專利名稱：：免疫原性多肽和單克隆抗體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫學，更特別地涉及引發(fā)對細菌的免疫反應。背景肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)是相當普遍的人類病原體，其可以感染一些器官，包括肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、中耳和鼻道。感染引起各種癥狀，例如支氣管炎、肺炎、腦膜炎、鼻竇感染和敗血癥。肺炎鏈球菌是人類中細菌性腦膜炎的主要原因，盡管有抗生素治療，與顯著的死亡率和發(fā)病率相關(Quagliarelloetal.,(1992)N.Eng.J.Med.327:869_872)。存在著兩種現(xiàn)用的肺炎球菌疫苗。一種是用于成年人由23種不同的莢膜多糖組成的疫苗，所述莢膜多糖在一起代表了引起肺炎球菌感染的約90%的菌株的莢膜類型。然而，這種疫苗在兒童中不是免疫原性的，兒童是對肺炎球菌感染有高度敏感性的年齡組。在成年人中，疫苗已經(jīng)顯示了對菌血癥性肺炎是約60%有效的，但是它在由于年齡或潛在醫(yī)學狀況處于肺炎球菌感染的更高風險中的成年人中是不那么有效的(Fedson，andMusher.2004."PneumococcalPolysaccharideVaccine，，，pp.529-588.InVaccines.S.A.PlotkinandW.A.Orenstein(eds.),W.B.SaundersandCo.,Philadelphia,PA；Shapiroetal.，N.Engl.J.Med.325:1453-1460(1991))。這種疫苗沒有顯示對感染的最普通的形式、非菌血癥性肺炎球菌肺炎的有效性。第二種現(xiàn)有的疫苗是7-價的綴合物疫苗，其在低于2歲的兒童中對菌血癥性肺炎球菌感染是有效的。它還展現(xiàn)了對肺炎的效力(Blacketal.,Arch.Pediatr.11(7)485-489(2004))。由于需要產(chǎn)生7種不同的綴合物，這種疫苗的生產(chǎn)是復雜的，這導致了該疫苗是昂貴的(約$200/兒童)。而且，在非疫苗型肺炎鏈球菌非常常見的發(fā)展中世界，該疫苗對于覆蓋感染做得不好(DiFabioetal.，Pediatr.Infect.Dis.J.20:959_967(2001)；Mulholland,Trop.Med.Int.Health10:497-500(2005))。該疫苗對抗中耳炎和定殖不象它對抗侵入性疾病那樣好。還顯示了，7-價的綴合物疫苗的使用導致具有不被疫苗中包括的7種多糖所代表的莢膜類型的菌株的定殖和疾病方面的提高(Bogaertetal.，LancetInfect.Dis.4144-154(2004)；Eskolaetal.,N.Engl.J.Med.344403-409(2001)；Mbelleetal.，J.Infect.Dis.1801171-1176(1999))。因而，仍然需要對肺炎鏈球菌的有效的治療。概述描述了引發(fā)針對肺炎鏈球菌的免疫反應的組合物和方法。提供了免疫原性PhtD多肽、特別是其片段、衍生物和變體，以及編碼它們的核酸。還提供了具有對這樣的多肽、片段、衍生物或變體具有特異性的單克隆抗體(和產(chǎn)生它們的雜交瘤)。進一步提供的是制造和使用所述免疫原性多肽、衍生物、變體和單克隆抗體的方法。本發(fā)明提供了選自以下構成的組的分離的核酸a)編碼具有與SEQIDN0:2至少90%同一性的肺炎鏈球菌多肽的核酸；b)與編碼具有與SEQIDNO:2至少90%同一性的肺炎鏈球菌多肽的核酸完全互補的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，所述序列同一性是至少85%、90%，更優(yōu)選的95到100%。本發(fā)明還提供了包含具有與SEQID吣2至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列的分離的多肽，以及特異性結合具有與SEQID而2至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的多肽的單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了選自以下構成的組的分離的核酸a)編碼具有與SEQIDNO:3至少80%同一性的肺炎鏈球菌多肽的核酸；b)與編碼具有與SEQIDNO:3至少80%同一性的肺炎鏈球菌多肽的核酸完全互補的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，所述序列同一性是至少85%、90%，更優(yōu)選的95%到100%。本發(fā)明還提供了包含具有與SEQIDN0:3至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列的分離的多肽，以及特異性結合具有與SEQIDN0:3的至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的多肽的單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了選自以下構成的組的分離的核酸a)編碼具有與SEQIDNO:4至少80%同一性的肺炎鏈球菌多肽的核酸；b)與編碼具有與SEQIDNO:4至少80%同一性的肺炎鏈球菌多肽的核酸完全互補的核酸；和c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，所述序列同一性是至少85%、90%，更優(yōu)選的95%到100%。本發(fā)明還提供了包含具有與SEQID吣4至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列的分離的多肽，以及特異性結合具有與SEQIDN0:4的至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的多肽的單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的進一步的方面，提供的是特異性結合具有SEQIDNO4中所列氨基酸序列的肽的抗原決定簇的單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，所述單克隆抗體特異性結合的抗原決定簇位于具有SEQIDNO4所列氨基酸序列的肽中跨越氨基酸1和氨基酸101的區(qū)域中。本發(fā)明還提供了選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO3和SEQIDNO4或其變體構成的組的免疫原性片段，所述變體選自由SEQIDNO15,SEQIDN0:16和SEQIDN0:17構成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，還提供的是免疫宿主對抗鏈球菌屬細菌感染的方法和治療鏈球菌屬細菌的感染的方法，包括向所述宿主施用選自由SEQIDN0:2、SEQIDNO3和SEQIDNO:4或其變體構成的組的至少一種PhtD多肽，所述變體選自由SEQIDNO:15、SEQIDN0:16和SEQIDN0:17構成的組。根據(jù)本發(fā)明的進一步的方面，提供的是單克隆抗體，其具有與ATCC編號XXXX的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體相同的抗原結合特異性。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，所述單克隆抗體選自由ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的1B12、ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的4D5、和ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的9E11構成的組。本發(fā)明還提供了在宿主中預防鏈球菌屬細菌感染的方法和治療鏈球菌屬細菌感染的方法，包括向所述宿主施用選自由ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的1B12、ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的4D5和ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的9E11構成的組的至少一種單克隆抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，至少兩種單克隆抗體被施用來預防和/或治療鏈球菌屬細菌的感染。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供的是測定生物樣品中蛋白質的數(shù)量的方法，包括使測試生物樣品暴露于選自由ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的1B12、ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的4D5和ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的9E11或其衍生物構成的組的單克隆抗體，測量與所述樣品結合的抗體或衍生物的數(shù)量，以及比較所述測試生物樣品中結合的量與對照生物樣品中觀察到的結合的量，其中與所述對照生物樣品相對的、所述測試生物樣品中提高的結合表明其中所述蛋白質的存在。根據(jù)本發(fā)明的進一步的方面，提供的是檢測生物樣品中鏈球菌屬細菌或其蛋白質的方法，所述方法包括步驟(a)使所述測試生物樣品暴露于選自由ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的1B12、ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的4D5和ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的9E11或其衍生物構成的組的至少一種單克隆抗體，所述暴露在容許所述抗體與它具有特異性的所述樣品中的成分的條件下進行；和(b)測定與所述測試生物樣品的成分結合的抗體的數(shù)量；和，(c)比較與所述測試生物樣品結合的抗體的數(shù)量和與對照樣品結合的數(shù)量；其中與所述對照生物樣品相比，顯著更高數(shù)量的抗體與所述測試生物樣品的成分的結合表明所述樣品中鏈球菌屬細菌或其蛋白質的存在。本發(fā)明還提供的是用于檢測生物樣品中鏈球菌屬細菌或其蛋白質的試劑盒，所述試劑盒包含選自由ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的1B12、ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的4D5和ATCC編號XXXX的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的9E11或其衍生物構成的組的至少一種單克隆抗體，和使用說明書。除了如上所述的示范性的方面和實施方式之外，參考以下詳細說明的研究，進一步的方面和實施方式將變得明顯。詳細說明在此公開的是多肽和核酸，作為用于鑒定單克隆抗體的結合位點、從多克隆血清中吸出交叉反應性抗體、限定涵蓋保護性表位的PhtD的區(qū)域、以比全長蛋白質所提供的更高的分辨率表征人類免疫反應(在臨床試驗中)的免疫學試劑或工具是有用的，并且可以提供生產(chǎn)期間的優(yōu)勢。作為測試試劑，這種截短的蛋白質的集合將容許表征PhtD對多價疫苗的單獨的貢獻。在一個實施方式中，組合物和方法對于治療和/或預防與表達PhtD的生物體如鏈球菌屬細菌的存在相關的狀況是有用的，通過刺激針對PhtD的免疫反應，從而治療所述生物體。免疫反應顯示了在向宿主施用PhtD、其免疫原性片段，或其變體，或編碼任何它們的核酸之后發(fā)生。在這種情況下，PhtD、其免疫原性片段，或其變體作為免疫原。如在此使用的，“免疫原”是各自來自PhtD的多肽、肽、片段，或其變體，其在已經(jīng)施用了所述免疫原的宿主中產(chǎn)生免疫反應。所述免疫反應可以包括結合免疫原的至少一個表位的抗體的產(chǎn)生，和/或針對表達所述免疫原的表位的細胞的細胞免疫反應的產(chǎn)生。通過例如檢測提高的抗體反應(即，抗體的數(shù)量，提高的親和力/抗體親抗原性)或提高的細胞反應(即，活化的T細胞的提高的數(shù)量，T細胞受體的提高的親和力/抗體親抗原性)，所述反應可以作為例如針對所述免疫原的現(xiàn)有免疫反應的增強來檢測。免疫反應的其他測量是本領域已知的，可以用來測定宿主中免疫反應的存在。用于進行這些測定的標準的方法是本領域中可獲得的。在某些實施方式中，所述免疫反應是可檢測的，而不必然是保護性的。在這些情況下，包含所述免疫原的組合物可以被認為是免疫學組合物。在某些實施方式中，所述免疫反應是保護性的，意味著所述免疫反應能夠預防表達PhtD的生物體(S卩，鏈球菌屬物種)的生長、或從宿主中的消滅。在這種情況下，包含免疫原的組合物，雖然仍被認為是免疫學組合物，可以另外被稱為疫苗。在某些實施方式中，在單個組合物中使用多種免疫原。PhtD的免疫原性片段(即，免疫原)在此與產(chǎn)生和使用片段的方法一起描述。此處描述的免疫原包括多肽，所述多肽包含全長PhtD(有或者沒有信號序列)、其PhtD片段和其變體。優(yōu)選的是所使用的氨基酸序列來自具有以下顯示的氨基酸序列的肺炎鏈球菌PhtD(GenBank登錄號AF318955；Adamou,etal.Infect.Immun.69(2)，949-958(2001))MKINKKYLAGSVAVLALSVCSYELGRHQAGQVKKESNRVSYID⑶QAGQKAENLTPDEVSKREGINAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVNEIKGGYVIKVDGKYYVYLKDAAHADNIRTKEEIKRQKQEHSHNHGGGSNDQAVVAARAQGRYTTDDGYIFNASDIIEDTGDAYIVPH⑶HYHYIPKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPSSSSSYNANPAQPRLSENHNLTVTPTYHQNQGENISSLLRELYAKPLSERHVESDGLIFDPAQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQMSELEKRIARIIPLRYRSNHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKViiDGYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEffFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.1)優(yōu)選的免疫原性組合物包含例如具有SEQIDNO:2、3、4、15、16或17的氨基酸序列的一種或更多種多肽。這些多肽可以包括一個或更多個保守性氨基酸替換和/或信號序列和/或可檢測的“標簽”，例如His(SP，MGHHHHHH(SEQIDNO:18)，參見，例如，SEQIDNO:15-17)。示范性的，優(yōu)選的免疫原性片段包括截短物1WVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKV⑶GYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEWFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.2)；截短物2VKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.3)；和，截短物3HVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.4)。如上所述，在此提供的免疫原性多肽可以包括對免疫原性PhtD多肽(S卩，SEQIDNO:2、3和/或4)的一個或更多個保守性氨基酸替換。例如，在此提供的免疫原可以包含具有一個或更多個氨基酸序列修飾的天然存在的PhtD的C-末端部分，從而保持了與天然存在的PhtD的約60到約99%的序列同一性或相似性。示范性的變體具有約60到約99%、約60到約65%、約65到約70%、約70到約75%、約80到約85%、約85到約90%、約90到約99%或約95到約99%相似于或相同于SEQIDNO:2、3、4、15、16和/或17的氨基酸序列，和/或其任何片段或衍生物。優(yōu)選的利用在此教導的或本領域可獲得的方法，針對它們作為免疫原起作用的能力來選擇變體。適合的氨基酸序列修飾包括對在此討論的任何PhtD多肽的氨基酸的替換、插入、刪除或其他改變。替換、刪除、插入或其任何組合可以被組合到單個變體中，只要所述變體是免疫原性的多肽。插入物包括氨基和/或羧基末端融合物，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入物。插入物通常將是比氨基或羧基末端融合物的那些更小的插入物，例如，在一個到四個殘基的級別。刪除的特征在于從蛋白質序列中除去一個或更多個氨基酸殘基。一般地，在蛋白質分子內的任一個位點刪除不超過約2到6個殘基。這些變體通常通過編碼蛋白質的DNA中核苷酸的定點誘變，從而產(chǎn)生編碼變體的DNA，此后在重組細胞培養(yǎng)物中表達所述DNA來制備。在具有已知序列的DNA中的預定位點產(chǎn)生替換突變的技術是公知的，包括但不限于，M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸替換一般是單個殘基的，但可以一次在多個不同的位置發(fā)生。替換變體是其中至少一個殘基被除去，在該位置插入不同的殘基的那些變體。這樣的替換一般根據(jù)以下的表1來制備，被稱為保守性替換，一般對該位置處氨基酸殘基的大小、極性、電荷、疏水性或親水性有很少的或沒有影響，特別是，不產(chǎn)生降低的免疫原性。然而，其它的是本領域技術人員公知的。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在此使用的變體還包括來自可選擇的鏈球菌屬菌株的天然存在的PhtD等位基因，其在同源的PhtD基因內的一個或更多個位點處展現(xiàn)了多態(tài)性。變體可以通過常規(guī)的分子生物學技術產(chǎn)生。在此相對于同天然存在的基因相比的序列相似性或同一性來描述變體。本領域技術人員容易地理解如何確定兩個多肽或核酸的序列相似性和同一性。例如，序列相似性可以在比對兩個序列使得同一性處于最高水平之后計算。比對在一定程度上取決于比對程序中特定算法的使用。這可以包括，例如，SmithandWatermanAdv.App1.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needlemanandffunsch,J.MoLBiol.48443(1970)的同源性比對算法，PearsonandLipman,PNASUSA85:2444(1988)的相似性搜索方法，這些算法的計算機化實現(xiàn)(WisconsinGenetics軟件包中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison，WI)，以及BLAST和BLAST2·O以及Altschuletal.，NucleicAcidsRes.253389-3402,1977；Altschul,etal.,J.Mol.Biol.215403-410,1990；Zuker,Μ.Science244:48_52，1989Jaegereta1.PNASUSA86:7706-7710，1989和Jaegeretal.MethodsEnzymol.183:281_306，1989所描述的算法。多重序列比對方法的新近的綜述由Nuinetal.，BMCBioinformatics7:471，2006所提供。這些參考文獻的每一個通過引用來合并，至少對于與序列相似性的比對和計算有關的材料。要理解的是，一般可以使用測定序列相似性或同一性的任何方法，在某些情況下，這些不同方法的結果可能是不同的。當以例如95%來提供序列相似性時，則這種相似性必需是用至少一種公認的計算方法可檢測的。此處描述的免疫原性多肽可以包括一個或更多個氨基酸類似物或非天然存在的立體異構體。通過用所選氨基酸填充tRNA分子和工程化遺傳構建體，所述工程化利用例如琥珀密碼子將類似物氨基酸以位點特異性方式插入到肽鏈中，這些氨基酸類似物和立體異構體可以容易地摻入多肽鏈中(Thorsonetal.，MethodsinMolec.Biol.7743-73(1991),Zoller,CurrentOpinioninBiotechnology,3348-354(1992)；Ibba,Biotechnology&GeneticEngineeringReviews13:197_216(1995),Cahilletal.,TIBS,14(10)400-403(1989)；Benner,TIBTech,12158-163(1994)；IbbaandHennecke,Bio/technology,12=678-682(1994)所有這些通過引用合并在此，至少對于與氨基酸類似物相關的材料)?？梢援a(chǎn)生相似于肽、但是不是經(jīng)由天然的肽鍵連接的免疫原性片段。例如，氨基酸或氨基酸類似物的連鍵可以包括CH2NH—、-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH=CH—(順式和反式)、--COCH2--、-CH(OH)CH2-和一CHH2S0—(這些和其他的可以在Spatola,A.F."Peptidebackbonemodifications:Astructure-activityanalysisofpeptidescontainingamidebondsurrogates,conformationalconstraints,andrelatedbackbonemodifications."InChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,pp.267-357.ffeinstein,B.editor,MarcelDekker,NewYork,N.Y.(1983)；Morley,TrendsinPharm.Sci.1(2)463-468(1980)；Hudson,etal.，IntJP印tProtRes14177-185(1979)(-CH2NH-,CH2CH2-)；Spatolaetal.LifeSci381243-1249(1986)(—CHH2--S)；Hann,JournaloftheChemicalSocietyPerkinTransactioins1pp.307-314(1982)(—CH—CH—,cisandtrans)；Almquistetal.，J.Med.Chem.231392-1398(1980)(-COCH2-)Jennings-Whiteetal.,TetrahedronLett23:2533(1982)(--COCH2--)；EuropeanPublicationNo.EP0045665toSzelke,etal.(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladayetal.,Tetrahedron.Lett24:4401-3404(1983)(—C(OH)CH2-)；和HrubyLifeSci31189-199(1982)(-CH2-S-)中找至Ij；其每一個通過引用合并在此，至少對于關于連鍵的材料)。氨基酸類似物和立體異構體常常具有增強的或期望的性質，例如，更為經(jīng)濟的生產(chǎn)、更高的化學穩(wěn)定性、增強的藥理學性質(半衰期、吸收、效價、效力，等等)、改變的特異性(例如，生物學活性的廣譜性)、和其他的。例如，D-氨基酸可以用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽，因為D-氨基酸不被天然存在的肽酶識別。用相同類型的D-氨基酸(例如，D-賴氨酸代替L-賴氨酸)系統(tǒng)性的替換共有序列的一個或更多個氨基酸可以用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。半胱氨酸殘基可以用于環(huán)化或連接兩個或更多個肽在一起。這對于將肽限制成特定的構象是有益的。(RizoandGieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992)，通過引用合并在此)·其他變體包括其中一個或更多個免疫靶向序列(即，GYGRKKRRQRRR(TAT;SEQIDNO.19),RQIKIffFQNRRMKffKK(AntP；SEQIDN0.20),SRRHHCRSKAKRSRHH(PER1-1；SEQIDNO.:21)，或GRRHHRRSKAKRSR(PER1-2;SEQIDNO.:22))連接到免疫原性PhtD多肽的那些。因而可以產(chǎn)生免疫原性融合蛋白并在實踐本發(fā)明中利用。在一個實施方式中，提供了編碼PhtD多肽如SEQIDNO:2、3、或4或其變體的任一個的核酸(即，SEQIDN0:5-10)。還提供的是這些序列的變體，包括其簡并變體。在某些實施方式中，編碼所述肽序列的核酸分子可以被插入表達載體中，如下文更詳細地討論的。在這樣的實施方式中，肽序列由與所述氨基酸序列相應的核苷酸編碼。編碼各種氨基酸的核苷酸的特定組合是本領域公知的，如本領域技術人員所使用的各種參考文獻中描述的(例如Lewin，B.GenesV,OxfordUniversityPress，1994)，如下文表2中顯示的。核酸變體可以使用編碼目標多肽的任何核苷酸組合。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>編碼SEQIDNO:2、3、4、15、16和17的多肽(即，有和沒有His標簽)的示范性的核酸如下所示截短物1(沒有His標簽)ATGTGGGTGCCCGACAGCAGACCCGAGCAGCCCAGCCCCCAGAGCACCCCCGAGCCCAGCCCCAGCCCCCAGCCCGCCCCCAACCCCCAGCCCGCCCCCAGCAACCCCATCGACGAGAAGCTGGTGAAGGAGGCCGTGAGAAAGGTGGGCGACGGCTACGTGTTCGAGGAGAACGGCGTGAGCAGATACATCCCCGCCAAGGACCTGAGCGCCGAGACCGCCGCCGGCATCGACAGCAAGCTGGCCAAGCAGGAGAGCCTGAGCCACAAGCTGGGCGCCAAGAAGACCGACCTGCCCAGCAGCGACAGAGAGTTCTACAACAAGGCCTACGACCTGCTGGCCAGAATCCACCAGGACCTGCTGGACAACAAGGGCAGACAGGTGGACTTCGAGGCCCTGGACAACCTGCTGGAGAGACTGAAGGACGTGCCCAGCGACAAGGTGAAGCTGGTGGACGACATCCTGGCCTTCCTGGCCCCCATCAGACACCCCGAGAGACTGGGCAAGCCCAACGCCCAGATCACCTACACCGACGACGAGATCCAGGTGGCCAAGCTGGCCGGCAAGTACACCACCGAGGACGGCTACATCTTCGACCCCAGAGACATCACCAGCGACGAGGGCGACGCCTACGTGACCCCCCACATGACCCACAGCCACTGGATCAAGAAGGACAGCCTGAGCGAGGCCGAGAGAGCCGCCGCCCAGGCCTACGCCAAGGAGAAGGGCCTGACCCCCCCCAGCACCGACCACCAGGACAGCGGCAACACCGAGGCCAAGGGCGCCGAGGCCATCTACAACAGAGTGAAGGCCGCCAAGAAGGTGCCCCTGGACAGAATGCCCTACAACCTGCAGTACACCGTGGAGGTGAAGAACGGCAGCCTGATCATCCCCCACTACGACCACTACCACAACATCAAGTTCGAGTGGTTCGACGAGGGCCTGTACGAGGCCCCCAAGGGCTACACCCTGGAGGACCTGCTGGCCACCGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNo5)截短物1(帶His標簽的)ATGGGCCACCACCACCACCACCACTGGGTGCCCGACAGCAGACCCGAGCAGCCCAGCCCCCAGAGCACCCCCGAGCCCAGCCCCAGCCCCCAGCCCGCCCCCAACCCCCAGCCCGCCCCCAGCAACCCCATCGACGAGAAGCTGGTGAAGGAGGCCGTGAGAAAGGTGGGCGACGGCTACGTGTTCGAGGAGAACGGCGTGAGCAGATACATCCCCGCCAAGGACCTGAGCGCCGAGACCGCCGCCGGCATCGACAGCAAGCTGGCCAAGCAGGAGAGCCTGAGCCACAAGCTGGGCGCCAAGAAGACCGACCTGCCCAGCAGCGACAGAGAGTTCTACAACAAGGCCTACGACCTGCTGGCCAGAATCCACCAGGACCTGCTGGACAACAAGGGCAGACAGGTGGACTTCGAGGCCCTGGACAACCTGCTGGAGAGACTGAAGGACGTGCCCAGCGACAAGGTGAAGCTGGTGGACGACATCCTGGCCTTCCTGGCCCCCATCAGACACCCCGAGAGACTGGGCAAGCCCAACGCCCAGATCACCTACACCGACGACGAGATCCAGGTGGCCAAGCTGGCCGGCAAGTACACCACCGAGGACGGCTACATCTTCGACCCCAGAGACATCACCAGCGACGAGGGCGACGCCTACGTGACCCCCCACATGACCCACAGCCACTGGATCAAGAAGGACAGCCTGAGCGAGGCCGAGAGAGCCGCCGCCCAGGCCTACGCCAAGGAGAAGGGCCTGACCCCCCCCAGCACCGACCACCAGGACAGCGGCAACACCGAGGCCAAGGGCGCCGAGGCCATCTACAACAGAGTGAAGGCCGCCAAGAAGGTGCCCCTGGACAGAATGCCCTACAACCTGCAGTACACCGTGGAGGTGAAGAACGGCAGCCTGATCATCCCCCACTACGACCACTACCACAACATCAAGTTCGAGTGGTTCGACGAGGGCCTGTACGAGGCCCCCAAGGGCTACACCCTGGAGGACCTGCTGGCCACCGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNo6)截短物2(沒有His標簽)ATGGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNo7)截短物2(帶His標簽的)ATGGGCCACCACCACCACCACCACGTGAAGTACTACGTGGAGCACCCCAACGAGAGACCCCACAGCGACAACGGCTTCGGCAACGCCAGCGACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNO.8)截短物3(沒有His標簽)ATGCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNO.9)截短物3(帶His標簽的)ATGGGCCACCACCACCACCACCACCACGTGAGAAAGAACAAGGTGGACCAGGACAGCAAGCCCGACGAGGACAAGGAGCACGACGAGGTGAGCGAGCCCACCCACCCCGAGAGCGACGAGAAGGAGAACCACGCCGGCCTGAACCCCAGCGCCGACAACCTGTACAAGCCCAGCACCGACACCGAGGAGACCGAGGAGGAGGCCGAGGACACCACCGACGAGGCCGAGATCCCCCAGGTGGAGAACAGCGTGATCAACGCCAAGATCGCCGACGCCGAGGCCCTGCTGGAGAAGGTGACCGACCCCAGCATCAGACAGAACGCCATGGAGACCCTGACCGGCCTGAAGAGCAGCCTGCTGCTGGGCACCAAGGACAACAACACCATCAGCGCCGAGGTGGACAGCCTGCTGGCCCTGCTGAAGGAGAGCCAGCCCGCCCCCATCCAG(SEQIDNO.10)還提供的是分離的核酸，其在高度嚴格條件下與雜交探針的任何部分雜交，所述雜交探針相應于編碼SEQIDNO:2、3、4、15、16和/或17的任一個、或相應于SEQIDN0:5-10的任一個的核苷酸序列。雜交核酸的雜交部分長度一般是至少15個(例如，15、20、25、30、40或更多個)核苷酸。雜交部分至少65%、80%、90%、95%或99%相同于它所雜交的序列的部分。雜交的核酸作為，例如克隆探針、引物(例如，PCR引物)或診斷探針是有用的。核酸雙螺旋或雜合體穩(wěn)定性被表示為熔解溫度或Tm，其是探針從目標DNA解離的溫度。這種熔解溫度被用于確定需要的嚴格條件。如果鑒定的序列相關于或基本上相同于探針，而不是相同的，則有用的是首先建立最低溫度，在該溫度下在特定的鹽濃度下(例如，使用各種濃度的SSC或SSPE緩沖液)僅發(fā)生同源的雜交。假定的錯配引起Tm上1°C的降低，則在雜交反應中最終洗滌的溫度相應地降低(例如，如果具有超過95%的同一性的序列是尋求的，最后的洗滌溫度降低5°C)。實際上，Tm的改變可以在每錯配0.5和1.5°C之間。高度嚴格條件包括在68°C下在5XSSC/5XDenhardt，s溶液/1.0%SDS下雜交，在室溫下在0.2XSSC/0.1%SDS中洗滌?！爸卸葒栏駰l件”包括在3XSSC中在42V洗浲。鹽濃度和溫度可以改變來實現(xiàn)探針和目標核酸之間最佳的同一性水平。關于這種嚴格條件的其他指導在本領域是容易獲得的，例如，在MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEditionbySambrooketal.,ColdSpringHarborPress,2001中。表達載體在實踐本發(fā)明中也是適用的。表達載體一般包含與編碼多肽的異源核酸序列(“編碼序列”)可操作連接的側翼序列。在其他實施方式中，或與這些實施方式組合地，側翼序列優(yōu)選的能夠實現(xiàn)編碼序列的復制、轉錄和/或翻譯，并與編碼序列可操作地連接。“可操作地連接的”表明核酸序列被配置以便進行它們通常的功能。舉例來說，啟動子可操作地連接到編碼序列，此時啟動子能夠指導編碼序列的轉錄。側翼序列不必與編碼序列是鄰接的，只要它們正確地起作用。因而，例如，插入的非翻譯但轉錄的序列可以位于啟動子和編碼序列之間，啟動子仍被認為是與編碼序列可操作地連接的。側翼序列可以是同源的(即，來自與宿主細胞相同的物種和/或菌株)、異源的(即，來自宿主細胞物種或菌株之外的物種)、雜合的(即，來自超過一個來源的側翼序列的組合)或合成的。側翼序列還可以是正常地起作用來調節(jié)宿主的基因組中編碼多肽的核苷酸序列的表達的序列。在某些實施方式中，優(yōu)選的是，側翼序列是驅動目標細胞中高水平基因表達的轉錄調節(jié)區(qū)域。轉錄調節(jié)區(qū)域可以包含，例如，啟動子、增強子、沉默子、抑制元件或其組合。轉錄調節(jié)區(qū)域可以是組成型的或組織_或細胞_類型特異性的(即，所述區(qū)域驅動在一種類型的組織或細胞中相比其他類型的組織或細胞更高水平的轉錄)。因而，轉錄調節(jié)區(qū)域的來源可以是任何原核或真核的生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體、或任何植物，只要所述側翼序列在宿主細胞機制下有功能，或可以被宿主細胞機制活化。各種各樣的轉錄調節(jié)區(qū)域可以在實踐本發(fā)明中使用。適合的轉錄調節(jié)區(qū)域包括，尤其是，CMV啟動子(S卩，CMV即時早期啟動子)；來自真核基因的啟動子(即，雌激素可誘導的雞卵清蛋白基因、干擾素基因、葡糖_類皮質激素-可誘導的酪氨酸轉氨酶基因和胸苷激酶基因)；主要早期和晚期腺病毒基因啟動子；SV40早期啟動子區(qū)域(BernoistandChambon,1981,Nature290304-10)；勞氏肉瘤病毒(RSV)的3，長末端重復(LTR)中含有的啟動子(Yamamoto,etal.，1980，Cell22787-97)；單純性皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)啟動子(Wagneretal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.781444-45)；金屬硫蛋白基因的調節(jié)序列(Brinsteretal.，1982，Nature29639-42)；或在原核表達載體中發(fā)現(xiàn)的調節(jié)序列中，例如β-內酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroffetal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.，75:3727_31)；tac啟動子(DeBoeretal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80:21_25)，或T7RNA聚合酶啟動子中的那些，PBAD阿拉伯糖啟動子或pTrc啟動子。組織和/或細胞類型特異性轉錄控制區(qū)域包括，例如，在胰腺的腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)域(Swiftetal.,1984，Cell38:639_46；Ornitzetal.，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald,1987,Hepatology7:425-515)；胰腺的beta細胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)域(Hanahan，1985，Nature315:115_22)；在淋巴樣細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)域(Grosschedletal.，1984，Cell38647-58；Adamesetal.，1985,Nature318533-38；Alexanderetal.，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睪丸、乳、淋巴樣和肥大細胞中的小鼠乳瘤病毒控制區(qū)域(Lederetal.,1986,Cell45:485-95)；肝臟中的白蛋白基因控制區(qū)域(Pinkertetal.，1987，GenesandDevel.1268-76)；肝臟中的甲胎蛋白質基因控制區(qū)域(Krumlaufetal.,1985,Mol.Cell.Biol.,51639-48；Hammeretal.，1987，Science235:53-58)；肝臟中的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)域(Kelseyetal.，1987，GenesandDevel.1:161_71)；髓樣細胞中的β-珠蛋白基因控制區(qū)域(Mogrametal.，1985，Nature315:338_40；Kolliasetal.，1986，Cell4689-94)；腦中少突膠質細胞中的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)域(Readheadetal.，1987，Cell48703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白輕鏈_2基因控制區(qū)域(Sani，1985，Nature314283-86)；和下丘腦中的促性腺釋放激素基因控制區(qū)域(Masonetal.，1986，Science2341372-78)，和黑素瘤細胞中的酪氨酸酶啟動子(Hart,I.SeminOncol1996Feb；23(1)154-8；Siders,etal.CancerGeneTher1998S印-Oct;5(5):281_91)。其他適合的啟動子是本領域已知的。編碼目標免疫原的核酸分子可以作為病毒或非病毒載體的部分施用。在一個實施方式中，利用DNA載體向患者遞送編碼目標免疫原和/或相關分子(例如，共同刺激分子、細胞因子或趨化因子)的核酸。這樣做時，可以利用各種策略來改善這些機制的效率，包括，例如，利用自我復制的病毒復制子(Caley，etal.1999.Vaccine,17=3124-2135；Dubensky,etal.2000.Mol.Med.6723-732；Leitner,etal.2000.CancerRes.6051-55)，密碼子優(yōu)化(Liu,etal.2000.Mol.Ther.，1:497_500；Dubensky,上文；Huang,etal.2001.J.Virol.75:4947_4951)，體內電穿孔(ffidera,etal.2000.J.Immunol.1644635-3640)，摻入編碼共同刺激分子、細胞因子和/或趨化因子的核酸(Xiang，etal.1995.Immunity,2129-135；Kim,etal.1998.Eur.J.Immunol.,281089-1103；Iwasaki,etal.1997.J.Immunol.158:4591_3601；Sheerlinck,etal.2001.Vaccine,192647-2656)，刺激基序例如CpG的摻入(Gurunathan，上文；Leitner，上文)，用于胞吞的或泛素加工途徑的靶向的序列(Thomson,etal.1998.J.Virol.72:2246_2252；Velders,etal.2001.J.Immunol.166:5366_5373)，初次免疫-強化方法(Gurunathan，上文；Sullivan,etal.2000.Nature,408605-609；Hanke,etal.1998.Vaccine,16439-445；Amara,etal.2001.Science,292:69_74)，蛋白酶敏感裂解位點，以及利用粘膜遞送載體如沙門氏菌屬(Salmonella)(Darji,etal.1997.Cell,91765-775；Woo，etal.2001.Vaccine,192945-2954)。其他方法是本領域已知的，其中一些描述如下。已經(jīng)成功地用于將核酸導入宿主的各種病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒和痘病毒，等等。本領域理解的是，許多這樣的病毒載體是本領域中可獲得的。本發(fā)明的載體可以利用本領域技術人員廣泛可用的標準重組技術來構建。這樣的技術可以在常用的分子生物學參考文獻中找到，例如MolecularCloning=ALaboratoryManual(Sambrook,etal.,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)，GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology,Vol.185,editedbyD.Goeddel,1991.AcademicPress，SanDiego,CA)，禾口PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis，etal.1990.AcademicPress，SanDiego，CA)0優(yōu)選的逆轉錄病毒載體是慢病毒的衍生物以及鼠或禽類逆轉錄病毒的衍生物。適合的逆轉錄病毒載體的實例包括，例如，Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腫瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和勞氏肉瘤病毒(RSV)。許多逆轉錄病毒載體可以摻入多個外源的核酸序列。由于重組的逆轉錄病毒是有缺陷的，它們需要幫助以產(chǎn)生傳染性載體顆粒。這種幫助可以由，例如，編碼逆轉錄病毒結構基因的輔助細胞系來提供。適合的輔助細胞系包括Ψ2、ΡΑ317和PA12，等等。使用這樣的細胞系產(chǎn)生的載體病毒粒然后可以用于感染組織細胞系，例如NIH3Τ3細胞，來產(chǎn)生大量的嵌合逆轉錄病毒病毒粒。逆轉錄病毒載體可以通過傳統(tǒng)方法(例如，注射)或通過“生產(chǎn)細胞系”靠近目標細胞群體的植入(Culver，K.，etal.，1994，Hum.GeneTher.,5(3):343_79；Culver,K.，etal.,ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.,59:685_90)；Oldfield,Ε.,1993,Hum.GeneTher.，4(1):39_69)來施用。所述生產(chǎn)細胞系被工程化來產(chǎn)生病毒載體并在目標細胞附近釋放病毒顆粒。釋放的病毒顆粒的一部分接觸目標細胞并感染這些細胞，因而將本發(fā)明的核酸遞送到目標細胞。在目標細胞的感染之后，發(fā)生載體的核酸的表達。腺病毒載體已經(jīng)被證實對于向真核細胞的基因轉移(Rosenfeld，Μ.，etal.，1991，Science,252(5004)431-3；Crystal,R.，etal.，1994，Nat.Genet.，8(1)42-51)，真核基因表達的研究(Levrero，Μ.，etal.，1991，Gene,101(2)195-202)，疫苗開發(fā)(Graham，F(xiàn).andPrevec,L.，1992，Biotechnology,20:363_90)，和動物模型(Stratford-Perricaudet,L.,etal.,1992,BoneMarrowTransplant.,9(Suppl.1)151-2；Rich,D.，etal.，1993，Hum.GeneTher.，4(4)461-76)是特別有用的。在體內向不同的組織施用重組Ad的實驗性的途徑包括氣管內滴注(Rosenfeld，Μ.，etal.，1992，Cell,68(1)143-55)注射到肌肉中(Quantin,B.，etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,89(7):2581-3)，外周的靜脈內注射(Herz,J.，andGerard,R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,90(7):2812_6)以及向腦部的趨實體(stereotactic)接種(LeGalLaSalle,G.,etal.，1993，Science，259(5097):988_90)，等等。腺伴隨病毒(AAV)展現(xiàn)了高水平的傳染性、廣泛的宿主范圍和在整合到宿主細胞基因組方面的特異性(Hermonat,P.，etal.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,81(20)6466-70)。單純皰疹病毒1型(HSV-I)是又一個吸引人的載體系統(tǒng)，特別是對于由于它的親神經(jīng)性質在神經(jīng)系統(tǒng)中的使用(Geller，Α.，etal.，1991，TrendsNeurosci.，14(10)428-32；Glorioso,etal.，1995，Mol.Biotechnol.，4(1)87~99；Glorioso,etal.，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49:675_710)。痘病毒是另一個有用的表達載體(Smith，etal.1983,Gene,25(1):21_8；Moss，etal,1992,Biotechnology,20:345_62；Moss,etal,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,15825-38；Moss，etal.1991.Science,2521662-1667)。被顯示有用的痘病毒包括牛痘、NYVAC、禽痘病毒(avipox)、禽痘病毒(fowlpox)、金絲雀痘、ALVAC和ALVAC(2)，等等。通過刪除編碼已知或潛在的毒力因子的基因組的六個非關鍵區(qū)域，NYVAC(vP866)來自牛痘病毒的哥本哈根疫苗毒株(參見，例如，美國專利NO.5，364，773和5，494，807)。刪除的基因座還作為用于外源基因的插入的接受者基因座被工程化。刪除的區(qū)域是胸苷激酶基因(TKJ2R)vP410；出血性區(qū)域(U；B13R+B14R)vP553；A型包涵體區(qū)域(ATI；A26L)vP618；血球凝集素基因(HA;A56R)vP723；宿主范圍基因區(qū)域(C7L-K1L)vP804；和，大亞基，核糖核苷酸還原酶(I4L)vP866。NYVAC是通過特異性刪除編碼與毒力和宿主范圍相關的基因產(chǎn)物的十八個開放閱讀框產(chǎn)生的遺傳工程化的牛痘病毒毒株。NYVAC已經(jīng)顯示了對于表達TA是有用的(參見，例如，美國專利NO.6，265，189)。NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB也根據(jù)布達佩斯條約在ATCC保藏，登記號碼分別是VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914。基于ALVAC的重組病毒(即，ALVAC-I和ALVAC-2)也適合于在本發(fā)明的實踐中使用(參見，例如，美國專利NO.5，756，103)οALVAC(2)與ALVAC(I)相同，只是ALVAC(2)基因組包含處于牛痘啟動子控制下的牛痘E3L和K3L基因(美國專利NO.6，130,066；Beattieetal.，1995a,1995b,1991；Changetal.，1992；Daviesetal.，1993)。ALVAC(1)^PALVAC(2)已經(jīng)顯示了在表達外源DNA序列，例如TA方面是有用的(Tartagliaetal.,1993a,b；美國專利NO.5，833，975)。ALVAC根據(jù)布達佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209，USA,ATCC登記號碼VR-2547。另一個有用的痘病毒載體是TROVAC。TROVAC是指減毒的禽痘，其是來自許可用于1天齡小雞的疫苗接種的禽痘病毒FP-I疫苗毒株的噬斑克隆的(plaque-cloned)分離物。TROVAC同樣地根據(jù)布達佩斯條約在ATCC保藏，登記號碼2553?！胺遣《尽辟|粒載體在某些實施方式中也是適合的。優(yōu)選的質粒載體是與細菌、昆蟲和/或哺乳動物宿主細胞相容的。這樣的載體包括，例如，PCR-II,pCR3禾口pcDNA3.1(Invitrogen,SanDiego,CA)，pBSII(Stratagene，LaJolla,CA)、pET15(Novagen,Madison，WI)、pGEX(PharmaciaBiotech，Piscataway,NJ)、pEGFP-N2(ClontechiPaloAltoiCA)^pETL(BlueBacILInvitrogen)、pDSR_alpha(PCT公幵/S)號W090/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)以及Bluescript質粒衍生物(高拷貝數(shù)的基于COLEl的噬菌粒，StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)，為克隆Taq擴增的PCR產(chǎn)物設計的PCR克隆質粒(例如，τοροTAcloningkit，PCR2.1,質粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。細菌載體也可以用于當前的發(fā)明。這些載體包括，例如，志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、卡介苗(Bacillecalmetteguerin)(BCG)和鏈球菌屬(參見，例如，WO88/6626；WO90/0594；WO91/13157；WO92/1796和WO92/21376)。許多其他的非病毒質粒表達載體和系統(tǒng)是本領域已知，可以用于當前的發(fā)明。其他遞送技術在實踐本發(fā)明中也是合格的，包括，例如，DNA-配體復合物、腺病毒-配體-DNA復合物、DNA的直接注射、CaPO4沉淀、基因槍技術、電穿孔和膠態(tài)分散系統(tǒng)。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括基于大分子復合物、納米囊、微球體、珠子和脂質的系統(tǒng)，包括水包油乳化劑、微團、混合的微團和脂質體。本發(fā)明的優(yōu)選的膠態(tài)系統(tǒng)是脂質體，其是作為體外和體內遞送載體有用的人工的膜囊。RNA、DNA和完整的病毒?？梢园庠谒詢炔恐?，以生物學活性形式遞送給細胞(Fraley，R.，etal.，1981，TrendsBiochem.Sci.，677)。脂質體的組成通常是磷脂、特別是高相轉變溫度的磷脂，通常與類固醇、特別是膽固醇的組合。也可以使用其他磷脂或其他脂質。脂質體的物理性質取決于PH值、離子強度和二價陽離子的存在。在脂質體生產(chǎn)中有用的脂質的實例包括磷脂酰基化合物，例如，磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂類、腦苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂類。特別有用的是，二酰基磷脂酰甘油，其中脂質部分含有14-18個碳原子，特別是16-18個碳原子，并且是飽和的。例示性的磷脂包括蛋磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。還提供了包含載體的培養(yǎng)的細胞。培養(yǎng)的細胞可以是用載體轉染的培養(yǎng)的細胞、或所述細胞的子代，其中所述細胞表達免疫原性多肽。適合的細胞系是技術人員已知的并且是商業(yè)上可獲得的，例如，通過美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)。轉染的細胞可以用于生產(chǎn)免疫原性多肽的方法中。所述方法包括在容許免疫原性多肽的表達的條件下、任選的在表達序列的控制下培養(yǎng)包含載體的細胞。免疫原性多肽可以使用標準的蛋白質純化方法從細胞或培養(yǎng)基中分離。免疫原性多肽可以使用更大的多肽或蛋白質的標準酶裂解來制造，或通過蛋白質化學技術將兩個或更多個肽或多肽連接在一起來產(chǎn)生。例如，肽或多肽可以使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔-丁氧基羰基)化學作用的當前可用的實驗室設備(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)來化學地合成。通過肽縮合反應、天然的化學物質連接、固相化學作用或酶連接，兩個片段可以通過在它們的羧基和氨基末端的肽鍵共價連接在一起形成免疫原性PhtD多肽。(SyntheticPeptides=AUserGuide.，Grant,ed.,W.H.FreemanandCo.,NewYork,N.Y.(1992)；PrinciplesofPeptideSynthesis.,BodanskyandTrost,eds.Springer-VerlagInc.,NewYork,N.Y.(1993)；AbrahmsenLetal.，Biochemistry,30:4151(1991)；Dawsonetal.Science，266:776_779(1994);SolidPhasePeptideSynthesis,2ndEdition,Stewart,ed.，PierceChemicalCompany,Rockford,IL,(1984)，對于其中描述的方法，所有這些通過引用合并在此)。免疫原性多肽和包含一個或更多個多肽的組合物可以用來產(chǎn)生抗體。因而，在受試者中產(chǎn)生特異于PhtD的抗體的方法包括向所述受試者施用此處描述的免疫原性PhtD片段。在此還提供的是結合PhtD多肽的抗體(或其片段或衍生物)?？贵w可以是多克隆或單克隆的，可以是完全人類的或人源化的，包括天然存在的抗體和單鏈抗體。抗體可以通過向受試者施用免疫原性PhtD多肽或其片段或衍生物來體內產(chǎn)生。體外抗體生產(chǎn)包括使用雜交瘤方法產(chǎn)生單克隆抗體。雜交瘤方法是本領域公知的，由KohlerandMilstein,Nature,256:495(1975)禾口HarlowandLane.Antibodies,ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPublications,NewYork,(1988)描述，對于其中描述的方法，通過引用將它們完全地合并在此。生產(chǎn)單鏈抗體的方法是本領域技術人員公知的。參見，例如，美國專利N0.5，359，046(對于這樣的方法，通過完全引用合并在此)。單鏈抗體是通過利用短的肽接頭將重鏈和輕鏈的可變域融合在一起，從而重建處于單個分子上的抗原結合位點來創(chuàng)造的。已經(jīng)開發(fā)了其中一個可變域的C-末端通過15到25個氨基酸的肽或接頭拴系到另一個可變域的N-末端的單鏈抗體可變片段(scFvs)，而不顯著地破壞抗原結合或結合的特異性。選擇接頭以容許重鏈和輕鏈以它們適當?shù)臉嬒笕∠蚪Y合在一起。參見，例如，Huston，J.S.，etal.,MethodsinEnzym.203:46_121(1991)，對于有關接頭的材料，通過引用將其合并在此。針對PhtD多肽的完全人類的和人源化抗體可以在此處描述的方法中使用。人源化的抗體包括人免疫球蛋白(接受者抗體)，在其中來自接受者的互補決定區(qū)(CDR)被來自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠或兔的、具有期望的特異性、親合性和能力的CDR的殘基替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非人殘基替代。可以采用在免疫時能夠產(chǎn)生人類抗體的完全集(即，完全人類抗體)的轉基因動物(例如，小鼠)。在嵌合的和種系突變小鼠中對抗體重鏈連接區(qū)(J(H))基因的純合刪除導致了對內源性抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這種種系突變小鼠中將導致在抗原攻擊時產(chǎn)生人類抗體(參見，例如，Jakobovitsetal.,PNASUSA,90=2551-255(1993)；Jakobovitsetal.,Nature,362255~258(1993)；Bruggemannetal.,YearinImmuno.,7:33(1993))。人類抗體也可以在噬菌體展示文庫中生產(chǎn)(Hoogenboometal.，J.Mol.Biol.，227:381(1991)；Marksetal.，J.Mol.Biol.，222:581(1991))。Cote等和Boerner等的技術也描述了制備人類單克隆抗體的方法(Cole，etal.,"TheEBV-hybridomatechniqueanditsapplicationtohumanlungcancer.，，In,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,Volume27,ReisfeldandSell,eds.,pp.77-96,AlanR.Liss,Inc.,NewYork,N.Y.,(1985)；Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86_95(1991))。對于其中描述的方法，這些參考文獻通過引用將它們完全地合并在此。在此使用的抗體片段包括F(ab')2、Fab'和Fab片段，包括雜交片段?？贵w的這些片段保持了結合特異性PhtD多肽的能力。一些方法可以用于構建(ab)表達文庫(參見，例如Huse，etal.，1989Science246:1275_1281)來容許具有對PhtD多肽的期望特異性的單克隆F(ab)片段的快速和有效的鑒定。含有對多肽的獨特型的抗體片段可以通過本領域已知的技術來產(chǎn)生，包括但不限于(i)通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab')2片段；(ii)通過還原F(ab')2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段；(iii)通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的F(ab)片段，和(iv)F(v)片段。在此描述了包含PhtD的免疫原性多肽和藥學上可接受的載體的組合物。任選地，所述組合物進一步包含佐劑。包含免疫原性多肽的組合物可以含有其他免疫原性多肽的組合，包括，例如，免疫原性的鏈球菌屬多肽，或PspA、NanA、PsaA、肺炎球菌溶血素、PspC的免疫原性片段，或其任何組合。任選地，此處描述的組合物適合于向粘膜表面施用。例如，組合物可以是鼻噴霧齊U、噴霧器溶液、氣霧劑吸入物。因而，所述組合物可以存在于容器中，所述容器可以是鼻部噴霧器(sprayer)、噴霧器(nebulizer)或吸入器。藥學上可接受的載體表示不是生物學上或其它方面不希望的材料，即，所述材料可以與PhtD的免疫原性片段一起施用給受試者，而不引起任何不希望的生物學作用，或以有害的方式與含有它的藥物組合物中的任何其他成分相互作用。載體將自然地選擇，來最小化活性成分的任何降解，或最小化受試者中的任何不良副作用，這對于本領域技術人員是公知的。在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,21stEdition，DavidB.Troy,ed.，LippicottWilliams&Wilkins(2005)中描述了適合的載體和它們的制劑。一般地，合適數(shù)量的藥學上可接受的鹽在制劑中使用來使得制劑是等滲的。藥學上可接受的載體的實例包括，但不限于，無菌水、鹽水、緩沖溶液如Ringer's溶液和葡萄糖溶液。溶液的PH值一般從約5到約8，或從約7到約7.5。其他載體包括持續(xù)釋放制品，例如，含有免疫原性PhtD多肽的固體疏水性聚合物的半透性的基質?；|是處于有形物體的形式，例如，膜、脂質體或微粒。對本領域技術人員顯而易見的是，取決于例如給藥途徑和施用的組合物的濃度，某些載體可能是更優(yōu)選的。載體是適合于向人類或其他受試者施用PhtD免疫原性片段的那些。藥物組合物除了所述免疫原性多肽之外可以包括載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、佐劑、免疫刺激劑。藥物組合物還可以包括一種或更多種活性成分，例如，抗微生物劑、抗炎試劑和麻醉劑。還可以包括佐劑來刺激或增強對PhtD的免疫反應。佐劑的適合的類別的非限制性實例包括凝膠型的那些(即，氫氧化鋁/磷酸鹽(“白礬佐齊U”)、磷酸鈣、微生物來源的(胞壁酰二肽(MDP))、細菌外毒素(霍亂毒素(CT)、天然霍亂毒素B亞基(CTB)、大腸桿菌不穩(wěn)定毒素(LT)、白喉毒素(PT)、CpG寡核苷酸、BCG序列、破傷風類毒素、例如，大腸桿菌、明尼蘇達沙門氏菌(salmonellamirmesota)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)或Shigellaexseri的單磷酰脂質A(MPL))、顆粒佐劑(生物可降解的，聚合物微球體)、免疫刺激性復合物(ISCOMs))、油-乳劑和基于表面活性劑的佐劑(Freund's不完全佐劑(FIA)、微流化乳劑(MF59，SAF)、皂角苷(QS-21))、合成的(胞壁酰肽衍生物(莫拉丁酯，蘇氨酰(thre0ny)-MDP)、非離子嵌段共聚物(L121)、聚磷腈(PCCP)、合成的多核苷酸(polyA:U，polyI:C)、沙利度胺衍生物(CC-4407/ACTIMID))、RH3-配體或聚交酯乙交酯(PLGA)微球體，等等。任何這些毒素的片段、同源物、衍生物和融合物也是適合的，條件是它們保持了佐劑活性。例如在WO95/17211(Arg-7-LysCT突變體)、WO96/6627(Arg-192-GlyLT突變體)和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu_129_GlyPT突變體)中描述了佐劑的適合的突變體或變體?？梢栽诒景l(fā)明的方法和組合物中使用的另外的LT突變體包括，例如，Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-IIO-Asp和Glu-112-Asp突變體。金屬鹽佐劑例如白礬佐劑是本領域公知的，提供了具有佐劑活性的安全的賦形齊U。這些佐劑的作用機制被認為包括抗原貯藏庫的形成，從而抗原可以保持在注射的位置直到施用后3周，以及更容易被抗原遞呈細胞吸收的抗原/金屬鹽復合物的形成。除了鋁之夕卜，其他金屬鹽類已經(jīng)用于吸附抗原，包括鋅、鈣、鈰、鉻、鐵和鈹?shù)柠}。鋁的氫氧化物和磷酸鹽是最常見的。含有鋁鹽、抗原和另外的免疫刺激劑的制劑或組合物是本領域已知的。免疫刺激劑的實例有3-去-0-?；膯瘟柞Ｖ|A(3D-MPL)。一種或更多種細胞因子也可能是本發(fā)明的實踐中適合的共同刺激成分，作為本發(fā)明的組合物中含有的多肽、或為本發(fā)明組合物中含有的核酸所編碼(Parmiani，etal.ImmunolLett2000Sep15；74(1)41-3；Berzofsky,etal.NatureImmunol.1209-219)。適合的細胞因子包括，例如，白細胞介素_2(IL-2)(Rosenberg，etal.NatureMed.4:32卜327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(Pardoll，1992；Harries,etal.J.GeneMed.2000Jul-Aug；2(4)243-9；Rao,etal.J.Immunol.156:3357_3365(1996)綜述)、IL-15(Xin,etal.Vaccine,17:858_866，1999)、IL-16(Cruikshank,etal.J.LeukBiol.67(6):757-66，2000)、IL-18(J.CancerRes.Clin.Oncol.2001.127(12):718_726)、GM-CSF(CSF(Disis,etal.Blood，88:202_210(1996))、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或干擾素-Y(INF-Y)0其他的細胞因子也可能適合于實踐本發(fā)明，這是本領域已知的。趨化因子還可以用于幫助免疫反應的誘導或增強。例如，包含融合到腫瘤自體抗原的CXCLlO(IP-IO)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白已經(jīng)顯示了誘導抗腫瘤免疫(Biragyn，etal.NatureBiotech.1999，17:253_258)。趨化因子CCL3(ΜΙΡ-1α)和CCL5(RANTES)(Boyer,etal.Vaccine,1999,17(Supp.2):S53_S64)在實踐本發(fā)明中也可能是有用的。其他適合的趨化因子是本領域已知的。在某些實施方式中，目標免疫原可以作為核酸分子來使用，單獨的或作為遞送載體例如病毒載體的部分。在這些情況下，可能有益的是在本發(fā)明的組合物中組合目標免疫原和一種或更多種共同刺激成分，例如細胞表面蛋白、細胞因子或趨化因子。例如，共同刺激成分可以作為多肽或作為編碼多肽的核酸來包括在組合物中。適合的共同刺激分子包括，例如，結合CD28家族的成員(即CD28，ICOS；Hutloff,etal.Nature1999，397263-265；Peach,etal.JExpMed1994，180:2049_2058)的多肽，例如CD28結合^ΙB7.1(CD80；Schwartz,1992；Chenetal,1992；Ellis,etal.J.Immunol.,156(8)2700-9)和B7.2(CD86；Ellis,etal.J.Immunol.,156(8):2700_9)；結合整聯(lián)蛋白家族的成員(即，LFA-I(CDlla/CD18)；Sedwick,etal.JImmunoll999,1621367-1375；ffulfing,etal.Science1998,282-.2266-2269；Lub,etal.ImmunolToday1995，16:479_483)，包括ICAM家族的成員(S卩，ICAM-I,-2或-3)，的多肽；結合⑶2家族成員(S卩，⑶2，信號傳導淋巴細胞活化分子(CDw150或“51^^，，汸￥6『83，6{al.JImmunol1997，158:4036_4044)的多肽，例如CD58(LFA-3；CD2配體；Davis，etal.ImmunolToday1996，17177-187)或SLAM配體(Sayos，etal.Nature1998,395:462-469)；結合熱穩(wěn)定抗原(HSA或CD24；Zhou,etal.EurJImmunol1997,27:2524-2528)的多肽；結合TNF受體(TNFR)家族的成員(即，4_1BB(CD137；Vinay,etal.SeminImmunol1998，10:481_489)，0X40(CD134；Weinberg,etal.SeminImmunol1998,10:471_480；Higgins,etal.JImmunol1999,162486-493)，和CD27(Lens,etal.SeminImmunol1998，10:491_499))的多肽，例如4-lBBL(4-lBB配#；Vinay,etal.SeminImmunol1998,10481-48；DeBenedette,etal.JImmunol1997,158:551_559)，TNFR相關因子_1(TRAF-1；4-1BB配體；Saoulli,etal.JExpMed1998,1871849-1862,Arch,etal.MolCellBiol1998,18:558-565)、TRAF-2(4-lBB和0X40配體；Saoulli，etal.JExpMed1998,187:1849-1862；Oshima,etal.IntImmunol1998，10:517_526，Kawamata，etal.JBiolChem1998,273:5808-5814)、TRAF-3(4-1BB禾口0X40配體；Arch,etal.MolCellBiol1998，18:558_565Jang,etal.BiochemBiophysResCommun1998,242613-620；KawamataS,etal.JBiolChem1998，273:5808-5814)、0X40L(0X40配體；Gramaglia，etal.JImmunol1998,1616510-6517)、TRAF-5(0X40配體；Arch，etal.MolCellBiol1998,18558-565；Kawamata,etal.JBiolChem1998，273:5808_5814)和CD70(CD27配體；Couderc，etal.CancerGeneTher.,5(3):163_75)。CD154(CD40配體或“CD40L”;Gurunathan，etal.J.Immunol.,1998,1614563-4571；Sine,etal.Hum.GeneTher.,2001,121091-1102)也是適合的。除了共同刺激分子本身以外的刺激基序可以摻入到編碼TA的核酸中，例如CpG基序(Gurunathan,etal.Ann.Rev.Immunol.，2000，18:927_974)。這些試劑和方法、以及本領域技術人員公知的其他的，可以在本發(fā)明的實踐中使用。本發(fā)明的基本上無毒的、生物學活性的佐劑的其他實例包括激素、酶、生長因子或其生物學活性部分。這樣的激素、酶、生長因子或其生物學活性部分可以是人類、牛、豬、羊、犬、貓、馬或禽類來源的，例如，可以是腫瘤壞死因子(TNF)、催乳素、表皮生長因子(EGF)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、胰島素樣生長因子(IGF-I)、促生長素(somatotropin)(生長激素(growthfactor))或胰島素，或其受體在免疫系統(tǒng)的細胞上表達的任何其他激素或生長因子。提供的是生產(chǎn)和使用此處描述的免疫原性多肽的方法，和在這些方法中有用的組合物。多肽可以使用標準的分子生物學技術和表達系統(tǒng)來產(chǎn)生。(參見，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEditionbySambrooketal.，ColdSpringHarborPress,2001)0例如，編碼免疫原性多肽的基因的片段可以被分離，編碼免疫原性多肽的多核苷酸可以克隆到任何商業(yè)上可獲得的表達載體(例如，PBR322和pUC載體(NewEnglandBiolabs，Inc.，Ipswich,MA))或表達/純化載體(例如，GST融合物載體(Pfizer，Inc.，Piscataway,N.J.))中，然后在適合的原核、病毒或真核宿主中表達。然后，通過常規(guī)方法，或對于商售的表達/純化系統(tǒng)來說根據(jù)廠家的說明書，可以實現(xiàn)純化。提供了檢測PhtD表達來區(qū)分肺炎球菌肺炎與其他形式的肺炎的方法。世界上肺炎球菌的主要儲存地在于人類鼻部攜帶(nasalcarriage)。感染的獲得一般是來自攜帶者，感染之前總是鼻部攜帶。鼻咽部的定殖被認為是肺炎球菌傳播到下呼吸道、鼻竇和中耳的先決條件。為了測定肺炎球菌的疫苗的效力，必須的是知道哪些受試者帶有肺炎球菌肺炎，哪些沒有。診斷肺炎的標準方法是通過X射線或其他診斷，以及肺炎鏈球菌的陽性血液培養(yǎng)物。滿足這些指標的受試者被認為患有肺炎球菌肺炎。令人遺憾的是，這種方法錯過了患有肺炎球菌肺炎的百分之75到85的患者，因為估計僅15-25%的肺炎患者也具有菌血癥(Fedson，etal.，Vaccine17:Suppl.1:S11_18(1999)；OstergaardandAndersen，Chest1041400-1407(1993))。解決這個問題的一種方法是使用抗原檢測分析，其檢測尿液中的細胞壁多糖。該分析是更為敏感的，但是令人遺憾的是在12%的成年人和高達60%的兒童中具有假陽性。這是因為，由于患者中肺炎球菌的鼻部定殖而在他們的肺或血液中沒有肺炎球菌的疾病，分析目標有時存在于尿液中。因而，在此還提供的是檢測受試者中的肺炎球菌肺炎的方法，包括在來自受試者的樣品中檢測PhtD的存在，其中PhtD的存在表明受試者中的肺炎球菌細菌?？梢酝ㄟ^本領域技術人員已知的方法分析生物樣品例如體液中的PhtD濃度。在所述方法中使用的適合的體液包括但不限于血液、血清、粘液和尿液。還在此描述的是在受試者中降低肺炎球菌感染的風險的方法，包括向所述受試者施用PhtD的免疫原性片段，或其衍生物或變體。肺炎球菌感染包括，例如，腦膜炎、中耳炎、肺炎、敗血癥或溶血性尿毒癥。因而，這些感染的任何一種或更多種的風險可以通過此處描述的方法來降低。包含PhtD多肽的組合物可以口服地、胃腸外地(例如，靜脈內地)、肌內地、腹膜內地、經(jīng)皮地或局部地施用，包括鼻內施用或施用到呼吸系統(tǒng)的任何部分。如在此使用的，向呼吸系統(tǒng)施用意味著通過一個或兩個鼻孔或通過口腔向鼻子和鼻道遞送所述組合物，包括通過噴霧機制或液滴機制、通過氣霧化或插管法的遞送。所需的組合物和PhtD多肽的確切數(shù)量是受試者和受試者之間不同的，取決于受試者的物種、年齡、體重和一般狀況，使用的肽、和其施用的方式。因而，對每種組合物不可能指定確切的數(shù)量。然而，合適的數(shù)量可以由本領域普通技術人員根據(jù)此處的描述來確定。此外，可以使用多劑量的PhtD多肽，例如，在初次免疫和強化方案中。術語“單種抗體(antibody)”或“復數(shù)種抗體(antibodies)”包括處于未純化的或部分純化的形式(即，雜交瘤上清液、腹腔積液、多克隆抗血清)或處于純化形式的完整的或片段的抗體?！凹兓摹笨贵w是從起初與之一起存在的至少約50%的蛋白質中分離出的抗體(即，作為雜交瘤上清液或腹腔積液制品的部分)。優(yōu)選的，純化的抗體是從起初與之一起存在的至少約60%、75%、90%或95%的蛋白質中分離的。適合的衍生物可以包括片段(即，F(xiàn)ab、Fab2或單鏈抗體(例如，F(xiàn)v))，這是本領域已知的?？贵w可以是任何適合的來源或形式，包括，例如，鼠(即，通過鼠雜交瘤細胞產(chǎn)生的)，或表達為人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體，等等。制備和利用各種形式的抗體的方法是本領域技術人員公知的，在實踐本發(fā)明中將是合適的(參見，例如，Harlow,etal.AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988；Harlow,etal.UsingAntibodies:ALaboratoryManual,PortableProtocolNo.1,1998；KohlerandMilstein,Nature,256495(1975)Jonesetal.Nature，321:522-525(1986)；Riechmannetal.Nature,332323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2593-596(1992)；Verhoeyenetal.,Science,2391534-1536(1988)；Hoogenboometal.,J.Mol.Biol.,227381(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.,222581(1991)；Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86_95(1991)；Marksetal.,Bio/Technology10，779-783(1992)；Lonbergetal.,Nature368856-859(1994);Morrison,Nature368812-13(1994)；Fishwildetal.，NatureBiotechnology14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology14,826(1996)；LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；以及美國專利Nos.4，816，567;5，545，807；5，545，806；5，569，825；5，625，126；5，633，425；和5，661，016)。在某些應用中，抗體可以包含在雜交瘤上清液或腹腔積液中，并這樣直接地或在使用標準技術濃縮之后使用。在其他應用中，抗體可以使用例如鹽分級分離和離子交換層析、或利用與固相支持物例如瓊脂糖珠子共價連接的蛋白A、蛋白質G、蛋白A/G和/或蛋白L配體的親和層析，或這些技術的組合來進一步純化。抗體可以以任何適合的形式保存，包括，作為冷凍制品(即，-20°C或-70°C)、凍干的形式、或處于正常的冷藏條件下(即，4°C)。當以液體形式保存時，優(yōu)選的是使用適合的緩沖液，例如Tris-緩沖鹽水(TBS)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。示范性的抗體包括單克隆抗體IB12，由根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的規(guī)定、保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209，U.S.Α.的、給予的專利保藏名稱XXXXX的小鼠雜交瘤XXXXX產(chǎn)生；單克隆抗體4D5，由根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的規(guī)定、保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209，U.S.Α.的、給予的專利保藏名稱XXXXX的小鼠雜交瘤XXXXX產(chǎn)生；和單克隆抗體9Ε11，由根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的規(guī)定、保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209,U.S.Α.的、給予的專利保藏名稱χχχχχ的小鼠雜交瘤XXXXX產(chǎn)生。其他抗體，例如，包括含有這樣的抗體的腹腔積液、多克隆抗血清或其他制品也是期待的。包括這樣的抗體的制品可以包括在雜交瘤上清液或腹腔積液制品、部分地純化的制品或純化的制品中存在的未純化的抗體。因而，在此提供的是含有純化到約50%、60%、75%、90%或95%純度的抗體的抗體制品。一般地，這樣的制品包括緩沖劑，例如磷酸鹽或Tris-緩沖鹽水(分別，PBS或TBS)。還提供的是這樣的抗體的衍生物，包括片段(Fab、Fab2或單鏈抗體(例如，F(xiàn)v))、人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體，等等。編碼抗體的可變和高變片段的基因也可以從表達該抗體的雜交瘤中分離，克隆到表達載體來產(chǎn)生某些抗體制品(即，人源化抗體)。生產(chǎn)這樣的制品的方法是本領域公知的。熟練的技術人員擁有使用此處描述的抗體的許多適合的技術來鑒定含有抗體結合的蛋白質的生物樣品。例如，使用例如免疫沉淀或其他捕獲型的分析，可以利用抗體來分離PhtD蛋白。這種公知的技術通過將抗體附著到固相支持物或層析材料(即，包被有蛋白A、蛋白G和/或蛋白L的珠子)上來進行。結合的抗體然后導入含有或被認為含有PhtD蛋白質的溶液中。PhtD蛋白質然后結合于抗體，未結合的材料在一定條件下洗去，在所述條件中PhtD蛋白質保持與抗體結合。結合蛋白質然后可以從抗體中分離，按照需要來分析。利用抗體分離蛋白質的類似的方法是本領域公知的。還可以利用抗體來檢測生物樣品內的PhtD蛋白質。例如，可以在如流式細胞計分析、ELISA、免疫印跡(S卩，Western印跡)、原位檢測、免疫細胞化學和/或免疫組織化學的分析中使用抗體。進行這些分析的方法是本領域公知的。為了幫助熟練的技術人員使用所述抗體，它們可以以試劑盒形式來提供。提供了包括1B12、4D5和/或9E11，任選地包括使用所述抗體來檢測表達PhtD的細胞所需的其他成分的試劑盒。試劑盒的抗體可以以任何適合的形式提供，包括冷凍、凍干，或在藥學上可接受的緩沖劑例如TBS或PBS中。試劑盒還可以包括在體外或體內利用所述抗體所需的其他試劑，例如緩沖劑(即，TBS、PBS)、封閉試劑(包括脫脂奶粉、正常血清、Tween-20洗滌齊U、BSA或酪蛋白的溶液)和/或檢測試劑(即，山羊抗小鼠IgG生物素、鏈霉抗生物素蛋白-HRP綴合物、別藻藍蛋白、B-藻紅素、R-藻紅素、過氧化物酶、熒光劑(即，DyLight、Cy3、Cy5、FITC、HiLyteFluor555、HiLyteFluor647)和/或染色試劑盒(即，ABCStainingKit，PierCe))。試劑盒還可以包括其他試劑和/或在如上所述通常利用的分析中使用所述抗體的說明書，所述分析例如，流式細胞術分析、ELISA、免疫印跡(即，Western印跡)、原位檢測、免疫細胞化學、免疫組織化學。在一個實施方式中，所述試劑盒提供了純化形式的抗體。在另一個實施方式中，抗體以生物素化的形式單獨地、或與抗生物素蛋白-綴合的檢測試劑(即，抗體)一起地提供。在另一個實施方式中，所述試劑盒包括熒光標記的抗體，其可以用于直接檢測PhtD蛋白質。使用任何這些系統(tǒng)所需的緩沖劑等等是本領域公知的，可以由最終用戶制備或作為試劑盒的部分來提供。所述試劑盒還可以包括含有陽性_和陰性_對照蛋白質和/或組織樣品的固相支持物。例如，用于進行斑點或Western印跡型分析的試劑盒可以包括對照細胞或組織溶胞產(chǎn)物，用于含有預先固定的對照樣品、含有實驗樣品的另外的空間的SDS-PAGE或尼龍或其他膜中。用于在載玻片上的細胞中PhtD的可視化的試劑盒可以包括含有對照細胞或組織樣品、具有實驗樣品的另外的空間的預制的載玻片。抗體和/或其衍生物還可以摻入本發(fā)明的組合物中，用于體內或體外使用?？贵w或其衍生物還可以綴合到功能性部分，例如細胞毒素藥物或毒素，或其活性片段，例如白喉毒素A鏈、外毒素A鏈、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、伊諾霉素等等。功能性部分還可以包括放射化學物質。還可能的是使用此處描述的抗體作為藥物篩選分析中的試劑。例如，所述試劑可以用于確定藥物候選物對患者的生物樣品中鏈球菌屬細菌的存在的影響。表達型分析技術可以與高通量篩選技術組合來容許有用的化合物的快速鑒定和監(jiān)視藥物候選物的治療有效性(參見，例如，Zlokarnik,etal.，Science279,84-8(1998))。藥物候選物可以是化合物、核酸、蛋白質、抗體或其衍生物，無論是天然存在的還是合成衍生的。由此鑒定的藥物候選物可以用作藥物組合物用于向患者施用或用于進一步的篩選分析，等等。此處描述的抗體可以制備為可注射的制品，例如，在無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的懸浮液中?？梢岳玫倪m合的載體和溶劑包括水、Ringer's溶液，和等滲氯化鈉溶液、TBS和PBS，等等。在某些應用中，所述抗體適合于體外使用。在其他應用中，所述抗體適合于體內使用。在兩種情況都適用的制品是本領域公知的，將取決于特定的應用而變化。要注意的是，如在本說明書和附隨的權利要求中使用的，單數(shù)形式一(“a”、“an”)和該(“the”)包括復數(shù)的對象，除非上下文明顯地相反指示。因而，例如，提及抗原性片段包括抗原性片段的混合物，提及藥物載體或佐劑包括兩種或更多種這樣的載體或佐劑的混合物。如在此使用的，受試者或宿主是指個體。所述受試者可以包括馴養(yǎng)的動物，例如，貓和狗，家畜(例如，牛、馬、豬、綿羊和山羊)、實驗動物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)和鳥類。在一個方面，所述受試者是哺乳動物，例如靈長類或人類。任選的或任選地是指隨后描述的事件或狀況可以或可以不發(fā)生，該描述包括了當事件或狀況發(fā)生的情況和它不發(fā)生的情況。例如，用語任選地所述組合物可以包含組合，意思是該組合物可以包含不同分子的組合，或可以不包括組合，從而該描述包括了組合和不存在組合(即，組合的各個成員)兩者。范圍可以在此表示為從約一個特定值，和/或到約另一個特定值。當表述這樣的范圍時，另一個方面包括從一個特定值和/或到另一個特定值。類似地，當值通過使用前面的約表示為近似值時，要理解的是該特定值形成了另一個方面。要進一步理解的是，每個范圍的終點在與另一個終點相關，和獨立于另一個終點時都是重要的(significant)。當術語預防在此與給定的治療一起使用用于給定的狀況(例如，預防鏈球菌屬的感染)，這意味著表示治療的患者完全不發(fā)生臨床上可見水平的狀況，或比他/她沒有治療時更緩慢地發(fā)生、和/或在更低的程度上發(fā)生。無論如何，這些術語不僅僅限于患者沒有經(jīng)歷狀況的方面的情況。例如，如果治療在患者對刺激的暴露期間給予，所述刺激預計將產(chǎn)生所述狀況的給定的顯現(xiàn)，導致患者經(jīng)歷與否則預期的相比更少的或更輕微的癥狀，治療被稱為已經(jīng)預防所述狀況。通過使患者僅展示感染的輕微表現(xiàn)的癥狀，治療可以“預防”感染；這不意味著必需沒有任何細胞被感染微生物穿透。類似地，在此使用的降低與給定治療和感染風險一起使用(例如，降低肺炎球菌感染的風險)是指，與不存在治療(例如，施用免疫原性多肽)時發(fā)生感染的對照或基礎水平相比，受試者發(fā)生更慢的或更低程度的感染。感染風險的降低可以導致患者僅顯示感染的輕微表現(xiàn)的癥狀或延遲的感染癥狀；這不意味著必需沒有任何細胞被感染微生物穿透。本發(fā)明的進一步的實施方式和特征在以下非限制性實例中提供。實施例上述公開一般地描述了本發(fā)明。參考以下具體實施例可以獲得更完整的理解。僅僅為了例示的目的而不是限制本發(fā)明的范圍而描述這些實施例。形式上的改變和等效物的替換是預期的，因為環(huán)境可以暗示或導致適宜。雖然在此已經(jīng)采用了特定的術語，這種術語意圖是描述性的意義，而不是為了限制的目的。在本發(fā)明的一個實施方式中，在此提供的是分離的截短的PhtD多肽，來自1997年6月27日作為ATCC55987保藏的肺炎鏈球菌血清型6菌株14453，和/或具有SEQIDNO1所列的序列。在本發(fā)明中描述的PhtD截短物涵蓋類似于或不類似于PhtB中的區(qū)域的蛋白質的區(qū)域，因而分別含有潛在的交叉反應性和獨特的表位。截短的蛋白質在大腸桿菌中作為重組的帶His標簽的衍生物表達以便于純化，隨后使用Ni2+-NTA親和層析來純化。實施例1重組PhtD截短的蛋白質的克隆和生產(chǎn)該實施例描述了phtD的截短的版本從肺炎鏈球菌血清型6菌株14453克隆到質粒pET28a(+)中，從而表達產(chǎn)物具有N-末端6XHis標簽。PhtD的截短的形式也可以如SEQIDNO:2、3和4(蛋白質)以及SEQIDNO:5、7和9(DNA)中說明的沒有N-末端6XHis標簽地表達。在擴增此處描述的序列中使用的引物在表3中示出^t3PCR引物引物名稱/編號序列5’一3’，限制性位點是下劃線的Spn0215CTAGCCATGGGACATCATCATCATCATCACTGGGTACCAGATTCAAGACCAG(SEQIDNO.11)Spn0216CTAGCCATGGGACATCATCATCATCATCACGTCAAGTACTATGTCGAACATCC(SEQIDNO.12)Spn0217CTAGCCATGGGACATCATCATCATCATCACCATGTTCGTAAAAATAAGGTAGAC(SEQIDNO.13)SpnO176TGGCCTCGAGTTACTACTGTATAGGAGCCGGTT(SEQIDNO.14)截短物#1簡短而言，使用HighFidelityAdvantage2聚合酶(BD)從肺炎鏈球菌血清型6菌株14453基因組PCR擴增phtDTl基因。PCR引物Spn0215和SpnO176分別將NcoI禾口XhoI限制性位點導入5’和3’末端(參見表3)。5’引物Spn0215還導入N-末端His標簽。PCR產(chǎn)物使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化，隨后在瓊脂糖凝膠上跑動用于利用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。PCR產(chǎn)物和pET28a(+)載體(Novagen)都用NcoI和XhoI消化，隨后利用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中純化。消化的載體和基因然后使用T4DNA連接酶(Invitrogen)連接在一起。連接混合物轉化到化學感受態(tài)的大腸桿菌DH5α中，通過在含有50μg/ml卡那霉素的Luria瓊脂上平鋪來選擇陽性克隆。每個構建體選擇四個集落，使用QIApr印SpinMinipr印試劑盒(Qiagen)分離質粒DNA。進行Ncol/Xhol消化來確定哪些克隆具有正確大小的片段。根據(jù)限制性分析，所有四個克隆是正確的，然后使用QIAfilterPlasmidMidi試劑盒(Qiagen)從一個陽性克隆(#1)分離Midipr印DNA，DNA測序來確保沒有引入克隆假象。這個克隆稱為pBAC30。PhtDTl以高水平在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，如在SDS-PAGE凝膠中大約56.IkDa的正確大小的強烈條帶所看出的。蛋白質表達用ImMIPTG誘導2小時。截短物#2還使用HighFidelityAdvantage2聚合酶(BD)從肺炎鏈球菌血清型6菌株14453基因組PCR擴增phtDT2基因。PCR引物Spn0216和SpnO176分別將NcoI和XhoI限制性位點導入5’和3’末端(參見表3)。5’引物Spn0216還導入N-末端His標簽。PCR產(chǎn)物使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化，隨后在瓊脂糖凝膠上跑動用于利用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。PCR產(chǎn)物和pET28a(+)載體(Novagen)都用NcoI和XhoI消化，隨后利用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中純化。消化的載體和基因然后使用T4DNA連接酶(Invitrogen)連接在一起。連接混合物轉化到化學感受態(tài)的大腸桿菌DH5ci中，通過在含有50μg/ml卡那霉素的Luria瓊脂上平鋪來選擇陽性克隆。使用QIApr印SpinMinipr印試劑盒(Qiagen)從選定的克隆分離質粒DNA。進行Ncol/Xhol消化來確定哪些克隆具有正確大小的片段。然后使用QIAfilterPlasmidMidi試劑盒(Qiagen)從一個陽性克隆分離MidiprepDNA，測序來確保沒有引入克隆假象。這個克隆稱為PBAC31。PhtDT2蛋白質在大腸桿菌BL21(DE3)中以高水平表達，如在SDS-PAGE凝膠中大約19.3kDa的強烈條帶所看出的。蛋白質表達用ImMIPTG誘導2小時。截短物#3還使用HighFidelityAdvantage2聚合酶(BD)從肺炎鏈球菌血清型6菌株14453基因組PCR擴增phtDT3基因。Spn0217和Spn0176分別將NcoI和XhoI限制性位點導入5'和3'末端(參見表3)。5’引物Spn0217還導入N-末端6XHis標簽。PCR產(chǎn)物使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化，隨后在瓊脂糖凝膠上跑動用于利用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。PCR產(chǎn)物和pET28a(+)載體(Novagen)都用NcoI和XhoI消化，隨后利用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中純化。消化的載體和基因然后使用T4DNA連接酶(Invitrogen)連接在一起。連接混合物轉化到化學感受態(tài)的大腸桿菌DH5ci中，通過在含有50yg/ml卡那霉素的Luria瓊脂上平鋪來選擇陽性克隆。選擇菌落，使用QIApr印SpinMinipr印試劑盒(Qiagen)分離質粒DNA。進行Ncol/Xhol消化來測定哪些克隆具有正確大小的片段。然后使用QIAfilterPlasmidMidi試劑盒(Qiagen)從一個陽性克隆分離Midipr印DNA，測序來確保沒有引入克隆假象。這個克隆稱為pBAC32。PhtDT3蛋白質在大腸桿菌BL21(DE3)中以高水平表達，如在SDS-PAGE凝膠中大約16.7kDa的強烈條帶所看出的。蛋白質表達用ImMIPTG誘導2小時。截短的多肽的氨基酸序列顯示如下從DBAC30表汰的包括His標簽(下劃線的)的PhtD截短物1MGHHHHHHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKV⑶GYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEWFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.15)從DBAC31表汰的包括His標簽(下劃線的)的PhtD截短物2MGHHHHHHVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.16)從PBAC32表汰的句,括His標簽(下劃線的)的PhtD截短物3MGHHHHHHHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO.17)PhtD截短物的結構表征和與全長PhtD的比較純化的PhtD截短物1、2和3各自通過生物化學和生物物理學手段來表征，獲得的結果與全長PhtD蛋白質(缺乏信號序列)組(lots)的分析所獲的特征數(shù)據(jù)比較。進行以下分析圓二色(CD)光譜法、內在熒光光譜法、分析性超速離心(AUC)、伴有多角度光散射檢測的大小排阻層折(SEC-MALS)和差示掃描量熱術(DSC)。這些分析的結果在以下的表4中概述。表4=PhtD和PhtD截短物的表征結果的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*在280nm和295nm的激發(fā)頻率下Tm，熱轉變中點根據(jù)表4中概述的表征結果，PhtD截短物1具有與全長PhtD類似的、但不相同的總體溶液結構，而PhtD截短物2和3的結構是不同的。在PhtD的DSC分析中觀察到的多個熱轉變是存在多個(即，三個)結構域的暗示。PhtD截短物1的DSC結果顯示了2個轉變，表明截短物除去了這些結構域之一。PhtD截短物2和3具有相似的總體結構，DSC結果顯示了高度熱穩(wěn)定的單個結構域的存在。這些結果顯示了截短物處于折疊構象中。實施例2單克隆抗體使用標準方法由ImmunoPrecise(Victoria，BC，Canada)產(chǎn)生針對多種Pht蛋白質(即，PhtD、PhtA、PhtB、PhtE)的單克隆抗體。為了產(chǎn)生單克隆抗體，小鼠用各種蛋白質免疫，使用標準方法分離分泌具有特異性的抗體的雜交瘤。對PhtD、PhtA,PhtB和PhtE的每一種產(chǎn)生多個雜交瘤克隆。對于PhtD，小鼠用重組產(chǎn)生的PhtD全長蛋白質(帶His標簽并缺乏信號序列)免疫。重組產(chǎn)生的PhtD蛋白質來自肺炎鏈球菌菌株TIGR4(保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所，ATCCBAA-334)。用于免疫小鼠的PhtD蛋白質的氨基酸序列SEQIDNO:24在下文中列出，相應的核苷酸序列是SEQIDN0:23。重組PhtD蛋白質序列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSSYELGRHQAGQVKKESNRVSYID⑶QAGQKAENLTPDEVSKREGINAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVNEIKGGYVIKVDGKYYVYLKDAAHADNIRTKEEIKRQKQEHSHNHGGGSNDQAVVAARAQGRYTTDDGYIFNASDIIEDTGDAYIVPHGDHYHYIPKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPSSSSSYNANPAQPRLSENHNLTVTPTYHQNQGENISSLLRELYAKPLSERHVESDGLIFDPAQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQMSELEKRIARIIPLRYRSNHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKV⑶GYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEALDNLLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEffFDEGLYEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQIDNO24)a.交叉反應性對不同的Pht蛋白質產(chǎn)生的每種單克隆抗體的交叉反應性使用來自雜交瘤的上清液通過ELISA來評估。ELISA的結果以下在表5中列出。產(chǎn)生的單克隆抗體的每一個(例如，PhtD)在ELISA中篩選對引發(fā)它的特定Pht蛋白質(如在表4中鑒定的為“自身”)的反應性，和對Pht蛋白質的組合(例如，PhtA和PhtE，在表5中鑒定為“A，E”)的反應性。對每個Pht蛋白質產(chǎn)生的雜交瘤克隆的總數(shù)在表5中在“免疫蛋白”列的應用的Pht蛋白的格中注明(例如，對PhtD產(chǎn)生14個雜交瘤克隆)。篩選中使用的Pht蛋白質是重組的完整蛋白質。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>在來自交叉反應性篩選(通過ELISA)的結果的基礎上，選擇了許多抗體用于進一步的分析，包括雜交瘤克隆9E11、4D5和IB12。雖然克隆9E11、4D5和IB12的每一個是針對PhtD產(chǎn)生的，克隆9E11在交叉反應性篩選中被測定僅具有對PhtD的特異性，而克隆4D5和IB12各自被發(fā)現(xiàn)具有對PhtA、B和D的特異性。b.表位作圖使用變性SDS-PAGE/Western印跡進行表位作圖。確定的是，克隆4D5和9E11各自產(chǎn)生結合PhtD的截短物3片段的線性表位的mAbs。在Western印跡之前PhtD的截短物3片段的蛋白水解消化顯示了，mAb9E11所識別的線性表位處于與截短物3片段(以及全長PhtD蛋白質的相應氨基酸序列)的氨基酸1到101(SEQIDNO26)相應的序列之內。使用PhtD的截短物1、2和3通過ELISA進一步測試每個克隆(S卩，克隆9E11、4D5和IB12)的mAbs證實了通過Western印跡對每個克隆確定的特異性，以及鑒定的mAb克隆(1B12)具有對T3截短物的特異性。c.被動保護在本發(fā)明的進一步的實施方式中，評估了克隆9E11、4D5和IB12的每一個產(chǎn)生的mAb的保護動物對抗肺炎鏈球菌攻擊的能力。進行初步的實驗來測試在兔中各自針對全長PspA、PhtB或PhtD產(chǎn)生的抗體提供對抗肺炎鏈球菌感染的被動保護的能力。在這項研究中，在50cfu的肺炎鏈球菌菌株A66.1的靜脈內施用前1小時，CBA/n小鼠的組用兔抗PspA、抗PhtB、或抗PhtD血清(110稀釋)的腹膜內劑量預先處理。對于用抗體(即，PspA、PhtB或PhtD)預先處理的每個組，100%的動物存活。相反，用預出血的(prebleed)兔PspA血清預處理的動物的1/20存活，用預出血的兔PhtB血清預處理的動物的0/10存活，用預出血的兔PhtD血清預處理的1/25的動物存活。進行的被動保護研究使用了早先開發(fā)的被動保護模型。所述模型利用CBA/CaHN-Btkxid/J小鼠，已知其對肺炎鏈球菌的感染是高度敏感的，涉及在50cfu的肺炎鏈球菌菌株A66.1的靜脈內施用之前1小時、被研究抗體的腹膜內的施用。施用的攻擊劑量在攻擊之前和之后驗證。監(jiān)視死亡率14天，來自幸存小鼠的血液平鋪來確認細菌清除。在實驗中，克隆4D5和9E11產(chǎn)生的mAbs使用被動免疫模型各自測試。使用了5只小鼠的組。三個組腹膜內施用400μg的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的4D5mAb，或PBS中的9EllmAb，或PBS(即，陰性對照組)。陽性對照組施用兔抗PhtD。每個組施用50cfu的肺炎鏈球菌菌株A66.1的攻擊劑量。用克隆4D5產(chǎn)生的mAb免疫的百分之八十的動物存活于攻擊劑量，用mAb9E11免疫的百分之百的動物存活于攻擊劑量。在用PBS“免疫”后沒有動物存活，而用兔抗PhtD免疫的動物的百分之百存活于攻擊劑量。在獨立的實驗中，使用被動免疫模型測試了mAbIB12。PBS中的^OyglB12mAb經(jīng)由腹膜內途徑施用，隨后施用50cfu的肺炎鏈球菌菌株A66.1的攻擊劑量。對于已經(jīng)用mAbIB12免疫的組，通過(through)第3天百分之百的動物存活于攻擊劑量，通過第14天(即，測試的極限)百分之八十的動物存活于攻擊劑量。用PBS“免疫”的組中的動物都沒有存活過第1天，而在陽性對照組(即，用兔抗PhtD血清免疫的)中的每個動物通過第14天存活于攻擊劑量。還進行了劑量研究。使用同樣的攻擊模型，在50cfu的肺炎鏈球菌菌株A66.1的攻擊劑量施用之前一小時，動物用？83中的40(^8、20(^8、10(^8或5(^8mAb9E11免疫。陰性對照組在攻擊之前施用PBS，陽性對照組在攻擊之前施用兔抗PhtD血清(110稀釋度)。在14天后，在400μg劑量后60%的小鼠存活；在200μg劑量后20%存活；在100μg或50μg劑量后沒有動物存活。對于施用400μg劑量的組，存活率在第6天跌至80%，到第9天跌至60%。對于施用200μg劑量的組，存活率在第3天跌至60%，到第5天跌至20%。對于施用IOOyg劑量的組，存活率在第2天跌至20%，到第3天跌至0%。因而，對于施用400μg劑量的組(60%存活率)和施用200μg劑量的組(20%存活率)，觀察到14天存活率的提高。使用mAb4D5進行了類似的劑量研究。在50cfu的肺炎鏈球菌菌株A66.1的攻擊劑量施用之前一小時，動物用PBS中的400μg、200yg、100yg或50μgmAb4D5免疫。14天后，在400yg劑量后100%的小鼠存活，更低劑量或對照(PBS)的沒有存活。在200μg劑量后到第2天百分之百的動物存活；到第2天存活60%，到第3天20%存活。因而，在施用400μg劑量的組(100%存活率)和施用200μg劑量的組(到第3天20%存活率)，觀察到14天存活率的提高。d.mAbs的協(xié)同效應進行研究來測試mAbs協(xié)同地作用的能力。使用同早先的研究中相同的被動保護模型。使用八組小鼠(每組5只)，在攻擊劑量之前施用100μg4D5mAbs、200yg4D5mAbs、IOOyg9EllmAbs、200yg9EllmAbs、200μg的由9E11禾口4D5的每一種100μg構成的庫、PBS(即陰性對照)、兔抗PspA血清(即陽性對照)或400yg的IB12mAbs。發(fā)現(xiàn)的是，含有4D5和9E11抗體每種100μg的200μg總劑量提供了100%的保護到14天(即，測試的極限)。相比之下，單獨的200μgmAbs4D5或9E11分別提供了在第14天時僅20%和40%的存活率。4D5的100μg劑量提供了通過第1天的100%存活率(如PBS)，和通過第2天的60%存活率，其在第3天跌至20%存活率(這維持通過第14天)。mAb9E11的IOOyg劑量提供了通過第1天的100%存活率(如PBS的)，通過第2天的80%存活率，通過第3天的60%存活率，和第4-6天的20%存活率，其然后跌至零。隨后的實驗確認了這種協(xié)同效應，其數(shù)據(jù)在下文的表6中示出。在這項研究中，動物組施用了改變濃度的mAb庫(即，等量的9E11和4D5mAbs的庫)的劑量。表爐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>天Γ~2Γ~3Γ15Γ~678910ΓΓ1213~|14~PBSIOO-O000000000000~PspA100~100100100~100~100~100~100100100100~100100~100200Ρ100~100100100~100~100~100~100100100100~100100~100~~00Ρ100~100100806060606060606060606050Ρ100~1008060402000000000~25Ρ100602000000000000~*PBS磷酸鹽緩沖鹽水；PspA抗全長PspA；200P:4D5和9E11的200μg庫；100P4D5和9E11的100μg庫；50P:4D5和9E11的50μg庫；25P:4D5和9E11的25μg庫。如表6中所示，對每種劑量觀察到協(xié)同效應。雖然早先沒有測試25yg劑量，25yg的組合的劑量提供了到第3天的20%存活率。在早先的實驗中，mAb4D5或9E11的50μg的劑量具有與PBS劑量(即陰性對照)的基本上相同的結果。這些實驗展現(xiàn)了4D5和9E1ImAbs可以各自用于提供對肺炎鏈球菌感染的保護。這些實驗還展現(xiàn)了由mAbs4D5和9E11的組合給藥引起的令人驚訝的協(xié)同效應，其超過了組合單獨抗體的預想的疊加效應。此處描述的單克隆抗體可以單獨地或組合地使用。雖然已經(jīng)就優(yōu)選的實施方式描述了本發(fā)明，要理解的是，本領域技術人員將想到變體和修改。因而，希望的是，附隨的權利要求覆蓋了所有這些等價的變體，其被包括在要求權利的本發(fā)明的范圍之內。參考文獻AdamouJE,HeinrichsJH,ErwinAL,WalshW,GayleT,DormitzerM,DaganR,BrewahYA,BarrenP,LathigraR,LangermannS,KoenigS,JohnsonS.2001."IdentificationandCharacterizationofaNovelFamilyofPneumococcalProteinsThatAreProtectiveagainstSepsis.“InfectImmun.69:949-958.HamelJ,CharlandN,PineauI,OuelletC,RiouxS,MartinD,BrodeurBR.2004."PreventionofPneumococcalDiseaseinMiceImmunizedwithConservedSurface-AccessibleProteins·，，InfectImmun.722659-2670.`OgunniyiAD,GrabowiczΜ,BrilesDE,CookJ,PatonJC.2007."DevelopmentofavaccineagainstinvasivepneumococcaldiseasebasedoncombinationsofvirulenceproteinsofStreptococcuspneumoniae·，，InfectImmun.75:350-357.ZhangY，MasiAW,BarniakV，MountzourosK，HostetterMK,GreenBA.2001.“RecombinantPhpAprotein，auniquehistidinemotif-containingproteinfromStreptococcuspneumoniae，protectsmiceagainstintranasalpneumococcaldisease.，，InfectImmun.69:3827_3836·GuiImi,etal.NewapproachestowardstheidentificationofantibioticandvaccinetargetsinStreptococcuspneumoniae.EMBOreports3，8，728-734(2002)UnitedStatesPatent7，122，194.Johnson，et.al.October17,2006.TitleVaccinecompositionscomprisingStreptococcuspneumoniaepolypeptideshavingselectedstructuralmotifsUnitedStatesPatent6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.權利要求81的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體特異性結合由SEQIDNO:26組成的肽。83.一種單克隆抗體，其特異性地結合與SEQIDNO:26具有至少90%的同一性的肽。全文摘要在此提供的是用于引發(fā)針對肺炎鏈球菌的免疫反應的組合物和方法。更特別地，所述組合物和方法涉及免疫原性多肽，包括PhtD的片段和其變體，以及編碼或表達所述多肽的核酸、載體和轉染的細胞。還描述了產(chǎn)生和利用所述免疫原性多肽的方法。文檔編號C12P21/08GK101802198SQ200880108203公開日2010年8月11日申請日期2008年7月23日優(yōu)先權日2007年7月23日發(fā)明者J·耶雄,M·奧赫斯,R·夏爾博瓦,R·布魯克斯申請人:圣諾菲·帕斯圖爾有限公司