，表6、和/或表11和/或表13)。表2.親和力成熟的、交叉反應(yīng)的、和/或修飾的抗體的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*完整重鏈的序列是重鏈構(gòu)架1+CDRl+構(gòu)架2+CDR2+構(gòu)架3+CDR3+構(gòu)架4。完整輕鏈的序列是輕鏈構(gòu)架1+CDR1+構(gòu)架2+CDR2+構(gòu)架3+CDR3+構(gòu)架4。使用本文提供的教導(dǎo)和序列信息，可以直接或通過接頭(辨如(Gly4Ser3,SEQIDNO:181)連接可變輕鏈和可變重鏈，以形成單鏈Fv抗體?？梢允褂酶鞣NCDR和/或構(gòu)架區(qū)，來形成全人抗體、嵌合抗體、抗體片段、多價抗體等。III.BoNT中和抗體的制備A)BoNT-中和抗體的重組表達(dá)使用本文提供的信息，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，制備本發(fā)明的肉毒桿菌神經(jīng)毒素-中和抗體。例如，本文提供的多肽序列(參^，辨如，表2、和/或表6、和/或表9和/或表13)可以用于確定編碼BoNT7A-中和抗體的適當(dāng)核酸序列，然后將該核酸序列用于表達(dá)一種或多種BoNT-中和抗體。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以最優(yōu)化所述核酸序列，以反映各種表達(dá)系統(tǒng)的特定密碼子"偏好"。使用本文提供的序列信息，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多標(biāo)準(zhǔn)方法，可以合成核酸。寡核苷酸合成，優(yōu)選地在可商業(yè)得到的固相寡核苦酸合成機(jī)器上進(jìn)行(Needham-VanDevanter爭(1984)7Vwc/e/c爿c/A12:6159-6168)，或使用Beaucage爭(Beaucage爭(1981)7^ra/^^o"Zeto.22(20):1859-1862)所述的固相亞磷酰胺三酯方法手工合成。一旦合成了編碼BoNT/A-中和抗體的核酸，就可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和/或克隆它。本領(lǐng)域已知達(dá)到這些目的的分子克隆技術(shù)。技術(shù)人員已知許多種適用于構(gòu)建重組核酸的克隆和體外擴(kuò)增方法。這些足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行許多克隆應(yīng)用的技術(shù)和說明書的實例，參見Berger和Kimmel，GWtfefoMo/ecw/arC7ow/wgrec/z"/，e-y，A/e/7w(i-s1/"￡>7z_ymo/og_yvo/wme152AcademicPress,Inc.,SanDiego，C(Berger);Sambrook爭(1989)M/ecw/"rC7om'"g-爿Z^Zorato^yMa"wa/(第2版)Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress,NY,(Sambrook);和Cw^reW尸nfoco/sMo/ecw/ar5/o/ogy，F(xiàn).M.Ausubel等,編，CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.,(1994增刊)(Ausubel)。生產(chǎn)重組免疫球蛋白的方法也是本領(lǐng)域已知的。Cabilly,美國專利號4,816,567;和Queen爭(1989)7V"/17爿c"t/.Sc/.86:10029-10033。足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行體外擴(kuò)增方法的技術(shù)的實例，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、QP-復(fù)制酶擴(kuò)增和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)，參見Berger、Sambrook和Ausubel,以及Mullis等，(1987)美國專利號4,683,202;尸CR/Votoco/s^Gw/cfe化MeAo(^awe/4p/7//ca"o/w(Innis爭編)AcademicPressInc.SanDiego,CA(1990)(Innis);Arnheim&Levinson(October1,1990)C&冊36-47;77^Jowma/Q/'A7/77^化""'/2(1991)3,81-94;(Kwoh爭(1989)尸roc.M//.」cac/.5W.固86,1173;Guatelli夢(1990)尸亂淑/.Jc^/.園87,1874;Lomell爭(1989)乂C7/".35，1826;Landegren等，(1988)Sc/騰e241,1077-1080;VanBrunt(1990)B/o化c/mo/ogy8,291-294;Wu和Wallace,(1989)Gene4，560;和Barringer爭(1990)Gene89,117。改進(jìn)的克隆體外擴(kuò)增的核酸的方法，記載在Wallace等，美國專利號5,426,039。一旦分離并克隆了BoNT/A-中和抗體的核酸，人們就可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多重組地工程改造的細(xì)胞中表達(dá)該基因。這些細(xì)胞的實例包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲(尤其是使用桿狀病毒載體時)和哺乳動物細(xì)胞。預(yù)見到，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用于表達(dá)BoNT/A-中和抗體的許多表達(dá)系統(tǒng)的知識?？傊幋aBoNT/A-中和抗體的天然的或合成的核酸的表達(dá)，通常通過將編碼所述抗體的核酸可操作地連接到啟動子(它是組成型或誘導(dǎo)型的)上，并將該構(gòu)建體整合入表達(dá)載體來實現(xiàn)。載體可以適合于在原核生物、真核生物或二者中復(fù)制并整合。一般的克隆載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子，它們用于調(diào)節(jié)編碼BoNT/A-中和抗體的核酸的表達(dá)。載體任選地包含基因表達(dá)盒，其含有至少l個獨立終止子序列、允許該表達(dá)盒在真核生物和原核生物兩者中復(fù)制的序列(即穿梭載體)和原核生物和真核生物系統(tǒng)兩者的選擇標(biāo)記。參jSSambrook。為了得到克隆的核酸的高水平表達(dá)，通常構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，后者通常含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動子、翻譯起始的核糖體結(jié)合位點、和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子。在大腸桿菌中適于該目的的調(diào)節(jié)區(qū)的實例是，Yanofsky(1984)J.158:1018-1024所述的大腸桿菌色氨酸生物合成途徑的啟動子和才喿縱基因區(qū)，和Herskowitz和Hagen(1980)Wev.GeW.，14:399-445所述的噬菌體X的左側(cè)啟動子(PO。在轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中的DNA載體中包含選擇標(biāo)記，也是有用的。這樣的標(biāo)記的實例包括賦予對氨節(jié)青霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性的基因。關(guān)于選擇標(biāo)記的細(xì)節(jié)，辨如.，在大腸桿菌中的應(yīng)用，Sambrook。使用大腸桿菌、芽孢桿菌屬物種(S"c/〃w)(Palva,爭(1983)Gene22:229-235;Mosbach等，淑匿，302:543-545和沙門氏菌屬0Sa/mo"e〃a),可以得到用于表達(dá)BoNT/A-中和抗體的表達(dá)系統(tǒng)。義應(yīng)々麥系統(tǒng)是優(yōu)選的。原核細(xì)胞生產(chǎn)的BoNT/A-中和抗體可能需要暴露于離液劑，以進(jìn)行正確折疊。在從辨如義應(yīng)^f霧純化的過程中，任選地將表達(dá)的蛋白變性，然后復(fù)性。這通過例如使細(xì)菌生產(chǎn)的抗體溶于離液劑(例如鹽酸胍)中來實現(xiàn)。然后通過緩慢的透析或通過凝膠過濾，使抗體復(fù)性。#^，美國專利號4,511,503。在哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和表達(dá)基因的方法，是本領(lǐng)域已知的。用核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可以包含，例如，將含有BoNT/A-中和核酸的病毒載體與該載體的宿主范圍內(nèi)的細(xì)胞一起溫育。參見，辨如，Goeddel(19卯)Methodsi/7z戸o/og3;,vol.185,AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA或Krieger(1990)Gene7Va;w/era<i￡x,e^/o—爿丄a60n3f07Man認(rèn)/，StocktonPress,NewYork,N.Y.和其中引用的文獻(xiàn)。在本發(fā)明中使用的細(xì)胞的培養(yǎng)，包括來自組織或血液樣品的細(xì)胞系和培養(yǎng)的細(xì)胞，是本領(lǐng)域眾所周知的(參^，辨如，F(xiàn)reshney(1994)Wiley-Liss,N.Y.和其中引用的文獻(xiàn))。關(guān)于使用和才乘作抗體的技術(shù)，參見Coligan(l"l)Cw〃e"/尸rofoco/s/m畫no/ogyWiley/Greene,NY;Harlow和Lane(1989)Antibodies.'爿Z^oraZor;/M腦"/ColdSpringHarborPress,.NY;Stites爭(編)5as7'c朋dC7/m'ca//wm節(jié)o/ogy(4thed.)LangeMedicalPublications,LosAltos,CA，和其中引用的文獻(xiàn)；Goding(1986)MonoclonalAntibodies.'尸nVzcZ/7/es尸/^c/7ce(第2片反)AcademicPress,NewYork,NY;和Kohler和Milstein(1975)Nature256:495-497。對肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型特異性的BoNT/A-中和抗體具有1x10-8]\4或更好的KD,優(yōu)選實施方案具有1nM或更好的Ko,且最優(yōu)選實施方案具有O.lnM或更好的KD。在一個優(yōu)選實施方案中，將BoNT/A-中和抗體基因(辨如BoNT/A-中和scFv基因)亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pUC119mycHis(Tomlinson爭(1996)J.M/.256:813-817)或pSYN3中，從而導(dǎo)致在scFv的C-末端添加六組氨酸標(biāo)記以促進(jìn)純化。在實施例1中，提供了用于克隆和純化BoNT/A-中和抗體的詳細(xì)方案。B)完整多克隆或單克隆抗體的制備本發(fā)明的BoNT中和抗體包括單個的、等位基因的、品系或物種變體和其片段，其都是它們的天然存在的(全長)形式和重組形式。在某些實施方案中，選擇結(jié)合被本文所述抗體(辨如，S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WRl(T)、3-1、3-8、3-10、CR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1和/或ING2)結(jié)合的一種或多種表位的優(yōu)選抗體。某些優(yōu)選抗體可與2種或更多種BoNT亞型(辨如BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3爭)交叉反應(yīng)。所述抗體可以以它們的天然構(gòu)型或非天然構(gòu)型產(chǎn)生。也可以產(chǎn)生抗獨特型的抗體。許多制備特異性地結(jié)合特定表位的抗體的方法，是技術(shù)人員已知的。下面的討論作為可用技術(shù)的一般綜述；但是，技術(shù)人員將認(rèn)識到，對下述方法的許多變化是已知的。1)多克隆抗體生產(chǎn)生產(chǎn)多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。簡而言之，將免疫原(夢/如，BoNT/Al或A2、BoNT/Al或A2H?；駼oNT/Al或A2子序列，包括但不限于，包含被本文公開的克隆S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3畫1、3-8、3-10和/或CRl、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1和/或ING2表達(dá)的抗體特異性地結(jié)合的表位的子序列)，優(yōu)選純化的多肽，與適當(dāng)載體(辨如，GST、匙孔血藍(lán)蛋白等)偶聯(lián)的多肽，或摻入免疫接種載體例如重組痘苗病毒中的多肽(參^，美國專利號4，722，848)，與佐劑相混合，并用該混合物免疫動物。通過采集試驗流血和測定對目標(biāo)多肽的反應(yīng)性的效價，監(jiān)控動物對免疫原制劑的免疫應(yīng)答。當(dāng)?shù)玫綄γ庖咴倪m當(dāng)高效價的抗體時，從該動物收集血液，并制備抗血清。在需要時，進(jìn)行抗血清的進(jìn)一步分級分離，以富集與BoNT/A多肽反應(yīng)的抗體(參i,Coligan(1991)Cw廳e"f尸rotoco/s/"/mm麗o/ogyWiley/Greene，NY;和Harlow和Lane(1989)Antibodies..爿Z^oro^or少Ma聰a/ColdSpringHarborPress,NY)。使用本文所述的選擇技術(shù)，可以從多克隆血清中選擇特異性地結(jié)合本文所述中和表位的抗體。2)單克隆抗體生產(chǎn)在有些情況下，需要從各種哺乳動物宿主例如小鼠、嚙齒類動物、靈長類動物、人等制備單克隆抗體。關(guān)于制備這樣的單克隆抗體的才支術(shù)的描述，參見，斧/;^7，Stites夢(編)5w'ca"JC7z'm'c"http://www"o/ogy(第4版)LangeMedicalPublications,LosAltos，CA,和其中引用的文獻(xiàn)；Harlow和Lane,同上；Goding(1986)MonoclonalAntibodies.'/V/wc/p/es尸rac/7ce(第2版)AcademicPress,NewYork,NY;和Kohler和Milstein(1975)淑,256:495-497?？傊?，如下所述生產(chǎn)單克隆抗體給動物注射免疫原(辨如，BoNT/A、BoNT/AHc或BoNT/A子序列，包括但不限于，包含被本文公開的克隆S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、ARl、AR2、WR1(V)、WRl(T)、3-1、3-8、3-10和/或CRl、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1和/或ING2表達(dá)的抗體特異性地結(jié)合的表位的子序列)。然后處死動物，從它的脾收集細(xì)胞，所述細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。結(jié)果是能體外繁殖的雜交細(xì)胞或"雜交瘤"。然后，篩選雜交瘤群體，以分離單個克隆，其中的每個分泌對免疫原的單一抗體種類。以此方式，得到的單個抗體種類是對在免疫原性物質(zhì)上識別出的特異性位點作出應(yīng)答所產(chǎn)生的來自免疫動物的無限增殖化的和克隆的單一B細(xì)胞的產(chǎn)物。無限增殖化的替代方法包括用EB病毒、癌基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，或本領(lǐng)域已知的其它方法。篩選由單個無限增殖化細(xì)胞產(chǎn)生的集落，用于生產(chǎn)對BoNT抗原具有需要的特異性和親和力的抗體，并通過各種技術(shù)，包括注射進(jìn)脊稚動物(優(yōu)選哺乳動物)宿主的腹膜腔，增強(qiáng)由這種細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的得率。本發(fā)明的抗體可以經(jīng)過或不經(jīng)過修飾地使用，且包括嵌合抗體例如人源化的鼠抗體。IV.BoNT中和抗體的修飾A)噬菌體展示可以用于增加抗體親和力。為了生成更高親和力的抗體，可以基于結(jié)合scFv的序列(辨如，表2、和/或表6、和/或表9和/或表13)，生成突變型scFv基因譜，且在噬菌體表面上表達(dá)?？贵w片段在感染細(xì)菌的病毒(噬菌體)表面上的展示，使得生產(chǎn)具有寬范圍的親和力和動力學(xué)特性的人或其它哺乳動物抗體(辨如scFv)成為可能。為了在噬菌體表面上展示抗體片段(噬菌體展示)，將抗體片段基因插入編碼噬菌體表面蛋白(辨如，pIII)的基因中，并在噬菌體表面表達(dá)抗體片段-pIII融合蛋白(McCafferty爭(1990)淑匿，348:552-554;Hoogenboom鄰991)A^c/e/d油L,19:4133-4137)。由于在噬菌體表面上的抗體片段是有功能的，所以通過抗原親和層析，可以將攜帶結(jié)合抗原的抗體片段的那些噬菌體與未結(jié)合的或更低親和力的噬菌體分離(McCafferty爭(1990)7Vafw，348:552-554)。允許噬菌體的混合物結(jié)合親和基質(zhì)，通過洗滌去除未結(jié)合的或更低親和力的噬菌體，并通過用酸或堿處理，洗脫結(jié)合的噬菌體。根據(jù)抗體片段的親和力，通過單輪親和選擇，得到20倍-1，000，000倍的富集因子。通過如下所述用洗脫的噬菌體或的洗脫的噬菌體的修飾變體感染細(xì)菌，可以培養(yǎng)更多的噬菌體，并用于另一輪選擇。以此方式，一輪的1000倍富集變成2輪選沖奪的l，OOO，OOO倍(McCafferty爭(1990)A^f,e，348:552-554)。因而，甚至當(dāng)每輪中的富集較低時，多輪親和選擇也導(dǎo)致罕見噬菌體的分離，且其中含有的遺傳材料編碼結(jié)合抗體的序列(Marks爭(1991)丄A^/.肌o/.，222:581-597)。噬菌體展示提供的基因型和表型之間的物理聯(lián)系，使得測試抗體片段文庫中的每個成員與抗原的結(jié)合成為可能，甚至對于大至100,000,000個克隆的文庫。例如，對抗原進(jìn)行多輪選擇后，回收以僅1/30,000,000克隆的頻率發(fā)生的結(jié)合scFv(同前)。1)鏈改組生成突變型scFv基因譜的一個方法包含，用Vh或VL基因譜替代來自結(jié)合scFv的Vh或VL基因(鏈改組)(Clackson夢(1991)A^w352:624-628)。這樣的基因譜含有許多源自與結(jié)合scFv相同種系基因的V基因，但是具有點突變(Marks鄰992)腸/rec/mo/，，10:779-783)。使用輕鏈或重鏈改組和噬菌體展示，可以顯著增加辨如BoNT/Al/BoNT/A2-中和抗體片段的結(jié)合親和力(參^，辦如，Marks爭(1992)肌o/rec/mo/og7，10:779-785，其中結(jié)合半抗原苯基嚅哇酮(phox)的人scFv抗體片段的親和力從300nM增加至15nM(20倍))。因而，為了改變BoNT-中和抗體的親和力，生成突變型scFv基因譜，其含有已知BoNT-中和抗體(辨如，CR1、RAZ1、ING1、ING2)的Vh基因和VL基因譜(輕鏈改組)?；蛘撸蓅cFv基因庫，其含有已知BoNT-中和抗體(,/如，CR1、RAZ1、ING1、ING2)的Vl基因和VH基因譜(重鏈改組)。將scFv基因諳克隆進(jìn)噬菌體展示載體(辦如，pHEN-l，Hoogenboom爭(l991)Wwc/e,'c^c/A19:4133-4137),且在轉(zhuǎn)化后，得到轉(zhuǎn)化體文庫。如實施例所述，制備噬菌體，濃縮，并進(jìn)行選l奪。在每輪選擇中，抗原濃度都降低，從而在最后的選擇輪次之前，達(dá)到低于所需的Kd的濃度。這導(dǎo)致基于親和力選擇噬菌體(Hawkins爭(1992)J.A/o/.fi/o/.226:889-896)。2)通過定點i秀變，增加BoNT-中和抗體的親和力接觸氨基酸側(cè)鏈的大多數(shù)抗原位于互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，3個在VH(CDR1、CDR2和CDR3),且3個在VL(CDR1、CDR2和CDR3)(Chothia爭(1987)丄Mo/.S/o/.'196:901-917;Chothia爭(1986)233:755-8;Nhan爭(1991)丄Mo/.B/o/.'217:133-151)。這些殘基提供負(fù)責(zé)抗體對抗原的親和力的大部分結(jié)合能量。在其它分子中，已經(jīng)表明使接觸配體的氨基酸突變，是增加一種蛋白分子對它的結(jié)合配偶體的親和力的有效方式(Lowman爭(1993)丄Mo/.A'o/.,234:564-578;Wells(1990)腸c/7麵勿,29:8509-8516)。因而，CDR的突變(隨機(jī)化)和針對BoNT/A、BoNT/AHc或本文鑒別出的它們的表位的篩選，可以用于生成具有提高的結(jié)合親和力的BoNT/A-中和抗體。在某些實施方案中，使用例如S25作為模板(Kd=7.3x1(T8M),在分開的文庫中隨機(jī)化每個CDR。為了簡化親和力測量，使用S25或其它更低親和力的BoNT/A-中和抗體作為模板，而不是更高親和力的scFv。組合來自每個CDR文庫的最高親和力突變體的CDR序列，以得到加性的親和力增加。類似的方法已經(jīng)用于將人生長激素(hGH)對生長激素受體的親和力增加了超過1500倍，從3.4x10"g至9.0xl(T13M(Lowman夢(1993)J.Mo/.234:564-578)。為了增加BoNT-中和抗體的親和力，通過合成"摻雜的"寡核香酸，其中野生型核苷酸以辨如49%的頻率存在，將位于一種或多種CDR中的氨基酸殘基(辨如，位于VLCDR3中的9個氨基酸殘基)部分地隨機(jī)化。將該寡核苦酸用于用PCR擴(kuò)增BoNT-中和scFv基因的剩余部分。例如，在一個實施方案中，為了生成其中VhCDR3被隨機(jī)化的文庫，合成寡核苷酸，其退火到BoNT-中和抗體VH構(gòu)架3,并編碼VHCDR3和構(gòu)架4的部分。在要隨機(jī)化的4個位置，可以使用序列NNS,其中N是4種核普酸的任一個，且S是"C"或"T"。將該寡核苷酸用于用PCR擴(kuò)增BoNT/A-中和抗體VH基因，從而生成突變型BoNT-中和抗體Vh基因譜。使用PCR來剪接Vh基因譜與BoNT-中和抗體輕鏈基因，并將得到的scFv基因i普克隆進(jìn)噬菌體展示載體(辨如，pHEN-l或pCANTAB5E)。連接的載體DNA用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)(electrocompetent)大腸桿菌，以生成喧菌體抗體文庫。為了選擇更高親和力的突變型scFv，如實施例所述，在遞減量的一種或多種BoNT亞型上，進(jìn)行噬菌體抗體文庫的每輪選擇。通常，通過96孔平板上的ELISA，可以篩選來自第3輪和第4輪選擇的96個克隆對所需抗原(辨如，BoNT/Al和/或BoNT/A2)的結(jié)合。例如在10ml培養(yǎng)物中表達(dá)來自辨如20-40個ELISA陽性克隆的scFv，收獲周質(zhì)，并通過BIAcore測定scFvk。ff。對具有最慢k。ff的克隆測序，并將每個獨特的scFv亞克隆進(jìn)適宜的載體(辨如，pUC119mycHis)。如本文所述，在培養(yǎng)物中表達(dá)scFv,并純化。通過BIAcore測定純化的scFv的親和力。3)BoNT-中和(scFv')2同源二聚體的生成為了生成BoNT-中和(scFv')2抗體，通過接頭(辨如，碳接頭、肽爭)或通過例如2個半胱氨酸之間的二硫鍵，連接2個BoNT-中和scFv。因而，例如，為了生成二硫鍵連接的BoNT/A-中和scFv，可以通過定點誘變將半胱氨酸殘基導(dǎo)入在BoNT/A-中和scFv的羧基-末端的myc標(biāo)記和六組氨酸標(biāo)記之間。通過DNA測序，證實正確序列的導(dǎo)入。在優(yōu)選實施方案中，構(gòu)建體是在pUC119中，以便pe舊前導(dǎo)序列指導(dǎo)表達(dá)的scFv到周質(zhì)中，且存在導(dǎo)入BoNT/A-中和突變型scFv的克隆位點(Ncol和Notl)。表達(dá)的scFv具有在C-末端的myc標(biāo)記，隨后是2個甘氨酸、1個半胱氨酸，然后是促進(jìn)通過IMAC純化的6個組氨酸。2個半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵后，2個scFv彼此被26個氨基酸(2個11氨基酸myc標(biāo)記和4個甘氨酸)分開。從該構(gòu)建體表達(dá)、通過IMAC純化的scFv可以主要包含單體scFv。為了生產(chǎn)(scFv')2二聚體，通過與1MMp-巰基乙醇一起溫育，還原半胱氨酸，且通過加入DTNB，封閉一半scFv。將封閉的和未封閉的scFv—起溫育，以形成(scFv')2，且得到的材料可以任選地通過凝膠過濾進(jìn)行分析。如本文所述，可以任選地通過BIAcore測定BoNT-中和scFv'單體和(scFv')2二聚體的親和力。在特別優(yōu)選的實施方案中，通過接頭、更優(yōu)選地通過肽接頭連接scFv片段，生成(scFv')2二聚體。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多種方式來實現(xiàn)。例如，一個優(yōu)選方法記載在Holliger爭(1993)OSA90:6444-6448WO94/13804)。通常，通過PCR克隆導(dǎo)入接頭。例如，編碼5氨基酸接頭(G4S，SEQIDNO:136)的合成寡核苷酸可以用于PCR擴(kuò)增BoNT/A-中和抗體Vh和Vl基因，然后將它們剪接到一起，以生成BoNT/A-中和雙抗體基因。然后，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，將該基因克隆進(jìn)適宜的載體，表達(dá)，并純化。4)BoNT-中和(scFv)2、Fab和(Fab')2分子的制備BoNT-中和抗體例如BoNT/A1-A2-中和scFv或具有更高親和力的變體，是適用于生成大小和效價變體的模板。例如，可以從本文所述的親本scFv(辨如CR1、RAZ1、ING1、ING2爭)生成BoNT/Al-A2-中和(scFv')2。使用適宜的限制酶，可以切割scFv基因，并將其克隆進(jìn)本文所述的另一種載體。在一個實施方案中，表達(dá)的scFv具有在C-末端的myc標(biāo)記，隨后是2個甘氨酸、1個半胱氨酸，然后是促進(jìn)純化的6個組氨酸。2個半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵后，2個scFv彼此被26個氨基酸(例如，2個11氛基酸myc標(biāo)記和4個甘氨酸)分開。從該構(gòu)建體表達(dá)scFv,并純化。為了生產(chǎn)(scFv')2二聚體，通過與1mM(3-巰基乙醇一起溫育，還原半胱氨酸，通過加入DTNB，封閉一半scFv。將封閉的和未封閉的scFv—起溫育，以形成(scFv')2，將其純化。在分離了更高親和力scFv時，將它們的基因類似地用于構(gòu)建(scFv')2。使用與Better爭(1988)Sc/e"ce,240:1041-1043所述類似的表達(dá)載體，在義應(yīng)^^"中表達(dá)BoNT/A-中和Fab。為了生成BoNT/A-中和Fab，使用PCR從scFv擴(kuò)增Vh和Vl基因。將VH基因克隆進(jìn)表達(dá)載體(辨如，基于PUC119的細(xì)菌表達(dá)載體)，該載體提供了位于VH基因下游且與其符合讀框的IgGCH1結(jié)構(gòu)域。所述載體也含有l(wèi)ac啟動子、指導(dǎo)表達(dá)的VH-CH1結(jié)構(gòu)域進(jìn)入周質(zhì)的pelb前導(dǎo)序列、指導(dǎo)表達(dá)的輕鏈進(jìn)入周質(zhì)的基因3前導(dǎo)序列、和輕鏈基因的克隆位點。例如通過PCR指紋分析，鑒別含有正確VH基因的克隆。使用PCR,將Vl基因剪接到Cl基因中，并克隆進(jìn)含有VHCH1基因的載體中。B)中和抗體的選擇在優(yōu)選實施方案中，BoNT-中和抗體(通過噬菌體展示、酵母展示、免疫接種方法、雜交瘤技術(shù)等生產(chǎn))的選擇包含，篩選得到的抗體與適宜抗原的特異性結(jié)合。在本發(fā)明的情況下，合適的抗原包括，但不限于BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3Hc、BoNT重鏈的C-末端結(jié)構(gòu)域(結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、BoNT7A3全毒素或重組BoNT結(jié)構(gòu)域例如HC(結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、HN(易位結(jié)構(gòu)域)或LC(輕鏈)。在特別優(yōu)選的實施方案中，選擇中和抗體與由一種或多種本文所述抗體識別的表位的特異性結(jié)合。選擇可以經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知許多方法中的任一種。在優(yōu)選實施方案中，選擇是通過針對所需靶例如BoNT/A或BoNT7AHc的免疫層沖斤(^/^7，<吏用免疫管(immunotube)、Maxisorp、Nunc)。在另一個實施方案中，選擇是針對在表面等離振子共振系統(tǒng)(辦如，BIAcore、Pharmacia)中的BoNTHC,其或者是單獨的，或者是與結(jié)合被一種或多種本文所述抗體特異性地結(jié)合的表位的抗體相組合。選擇也可以4吏用酵母展示文庫的流式細(xì)胞術(shù)來實現(xiàn)。在一個優(yōu)選實施方案中，順序選擇酵母展示文庫，首先在BoNT/Al上，然后在BoNT/A2上，以得到高親和力地結(jié)合BoNT/A的兩種亞型的抗體。對于其它亞型，也可以重復(fù)該-燥作。關(guān)于噬菌體展示，通過在抗體片段基因和基因III之間包含琥珀密碼子，可以簡化結(jié)合的分析。這使得可能簡單地通過改變宿主細(xì)菌品系，容易地在展示的和可溶的抗體片段之間轉(zhuǎn)換。當(dāng)噬菌體在義廯##的s叩E抑制性品系中生長時，抗體基因和基因III之間的琥珀終止密碼子被讀作谷氨酰胺，并在噬菌體表面上展示抗體片段。當(dāng)洗脫的噬菌體用于感染非抑制性品系時，琥珀密碼子被讀作終止密碼子，且細(xì)菌將可溶抗體分泌進(jìn)周質(zhì)和培養(yǎng)基中(Hoogenboom爭(l991)販'/e/d^7^.'19:4133-4137)?？梢詸z測可溶scFv與抗原的結(jié)合，辨如通過使用識別scFv上的C-末端wyc肽標(biāo)記的鼠IgG單克隆抗體(辨如，9E10)的ELISA(Evan夢(1985)M/.Ce〃腸/.，5:3610-3616;M麗o爭(1986)CW/'46:291-300)，例如隨后與綴合到檢測標(biāo)記(辦如，辣根過氧化物酶)上的多克隆抗-小鼠Fc—起溫育。如上文所指出的，通過將scFv基因克隆進(jìn)表達(dá)載體(辨如，表達(dá)載體pUC119mycHIS),其導(dǎo)致在scFv的C-末端添加myc肽標(biāo)記和隨后的六組氨酸標(biāo)記，可以4足進(jìn)BoNT-中和抗體的純化。所述載體也優(yōu)選地編碼果膠酸裂合酶前導(dǎo)序列，其指導(dǎo)scFv表達(dá)進(jìn)細(xì)菌周質(zhì)，在那里切割前導(dǎo)序列。這使得從細(xì)菌周質(zhì)直接收獲天然的正確折疊的scFv成為可能。然后表達(dá)BoNT-中和抗體，并使用固定化的金屬親和層析，從細(xì)菌上清液進(jìn)行純化。C)測量BoNT-中和抗體對一種或多種BoNT亞型的親和力如上面所解釋的，對增加的抗體親抗原性的選擇包含，測量BoNT-中和抗體(或修飾的BoNT-中和抗體)對一種或多種目標(biāo)耙(辦如BoNT/A亞型或其結(jié)構(gòu)域，辨如Hc或其它表位)的親和力。在本文揭_供的實施例中，詳細(xì)描述了進(jìn)行這樣的測量的方法。簡而言之，例如，在BIAcore(—種基于表面等離振子共振的生物傳感器)中，測定BoNT/A-中和抗體的Kd和與BoNT/A結(jié)合的動力學(xué)。關(guān)于該技術(shù)，將抗原偶聯(lián)到能檢測質(zhì)量變化的衍生傳感器芯片上。當(dāng)抗體經(jīng)過傳感器芯片時，抗體結(jié)合抗原，從而導(dǎo)致可定量的質(zhì)量的增加。隨著抗體濃度而變化的結(jié)合速率的測量，可以用于計算結(jié)合速率常數(shù)(k。n)。結(jié)合階段后，使緩沖液經(jīng)過芯片，并測定抗體的解離速率(k。ff)。通常，測量的K。n的范圍是l.Ox102-5.0x106，而k。ff的范圍是l.Ox10"-1.0x10—6。然后，計算平衡常數(shù)Kd為k。ff/k。n，并因而通常測量范圍是l(T5-l(T12。以該方式測量的親和力與通過熒光猝滅滴定在溶液中測量的親和力很好地關(guān)聯(lián)。噬菌體展示和選擇通常導(dǎo)致更高親和力的突變型scFv的選擇(Marks爭(1992)肌o/rec/mo/ogy,10:779-783;Hawkins爭(1992)丄A/o/.^/o/.226.'889-896;Hiechmann爭(1993)S/oc/zem/Wr_y，32:8848-8855;Clackson鄰991)淑廳，352:624-628)，但是可能不導(dǎo)致親和力差異低于6倍的突變體的分離(Riechmann爭(1993)B/oc'/7e"7"^y,32:8848-8855)。因而，需要快速方法來估計選擇后分離的突變型scFv的相對親和力。因為增加的親和力主要源自k。ff的降低，所以測量k。ff應(yīng)鑒別出更高親和力的scFv。在BIAcore中，可以測量細(xì)菌周質(zhì)中未純化的scFv的k。ff,因為表達(dá)水平高得足以產(chǎn)生足夠的結(jié)合信號，且k。ff獨立于濃度。周質(zhì)的和純化的scFv的k。ff值，通常非常一致。V.人或人源化的(嵌合的)抗體生產(chǎn)如上文所指出的，本發(fā)明的BoNT-中和抗體可以施用給生物(辦如，人患者)，以用于治療目的(辨如，治療肉毒中毒)。施用給生物的抗體可能是免疫原性的，所述生物為除了所述抗體在其中產(chǎn)生的以外的。因而，例如，重復(fù)施用給人的鼠抗體經(jīng)常誘導(dǎo)抗所述抗體的免疫應(yīng)答(例如，人抗-小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答)。盡管對于使用本發(fā)明的非人抗體，這通常不是問題，因為它們通常不會重復(fù)使用，但通過將所述抗體的部分或全部改變成特有的人序列，從而分別產(chǎn)生嵌合抗體或人抗體，可以降低所述抗體的免疫原性質(zhì)。A)嵌合抗體嵌合抗體是包含人和非人部分的免疫球蛋白分子。更具體地，嵌合抗體的抗原結(jié)合區(qū)(或可變區(qū))源自非人來源(辨如，鼠)，且嵌合抗體的恒定區(qū)(它賦予免疫球蛋白生物效應(yīng)子功能)源自人來源。嵌合抗體應(yīng)當(dāng)具有非人抗體分子的抗原結(jié)合特異性和人抗體分子賦予的效應(yīng)子功能。大量生成嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參JS，^/i口，美國專利號5,502,167、5,500,362、5,491,088、5,482,856、5,472,693、5,354,847、5,292,867、5,231,026、5,204,244、5,202,238、5,169,939、5,081,235、5,075,431和4,975,369)。通常，用于生產(chǎn)嵌合抗體的方法由下述步驟組成(一些步驟的次序可以互換)(a)筌別和克隆編碼所述抗體分子的抗原結(jié)合部分的正確基因區(qū)段；該基因區(qū)段(對于重鏈，稱作VDJ，即可變、多變和連接區(qū)，或?qū)τ谳p鏈，稱作VJ，即可變、連接區(qū))(或簡稱為V或可變區(qū))可以是cDNA或基因組形式；(b)克隆編碼恒定區(qū)或其所需部分的基因區(qū)段；(c)將可變區(qū)與恒定區(qū)相連接，從而使得完整嵌合抗體以可轉(zhuǎn)錄的和可翻譯的形式編碼；(d)將該構(gòu)建體連接進(jìn)載體，所述載體含有選擇標(biāo)記和基因控制區(qū)例如啟動子、增強(qiáng)子和聚腺苷酸添加信號；(e)在宿主細(xì)胞(辨如，細(xì)菌)中擴(kuò)增該構(gòu)建體；(f)將該DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞(轉(zhuǎn)染)，最經(jīng)常是哺乳動物淋巴細(xì)胞；和在適合表達(dá)嵌合抗體的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞。通過這些方法，已經(jīng)操作了幾種不同抗原結(jié)合特異性的抗體，以制備嵌合蛋白(辦如，抗-TNP:Boulianne爭(1984)7VWwre，312:643;和抗-胂瘤抗原Sahagan夢(1986)J./mw麗o/.,137:1066)。同樣地，通過將新序列連接到編碼抗原結(jié)合區(qū)的那些序列上，已經(jīng)實現(xiàn)了幾種不同效應(yīng)子功能。其中的一些包括酶(Neuberger爭(1984)A^"fw"312:604)，來自另一物種的免疫球蛋白恒定區(qū)和另一免疫球蛋白鏈的恒定區(qū)(Sha畫爭(1984)淑,309:364;Tan等'(1985)//國,/.135:3565-3567)。在一個優(yōu)選實施方案中，重組DNA載體用于轉(zhuǎn)染生產(chǎn)BoNT/A-中和抗體的細(xì)胞系。新的重組DNA載體含有用于替代在細(xì)胞系中編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的基因的全部或部分的"替代基因"(辦如，替代基因可以編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)，特定免疫球蛋白類別，或酶，毒素，生物學(xué)活性肽，生長因子，抑制劑，或促進(jìn)與藥物、毒素或其它分子的綴合的接頭肽的全部或部分，等)，和允許與抗體生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)的免疫球蛋白序列進(jìn)行靶定的同源重組的"靶序列"。在另一個實施方案中，重組DNA載體用于轉(zhuǎn)染生產(chǎn)具有所需效應(yīng)子功能的抗體(辨如，人免疫球蛋白恒定區(qū))的細(xì)胞系，在該情況下，在重組載體中包含的替代基因可以編碼BoNT/A-中和抗體的全部或部分區(qū)域，且在重組載體中包含的靶序列允許抗體生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)的同源重組和靶定的基因修飾。在任一個實施方案中，當(dāng)僅僅替代可變區(qū)或恒定區(qū)的部分時，得到的嵌合抗體可以確定相同抗原和/或4吏相同效應(yīng)子功能被修改或提高，從而嵌合抗體可以表現(xiàn)出更大的抗原特異性、更高親和力的結(jié)合恒定區(qū)、增強(qiáng)的效應(yīng)子功能或轉(zhuǎn)染的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的增強(qiáng)的分泌和生產(chǎn)爭。不論實現(xiàn)的實施方案，整合的DNA的選擇方法(通過選擇標(biāo)記)、嵌合抗體生產(chǎn)的篩選和細(xì)胞克隆，可以用于得到生產(chǎn)嵌合抗體的細(xì)胞克隆。因而，可以將編碼單克隆抗體修飾的DNA片段直接靶向B-細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)的免疫球蛋白基因的位點。任意特定修飾的DNA構(gòu)建體，可以用于改變?nèi)我鈫慰寺〖?xì)胞系或雜交瘤的蛋白產(chǎn)物。這樣的方法避免了高成本且費時的從表達(dá)有用抗原特異性的每個B-細(xì)胞克隆克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的任務(wù)。除了避免克隆可變區(qū)基因的方法以外，當(dāng)基因是在它的天然染色體位置而不是隨機(jī)位置時，嵌合抗體的表達(dá)水平應(yīng)更高。制備嵌合的(人源化的)抗體的詳細(xì)方法，可參見美國專利5,482,856。B)人和人源化抗體在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了人源化的或全人的抗-BoNT-中和抗體(辨:知HuC25、RAZ1、CR1、ING1、ING2爭)。人抗體完全由特性人多肽序列組成。使用許多方法(綜述參I,辨如，Larrick等，美國專利號5,001,065)，可以生產(chǎn)本發(fā)明的人BoNT-中和抗體。在某些優(yōu)選實施方案中，通過修飾和篩選全人單鏈(辨如scFv)文庫，獲得本發(fā)明的全人scFv抗體。因而，在某些實施方案中，使用本文所述的噬菌體和/或酵母展示方法，生產(chǎn)全人抗體。生產(chǎn)全人基因文庫的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，辦如，Vaughn爭(l996)yVa&"S,.o化c/mo/og7，14(3):309-314，Marks爭(1991)乂7kfo/.222:581-597，和PCT/US96/10287)。在另一個實施方案中，在三體瘤(trioma)細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明的人BoNT-中和抗體。然后，將編碼抗體的基因克隆進(jìn)其它細(xì)胞、尤其是非人哺乳動物細(xì)胞，并表達(dá)。通過三體瘤技術(shù)生產(chǎn)人抗體的一般方法，已經(jīng)記載在Ostberg爭(1983)7fy6nWow"2:361-367，Ostberg,美國專利號4,634,664和Engelman等，美國專利號4,634,666。通過該方法得到的抗體生產(chǎn)性細(xì)胞系稱作三體瘤，因為它們源自3種細(xì)胞2種人細(xì)胞和1種小鼠細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三體瘤比從人細(xì)胞制備的普通雜交瘤更穩(wěn)定地生產(chǎn)抗體。三體瘤細(xì)胞的制備，需要初始融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞系和未免疫的人外周B淋巴細(xì)胞。該融合產(chǎn)生含有人和小鼠染色體的異種雜交細(xì)胞(^Ji,Engelman，同上)。選擇已經(jīng)喪失分泌抗體的能力的異種細(xì)胞。優(yōu)選地，選擇抗8-氮烏噤呤的異種細(xì)胞。這樣的細(xì)胞不能在次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)或重氮絲氨酸-次黃嘌呤(AH)培養(yǎng)基上繁殖。通過異種細(xì)胞和針對BoNT多肽(辨如，BoNT/A、BoNT/AHc、表位的子序列爭)免疫的B-淋巴細(xì)胞之間的進(jìn)一步融合，賦予分泌抗體的能力。從人供體的脾、血或淋巴結(jié)，得到B-淋巴細(xì)胞。如果需要抗特定抗原或表位的抗體，則優(yōu)選地使用該抗原或其表位(而不是整個多肽)作為免疫原?；蛘?，從未免疫的個體得到B-淋巴細(xì)胞，并用BoNT多肽或其表位體外地刺激。在另一個變體中，從受感染的或以另外方式免疫的個體得到B-淋巴細(xì)胞，然后通過體外地暴露于BoNT多肽約7-14天，進(jìn)行超免疫化。通過眾所周知的方法，將通過上述方法之一制備的免疫的B-淋巴細(xì)胞與異種雜交細(xì)胞相融合。例如，在約37°C,用40-50%的MW1000-4000的聚乙二醇處理所述細(xì)胞約5-10分鐘。/人融合混合物分離細(xì)胞，并在對所需雜交體選擇性的培養(yǎng)基中繁殖。當(dāng)異種雜交細(xì)胞對8-氮鳥噪呤有抗性時，通過在HAT或AH培養(yǎng)基上連續(xù)傳代細(xì)胞，可以方便地選擇無限增殖化的三體瘤細(xì)胞。其它選擇方法當(dāng)然也是可能的，這取決于在融合中使用的細(xì)胞的性質(zhì)。通過測定三體瘤培養(yǎng)基結(jié)合BoNT多肽或其表位的能力，鑒別出分泌具有要求的結(jié)合特異性的抗體的克隆。通過有限稀釋技術(shù)，亞克隆生產(chǎn)具有所需的特異性的人抗體的三體瘤，并在培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，或注射進(jìn)選擇的宿主動物，并體內(nèi)生長。然后，測試得到的三體瘤細(xì)胞系結(jié)合BoNT多肽或其表位的能力。通過常規(guī)的抗體分級分離方法，例如硫酸銨沉淀、DEAE纖維素層析和親和層析，可以從得到的培養(yǎng)基或體液分離抗體。盡管三體瘤是遺傳上穩(wěn)定的，但它們不以非常高的水平生產(chǎn)抗體。通過將來自三體瘤的抗體基因克隆進(jìn)一種或多種表達(dá)載體，和將所述載體轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞系，例如通常用于表達(dá)重組的或人源化的免疫球蛋白的細(xì)胞系，可以提高表達(dá)水平。與增加抗體得率一樣，該策略提供額外的優(yōu)點，即從不具有人組分的細(xì)胞系獲得免疫球蛋白，且因此不需要進(jìn)行人細(xì)胞系所需的特別廣泛的病毒篩選。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),克隆編碼由三體瘤細(xì)胞系分泌的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的基因(7Z，夢/;^，Sambrook等，Afo/ecw/arC7om'ng.'JZ^6orafor_yMa"wa/'第2版，ColdSpringHarbor,N.Y.,1989;Berger&Kimmel，MethodsinEnzymo/ogy，F(xiàn)o/./52..GwzWetoMo/ecw/arC7om'wg『(ec/zm々wes，AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif"1987;Co爭(1992)/./mmw"o/.，148:1149)。例如，從通過逆轉(zhuǎn)錄三體瘤RNA生產(chǎn)的三體瘤基因組DNA或cDNA，克隆編碼重鏈和輕鏈的基因。克隆通過常規(guī)技術(shù)來實現(xiàn)，包括使用PCR引物，該引物與和待克隆的基因或該基因的區(qū)段側(cè)接或重疊的序列雜交。通常，重組構(gòu)建體包含編碼由三體瘤細(xì)胞系表達(dá)的免疫球蛋白的完整人免疫球蛋白重鏈和/或完整人免疫球蛋白輕鏈的DNA區(qū)段?；蛘?，生產(chǎn)僅編碼第一抗體基因的部分的DNA區(qū)段，所述部分具有結(jié)合和/或效應(yīng)子活性。其它重組構(gòu)建體含有與其它免疫球蛋白基因區(qū)段、尤其是其它人恒定區(qū)序列區(qū)段(重鏈和/或輕鏈)融合的三體瘤細(xì)胞系免疫球蛋白基因區(qū)段?？梢詮母鞣N參照來源選擇人恒定區(qū)序列，包括但不卩艮于在Kabat爭(1987)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices中列出的那些。除了編碼BoNT/A-中和免疫球蛋白或其片段的DNA區(qū)段外，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種重組DNA技術(shù)，例如定點誘變(參iGillman&Smith(1979)Gene,8:81-97;Roberts爭(1987)脂訓(xùn)328:731-734)，可以容易地設(shè)計和生產(chǎn)其它基本上同源的^^飾的免疫球蛋白。這樣的修飾的區(qū)段通常將保留抗原結(jié)合能力和/或效應(yīng)子功能。此外，迄今為止修飾的區(qū)段通常不從原始三體瘤基因組序列改變以阻止在嚴(yán)格條件下與這些序列的雜交。因為，象許多基因一樣，免疫球蛋白基因含有分開的功能區(qū)，每個功能區(qū)具有一種或多種不同的生物活性，所述基因可以與來自其它基因的功能區(qū)相融合，以產(chǎn)生具有新性質(zhì)或新性質(zhì)組合的融合蛋白(辨如，免疫毒素)。才艮據(jù)本文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以克隆和表達(dá)基因組序列?？贵w生產(chǎn)的其它方法包括體外免疫接種人血。在該方法中，生產(chǎn)能生產(chǎn)人抗體的人血淋巴細(xì)胞。從患者收集人外周血，并處理，以回收單核細(xì)胞。然后去除抑制性T-細(xì)胞，并將剩余細(xì)胞懸浮于組織培養(yǎng)基中，向其中加入抗原和自體血清，以及優(yōu)選的非特異性淋巴細(xì)胞激活劑。然后將細(xì)胞溫育一段時間，從而使它們生產(chǎn)所需的特異性抗體。然后將細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞融合，以使細(xì)胞系無限增殖化，從而允許連續(xù)生產(chǎn)抗體(參^美國專利4,716,111)。在另一種方法中，制備生產(chǎn)人BoNT-中和抗體的小鼠-人雜交瘤(參^，辨如，美國專利5,506,132)。其它方法包括轉(zhuǎn)化成表達(dá)人免疫球蛋白基因的鼠的免疫接種，和噬菌體展示篩選(Vaughan爭/^7丄)。VI.測定中和表位的交叉反應(yīng)性在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體特異性地結(jié)合一種或多種被本文所述的抗體(辨如S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、ING2爭)識別的表位。換而言之，特別優(yōu)選的抗體與這些抗體中的一種或多種交叉反應(yīng)。測定交叉反應(yīng)性的方法，是本領(lǐng)域l支術(shù)人員眾所周知的(參f，辨如，Dowbenko爭(1988)/K>o/.62:4703-4711)。這可以通過提供一種或多種附著在固體支持物上的分離的靶BoNT多肽(辦如BoNT/Al和/或BoNT/A2，或所述毒素的重組結(jié)構(gòu)域，例如He)，和測定測試抗體與辦如S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1和/或ING2等竟?fàn)幗Y(jié)合耙BoNT肽的能力來確定。因而，竟?fàn)幗Y(jié)合格式的免疫測定優(yōu)選地用于交叉反應(yīng)性測定。例如，在一個實施方案中，將BoNT/Al和/或A2Hc多肽固定化到固體支持物上。加入測定中的待測抗體(辨:知通過從噬菌體-展示文庫選4奪來產(chǎn)生)與S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、ING2等抗體竟?fàn)幣c固定化的BoNT多肽的結(jié)合。對比測試抗體與S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1和/或ING2等抗體竟?fàn)幣c固定化的蛋白結(jié)合的能力。然后使用標(biāo)準(zhǔn)計算，計算上述蛋白的％交叉反應(yīng)性。如果測試抗體與S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1和/或ING2等抗體中的一種或多種竟?fàn)?，并與相同耙具有相當(dāng)于或大于約1x10—SM的結(jié)合親和力，則預(yù)期該測試抗體是BoNT-中和抗體。在特別優(yōu)選的實施方案中，通過在BIAcore中使用表面等離振子共振，進(jìn)行交叉反應(yīng)性。在BlAcore流動室中，如實施例所述，將BoNT多肽(辨如，BoNT/Al和/或BoNT/A2H。)偶聯(lián)到傳感器芯片(辨如CM5)上。以5(al/分鐘的流速，將100nM-1(iM抗體滴定注射到流動室表面上約5分鐘，以確定導(dǎo)致表面幾乎飽和的抗體濃度。然后，使用產(chǎn)生幾乎飽和和至少100RU結(jié)合的抗體的濃度的抗體對，評價表位作圖或交叉反應(yīng)性。對于對中的每個成員，測定結(jié)合的抗體的量，然后將2種抗體混合到一起，以產(chǎn)生等于用于測量單一抗體的濃度的終濃度。當(dāng)一起注射時，識別不同表位的抗體表現(xiàn)出結(jié)合的RU的基本上加性的增加，而識別相同表位的抗體僅僅表現(xiàn)出RU的最小增力口(參jE^滋^)。在特別優(yōu)選的實施方案中，如果在一起"注射"時，抗體表現(xiàn)出基本上加性的增加(優(yōu)選地以至少約1.4的因子增加，更優(yōu)選地以至少約1.6的因子增加，且最優(yōu)選地以至少約1.8或2的因子增加)，則稱所述抗體是交叉反應(yīng)性的。通過許多其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參i，辨如，Geysen爭(1987)//畫磨/.臉仇102,259-274),可以確定在所需表位的交叉反應(yīng)性。該技術(shù)包含，合成大量重疊BoNT肽。然后針對一種或多種原型抗體(辨如，CR1、RAZ1、ING1、ING2爭)篩選合成的肽，且通過結(jié)合特異性和親和力，可以鑒別出被這些抗體特異性地結(jié)合的特征表位。這樣鑒別出的表位可以方便地用于本文所述的竟?fàn)帨y定，以鑒別交叉反應(yīng)性的抗體。使用"多大頭針"肽合成技術(shù)(參^，辨如，Geysen爭(1987)5Wwce，235:1184-1190),可以方便地制備用于表位作圖的肽。4吏用一種或多種BoNT亞型的已知序列(參^，辨如，Atassi爭(1996)義C/7em.,7:691-700和其中引用的文獻(xiàn))，可以以順序方式，在一個或多個96-孔微量培養(yǎng)板陣列的塑料大頭針上，單個地合成重疊BoNT多肽序列。使用該多大頭針肽系統(tǒng)進(jìn)行表位作圖的方法，記載在美國專利5,739,306。簡而言之，首先用含有溶于PBS中的2%牛血清清蛋白和0.1%吐溫20的預(yù)涂布緩沖液在室溫處理大頭針1小時。然后，將大頭針插入96-孔微量培養(yǎng)板的個別孔中，所述孔含有溶于預(yù)涂布緩沖液中的抗體，辨如為2jug/ml。溫育優(yōu)選地是在室溫約1小時。在PBST中洗滌大頭針(辨如，每10分鐘沖洗3次)，然后在96-孔微量培養(yǎng)板的孔中在室溫溫育1小時，所述孔含有100pl1:4,000稀釋的HRP-纟晨合的山羊4元-小鼠1gG(Fc)(JacksonImmunoResearchLaboratories)。如前所述洗滌大頭針后，將大頭4十置于孔中在室溫30分鐘進(jìn)行顏色反應(yīng)，所述孔含有過氧化物酶底物2,2'-連氮基-雙[3-乙基苯并p塞唑啉-b-磺酸](ABTS)二銨溶液和H202(Kirkegaard&PerryLaboratoriesInc.,Gaithersburg,Md,)。通過平板讀數(shù)器(辨如,BioTekELISA平板讀數(shù)器)，針對492nm背景吸收波長在405nm讀平板。表現(xiàn)出顯色的孔指示著這些孔中的BoNT/AHc肽與S25、C25、C39、1C6或1F3抗體的反應(yīng)性。VII.測定抗-BoNT抗體的中和活性優(yōu)選的本發(fā)明抗體單獨地或組合地，起中和(減少或消除)肉毒4干菌神經(jīng)毒素A型的毒性的作用?？梢泽w內(nèi)或體外地評價中和。體內(nèi)中和測量簡單地包含，測量由于存在一種或多種待測中和活性的抗體，BoNT神經(jīng)毒素施用引起的致死率(辨如，LD5()或其它標(biāo)準(zhǔn)度量)的變化。神經(jīng)毒素可以直接施用給測試生物(辦如小鼠)，或生物可以攜帶肉毒中毒感染(斧/如，被肉毒梭菌感染)?？梢栽谧⑸銪oNT神經(jīng)毒素或感染實驗動物之前、過程中或之后，施用抗體。進(jìn)展速率或死亡率的降低，指示著抗體具有中和活性。中和活性的一種合適的體外測定使用半膈制劑(Deshpande爭(1995)7bx/co,33:551-557)。簡而言之，將左和右膈神經(jīng)半膈制劑懸浮于生理溶液中，并維持在恒溫(,/如36。0)。超大地刺激膈神經(jīng)(辨如^0.05Hz，以0.2ms持續(xù)時間的方波)。使用連接到圖表記錄器上的力位移轉(zhuǎn)換器(辨如，GmssModelFT03)，測量等長顫搐張力。將純化的抗體與純化的BoNT(辨如BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/B爭)在室溫溫育30分鐘，然后加入組織浴中，從而產(chǎn)生約2.0x1(T8M的最終抗體濃度和約2.0x10—11M的最終BoNT濃度。對于每種研究的抗體，測定達(dá)到50%顫搐張力減少的時間(辨如，且對于單獨的BoNT，測量3次；且對于抗體+BoNT，測量3次)。通過標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計學(xué)分析(A/如雙尾(two-tailed)Z在標(biāo)準(zhǔn)的顯著性水平(辨如，認(rèn)為<0.05的P值是顯著的)，測定達(dá)到特定(任意)百分比(辨如50%)顫搐減少的時間之間的差異。VIII.it斷測定如上面所解釋的，本發(fā)明抗-BoNT抗體可以用于BoNT毒素(辨如BoNT/Al毒素)的體內(nèi)或體外檢測，并因而可以用于肉毒中毒的診斷(辨如確認(rèn)診斷)。從生物獲取的生物學(xué)樣品中BoNT的一企測和/或定量，是該生物感染肉毒梭菌的指示?？梢远吭醋曰颊叩纳飳W(xué)樣品，例如源自患者的細(xì)胞或組織樣品中的BoNT抗原。本文使用的生物學(xué)樣品是含有可以與肉毒梭菌感染相關(guān)聯(lián)和指示該感染的BoNT濃度的生物學(xué)組織或流體樣品。優(yōu)選生物學(xué)樣品包括血液、尿、唾液和組織活組織一全查。盡管樣品通常采自人患者，但所述測定可以用于檢測來自一般哺乳動物的細(xì)胞中的BoNT抗原，所述哺乳動物例如狗、貓、羊、牛和豬，且最特別是靈長類動物，例如人、黑猩猩、大猩猩、獼猴和狒狒，和嚙齒類動物例如小鼠、大鼠和力豕鼠。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，最一般地通過活組織檢查或靜脈穿刺術(shù)，從患者分離組織或流體樣品。通過在適宜的緩沖溶液中稀釋，或根據(jù)需要進(jìn)行濃縮，任選地在必要時預(yù)處理樣品?？梢允褂迷谏韕H的眾多標(biāo)準(zhǔn)含水緩沖溶液中的任一種，其中使用許多緩沖劑之一，例如磷酸鹽、Tris等。A)免疫結(jié)合測定使用一種或多種本發(fā)明的抗-BoNA抗體作為特異性地結(jié)合BoNT多肽的捕獲劑，可以在免疫測定中檢測BoNT多肽(辨如，BoNT/Al、BoNT/A2夢)。本文使用的免疫測定是使用抗體(夠如BoNT/A-中和抗體)來特異性地結(jié)合分析物(辨如，BoNT/A)的測定。所述免疫測定的特征在于，一種或多種抗-BoNT抗體與耙(辨如一種或多種BoNT/A亞型)的結(jié)合，這與其它用以分離、靶向和定量所述BoNT分析物的物理或化學(xué)性質(zhì)成對比。使用許多非常公認(rèn)的免疫結(jié)合測定中的任一種(參見，辦i。，美國專利4,366,241;4,376,110;4,517,288;和4,837,168等)，可以檢測和定量BoNT標(biāo)記。關(guān)于一^:免疫測定的綜述，也參見MethodsinCellBiologyVolume37:AntibodiesinCellBiology,Asai，編AcademicPress,Inc.NewYork(1993);Bos、/cC7/m.ca//附m麗o/ogj1第7版，Stites&Terr,編(1991))。本發(fā)明的免疫測定可以以許多構(gòu)造形式的任一種來進(jìn)行(參^，辦如，Maggio(編)(1980)Ewz戸e/mmw即owayCRCPress,BocaRaton,Florida;Tijan(1985)"PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,"丄a/70rafo^yrec/mz々wesB/oc/ze脂'欲yMo/ecw/arJ5/o/ogy,ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam;Harlow和Lane,同上；Chan(編)(1987)/wwimo(X^ay.'J尸rac/7ca/GWc/eAcademicPress,Orlando,FL;Price禾口Newman(纟扁)(1991)/V/wcZ//e-s10//w附w"o"s5"j)AS"StocktonPress,NY;和Ngo(編)(1988)jVow/w2w2簡o(x^a3ASPlenumPress,NY綜述的那些)。免疫測定經(jīng)常使用標(biāo)記試劑來特異性地結(jié)合和標(biāo)記由捕獲劑和分析物形成的結(jié)合復(fù)合物(辨如，B0NT/A-中和抗體/B0NT/A復(fù)合物)。標(biāo)記試劑本身可以是構(gòu)成抗體/分析物復(fù)合物的部分之一。因而，例如，標(biāo)記試劑可以是標(biāo)記的BoNT/A多肽或標(biāo)記的抗-BoNT/A抗體。或者，標(biāo)記試劑任選地是第三部分，例如另一種抗體，其特異性地結(jié)合BoNT抗體、BoNT肽、抗體/多肽復(fù)合物、或共價地連接到BoNT多肽或抗-BoNT抗體的修飾的捕獲基團(tuán)(辦如，生物素)。在一個實施方案中，標(biāo)記試劑是特異性地結(jié)合抗-BoNT抗體的抗體。這樣的試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且最一般地包含標(biāo)記的抗體，其特異性地結(jié)合抗-BoNT抗體所來源的特定動物物種的抗體(W如，抗-物種抗體)。因而，例如，當(dāng)捕獲劑是人來源的BoNT/A-中和抗體時，標(biāo)記試劑可以是小鼠抗-人IgG，伊對人抗體恒定區(qū)特異性的抗體。能特異性地結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的其它蛋白，例如鏈球菌A蛋白或G蛋白，也可以用作標(biāo)記試劑。這些蛋白是鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞壁的正常組分。它們表現(xiàn)出強(qiáng)烈的與來自許多物種的免疫球蛋白恒定區(qū)的非免疫原性反應(yīng)性(遞,參^Kronval，等，(1973)丄/聽磨/.,111:1401-1406,和Akerstrom，等，(1985)J./附w腦o/.,135:2589-2542，等)。在整個測定中，在每次組合試劑后，可能需要溫育和/或洗滌步驟。溫育步驟可以為約5秒至幾小時，優(yōu)選為約5分鐘至約24小時。但是，溫育時間將依賴于測定形式、分析物、溶液體積、濃度等。通常，在環(huán)境溫度進(jìn)行測定，盡管它們可以在一定溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，例如5。C至45°C。1)非竟?fàn)幮詼y定形式在某些實施方案中，用于才企測BoNT神經(jīng)毒素(辨如BoNT血清型和/或亞型)的免疫測定是竟?fàn)幮缘幕蚍蔷範(fàn)幮缘摹７蔷範(fàn)幮悦庖邷y定是直接測量捕獲的分析物(在該情況下，BoNT多肽)的量的測定。例如，在一個優(yōu)選的"夾心"測定中，將捕獲劑(辨如，抗-BoNT抗體)直接或間接地結(jié)合到固體基質(zhì)上，將它固定化在那里。這些固定化的抗-BoNT抗體捕獲存在于試驗樣品(辦如，血液樣品)中的BoNT多肽。這樣固定化的BoNT多肽然后被標(biāo)記試劑結(jié)合，所述標(biāo)記試劑例如攜帶標(biāo)記的SoA07A-中和抗體?；蛘撸诙贵w可以缺少標(biāo)記，但是它又可以被標(biāo)記的第三抗體結(jié)合，所述第三抗體對第二抗體所來源的物種的抗體是特異性的。洗掉游離的標(biāo)記的抗體，并檢測剩余的結(jié)合的標(biāo)記的抗體(辨如，使用Y檢測器，其中標(biāo)記是放射性的)。2)竟?fàn)幮詼y定形式在竟?fàn)幮詼y定中，通過測量由存在于樣品中的分析物從捕獲劑(辨如，BoNT/A-中和抗體)置換(或竟?fàn)幊?的添加的(外源性的)分析物的量，間接測量存在于樣品中的分析物(辨如，BoNT/A)的量。例如，在一個竟?fàn)幮詼y定中，將已知量的BoNT/A加入含有未確定量的BoNT/A的試驗樣品中，并使樣品接觸特異性地結(jié)合BoNT/A的捕獲劑，辨如，BoNT/A-中和抗體。加入的結(jié)合BoNT/A-中和抗體的BoNT/A的量，與存在于試驗樣品中的BoNT/A的濃度成反比?？梢詫oNT/A-中和抗體固定化在固體基質(zhì)上。通過測量存在于BoNT/A-BoNT/A-中和抗體復(fù)合物中的BoNT/A的量，或通過測量剩余的未復(fù)合的BoNT/A的量，測定結(jié)合到BoNT/A-中和抗體上的BoNT/A的量。B)非特異性結(jié)合的減少技術(shù)人員將明白，經(jīng)常需要減少免疫測定中和分析物純化過程中的非特異性結(jié)合。當(dāng)測定包含例如BoNT/A多肽、BoNT/A-中和抗體、或固定化在固體基質(zhì)上的其它捕獲劑時，需要使與基質(zhì)的非特異性結(jié)合的量最小化。減少這樣的非特異性結(jié)合的方式，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。通常，這包含，給基質(zhì)包被蛋白組合物。具體地，廣泛地使用諸如牛血清清蛋白(BSA)、脫脂奶粉和明膠的蛋白組合物。C)基質(zhì)如上所述，依賴于測定，任選地將各種組分(包括BoNT多肽、抗-BoNT抗體爭)結(jié)合到固體表面上。許多用于固定化生物分子到多種固體表面上的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，固體表面可以是膜(辨如，硝酸纖維素)、微量滴定盤(辨如，PVC、聚丙烯或聚苯乙烯)、試管(玻璃或塑料)、測量尺(辨如，玻璃、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯、膠乳等)、微量離心管、或玻璃、二氧化硅、塑料、金屬或聚合物珠?？梢怨矁r地結(jié)合或通過非特異性結(jié)合非共價地附著所需組分。許多種有才幾的和無機(jī)的、天然的和合成的聚合物，可以用作固體表面的材料。示例性的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-曱基丁烯)、聚苯乙烯、聚曱基丙烯酸酯、聚對苯二曱酸乙二酯、人造絲、尼龍、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅氧烷、聚曱醛、纖維素、乙酸纖維素、硝酸纖維素等。可以使用的其它材料包括紙、玻璃、陶瓷、金屬、準(zhǔn)金屬、半導(dǎo)體材料、水泥等。另外，可以使用形成凝膠的物質(zhì)，例如蛋白(#/如，明膠)、脂多糖、硅酸鹽、瓊脂糖和聚丙烯酰胺。形成幾個水相的聚合物例如葡聚糖、聚(亞烷基)二醇，或表面活性劑例如磷脂、長鏈(12-24碳原子)烷基銨鹽等，也是合適的。當(dāng)固體表面是多孔的時，依賴于系統(tǒng)的性質(zhì)，可以使用各種孔徑。在制備表面中，可以使用許多不同的材料，翔如作為疊層，以得到各種性質(zhì)。例如，蛋白包衣例如明膠，可以用于避免非特異性結(jié)合、簡化共價綴合、增強(qiáng)信號檢測等。如果需要化合物和表面之間的共價結(jié)合，則表面通常是多功能的，或能被多功能化?？梢源嬖谟诒砻嫔喜⒂糜谶B接的官能團(tuán)可以包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羥基、巰基等。將許多種化合物連接到各種表面上的方式，是眾所周知的，并在文獻(xiàn)中詳細(xì)地闡明。參見，例^口,/mmo^7//zec/￡/7z_ymw，IchiroChibata，HalstedPress,NewYork,1978，和Cuatrecasas,(1970)丄編.dm.2453059。除了共價結(jié)合外，可以使用各種非共價結(jié)合測定組分的方法。非共價結(jié)合通常是化合物向表面的非特異性吸收。通常，用第二種化合物封閉表面，以阻止標(biāo)記的測定組分的非特異性結(jié)合?；蛘撸瑢⒈砻孢M(jìn)行設(shè)計，從而使得它非特異性地結(jié)合一種組分，但是不顯著結(jié)合另一種組分。例如，攜帶凝集素例如伴刀豆球蛋白A的表面，將結(jié)合含有碳水化合物的化合物，但是不結(jié)合缺少糖基化的標(biāo)記的蛋白。在美國專利號4,447,576和4,254,082中，綜述了用于非共價附著測定組分的各種固體表面。D)其它測定形式通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多其它方式中的任一種，也可以沖企測和定量BoNT多肽或抗-BoNT抗體(辦如BoNT/A中和抗體)。這些包括分析型生化方法例如分光光度法、射線照相術(shù)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴(kuò)散(hyperdiffusion)層析等，和各種免疫學(xué)方法例如流體或凝膠沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散(單或雙)、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫熒光測定等。蛋白印跡分析和相關(guān)方法也可以用于;f全測和定量BoNT多肽在樣品中的存在。該技術(shù)通常包含，在分子量的基礎(chǔ)上，通過凝膠電泳分離樣品產(chǎn)物，將分離的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至合適的固體支持物(例如硝酸纖維素濾器、尼龍濾器或衍生的尼龍濾器)，和將樣品與特異性地結(jié)合BoNT多肽的抗體一起溫育。所述抗體特異性地結(jié)合固體支持物上的目標(biāo)生物試劑。這些抗體被直接標(biāo)記，或隨后使用標(biāo)記的抗體(辦如，標(biāo)記的羊抗-人抗體，其中標(biāo)記基因的抗體是人抗體)進(jìn)行檢測，所述標(biāo)記的抗體特異性地與結(jié)合BoNT多肽的抗體結(jié)合。其它測定形式包括脂質(zhì)體免疫測定(LIA),它們使用設(shè)計用于結(jié)合特定分子(辨如，抗體)和釋放被嚢化的試劑或標(biāo)記的脂質(zhì)體。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見，Monroe等，(1986)C//".Aev.5:34-41)，檢測釋放的化學(xué)試劑。E)抗-BoNT(辨如，BoNT/A-中和)抗體的標(biāo)記通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法之一，可以標(biāo)記抗-BoNT抗體。因而，例如，標(biāo)記試劑可以是，辨如，單克隆抗體、多克隆抗體、蛋白或復(fù)合物，例如本文所述的那些，或聚合物例如親和基質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì)。通過任意已知方法進(jìn)行檢測，包括免疫印跡、蛋白印跡分析、凝膠遷移率變動分析、放射性或生物發(fā)光標(biāo)記的示蹤、核》茲共振、電子順磁共振、停流光譜學(xué)、柱層析、毛細(xì)管電泳或基于大小和/或電荷變化的示蹤分子的其它方法。在測定中使用的具體標(biāo)記或可檢測的基團(tuán)，不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面?？蓹z測的基團(tuán)可以是具有可檢測的物理或化學(xué)性質(zhì)的任意材料。這樣的可檢測的標(biāo)記已經(jīng)在免疫測定領(lǐng)域^艮好地開發(fā)，且通常，在這樣的方法中有用的任意標(biāo)記都可以用于本發(fā)明。因而，標(biāo)記是通過光譜的、光化學(xué)的、生化的、免疫化學(xué)的、電的、光學(xué)的或化學(xué)的方式可檢測的任意組合物。在本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括^茲珠(,/^DynabeadsTM)、熒光染料(辨如，異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明等)、放射性標(biāo)記(辨介，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(辨如，LacZ、CAT、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和通常用作可檢測酶的其它酶，無論作為標(biāo)記基因產(chǎn)物還是在ELISA中)和比色標(biāo)記例如膠態(tài)金或有色玻璃或塑料(^/如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳爭)珠。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，可以將標(biāo)記直接或間接偶聯(lián)到所需測定組分上。如上文所指出的，可以使用許多種標(biāo)記，標(biāo)記的選擇取決于要求的靈敏度、綴合化合物的容易、穩(wěn)定性要求、可利用的儀器和處理規(guī)定。非放射性標(biāo)記經(jīng)常通過間接方式進(jìn)行附著。通常，將配體分子(辦如，生物素)共價結(jié)合到分子上。配體然后結(jié)合抗-配體(辦余，鏈霉抗生物素蛋白)分子，后者是固有地可檢測的或共價地結(jié)合到信號系統(tǒng)上，例如可檢測的酶、焚光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物?？梢允褂迷S多配體和抗-配體。當(dāng)配體具有天然抗-配體時，例如，生物素、甲狀腺素和氫化可的松，它可以與標(biāo)記的、天然產(chǎn)生的抗-配體結(jié)合使用?；蛘?，任意半抗原或抗原化合物可以與抗體結(jié)合使用。所述分子也可以直接綴合到信號產(chǎn)生性化合物上，辨^,通過與酶或熒光團(tuán)綴合。作為標(biāo)記的目標(biāo)酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素和它的衍生物，羅丹明和它的衍生物，丹磺酰，傘形酮，等。化學(xué)發(fā)光化合物包括螢光素和2，3-二氫酞。秦二酮，辨如，魯米諾。關(guān)于可以使用的各種標(biāo)記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，參見，美國專利號4,391,904，其在本文引作參考。檢測標(biāo)記的方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。因而，例如，當(dāng)標(biāo)記是放射性標(biāo)記時，檢測方式包括閃爍計數(shù)器或在放射自顯影中的照相膠片。當(dāng)標(biāo)記是熒光標(biāo)記時，它可以如下檢測用適宜波長的光來激發(fā)熒光染料，并檢測得到的熒光，辨如，通過顯微鏡術(shù)、目檢、通過照相膠片、通過使用電子檢測器例如電荷耦合設(shè)備(CCD)或光電倍增器等。類似地，通過提供酶的適宜底物，和檢測得到的反應(yīng)產(chǎn)物，可以4企測酶促標(biāo)記。最后，通過觀察與標(biāo)記有關(guān)的顏色，可以簡單地檢測簡單的比色標(biāo)記。因而，在各種測量尺測定中，綴合的金經(jīng)常呈現(xiàn)粉紅色，而各種綴合的珠呈現(xiàn)珠的顏色。有些測定形式不需要使用標(biāo)記的組分。例如，凝集測定可以用于檢測BoNT肽的存在。在該情況下，用包含靶抗體的樣品，凝集抗原-包被的顆粒。在該形式中，不需要標(biāo)記任何組分，且通過簡單的目檢，才企測耙抗體的存在。IX.藥物組合物本發(fā)明的BoNT-中和抗體可以用于減輕肉毒中毒的進(jìn)展，所述肉毒中毒由例如內(nèi)源性疾病過程或化學(xué)/生物戰(zhàn)試劑產(chǎn)生。通常，將包含一種、或優(yōu)選2種或更多種不同抗體的組合物施用給需要它的哺乳動物(辨如，人)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用高親和力地結(jié)合特定BoNT血清型的2種或更多種亞型的中和抗體，可以特別有效地中和肉毒中毒神經(jīng)毒素(BoNT)亞型。盡管這可以通過使用針對每種亞型的2種或更多種不同抗體來實現(xiàn)，但這是低效率的、無效的且不實際的。給定BoNT的高毒性，希望BoNT治療劑是非常有效的。因為通常必須使用多種抗體來以所需效力中和給定BoNT血清型(參見下面和圖5、6、16和17)，所以如果必須使用每種亞型的不同抗體，則從生產(chǎn)觀點看，所需抗體的數(shù)目將是難以接受的。增加混合物中抗體的數(shù)目，也降低效力。因而，如果在4種抗體的混合物中，2種中和Al，且2種中和A2毒素，則僅僅50%抗體將中和給定毒素。相反地，二者都中和A1和A2毒素的2種抗體的混合物，對任一種毒素都將具有100%活性，且將更容易生產(chǎn)。例如對于兩種BoNT/A亞型(A1、A2),可以用2-3種抗體實現(xiàn)有效的中和。如果BoNT/Al和BoNT/A2中和需要不同抗體，則需要4-6種抗體。對于額外的亞型，復(fù)雜性進(jìn)一步增加。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含高親和力地結(jié)合2種或更多種BoNT亞型(辨如，BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3夢)的中和抗體。還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人們開始組合中和抗體時，抗體組合的效力急劇增加。該增加使得生成用于治療用途所需效力的肉毒桿菌抗體成為可能。還令人驚奇地，當(dāng)人們開始組合2和3種單克隆抗體時，識別的特定BoNT表位變得不太重要。因而，例如，如實施例5所表明的，結(jié)合BoNT的易位結(jié)構(gòu)域和/或催化結(jié)構(gòu)域的抗體具有中和活性，當(dāng)相互組合時，或當(dāng)與識別BoNT受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HC)的mAb組合時，都可以有效地中和BoNT活性。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明預(yù)期組合物，其包含至少2種、更優(yōu)選至少3種結(jié)合BoNT上的非重疊表位的高親和力抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明預(yù)期組合物，其包含2種或更多種、優(yōu)選3種或更多種選自下述的不同抗體3D12、RAZ1、CR1、ING1、ING2和/或包含一個或多個來自這些抗體的CDR的抗體，和/或一種或多種包含自這些抗體的突變體的抗體，例如ING1的1D11、2G11和5G4突變體。本發(fā)明的BoNT-中和抗體可以用于腸胃外、體表、經(jīng)口或局部施用，例如通過氣溶膠或經(jīng)皮地，以用于預(yù)防和/或治療性處理。依賴于施用方式，可以在許多單位劑量形式中施用藥物組合物。例如，適用于經(jīng)口施用的單位劑量形式包括粉末、片劑、丸劑、膠嚢和糖錠。當(dāng)經(jīng)口施用時，優(yōu)選地保護(hù)本發(fā)明的包含抗體的藥物組合物免受消化。這通常通過使抗體與組合物相混合，以使它們對酸和酶促水解有抗性，或通過將抗體包裝在適當(dāng)抗性的載體例如脂質(zhì)體中來實現(xiàn)。保護(hù)蛋白免受消化的方法，是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明的藥物組合物特別適用于腸胃外施用，例如靜脈內(nèi)施用或施用進(jìn)體腔或器官內(nèi)腔中。用于施用的組合物通常將包含一種或多種BoNT-中和抗體溶于藥學(xué)可4妄受的載體、優(yōu)選含水載體中的溶液?？梢允褂迷S多種含水載體，辨如，緩沖鹽水等。這些溶液是無菌的，且通常不含有不需要的物質(zhì)。通過常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)，可以將這些組合物滅菌。根據(jù)需要，所述組合物可以含有藥學(xué)可接受的輔料，以接近生理條件，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化釣、乳酸鈉等。這些制劑中BoNT/A-中和抗體的濃度可以廣泛變化，且將主要根據(jù)選擇的特定施用方式和患者的需要，基于流體體積、粘度、體重等進(jìn)行選擇。因而，用于靜脈內(nèi)施用的一般藥物組合物可以是每位患者每天約0.1-10mg?？梢允褂妹课换颊呙刻旒s1mg至最高達(dá)約200mg的劑量。制備可腸胃外施用的組合物的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或顯而易見的,且更i,纟田i也i己載在諸^口iem/"gto"、P/zaA7wacew"c"/Scz,ewce,第15版，MackPublishingCompany,Eastern,Pennsylvania(1980)的出版物中。含有本發(fā)明的BoNT-中和抗體或其混合物的組合物，通常用于治療性處理。優(yōu)選的藥物組合物以足以中和(減輕或消除)BoNT毒素(伊減少或消除BoNT中毒(肉毒中毒)的癥狀)的劑量施用。足以實現(xiàn)該目的的量，定義為"治療有效劑量"。對于該用途有效的量，將取決于疾病的嚴(yán)重性和患者健康的總體狀況。依賴于患者需要和耐受的劑量和頻率，可以施用組合物一次或多次。在任何情況下，組合物應(yīng)當(dāng)提供足夠量的本發(fā)明的抗體，以有效地治療患者。X.診斷或治療用試劑盒在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其用于治療肉毒中毒，或用于檢測/確認(rèn)肉毒梭菌感染。所述試劑盒通常包含一種或多種本發(fā)明的抗-BoNT抗體(辨如，用于藥物用途的BoNT-中和抗體)。對于診斷目的，可以任選地標(biāo)記抗體。另外，所述試劑盒通常包括指導(dǎo)材料，其公開了使用BoNT-中和抗體治療肉毒中毒癥狀的方法。所述試劑盒也可以包括其它組分，以促進(jìn)試劑盒的設(shè)計的特定用途。因而，例如，當(dāng)試劑盒含有一種或多種用于檢測或診斷BoNT亞型的抗-BoNT抗體時，可以標(biāo)記所述抗體，且所述試劑盒可以另外含有一全測所述標(biāo)記的工具(辨如酶促標(biāo)記的酶底物，用于檢測熒光標(biāo)記的濾器裝置，適宜的第二標(biāo)記例如羊抗-人抗體等)。所述試劑盒可以另外包括緩沖劑和常規(guī)地用于實踐特定方法的其它試劑。這樣的試劑盒和適宜的內(nèi)容物是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在某些實施方案中，提供用于治療肉毒中毒的試劑盒包含一種或多種BoNT中和抗體。所述抗體可以分開地提供，或混合在一起提供。通常，所述抗體提供在無菌的藥理學(xué)可接受的賦形劑中。在某些實施方案中，所述抗體可以預(yù)裝載在遞送裝置(辦如，一次性注射器)中提供。所述試劑盒可以任選地包括指導(dǎo)材料，其教導(dǎo)抗體的用途、推薦的劑量、禁忌癥等。實施例提供下面的實施例，其僅作為解釋，而不是作為限制。技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到可以改變或修改許多非關(guān)鍵參數(shù)以產(chǎn)生基本上類似的結(jié)果。實施例1肉毒桿菌神經(jīng)毒素中和抗體的制備才才泮牛禾口方法A)寡核苷酸設(shè)計如以前關(guān)于人V-基因引物所述(Marks，爭(1991)丄Mo/.222:581-597;Marks，等，J./mm冊o/.21:985-991),設(shè)計家族-特異性的鼠Vh和Vk引物，以擴(kuò)增全長重排的V基因。簡而言之，從Kabat(Kabat，爭(1991)5^we/"2cesOotoVwc>//mw調(diào)o/og/ca///7femf,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice,Bethesda，MD)和GenBank數(shù)據(jù)庫收集鼠Vh和VkDNA序列，比對，并根據(jù)家族分類，且設(shè)計家族特異性的引物，以退火到包含構(gòu)架1的前23個核苷酸。類似地，設(shè)計Jh和JK基因-區(qū)段特異性的引物，以退火到包含4個Jh和5個Jk基因區(qū)段中的每一個的最后24個核苷酸(Kabat,爭^j:)。B)載體構(gòu)建為了構(gòu)建載體pSYN3，使用PCR,利用引物L(fēng)MB3(Marks,爭(1991)￡紅.丄/wmwo/.21:985-991)和E-tagback(5'-ACCACCGAATTCTTATTAATGGTGATGATGGTGGATGACCAGCCGGTTCCAGCGG-3'(SEQIDNO:137),從pCANTAB5E(PharmaciaBiotech,Milwaukee,WI.)擴(kuò)增1.5kb填充片^:。用S//I和iVof/消化該DNA片段，凝膠純化，并連接進(jìn)用S/ZI和Notl消化的pCANTAB5E。連接的DNA用于轉(zhuǎn)4b大腸4干菌TGI(Gibson(1991)^wd/wo"五;w^/"-Ba〃Wmst/m'vers7.(y。/Caw6"Wge，Caw厶nWge't/.AT.),并通過DNA測序，鑒別含有正確插入片段的克隆。得到的載體允許將噬菌體-展示的scFv亞克隆為S力7-iVo〃4'Mco/-A^/々度，以作為含有C-末端E表位標(biāo)記、隨后是六組氨酸標(biāo)記的天然scFv分泌進(jìn)義應(yīng)^f,周質(zhì)中。C)免疫接種為了構(gòu)建文庫1,在第0、2和4周，用純BoNT/AHc(OphidianPharmaceuticals,Madison,WI.)免疫BALB/c小鼠(16-22g)。給每只動物皮下給予1|ig吸附到明礬(PierceChemicalCo"Rockford，IL.)上的材料，體積為0.5ml。第二次免疫接種后，用100,00050%致死劑量的純BoNT/A攻擊小鼠2周，并在l周后將其處死。為了構(gòu)建文庫2，在第0、2和4周，用純BoNT/AHc免疫CD-l小鼠(16-22g)，并在第三次免疫接種后2周將其處死。對于2個文庫，在處死后立即取出脾，并通過Cathala爭(1993)DA^2:329的方法，提取總RNA。D)文庫構(gòu)建如以前在Marks,鄰991)J.M/.222:581-597中所述的，從約10pg總RNA合成第一鏈cDNA,例外是，用10pmol每種寡核普酸MIgGlFor、MlgG3For和MCKFor(表3),特異性地引發(fā)免疫球蛋白mRNA。為了構(gòu)建文庫1，使用可商業(yè)得到的Vh和Vk反向引物和Jh和Jk正向引物(重組p盆菌體抗體系統(tǒng)；PharmaciaBiotech),乂人第一鏈cDNA擴(kuò)增重排的Vh和Vk基因。對于文庫2，與Jh或Jk基因-區(qū)段-特異性的正向引物的等摩爾混合物聯(lián)合使用家族特異性的Vh和Vk反向引物的等摩爾混合物，以嘗試增加文庫多樣性(參見上面的"寡核苷酸設(shè)計")。在50卞1反應(yīng)混合物中，分開地擴(kuò)增重排的Vh和Vk基因，所述反應(yīng)混合物含有在生產(chǎn)商提供的緩沖液中的5pl第一鏈CDNA反應(yīng)混合物、適宜反向引物的20pmol等摩爾混合物、適宜正向引物的20pmo1等摩爾混合物、250ium(每種)脫氧核苷三磷酸、7.5mmMgCI2、10|ag牛血清清蛋白/ml和1pi(5U)水生棲熱菌(7Tzer麵s(^認(rèn)"'cw)(Ta《)DNA聚合酶(Promega)。給所述反應(yīng)混合物覆蓋石蠟油(Sigma)，并循環(huán)30次(95。C1分鐘，60°C1分鐘，和72°C1分鐘)。凝膠純化反應(yīng)產(chǎn)物，使用DEAE膜從凝膠分離，用高鹽緩沖液從膜洗脫，乙醇沉淀，并重新懸浮于20水中(Sambrook,爭(1989)Mo/ecw/arc/om>gva/aZ)0rator7m顯薦/,,2成CoWSpn'wg表3.小鼠免疫球蛋白基因的PCR使用的寡核普酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>通過重疊延伸，使用剪接，從純化的Vh和VK基因譜和接頭DNA裝配ScFv基因譜。接頭DNA編碼肽序列(Gly4Ser3,(SEQIDNO:181)Huston,爭(1988)/Voc.Wa"Jem/.5W.85:5879-5883),且與重排的Vh基因的3'末端和重排的V.基因的5'末端互補(bǔ)。將Vh和VkDNA(各1.5嗎)與500ng接頭DNA(重組噬菌體抗體系統(tǒng)；PharmaciaBiotech)在25piPCR混合物中相組合，所述PCR混合物含有在生產(chǎn)商提供的緩沖液中的250|im(每種)脫氧核苷三磷酸、1.5mMMgCl、10叫牛血清清蛋白/ml和1|il(5U)r呵DNA聚合酶(Promega)，并將混合物循環(huán)10次(94。Cl分鐘，62°Cl分鐘，和72。C1分鐘)，以連接片段。加入側(cè)接寡核苷酸引物(對于文庫I，是提供在重組噬菌體抗體系統(tǒng)試劑盒中的RS;且對于文庫2,是VHSfi和JKNot引物的等摩爾混合物[表31)，并將反應(yīng)混合物循環(huán)33次(9(C1分鐘，M。C1分鐘，和72°C1分鐘)，以添加限制位點。如上所述凝膠純化ScFv基因謙，用Sfif和Wo"消化，并通過電洗脫純化，并將1|ig每種譜連接進(jìn)用Sfil和消化的1ngpCANTAB5E載體(PharmaciaBiotech)(文庫l)或1|igpHEN-1(Hoogenboom，爭(1991)M/c/e/c紐19:4133-4137)(文庫2)。通過苯酚-氯仿提取，純化連接混合物，乙醇沉淀，重新懸浮于20pl水中，并將2.5pl樣品電穿孔入(Dower,鄰988)AWe/c^c油16:6127-6145)50義應(yīng)Vf霧TGI(Gibson(1984),5V^/z.mo"Ae五戸^'n-So^rWmsUniversityofCambridge,Cambridge,U.K.)。使細(xì)胞在1mlSOC(Sambrook，等/^i:)中生長30分鐘，然后鋪平板在含有100jag的AMP/ml和1%(wt/vol)GLU(TYE-AMP國GLU)的TYE(Miller(1972)wo/ecw/argewWd,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.)培養(yǎng)基上。將菌落從平氺反刮到5ml2xTY培養(yǎng)液(Miller(1972)同上)中，后者含有100嗎AMP/ml、1%GLU(2xTY-AMP-GLU)和15%(vol/vol)甘油，用于在-7CTC保藏。如Marks爭(1991)J./"潔w朋/.，21:985-991所述，通過PCR篩選(Gussow,夢(1989),M/c/e/c^c/&17:4000)，測定文庫的克隆效率和多樣性。E)噬菌體的制備為了從文庫拯救噬菌粒顆粒，將10ml2xTY-AMP-GLU用來自文庫原種的適宜體積的細(xì)菌(約50-100ial)接種，以產(chǎn)生0.3-0.5的A600,且在搖動下，在37。C培養(yǎng)細(xì)菌30分鐘。加入約1012PFU的VCS-M13(Stratagene)顆粒，并將混合物在4°C溫育過夜。用2%MPBS在37°C封閉管1小時，選擇，洗滌，并使用濃度為5.0x1012TU/ml的噬菌體，如文獻(xiàn)35所述準(zhǔn)確地進(jìn)行洗脫。1/3洗脫的噬菌體用于感染10ml對數(shù)期大應(yīng)^霧TGI，將其如上所述鋪平板到TYE-AMP-GLU平板上。重復(fù)拯救-選擇-鋪平板循環(huán)3次，此后通過ELISA分析克隆的結(jié)合。還在可溶BoNT/AHe上選4奪文庫。對于文庫1，將1.0mgBoNT/AHc(700pg/ml)生物素化(重組噬菌體選擇模塊；Pharmacia),并按照生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行純化。對于每輪選擇將1ml噬菌體(約1013丁11)與1mlPBS相混合，所述PBS含有4%脫脂奶粉、0.05%吐溫20和10嗎生物素化的BoNT7AHc/ml。在室溫1小時后，如Schier爭(1996)J.Mo/.S/o/.，255:28-43所述，將抗原-結(jié)合的噬菌體捕獲到封閉的鏈霉抗生物素蛋白-包被的M280萬茲珠(Dynabead;Dynal)上。將Dynabead洗滌共10次(3次在TPBS中，2次在TMPBS中，2次在PBS中，1次在MPBS中，和另外2次在PBS中)。通過與100(al100mM三乙胺一起溫育5分鐘，從Dynabead洗脫結(jié)合的噬菌體，并用1MTris-HCl、pH7.5中和，且將1/3洗脫物用于感染對數(shù)期義應(yīng)Yf,TGl。對于文庫2，通過降低用于選擇的可溶BoNT/AHe的濃度(第l輪10(ag/ml,第2輪1(ig/ml,和第3輪10ng/ml)，進(jìn)行親和力-驅(qū)動的選擇(Hawkins,爭(1992)J.Mo/.所o/.226:889-896;Schier，爭(1996)同上))。通過C-末端六組氨酸標(biāo)記，將可溶BoNT/AH。捕獲到200iil>^2+->0^((^3§611)上。捕獲后，洗滌N產(chǎn)-NTA樹脂共10次(5次在TPBS中，且5次在PBS中)，如上所述洗脫結(jié)合的噬菌體，且將洗脫物用于感染對數(shù)期義應(yīng)^麥TGI。F)結(jié)合劑的初步表征使用含有表達(dá)的scFv的細(xì)菌上清液，通過ELISA,初步分析與BoNT/A、BoNT/AHc和BoNT/AHN的結(jié)合(Chen,爭(1997)/"/e"./mwim.65:1626-1630)。^口marks夢(1991)J.A/o/.S/o/"222:581-597所述，在96-孔微量滴定板中進(jìn)行scFv的表達(dá)(DeBellis，等，(1990)版'/e/d/A細(xì).18:1311)。對于ELISA,用溶于PBS中的BoNT/A、BoNT/AHe或BoNT/AHN(10嗎/ml),在4°C包被微量滴定板(Falcon3912)過夜，然后用2。/。MPBS在室溫封閉1小時。將含有表達(dá)的scFv的細(xì)菌上清液加入孔中，并在室溫溫育1.5小時。洗滌平^反6次(3次4吏用TPBS,且3次^f吏用PBS)，并如Marks爭(1991)J.Afo/.5zW.，222:581-597和Schier鄰996)Gene169:147-155所述，使用抗-myc標(biāo)^己才元體(9E10;SantaCruzBiotechnology)或4元-E4元體(PharmaciaBiotech)和過氧化物酶-綴合的抗-小鼠Fc抗體(Sigma),通過它們的C-末端肽標(biāo)記，檢測scFv的結(jié)合(對于文庫1，在pCANTAB5E中的E表位標(biāo)記；且對于文庫2，在pHEN-l中的myc表位標(biāo)記[Munro,爭(1986)Cell46:291-300])。通過^WN1指紋分析和DNA測序，測定獨特的結(jié)合scFv的lt目。G)scFv的亞克隆、表達(dá)和純化為了促進(jìn)純化，將scFv基因亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pUC119mycHis(Schier爭(1995)J.Mo/.仏W.，263:55l-567)或pSYN3,/人而導(dǎo)致六組氨酸標(biāo)記添加在scFv的C-末端。培養(yǎng)200毫升含有適宜噬菌粒之一的義應(yīng)^霧TG1培養(yǎng)物，用IPTG誘導(dǎo)scFv的表達(dá)(DeBellis,爭(1990),A^c/e/c^c/A尺w.18:1311),并使培養(yǎng)物在25。C生長過夜。從周質(zhì)收獲scFv(Breiting,爭(1991)Gene104:147-153)，針針I(yè)MAC加載緩沖液(50mM磷酸鈉[pH7.5],500mMNaCl,20mM咪哇)中在4匸透析過夜，且然后通過02卞m-孔徑濾器過濾。如上面的Schier爭(1995)所述，通過IMAC純化scFv(Hochuli,爭(1988)腸/rec/mo/，6:1321-1325)。為了從二聚的和聚集的scFv制備單體scFv，在離心濃縮器(Centricon10;Amicon)中將樣品濃縮至<1ml的體積，并使用HBS,在Superdex75柱(Pharmacia)上分級分離。通過十二烷基碌^酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定等分試樣，評價最終制劑的純度。通過考馬斯藍(lán)染色，檢測蛋白條帶。分光光度地測定濃度，其中假定1.0的八280對應(yīng)著0.7mg/m的scFv濃度。H)親和力和結(jié)合動力學(xué)的測量4吏用在BIAcore(PharmaciaBiosensorAB)中的表面等離振子共振，測定純化的scFv的Kds。在BIAcoi'e流動室中，使用N-羥基琥珀酰亞胺-N-乙基-vV'-(二甲氨基丙基)碳二亞胺化學(xué)(Johnson,爭(1991)S/oc/zew.198:268-277),將約600RU的BoNT/AHc(15|iig/ml,溶于10mM乙酸鈉[pH個習(xí)中)偶聯(lián)到CM5傳感器芯片上。該量偶聯(lián)的BoNT/AHc導(dǎo)致最多100-175RU的結(jié)合的scFv。為了在scFv結(jié)合后再生表面，注射5[il的4MMgCl2,從而導(dǎo)致回到基線。在這些再生條件下，重復(fù)使用表面20-30次。在濃度范圍為50-1,000nM的5分鐘連續(xù)流下，測量結(jié)合。從ln^/A/J"々對濃度的圖，測定&，其中R是反應(yīng)，且t是時間(Karlsson,爭(1991)J./附ww"o/.Af"/zoA145:229-240)。通過使用30pl/分鐘的流速，從在最高濃度的分析的scFv處的傳感器圖的解離部分，測定^//(Karlsson,爭(1991)J./ww""o/.7kfe/zo^s145:229-240)。將計算為I)表位作圖BlAcore流動室中，如上所述將約1，200RU的BoNT/AHe偶聯(lián)到CM5傳感器芯片上。以5lil/分鐘的流速，將lOOnM-1pMscFv的滴定在流動室表面注射5分鐘，以測定導(dǎo)致表面接近飽和的scFv濃度。用scFv對，以產(chǎn)生接近飽和和至少100RU結(jié)合的scFv的濃度，進(jìn)行表位作圖。對于對中的每個成員，測定結(jié)合的scFv的量，然后將2種scFv混合到一起，產(chǎn)生的終濃度等于用于測量單一scFv的濃度。當(dāng)一起注射時，識別不同表位的scFv表現(xiàn)出結(jié)合的RU的加性增加(圖2圖A)，而識別相同表位的scFv僅僅表現(xiàn)出RU的最小增加(圖2圖B)。J)體外中和研究如Deshpande鄰995)7W函33:551-557所述,使用小鼠半膈制劑，進(jìn)行體外中和研究。簡而言之，從雄性CD/1小鼠(25-33g)切下左和右膈神經(jīng)半膈制劑，并懸浮于生理溶液(135mMNaCl，5mMKC1，15mMNaHC03,1mMNa2HP04，1mMMgCl2，2mMCaCl2》11mMGLU)中。使95%02-5%C02作泡狀通過溫育浴，并維持在恒溫36°C。40.05Hz,以0.2ms持續(xù)時間的方波，超大地刺激膈神經(jīng)。使用連接到圖表記錄器上的力位移轉(zhuǎn)換器(ModelFT03;Grass)，測量等長顫搐張力。將純化的scFv與純化的BoNT/A在室溫溫育30分鐘，然后加入組織浴，/人而產(chǎn)生2.0x10』M的終scFv濃度和2.0xM的終BoNT/A濃度。對于研究的每種scFv，對于單獨的BoNT/A,測定達(dá)到50%顫搐張力減少的時間3次，且對于scFv+BoNT/A，測定達(dá)到50%顫搐張力減少的時間3次。以分別2.0xl(T8M的終濃度，研究S25和C25的組合。通過雙尾f超v發(fā)，測定達(dá)到50%顫搐減少的時間之間的差異，認(rèn)為<0.05的P值是顯著的。表4.結(jié)合來自噬菌體抗體文庫的克隆的頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>a表達(dá)為陽性克隆數(shù)/克隆總數(shù)。對于BoNT/A和BoNT/AHe上的選擇，分別在固定化的BoNT/A和BoNT/AH。上進(jìn)行ELISA。ND,從進(jìn)行的選擇沒有測定數(shù)據(jù)。、原自用BoNT/AHe免疫2次和用BoNT/A免疫1次的小鼠。M吏用吸收到免疫管上的抗原，進(jìn)行免疫管選擇。d在溶液中進(jìn)行生物素化的選擇，捕獲到鏈霉抗生物素蛋白磁珠上。e源自用BoNT/AHc免疫3次的小鼠。f在溶液中進(jìn)行N嚴(yán)-NTA選擇，捕獲到N產(chǎn)-NTA瓊脂糖上。結(jié)果A)喧菌體抗體文庫構(gòu)建和表征.從免疫的小鼠的Vh和Vk基因，構(gòu)建了2個噬菌體抗體文庫(圖1)。對于文庫l，用BoNT/AHc免疫小鼠2次，且在第二次免疫接種后2周，用100,00050%致死劑量的BoNT/A進(jìn)行攻擊。小鼠在BoNT/A進(jìn)行攻擊后存活，且1周后處死。處死后立即取出脾，并制備總RNA。為了文庫構(gòu)建，特異性地引發(fā)IgG重鏈和K輕鏈mRNA，并合成第一鏈cDNA。通過PCR擴(kuò)增Vh和VK基因譜，并在重組噬菌體抗體系統(tǒng)中提供Vh、JhVk和Jk引物。.使用編碼15-氨基酸肽接頭(G4S)3(SEQIDNO:182)的合成DNA，將Vh和VK基因譜隨機(jī)地剪接到一起，以制備scFv基因鐠。將每個scFv基因語分別地克隆進(jìn)噬菌體展示載體pCANTAB5E(Pharmacia)。轉(zhuǎn)化后，得到2.1x106成員的文庫。如通過PCR篩選測定的，90%的克隆具有scFv基因的適當(dāng)大小的插入片段，且如通過PCR指紋分析測定的，克隆的scFv基因是多樣的。10個來自文庫1的未選擇的克隆的DNA測序揭示，所有Vh基因都源自鼠VH2家族，且所有Vk基因都源自鼠VK4和VK6家族(Kabat,爭(1"1)同上)?；谠撚^察的V-基因偏好，設(shè)計了家族特異性的Vh和VK引物以及Jh和Jk基因-區(qū)段-特弄性的引物(表3)。然后，將這些引物用于構(gòu)建第二個噬菌體抗體文庫。對于文庫2，用BoNT/AHc免疫小鼠3次，并在第三次免疫接種后2周處死。在脾收獲之前，沒有用BoNT/A攻擊小鼠，因為這導(dǎo)致非-Hc-結(jié)合抗體的生成(參見下面的"噬菌體抗體的選擇和初步表征")。收獲脾，并如上所述構(gòu)建噬菌體抗體文庫，例外是，使用VH-、Jh-、Vk-和Jk-特弄性的引物。轉(zhuǎn)化后，得到l.Ox106成員的文庫。如通過PCR篩選測定的，95%的克隆具有scFv基因的適當(dāng)大小的插入片段，且如通過PCR指紋分析測定的，克隆的scFv基因是多樣的(未顯示數(shù)據(jù))。10個來自文庫2的未選擇的克隆的DNA測序揭示了比在文庫1中觀察到的更大的多樣性；Vh基因源自Vw、Vk2和VK3家族，且Vk基因源自Vk2、Vk3、VK4和VK6家族(Kabat,爭(1991)同上)。B)噬菌體抗體的選纟奪和初步表征為了分離結(jié)合BoNT/A的噬菌體抗體，從文庫拯救噬菌體，并在純化的BoNT/A或BoNT/AH。上選擇。除了H。以外，在全毒素上進(jìn)行選擇，因為不清楚重組毒素Hc模仿全毒素中的Hc的構(gòu)象的程度。在吸附到聚苯乙烯的抗原上，進(jìn)行BoNT/A和BoNT/AHe結(jié)合劑的選擇。另外，在溶液中，在生物素化的Hc上選擇結(jié)合Hc的噬菌體，捕獲到鏈霉抗生物素蛋白磁珠(對于文庫l)上，或在六組氨酸標(biāo)記的Hc上進(jìn)行選擇，捕獲到N嚴(yán)-NTA瓊脂糖(對于文庫2)上。基于我們以前的觀察，即在吸附到聚苯乙烯上的蛋白上的選擇，產(chǎn)生不識別天然蛋白的喧菌體抗體(Schier爭(1995)/mm冊o&c/mo/ogy,1:73-81)，4吏用在溶液中的選擇。在溶液中的選擇不是在全毒素上進(jìn)行的，因為我們不能成功地生物素化該毒素而不破壞免疫反應(yīng)性。2-3輪選擇后，至少67%分析的scFv結(jié)合用于選擇的抗原(表2)。通過DNA指紋分析和隨后的DNA測序，測定獨特scFv的數(shù)目，并通過ELISA測定每種scFv對純BoNT/A和重組BoNT/AH。和HN的特異性，且推測結(jié)合BoNT/A、但是不結(jié)合H?；騂N的scFv結(jié)合輕鏈(催化結(jié)構(gòu)域)。從用Hc免疫、并用BoNT/A攻擊的小鼠，分離出共33個獨特的scFv(表5,文庫1)。當(dāng)在全毒素上選4奪文庫1時，鑒別出25個獨特的scFv。但是，這些scFv中僅有2個結(jié)合Hc，大多凄史(Hathaway,爭(1984)J./"/e".150:407-412)結(jié)合輕鏈，且2個結(jié)合HN。2個He結(jié)合性scFv不象識別類似表位的其它scFv—樣好地表達(dá)，且因此在親和力或中和能力方面沒有表征它們(參見下文)。在He上選擇文庫l,產(chǎn)生了另外8個獨特的scFv(表3和4)。但是，共計僅50%在He上選擇的scFv也結(jié)合全毒素。該結(jié)果表明，Hc表面的相當(dāng)大部分不能被全毒素接近?；蛘撸瑂cFv可以結(jié)合在全毒素中不存在的He構(gòu)象。從僅用Hc免疫的小鼠(文庫2)，在全毒素上選擇的所有scFv也結(jié)合H"但是與文庫1一樣，僅50。/。的在Hc上選擇的scFv結(jié)合全毒素?？傊?，從文庫2分離出18個獨特的He結(jié)合性scFv，從而產(chǎn)生共28個獨特的He結(jié)合性scFv(表5和6)。在固定化到聚苯乙歸上的Hc和在溶液中的Hc上，分離出相同或相關(guān)序列的scFv。因而，在He的情況下，選擇方法不重要。表5.從噬菌體抗體文庫選擇的BoNT結(jié)合性scFv的特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>C)表位作圖使用在BIAcore中的表面等離振子共振，對所有28個獨特的Hc結(jié)合性scFv進(jìn)行表位作圖。用scFv對，以導(dǎo)致芯片表面接近飽和和至少100RU結(jié)合的scFv的濃度，進(jìn)行表位作圖。對于對中的每個成員，測定結(jié)合的scFv的量，然后將2種scFv混合到一起，產(chǎn)生的終濃度等于用于測量單一scFv的濃度。當(dāng)一起注射時，識別不同表位的scFv表現(xiàn)出結(jié)合的RU的加性增加(圖2圖A)，而識別相同表位的scFv僅僅表現(xiàn)出RU的最小增加(圖2圖B)。通過該」汰術(shù)，28個scFv的作圖，產(chǎn)生在He上識別的4個不重疊表位(表6)。從文庫l得到僅識別表位1和2的scFv,而從文庫2得到識別所有4個表位的scFv。識別相同表位的許多scFv(Cl和S25;C9和C15;1E8和1G7;1B6和1C9;C25和C39;2G5、3C3、3F4和3H4;1A1和1F1;1B3和1C6;1G5和1H6;1F3和2E8)具有源自相同V-D-J重排的VH結(jié)構(gòu)域，如由高水平的VHCDR3和Vh-基因區(qū)段同源性所證實的(表6)。這些scFv的不同之處僅在于，通過體細(xì)胞高變或PCR錯誤導(dǎo)入的置換。對于表位1和2，識別相同表位的大多數(shù)或所有scFv都源自相同或非常類似的Vh-基因區(qū)段，但是在VHCDR3長度和序列方面明顯不同(對于表位1，9個scFv中的5個；對于表位2，8個scFv中的8個)(表6)。這些包括源自不同小鼠的scFv。鑒于基本譜中VHCDR2序列的巨大程度的多樣性(Tomlinson爭(1996)丄M/.6,'o/.，256:813-817),特定的Vh-基因區(qū)段關(guān)于它們形成能識別特定病原性抗原形狀的結(jié)合位點的能力可能已經(jīng)發(fā)生了進(jìn)化。相反地，更大的結(jié)構(gòu)變化似乎發(fā)生在重排的Yk基因中。例如，對于表位21，觀察到3種不同種系基因和CDR1主鏈構(gòu)象(Chothia,爭(1987)丄Mo/.5"/.196:901-917)，其中所有VH基因都源自相同種系基因。以前已經(jīng)報道了這樣的鏈配對中的"混亂，，(Clackson,等(1991)Nature352:624-628)。D)親和力、結(jié)合動力學(xué)和體外毒素中和為一種代表性的結(jié)合每種表位的scFv，測定親和力、結(jié)合動力學(xué)和體外毒素中和。對于每種表位，選擇用于進(jìn)一步研究的scFv具有高表達(dá)水平和慢k。ff的最佳組合，如在表位作圖研究過程中所測得的。研究的4種scFv的Kd是7.3x10—8至1.1xl(T9M(表7)，這些值與從雜交瘤生產(chǎn)的單克隆IgG的報道的值相當(dāng)(Foote，爭(1991)淑騰352:530-532)。對于抗-肉毒桿菌毒素抗體，C25具有報道的最高親和力(Kd=1.1x10—9M)。scFv之間的k加差異超過84倍，且k。ff差異超過33倍(表7)。通過使用小鼠半膈制劑，和測量單獨的BoNT/A和在有2.0x10-SMscFv存在下，達(dá)到50%顫搐張力減少的時間，測定體外毒素中和。將值記錄為達(dá)到50%顫搐減少的時間。結(jié)合表位1(S25)和表位2(C25)的scFv明顯延長了達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間分別是1.5倍(152%)和2.7倍(270%)(表7和圖3)。相反地，結(jié)合表位3和4的scFv對達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間沒有顯著作用。S25和C25的混合物對達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間具有顯著的加性作用，達(dá)到50%顫搐減少的時間增加了3.9倍(390%)。EVKLVESGGGLVOPGOSP-KLSCATSCrrPSCH"MSWIRQSPDKRLEWVAQI—U——......--------------VKLVESGP-L-J:PS0SL3LTCTVTGYSIT扁q----q扁-abl----a-vkn—扁k國--y--t-----Q—-AEL-K--A-VKN-—Y--T—KITSFWNH-V—T-EH......HVP.QAPGKOLEKVADIELT0SPAIM6ASPSEKVIMTCSASESVSHKV匿p-----1——.....SETSPKPH—-SUW-L-QJIA匿IS-RA-ESVDSYGN-----.....IMS*-P-EKVTTT---.......IMSA-P-EKVTTT--T-......HSA-P-EKVTHT-.....----IKSA一P-BKVTMT扁DSELT(JSPTTMAASK3EKITTTC匿......AEL-V-L-RRA--S-、-I------AEL-V-L扁QHA--S-—I------ASL-V-L-QEA--S-SASSSrSSNlfLHR—B-VEYVCTSLHQDIELTOSPASMSA￡K3E1!VTHTC........TT-A—.....表6根描識別出的表位分類的BoNT/AHc結(jié)合性scFv的VH和VL的推論蛋白序列區(qū)域表位克隆序列'構(gòu)架l構(gòu)架2構(gòu)架3構(gòu)架4-Lib.文庫，^"對于克隆C12、C13、C2和S44(都結(jié)合表位l),未測定全長序列。可以從Genbank號AFfl03702至AF003725得到。RISI-R扁T匿KNQFFL扁匿N-V—r--TGr-----RISI-R-T-KN^PFL—了GT-----RFTISRDHAKHTIA.LQHSSLKSEOTAHYYCVRRGK3KCft3TTVTVSSP—FTISRMJSKNTLYliQMNSLRAHJTAVYIfCAP.一rSIT--T----VTS----T-----KA-LTV-T-SS-A*N*L>S—TS-------ka-ltv-ta-m-ls--ts--s-------YR-DEGLVR-DDAMnlpydkvNLPYDKVAGD3Tf-VDEU3CWGTGTTVTVSS-r-det---nfv--GVPARFSGSGSKTDFTLT1DPVEADDAATYYC-----------G-SYG---SKH-匿E---......RSSY----.......---G-SYS…SRM--E-........RSS1T…——V.....—G-Slf3…SRM—E-........-扁-V.......G陽SXS-匿-SRM--E.........WSSY-P-GVPARFSGSGSGrrSYSLTiaTHEAEDVRTVYCQQGSSPRT-----........DP—H-HPV-B-I-M-P-—SRKV-W-...........R-DFT"-DPV"D-A.....—NNED-Y--A----.......DF—N-HPV-BD-I-H-P---SRKV-Y-"GSS----DQAON-S—A——V-LR-HIHf'SN3EISFNQKFUlY扁S./SGSTtrraPSLKSTi:SCCGTYTiTPCSVh;D-i.P-SGSTKYWEKF—SRLDPWSGETKYNEKPk5200680009715.7勢滔也被65/112^;表7.從噬菌體抗體文庫選擇的scFv的親和力、結(jié)合動力學(xué)和體外毒素中和結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>"通過表面等離振子共振測量kon和koff，且將Kd計算為k0ff/kon。6與單獨BoNT/A的時間相比，在小鼠半膈測定中使用20nMscFv+20pMBoNT/A達(dá)到50%顫搐減少的時間(分鐘)。對于C25+S25組合，每次使用20nMscFv。每個值是至少3次觀察的平均值±SEM。cp<0.01，與BoNT/A相比?！╬<0.05，與C25相比。討論BoNT由通過一個二硫鍵相連的重鏈和輕鏈組成。毒素的羧基-末端一半結(jié)合特異性的膜受體，從而導(dǎo)致內(nèi)化，而氨基-末端一半介導(dǎo)毒素從內(nèi)體進(jìn)入胞質(zhì)的易位。輕鏈?zhǔn)卿\內(nèi)肽酶，其切割基本的突觸小體蛋白，從而導(dǎo)致突觸傳遞的失敗和麻痹。有效的免疫治療必須阻止毒素與受體的結(jié)合，因為其它2種毒素功能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。鑒別Hc上的介導(dǎo)結(jié)合的表位，是設(shè)計更好的疫苗和開發(fā)用于被動免疫治療的高效價的中和單克隆抗體(或多種抗體)基本的第一步。為此，我們嘗試通過用重組BoNT/AH。免疫接種，指導(dǎo)對中和表位的免疫應(yīng)答。這應(yīng)導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生，所述抗體阻止毒素與它的細(xì)胞受體的結(jié)合。該方法的一個限制是，重組He模仿全毒素中的He的構(gòu)象的程度。50%的在Hc上選擇出的抗體識別全毒素的事實，暗示著該分子的大部分的顯著結(jié)構(gòu)同源性。盡管50%的在Hc上選擇出的抗體不結(jié)合全毒素，但這可能由針對其它毒素結(jié)構(gòu)域包裝Hc表面的相當(dāng)大部分引起。但是，我們的結(jié)果沒有排除下述可能性，即有些這樣的抗體會結(jié)合不存在于全毒素中的Hc構(gòu)象，或重組Hc缺少存在于全毒素中的構(gòu)象表位。這會導(dǎo)致不能生成抗某些構(gòu)象表位的抗體。盡管如此，用He進(jìn)行免疫和選擇，導(dǎo)致結(jié)合全毒素的大量單克隆抗體的分離。相反地，用全毒素或類毒素免疫接種后分離的單克隆抗體結(jié)合其它毒素結(jié)構(gòu)域(Hn或輕鏈)或存在于粗毒素制劑中的非毒素蛋白和類毒素(參I上面來自文庫1的結(jié)果，和Emanuel爭(1996)//w附w"o/.她仇，193:189-197)。為了生產(chǎn)和表征最大數(shù)目的可能的單克隆抗體，我們使用了噬菌體展示。該方法使得生成和篩選數(shù)百萬用于結(jié)合的不同抗體成為可能。產(chǎn)生的抗體片段是已經(jīng)克隆的，且可以容易地測序，以鑒別獨特抗體的數(shù)目。在義應(yīng)存^中的表達(dá)水平通常足以產(chǎn)生毫克量的scFv,后者可以在亞克隆進(jìn)在C末端附著了六組氨酸標(biāo)記的載體后，通過IMAC容易地純化。最后，可以亞克隆Vh和Vl基因，以構(gòu)建完整的IcG分子，進(jìn)行嫁接，以構(gòu)建人源化的抗體，或進(jìn)行突變以制備超高-親和力抗體。通過該方法，制備和表征了28個獨特的單克隆抗-BoNT/AHe抗體?？贵w序列是多樣的，由3個不同Vh-基因家族、至少13個獨特的V-D-J重排、和3個Vk-基因家族組成。該大量BoNT/AHc抗體的產(chǎn)生，是選擇用于免疫接種和選擇的抗原(BoNT/AH》的結(jié)果。例如，從用五價類毒素免疫的小鼠的V基因構(gòu)建的Fab噬菌體抗體文庫，僅僅產(chǎn)生2個結(jié)合純毒素(在該情況下，BoNT/B)的Fab。大多數(shù)Fab結(jié)合存在于類毒素中的非毒素蛋白(Emanuel，等，丄/wmw"o/.M"/ocM93:189-197(1996))。盡管抗體的序列多樣性，但表位作圖揭示了僅4個不重疊的表位。表位1和2是免疫顯性的，可被21/28(75%)的抗體識別。令人感興趣地，大約相同數(shù)目(3-5)的免疫顯性的BoNT/AHe肽(非構(gòu)象的)表位，在用五價類毒素免疫接種后被小鼠和人多克隆抗體識別，且在用曱醛-滅活的BoNT/A免疫接種后被馬多克隆抗體識別(Atassi(1996)丄/V幽."C/z綴.，15:691-699)。結(jié)合表位1和2的scFv導(dǎo)致小鼠神經(jīng)肌接點處毒素-誘導(dǎo)的神經(jīng)性麻痹的部分拮抗作用。當(dāng)一起施用時，兩種scFv具有加性作用，達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間顯著增加。這些結(jié)果與BoNT/AHe上存在2個獨特受體結(jié)合位點相一致。盡管尚未正式地筌別出BoNT/A受體，但結(jié)果與配體結(jié)合研究的結(jié)果相一致，這也指示毒素上高和低親和力的2類受體結(jié)合位點，且已經(jīng)導(dǎo)致毒素結(jié)合的"雙受體"模型(Montecucco(1986)7Ve"Afi/oc/zew.Scz'.11:314-317)。但是，這2個位點是否是在Hc上，存在爭論。在2個研究中，BoNT/AHe部分地抑制了結(jié)合和神經(jīng)肌肉麻痹(Black，夢(1986)丄O//腸/.，103:521-534;Black,爭(1980)^m.J.Afec/.，69:567-570),而Daniels-Holgate爭(1996),7Ve紅ow/.44:263-271表明，BoNT/AHc抑制運動神經(jīng)末端的結(jié)合，但是對小鼠神經(jīng)肌接點處毒素-誘導(dǎo)的神經(jīng)性麻痹沒有拮抗作用。我們的結(jié)果與He上存在2個"生產(chǎn)性"受體結(jié)合位點相一致，它們導(dǎo)致毒素內(nèi)化和毒性。scFv效力的差異，可能反映Hc對受體結(jié)合位點的親和力差異，或可能反映大于10倍的scFv對He的親和力差異。最后，我們尚沒有正式地表明，任一種scFv實際上阻斷毒素與細(xì)胞表面的結(jié)合?？梢韵胂?，觀察到的對達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間的作用，源自結(jié)合后事件的干擾。ScFv對小鼠半膈測定中毒素-誘導(dǎo)的神經(jīng)性麻痹的拮抗作用，低于對2.0xIO-9M多克隆馬抗毒素(PerlmmuneInc.)觀察到的拮抗作用(達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間延長7.5倍)。該差異可能是由于封閉其它結(jié)合位點的必要性、抗體親和力或抗體親抗原性的差異、或?qū)е虏荒芙Y(jié)合的聚集毒素的交聯(lián)作用。抗體結(jié)合的親和力也可能是重要因子，因為毒素以高親和力結(jié)合它的受體(Williams爭(1983)歷oc/zew.，131:437-445)，且可以通過內(nèi)化，在細(xì)胞內(nèi)濃縮。注意到，最有效的scFv具有最高的對Hc的親和力。本文描述的識別相同中和表位、但是具有不同Kd的其它scFv的可用性，應(yīng)有助于定義親和力的重要性。但是，這些scFv的差異在于許多氨基酸，且也可以差異在于細(xì)微特異性，從而使得難以解釋結(jié)果。或者，與噬菌體展示相組合的誘變可以導(dǎo)致差別僅在于序列中的少數(shù)氨基酸、但是親和力變化是幾個數(shù)量級的scFv的生產(chǎn)(Schier等(1996)J.M/.263:551-567)。相同的方法可以用于使抗體親和力增加到皮摩爾范圍(^;C)。中和的"黃金標(biāo)準(zhǔn)"是保護(hù)小鼠免于與抗體共注射的毒素的致死作用。盡管尚未正式確立體外和體內(nèi)保護(hù)之間的關(guān)系，但馬抗毒素可能中和2類測定中的毒素(參見上文和Hatheway爭(1984)/./w/e".Dzi，150:407-412)。認(rèn)為該關(guān)系適用于本文才艮告的scFv,且這可以實驗地驗證。這樣的研究對于小(25-kDa)scFv抗體片段是不適當(dāng)?shù)摹Ｐ〕叽绲膕cFv導(dǎo)致快速再分布(在a階段的半衰期是2.4-U分鐘)和清除(在(3階段的半衰期是15-4小時)和迅速變得不可檢測的抗體水平(Huston,等，(1996)J.7Vwc/.M^/.40:320;Schier爭(1995)/畫,&c/mo/og乂1:73-81)，同時毒素水平可能保持較高(Hildebrand,鄰961)尸亂化c.￡xp.肌o/.Mec/.107-284-289)。通過從scFv的Vh和Vl基因枸建完整IgG分子，可以促進(jìn)體內(nèi)研究的表現(xiàn)。人恒定區(qū)的使用，將產(chǎn)生免疫原性比鼠單克隆更低、且比目前使用的馬抗毒素低得多的嵌合抗體。通過CDR嫁接，可以進(jìn)一步降低免疫原性，以產(chǎn)生人源化的抗體。實施例2重組寡克隆抗體對肉毒桿菌神經(jīng)毒素的有效中和產(chǎn)芽孢細(xì)菌肉毒梭菌分泌肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)，即已知的最有毒的物質(zhì)(Gill(1982)綠ra"o/.Aev.46:86—94)。該蛋白毒素由重鏈和輕鏈組成，含有3個功能結(jié)構(gòu)域(Simpson(1980)丄P/^waco/.￡"x/.212:16—21;Montecucco和Schiavo(1995)g.iev.5/o//z,28:423—472;Lacy爭(1998)7Vaf.6V廠w".S/o/.5:898—902)。重l連^;C末端部分(HC)包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它結(jié)合突觸前神經(jīng)元上的唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂受體和推定的蛋白受體，從而導(dǎo)致毒素胞吞作用(Dolly爭(1984)淑,(To油m」307:457-460;Montecucco(1986)r腦A11:315-317)。重鏈的N-末端部分(HN)包含易位結(jié)構(gòu)域，它允許毒素逃離內(nèi)體。輕鏈?zhǔn)乔懈頢NARE復(fù)合物的不同成員的鋅內(nèi)肽酶，依賴于血清型，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳遞的阻斷(Schiavo爭(1992)淑,flo油"」359:832-835;Schiavo爭(1993)/.腸/.C7z簡.268:23784—23787)。存在7種BoNT血清型(A-G;Lacy和Stevens(1999)丄Mo/.291:1091-1104)，其中4種(A、B、E和F)造成人疾病肉毒中毒(Arnon爭(2001)JJm.Mec/.jmoc.285:1059—1070)。肉毒中毒的特征在于弛緩性麻痹，其如果沒有立即致命，則需要長期在重病監(jiān)護(hù)病房中住院治療和機(jī)械換氣。毒素的有效麻痹能力，已經(jīng)導(dǎo)致它在低劑量作為治療許多活動過度的肌肉狀況的藥物的應(yīng)用，所述狀況包括頸張力障礙、大腦性癱瘓、創(chuàng)傷后腦損傷和中風(fēng)后痙攣狀態(tài)(Mahant爭(2000)C//".TV醇頻'.7:389—394)。BoNT也被疾病控制中心(CDC)歸入生物恐怖主義的6種最高危險的威脅因子("A類因子")之一，這是由于它們的巨大效力和致死率、容易生產(chǎn)和運輸、和需要長期重癥監(jiān)護(hù)(Arnon爭(2001)JJm.Med.J，c.285:1059-1070)。伊拉克和前蘇Jf關(guān)都生產(chǎn)了用作武器的BoNT(UnitedNationsSecurityCouncil(1995)五加W/s/zet/f/ze/S^cTeto，Ge認(rèn)ra/尸wra薦/7fto尸aragra//z90」卩"o/("799/y)cw//zey4"/v/fejS/ec/"/C函脂.肌'o/(UnitedNationsSecurityCouncil,NewYork);Bozheyeva爭(1999)FormerSovietBiologicalWeaponsFacilitiesinKazakhstan:Past,Present,andFuture(CenterforNonproliferationStudies,MontereyInstituteofInternationalStudies,Monterey,CA),且日本宗教奧姆真理教嘗試使用BoNT進(jìn)行生物恐怖主義(Ar畫鄰001)丄為.MW.A亂285:1059—1070)。作為這些威脅的結(jié)果，需要用于預(yù)防和治療中毒的特異性藥物試劑。沒有存在特異性的小分子藥物可以用于預(yù)防或治療肉毒中毒，但是從CDC可以得到用于研究的五價類毒素(Siegel(1988)J.C//".M/cra^W.26:2351-2356)，且重組疫苗正在開發(fā)中(Byrne和Smith(2000)82:955—966)。無i侖如4可，由于疾病或暴露的^希少，和接種疫苗將阻止BoNT的隨后的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的事實，大規(guī)模平民或軍人接種疫苗是不可能的。由于疾病的快速發(fā)作，暴露后的接種疫苗是無用的。毒素中和抗體(Ab)可以用于暴露之前或之后的預(yù)防，或用于治療(Franz爭(1993)Pp.473-476InBotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects.,DasGuptaB.R.,(編)，Plenum,NewYork)。存在小量的馬抗毒素和人肉毒桿菌免疫球蛋白，且其目前分別用于治療成年人(Black和Gunn(1980)」m.她d69:567-570;Hibbs鄰996)C7k/"/e".23:337—340)和嬰兒肉毒中毒(Ar謹(jǐn)(1993)Pp.477-482inBotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects,ed.DasGupta,B.R.Plenum,NewYork)。重組單克隆抗體(mAb)可以無限地提供抗毒素，其沒有感染性疾病危險，且不需要人供體進(jìn)行血漿去除術(shù)。這樣的mAb必須是高效力的，以在合理的成本提供足夠數(shù)量的劑量。在有些情況下，多克隆Ab的效力可以概括在單一mAb中(Lang爭(1993)丄/mm簡o/.151:466—472)。在BoNT的情況下，還要生產(chǎn)有效的中和mAb:單一mAb中和小鼠中的最多10-100倍50%致死劑量(LD50)的毒素(Pless鄰OOl)/"/e"./畫肌69:570-574;Hallis爭(1993)Pp.433-436In:^/^//謂7"^a鼎siVewn^o:n7w..A^nZ7Ym扁^/owjS/omed/ca/爿平ec&，編DasGupta,B.R.，Plenum,NewYork)。在該實例中，我們表明通過組合2或3種mAb，可以非常有效地體外和體內(nèi)地中和BoNT血清型A(BoNT/A),^v而^是供預(yù)防和治療肉毒中毒和由其它病原體和生物威月辦因子造成的疾病的藥物。方法IgG構(gòu)建使用PCR,利用引物對GTCTCCTGAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT(SEQIDNO:183)和GTACCAACGCGTGTCTTGTCCCAGGTCCAGCTGCAGGAGTCT(C25，SEQIDNO:184)、GTACCAACGCGTGTCTTGTCCCAGGTGAAGCTGCAGCAGTCA(S25，SEQIDNO:185)、或GTACCAACGCGTGTCTTGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT(3D12，SEQIDNO:186),從各噬菌粒DNA擴(kuò)增C25、S25和3D12單鏈可變片段(scFv)的VH基因。用Mlul和AT^I消化DNA，連接進(jìn)N5KGlVal-Lark(MitchReff贈，IDECPharmaceuticals,SanDiego)，并通過DNA測序，鑒別含有正確VH的克隆。利用引物對TCAGTCGTTGCATGTACTCCAGGTGCACGATGTGACATCGAGCTCACTCAGTCT(SEQIDNO:187)和CTGGAAATCAAACGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGT(C25，SEQIDNO:188)、TCAGTCGTTGCATGTACTCCAGGTGCACGATGTGACATCGAGCTCACTCAGTCT(SEQIDNO:189)和CTGGAAATCAAACGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTCS25,SEQIDNO:190),或TCAGTCGTTGCATGTACTCCAGGTGCACGATGTGACATCGTGATGACCCAGTCT(SEQIDNO:191)和CTGGAAATCAAACGTACGTTTTATCTCCAGCTTGGT(3D12,SEQIDNO:192),從各謹(jǐn)菌粒DNA擴(kuò)增C25、S25和3D12scFv的V—基因，克隆進(jìn)pCR-TOPO(Invitrogen)，并通過DNA測序，鑒別含有正確V—的克隆。使用Drain和5w'WI，從pCR-TOPO切除V—基因，并連接進(jìn)DraIII-和BsiWI-消化的含有適宜Vh基因的N5KGlVal-LarkDNA。并通過DNA測序，鑒別含有正確VH和Vk基因的克隆，并通過電穿孔，將載體DNA用于轉(zhuǎn)染CHODG44細(xì)胞。通過在G418中選擇，確立穩(wěn)定細(xì)胞系，并在1L旋轉(zhuǎn)搖瓶中擴(kuò)張。收集含有IgG的上清液，通過超濾濃縮，并在G蛋白(Pharmacia)上純化。IgG親和力和結(jié)合動力學(xué)的測量使用表面等離振子共振，在BIAcore(PharmaciaBiosensor)中測量IgG結(jié)合動力學(xué)，并用于計算《d。使用iV-羥基琥珀酰亞胺-iV-乙基-(二曱氨基丙基)-碳二亞胺化學(xué)，將約200-400反應(yīng)單位的純化的IgG(10—20/ig/ml，溶于10mM乙酸鹽中，pH3.5—4.5)偶聯(lián)到CM5傳感器芯片上。使用50-800nM的濃度范圍，在15pl/分鐘的連續(xù)流下，測量純化的BoNT/AHc的結(jié)合速率常數(shù)。從(ln(dR/dt))/t與濃度的圖，確定結(jié)合速率常數(shù)(/U)。從使用30pl/分鐘的流速來預(yù)防重新結(jié)合分析的最高scFv濃度處的傳感器圖解離部分，確定解離速率常數(shù)(A。ff)。將尺d計算為A。VA訓(xùn)。體外毒素中和的測量從雄性CD-1小鼠(25-33g)切除膈神經(jīng)半膈制劑，并懸浮于135mMNaCl，5mMKC1，1mMNa2HP04，15mMNaHC03,1mMMgCl2,2mMCaCl2和llmM葡萄糖。使95%02/5%0)2作泡狀通過溫育浴，并維持在36。C。在0.05Hz，以0.2ms持續(xù)時間的方波刺激膈神經(jīng)。4吏用力4立移摔爭4奐器(ModelFT03,GrassInstruments,Quincy,MA)，測量等長顫搐張力。將純化的IgG與BoNTA在室溫溫育30分鐘，然后加入組織浴，從而產(chǎn)生終IgG濃度6.0x10-sm(只有S25和3D12)或2.0x10-8M(只有C25)和終BoNTA濃度2.0xl(T11M。對于IgG對，每種IgG的終濃度降低50%,且對于所有3種IgG混合物的研究，每種IgG的終濃度降低67%。體內(nèi)毒素中和的測量在總體積為0.5ml的明膠磷酸鹽緩沖液中，將50微克適宜的IgG加入指示數(shù)目小鼠LDs。的BoNT/A神經(jīng)毒素(Ha11品系)，且在室溫溫育30分鐘。對于Ab對，加入25iug每種Ab,且對于3種Ab的組合，加入16.7pg每種Ab。然后，將混合物腹膜內(nèi)地注射進(jìn)雌性CD-1小鼠(16-22g)。將小鼠分成10只的組進(jìn)行研究，且至少每天觀察。注射后5天，測定最終的死亡計數(shù)。mAb溶液親和力的測量使用KinExA流式熒光計進(jìn)行平衡結(jié)合研究，以定量抗體與抗原的反應(yīng)混合物中具有未占據(jù)的結(jié)合位點的抗體。在Hepes-緩沖鹽水pH7.4中，進(jìn)行使用包含l、2或3種不同抗體的反應(yīng)混合物的研究，總抗體濃度分別是342、17.2和17.2pM。在所有情況下，可溶毒素的濃度從低于表觀^/值的0.1變至大于其10倍(12濃度，最小)。將包含1、2或3種不同抗體的反應(yīng)混合物在25。C分別溫育0.5、3和17小時，以確保達(dá)到平ff。結(jié)果為了生成能中和BoNT/A的mAb,我們預(yù)先從用重組BoNT/A結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Hc)免疫的小鼠和從用五價肉毒桿菌類毒素免疫的人生成了scFv喧菌體抗體文庫(Amersdorfer爭(1997)/w麵".65:3743—3752;Amersdorfer鄰002)J^cc/w20:1640—1648)。從這些文庫篩選超過100種獨特mAb后，鑒別出3組scFv,它們結(jié)合BoNT/AHc上的不重疊表位，且體外中和毒素(延長在鼠半膈模型中達(dá)到神經(jīng)性麻捧的時間；Amersdorfer爭(1997)/"/e"./mmw.65:3743—3752;Amersdorfer爭(2002)^cc,"e20:1640—1648)。當(dāng)組合2種結(jié)合不重疊表位的scFv時，體外毒素中和顯著增加。因為25-kDascFv從血清的迅速清除，不能測定體內(nèi)毒素中和(Colcher爭(1990),7Wz//.Omce〃raf.82:1191—1197)。為了評價體內(nèi)BoNT神經(jīng)毒素中和，從糸^中和毒素的3種BoNT/AscFv的VH和V-基因，構(gòu)建IgG。將VH和Vk基因順序克隆進(jìn)哺乳動物表達(dá)載體，從而導(dǎo)致人Ck基因與Vk的融合，和人y1基因與Vh的融合。確立穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞系，并從上清液純化IgG，從而對于鼠scFvC25和S25,產(chǎn)生含有鼠V-結(jié)構(gòu)域和人C-結(jié)構(gòu)域的嵌合IgG,且對于人scFv3D12,產(chǎn)生全人IgG。測量IgG平衡結(jié)合常數(shù)(《d),并發(fā)現(xiàn)至少與它們所來源的scFv的結(jié)合常數(shù)相當(dāng)(表8)。2種IgG(S25和3D12)的抗原結(jié)合親和力顯著高于對應(yīng)的scFv(更低的ATd),主要是因為結(jié)合速率常數(shù)(的增加。我們推測這反映了分子穩(wěn)定性的增加，并從而反映功能性抗體濃度的增加。表8.BoNT/AIgG和IgG所來源的scFv的結(jié)合(A加)和解離(&ff)速率常數(shù)和平衡解離常數(shù)(A)<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>在小鼠半膈測定中，測定IgG的體外毒素中和(Desphande等(1995)Toxicon33:551-557)。與單獨的毒素相比，3種IgG中的每種都顯著增加了達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間，其中C25是最有效的(圖4)。當(dāng)研究IgG對時，觀察到毒素中和的顯著協(xié)同作用。對于這些研究，必需降低研究的C25IgG的濃度3倍，至20nM，這是因為它的高效力和半膈制劑具有8-小時的壽命的事實。與任一種單獨的IgG的時間相比，每對IgG顯著增加達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間(圖4)。所有3種IgG的混合物進(jìn)一步增加達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間，盡管該差異與抗體對相比并沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性，因為僅研究了小量膈。使用小鼠測定研究了體內(nèi)毒素中和，其中預(yù)混合毒素和Ab，并腹膜內(nèi)地注射，并測定達(dá)到死亡的時間和存活小鼠的數(shù)目(Sheridan等(2001)Toxicon39:651—657)。50微克每種單一mAb都延長了達(dá)到死亡的時間，但是不能保護(hù)用20LDso攻擊的小鼠(圖5A)。相反地，任意mAb對完全保護(hù)用100LDso的毒素攻擊的小鼠(圖5B)。在500LD50,大多數(shù)接受2種mAb對(S25+3D12或C25+S25)的小鼠死亡，而80%接受C25+3D12對的小鼠存活(圖3)。接受所有3種mAb(寡克隆Ab)的混合物的所有小鼠在500LDso的毒素的攻擊后存活(圖6)。在這些研究中，施用的Ab的總量保持恒定在每只小鼠50pg。為了測定效力，以遞增劑量的毒素，研究了mAb對和寡克隆Ab(圖6)。最有效的mAb對(C25+3D12)保護(hù)90%的用l，OOOLD5。攻擊的小鼠，且沒有小鼠在2，500LDsQ的攻擊后存活。相反地，寡克隆Ab完全保護(hù)用5,000LD5q毒素攻擊的所有小鼠，5/10的小鼠在20,000LD5q毒素的攻擊后存活。使用改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)小鼠中和生物測定(Hatheway和Dang(1994)Pp.93-107In:T7zera/少w"/zS幽/Zw謂Tbx/w,編Jankovic，J.,Dekker,NewYork)，滴定寡克隆Ab的效力，并測得為45國際單位(IU)/mg的Ab，比用于治療嬰兒肉毒中毒的人肉毒桿菌免疫球蛋白有效90倍(Araon(1993)Pp.477-482in嫁w/Zw畫顯dT加廳jVewn9fox/"fjVewrCraw，,^ow■S/omed/ca/y^/^c^1,編DasGupta,B.R.Plenum,NewYork)。作為定義，1IU中和10,000LD50的BoNT/A毒素(Bowmer(1963)歸.,.//.O.29:701—709)。2個可能的機(jī)理是當(dāng)組合mAb時觀察到效力增加的原因Ab混合物對毒素的功能性結(jié)合親和力的增加，和/或結(jié)合細(xì)胞受體的毒素表面的封閉的增加。為了確定組合抗體對功能性結(jié)合親和力的作用，通過使用流式熒光計來定量溶液反應(yīng)混合物中剩余的游離抗體，測定每種單一mAb、mAb對和所有3種mAb的混合物的表觀《d。對于單一mAb，在均勻溶液中測得的抗原結(jié)合親和力(抗原和抗體都在溶液中；圖7)低于通過表面等離振子共振在BIAcore中測得的親和力(表8)(更高的尺d)，在后者中，抗體被固定化，且僅抗原在溶液中。當(dāng)抗體C25(它表現(xiàn)出最大體外效力)與抗體3D12以等摩爾量混合時，得到的Ab組合以65pM的表觀〖d結(jié)合毒素，所述親和力為用單獨的個別抗體觀察到的親和力的200和10倍(更低的Kd)。向混合物中加入等摩爾量的第三種mAb(S25)，使表觀親和力進(jìn)一步增加至l8pM。C25與S25的等摩爾混合物，僅僅產(chǎn)生親和力的微弱的2倍增加，這可以解釋為什么該對比C25和3D12的組合的體內(nèi)效力更^f氐。用多種mAb觀察到的功能性親和力的增加，可能是由于在第一種mAb的結(jié)合后發(fā)生的毒素構(gòu)象變化，其導(dǎo)致第二種和第三種mAb的更高親和力的結(jié)合，或來自mAb結(jié)合，其使毒素從單價變成多價抗原(Moyle爭(1983)丄/mw簡o/.131:1900—1905)。這導(dǎo)致"抗體親抗原性作用"和親和力的增加。抗體親抗原性作用已經(jīng)被較好地認(rèn)識，并關(guān)于結(jié)合多i"介4元原的IgG進(jìn)^亍表;[正(Crothers和Metzger(1972)/mmM"oc/zem^try9:341-357)，例如細(xì)胞表面，但是未被充分認(rèn)為發(fā)生在溶液中。測得的Kd的增加，與觀察到的mAb對和寡克隆Ab的體內(nèi)效力的增加相一致。重排平衡結(jié)合方程游離的毒素/結(jié)合的毒素=^/[血清抗體].假定2-ml小鼠血量，當(dāng)小鼠接受50pgAb時，血清抗體濃度是160nM。因為毒素的施用量是LD50的許多倍，所以結(jié)合的毒素約等于施用的毒素。因而，上述方程簡化為游離的毒素/施用的毒素=Kd/160nM。為了確定導(dǎo)致50%小鼠死亡的施用的毒素量，人們使用1LD50替代游離的毒素的量，并求出施用的毒素，產(chǎn)生方程施用的毒素(按LDso計)=1LD5Qx160nM/^d.使用C25的溶液Xd，50。/。小鼠存活的預(yù)測毒素劑量是16LD5o(施用的毒素=1LD50x160nM/10nM)。當(dāng)將該計算應(yīng)用于C25和3D12Ab對和寡克隆Ab時，組合抗體的效力增加的量級與功能性親和力的增加平行(表9)。表9.觀察到的和預(yù)測的重組抗體的毒素中和抗體預(yù)測的毒素中和觀察到的毒素中和C2516LD50<20LD50C25+3D122,500LD501,500LD50C25+3D12+S258,900LD5020,000LD50寡克隆Ab的有效毒素中和的第二個可能機(jī)理是，需要封閉結(jié)合細(xì)胞受體的毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域表面上的多個表位。已經(jīng)假設(shè)，毒素通過毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的至少2個位點，結(jié)合細(xì)胞受體(Dolly爭(1984)A/Wwre(Xo"dow〕307:457—460;Montecucco(1986)7>ew(^歷0c/7，.11:315-317)。這些包括神經(jīng)節(jié)普脂結(jié)合位點和推定的蛋白受體結(jié)合位點。實際上，已經(jīng)在同源破傷風(fēng)毒素的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)中，觀察到2個空間上分離的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點(Fotinou鄰OOl)腸/.C7z縫276:32274-32281)，且結(jié)合不重疊的破傷風(fēng)毒素表位的mAb可以阻斷毒素與GTlb神經(jīng)節(jié)苦脂的結(jié)合(Fitzsimmons爭(2000)F"c"7e19:114-121)。我們以前的表位作圖研究與封閉大部分BoNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HC)的多個mAb相一致(Mullaney爭(2001)/"/e"./wm麗.69:6511-6514)。2種mAb(S25和3D12)結(jié)合BoNTHC的C-末端亞結(jié)構(gòu)域。C25mAb結(jié)合由來自BoNTHc的N-和C-末端亞結(jié)構(gòu)域的序列組成的構(gòu)象表位。與表位作圖相一致的一種模型將3種mAb表位置于相同Hc表面上，并與推定的細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂受體GTlb的已知?？课稽c重疊(Mullaney爭(2001)/"/e"./wmw".69:6511—6514)。討論總之，我們已經(jīng)表明，6種A類生物戰(zhàn)試劑之一BoNT/A，可以用僅由3種mAb組成的寡克隆Ab有效地中和。寡克隆Ab的效力是超免疫的人球蛋白的90倍，并接近超免疫的單-血清型馬A型抗毒素的效力(Sheridan鄰OOl)Tox/，39:651—657)。因而，可以將多克隆血清的效力去巻積(deconvolute)或還原成^U又結(jié)合3種不重疊的表位的mAb。該協(xié)同作用導(dǎo)致3種mAb的效力與任一種單一mAb的效力相比增加了超過20,000倍。其它人以前已經(jīng)表明單克隆抗體之間在中和破傷風(fēng)毒素或HIV感染中的協(xié)同作用。在破傷風(fēng)毒素的情況下，組合3-4種單克隆抗體，使體內(nèi)毒素中和的效力增加最高達(dá)200倍(Volk爭(1984)/"/e"./mm麗.45:604—609)。在HIV的情況下，組合3或4種mAb，使病毒中和效力與單一mAb相比增加10倍(Zwick爭(2001)丄)^yo/.75:12198—12208)。因而，我們的觀察可能證實在許多系統(tǒng)中是常見的。但是，我們表明，在毒素中和的情況下，增加的效力可能源自混合抗體的功能性親和力的大幅增加。不清楚該機(jī)理是否對于病毒中和是真實的。人們可以假設(shè)，對毒素的多克隆體液免疫應(yīng)答，在功能上由僅僅結(jié)合少數(shù)不重疊的表位的Ab支配。效力的增加似乎主要源自寡克隆Ab的《d與單一mAb相比的大幅降低，且也源自與細(xì)胞受體相互作用的毒素表面的更大封閉，這樣的機(jī)理通常適用于許多在溶液中的抗原，從而表明寡克隆Ab可以提供比mAb更有效的抗原中和的一^殳途徑。盡管通過工程改造使C25mAb的&變得接近pM,可能實現(xiàn)類似的效力，但寡克隆Ab提供達(dá)到有效的抗毒素的更簡單的、更快速的途徑。寡克隆Ab也提供安全的且無限供給的藥物，用于預(yù)防和治療BoNT/A中毒。因為Ab由嵌合的或人IgG組成，所以可以立即^安比例生產(chǎn)，以生產(chǎn)安全的抗毒素庫?；蛘撸覀円呀?jīng)用全人IgG替代嵌合S25IgG，并使寡克隆Ab的效力增加了超過2倍。正在進(jìn)行用全人同源物替代嵌合C25的工作。嵌合的、人源化的和人mAb代表著日益重要的治療劑類別，它們的生產(chǎn)方式是已知的。10種mAb已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于人治療，且超過70種其它mAb治療劑正在臨床試驗中(Reichert(2001)yVW.肌o&c/mo/.19:819—822)。由于消除半衰期最高達(dá)4周，所以Ab可提供數(shù)月的抗毒素的保護(hù)，或可以用于治療。寡克隆Ab適用于其它BoNT毒素血清型，以及其它A類試劑。炭疽是毒素-介導(dǎo)的疾病，且已經(jīng)表明Ab對該試劑是保護(hù)性的(Little爭(1997)/m腦"5:5171—5175;Beedham鄰001)r"c".we19:4409—4416)。牛痘免疫球蛋白可以用于預(yù)防或治療天花或由無免疫應(yīng)答的宿主的接種疫苗引起的并發(fā)癥(Feery(1976)Fox31:68-76)。Ab也可以用于鼠疫和由出血熱病毒造成的疾病(Hill爭(1997)/mm肌65:4476-4482;Wilson爭(2000)Sc/e,287:1664—1666)。我們的數(shù)據(jù)支持了用于對抗BoNT和生物戰(zhàn)和生物恐怖主義的其它試劑的寡克隆Ab的快速開發(fā)和評價。實施例3來自免疫和未免疫人噬菌體文庫的抗-肉毒桿菌A型抗體的遺傳學(xué)和免疫學(xué)對比理解抗體在肉毒桿菌中毒中的應(yīng)答，對于疫苗設(shè)計和被動預(yù)防是重要的。為了研究該活性，我們已經(jīng)使用噬菌體展示，在分子水平研究了對BoNT/A(肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Hc)的免疫應(yīng)答。從由(a)用五價肉毒桿菌類毒素免疫的人志愿者和(b)未免疫人外周血淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞制備的V-基因譜，分離scFv抗體。從2個文庫中，可以選擇出一大組血清型特異性的表達(dá)結(jié)合肉毒桿菌的scFv的噬菌體。免疫scFv結(jié)合劑對BoNT/AHC的表位作圖，令人驚奇地揭示了有限數(shù)目的識別與2個不同組(聚簇I和II)對應(yīng)的構(gòu)象表位的scFv。僅來自聚簇I的scFv在小鼠半膈測定中表現(xiàn)出中和活性。源自未免疫文庫的抗-BoNT/AHC克隆可以方便地分成聚簇ni-xi,且似乎與聚簇I或II沒有共有重疊表位。另外，它們在生物學(xué)上顯著的濃度沒有表現(xiàn)出毒素的中和。因此，我們提出，基于五價肉毒桿菌類毒素的疫苗指導(dǎo)對結(jié)合結(jié)構(gòu)域HC上暴露的有限數(shù)目的免疫顯性表位的體液免疫應(yīng)答。簡介肉毒桿菌毒素是麻痹性神經(jīng)毒素，其作為由梭菌屬的許多細(xì)菌物種產(chǎn)生的7種不同血清型(A-G)而存在(Hatheway(1989)Pp.3-24In:SimpsonLL，編.Botulinumneurotoxinandtetanustoxin.SanDiego:AcademicPress)。它們作為單鏈蛋白產(chǎn)生(Mr:150,000),且被有限的蛋白水解完全激活，這導(dǎo)致2條鏈的形成，重鏈(Mr:100，000)和輕鏈(Mr:50,000)其通過二硫鍵和非共價鍵結(jié)合到一起(Niemann(1991)Pp.303-348In:AloufJE，F(xiàn)reerJH，編.Sourcebookofbacterialproteintoxins.NewYork:AcademicPress;Simpson(1990)JP/zjwW.,84:143-151)。中毒可因下述原因產(chǎn)生攝食梭菌-污染的食物(食物傳播的肉毒中毒)，嬰兒腸感染(嬰兒肉毒中毒)，和傷口的深度皮下感染(傷口肉毒中毒)。人肉毒中毒最經(jīng)常由A、B和E型造成，且很少由F型造成(Dowell(1984)/"D".,6(Suppl1):202—207;BotulismintheUnitedStates.Handbookforepidemiologists,cliniciansandlaboratoryworkers.Atlanta,CenterforDiseaseControl,1980)。BoNT(肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型)優(yōu)先作用于膽堿能神經(jīng)末梢，以阻斷乙酰膽堿釋放(Habermann爭(1986)7b/MkroZ/o//mm麗o/"129:93—179;Montecucco爭(1994)Mo/M/cto&o/.，13:1—8)。BoNT的作用包括3步(Simpson(1986)j朋Wev尸/w畫co/7b:c/co/.，26:427—453):(1)通過重鏈的C-末端HC，結(jié)合突觸前膜上的受體；(2)通過重鏈的N-末端HN，輕鏈易位進(jìn)胞質(zhì)；和(3)通過輕鏈的鋅蛋白酶活性，切割突觸小泡?？亢腿诤系鞍讖?fù)合物中的一種或多種關(guān)4建組分(Montecucco爭(1994)編Mcto&W"13:1—8;Schiavo(1992)J脂C/2亂，267:23479—23483;Schiavo邦995)C釘7b/她油'o//固朋.，195:257—275)。被動免疫治療已經(jīng)被公認(rèn)為抗人病原體和它們的毒素的有價值的預(yù)防和治療方法(綜述參見Gronski辨1990)似0//附附麗0/.,28:1321—1332禾口Cross(1997)P.97In:CryzSJ，纟扁.Immunotherapyandvaccines.Weinheim,Germany:VCHVerlagsgesellschaft)。在肉毒中毒的情況下，認(rèn)為識別BoNT重鏈的C-末端結(jié)構(gòu)域(HC)的抗體制劑能阻止毒素與它的細(xì)胞受體的結(jié)合。用重組HC免疫接種小鼠，賦予對最高達(dá)1,000,000小鼠腹膜內(nèi)LD50攻擊劑量的良好體內(nèi)保護(hù)(Clayton爭(1995)/畫肌，63:2738-2742;Byrne爭(1998)/一"/畫亂，66:10)。在過去，馬血漿-衍生的多克隆抗-肉毒桿菌抗體制劑(馬HIG)已經(jīng)施用給超過80。/。的成年人肉毒中毒患者(Middlebrook和Brown(1995)CW7b/Mcra6,W/羅亂，195:89-122;Tacket爭(1984)為J她d.,76:794—798;Morris(1981)P.15In:LewisGEjr，編.Biomedicalaspectsofbotulism.NewYork:AcademicPress)。一皮多克隆抗體制齊寸識別出的大量不同表位，通常確保保護(hù)性抗體的存在，后者通常是總抗體的小亞群。對于預(yù)防，當(dāng)在暴露前施用時，馬抗體是最有效的，但是可以在暴露后最高達(dá)24小時預(yù)防疾病(Middlebrook和Brown(1995)Cw廠rTopM/cro6/o//mmw".,195:89—122)。^旦是，馬4元毒素的施用可能造成不良反應(yīng)，例如在9%的病例中，造成血清病和過敏反應(yīng)(Black和Gunn(1980)JMed,69:567-570)。最近的努力已經(jīng)集中在乂人免疫的志愿者供體的血清制備的人免疫球蛋白(人BIG)的生產(chǎn)(Arnon(1993)Pp.477-482In:DasGuptaBR,編.Botulinumandtetanusneurotoxins,neurotransmissionandbiomedicalaspects.NewYork:PlenumPress)。中和單克隆抗體，特別是如果屬于人來源，會提供抗體的無限來源，并替代來自人或馬的抗體的制備。我們已經(jīng)使用抗體噬菌體展示來生成能中和BoNT的單克隆抗體(Hoogenboom爭(1991)i^.，19:4133—4137;McCafferty鄰990)瑜臟,348:552—554;Skerra和Pluckthun(1988)<Sc/e"ce,240:1038-1041)。使用從免疫的小鼠構(gòu)建的噬菌體抗體文庫，我們鑒別出2組單克隆，它們結(jié)合BoNT/AHC上的2種非重疊中和表位(Amersdorfer爭(1997)/mm亂，65:3743—3752)。在本實施例中，我們描述了從用五價肉毒桿菌類毒素(A-E)免疫的人志愿者構(gòu)建的噬菌體抗體文庫選擇出的單克隆抗體的表征。將這些單克隆抗體識別出的親和力和表位與用從未免疫人噬菌體文庫選擇的單克隆抗體識別出的親和力和表位相比較。結(jié)果鑒別出了另外的中和表位，并提供了生成用于肉毒中毒預(yù)防和治療的全人抗體的途徑。材料和方法免疫和未免疫V-基因抗體文庫為了構(gòu)建免疫噬菌體抗體文庫，人志愿者接受五價肉毒桿菌類毒素A—E型(MichiganDepartmentofPublicHealth)的免疫接種。在0、2和12周，用0.5ml五價類毒素免疫志愿者，且l年后，用0.5ml類毒素加強(qiáng)。使用小鼠血清中和生物測定，測量抗BoNT/A的中和效價(Hatheway鄰984)■//"/e"ZXs.,150:407-412)。通過在Histopaque1077中離心，分離PBL，并使用改進(jìn)的Cathala等的方法(Cathala爭(1983)房j,2:329-335),制備RNA。從用1.0x108B細(xì)胞制備的RNA，制備第一鏈cDNA,其中使用IgG恒定區(qū)引物(對于重鏈)或k和X恒定區(qū)引物(對于輕鏈)[26]。如(Marks爭(1991)JM/肌o/"222:581-597)所述，從第一鏈cDNA擴(kuò)增P7/,r/c和Pa差^。凝膠純化PCR產(chǎn)物，從凝膠提耳又后進(jìn)行乙醇沉淀，并如前所述用于構(gòu)建^Fv差^,(^7,)。凝膠純化差~7,，然后將其用作使用含有附加限制位點的側(cè)接寡核苷酸進(jìn)行再擴(kuò)增的模板(#")。凝膠純化"/^差^浮([7/-&、P7/-F2)，用S/zl和iVort消化，用苯酚/氯仿提取，并連4妻進(jìn)用S刀I和Wofl消化的載體pCANTAB-5E(PharmaciaBiotech,Milwaukee,WI)(Sambrook爭(1991)NewYork:ColdSpringHarborLaboratory)。用苯酚/氯仿|是耳又連接混合物，乙醇沉淀，并電穿孔進(jìn)50|il大腸一干菌TGI纟田月包(Gibson(1984)UniversityofCambridge:studiesontheEpstein-Barrvirusgenome)。3尋纟田月包4it平才反在含有100—g/ml氨千青霉素和1%(W/V)葡萄糖的TYE平板上。將菌落從平板刮到2ml2xTY中，其中含有100pg/ml氨千青霉素、P/。(w/v)葡萄糖和15。/o(v/v)甘油，以在-70。C保藏。來自4次轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物產(chǎn)生了7.7xl()s個單個重組體的文庫。對于未免疫文庫，使用以前報道的噬菌體-展示的人單鏈抗體文庫，它含有6.7x109個成員(Sheets爭(1997)i^ocA^".」cad5W園，95:6157—6162)。噬菌體制備和選擇如(Marks爭(1991)Mo/5/o/.，222:581—597)以前所述的，通過用VCS-M13輔助噬菌體(Stratagene)拯救，制備來自2個文庫的噬菌粒顆粒。純化噬菌體顆粒，并通過2次PEG沉淀進(jìn)ff濃縮(Sambrook爭(1991)NewYork:ColdSpringHarborLaboratory),重新懸浮于2ml磷酸緩沖鹽水(PBS:25mMNaH2P04,125mMNaCl，pH7.4)中，并經(jīng)0.45濾器(Nalgene)過濾，以達(dá)到約1013轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)/ml的效價。使用75mmx12mm免疫管(Nunc,Maxisorb)選擇文庫，所述免疫管用2ml溶于PBS，pH7.4中的BoNT血清型A、B、C和E(各自50pg/ml)或BoNT/AHC(50)ag/ml)在4°C包被過夜(Emanuel爭(1996)J/mww"o/M"/2.,193:189—97)。在室溫(RT),用溶于PBS中的2%脫脂奶粉封閉管1小時，然后如(Marks爭(1991)J楊/腸/.，222:581-597)以前所述的，使用濃度為5.0x1012TU/ml的噬菌體，進(jìn)行選擇、洗滌和洗脫操作。500pl洗脫的噬菌體用于感染10ml對數(shù)期生長的義應(yīng)^"霧TG1，后者鋪平板在2xTY-AMP-Glu平板上。拯救噬菌體，如上所述濃縮，并用于下一個選擇輪次。拯救-選擇-鋪平板循環(huán)通常重復(fù)4輪。ELISA篩選和指紋分析每輪選擇后，單個氨千青霉素-抗性菌落用于接種微量滴定板孔，所述孔中含有150iu12xTY-AMP-0.1。/。葡萄糖。使細(xì)菌生長，以達(dá)到J600約0.9,并通過加入異丙基-P-d-吡喃型硫代半乳糖苷(IPTG)至lmM的終濃度，i秀導(dǎo)scFv表達(dá)(DeBellis和Schwartz(1990)A^c/Jc/A18:1311)。在25。C,在搖動下，使細(xì)菌生長過夜，通過離心沉淀細(xì)胞，并收集含有可溶scFv的上清液。在用10)ig/ml溶于PBS、pH7.4中的抗原包被的96-孔微量滴定板(Falcon3912)中，篩選scFv與BoNT和BoNT/AHC的結(jié)合。使用小鼠單克隆抗體9E10(1ng/ml)(SantaCruzBiotechnology,CA),它i口、另'JC-末端myc才示i己(Munro禾口Pelham(1986)Ce〃，46:291—300)，然后使用(Griffiths和Malmqvist(1993)酉紹/.,12:725-734)所述的過氧化物酶-綴合的抗-小鼠Fc抗體(Sigma),檢測源自未免疫文庫的scFv。使用過氧化物酶-綴合的單克隆抗體抗-E(2.5ng/ml)(PharmaciaBiotech),檢測源自免疫文庫的scFv。30分鐘后，用NaF(3.2mg/ml)終止反應(yīng)，并測量A405nm。通過PCR-指改分析(Marks爭(1991)>/A^/fi/o/"222:581—597)，然后通過來自每個指紋型的至少2個克隆的Vh和Vl差/^的DNA測序，確定獨特克隆的數(shù)目。使用10pg/ml的BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/E、BoNT/AHc和血清型A的重組易位結(jié)構(gòu)域(BoNT/AHN)包被的孔，如上所述通過ELISA確定抗體的特異性。如果它們產(chǎn)生為背景的至少5倍的信號，則鑒定克隆是對選擇的抗原特異性的。scFv的亞克隆、表達(dá)和純化將通過ELISA測定的結(jié)合BoNT/A和BoNT/AHC的scFv抗體亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pUC119Sfi-NotmycHis，從而產(chǎn)生在scFv的C-末端鬲蟲合六纟且氛酉交才示i己(Schier爭(1995)/mmimo化c'/.,1:73—81)。^口(Schier爭(1996)■/7kfo/Ao/.，255:28-43)以前所述的，表達(dá)scFv,并通過固定化的金屬親和層析進(jìn)行純化，和分光光度地測定純化的單體scFv的濃度，其中，i定在1.0的A280nm與0.7mg/ml的scFv濃度關(guān)耳關(guān)。表位作圖和親和力測定使用表面等離振子共振，在BIAcore(PharmaciaBiosensor)中進(jìn)行表位作圖和動力學(xué)研究。在BIAcore流動室中，使用NHS-EDC化學(xué)(Johnson爭(1991)J聰/198:268—277),將約600共振單位(RU)的BoNT/AHC(15pg/ml,溶于10mM乙酸鈉中，pH4,5)偶聯(lián)到CM5傳感器芯片上。該量偶聯(lián)的BoNT/AHC導(dǎo)致scFvRumax為100-175RU。結(jié)合scFv后，使用4MMgCl2再生表面。對于表位作圖研究，測定對的每個成員結(jié)合的scFv的量(RU)，且然后將2種scFv混合到一起，產(chǎn)生的終濃度等于用于測量單一scFv的濃度(Amersdorfer爭(1997)/m扁n.，65:3743—3752)。從在BIAcore中測得的結(jié)合速率常數(shù)(/U)和解離速率常數(shù)(&ff)，計算scFv的《d(Kd=A。ff/A:。n)。使用濃度范圍為50-1000nM的scFv,在5pl/分鐘的連續(xù)流下，測量結(jié)合。從In(dW/dO〃與濃度的圖，測定(Karlsson爭(1991)J/mwwwo/Me仇'145:229-240)。使用30iul/分鐘的流速以阻止重新結(jié)合，從在最高濃度的分析的scFv處的傳感器圖的解離部分，測定U。體外生物測定如(Desphande(1995)7bx/co",33:551—557)以前所述的，使用小鼠半膈制劑，進(jìn)行體外中和研究。從雄性CD/1小鼠("-33g)切除膈神經(jīng)-半膈制劑，并懸浮于135mMNaCl，5mMKC1，lmMNa2P0415mMNaHC03lmMMgCl22mMCaCl2,和llmM葡萄糖中。使95%02-5%C02作泡狀通過溫育浴，并維持在36。C。在0.05Hz，以0.2ms持續(xù)時間的方波刺激膈神經(jīng)。使用連接到圖表記錄器上的力位移轉(zhuǎn)換器(ModelFT03;Grass)，測量等長顫搐張力。將純化的scFv抗體與BoNT/A在室溫溫育30分鐘，然后加入組織浴，從而產(chǎn)生2.0xl(T8M的終scFv濃度和2.0x10—11M的終BoNT/A濃度。將毒素誘導(dǎo)的麻痹定義為初始肌肉顫搐的50%減少。從抗體引起的50%減少值除以BoNT/A的50%減少的值，計算延長比。以各自2.0x1(T8M的終濃度，研究31)12和C25的組合。通過雙尾fyi、發(fā)，測定達(dá)到50%顫搐減少的時間之間的差異，認(rèn)為P<0.05是顯著的。肉毒桿菌毒素和肉毒桿菌毒素結(jié)構(gòu)域的制備從USAMRIID得到純化的肉毒桿菌毒素血清型A、B、C和E(150kDa)。在義應(yīng)yf麥中表達(dá)肉毒桿菌毒素A型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BoNT/AHC)，并使用C-末端(His6)標(biāo)記(OphidianPharmaceuticals,Inc.)，通過固定化的金屬親和層析(IMAC)進(jìn)行純化。肉毒桿菌毒素A型的易位結(jié)構(gòu)域(BoNT/AHN)是R.Stevens博士(UC-Berkeley，CA)的贈品。表10.選自免疫和未免疫噬菌體展示文庫的BoNT結(jié)合性scFv的特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>結(jié)果合成免疫噬菌體展示文庫的策略來自用五價肉毒桿菌類毒素免疫的人志愿者的PBL,用于生成scFv噬菌體抗體文庫。在小鼠中和生物測定(Hatheway爭(1984)J/w/e"ZX、，150:407—412)中，供體多克隆血清對效價為2.56IU(國際單位)的BoNT/A是保護(hù)性的。從RNA擴(kuò)增^T/和)^差^，剪接到一起，以生成"Fv差^潘，并克隆進(jìn)pCANTAB-5E,以生成7.7x105轉(zhuǎn)化體的噬菌體抗體文庫。15個隨機(jī)選擇的克隆的PCR篩選表明，全部都攜帶全長插入片段，如通過種系基因特異性的輕鏈引物測得的，66%具有*鏈，且34%具有Vx輕鏈(未顯示數(shù)據(jù))。噬菌體抗體文庫的選擇和ELISA篩選在BoNT血清型A、B、C、E和BoNT/AHC上，選擇免疫文庫和大的未免疫人噬菌體抗體文庫(Sheets爭(1997)A^f/.^c^/OS^，95:6157-6162)。在BoNT/A或BoNT/AHC上選擇3輪后，ELISA陽性克隆的頻率分別是79和100%來自免疫文庫。對于其它血清型，觀察到ELISA陽性的類似頻率。在BoNT/A或BoNT/AHC上選擇3輪后，ELISA陽性克隆的頻率分別是28和94%來自未免疫文庫。對于其它血清型，觀察到ELISA陽性的類似頻率。通過DNA指紋分析和隨后DNA測序測定獨特scFv的數(shù)目，并通過ELISA測定每種scFv的特異性。在篩選來自每個選擇的100個菌落中，從免疫文庫鑒別出48種獨特抗體(23BoNT/A、16BoNT/B、6BoNT/C和3BoNT/E),且從未免疫文庫鑒別出27種獨特抗體(14BoNT/A、5BoNT/B、5BoNT/C和3BoNT/E)(表10)。通過ELISA，在重組BoNT/AHC和BoNT/AHN結(jié)構(gòu)域上，測定每種BoNT/AscFv的細(xì)微特異性(圖8)。在毒素上選擇后分離的23種免疫BoNT/A抗體中，6種結(jié)合BoNT/AHC(3A6、3D12、2A1、3B8、3F10、2B11)，4種結(jié)合BoNT/AHN(3D4、3A11、4A4、3G4)(圖8A)，且剩余的13種抗體推測結(jié)合輕4連(Chen爭(1997)/"/e"/mww".，65:1626-1630)。這些發(fā)現(xiàn)表明，肉毒桿菌類毒素的免疫接種指導(dǎo)朝向輕鏈的免疫應(yīng)答，其中更少的抗體針對HC或HN結(jié)構(gòu)域。在BoNT/AHC上選擇免疫文庫，僅僅產(chǎn)生單一獨特的抗體(2A1)，它與毒素選擇的克隆3D12和3D6克隆相關(guān)(表11)。當(dāng)分析6個抗-HC克隆的PT基因用法時，發(fā)現(xiàn)全部都使用Fk/差^家族(表11)，盡管該文庫含有2/3F/c和l/3Pa^鏈基因。在BoNT/A全毒素上選擇未免疫文庫，產(chǎn)生4種抗體，但是它們都不結(jié)合BoNT/AHC。在BoNT/AHC上選一奪文庫，產(chǎn)生10種獨特的scFv,它們使用FK或'W^鏈基因(表ll)。總的來說，僅僅50%這樣的scFv結(jié)合全毒素，這與HC表面的相當(dāng)大部分埋入全毒素的觀察相一致(Lacy爭(1998)AW肌o/.,5:898-902)。所有scFv抗體都是血清特異性的和結(jié)構(gòu)域特異性的，除了來自未免疫文庫的克隆2BU以外，沒有觀察到交叉反應(yīng)性，如通過ELISA測得的，所述克隆2B11結(jié)合BoNT7AHC和BoNT/AHN結(jié)構(gòu)域(圖8B)。表11.在BoNT/A和BoNT/AHc上選擇的、從免疫和未免疫文庫分離的人scFv抗體的CDR3-序列和親和力a未免疫文庫重鏈<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>a如V-BASE數(shù)據(jù)庫(MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK)所詳述的，指定人種系VH、Vk和VX區(qū)段。列出的克隆(具有相同的VH或VLCDR3區(qū))表現(xiàn)出不同的CDR1、CDR2和構(gòu)架區(qū)，正如它們來自種系基因的差異所指明的；可以從GenBank登記號AF090405—AF090420獲得。b在BoNT/A上選擇的文庫。c在BoNT/AHC上選擇的文庫。BoNT/AHC特異性的抗體片段的表位作圖對BoNT/AHC結(jié)合性scFv進(jìn)行表位作圖，以確定識別的非重疊表位的數(shù)目。在以導(dǎo)致芯片表面接近飽和和至少100RU的結(jié)合的scFv濃度，研究scFv對的BIAcoreTM中，使用表面等離振子共振進(jìn)4亍表位作圖。對于對中的每個成員，測定結(jié)合的scFv的量，然后將2種scFv混合到一起，產(chǎn)生的終濃度等于用于測量單一scFv的濃度。當(dāng)一起注射時，識別相同表位的抗體表現(xiàn)出結(jié)合的RU的最小增加(圖9A)，而識別不同表位的scFv表現(xiàn)出RU的加性增力口(圖9B)。如表2和3所示，scFv3A6、3D12和2A1(稱作聚簇I)共有F//f。PT差^區(qū)段(分別是DP50和L12)的高度同源性，并識別重疊表位。它們的序列差異僅在于通過體細(xì)胞突變導(dǎo)入的重鏈和輕鏈基因。scFv3B8和3F10(稱作聚簇II)形成第二組抗體，其結(jié)合與聚簇I相比不同的表位。由于較差的表達(dá)水平，不能分析代表可能的獨特表位的克隆2BU。當(dāng)分析源自未免疫文庫的scFv抗體時，我們發(fā)現(xiàn)全部都結(jié)合獨特的表位，稱作聚簇III-XI，如表3所示。未免疫文庫成員(聚簇III-XI)沒有表現(xiàn)出與免疫文庫成員(聚簇I和H)的重疊結(jié)合。被免疫和未免疫scFv識別的表位不與被2種以前報道的鼠scFv(C25和S25)結(jié)合的表4立重疊(Amersdorfer爭(1997)/"/e"./mmw".,65:3743—3752)。動力學(xué)測量和中和測定使用表面等離振子共振，在BIAcore中測量A:on和Aoff,并用于計算平衡解離常數(shù)。從免疫文庫選擇的scFv具有3.69xl(T8和7.8xl(T9M的Kd，這些值與從雜交瘤生產(chǎn)的單克隆IgG的報道值相當(dāng)(Foote和Milstein(1991)iVam",352:530—532)(表12)。未免疫scFv具有更低的Kd，其范圍為4.6x10—7至2.61xl(T8M。為了確定scFv中和毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)性麻痹的能力，使用膈神經(jīng)-半膈制劑，在來自每個表位聚簇的一個代表性成員上進(jìn)行體外研究。對于單獨的BoNT/A和在有2.0x10—8MscFv存在下，將值報道為達(dá)到50%顫搐減少的時間。如表12和圖IOA和IOB所示，發(fā)現(xiàn)了中和不同抗-BoNT/AHcscFv的顯著差異，這取決于使用哪種文庫。從免疫文庫中，3D12(聚簇I)明顯延長達(dá)到神經(jīng)性麻痹的時間1.5倍，而3F10(聚簇II)沒有表現(xiàn)出對毒素中和的作用。未免疫文庫(聚簇III-XI)的代表在半膈測定中沒有表現(xiàn)出保護(hù)作用，甚至在與終濃度為1.8x10—7M的聚簇III-XI所有成員組合后。當(dāng)使用3D12(聚簇I)與以前分離的鼠scFv(C25)(Amersdorfer爭(1997)/"/e"./mw簡"65:3743—3752)的組合時，達(dá)到麻痹的時間顯著增加至3.2倍，從而證實了對毒素中和的協(xié)同作用。我們用鼠scFvS25和3D12觀察到了類似的協(xié)同作用(未顯示數(shù)據(jù))。表12.選自噬菌體抗體文庫的scFv的親和力、結(jié)合動力學(xué)和體外毒素中和結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>a通過表面等離振子共振，測量變量kon和koff，并將Kd計算為koff/kon。b與單獨的BoNT/A的時間相比，使用20nMscFv+20pMBoNT/A在小鼠半膈測定中達(dá)到50%顫搐減少的時間(分鐘)。每個值是至少3次觀測值的平均值士S.E.M.c在BoNT/A上選4奪的文庫。d與BoNT/A相比PO.Ol。6不顯著。f在BoNT/AHC上選擇的文庫。g與BoNT/AHC相比P<0.01。討論我們以前證實，用BoNT/AHC的重組結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫接種小鼠，指導(dǎo)朝向產(chǎn)生抗體的免疫應(yīng)答，所述抗體結(jié)合參與HC結(jié)合突觸前毒素受體的表位(Amersdorfer爭(1997)/"/e"./畫肌，65:3743—3752)。這些實驗表明，scFv對毒素的中和，可以與scFv親和力和與全毒素竟?fàn)幨荏w結(jié)合位點的能力相關(guān)聯(lián)。在這里，我們使用免疫和未免疫噬菌體展示文庫進(jìn)行了更系統(tǒng)的方法，以對BoNT/A的人體液免疫和未免疫應(yīng)答作圖。2個抗體文庫的抗體基因來源是，(a)用五價類毒素(A-E)免疫的人志愿者的PBL,和(b)未免疫外周血淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞。該方法的一個限制是，用于這些研究的一種免疫人供體代表暴露于肉毒中毒后產(chǎn)生的廣泛遺傳多樣性的程度。小鼠和人中的體液免疫應(yīng)答導(dǎo)致非常有限數(shù)目的保護(hù)性表位的事實，暗示著賦予保護(hù)的抗原表位的相當(dāng)保守。選擇操作包含，針對4種固定化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B、C和E,淘選2個組合文庫。3-4個淘選循環(huán)后，/人2個文庫得到針對每個血清型的抗體，頻率遞減的次序是，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C和BoNT/E。對于未免疫文庫，也觀察到結(jié)合劑的類似頻率，例外是BoNT/B。這些結(jié)果與Siegel(Siegel(1989)/M/cto&o/.,26:2351-2356)的發(fā)現(xiàn)相關(guān)聯(lián)，在后者中，他們研究了來自25個肉毒桿菌五價類毒素的人受體的血清樣品。通過小鼠血清中和生物測定，測定各種血清型的免疫原性血清型A的范圍是5.7-51.6IU/ml,其次血清型B是0.78-18IU/ml,且血清型E是0.61-101U/ml。人免疫接種類毒素導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生，所述抗體主要針對毒素輕鏈，少數(shù)抗體結(jié)合HC。在用BoNT/AHC免疫接種小鼠、隨后用全毒素加強(qiáng)后，觀察到類似的結(jié)果。由于抗體中和活性主要源自HC對細(xì)胞受體結(jié)合的封閉，所以這些分析表明，HC疫苗比基于毒素的疫苗更有保護(hù)性，因為產(chǎn)生了更多的HC抗體。人免疫HCscFv識別至少2種非重疊表位。結(jié)合這些表位(聚簇I)之一的scFv，可以體外中和毒素。當(dāng)scFv結(jié)合聚簇I與結(jié)合2種非重疊HC表位之一的免疫小鼠scFv相組合時，毒素中和的效力增加。該結(jié)果表明，HC與多種細(xì)胞受體對接，或?qū)影l(fā)生在廣表面區(qū)域(Mullaney爭(2001)/"/e"/ww"".，69:6511—6514)。通過在BoNT/A上選擇大的未免疫文庫，可以將識別HC的人scFv譜延伸到其它表位(聚簇III-XI)的范圍。令人感興趣地，該結(jié)果與下述概念相一致，即基本免疫譜含有能識別大多數(shù)溶劑可接近的抗原區(qū)域的抗體，但是免疫接種指導(dǎo)識別有限數(shù)目的免疫顯性的表位。但是，從未免疫文庫得到的所有抗體都針對非中和表位(或至少不體外中和毒素)。不能中和的一種解釋是，由于與毒素對它的受體的0.3-2.3nM的高親和力相互作用相比，抗體對HC結(jié)構(gòu)域(例如2B10、2E6、2B1、3D1)的107至460nM的j氐親和力(Schengrund(1999)Jrox/co/7bx/"Wev.，18:35—44)?？傊覀冊谶@里報道，使用從免疫和未免疫人供體制備的組合文庫，成功地分離了針對肉毒桿菌神經(jīng)毒素和它們的亞結(jié)構(gòu)域的特異性人抗體。使用噬菌體展示來篩選具有感染性疾病或病原體的任意人的抗體譜，允許我們接近具有治療和研究潛力的人單克隆抗體的非常大的庫。實施例4進(jìn)化更高親和力的中和抗體為了改善肉毒中毒的檢測和治療，使用分子進(jìn)化和酵母展示來增加2種中和單鏈Fv(scFv)抗體結(jié)合BoNT血清型A(BoNT/A)HuC25和3D12的親和力。mAbHuC25的親和力成熟使用一系列突變型酵母展示文庫，順序增加HuC25對BoNT/A的親和力(圖20)。首先，將HuC25基因亞克隆進(jìn)酵母展示載體pYD2，作為NcoI-NotI片段。scFv基因成功地展示在酵母表面上，且通過流式細(xì)胞術(shù)測得，展示的scFv對純BoNT/A的KD是8.44x10"uM(圖21)。這與以前使用SPR在BIAcore中測量的純化的HuC25scFv結(jié)合重組BoNT/AHC的KD(1.4x10-9M)相當(dāng)。然后，使用易錯條件，通過PCR隨機(jī)突變HuC25scFv基因，且使用缺口修復(fù)，將得到的基因譜克隆進(jìn)pYD2，以生成2.0x105轉(zhuǎn)化體的文庫(圖20)。使文庫生長，誘導(dǎo)，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析scFv展示頻率(27%)和抗原結(jié)合頻率(3.65%)。然后，使用遞減濃度的純BoNT/A,對文庫進(jìn)行4輪選擇。從在最后一輪分選后得到的6個單個菌落，PCR擴(kuò)增scFv基因，從而揭示了1個獨特序列AR1的存在(圖18)。使AR1克隆生長，誘導(dǎo)scFv展示，且測得展示的scFv對BoNT/A的KD是1.69x1(T"M，為HuC25的5倍(圖21)。為了進(jìn)一步增加親和力，基于AR1的序列，構(gòu)建了2個突變型酵母展示文庫。對于l個文庫，使用易錯PCR,隨機(jī)誘變AR1scFv基因；對于第2個文庫，使用定點誘變來使L3中的4個氨基酸(SNED)多樣化。選擇該環(huán)進(jìn)行誘變，因為從AR1的選擇表明，這里的突變可以增加親和力，且該易錯方法可能沒有完全抽樣該環(huán)中的突變。對于每個文庫，進(jìn)行4輪選擇，通過用純化的BoNT/A進(jìn)行標(biāo)記，然后在有阻止重新結(jié)合的BoNT/A結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HC)存在下解離12小時，進(jìn)行最后一輪解離速率選擇。然后，使用結(jié)合毒素的催化結(jié)構(gòu)域的mAb(7C1)，分選BoNT/A標(biāo)記的酵母。從最后一輪分選篩選單個菌落，僅僅揭示了位點定向文庫的野生型AR1序列，從而表明L3已經(jīng)被最優(yōu)化。從易錯的文庫，分離出單個獨特克隆(AR2，圖18)，測得其酵母展示的scFv的KD是6.14x10—11M,是親本AR1的2.8倍(圖21)。生成了另一個酵母展示文庫，以進(jìn)一步增加AR2的親和力。它們包括其中將隨機(jī)突變導(dǎo)入AR2基因的文庫，和基于AR2序列的2個位點定向文庫，它們的不同之處在于Hl中的5個氨基酸或L2中的4個氨基酸。使用為選擇AR1所述的策略，在純BoNT/A上選擇文庫，對單個菌落測序，并測量獨特的酵母展示的scFv的親和力。從易錯的文庫或L2突變體文庫，沒有鑒別出更高親和力的克隆。從H1文庫鑒別出了2個更高親和力的克隆(圖18),AR3和AR4(KD為1.9和2.3xl(T"M,為AR2的親和力的約3倍，圖21)。mAb3D12的親和力成熟對于親和力成熟，將3D12scFv基因作為來自噬菌粒載體pCANTAB5E的Ncol-Notl片段克隆進(jìn)酵母展示載體pYD2。然后，在易錯條件下，使用PCR將隨機(jī)突變導(dǎo)入3DKscFv基因，并使用缺口修復(fù)，將得到的基因譜克隆進(jìn)pYD2,以生成2.1x106轉(zhuǎn)化體的文庫。使文庫生長，誘導(dǎo)，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析scFv展示頻率(27%)和抗原結(jié)合頻率(3.65%)。然后，使用遞減濃度的BoNT/A,對文庫進(jìn)行5輪選擇。通過用純化的BoNT/A進(jìn)行標(biāo)記，然后在有阻止重新結(jié)合的BoNT/A結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HC)存在下解離15小時，進(jìn)行最后一輪解離速率選擇。然后，使用結(jié)合毒素的催化結(jié)構(gòu)域的mAb(7C1),分選BoNT/A標(biāo)記的酵母。從最后一輪分選后得到的6個單個菌落，PCR擴(kuò)增scFv基因，從而揭示了3個獨特序列的存在(表13，克隆3-l(也稱作RAZl,圖19A)、3-8和3-10)。使每個獨特克隆生長，誘導(dǎo)scFv展示，且使用流式細(xì)胞術(shù)，測量展示的scFv和野生型3D12scFv對BoNT/A的KD。所有3種突變型scFv都具有比野生型3D12scFv更高的親和力。對于最高親和力的scFv(RAZ1,KD，在圖21中)，突變完全位于VL內(nèi)，在CDR1、2和3中(圖19A)。表13.親和力成熟的和/或修飾的抗體的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>重鏈續(xù)表<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>C(SEQ工DNO:96)(SEQIDNO:97>LIY(SEQIDNOr98)rDNO:99)輕鏈續(xù)表克隆構(gòu)架3CDR3構(gòu)架4HuC25g工parfsgsgsgtdftlt工sslepedfavyyc(seqidqqsnedpft(sEG工dfgqgtkve工kr(seqidAR1giparfsgsgsgtdftltisslepedfavytc(seq工dno:327)qqgnevpbt(sidno..328〉fgqgtkveikr(segidno:329)AR2g工parfsgsgsgtdf丁lt工sslepedfavyyc(seq工dn〇330)qqgnevpft(sidfgqgtkveikr(seg工Dmo:332)WR1(V)g工parfsgsgsgtdftlt工sslepedfavyyc(seqidno:333)qqgnevpft(seqidn〇334)fgqg丁kveikr(seq工dno:335)WR1(T)g工parfsgsgsgtdftltisslepedfavyyc(seqidqqgnevpft(s工dn〇337)fgqgtkveikr(segidno.,338)3D12gwsrfsgsgsgteftlt工ss:lqpddfaayyc(seq工dno:339)qhyntypyt(Segidno:340)FGQGTKIjEIKR(segidRAZ1gvpsrfsgsgsgteftlt工sslqpddfaayyc(seq工dno:342〉qhydtypyt(segidfgqgtkle工kr(seqid3-8gvpsrfsgsgsgteftltisslhpddfaayyc(seqidno:345)qhyntypyt(s工dn〇346)fgqgtkle工kr(seg工d3-10gvpsrfsgsgsgteftlt工sslqpddfaayyc(seq工dno..3竭qhystypyt(Se<2工dfgqgtkxeikr(seqidING1gvpsrfsgsgsgtdftlt工sslqpedfatyyc(seqidno:124)qqsystprtt(seg工dno:125)fgggtkvdikr(seg工dno:126>*完整重鏈的序列是重鏈構(gòu)架1+CDRl+構(gòu)架2+CDR2+構(gòu)架3+CDR3+構(gòu)架4。完整輕鏈的序列是輕鏈構(gòu)架1+CDRl+構(gòu)架2+CDR2+構(gòu)架3+CDR3+構(gòu)架4。酵母展示的scFv向IgG的轉(zhuǎn)化對親和力的影響對于許多免疫測定以及體內(nèi)中和研究而言，必需使用IgG。因此，我們通過將VH和Vk基因順序克隆入由雙CMV啟動子驅(qū)動的哺乳動物表達(dá)載體，將HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、3D12和RAZ1轉(zhuǎn)化為由人yl恒定區(qū)和人k恒定區(qū)組成的全長IgG。為7種抗體中的每一種，確立穩(wěn)定的CHODG44細(xì)胞系，并從細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化IgG,7種抗體中的6種的得率為5-20mg/L。我們不能表達(dá)任何顯著量的AR3IgG。通過動態(tài)排除分析(Kinexa)，測量每種IgG的親和力。HuC25突變體家族和RAZ1作為IgG的親和力顯著高于酵母展示的scFv，但是IgG親和力的相對增加，與在酵母展示的scFv上測得的相對親和力相一致(表l4)。例如，通過酵母展示測得，AR4scFv的親和力為HuC25scFv的37倍，且如通過Kinexa測得的，AR4IgG的親和力為HuC25IgG的34倍。通過酵母展示測得，RAZ1scFv的親和力為3D12scFv的45倍，且如通過Kinexa測得的，RAZlIgG的親和力為3D12IgG的35倍。表14.抗體對A1和A2毒素的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>親和力對通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BoNT/A的影響與更低親和力的酵母展示的scFv相比，在酵母上展示的更高親和力的scFv能檢測明顯更低濃度的BoNT/A(圖22)。最高親和力的scFv(AR4)能檢測少至0.1pM的BoNT/A，該值低于其它未擴(kuò)增的BoNT檢測系統(tǒng)的報道值。因而，該結(jié)果驗證了遞增的抗體親和力在增加檢測靈敏度中的應(yīng)用。親和力對BoNT/A中和的影響在體內(nèi)小鼠中和測定中，研究了野生型和更高親和力的抗體。對于單一抗體，更高親和力導(dǎo)致用腹膜內(nèi)BoNT/A攻擊的小鼠的保護(hù)中的小(約2倍)增加(圖23),最高親和力AR4抗體提供抗100只小鼠LD50的毒素的完全保護(hù)，但是不能抗200LD50。當(dāng)組合2種抗體時，保護(hù)顯著增加，其中AR4+3D12的組合提供保護(hù)的約2倍增加，從2500LD50至5000LD50。當(dāng)用RAZ1替代抗體對中的3D12時，觀察到AR4和RAZ1的組合的保護(hù)為10，000只小鼠LD50。因而數(shù)據(jù)表明，在抗體組合中使用更高親和力的抗體導(dǎo)致更有效的毒素中和。對于3種抗體的組合，這更明顯(表15)。表15.抗體組合的中和效力<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>這里，在HuC25/B4/3D12或RAZ1的組合中，用更高親和力RAZ1替代3D12,提供了在10,000LD50攻擊劑量的毒素的完全保護(hù)。在組合中使用野生型3D12時，沒有小鼠在IO，OOOLD50的攻擊后存活。用更高親和力ING1替代B4、并用更高親和力CR1替代HuC25,允許抗體劑量從50ug降低至lug，在10,000LD50攻擊劑量的毒素仍然保持80%存活。因而，增加在抗體組合中使用的單一抗體的親和力，增加效力并允許降低抗體劑量。實施例5肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型內(nèi)的序列變異影響抗體結(jié)合和中和材料和方法毒素基因序列搜索NCBI數(shù)據(jù)庫和Medline，以鑒別肉毒桿菌神經(jīng)毒素基因或蛋白的公開的或存檔的序列。為該工作(手稿在準(zhǔn)備中)，將梭菌品系FRI-A2H的神經(jīng)毒素基因測序。梭菌品系的神經(jīng)毒素基因序列是MichaelPeck的贈品。4吏基因序列進(jìn)入VectorNTI(Invitrogen,SanDiego，CA)，翻譯，根據(jù)血清型分類，和比對。使用ClustalW，構(gòu)建系統(tǒng)樹。毒素和抗體純化的純的和復(fù)合的肉毒桿菌神經(jīng)毒素Al(Hallhyper)和A2(FRI-A2H)購自MetabiologicsInc(Madison,WI)?？贵wS25和C25源自從免疫的小鼠的V-基因構(gòu)建的單鏈Fv噬菌體展示文庫(Amersdor化r鄰997)/"/ecZ./畫亂65:3743-3752;Nowakowski鄰002)尸亂tV"/7.JCGd.99:11346-50)?？贵w3D12源自從免疫的人志愿者供體的V-基因構(gòu)建的單鏈Fv噬菌體展示文庫(Amersdorfer爭(2002)Vaccine20:1640-1648;Amersdorfer爭(1997)/國頭.65:3743-3752)?？贵wB4源自從免疫的對于人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)基因的小鼠(Xenomouse)(I.Geren和J.D.Marks,提交的)的V-基因構(gòu)建的單鏈Fv謹(jǐn)菌體展示文庫。如(Nowakowski爭(2002)Prac.Wa"./kw/.Sc/.VSA99:11346-50)以前所述的，將這4種抗體中的每一種的V-基因克隆進(jìn)含有人IgGl和k恒定區(qū)的哺乳動物表達(dá)載體。確立穩(wěn)定的CHODG44細(xì)胞系，并如(Nowakowski爭(2002)尸亂淑/.爿cfld.Sc/.t/SA99:11346-50)以前所述的使用G蛋白，純化IgG。通過SDS-PAGE和在280nm的吸光度測定抗體純度和濃度。抗體9D8(鼠IgGl/k)和7Cl(鼠IgGl/k)源自從用rBoNT/AHc免疫、并用BoNT/A毒素加強(qiáng)的小鼠產(chǎn)生的雜交瘤。使用G蛋白從雜交瘤上清液純化IgG，并通過SDS-PAGE和BCA測定(PierceChemicalCo.)測定純度和濃度。對于后續(xù)研究，以約l-3mg/ml將IgG抗體保藏在PBS,pH7.4中。毒素捕獲ELISA:對于毒素捕獲ELISA，給96孔微量滴定板(Immunolon2,Dynatech)包被2pg/ml的抗體，在4'C過夜。在5。/。脫脂乳-PBS中封閉30分鐘后，將毒素一式兩份地應(yīng)用于100nM至1pM的半對數(shù)(half-log)稀釋物，并在37。C溫育90分鐘。洗滌平板，并與稀釋至02IU/ml的馬抗-BoNT抗體(Perlmmune)溫育60分鐘，然后洗滌，并與綴合到f束根過氧化物酶(KPL)上的山羊抗-馬抗體的1:1000稀釋物溫育60分鐘。用ABTS(KPL)使平板顯影。相對于毒素濃度，繪制減去背景對照后在405nm的平均吸光度的圖。測量毒素的抗體親和力4吏用表面等離振子共振，在BIAcore1000(PharmaciaBiosensor)中測量純化的BoNT/Al或A2毒素的IgG結(jié)合和解離速率常數(shù)，并如(Nowakowski鄰002)淑/.Am/.t/^A99:11346-11350)以前所述的，用于計算KD。簡而言之，使用NHS-EDC化學(xué)，將約100-400RU的純化的IgG(10-20ug/ml，溶于10mM乙酸鹽中，pH3.5-4.5)偶聯(lián)到CM5傳感器芯片上。使用濃度范圍為50nM-800nM的毒素，在15pl/分鐘的連續(xù)流下，測量純化的BoNT/Al或A2神經(jīng)毒素的結(jié)合速率常數(shù)。從(ln(dR/dt))/t與濃度的圖，確定結(jié)合速率常數(shù)(A。n)。從使用30)Lll/分鐘的流速來預(yù)防重新結(jié)合分析的最高毒素濃度處的傳感器圖解離部分，確定解離速率常數(shù)(&ff)。將AT)計算為A冊。體內(nèi)毒素中和的測量將50微克適宜的IgG加入指示數(shù)目的小鼠LD50的BoNT/Al神經(jīng)毒素復(fù)合物(Hall品系)或BoNT/A2神經(jīng)毒素復(fù)合物(FRI-A2H品系)，總體積為0.5ml的明膠磷酸鹽緩沖液，且在室溫溫育30分鐘。只寸于mAb只寸，力口入25iug每種mAb,且只于于3種mAb的纟且合，力口入16.7pg每種mAb。然后，將混合物腹膜內(nèi)地注射進(jìn)雌性CD-1小鼠(接收16-22g)。將小鼠分成10只的組進(jìn)行研究，且至少每天觀察。注射后5天，測定最終的死亡記數(shù)。按照動物福利法案(AnimalWelfareAct)和關(guān)于動物和涉及動物的實驗的其它聯(lián)邦法規(guī)和規(guī)章，并遵守GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals,NationalResearchCouncil,1996所述的原則，使用小鼠進(jìn)行研究。進(jìn)行該研究的設(shè)施，得到了AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCareInternational的完全4受才又。結(jié)果肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型內(nèi)的序列變異為了確定毒素血清型內(nèi)序列變異性的程度，檢索文獻(xiàn)，從而揭示了60個公開的神經(jīng)毒素序列。該數(shù)據(jù)包括49個完整毒素基因序列和11個部分毒素基因序列(表16)。根據(jù)血清型將49個完整序列分類，比對，并測定序列同一性的程度(表17和圖11)。在分析的49個序列中，有7個BoNT/A、9個BoNT/B、6個BoNT/C、5個BoNT/D、17個BoNT/E、4個BoNT/F和1個BoNT/G。在血清型內(nèi)，觀察到2類毒素基因序列；事實上彼此相同的那些(見下文)，和在氨基酸水平相差至少2.6%的那些。在所有6種血清型內(nèi)，觀察了這樣的序列變異性，其中超過1個毒素基因已經(jīng)被測序(BoNTA、B、C、D、E和F)。在血清型內(nèi)，變異性范圍從BoNTZF的高達(dá)32%至BoNT/E的低至2.6%(表17)。對3種BoNTC/D和2種BoNTD/C嵌合品系進(jìn)行測序。這些品系通常含有與它們的親本血清型匹配的輕鏈和N末端重鏈，神經(jīng)毒素序列的末端三分之一與嵌合體的替代血清型具有強(qiáng)的、但不是絕對的同一性(表16)。表16.用于序列分析的梭菌品系。登記號來自NCI核苷酸數(shù)據(jù)庫。<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>1.Thompsonw"/(1990)E"r./.腸cft訓(xùn).，189(1):73-81.2.Binz(1990)/Oie/n.,265(16):9153-9158.3.Dineena/.(2003)C"r./"Mcra艦，46(5):345-352.4.ZhangW(2003)Gctc,315:21-32.5.Willemsa/.(1993)Ww.臉raW。Z.,144(7):547-556.6.WhelanW(1992)zlpp/.￡>!v/ra".58(8):2345-2354.7.Ki函"a/.(2004)/^船Mcra嵐Lett"231(2):159-164.8.Iharada/.(2003)別ocW肌fii'叩/^i.Acto,1625(1):19-26.9.Hutsonefa/,(1994)C歐A/;crc^('。/.,28(2):101-110.JO.HauserWa,.(!990)他cte!'cAc!'^rto.,18(16):4924.11.Kimura(1990)別oc/je/n.fli.op/iw.Com/nun"171(3):1304-1311.12.Ha證a/.(1994)M。/.Ge".Ge"汰，243(6):631-640.13.Sagane"a/.(2001)￡i'。c/iem.fi—Wes.Co畫m""288(3):650-657.RMoriishiCa/.(1996)fi!'oc/i!Vn.B!'opftyiActa,1307:123-126.15.Binz"W.(1990)Wwctei.c/kWi'Wex,18(18):5556.16.S陽gawa"a;.(1992)丄Vet則.54(5):905-913.17.Nakajimae,。/■(1998)似,.craWo/./m/mY"o/"42(9):599-605.18.KouguchiWa'.(2002)J.Biol.Chem.，277(4):2650-2656.19.Whdan"a/.(1992)丄說oc/iem,，204(2):657-667,20.Poulet"aZ.(1992)Bioc/iew.B;op/iy《.CowmK""183(1):107-113.21.Tsukamoto(2002)MfcraA.Paf/wg.，33(4):177-184.22.WangWa,.(2000)麵諷iWfcraW。/"66(11):4992-4997.23.Eastefa/.(1992)Mcr。嵐Lc".，75(2-3):225-230,24.Thompson""Z.(1993)F￡MSA/i'ctoWo/.Le".,108(2):175-182.25.Santos-BuelgawaZ.(1998)Cw"Mi'croWo/"37(5):312-318.26.Campbell。/.(1993)fli'ocfeVn別op/zyiArta，1216(3):487-491.更詳細(xì)地分析了造成超過90%人肉毒中毒的2種毒素血清型(BoNT/A和B，(Control(1998)BotulismintheUnitedStates,1899-1998.Handbookforepidemiologists,clinicians,andlaboratoryworkers.Atlanta:GeorgiaU.S.DepartmentofHealthandHumanServices,PublicHealthService:下載J;也iiliwww.bt.cdc.gov/agent/botulism/index.asp)。在7個公開的BoNT/A毒素序列中，5個(62A、NCTC2916、ATCC3502和Hallhyper(HallAllergan))事實上是相同的(99.9-100%同一性)，且已經(jīng)分類成亞型Al(圖12A)。其它2個BoNT/A序歹'J(Kyoto-F和FRI-A2H)是100%相同的，且已經(jīng)分類成亞型A2(圖UA)。A1毒素與A2毒素的不同之處是10.1%，序列的最大不同是受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C-末端重鏈，HC)(表18)。除了數(shù)目更大外，HC氨基酸差異傾向于位于在毒素表面上暴露的溶劑可接近的氨基酸(圖12B)。許多這樣的差異聚簇在推定的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點周圍(圖12B)。催化結(jié)構(gòu)域(輕鏈)的序列更保守(表18)，差異更可能被隱藏(圖12B)。表17.梭菌肉毒桿菌神經(jīng)毒素基因序列的分類。根據(jù)氨基酸水平至少2.6%的差異，定義亞型。<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>表18.BoNTAl和A2品系之間的百分比氨基酸同一性全毒素<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>基于DNA和蛋白同源性，可以將9個公開的BoNT/B序列分成4個亞型(圖13)。這些組包括二價BoNT/B(BoNTAb1436、BoNTAb588、BoNTAb593和BoNTBf3281)、BoNT/Bl(Bo麗BDanish)、BoNT/B2(BoNT/B品系lll)和非蛋白水解的BoNT/B(BoNT/BEkhmd)。這些毒素彼此在氨基酸水平的差別是3.6%-7.7%,與輕鏈相比，重鏈的差異更大(表19)。表19.BoNTB品系中的百分比氨基酸同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>BoNT/A毒素序列變異和抗體結(jié)合的影響為了確定BoNT/A毒素序列變異性對免疫識別的影響，我們通過捕獲ELISA，測量了針對BoNT/Al產(chǎn)生的6種單克隆抗體結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2的能力。測定了與純的神經(jīng)毒素和神經(jīng)毒素復(fù)合物的結(jié)合。如通過重組HC上的ELISA測得的，4種mAb(3D12、C25、B4和S25)結(jié)合BoNT/AHC上的非重疊表位。以前已經(jīng)將3D12和S25表位作圖到BoNT/AHC的C-末端亞結(jié)構(gòu)域，而C25識別由2個HC亞結(jié)構(gòu)域形成的復(fù)合物表位(Mullaney等(2001)///附w"".,69:6511-6514)。如通過重組HN上的ELISA測得的，1種mAb(9D8)結(jié)合BoNT/A易位結(jié)構(gòu)域(HN)(未顯示數(shù)據(jù))。如通過重組輕鏈上的ELISA測得的，l種mAb(7Cl)結(jié)合BoNT/A輕鏈。結(jié)合BoNT/AHC的4種抗體中的3種表現(xiàn)出與BoNT/Al毒素的結(jié)合比與BoNT/A2毒素的結(jié)合顯著降低(圖14)。相反地，不結(jié)合HC的mAb在Al和A2毒素上表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)腅LISA信號(圖15)。為了定量結(jié)合A1和A2毒素的差異，測量了每種mAb與純化的Al和A2毒素的結(jié)合的平衡解離常數(shù)和結(jié)合速率動力學(xué)(表17)。所有mAb都以高親和力(KD范圍為6-0.17nM)結(jié)合Al毒素。通過捕獲ELISA證實了降低的與A2毒素的結(jié)合的3種mAb(C25、S25和B4)，表現(xiàn)出的與A2毒素的親和力比與Al毒素的親和力減少了553至超過1200倍。由于非常低親和力的結(jié)合，不可能測量B4mAb結(jié)合BoNT/A2的KD。大部分親和力減少是由于結(jié)合速率常數(shù)的大幅降低(表20)。相反地，3種mAb(3D12、9D8和7C1)表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膶l和A2毒素的高親和力。表20.BoNT/AIgG結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2的結(jié)合(kon)和解離(k。ff)速率常數(shù)和平衡解離常數(shù)(Kd)。通過表面等離振子共振，在BIAcore中測定結(jié)合和解離速率常數(shù)，并將Kd計算為k。ff/k。n。NM=不可測<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>抗體結(jié)合對Al和A2神經(jīng)毒素中和的影響我們以前研究了這里所述的3種mAb(3D12、S25和C25)對BoNT/Al毒素的體內(nèi)中和能力。盡管表現(xiàn)出BoNT/Al的顯著體外中和，但這3種mAb都沒有表現(xiàn)出對接受50ug抗體和用20只小鼠LD50的BoNT/Al攻擊的小鼠的顯著體內(nèi)保護(hù)(僅10-20%存活，(Nowakowski等(2002)Proc.NatlAcadSc/.SA99:11346-11350))。類似地，當(dāng)用20只小鼠LD5o的BoNT/Al攻擊小鼠時，這里報道的剩余3種mAb都沒有表現(xiàn)出顯著的體內(nèi)保護(hù)(僅10-20%存活，未顯示數(shù)據(jù))。因為我們以前報道了當(dāng)組合mAb時體內(nèi)保護(hù)的顯著協(xié)同作用，所以我們研究了mAb對和三聯(lián)體體內(nèi)中和毒素的能力。如以前觀察到的，抗體對表現(xiàn)出比單一mAb明顯更大的BoNT/Al中和，對于3種mAb的組合，觀察到甚至更大的效力(圖16和17A)。對于包含僅1種結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體(C25+9D8)或沒有結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體(9D8+7C1)的mAb對(圖16),或包含僅1種結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體(C25+9D8+7C1)的3種mAb的組合(圖17A)，觀察到了協(xié)同作用。關(guān)于BoNT/A2毒素的中和，僅含有以高親和力結(jié)合BoNT/A2的mAb的mAb對或三聯(lián)體，表現(xiàn)出顯著的中和協(xié)同作用(圖17B)。最有效的mAb三聯(lián)體(3D12+9D8+7C1)能完全保護(hù)小鼠抗10，000只小鼠LD50的A1或A2毒素攻擊。盡管該組合(3DH+9DS+7C1)不如3種結(jié)合結(jié)構(gòu)域mAb的組合(C25+3D12+B4)—樣有效地中和Al毒素，但僅一種結(jié)合結(jié)構(gòu)域mAb以任意的親和力結(jié)合A2毒素，且結(jié)果，C25+3D12+B4三聯(lián)體中和低于200只小鼠LD50的A2毒素。討論分析49個完整的公開的肉毒桿菌神經(jīng)毒素序列，揭示了在血清型內(nèi)，毒素基因序列是事實上相同的，或在氨基酸水平彼此相差至少3.6%。我們已經(jīng)將具有該最小差異(3.6%)的那些毒素稱作給定血清型的亞型。這樣的分析揭示了6種血清型的平均2.8種亞型，其中超過一個毒素基因已經(jīng)被測序(范圍2-4亞型/血清型)。盡管該分析可能揭示最常見的毒素亞型，但在對相當(dāng)小量的毒素基因測序的情況下(平均8個毒素基因/血清型)，可能鑒別其它毒素亞型。毒素亞型的重要性，是它們對診斷試驗和毒素治療劑的開發(fā)的影響。顯然，該水平的核普酸多態(tài)性可以影響基于DNA探針的測定，例如PCR。重要的是，氨基酸置換的程度，可以影響用于ELISA的單克隆抗體的結(jié)合和基于其它免疫學(xué)的診斷試驗。我們已經(jīng)清楚地表明，BoNTZAl和BoNT/A2亞型之間的10%氨基酸差異對分析的6種單克隆抗體中的3種的結(jié)合親和力和ELISA信號具有顯著作用。令人感興趣地，減少的mAb親和力的動力學(xué)基礎(chǔ)，很大程度上是由于結(jié)合速率常數(shù)的減少，而不是解離速率常數(shù)的增加。尚不清楚毒素氨基酸序列的差異對多克隆抗體的結(jié)合的影響。顯然，需要使用不同毒素的亞型，驗證基于免疫識別的毒素測定。結(jié)合親和力的差異轉(zhuǎn)化成體內(nèi)毒素中和效力的顯著差異。由于我們沒有觀察到單一mAb的有效的體內(nèi)毒素中和，所以我們研究了毒素序列變異對mAb組合的效力的影響。如同結(jié)合研究一樣，僅牢固地結(jié)合Al和A2亞型的mAb組合有效地體內(nèi)中和毒素。因而，在基于抗體的毒素治療的開發(fā)中，無論這樣的治療是寡克隆的還是多克隆的，都必須評價亞型變異性對效力的影響。類似地，可能需要評價基于單一亞型的毒素疫苗的抗相關(guān)亞型的保護(hù)能力。在這些研究中未預(yù)料到的發(fā)現(xiàn)是，結(jié)合BoNT的易位結(jié)構(gòu)域和/或催化結(jié)構(gòu)域的mAb具有中和活性，無論是在彼此組合時，還是在與識別BoNT受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HC)的mAb組合時。還已經(jīng)報道了結(jié)合破傷風(fēng)毒蛋白(Kozaki爭(1995)Af/cro6z'o/./wmw"o/"39:767-774)和蓖麻毒蛋白(Lang爭(1993)J./www"o/.151:466-472)的催化結(jié)構(gòu)域的mAb的中和活性。由于不結(jié)合BoNT受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的mAb不能嚴(yán)格阻斷BoNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域表位與細(xì)胞受體的相互作用和隨后的BoNT胞吞作用，所以尚不清楚它們?yōu)橹泻妥鞒鲐暙I(xiàn)的機(jī)理?？赡艿臋C(jī)理包括，在結(jié)合多個mAb后，增強(qiáng)BoNT從循環(huán)中的清除(Montero-Julian鄰995)脅od85:917-924)，通過空間作用干擾受體結(jié)合，干擾需要的細(xì)胞內(nèi)毒素加工(內(nèi)體逃脫或催化活性)(Koriazova和Montal(2003)iVaf.S&m".5/o/.，10:13-18)，和/或改變細(xì)月包內(nèi)BoNT運輸。無論機(jī)理如何，非結(jié)合結(jié)構(gòu)域mAb中和毒素的能力顯著增加可用于中和mAb產(chǎn)生的表位的數(shù)目，從而增加發(fā)現(xiàn)結(jié)合和中和所有BoNT亞型的mAb的可能性。盡管我們僅研究了序列變異性對抗體結(jié)合和單一血清型(BoNT/A)的中和的影響，但3種血清型(BoNT/C、D和F)具有亞型，它們;波此的差異為BoNT/Al和BoNT7A2之間超過10%的差異(10.7%畫31.6%)。對于這3種血清型，序列變異性對免疫識別的影響可能大于BoNT/A。對于2種血清型(BoNT/B和E),序列變異性低于對BoNT/A觀察到的(2.6%-7.6%)。需要評價該水平的序列變異性的影響，但是顯然在一定范圍內(nèi)其可影響mAb結(jié)合，如在MAb結(jié)合BoNT/B毒素的以前評價中所表明的(Gibson爭(1988)」p//.5acfenW.,64:285-291;Kozaki爭(1998)/mw簡.，66:4811-4816)和BoNTE(Kozaki爭(1986)/"/e"./mm節(jié).'52:786-791)?？傊?，我們報道了在7種肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型中的6種中存在相當(dāng)大的序列變異性，并表明該水平的變異性可以顯著影響抗體結(jié)合和中和。測定這樣的毒素多樣性的完整范圍，是開發(fā)免疫學(xué)肉毒桿菌毒素測定、治療劑和疫苗的重要步驟。一旦已確定了序列變異性，就可能需要生產(chǎn)一些這樣的毒素變體，以用于檢測測定、治療劑和疫苗的驗證。實施例6為BoNT/A亞型Al、A2和A3的交叉中和選4奪和進(jìn)化的中和抗體肉毒桿菌神經(jīng)毒素的不同亞型(包括BoNT/A)的發(fā)現(xiàn)，為診斷和治療性抗體的開發(fā)提出了挑戰(zhàn)。理想地，mAb或mAb混合物會結(jié)合和檢測/中和大部分或所有的不同BoNT亞型。這會產(chǎn)生不會錯過一些亞型的檢測的檢測系統(tǒng)。對于治療性抗體，交叉反應(yīng)性確?？贵w成功地中和一種或多種亞型。結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2的抗體的選沖奪為了生成能結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2的單克隆抗體，順序選擇了免疫噬菌體或酵母scFv抗體文庫，首先在BoNT/Al上，然后在BoNT/A2上。多輪選4奪后，篩選噬菌體或酵母抗體對兩種BoNT亞型的結(jié)合。鑒別出以相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2兩者的2種scFv才元體(INGl,scFvKDBoNT/Al=1.17X10—9M;scFvKDBoNT/A2=1.18x10—9M:和ING2，scFvKDBoNT/Al=4.17X10.10M;scFvKDBoNT/A2=4.5xl(T10M。ING1和ING2的序列參見表13。對于體內(nèi)研究，將這2種scFv轉(zhuǎn)化成IgG。IgG維持對Al和A2BoNT兩者的高親和力結(jié)合(表21)。表21.以高親和力結(jié)合BoNT/Al和A2兩者的交叉反應(yīng)性IgG的親和力。通過流式熒光測定法，測定親和力和結(jié)合動力學(xué)。<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>能高親和力地結(jié)合BoNT/Al和A2兩者的HuC25變體的生成HuC25和它的更高親和力的衍生物都不高親和力地結(jié)合BoNT/A2(AR2對boNt/Al和BoNT/A2的親和力，參見表22)。為了增加對BoNT/A2的親和力，我們從更高親和力變體AR2開始。該抗體作為IgG對BoNT/A2的親和力比對BoNT/Al低超過10,000,對BoNT/A2的非常低的親和力是2.0x10-7M(表22)。表22.AR2IgG和酵母展示的scFv對BoNT/Al和BoNT/A2的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>使用摻料寡核苷酸或易錯PCR，生成AR2突變體文庫，并將突變體作為scFv展示在酵母表面上。對文庫進(jìn)行系列選擇，首先在BoNT/A1和BoNT/A2上，從而產(chǎn)生突變體WR1(T),KDBoNT/A2=3.7nM，WR1(V),KDBoNT/A2=9.0nM和CRlKDBoNT/A2=850pM(序列見表20)。將最高親和力scFv(CR1)轉(zhuǎn)化成IgG,其對BoNT/A2毒素的親和力為親本AR2IgG的約80倍，同時也4吏它對BoNT/Al的親和力增加約10倍(表23)。為了進(jìn)一步增加對BoNT/A2的親和力，隨機(jī)地突變CR1scFv基因，在酵母上展示，并在BoNT/Al和BoNT/A2上順序選擇更高親和力scFv，從而產(chǎn)生突變型CR2(序列參見序列表或表13)。轉(zhuǎn)化成IgG后，CR2對BoNT/A2的親和力為CR1的約6倍，并維持對BoNT/Al的高親和力結(jié)合(表23)。表23.通過流式熒光測定法測得的AR2、CR1和CR2IgG對BoNT/Al和BoNT/A2的親和力和結(jié)合動力學(xué)<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>對BoNT/A2具有更高親和力的抗體高效力地中和BoNT/A2在實施例5中，表明50ug抗體HuC25、B4和3DU的組合會中和40,000只小鼠LD50的BoNT/Al，j旦是j氐于200LD50的BoNT/A2。B4和HuC25都不高親和力地結(jié)合BoNT/A2。因此，我們研究了源自HuC25、但是對BoNT/Al和BoNT/A2具有高親和力的CR1抗體的中和BoNT/Al和BoNT/A2的能力，所述CR1抗體與RAZ1和ING1或ING2任一種相組合。使用50ug總抗體的抗體劑量，CR1+RAZ1+ING1或ING2任一種的組合完全保護(hù)用40,000只小鼠LD50的BoNT/Al攻擊的小鼠。相同劑量的抗體表現(xiàn)出對用BoNT/A2攻擊的小鼠的顯著保護(hù)，其中組合CR1+RAZ1+ING1是最有效的，其完全保護(hù)用40,000只小鼠LD50的BoNT/A2攻擊的小鼠(圖25)。因而，我們已經(jīng)表明，可以生成以及進(jìn)化以高親和力結(jié)合多種BoNT亞型(在該情況下BoNT/Al和A2)的抗體，且當(dāng)組合抗體時，這導(dǎo)致有效的中和。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實施例和實施方案僅用于解釋目的，且本的精神和范圍、和所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請，都在本文中為所有目的整體引作參考。權(quán)利要求1.中和哺乳動物的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，所述方法包含，給所述哺乳動物施用BoNT血清型的至少2種不同中和抗抗體，其中所述2種抗體中的至少一種以大于約10nM的親和力結(jié)合所述BoNT血清型的至少2種不同亞型。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述BoNT血清型選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E和BoNT/F。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述BoNT血清型是BoNT/A或Bo麗B。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述BoNT血清型是BoNT/A。5.權(quán)利要求4的方法，其中至少一種所述抗體結(jié)合選自下述的至少2種不同亞型BoNT/Al、BoNT/A2和BoNT/A3，分別以大于約10nM的親和力。6.權(quán)利要求4的方法，其中至少一種所述抗體結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2，分別以大于約10nM的親和力。7.權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述抗體中和至少10,000只小鼠LD50/mg抗體。8.權(quán)利要求1或4的方法，其中兩種抗體同時結(jié)合至少一種所述亞型。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗體中和至少10,000只小鼠LD50/mg抗體。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體各自包含至少1個選自下述的CDR:RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、INGlVLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、INGlVHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2和ING2VHCDR3。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體各自包含至少3個選自下述的CDR:RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CRlVLCDR2、CRlVLCDR3、CR1VHCDR1、CRlVHCDR2、CRlVHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、INGlVLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、INGlVHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2和ING2VHCDR3。12.權(quán)利要求l的方法，其中所述抗體各自包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDR1、CDR2和CDR3,所述VH結(jié)構(gòu)域選自RAZ1VH結(jié)構(gòu)域、CR1VH結(jié)構(gòu)域、CR2VH結(jié)構(gòu)域、INGlVH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域。13.權(quán)利要求l的方法，其中所述抗體各自包含均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3,所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZ1VL結(jié)構(gòu)域、CR1VL結(jié)構(gòu)域、CR2VL結(jié)構(gòu)域、INGlVL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述抗體各自包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDR1、CDR2和CDR3，所述VH結(jié)構(gòu)域選自RAZ1VH結(jié)構(gòu)域、CR1VH結(jié)構(gòu)域、CR2VH結(jié)構(gòu)域、ING1VH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域；和均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3,所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZlVL結(jié)構(gòu)域、CRlVL結(jié)構(gòu)域、CR2VL結(jié)構(gòu)域、INGlVL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。15.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種所述抗體包含選自下述抗體的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3:RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、IDII、2G11、3D12和5G4。16.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種所述抗體是單鏈Fv(scFv)。17.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種所述抗體是IgG。18.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種所述抗體是Fab。19.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種所述抗體是(Fab')2。20.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種所述抗體是(scFv')2。21.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種所述抗體選自RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12和5G4。22.權(quán)利要求1的方法，其中至少2種所述抗體選自RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、IDII、2G11、3D12和5G4。23.用于中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)的組合物，所述組合物包BoNT血清型的至少2種不同中和抗體，其中所述2種抗體中的至少一種以大于約10nM的親和力結(jié)合所述BoNT血清型的至少2種不同亞型。24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述BoNT血清型選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、Bo麗D、Bo麗E和BoNT/F。25.權(quán)利要求23的組合物，其中所述BoNT血清型是BoNT/A或BoNT/B。26.權(quán)利要求23的組合物，其中所述BoNT血清型是BoNT/A。27.權(quán)利要求23的組合物，其中至少一種所述抗體結(jié)合選自下述的至少2種不同亞型BoNT/Al、BoNT/A2和BoNT/A3,分別以大于約10nM的親和力。28.權(quán)利要求23的組合物，其中至少一種所述抗體結(jié)合BoNT/Al和BoNT/A2，分別以大于約10nM的親和力。29.斥又利要求23或26的組合物，其中兩種抗體同時結(jié)合至少一種所述亞型。30.權(quán)利要求23的組合物，其中所述抗體各自包含至少1個選自下述的CDR:RAZ1VLCDR1、RAZlVLCDR2、RAZlVLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CRlVLCDR2、CRlVLCDR3、CR1VHCDR1、CRlVHCDR2、CRlVHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、INGlVLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、INGlVHCDR2、INGlVHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2和ING2VHCDR3。31.權(quán)利要求23的組合物，其中所述抗體各自包含至少3個選自下述的CDR:RAZ1VLCDR1、RAZlVLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZlVHCDR2、RAZlVHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CRlVLCDR2、CRlVLCDR3、CR1VHCDR1、CRlVHCDR2、CRlVHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、INGlVLCDR2、INGlVLCDR3、ING1VHCDR1、INGlVHCDR2、INGlVHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2和ING2VHCDR3。32.權(quán)利要求23的組合物，其中所述抗體各自包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDR1、CDR2和CDR3，所述VH結(jié)構(gòu)域選自RAZlVH結(jié)構(gòu)域、CRlVH結(jié)構(gòu)域、CR2VH結(jié)構(gòu)域、INGlVH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域。33.權(quán)利要求23的組合物，其中所述抗體各自包含均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZlVL結(jié)構(gòu)域、CRlVL結(jié)構(gòu)域、CR2VL結(jié)構(gòu)域、INGlVL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。34.權(quán)利要求23的組合物，其中所述抗體各自包含RAZ1VH結(jié)構(gòu)域、CR1VH結(jié)構(gòu)域、CR2VH結(jié)構(gòu)域、INGlVH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域；和均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZlVL結(jié)構(gòu)域、CRlVL結(jié)構(gòu)域、CR2VL結(jié)構(gòu)域、INGlVL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。35.權(quán)利要求23的組合物，其中至少一種所述抗體包含選自下述抗體的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3:RAZ1、CR1、CR2、ING1、1NG2、IDII、2G11、3D12和5G4。36.權(quán)利要求35的組合物,其中至少一種所述抗體是單鏈Fv(scFv)。37.權(quán)利要求35的組合物，其中至少--種所述抗體是IgG。38.權(quán)利要求35的組合物，其中至少--種所述抗體是Fab。39.權(quán)利要求35的組合物，其中至少--種所述抗體是(Fab')2。40.4又利要求35的組合物，其中至少--種所述抗體是(scFv')2。41.權(quán)利要求23的組合物，其中至少一種所述抗體選自RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、IDII、2G11、3D12和5G4。42.權(quán)利要求23的組合物，其中至少2種所述抗體選自RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、IDII、2G11、3D12和5G4。43.權(quán)利要求23的組合物，其中所述抗體是在藥學(xué)可接受的賦形劑中的。44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述組合物是單位劑量制劑。45.中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BontA)的抗體，其中所述抗體結(jié)合至少2種不同BontA亞型，對每種亞型的親和力大于約10nM。46.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體結(jié)合BontAl和A2亞型兩者，分別以大于約10nM的親和力。47.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含至少1個選自下述的CDR:RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G1VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2和ING2VHCDR3。48.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含至少3個選自下述的CDR:RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CRlVLCDRl、CRlVLCDR2、CRlVLCDR3、CRlVHCDRl、CRlVHCDR2、CRlVHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、INGlVLCDRl、INGlVLCDR2、INGlVLCDR3、INGlVHCDRl、INGlVHCDR2、INGlVHCDR3、ING2VLCDRl、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDRl、ING2VHCDR2和ING2VHCDR3。49.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDRl、CDR2和CDR3,所述VH結(jié)構(gòu)域選自RAZlVH結(jié)構(gòu)域、CRlVH結(jié)構(gòu)域、CR2VH結(jié)構(gòu)域、INGlVH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域。50.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZlVL結(jié)構(gòu)域、CRlVL結(jié)構(gòu)域、INGlVL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。51.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含RAZlVH結(jié)構(gòu)域、CRlVH結(jié)構(gòu)域、CR2VH結(jié)構(gòu)域、INGlVH結(jié)構(gòu)域、ING2VH結(jié)構(gòu)域、1D11VH結(jié)構(gòu)域、2G11VH結(jié)構(gòu)域、3D12VH結(jié)構(gòu)域和5G4VH結(jié)構(gòu)域；和均選自VL結(jié)構(gòu)i成的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL結(jié)構(gòu)域選自RAZlVL結(jié)構(gòu)域、CRlVL結(jié)構(gòu)域、CR2VL結(jié)構(gòu)域、INGlVL結(jié)構(gòu)域、ING2VL結(jié)構(gòu)域、1D11VL結(jié)構(gòu)域、2G11VL結(jié)構(gòu)域、3D12VL結(jié)構(gòu)域和5G4VL結(jié)構(gòu)域。52.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含選自下述抗體的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDRl、VLCDR2和VLCDR3:RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、IDII、2G11、3D12和5G4。53.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含RAZ1VH和RAZ1VL。54.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含CR1VH和CR1VL。VL。VL。VL。VL。55.56.57.58.59.60.61.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含CR2VH和CR2權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體包含ING1VH和ING1,其中所述抗體包含ING2VH和ING2其中所述抗體包含1D11VH和lDll其中所述抗體包含2G11VH和1G11權(quán)利要求45的抗體:權(quán)利要求45的抗體權(quán)利要求45的抗體權(quán)利要求45的抗體:權(quán)利要求45的抗體其中所述抗體包含5G4VH和5G4VL。,其中所述抗體包含3D12VH和3D1262.63.64.65.66.67.權(quán)利要求45的抗體權(quán)利要求45的抗體權(quán)利要求52的抗體其中所述抗體是單鏈Fv(scFv)。其中所述抗體是IgG。其中所述抗體是Fab。權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體是(Fab')2。權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體是(scFv')2。權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體選自RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、3D12、1D11、2G11和5G4。68.結(jié)合肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BontA)的抗體，其中所述抗體包含至少1個選自下述的CDR:AR2VLCDR1、AR2VLCDR2、AR2VLCDR3、AR2VHCDR1、AR2VHCDR2、AR2VHCDR3、AR3VLCDR1、AR3VLCDR2、AR3VLCDR3、AR3VHCDR1、AR3VHCDR2、AR3VHCDR3、AR4VLCDR1、AR4VLCDR2、AR4VLCDR3、AR4VHCDR1、AR4VHCDR2和AR4VHCDR3。69.權(quán)利要求68的抗體，其中所述抗體包含至少3個選自下述的CDR:AR2VLCDR1、AR2VLCDR2、AR2VLCDR3、AR2VHCDR1、AR2VHCDR2、AR2VHCDR3、AR3VLCDR1、AR3VLCDR2、AR3VLCDR3、AR3VHCDR1、AR3VHCDR2、AR3VHCDR3、AR4VLCDR1、AR4VLCDR2、AR4VLCDR3、AR4VHCDR1、AR4VHCDR2和AR4VHCDR3。70.權(quán)利要求68的抗體，其中所述抗體包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDRl、CDR2和CDR3，所述VH結(jié)構(gòu)域選自AR2VH結(jié)構(gòu)域、AR3VH結(jié)構(gòu)域和AR4VH結(jié)構(gòu)域。71.權(quán)利要求68的抗體，其中所述抗體包含均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL結(jié)構(gòu)域選自AR2VL結(jié)構(gòu)域、AR3VL結(jié)構(gòu)域和AR4VL結(jié)構(gòu)域。72.權(quán)利要求68的抗體，其中所述抗體包含均選自VH結(jié)構(gòu)域的VHCDR1、CDR2和CDR3,所述VH結(jié)構(gòu)域選自AR2VH結(jié)構(gòu)域、AR3VH結(jié)構(gòu)域和AR4VH結(jié)構(gòu)域；和均選自VL結(jié)構(gòu)域的VLCDR1、CDR2和CDR3,所述VL結(jié)構(gòu)域選自AR2VL結(jié)構(gòu)域、AR3VL結(jié)構(gòu)域和AR4VL結(jié)構(gòu)域。73.權(quán)利要求68的抗體，其中所述抗體包含選自下述抗體的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3:AR2、AR3和AR4。74.權(quán)利要求68的抗體，其中所述抗體是單鏈Fv(scFv)。75.權(quán)利要求68的抗體76.權(quán)利要求68的抗體77.權(quán)利要求68的抗體78.權(quán)利要求68的抗體79.權(quán)利要求68的抗體其中所述抗體是IgG。其中所述抗體是Fab。其中所述抗體是(Fab')2。其中所述抗體是(scFv')2。其中所述抗體選自AR2、AR3和AR4。80.核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求45-79中任一項的抗體。81.細(xì)胞，其含有編碼根據(jù)權(quán)利要求45-79中任一項的抗體的核酸。82.用于中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求23-44中任一項的組合物；和教導(dǎo)使用所述組合物來中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素的指導(dǎo)材料。83.權(quán)利要求82的試劑盒，其中所述組合物保藏在一次性注射器中。全文摘要本發(fā)明提供了抗體，其特異性地結(jié)合和中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型(BoNT/A)和被那些抗體結(jié)合的表位。所述抗體和其衍生物和/或特異性地結(jié)合本文提供的中和表位的其它抗體，可以用于中和肉毒桿菌神經(jīng)毒素，且因此也可以用于治療肉毒中毒。文檔編號A61K39/40GK101146554SQ200680009715公開日2008年3月19日申請日期2006年1月26日優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日發(fā)明者A·拉扎伊,I·格倫,J·D·馬克斯,M·C·加西亞,P·阿默斯多菲,樓建龍申請人:加州大學(xué)評議會