專利名稱：：抗cd4和趨化因子受體結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的抗體及其抵抗hiv感染的應(yīng)用的制作方法發(fā)明概述本發(fā)明涉及按照所述的方法及篩選步驟以能表達CD4的T淋巴細胞，例如外周血單核T細胞，胸腺細胞，脾細胞和白血病或淋巴瘤衍生的T細胞系例如HPB-ALL或SUP-T細胞作為免疫原生產(chǎn)的單克隆抗體。本發(fā)明單克隆抗體的特性在于其能在體內(nèi)或體外中和人類免疫缺陷病毒(HIV)及相關(guān)的免疫缺陷病毒的原代分離物。此抗體是針對含有與趨化因子受體的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CD4蛋白質(zhì)的宿主細胞抗原復(fù)合物的，對第一型的HIV(HIV-1)所有分化體的原代分離物和第二型的HIV(HIV-2)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的原代分離物具有廣泛的中和活性。本發(fā)明也涉及篩選及制造此種抗體的方法，能分泌此類抗體的雜交瘤，含有此抗體的藥物組合物和在靈長類，包括人類中，用此類抗體在接觸病毒前后預(yù)防免疫缺陷病毒所造成的感染，此類抗體的原靶為可表達CD4的淋巴細胞。
背景技術(shù)：
：距發(fā)現(xiàn)HIV為獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)病毒以來已有12年，而對艾滋病毒的分子克隆和表征也已有10年，盡管有許多的研究致力于疫苗的開發(fā)，但對HIV疫苗及其免疫療法的發(fā)展仍存在許多的困難。這些障礙包括HIV-1的變異性，病毒的多種傳染途徑/方式，以及有關(guān)預(yù)防HIV感染所必需的免疫反應(yīng)知識的不足。在1995年7月28日發(fā)表的一篇文章(細胞82:175-176)中，DavidBaltimore要所有這個領(lǐng)域中的科學(xué)家退一步想為什么在動用了美國國家衛(wèi)生院(NIH)10％的預(yù)算后，對于此種病毒感染仍一無所知。早期對有效的重組HIV-1外殼亞單位疫苗(如gp120和gp160疫苗產(chǎn)品)抱持樂觀的態(tài)度，因在數(shù)次臨床試驗中的疫苗血清能在體外中和實驗室所分離出的HIV-1(Belshe等人，JAMA,1994,272:475；Keefer等人，AIDSResHumRetroviruses,1994,10:1713)。但此種樂觀態(tài)度不久即因疫苗血清無法中和由病人體內(nèi)分離出的HIV-1原代分離物而有所動搖(Hanson,AIDSResHumRetroviruses,1994,10:645；Mascola等人，傳染病雜志，1996,173:340)。這些令人失望的結(jié)果使得NIH在1994年6月決定延緩進行數(shù)種基于重組外殼蛋白質(zhì)的HIV亞單位疫苗的昂貴的大型功效試驗。HIV-1的原代分離物獲自病人外周血單核細胞(PBMCs)或具有未感染的PBMCs的血漿所作的有限培育。它們非常類似能感染人類的HIV株(Sawyer等人，病毒學(xué)雜志，1994,68:1342；Cornelissen等人，病毒學(xué)雜志，1995,69:1810)。HIV-1的原代分離物可很容易與常用的已適應(yīng)實驗室環(huán)境的親T型細胞的病毒如Ⅲb/LAI,SF2，和MN，區(qū)分開來，這些病毒已在人類T淋巴樣細胞系中生存了好幾代的時間且已完全能適應(yīng)在這些T細胞系中生長。首先，大部分原代分離物為親M細胞的病毒。它們不易在培養(yǎng)的T細胞系中生長，相反，雖然它們也可以感染初級T細胞，但一般而言這類病毒是親單核細胞或巨噬細胞的(Cheng-Mayer等人，科學(xué)，1988,240:80)。其次，原代分離物對由重組可溶性形式的病毒受體蛋白質(zhì)CD4(rsCD4)所作的體內(nèi)中和具有相當(dāng)高的抗性，需要比實驗室株多200-2700倍的rsCD4(Daar等人，PNASUSA,1990,87:6574-6578)。第三點，原代分離物對以gp120疫苗所引發(fā)的中和性抗體也具有抗性(Mascola等人)。原代分離物包括可在PBMC培養(yǎng)中誘發(fā)合胞體形成的合胞體誘發(fā)分離物(SI)和非合胞體誘發(fā)(NSI)分離物兩種。在SI原代分離物中，大部分能在對HIV-敏感的T細胞系MT2中進行復(fù)制，但少數(shù)可在寬容性較小且已轉(zhuǎn)化的T細胞系如CEM或H9中進行復(fù)制，這些細胞一般用來培養(yǎng)適于實驗室生存的分離物。非合胞體誘發(fā)(NSI)原代分離物只能在外周血的初級T細胞中進行培養(yǎng)。早期對艾滋病疫苗的樂觀態(tài)度一方面也來自猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的滅活病毒制品。SIV與HIV-1在外觀，基因排列，感染及疾病發(fā)展過程均極為類似，因此使得SIV在恒河猴中的感染成為探索不同艾滋病疫苗策略的一種極佳的模型。以此模型所作的早期研究顯示在人類T細胞系中生長且在佐劑中配制的SIV的滅活制品可保護實驗接種了以人類細胞培育出的高感染性SIV病原性變體的恒河猴不受病毒的感染(Desrosiers等人，PNASUSA,1989,86:6353-6357；Murphey-Corb等人，科學(xué)，1989,246:1293)。意料之外的是，當(dāng)用在同源性猴子細胞上生長的SIV原種來攻擊免疫的動物時這種保護作用就喪失了。稍后由以猴子細胞培育的SIV和未感染的人類細胞進行的免疫研究中發(fā)現(xiàn)在那些早期SIV研究中對病毒感染的保護作用可能是因其刺激了對異種人類宿主細胞蛋白質(zhì)而非病毒編碼抗原的免疫應(yīng)答所致(Stott，自然，1991,353:393)。牽涉到SIV的被動免疫實驗中的一些證據(jù)顯示某些抗細胞抗體在缺乏細胞介導(dǎo)的免疫下可能對SIV所造成的感染有保護作用(Gardner等人，AIDSResHumRetroviruses,1995,11:843-854)。由抗細胞抗體所提供的對SIV感染的保護性免疫機制目前仍不清楚。由抗細胞抗體所介導(dǎo)的對SIV感染的保護作用的可能機制之一牽涉到與病毒結(jié)合的細胞蛋白質(zhì)。已知免疫缺陷病毒如HIV和SIV均會與細胞蛋白質(zhì)結(jié)合，此蛋白質(zhì)可能得自當(dāng)病毒由宿主細胞膜上芽生時的宿主細胞。某些與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合的細胞蛋白質(zhì)，β2-微球蛋白，HLA-DR，和第Ⅰ類HLA分子的抗體，參與體外中和SIV和HIV-1的實驗室株(Arthur等人，科學(xué)，1991,258:1935)。除了與MHC結(jié)合的表面蛋白質(zhì)外，Montefiori等人(病毒學(xué)，1994,205:82；AIDSResHumRetroviruses,1995,11:1429)最近在以人類細胞培育的SIV及HIV-1病毒表面上鑒別出三種補體控制蛋白質(zhì)，CD46,CD55，和CD59，因此出現(xiàn)了這些宿主細胞分子也可被病毒利用作為躲避補體病毒溶解機制的可能性。另一抗細胞抗體的保護機制可能是通過以一種以前所不知道的方式抑制免疫缺陷病毒對免疫系統(tǒng)細胞的活性介導(dǎo)的。似乎有一種與宿主T細胞表面CD4結(jié)合的宿主細胞抗原復(fù)合物能促進病毒的結(jié)合和進入，進而成為保護性抗細胞抗體的靶。在本發(fā)明仍在進行的階段中，近來也有報導(dǎo)指出除了宿主抗原復(fù)合物上的CD4受體能與HIV結(jié)合外，其它因子或HIV共同受體也能影響HIV的復(fù)制，進入或融合。這些包括由CD8+T細胞所產(chǎn)生的三種能抑制HIV的趨化因子(Cocchi等人，科學(xué)，1995,270:1811-1815)；一種在表達CD4的細胞上的親T型而非親M型的HIV-1融合和進入的CXC-CKR4共同受體(亦稱為融合素或LESTR)(Feng等人，科學(xué)，1996,272:873)，能結(jié)合三種抑制性趨化因子(Cocchi等人)之β-趨化因子受體CC-CKR5以作為親M型而非親T型的HIV-1的共同受體(Doranz等人，細胞，1996,85:1149；Dragic等人，自然，1996,381:667；Choe等人，細胞，1996,85:1135；Deng等人，自然，1996,381:661；Alkhatib等人，科學(xué)，1996,272:1955)，及作為親M和雙親性HIV共同受體的其它β-趨化因子受體(CC-CKP2b和CC-CKR3)(Doranz等人，細胞，1996,85:1149)。據(jù)報導(dǎo)這些共同受體是與以前描述的G蛋白偶聯(lián)且具有七個跨膜區(qū)段的受體(Loetscher等人，生物化學(xué)雜志，1994,264:232；Samson等人，生物化學(xué)，1996,35:3362)。為了能更精確地鑒別這種能引發(fā)保護反應(yīng)的推定的細胞蛋白質(zhì)，且更好地表征由抗細胞抗體所介導(dǎo)的保護作用機制，本發(fā)明人針對抗多種細胞抗原β2-微球蛋白，MHC第Ⅰ類HLAA,B,C分子及MHC第Ⅱ類HLADR蛋白質(zhì)，和其它與T細胞系有關(guān)的T細胞抗原的一組單克隆抗體的成員鑒定了其中和HIV的活性，以鑒別出那些能在體外微小空斑中和測定中能夠中和HIV原代分離物的抗體。實驗?zāi)康氖菧y定那些具有此種活性之抗體的中和活性的范圍；并確定在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ椭写朔N體外活性是否可以被有效地轉(zhuǎn)換成體內(nèi)活性。這些實驗的結(jié)果顯示，除了針對包含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物的抗體外，沒有任何一種其它抗細胞抗體(排除CD4特異性抗體)，能在中和測定中有效地中和HIV原代分離物。這些結(jié)果也顯示針對包含與趨化因子受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物的抗體能促進與rsCD4的結(jié)合。再者，被鑒別出具有所需性質(zhì)的抗體能抑制猴子體內(nèi)SIV所引起的感染及小鼠體內(nèi)HIV-1對重組的人類免疫系統(tǒng)的感染。本發(fā)明的簡要說明本發(fā)明首次提供的抗體及其同源物可以(1)抑制HIV與表達CD4的細胞之間的結(jié)合，(2)抑制HIV誘發(fā)的在表達CD4的細胞間的合胞體形成，(3)有效中和由第Ⅰ型HIV的所有分化體，及各種第Ⅱ型HIV和SIV中分離出的原代分離物對CD4陽性細胞的體外感染，(4)在接觸這些病毒之前或之后有效中和HIV-1的原代分離物對CD4陽性細胞的體外感染，(5)當(dāng)這些抗體以非經(jīng)腸胃途徑施用，即靜脈或腹膜內(nèi)注射時，可以預(yù)防HIV和SIV的原代分離物對靈長類包括恒河猴及人類的感染，(6)以接觸前和接觸后方式預(yù)防HIV-1的原代分離物對經(jīng)人類外周血淋巴細胞重組的SCID小鼠(hu-PBL-SCID)的感染。因此本發(fā)明涉及可與表達CD4之人類細胞表面上的含CD4的人類宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合且具有中和HIV的原代分離物，即由患者身上所分離出且僅在外周血單核細胞(PBMC)中傳代不超過3-5次的病毒能力的抗體。更明確地說，本發(fā)明是關(guān)于針對存在于含有與趨化因子受體例如CC-CKR5的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CD4蛋白質(zhì)的宿主細胞抗原復(fù)合物上的抗原決定簇的抗體，能廣泛有效地中和所有HIV-1分化體的原代分離物及各種HIV-2和SIV的原代分離物。本發(fā)明也涉及經(jīng)靜脈內(nèi)和/或腹膜內(nèi)途徑以5-10×106表達CD4的細胞，優(yōu)選衍生自人類T白血病或淋巴瘤的細胞系例如來自患有T型急性淋巴母細胞白血病患者的HPB-ALL細胞，或來自患有T細胞非霍金氏淋巴瘤患者的SUB-T細胞免疫非人類哺乳動物制備此抗體的方法，清洗細胞后重新懸浮于PBS或佐劑如弗氏完全佐劑中；接著進行兩次以上的靜脈或腹膜內(nèi)注射5-10×106清洗后懸浮于無佐劑的PBS中的細胞。已知由免疫動物產(chǎn)生的抗體其血清抗體具有可結(jié)合下列物質(zhì)的能力1．rsCD4；2．具較強反應(yīng)性能與趨化因子受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的rsCD4；3．如在高分辨率熒光顯微鏡下所示呈帽狀分布的表達CD4的細胞包括HPB-ALL或SUP-T細胞的表面；4．以下任一肽衍生自rsCD4的AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375；和5．中和HIV的原代分離物。本發(fā)明的抗體可進一步表征為通過HIV或SIV的原代分離物在ED50＜50mg/Kg的濃度下感染靈長類動物或hu-PBL/SCID小鼠提供被動免疫。本發(fā)明也包括能分泌具有這些特性之抗體的雜交瘤。含這些抗體的預(yù)防及治療組合物，用于預(yù)防由那些原靶為表達CD4的淋巴細胞的感染因子所造成的靈長類動物，包括人類的免疫缺陷病毒感染。本發(fā)明的抗體及其同源物可識別含CD4分子，特別是當(dāng)與存在于CD4表達細胞上的其它趨化因子受體如CC-CKR5的結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，的宿主細胞抗原復(fù)合物上＂不連續(xù)的散布的構(gòu)象性＂表位。這些抗體結(jié)合在衍生自人類CD4四個胞外域中任一結(jié)構(gòu)域的合成模擬物(表1；SEQIDNO:1)上，所說的胞外域包括以下肽CD4的AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，和AA361-AA375。本發(fā)明也涉及抗體同源物。這些包括單克隆抗體，重組抗體，重組嵌合抗體(其抗體結(jié)構(gòu)域來自某種動物且與人類抗體結(jié)構(gòu)域或人源化抗體融合)。本發(fā)明的抗體同源物優(yōu)選的是具有重鏈及輕鏈的完整的免疫球蛋白分子。此外，本發(fā)明的CD4反應(yīng)性抗體同源物可以以Fab片段，F(xiàn)ab′片段，F(xiàn)(ab′)2片段，F(xiàn)(v)片段或任何具有上述結(jié)合性質(zhì)的其它免疫球蛋白片段形式存在。本發(fā)明所提供的優(yōu)選的抗體或抗體同源物為稱為B4或M2或B13的小鼠單克隆抗體。同時也提供了能產(chǎn)生本發(fā)明的抗體同源物的雜交瘤，通過培養(yǎng)這些細胞篩選及制造此抗體同源物的方法，及制備本發(fā)明雜交瘤的方法。表1用于抗CD4表位定位實驗的CD4肽*肽通過作為CD4肽段一部分存在的兩個內(nèi)源性半胱氨酸殘基形成環(huán)狀或者是在CD4肽段的N端和C端上加上半胱氨酸殘基以促進其環(huán)化。(C)在現(xiàn)存的CD4肽片段中加上的額外的半胱氨酸?！貶BVTh(FFLLTRILTIPQSLD,SEQIDNO:2)代表衍生自HBsAg蛋白質(zhì)具有非選擇性T輔助細胞功能的肽段。GG插在CD4位點和T輔助細胞表位之間作為間隔基的(甘氨酸-甘氨酸)。附圖的簡要說明圖1代表由核酸序列中所推測出的人類CD4的氨基酸序列(SEQIDNO:1)，即宿主抗原復(fù)合物的一部分。氨基酸以單字母代碼表示如下丙氨酸A半胱氨酸C組氨酸H甲硫氨酸M蘇氨酸T精氨酸R谷氨酰胺Q異亮氨酸I苯丙氨酸F色氨酸W天冬酰胺N谷氨酸E亮氨酸L脯氨酸P酪氨酸Y天冬氨酸D甘氨酸G賴氨酸K絲氨酸S纈氨酸V使用Littman等人的校正編號系統(tǒng)(細胞，1988,55:541),AA1-AA110,AA111-AA181,AA182-AA287,AA288-AA375,AA376-AA393，和AA394-AA433分別代表CD4分子的第一，二，三，及第四個胞外域，跨膜結(jié)構(gòu)域，及胞質(zhì)區(qū)。圖2示出了三個理論上可能的表位構(gòu)型。抗體僅以Fv片段的略圖描繪。實心長方形代表與表位的氨基酸相接觸的抗體部分。表位的氨基酸以小圓圈表示。如果表位的氨基酸形成一條連續(xù)的肽序列，則此表位可被認定為＂呈線性＂(如MAbsE31及E6)；如果因構(gòu)象折疊使氨基酸在空間上相鄰的兩個或數(shù)個肽段上分散開，則此表位可被稱為＂不連續(xù)的＂(如MAbsJ33,H5,D5,E2及I26)。最極端的例子被稱為＂不連續(xù)的散布的＂，其中許多不連續(xù)的位點，衍生自復(fù)合物中一或一個以上的分子，通過構(gòu)象折疊聯(lián)合形成一延伸的表位(例如MAbsB4和M2的表位)(由Meloen等人修飾，AnnBiolClin,1991,49:231)。圖3是六種真正的抗CD4抗體，兩種能識別含與趨化因子受體結(jié)合的CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物，和豚鼠αrsCD4血清在表達CD4的HPB-ALL細胞上所觀察到的三種不同結(jié)合類型的簡單示意圖帽狀，不規(guī)則斑點狀及團狀。在免疫熒光測定中，于高分辨率熒光顯微鏡下B4或M2與HPB-ALL細胞的結(jié)合呈現(xiàn)帽狀(A)的熒光點。每一種抗CD4抗體或豚鼠αrsCD4血清與HPB-ALL細胞的結(jié)合呈現(xiàn)不規(guī)則斑點狀(B)的熒光點。標記了FITC的HIV-1的gp120蛋白質(zhì)與HPB-ALL細胞的結(jié)合則呈現(xiàn)團狀(C)的熒光點分布。圖4顯示在劑量依賴性研究中，趨化因子受體CC-CKR5第3結(jié)構(gòu)域肽(p2047a)對各種單克隆抗體結(jié)合rsCD4活性的增強百分比。圖5顯示MabB4對rsCD4/趨化因子受體CC-CKR5第3結(jié)構(gòu)域肽混合物比對rsCD4親合力增強的量化圖(IC50rsCD4)。本發(fā)明的詳細說明在此所用的＂第Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的原代分離物＂是將患者外周血單核細胞(PBMCs)或具有未感染的PBMCs的血漿作有限的培育，至第五代，而得來的。可借助三種很重要的性質(zhì)將原代分離物與已適應(yīng)實驗室環(huán)境的病毒株，例如已在人類T型淋巴樣細胞系中傳代多次的Ⅲb/LAI,SF2和MN加以區(qū)分。首先，大部分的原代分離物不易在T細胞系中生長。例如，許多在PBMC培養(yǎng)中誘發(fā)合胞體形成的原代分離物(SI分離物)會在對HIV敏感的MT2T細胞系中進行復(fù)制，但只有少數(shù)會在寬容性較小的T細胞系如CEM或H9中進行復(fù)制。非合胞體誘發(fā)原代分離物(NSI分離物)則只能在初級T細胞中進行復(fù)制。其次，它們與已適應(yīng)實驗室環(huán)境的病毒株在對重組可溶形式的病毒受體蛋白質(zhì)CD4(rsCD4)的體外中和作用的敏感度上不相同(Daar等人，PNASUSA,1990,87:6574-6578)。第三點，已適應(yīng)實驗室環(huán)境的病毒株對具有病毒外殼特異性的抗體的中和作用敏感，而原代分離物則是抗性的(Sawyer等人，病毒學(xué)雜志，1994,68:1342；Mascola等人，傳染病雜志，1996,173:340)。如實施例1所示，表2的實驗室株，如HIV-1MN，對抗-V3抗體的中和作用相當(dāng)敏感，而另兩種原代分離物則是抗性的，甚至對抗-V3制品也是抗性的，抗-V3制品對HIV-1MN的中和滴度為1:203,080。但是，抗細胞抗體對HIV實驗室株和原代分離物的中和趨勢與抗病毒蛋白質(zhì)外殼抗體不同。在實施例2的表3中，針對β2微球蛋白，MHC第Ⅰ級HLAA,B,C，和MHC第Ⅱ級HLADR，及其它已知的T細胞表面抗原的單克隆抗體無法抑制衍生自實驗室細胞系的HIV-1MN株或HIV-1B分化體原代分離物所引起的感染，而針對HPB-ALL所產(chǎn)生的單克隆抗體(MabB4)卻對rsCD4蛋白質(zhì)有中等程度的反應(yīng)性且能與HPB-ALL細胞及與趨化因子受體如CC-CKR5結(jié)構(gòu)域結(jié)合的rsCD4蛋白質(zhì)強烈的結(jié)合，且已知其可有效地中和HIV-1的原代分離物(表3,7，和13)，但對衍生自實驗室細胞系的HIV-1MN株的中和活性則較小(表13)。在體外微小空斑測定中，已知當(dāng)B4濃度低于10μg/mL(表3,7，和13)時較只對CD4有特異性的抗體(表7)能更有效地中和HIV原代分離物。因此，看起來原代分離物對抗含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物抗體較為敏感。已知MAbB4的中和活性可延伸包括對HIV-2和SV的交叉中和(表14)。這些結(jié)果(表7,13)強烈顯示在與HIV有關(guān)的細胞蛋白質(zhì)中，有一個含CD4及共同受體，例如，趨化因子受體CC-CKR5的宿主細胞抗原復(fù)合物，它是具有交叉中和活性抗體的靶。共同受體是能使HIV融合，進入的受體或抑制因子。對于抗含CD4的抗原復(fù)合物抗體廣泛的中和活性的機制目前仍不清楚。含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物在介導(dǎo)HIV所造成的感染及疾病中可能扮演一個雙重的角色作為可供HIV結(jié)合的T細胞表面受體以及作為容許HIV產(chǎn)生細胞融合及進入的受體或HIV抑制因子。在此所用＂含CD4蛋白質(zhì)的宿主細胞抗原復(fù)合物＂一詞是指含可供HIV結(jié)合的受體與可作為HIV抑制因子或容許HIV產(chǎn)生細胞融合及進入的共同受體例如，CC-CKR5，的復(fù)合物。此分子復(fù)合物僅在表達CD4的細胞的表面上表達。其與以基因重組方式表達的可溶性CD4蛋白質(zhì)分子在血清學(xué)上及功能上均大不相同。在此所用＂CD4＂一詞是指任何由天然存在的CD4基因所編碼的CD4蛋白質(zhì)。在此所用＂表達CD4的細胞或CD4陽性細胞＂一詞是指所有在其表面能表達CD4糖蛋白的細胞。此類細胞包括表達CD4的T淋巴細胞，例如，外周血T細胞，胸腺細胞，脾細胞，等和衍生自白血病或淋巴瘤的T細胞系細胞，如HPB-ALL或SUP-T1細胞。在此所用＂重組可溶性CD4＂或＂rsCD4＂一詞是指含有人類CD4的AA1-AA375的多肽(圖1，SEQIDNO:1)。在此所用＂含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物＂或＂細胞表面CD4抗原復(fù)合物＂一詞是指含CD4的細胞膜結(jié)構(gòu)，CD4是一種包含了四個胞外域，一個跨膜結(jié)構(gòu)域，及一個胞質(zhì)區(qū)的50kD糖蛋白(圖1,SEQIDNO:1)，它與其它相關(guān)的宿主細胞蛋白質(zhì)，如趨化因子受體的結(jié)構(gòu)域復(fù)合。CD4最初被描述為T輔助淋巴細胞的一種細胞表面標記。之后發(fā)現(xiàn)CD4稀少地在單核細胞，朗格漢氏細胞，小神經(jīng)膠質(zhì)細胞，及B細胞亞型上表達。同時也發(fā)現(xiàn)CD4分子可作為MHC第Ⅱ級分子的受體直接參與抗原特異性T輔助細胞的活化。1984年，發(fā)現(xiàn)人類CD4是HIV的受體(Dalgleish等人，自然，1984,312:763)。HIV外殼糖蛋白，gp120，與CD4的結(jié)合是病毒進入其靶細胞的第一步。目前已對CD4分子進行了詳細的定位研究，是以CD4特異性單克隆抗體所作的結(jié)合研究及反面推導(dǎo)如CD4結(jié)構(gòu)修飾，例如，氨基酸的取代，缺失或插入與產(chǎn)生的CD4的功能改變的相互關(guān)系來進行的(Sattentau等人，科學(xué)，1986,234:1120；Peterson和Seed，細胞，1988,54:65；Jameson等人，科學(xué)，1988,240:1335；Sattentau等人，J.ExpMed,1989,170:1319；Hasunuma等人，免疫學(xué)雜志，1992,148:1841；Burkly等人，免疫學(xué)雜志，1992,149:1779；Davis等人，自然，1992,358:76)。這些定位研究使得人們能構(gòu)建CD4分子的結(jié)構(gòu)-功能圖譜。已知許多CD4特異性單克隆抗體具有中和HIV實驗室株的活性。但卻未有人對這些具HIV中和活性的抗體通過接觸HIV之前或之后的方式體內(nèi)抑制原代分離物所造成的感染的能力進行評估。也從未有報導(dǎo)指出任一以上抗體對含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物(特別是當(dāng)其與趨化因子受體的結(jié)構(gòu)域結(jié)合時)具有反應(yīng)性。CD4的第一個胞外域與免疫球蛋白在三個互補性決定區(qū)(CDRs)具有同源性。已知CD4分子胞外域的第1及第2結(jié)構(gòu)域與第Ⅱ級MHC分子的結(jié)合位點有關(guān)，而單獨第1結(jié)構(gòu)域則與HIV的結(jié)合及合胞體的形成有關(guān)。HIV外殼糖蛋白gp120的結(jié)合位點位于第1結(jié)構(gòu)域中類似CDR2環(huán)的地方(Peterson和Seed，細胞，1988,54:65；Landau等人，自然，1988,334:159；Clayton等人，自然，1988,335:363；Arthos等人，細胞，1989,57:469；Sattentau等人，J.Exp.Med.,1989,170:1319)。已知在第1結(jié)構(gòu)域中與CDR3區(qū)域互相重疊的分立區(qū)與合胞體的形成有關(guān)(Kalyanaraman等人，免疫學(xué)雜志，1990,145:4072；Camerini和Seed，細胞，1990,60:747；Corbeau等人，免疫學(xué)雜志，1993,150:290)。由這些參考文獻中，可以得出結(jié)論CD4的特異性抗體與免疫系統(tǒng)間的作用方式可能有以下數(shù)種首先，抑制表達CD4的T細胞與其它活化T細胞，B細胞，或單核細胞之間第Ⅱ級CD4的反應(yīng)；其次，傳送信號至T細胞以抑制正常含CD4的T細胞所介導(dǎo)的免疫調(diào)控功能；第三，通過當(dāng)同時捕獲T細胞受體分子引發(fā)的編程性細胞死亡使表達CD4的T細胞死亡；第四，抑制CD4和HIV之間的相互作用，以抑制HIV所介導(dǎo)的免疫病理反應(yīng)?；谝陨线@些結(jié)論，CD4抗體似乎是能預(yù)防及治療HIV感染和與HIV相關(guān)的疾病(包括艾滋病)的最佳物質(zhì)。而且，CD4抗體可能對預(yù)防那些不希望發(fā)生的免疫反應(yīng)也非常有用，例如移植排斥，或治療自體免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，或牛皮癬。有許多研究均以抗CD4抗體為其研究主題。目的是希望這些可抑制HIVgp120與CD4結(jié)合的抗體能防止合胞體的形成和預(yù)防由HIV所造成的感染。兩種完全定性的抗CD4抗體，Leu3A和OKT4A，已知能有效地抑制HIV所誘發(fā)的合胞體的形成。由Chiba的美國專利5,171,838中已知單克隆抗體Leu3A所能識別的表位精確定位于與HIV-1gp120結(jié)合位點的CDR2區(qū)域重疊的一段15個氨基酸AA49-AA63。已知單克隆抗體OKT4A所識別的表位已被定位于與HIV-1gp120結(jié)合位點重疊，在AA16-AA49之間的CD4位點(Jameson等人，科學(xué)，1988,240:1336。注在Jameson的文章中所公開的CD4序列與顯示于本發(fā)明圖1,SEQIDNO:1中的CD4序列之間有9個氨基酸的移碼)。但此兩種抗體在治療HIV所造成的感染上的應(yīng)用非常有限，因其無法結(jié)合或作用于已結(jié)合到HIVgp120上的CD4分子(Burkly等人，WO92/09305)。此似乎是因表位與gp120結(jié)合位點的接近所造成的位阻。其它已知的抗CD4抗體對HIV誘發(fā)的合胞體的形成有一些作用，包括MT151,MT413,13B8-2,OKT4E,VIT4和MT321(Dalgleish等人，自然，1984,312:763；Sattentau等人，科學(xué)，1986,234:1120；Davis等人，自然，1992,358:76；Corbeau等人，免疫學(xué)雜志，1993,150:290)。已知這些抗體可結(jié)合靠近第一結(jié)構(gòu)域的CDR3區(qū)，與OKT4A和Leu3A所結(jié)合的表位不同的決定簇。但是，同OKT4A和Leu3A一樣，它們也無法與已結(jié)合了HIVgp120的CD4分子結(jié)合，因此限制了它們的使用用途(Burkly等人，WO92/09305)。另一組抗CD4的單克隆抗體，包括單克隆抗體5A8，如Burkly等人所述(出處同上)，也同樣可以抑制HIV介導(dǎo)的合胞體的形成。表征單克隆抗體5A8的表位定位研究結(jié)果(p.81-82,WO92/09305)發(fā)現(xiàn)單克隆抗體5A8能識別CD4中的一個構(gòu)象表位，包括CD4的第一及第二結(jié)構(gòu)域且兩個位置對5A8的結(jié)合是必須且“足夠的”。同時也發(fā)現(xiàn)連接第一及第二結(jié)構(gòu)域的桿狀β鏈中的AA83-AA105有很大的影響，且第二結(jié)構(gòu)域中的AA105-AA131對5A8與CD4的結(jié)合是絕對必要的。至于CD4的第三及第四結(jié)構(gòu)域和其它復(fù)合的細胞表面抗原則并未參與這種反應(yīng)。以前曾有建議使用抑制HIV與CD4陽性細胞間的結(jié)合和/或抑制HIV誘發(fā)的合胞體形成的那些能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體作為被動免疫預(yù)防劑來預(yù)防因意外接觸引起的感染及中止受感染的母親和嬰孩之間的垂直感染(Rieber等人，Lancet,1990,336:1007；Rieter等人，PNAS,1992,89:10792；Attanasio等人，傳染病雜志，1993,168:515)。但是，大部分這些抗CD4抗體只以HIV實驗室株作過體外中和活性分析試驗，從未通過接觸病毒之前或之后的應(yīng)用對任一抗體作過其體內(nèi)抑制原代分離物造成的感染能力的評估。已知這種體外病毒中和結(jié)果不一定變?yōu)閷IV的體內(nèi)功效。特別是大家都知道rsCD4無法在受HIV-1感染的患者中發(fā)揮抗病毒作用(Daar等人，PNASUSA,1990,87:6574-6578)，盡管其具有很高的體外中和病毒活性。在本發(fā)明之前，沒有任何一種已知的抗CD4抗體被報導(dǎo)過能與CD4的所有四個結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或緊密地接觸，以能抑制HIVgp120與人類CD4的初始結(jié)合，同時有效地中和HIV第1及第2型和SIV的各種原代分離物的感染性，并且能通過結(jié)合后的抗病毒機制具有這種中和能力。依據(jù)本發(fā)明，所提供的抗體可與CD4的所有四個結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或接觸，且當(dāng)與趨化因子受體結(jié)合時可進一步提高其結(jié)合的效果。這些抗體能抑制HIVgp120與人類CD4的初始結(jié)合，同時有效地中和HIV第1及第2型和SIV的原代分離物的感染性，并且能通過結(jié)合后的抗病毒機制發(fā)揮這種作用。本發(fā)明的單克隆抗體及其同源物首次證明了一種能抵抗靈長類及huPBL/SCID小鼠模型的重組人類免疫系統(tǒng)中免疫缺陷病毒的原代分離物所造成的感染的抗體在動物體內(nèi)的功效(實施例17和18)。具有這些性質(zhì)的抗體，例如單克隆抗體B4，很顯然能在以藥物治療HIV感染和與HIV相關(guān)的疾病例如艾滋病上提供一些好處。與已知的抗CD4抗體不同的是，B4或其同源物可在HIV與含CD4的細胞表面抗原復(fù)合物結(jié)合之前和之后用來阻斷其結(jié)合，且其能提供有效的保護作用以免受各種原代分離物的感染，包括交叉保護作用。本發(fā)明的單克隆抗體是第一種被證明能在靈長動物模型及重組的人類免疫系統(tǒng)中對免疫缺陷病毒原代分離物產(chǎn)生有效的體內(nèi)中和作用的單克隆抗體。如實施例2-18所示的本發(fā)明抗體的體外及體內(nèi)中和作用結(jié)果，以及在此所述的性質(zhì)的有機結(jié)合，顯示其在意外接觸病毒前后在預(yù)防人類受世界性第1及第2型HIV株感染上非常有用。基于由實施例2-16和19-20中所得的結(jié)果概括出以下對本發(fā)明有用的抗體的性質(zhì)1．在ELISA測定中與rsCD4的結(jié)合；2．在免疫熒光測定中與表達CD4的細胞的結(jié)合，其結(jié)合模式于高分辨率熒光顯微鏡下觀察時呈現(xiàn)＂帽狀＂；3．抑制HIVgp120與表達CD4的細胞的結(jié)合；4．與已結(jié)合了HIVgp120的表達CD4的細胞的結(jié)合；且5．在體外微小空斑測定中以＜10μg/mL的濃度中和HIV的原代分離物，對50％中和活性而言濃度優(yōu)選在0.01-10μg/mL之間，對90％中和活性而言濃度優(yōu)選在0.1-35μg/mL之間。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體也能展現(xiàn)。6．當(dāng)rsCD4事先與趨化因子受體結(jié)構(gòu)域肽一起溫育時可提高在ELISA測定中與rsCD4的結(jié)合；7．與以下肽所代表的CD4四個結(jié)構(gòu)域中任一個的結(jié)合CD4的AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。具有這些性質(zhì)的抗體對預(yù)防和治療其由原靶是CD4陽性細胞的感染因子所造成的人類疾病特別有效。因此，本發(fā)明提供了含有這些抗體或其同源物的預(yù)防和治療組合物，以及使用這些抗體組合物的方法，該組合物對由原靶是CD4陽性細胞的感染因子所造成的人類疾病，例如，與HIV相關(guān)的疾病包括各種程度的艾滋病的預(yù)防及治療特別有用。如文中所述，＂抗體同源物＂是指包含一種或多種選自免疫球蛋白輕鏈，免疫球蛋白重鏈，和它們的抗原結(jié)合片段的多肽的蛋白質(zhì)，其具有以上所述的結(jié)合及中和活性?？贵w同源物包括IgA,lgG,IgE,IgD,IgM類型的完整的免疫球蛋白(及其亞型)，并具有K或λ輕鏈。具有上述性質(zhì)的抗體或其同源物的片段，例如，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab′片段，F(xiàn)(ab′)2片段，F(xiàn)(v)片段，重鏈單體或二聚物，輕鏈單體或二聚物，含一重鏈和一輕鏈的二聚物，或其類似物均涵蓋于本發(fā)明的范疇中。抗體同源物也包括人源化重組抗體及嵌合抗體。在整個說明書中，＂本發(fā)明的抗體＂一詞及其類似物均涵蓋其同源物。如文中所述，＂CD4陽性細胞表面抗原復(fù)合物＂或＂含CD4的細胞表面抗原復(fù)合物＂是指本發(fā)明抗體的結(jié)合位點。復(fù)合物可包括與趨化因子受體，例如CC-CKR5的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CD4。如文中所述，＂人源化重組抗體＂是指初始衍生自非人類哺乳動物的抗體，其中利用基因重組技術(shù)以人類免疫球蛋白輕鏈或重鏈上相應(yīng)區(qū)域的氨基酸來取代部分或全部表達CD4的細胞上未用于與CD4細胞表面復(fù)合物結(jié)合的氨基酸。如文中所述，＂重組嵌合抗體＂是指初始衍生自非人類哺乳動物的抗體，其中利用DNA重組技術(shù)以另一不同種的哺乳動物，優(yōu)選的是人類，的免疫球蛋白輕鏈或重鏈上相應(yīng)區(qū)域來取代輕鏈，重鏈或兩者的全部或部分絞鏈和恒定區(qū)。如文中所述，＂Leu3A＂是抗CD4小鼠單克隆抗體，目前商業(yè)上有來自BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose,CA的，目錄號為340133的FITC綴合物出售。如文中所述，＂OKT4A＂是抗CD4小鼠單克隆抗體，目前商業(yè)上有來自O(shè)rthoDiagnosticSystems,Raritan,NJ的，目錄號為OK704010的FITC綴合物出售。如文中所述，＂5A8＂是詳述于PCTWO92/09305的抗CD4小鼠單克隆抗體。如文中所述，＂B4模仿劑＂是能引起單克隆抗體B4與人類重組可溶性CD4(rsCD4)或與表達CD4的細胞上的人類細胞表面CD4抗原復(fù)合物的結(jié)合至少降低30％的化合物。依據(jù)本發(fā)明的抗體本發(fā)明的抗體或抗體同源物可與含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物特異性結(jié)合。復(fù)合物可包括與趨化因子受體，如CC-CKR5的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CD4。在間接免疫熒光測定中，以高分辨率熒光顯微鏡觀察它們與表達CD4的細胞的結(jié)合模式呈特征性＂帽狀＂。本發(fā)明的抗體可與含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物上散布的不連續(xù)的表位特異性結(jié)合。復(fù)合物可包括與趨化因子受體，例如CC-CKR5分子的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CD4，能抑制HIVgp120與表達CD4的細胞之間的結(jié)合，同時能在已結(jié)合了HIVgp120后與含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合，并抑制多種HIV原代分離物對表達CD4的細胞所造成的感染。優(yōu)選的是那些能夠抑制HIVgp120與表面CD4的結(jié)合，且可以病毒結(jié)合之前和之后的方式抑制所有第1及第2型HIV原代分離物對CD4細胞的感染。依據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的抗體包括如下所述的小鼠單克隆抗體B4(IgG2a),M2(IgG1)和B13(IgG2a)。本發(fā)明的抗體及其同源物對HIV感染及各種階段的艾滋病具有預(yù)防及治療作用，因其可在HIVgp120與CD4陽性淋巴細胞表面上的含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合之前和之后預(yù)防宿主細胞的復(fù)制性感染。因此它們能預(yù)防HIV的感染并阻止病毒擴散到其它未感染的細胞上。本發(fā)明的抗體及其同源物有獨特的效用因其能抑制HIV在與表達CD4的細胞結(jié)合后所造成的感染。用于本發(fā)明抗體的篩選測定普通技術(shù)人員可很容易地以已知的方法確定某一抗體或其同源物是否具有上述特性以鑒定本發(fā)明的抗體或其同源物。為確定某一抗體是否能與人類CD4結(jié)合，可以使用任何以rsCD4蛋白質(zhì)作為固相抗原的傳統(tǒng)結(jié)合測定方法。通過使用一種酶標記的對免疫球蛋白特異的二級抗體，可很方便地利用ELISA試驗或類似的試驗進行有用的rsCD4結(jié)合測定，其中免疫球蛋白屬于產(chǎn)生抗體同源物的物種?？贵w或其同源物與表達CD4的人類細胞上的含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物的結(jié)合可通過以具有熒光標記的特異性免疫球蛋白二級抗體來作染色，其中免疫球蛋白屬于產(chǎn)生所測試的抗體或其同源物的相同物種，或者以采用與衍生自趨化因子受體的肽，如肽2047結(jié)合的rsCD4蛋白質(zhì)的ELISA試驗來檢測。以一種熒光活化的細胞分選器(＂FACS＂)或高分辨率熒光顯微鏡來測定能與抗體反應(yīng)的細胞百分比及其熒光強度。結(jié)合在細胞上的抗體可以用高分辨率熒光顯微鏡來觀察，其呈特征性＂帽狀＂的熒光分布。適合此目的的表達CD4的細胞為表達CD4的T淋巴細胞，例如人類外周血T細胞，胸腺細胞，和脾細胞或表達CD4的白血病T細胞系如HPB-ALL或SUP-T。以已知的方法來分離這些細胞。例如，以Ficoll-Hypaque離心法可以分離出正常T淋巴細胞，以離心法可以分離出惡性T細胞。可以使用任何適當(dāng)?shù)母偁幮詼y定方法來確定某一特定抗體是否能抑制HIVgp120與人類CD4之間的結(jié)合?？捎玫臏y定方法包括，例如，ELISA，間接免疫熒光測定，及其它類似的方法。優(yōu)選的是，事先將細胞與抗體一起溫育來測定標記的HIVgp120與表達CD4的細胞上的CD4之間的結(jié)合能力。HIVgp120抑制對CD4有反應(yīng)的單克隆抗體與表達CD4的細胞之間結(jié)合的能力是通過事先將HIVgp120與表達CD4的細胞一起溫育，并定量預(yù)先結(jié)合的HIVgp120抑制抗體與細胞間結(jié)合的程度來評價的?？贵w與表達CD4的細胞間的結(jié)合通過FACS分析或高分辨率熒光顯微鏡，使用對產(chǎn)生所測試的抗體的物種具有特異性的熒光標記的二級抗體來進行定量。用于上述測定中的HIVgp120可由以HIV感染的細胞，HIV本身，經(jīng)HIVgp120基因轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，以表達gp120的重組病毒感染的宿主細胞，或分離的gp120來提供。優(yōu)選的是重組產(chǎn)生的gp120。目前市面上有純化的，重組HIVgp120產(chǎn)品出售(美國生物技術(shù)公司，Cambridge,MA)?？墒褂萌魏我阎暮习w測定方法來評估某一特定抗體抑制HIV在表達CD4的細胞中誘發(fā)合胞體形成的能力。優(yōu)選的是，將原代分離物或受HIV感染的表達CD4的組織培養(yǎng)細胞(如，H9)加到MT-2細胞培養(yǎng)物中。之后加入不同量的抗體。陰性對照組則只加常規(guī)培養(yǎng)基，或添加與HIV無關(guān)的抗體。也可使用誘發(fā)巨大合胞體的病毒株作為陽性對照組。就誘發(fā)巨大合胞體的病毒株而言，在溫育后，以肉眼觀察確定合胞體或蝕斑的形成數(shù)量來評定所有培養(yǎng)物。用這種方法來評定抗體抑制合胞體形成或降低細胞培養(yǎng)物中形成的蝕斑的數(shù)目的能力?？杀O(jiān)測HIV感染的任何指征來確定某一特定抗體是否能抑制HIV對表達CD4的細胞所造成的感染。有用的HIV感染的體外指示物包括，例如，HIV核心抗原p24的分泌。優(yōu)選的是，在有或沒有抗體存在下于受到HIV感染的表達CD4的細胞培養(yǎng)物中通過比較HIVp24量的多寡來確定對HIV感染的抑制。可使用p24病毒抗原的定量測定來評估某一特定抗體抑制表達CD4的細胞受到HIV感染的能力。優(yōu)選的是以p24病毒抗原中和測定來測定抗體在指明的稀釋度下對侵入病毒的中和活性(Wrin等人，病毒學(xué)雜志，1995,69:39-48)。在這種p24HIV病毒測定中，病毒的感染性及中和活性可通過用p24ELISA測定PBMC培養(yǎng)物中所累積的p24抗原來定量(Coulter免疫學(xué)，Hialeah,FL)?？梢杂肊LISA或其它類似的方法來確定某一特定抗體是否對含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物比對rsCD4分子具有更高的結(jié)合性質(zhì)。在此測定方法中，可通過使用標記的對免疫球蛋白特異的二級抗體來檢測抗體與含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合的能力，此免疫球蛋白屬于用rsCD4產(chǎn)生抗體的物種，rsCD4事先與衍生自可能與CD4結(jié)合的受體結(jié)構(gòu)域的肽一起溫育。該肽選自IL8Rα的第3結(jié)構(gòu)域(p2029a),CC-CKR2b的第2及3結(jié)構(gòu)域(p2087a,p2088a),CC-CKR3的第1和4結(jié)構(gòu)域(p2079a,2082a)，和CC-CKR5的第3結(jié)構(gòu)域(p2047a)?？梢杂肊LISA或其它類似的方法來確定某一特定抗體是否能與衍生自人類CD4的肽結(jié)合。在此測定方法中，可通過使用標記的對免疫球蛋白特異的二級抗體來檢測抗體與這些肽之間的結(jié)合能力，此免疫球蛋白屬于產(chǎn)生抗體的物種?？梢杂肊LISA或其它類似的方法來確定某一特定抗體是否能與衍生自人類趨化因子受體的肽結(jié)合。在這樣的測定中，可通過使用標記的對免疫球蛋白特異的二級抗體來檢測抗體與這些肽之間的結(jié)合能力，此免疫球蛋白屬于產(chǎn)生抗體的物種?？贵w與肽間的結(jié)合優(yōu)選的是通過在rsCD4ELISA中的抑制性研究先將能與rsCD4反應(yīng)的抗體與上述或表1中所列的CD4肽一起溫育，接著再將抗體-肽復(fù)合物與包被有rsCD4或rsCD4/趨化因子受體肽的微孔一起溫育來測定的。本發(fā)明的抗體同源物的類型及其制備本發(fā)明的抗體包括能呈現(xiàn)如上述B4新穎特性的抗體與抗體同源物兩大類，其特性可以上述及實施例2-18的步驟來確定。本發(fā)明的抗體可以是完整的單克隆抗體、完整的重組抗體、完整的嵌合型抗體、完整的人源化重組抗體或能呈現(xiàn)出結(jié)合及中和B4、M2和B13的抗原結(jié)合部位。A．單克隆抗體本發(fā)明中最優(yōu)選的抗體類型為由本發(fā)明中的雜交瘤所制備的完整的單克隆抗體。用于制備單克隆抗體的技術(shù)已眾所周知(參見Kennett等人，＂制備和表征單克隆抗體的方法＂，單克隆抗體、雜交瘤生物分析中的新領(lǐng)域，Plenum出版社，pp363-419,1980)。用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物包括表達CD4的人類細胞，如，能表達CD4的外周血淋巴細胞、胸腺細胞或源自表達CD4的人類T細胞系。這點與Kung等人在美國專利號4,381,295中所述有所出入，該專利認為＂事實上，在本申請中發(fā)現(xiàn)使用惡性T細胞系作為抗原發(fā)現(xiàn)會產(chǎn)生無法制造所須[T4]抗體的雜交瘤＂。(第四欄，54-56行)。事實上，Kung及其同事報告在8個急性淋巴T細胞白血病(第十四欄，45行)及大部分的T細胞系(第51行)中未觀察到OKT4的反應(yīng)性，因此得出結(jié)論惡性T細胞系為不適當(dāng)?shù)拿庖咴?。用來生產(chǎn)本發(fā)明抗體的免疫原來自表達CD4細胞的可靠的來源，優(yōu)選的來自例如衍生自患有急性T淋巴母細胞白血病病人(T-ALL)HPB-ALL的T細胞系或來自患有非霍金氏淋巴瘤病人(T-NHL)的T細胞系SUP-T1的T細胞系。為不受限于理論，一般均相信使用能表達CD4的細胞例如HPB-ALL,SUP-T細胞或MT-2作為免疫原，較使用分離的CD4或重組可溶性CD4(如rsCD4)，更能引發(fā)本發(fā)明抗體的產(chǎn)生。使用能表達CD4的細胞可在細胞表面為含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物提供更適宜的構(gòu)象，此為單獨CD4分子所無法提供的。可以標準的方法完成免疫接種。單位劑量及免疫方法視哺乳動物的種類、其免疫狀況、體重和施用的制劑中含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物之量而定。在一實施例中，每一用于接種小鼠的表達CD4的細胞制劑中至少含約5-10×106的細胞。典型的，小鼠在第0天經(jīng)腹膜接種能表達CD4的T細胞，在有或無佐劑存在下以PBS徹底清洗使其完全沒有任何殘存的培養(yǎng)基蛋白質(zhì)。第一次接種后約14天至6個月，優(yōu)選為15-30天，小鼠便由腹膜在沒有任何佐劑存在下進行第一次能表達CD4T細胞的加強接種，其中能表達CD4的T細胞清洗后重新懸浮于PBS。并可施以額外的加強免疫。優(yōu)選為在沒有佐劑下以多次加強免疫使其達高度免疫。在進行融合前三天，由靜脈注射最后一劑加強免疫(沒有佐劑下懸浮于PBS中能表達CD4的T細胞)。依上述方法，或更明確的來說，依用于本發(fā)明抗體存在的表12的條件對被免疫的哺乳動物的血清進行篩檢是否有本發(fā)明抗體存在。從血清可與rsCD4反應(yīng)的被免疫的哺乳動物中分離出脾細胞?？梢匀魏沃苤钠⒓毎c永生的細胞系融合的方法來制造本發(fā)明的雜交瘤。典型的，永生細胞系(例如骨髓瘤細胞系)和脾細胞衍生自相同的哺乳動物中。有用的哺乳動物包括小鼠、大鼠和恒河猴。優(yōu)選的，脾細胞衍生自近交BALB/c小鼠株或雜交CD1小鼠株中(JacksonLabs,BarHarbour,ME)。優(yōu)選的永生細胞系是對含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(＂HAT＂培養(yǎng)基)敏感的小鼠骨髓瘤細胞系。最優(yōu)選的小鼠骨髓瘤細胞系是P3×63-AG8.653(ATCC,Rockville,MD,catalogNo.CRL1580)。典型的，以聚乙二醇(PEG)來融合對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞系與小鼠脾細胞。再以HAT培養(yǎng)基來篩選由此融合所產(chǎn)生的雜交瘤細胞，HAT培養(yǎng)基會殺死那些未融合及未能有效融合的骨髓瘤細胞，而未融合的脾細胞則會在數(shù)天后自然死亡。產(chǎn)生依據(jù)本發(fā)明的抗體的雜交瘤細胞可用上述篩選方法篩選培養(yǎng)上清液而檢出。優(yōu)選的，初次篩選時通過其與rsCD4自身的結(jié)合活性可選擇“偏好”與事先已與一衍生自趨化因子受體CC-CKR5外部第三結(jié)構(gòu)域的肽(例如p2047)預(yù)溫育的rsCD4有結(jié)合活性的抗體。通過比較相應(yīng)的rsCD4/p2047復(fù)合物與單獨rsCD4之ELISA結(jié)果來測定所提高的結(jié)合活性。此種簡單的重復(fù)初級篩選(rsCD4/p2047vs.rsCD4)可去除大部分(＞90％)對不含CD4表面抗原有反應(yīng)性的抗體。以此種對與CC-CKR5分子第三外部結(jié)構(gòu)域的肽結(jié)合的rsCD4，而非單獨的rsCD4的偏好反應(yīng)性所篩選出的抗體須再經(jīng)過第二種能否與含CD4細胞的細胞表面抗原復(fù)合物結(jié)合篩選，其是通過表征它們與表達CD4的細胞例如，HPB-ALL或SUP-T細胞的結(jié)合性來篩選。以衍生自與抗體相同物種的熒光標記的免疫球蛋白二級抗體來檢測此結(jié)合情形，并以FACS分析或熒光顯微鏡來加以量化，且以熒光顯微鏡來進行觀察。并以用于檢測合胞體形成抑制情形的MT-2微小空斑中和試驗或用于檢測病毒復(fù)制抑制情形的p24抗原中和分析來進一步檢測這些對能表達CD4的細胞有結(jié)合反應(yīng)性的抗體其中和HIV-1原代分離物，例如，23135的能力。選擇那些能分泌對rsCD4/p2047有較優(yōu)先結(jié)合性質(zhì)和/或在ELISA中對rsCD4有結(jié)合活性，在間接免疫熒光分析中能對表達CD4的細胞染色，及對濃度＜10μg/mL的HIV原代分離物呈現(xiàn)中和活性的抗體的細胞集落進行最后的克隆及亞克隆。為制備本發(fā)明中完整的單克隆抗體的抗體，將在上述篩選分析中呈陽性反應(yīng)的雜交瘤以已知的條件在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段足以使其將單克隆抗體分泌至培養(yǎng)基的時間。適宜雜交瘤細胞的培養(yǎng)技術(shù)及培養(yǎng)基早已為大眾所周知(參見，例如，Kennett等人，單克隆抗體，出處同前)。收集那些含有所要抗體的特定雜交瘤培養(yǎng)基的上清液?；蛘?，通過將篩選出的雜交瘤細胞注射至一未免疫的小鼠的腹腔內(nèi)來制備所要的抗體。雜交瘤細胞將會在小鼠的腹腔中增生，分泌的抗體則會累積在腹水中(Kennett等人，單克隆抗體，出處同前)。以針頭由腹腔中抽取腹水即可獲得所要的抗體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，依據(jù)本發(fā)明所制備的單克隆抗體可很容易的從特定的雜交瘤細胞培養(yǎng)基上清液或腹水中加以純化。B．重組抗體及其編碼DNA依據(jù)本發(fā)明，抗體同源物可以是由已用編碼如本發(fā)明免疫球蛋白輕鏈及重鏈的DNA轉(zhuǎn)化過的宿主細胞生產(chǎn)的重組單克隆抗體。重組抗體可以周知的遺傳工程技術(shù)來合成。例如，重組抗體可通過克隆編碼來自產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的雜交瘤細胞的抗體其免疫球蛋白輕鏈及重鏈的cDNA或基因組DNA來制備。之后再將編碼這些多肽的cDNA或基因組DNA插入重組表達載體中，使兩組基因均與其自身控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因調(diào)控序列可操縱地相連。選擇能與所選宿主細胞基因表達相容的表達載體及其控制表達的調(diào)控基因序列。典型的，輕鏈及重鏈的基因被插入同一表達載體上以使兩者的基因表達呈可操縱地相連?？梢栽嘶蛘婧思毎鳛楸磉_宿主。優(yōu)選的在真核宿主細胞中進行表達，因這種細胞較原核細胞更能裝配及分泌出正確折疊且具免疫活性的抗體。應(yīng)了解上述步驟的一些改變均應(yīng)視為仍在本發(fā)明的范圍中。宿主細胞有可能只制造出完整抗體的一部分，例如輕鏈或重鏈的二聚物，依據(jù)本發(fā)明這些仍然屬于抗體的同源物。例如，可能需要以編碼本發(fā)明抗體輕鏈或重鏈的DNA(但不是兩者)來轉(zhuǎn)化宿主細胞。也可用重組DNA技術(shù)來編碼除去在CD4結(jié)合時非必需的輕鏈或重鏈或兩者均有的部分或全部DNA序列，亦即，編碼Fab′片段的DNA。依據(jù)本發(fā)明，由此種截短的DNA分子所表達的分子是抗體同源物。C．嵌合型及人源化重組抗體及其編碼DNA可用編碼上述重組抗體的DNA作為起始物來制備嵌合型或人源化重組抗體。通過以含有所要免疫球蛋白輕鏈及重鏈DNA的合適的表達載體來轉(zhuǎn)化宿主細胞以制備嵌合型重組抗體，其中編碼重和/或輕鏈DNA的鉸合區(qū)及恒定區(qū)的全部或部分DNA已用不同物種免疫球蛋白的重或輕鏈相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的DNA取代。當(dāng)原始重組抗體非人源時，優(yōu)選的是用人編碼鉸合區(qū)及恒定區(qū)的DNA序列進行取代。嵌合型重組抗體例子具有小鼠的可變結(jié)構(gòu)域及人的鉸合區(qū)及恒定區(qū)。參見，美國專利號4,816,397及Morrison等人，＂嵌合型人抗體分子小鼠抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域及人恒定區(qū)＂，美國國家科學(xué)院院報，1984,81:6851-55。人源化重組抗體是通過用由內(nèi)含編碼所要非人類免疫球蛋白輕及重鏈的DNA的適當(dāng)表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞而制備的，其中編碼與CD4抗原復(fù)合物結(jié)合無關(guān)的氨基酸，包括分布在互補性決定區(qū)(CDRs)中的框架序列的全部或部分DNA已用來自所期望的人類免疫球蛋白輕或重鏈相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的DNA序列加以取代。參見，P.T.Jones等人，＂以來自小鼠的相應(yīng)DNA取代人抗體中互補性決定區(qū)的DNA＂，自然，1986,321:522-25。本發(fā)明中最優(yōu)選的人源化重組抗體含有散布在其人類框架序列中的B4＂CDRs＂序列。D．依據(jù)本發(fā)明在轉(zhuǎn)基因哺乳動物中制備的抗體同源物內(nèi)源滅活免疫球蛋白基因座且含編碼人重鏈及輕鏈基因序列的轉(zhuǎn)基因序列的小鼠同型接合雜交瘤，可分泌含有人重鏈及輕鏈的抗體同源物。這些轉(zhuǎn)基因抗體同源物，通過分別的ELISA可結(jié)合到重組可溶性CD4分子上且優(yōu)選為結(jié)合在與衍生自CC-CKR5趨化因子受體第三外部結(jié)構(gòu)域的肽(即，p2047)相結(jié)合的rsCD4上，且通過表達CD4的細胞的間接免疫熒光染色可結(jié)合在含CD4的人宿主細胞抗原復(fù)合物上，并具有能直接中和所有HIV-1分化體的原代分離物和HIV-2及SIV不同的原代分離物的活性，且與單克隆抗體B4具有類似的抗體結(jié)合性質(zhì)，其可以上述標題為單克隆抗體的段落A中所述的免疫接種及篩選過程來制備。更明確的來說，如Smith等人在WO93/12227中所描述的一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其特點是帶有HC1或HC2基因型，以其不具功能的JH位點及能重新排列以編碼人類重鏈的轉(zhuǎn)基因和能重新排列以編碼人類輕鏈的轉(zhuǎn)基因的同型接合體取代正常BALA/c或CD1小鼠作為免疫接種的宿主。E．依據(jù)本發(fā)明屬于非完整抗體的抗體同源物同源物也包括本發(fā)明抗體的片段。此類片段可以衍生自上述任一完整抗體的片段。例如，與宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合的片段，以及衍生自上述抗體多肽的單體或二聚物，依據(jù)本發(fā)明這些物質(zhì)本身也屬于抗體同源物。有用的此類抗體同源物包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、F(v)片段、重鏈單體或二聚物、輕鏈單體或二聚物、含有一重鏈一輕鏈的二聚物，及其類似物。依據(jù)本發(fā)明前述片段通常是有用的抗體同源物。可以化學(xué)方法產(chǎn)生抗體片段，亦即以蛋白酶，例如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶切割完整抗體，也可選擇性地以還原劑來處理切割過的產(chǎn)物。或者，以帶有截短的重鏈和/或輕鏈基因或截短的重鏈和輕鏈基因的融合基因轉(zhuǎn)化的宿主細胞來制備這些有用的片段?？梢杂眠€原劑，如1,4-二硫蘇糖醇來處理完整的抗體，再進行純化以分離各鏈。也可由編碼任一期望的重或輕鏈但非兩者均有的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細胞來制備重和輕鏈單體(參見，Sastry等人，美國國家科學(xué)院院報，1989,86:5728-32)。能制備本發(fā)明抗體的細胞本發(fā)明也提供了能制造本發(fā)明抗體的細胞及細胞培養(yǎng)物。此類細胞包括能制造本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。此外，本發(fā)明也通過培養(yǎng)能產(chǎn)生此抗體的細胞提供了一種能制造本發(fā)明抗體的方法。培養(yǎng)此類細胞及分離其所制造的抗體方法為大眾所熟知。。這些方法包括細胞培養(yǎng)技術(shù)以及腹水的生成。同時也提供了一種用以產(chǎn)生本發(fā)明雜交瘤的方法，包括用表達CD4的細胞對一非人類哺乳動物進行免疫接種的步驟。在此步驟中作為免疫原的細胞來自一可靠來源的表達CD4的細胞系，例如，衍生自人類白血病或淋巴瘤的T細胞系如衍生自患有急性T-型淋巴母細胞白血病病人(T-ALL)的HPB-ALL細胞或患有非霍金氏淋巴瘤病人(T-NHL)的SUP-T1細胞系，第一次接種時將其溶于PBS，或完全弗氏佐劑中腹膜注射，之后的加強免疫注射則采腹膜或靜脈注射且完全不用佐劑。本發(fā)明的藥物組合物及方法本發(fā)明的抗體及其同源物可作為預(yù)防及治療性藥物組合物來防止由原靶為表達CD4的淋巴細胞的感染物所造成的疾病。此類疾病包括HIV感染和相關(guān)的疾病包括艾滋病。優(yōu)選的用于人類的本發(fā)明的藥物組合物包括本發(fā)明的抗體，諸如一種或多種小鼠單克隆抗體B4或M2或B13及其同源物，諸如小鼠/人嵌合型重組抗體、人源化重組抗體或這些抗體的抗原結(jié)合部位。優(yōu)選為與單克隆抗體B4或M2或B13或人源化嵌合型重組抗體有類似結(jié)合性質(zhì)的小鼠/人嵌合型重組抗體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可進一步包含其它用于預(yù)防HIV感染的治療劑。例如，本發(fā)明的抗體同源物可和能抑制反轉(zhuǎn)錄酶的抗反轉(zhuǎn)錄藥劑，如AZT一同使用，或與能抑制HIV蛋白酶的藥劑一同使用。此外，本發(fā)明的藥物組合物可進一步包含抗病毒藥劑例如干擾素，或免疫抑制劑如環(huán)胞菌素。此外，一種或多種抗體同源物也可與兩種或多種前述治療劑一同使用。此種組合療法的優(yōu)點是可使用較低劑量的治療藥劑，因此可避免當(dāng)使用各種單一藥劑時可能會有的毒性或副作用。本發(fā)明的藥物組合物包含依據(jù)本發(fā)明的一種或多種免疫治療有效量的抗體同源物，或其衍生物，且優(yōu)選的為藥學(xué)可接受的載體。＂免疫治療有效量＂意指足夠能防止因HIV感染或艾滋病，或由原靶為表達CD4的淋巴細胞的感染因子所引起的其它疾病所造成的免疫應(yīng)答作用的量。＂藥學(xué)可接受的載體＂意指不會在所施用的病人身上引發(fā)過敏反應(yīng)或其它不適宜影響的載體。合適的藥學(xué)可接受的載體包括，例如，一種或多種水、生理鹽水、磷酸緩沖鹽液、右旋糖、甘油、乙醇和其它類似物，以及上述物質(zhì)的組合。藥學(xué)可接受的載體可進一步包括能提高抗體同源物的保存期限或效用的微量輔助性物質(zhì)例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。本發(fā)明的組成可以有許多不同形式。這些包括，例如，固體、半固體和液體的劑型，例如片劑、丸劑、粉末、溶液、分散液或懸浮液、脂質(zhì)體、栓劑、注射用及輸液用溶液。優(yōu)選的形式視施用方式及其預(yù)防或治療應(yīng)用而定。優(yōu)選的組合物是注射用及輸液用的溶液的形式。本發(fā)明優(yōu)選的藥物組合物與那些用于人被動免疫的其它抗體的組合物類似。優(yōu)選的施用方式是非腸道施用。此領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)不難了解，本發(fā)明抗體同源物的免疫治療有效量將視施用程序、所施用的抗體同源物的單位劑量、抗體同源物是否與其它治療藥劑一同施用、病人的免疫及健康情況、所施用的特定抗體同源物的抗病毒活性而定。預(yù)防HIV感染的免疫治療，如每單位劑量的抗體同源物(完整抗體)其免疫治療有效量范圍為每公斤患者體重約1至100mg，優(yōu)選為每公斤患者體重約5至50mg，最優(yōu)選為每公斤患者體重約5mg。應(yīng)每兩周施用一次單位劑量，且當(dāng)有意外接觸情況如被針頭刺傷后優(yōu)選的應(yīng)立即施用。可以數(shù)種方法來測定其抗病毒效果，包括病毒負荷。然而，應(yīng)了解也可使用低或高劑量及其它施用程序。非完整抗體的抗體同源物的治療方法有些不同，視其體積及藥學(xué)性質(zhì)而定。為了能更充分了解本發(fā)明而給出下列實施例。這些實施例只是為了說明之用，因此本發(fā)明的范圍在任何情況下并不因此而受到限制。實施例1在體外中和試驗中以針對HIV-1gp120的抗體來比較對實驗室株與HIV原代分離物的敏感性以抗體來測定其中和病毒能力的特定步驟細胞將人類T細胞系MT-2(No.237,NIHAIDS研究及參考試劑方法目錄)培育在如前述有15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(Hanson等人，臨床微生物雜志(JClinMicrobiol),1990,28:2030-2034)。以Ficoll-Hypaque梯度分離法由新鮮淡黃色外表的單元中分離出屬陰性血清供體的HIV-1外周血單核細胞(PBMC)(OrganonTeknika公司，Durham,NC)。以0.5％PHA-P(DifcoLaboratories,Detroit,MI)刺激所得的PBMC。3至4天后，除去含有PHA-P的培養(yǎng)基并讓細胞培養(yǎng)在含有15％胎牛血清、900μg/mL谷胺酰胺、抗生素及5％白介素-2的RPMI培養(yǎng)基中(CellularProducts,Inc.,Buffalo,NY)。病毒HIV-1MN是適應(yīng)了實驗室環(huán)境的病毒株，目前由位于馬里蘭州百沙士達市的美國國家衛(wèi)生院維持并以永久性感染的H9細胞系方式提供(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgramCatalogno.402)，我們由此制備出無細胞濃縮物。通過與PBMC共培養(yǎng)由患者的PBMC中制備HIV-1的原代分離物。通過PBMC以不超過3-5代的方式制備原代分離物的細胞濃縮培養(yǎng)物且通過離心加以分類。(Sawyer等人，病毒學(xué)雜志，1994,68:1342-1349)。此由位于加州柏克萊加州健康服務(wù)部門的卡爾漢森(CarlHanson)提供。MT-2微小空斑中和分析試驗在測定中和HIV抗體的滴度時采用的方法是，先讓一系列稀釋過的血清或抗體與固定量的HIV預(yù)溫育，之后感染對HIV敏感的MT-2細胞，并在單層細胞上形成由HIV引發(fā)的微小空斑。無論是由適應(yīng)了實驗室環(huán)境的病毒株分離的產(chǎn)物或是原代分離物，由于微小空斑代表MT-2細胞與受HIV感染的細胞融合后所產(chǎn)生的巨大合胞體所形成，此分析方法只適用于SI分離物；且無論是由病毒至細胞或細胞至細胞間傳遞的抑制情形均可以此分析法來作評估，因為合胞體形成的抑制是由抗體對HIV顆粒或是HIV感染的細胞的作用所造成的，即，此方法可同時測定病毒對細胞HIV誘導(dǎo)的融合或細胞至細胞間HIV誘導(dǎo)的融合的抑制情形。可通過所降低的微小空斑數(shù)目，即在一周后觀察由伯比定碘(propidiumiodide)染色的空斑數(shù)目來觀察中和的情形(參見，Hanson等人，臨床微生物學(xué)雜志，1990,28:2030-2034)。在此分析法中，病毒及血清或抗體均以50％合并的、去纖維蛋白的、正常人類血漿稀釋以除去任何非特異性的增高或抑制效果。血清及抗體GP抗-gp120N-端V3MN是從一種已被超免疫的豚鼠體內(nèi)收集的血清(Wang等人，科學(xué)，1991,254:285-288)，其中帶有相應(yīng)于HIV-1MN的gp120多變的V3結(jié)構(gòu)域中的N-端部分(抗-N-端V3MN)的合成肽抗原。GP抗-gp120N-端V3的文庫血清是來自三只以肽混合物進行超免疫的豚鼠體內(nèi)收集的血清，此肽混合物是約1×1013可能的HIV-1N-端V3序列的總合(抗-N-端V3文庫)。用于豚鼠免疫接種的N-端V3MN和N-端V3免疫原庫是如Walfield等人所述可用于產(chǎn)生帶有數(shù)種實驗室HIV-1株的中和活性的多克隆抗體的多分支N-端V3合成肽免疫原(Koff等人編輯，艾滋病研究綜述(AIDSResearchReviews)，第18章，MarcelDekker:紐約，1993)。另一種抗-gp120抗體是重組人單克隆抗體(Mab)，命名為IgG1b12，其帶有對CD4上gp120的結(jié)合位點的特異性(抗gp120CD4-BS)(Burton等人，科學(xué)，1994,266:1024-1027)。由長時間無癥狀但血清呈陽性的HIV-1捐贈者的骨髓制備的抗體-噬菌體展示文庫中以Fab片段的方式生成IgG1b12，將其克隆到重組DNAIgG1表達載體中來轉(zhuǎn)換成完全人類抗體。此被視為用于中和各類HIV原代分離物的抗體的一種最佳標準(Burton等人，出處同前)。結(jié)果抗-N-端V3MN豚鼠抗血清、抗-N-端V3文庫豚鼠抗血清和IgG1b12(抗gp120CD4-BS)的HIV-1中和活性的比較示于表2?；贖IV-1MN實驗室株和兩種HIV-1原代分離物(23135和BR014)來測定兩種抗-N-端V3血清的中和活性。以兩種原代分離物(23135和BR014)來測定抗-gp120CD4結(jié)合位點的抗體的中和活性。以MT-2微小空斑中和活性分析試驗來測量中和活性，以多克隆抗體血清稀釋滴度表示的終點(50％和90％)和以單克隆抗體濃度(μg/mL)表示的結(jié)果示于表2。HIV-1MN，生長于T細胞系H9的適應(yīng)了實驗室環(huán)境的病毒株，對兩種抗-N-端V3抗血清的中和活性都非常敏感，但相對于較不具有菌株特異性的抗-N-端V3庫抗血清，抗-N-端V3M的活性要高出四倍。PBMC培育的原代分離物則對任一抗-N-端V3血清的中和活性具有抵抗力。但是，至少一種原代分離物可被抗-gp120CD4結(jié)合位點，IgG1b12中等程度地中和。這些結(jié)果反應(yīng)出實驗室HIV-1株與原代分離物之間對中和反應(yīng)敏感度的差異，表示實驗室HIV-1株對于菌株特異性的抗-gp120N-端V3抗體的敏感性，原代分離物對這類抗體的耐受性，以及某些原代分離物被針對宿主CD4受體上gp120結(jié)合的抗體所中和的敏感性。表2針對HIV-1實驗室株和HIV-1原代分離物抗-gp120抗體的中和活性*wpi免疫接種后的周數(shù)實施例2針對HIV-1原代分離物的抗宿主細胞抗體其體外中和活性的表征以蛋白A親和層析法由腹水中純化單克隆抗體并由血漿中純化豚鼠抗-gp120N-端V3的多克隆抗體。在無菌磷酸緩沖鹽液(PBS)中以1mg/mL重構(gòu)抗體并制備其在PBS中一系列的稀釋液，以用于HIV-1的中和分析試驗。單獨分析每一種抗體并合并入第7-15組混合物中以顯示不同特異性抗體間有或無協(xié)同作用。以兩種原代分離物通過MT-2微小空斑中和試驗分析來測定抗HIV-1的中和活性并以終點(50％和90％)的抗體濃度(μg/mL)來表示。結(jié)果表3的結(jié)果顯示抗兩組分化體BHIV-1的原代分離物(23135和BR014)的抗體中和活性，此類抗體包括對各種細胞表面抗原(第1和2組，HLADR的單克隆抗體ID1和80A；第3組，HLAA、B、C重鏈的單克隆抗體A1.4；第4組，β2-微球蛋白的單克隆抗體H28；和第5組，針對含CD4蛋白質(zhì)的宿主細胞抗原復(fù)合物的B4)具有特異性的小鼠單克隆抗體，以取自HIV-1MN的gp120的N-端V3結(jié)構(gòu)域的合成肽免疫接種豚鼠所制備出的抗gp-120N-端V3MN的多克隆抗體(第6組)，這些抗體的混合物(第7-15組)，和五種額外的針對充分表征的抗T細胞抗原的單克隆抗體(第16組，E羅賽受體的單克隆抗體(Erosettereceptor)；第17組，T3抗原的單克隆抗體；第18組，Leu1的單克隆抗體；第19組，T8抗原的單克隆抗體；和，第20組，T細胞抗原受體的單克隆抗體C37)(Wang等人，雜交瘤1986,5:179-190)。在表3的實驗中所測試的11種抗體中，只有衍生自以T細胞系HPB-ALL免疫接種的小鼠的單克隆抗體，B4(第5組)(本發(fā)明優(yōu)選的實施方案之一，其對含CD4的宿主細胞受體抗原復(fù)合物具有獨特的結(jié)合活性)，對原代分離物表達出非常強的中和活性。第7-15組的抗體混合物只在含有B4時才有中和活性。第7-10和15組與第11-14組的結(jié)果類似。此外，比較第5、第9、10、15和第7和8組的中和活性顯示混合物的中和活性主要由B4造成的。其它抗體只會稀釋B4的中和活性且并無證據(jù)顯示抗本發(fā)明含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物的抗體(MabB4)和其它抗細胞抗體或抗-gp120N-端V3抗體間有任何協(xié)同作用。沒有任何一種已知在HPB-ALL細胞上表達的單克隆抗體抗其它T細胞抗原，在可檢測的水平上中和HIV-1原代分離物。表3抗宿主細胞抗原的單克隆抗體對HIV-1所有B分化體原代現(xiàn)場分離物的中和活性(MT-2微小空斑中和測定)</tables>實施例3以HPB-ALL細胞免疫接種BALB/c小鼠產(chǎn)生抗含CD4的宿主抗原復(fù)合物的單克隆抗體測定單克隆抗體與rsCD4和表達CD4的細胞之間反應(yīng)性的特定方法rsCD4由商業(yè)來源(美國生物科技公司，劍橋，MA)及國家衛(wèi)生院(MIH)艾滋病研究中心和參考藥劑計劃中獲得純化的重組可溶性CD4。以rsCD4的ELISA試驗測定抗CD4反應(yīng)性于4℃下在96孔板上以每孔100μL的量包被溶于10mMNaHCO3緩沖液，pH9.5,0.25μg/mL的rsCD4，溫育過夜。將rsCD4包被的孔與250μL溶于PBS中3％(重量百分比)的明膠在37℃下溫育1小時以封閉非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點，以含有0.05％(體積百分比)TWEEN20的PBS清洗3次后晾干。以內(nèi)含20％(體積百分比)正常羊血清、1％(重量百分比)明膠和0.05％(體積百分比)TWEEN20的PBS稀釋測試樣品，除非特定指明否則所有稀釋均為1∶20(體積比)。將100μL的稀釋樣品加入每一孔中并使其在37℃下反應(yīng)1小時。之后以0.05％(體積百分比)溶于PBS的TWEEN20清洗6次以除去未結(jié)合的標記過的抗體。將100μL溶于1％(體積百分比)正常羊血清，稀釋比為1∶1000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠-IgG或山羊抗豚鼠-IgG,0.05％(體積百分比)溶于PBS的TWEEN20加入每個小孔中并在37℃下溫育15分鐘。之后以0.05％(體積百分比)溶于PBS的TWEEN20清洗孔6次以除去任何未結(jié)合的標記過的抗體結(jié)合物并使其與100μL內(nèi)含0.04％(重量百分比)鄰苯二胺(OPD)和溶于檸檬酸鈉緩沖液，pH5.0,0.12％(體積百分比)過氧化氫的混合物作用15分鐘。加入100μL1.0MH2SO4中止反應(yīng)并測量產(chǎn)物在492nm(A492)的吸光度。以間接免疫熒光染色來測定對于表達CD4的細胞的反應(yīng)性先以內(nèi)含1％BSA的PBS來清洗每孔中所含0.5×106的表達CD4的細胞(即，HPB-ALL或SUP-T1細胞系)，之后使其與指定的單克隆抗體或豚鼠抗-rsCD4血清在室溫下溫育45分鐘。在細胞與第一種染色的抗體溫育后，以同樣的清洗液清洗細胞2次再與1∶500稀釋的熒光標記的(FITC)-山羊抗小鼠IgG或(FITC)-結(jié)合山羊抗豚鼠IgG二級抗體(Cappel,MalvernPA)一同于室溫下作用45分鐘。再次以同樣的清洗液清洗染色的細胞，之后以細胞熒光圖譜和/或免疫熒光顯微鏡來測定染色的細胞比例、染色強度及更優(yōu)選的每一抗體的抗原結(jié)合的模式進行熒光分析。結(jié)果HPB-ALL細胞系是衍生自患有急性淋巴母細胞白血病患者的惡性人類T細胞系，以間接免疫熒光觀察，其具有以下膜的表型CDS+(T1/Leu+)，能表達的CD4(T4/Leu3A+),CD8+(T8/Leu2/C8+),CD3+(T3/Leu4+),CD6+(T6/Leu6+),CD2+(T11/Leu5/D9+),CD25+(Tac+),HLA-A、B、C和β2微球蛋白+,HLA-DR-(Wang等人，1986，出處同前)。以腹膜注射方式對BALB/c小鼠接種5-10×106經(jīng)PBS清洗過的溶于弗氏完全佐劑中呈指數(shù)函數(shù)生長的HPB-ALL細胞，之后每隔一周至兩周再由腹膜追加注射5-10×106經(jīng)PBS清洗過不含任何佐劑的呈指數(shù)函數(shù)生長的細胞，總計期限為三個月。最后一次靜脈注射5×106經(jīng)PBS清洗過的HPB-ALL細胞后3天，將脾切除并由此制備單核細胞懸浮液。以聚乙二醇(PEG)來處理單核脾細胞以使其能與骨髓瘤細胞和體細胞雜交。將融合細胞懸浮后加入96孔板中溫育，以上述rsCD4ELISA方法篩選含有特異作用于rsCD4抗體的孔。收集rsCD4反應(yīng)性的雜交瘤并于96孔平底培養(yǎng)皿中在有飼養(yǎng)細胞存在下以限制性稀釋法篩選單細胞克隆。隨后先以rsCD4-ELISA試驗篩選這些亞克隆雜交瘤細胞系是否對rsCD4有反應(yīng)，之后再進一步篩選這些對rsCD4有反應(yīng)的細胞系其抗體是否能與HPB-ALL細胞作用。只有兩個細胞系，稱為B4和M2，對rsCD4有中等程度的反應(yīng)性且能染色HPB-ALL細胞，選擇這兩株細胞系進行隨后的再克隆，通過腹膜內(nèi)注射1×107細胞至以姥鮫烷刺激過的nu/nu小鼠體內(nèi)腹水的形式維持細胞。實施例4-13中表征了由此兩株細胞所分泌出的抗體，以及其它能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體的結(jié)合與中和活性。實施例4通過用rsCD4免疫BALB/c小鼠所產(chǎn)生的真正的CD4特異性單克隆抗體結(jié)果BALB/c小鼠在第0天以腹膜注射方式接種10μg溶于弗氏完全佐劑(CFA)的rsCD4，并且分別在第21、42和137天追加注射10μg溶于弗氏不完全佐劑(ICFA)的rsCD4，且在第145天以10μg溶于PBS的rsCD4作最后一次靜脈注射的加強免疫。在最后一次加強免疫后3天將脾切除并進行融合。以rsCD4-ELISA來篩選那些含有能與rsCD4反應(yīng)的抗體的孔。收集四個雜交瘤細胞，命名為E6、E31、H5和J33并進行單細胞克隆。隨后將這些雜交瘤細胞進行再克隆并維持以用于在腹水中培育。在對照組中，于第0天以100μg溶于弗氏完全佐劑的rsCD4免疫接種一只豚鼠，并于第14和28天加強免疫100μg溶于弗氏不完全佐劑的rsCD4。分別于第28和42天收集該動物血清作為抗-rsCD4的陽性對照組。實施例6-10中表征了四株雜交瘤及其抗體的結(jié)合與中和活性，以及其與其它單克隆抗體B4和M2的比較。實施例5通過免疫接種HPB-ALL細胞至BALB/c小鼠并追加接種gp120-rsCD4復(fù)合物產(chǎn)生的真正的CD4特異性單克隆抗體結(jié)果BALB/c小鼠在第0天以腹膜注射方式接種5×106溶于弗氏完全佐劑(CFA)的HPB-ALL細胞，并且在第28天追加注射5x106溶于弗氏不完全佐劑(ICFA)的HPB-ALL細胞，再于第56天開始每周一次以溶于ICFA的HIV-1gp120-rsCD4復(fù)合物(每次10μg)作加強免疫接種持續(xù)3周。在最后一次加強免疫后3天將脾切除并進行融合。檢出那些含有能與rsCD4反應(yīng)的抗體的孔。收集三個雜交瘤細胞，命名為D5、E2和I26，并進行篩選、克隆和再克隆，維持這些雜交瘤用于在腹水中培育。實施例6-10中表征了此三株雜交瘤細胞系及其抗體的結(jié)合與中和活性，以及其與其它單克隆抗體B4和M2的比較。實施例6能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體和多克隆抗體其各自的結(jié)合活性與其中和HIV原代分離物的活性的表征測定單克隆抗體與rsCD4、結(jié)合了衍生自CCKR5表面分子的肽的rsCD4、合成的CD4肽以及與表達CD4的細胞之間反應(yīng)性的特定方法以抗體來測定病毒的中和活性的方法詳述于實施例1中，而測定抗體與rsCD4及與含表達CD4的細胞的細胞表面結(jié)合的方法則詳述于實施例3中。本實施例則只提供測定抗體與合成的CD4肽的反應(yīng)性及用以確定表位圖譜的ELISA抑制試驗分析的詳細步驟及方法。合成的CD4肽列于表1的肽是以Merrifield固相合成法以Fmoc化學(xué)法于應(yīng)用生物系統(tǒng)肽自動合成儀(AppliedBiosystemsautomatedpeptidesynthesizers)上所合成出來的(型號430、431和433A)。在所期望肽的裝配后，依標準程序以三氟醋酸將肽由樹脂中切出并除去氨基酸側(cè)鏈上的保護基團。對于環(huán)肽，將切下的肽溶于15％DMSO水溶液中48小時以加速分子內(nèi)兩半胱氨酸間二硫鍵的形成。表1中標有*號的肽是如此環(huán)化的。其它肽則為線形。標號有*號的肽則含有甘氨酸-甘氨酸的間隔基及來自乙型肝炎病毒(HBV)的T細胞輔助表位。以HPLC來純化所切出，萃取及清洗后的肽并以質(zhì)譜儀及反相HPLC來進行表征。以合成的CD4肽為底物的ELISA試驗以合成的CD4肽為底物的ELISA試驗方法除了抗原包被步驟外與前述rsCD4的ELISA試驗方法基本類似，其中將微孔板于37℃下與5μg/mL指定的CD4肽，而非4℃下0.25μg/mL的rsCD4，反應(yīng)1小時進行包被。ELISA抑制試驗分析通過在rsCD4結(jié)合稀釋終點稀釋后的樣品預(yù)先與濃度范圍在1.67mg/mL至16.7μg/mL的競爭性肽于37℃下預(yù)溫育1小時來測定在rsCD4ELISA試驗中由肽引發(fā)的抗體結(jié)合活性的抑制。將預(yù)溫育的樣品與肽混合物直接用于上述標準的rsCD4ELISA試驗中。以相對于在無肽存在下預(yù)溫育過的適當(dāng)稀釋后的相同單克隆抗體來計算抑制百分比。同樣以類似的方法在rsCD4結(jié)合稀釋終點，指定濃度的競爭性rsCD4與稀釋樣品預(yù)溫育，以測量在rsCD4-ELISA試驗中由rsCD4所引發(fā)的抗體結(jié)合的抑制。間接免疫熒光抑制分析以間接免疫熒光染色技術(shù)來進行競爭性抑制分析，將細胞與各種干擾劑在一特定步驟中溫育并在每兩次作用之間以同樣的清洗液清洗兩次。結(jié)果由上述實施例3、4和5所述的融合實驗中篩選出9個能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體進一步分析其(1)通過間接免疫熒光分析其與表達CD4的細胞的反應(yīng)模式，(2)以直接結(jié)合及間接抑制ELISA試驗作為固相抗原(如表1中合成的CD4肽)來測定其在CD4上的抗原性，且(3)以MT2微小空斑中和分析試驗測定其中和HIV原代分離物的能力?？贵w特性測定除了屬于鼠免疫球蛋白γ2a,k型的單克隆抗體B4外，所有其它的單克隆抗體以鼠雜交瘤亞同型化試劑盒(Calbiochem,SanDiego,CA,Cat.No.386445)檢測后發(fā)現(xiàn)均屬于γ1,k型(表7)。所選出的9種能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體，如在rsCD4ELISA試驗(表4)中所示均與rsCD4蛋白質(zhì)表現(xiàn)出免疫反應(yīng)活性，其中與單克隆抗體J33、H5、E6、E2和I26有較強結(jié)合活性，與單克隆抗體D5結(jié)合活性較弱，而與單克隆抗體B4、M2和E31有中等強度的結(jié)合活性。由先前以溶于完全和不完全佐劑中的100μgrsCD4進行免疫接種的動物體在第28天取血后所獲得的豚鼠抗-rsCD4血清在rsCD4ELISA試驗中對rsCD4具有極高的反應(yīng)性，其反應(yīng)終點滴度大于105。已知此血清對rsCD4的多個結(jié)構(gòu)域均具有反應(yīng)性因此在接下來的抗體特性實驗中被用作真正抗Cd4的陽性對照組，參見表4、7、8。表4以衍生自CD4分子胞外域1-4的特定合成肽來定位各類CD4反應(yīng)性單克隆抗體的抗原決定簇凡A492大于0.150的樣品均視為具有反應(yīng)性且為尋找方便起見在其反應(yīng)值下加底線。#豚鼠抗-rsCD4血清(4wpi)以1∶1000稀釋度在492nm下的吸光值。*環(huán)形肽。每一單克隆抗體上的表位的鑒定通過表1中所列的合成CD4肽以直接結(jié)合實驗來鑒定CD4分子上能被每一單克隆抗體識別的表位。這些肽依現(xiàn)有人CD4的前兩個結(jié)構(gòu)域(Wang等人，自然，1990,348:411)及由現(xiàn)有小鼠CD4分子的同源分析所推斷出的第3及第4結(jié)構(gòu)域(Brady等人，科學(xué)，1993,260:979)的3D結(jié)構(gòu)所設(shè)計，以使合成CD4肽與天然CD4之間血清學(xué)交叉反應(yīng)活性達到最大。其與片段的結(jié)合同其與rsCD4的結(jié)合類似。以酶于一系列稀釋的免疫分析中來確定每一抗體的結(jié)合，對于結(jié)合的鼠抗體的檢測，起始抗體濃度為50μg/mL，并以指定的肽或rsCD4作為固相抗原。在以肽及rsCD4為底物的ELISA試驗中，以吸光度來表示結(jié)合的結(jié)果。為簡化識別模式，只有經(jīng)一系列稀釋后濃度最高的抗體達到50μg/mL的反應(yīng)信號的結(jié)果才被顯示出來。認為A492大于0.150的樣品具有反應(yīng)性。表4中有下劃線的結(jié)果表示其結(jié)合反應(yīng)呈陽性。由此種細密分析的結(jié)果參照CD4的一級氨基酸序列(表4)，檢定所有單克隆抗體中肽結(jié)合位點及其表位所在的結(jié)構(gòu)域。由表4所示的肽的反應(yīng)模式將9種抗體分成3組(圖2)。第一組的抗體能識別線性表位位點且包括兩種分別稱為E6和E31的抗體。由一合成肽可知此類抗體可識別線性表位結(jié)構(gòu)域(表4)。更明確的來說，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體E6識別位于來自與CDR2GP120結(jié)合結(jié)構(gòu)域互相重疊的第一結(jié)構(gòu)域的一個短至15個氨基酸確定的結(jié)構(gòu)域之外的表位(AA41-AA55)，且E3可以和一大的環(huán)形肽AA118-AA165反應(yīng)。第2組的抗體，包括五種單克隆抗體H5、J33、E2、D5和I26，可與一衍生自CD4中兩個結(jié)構(gòu)域的線性肽反應(yīng)，偶而則優(yōu)選與其中的一個結(jié)構(gòu)域作用(表4)，因此定性這類抗體為可識別不連續(xù)構(gòu)象的表位。更明確的來說，H5主要是與CD4分子第一結(jié)構(gòu)域中的CDR3區(qū)(AA79-AA96)反應(yīng)，且對以環(huán)形肽AA133-AA151和AA118-AA165為特征的CD4分子第二結(jié)構(gòu)域具有中等程度的反應(yīng)性；J33則主要是與以環(huán)形肽AA133-AA151為特征的CD4第二結(jié)構(gòu)域的中心位點反應(yīng)，且對分別來自CDR1和CDR3結(jié)構(gòu)域的帶有對結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵形成均有貢獻的肽(AA1-AA20)和(AA68-AA92)的人工二聚物(P1852，表4)為特征的第一結(jié)構(gòu)域具有中等程度的反應(yīng)性；D5可識別分別以環(huán)形肽AA1-AA20和AA235-AA251為特征的第一及第三結(jié)構(gòu)域中兩段氨基酸；E2主要識別以環(huán)形肽AA235-AA251為特征的第三結(jié)構(gòu)域中的一段氨基酸，對于以雜合肽1858為特征的CD4分子的N-端(AA1-AA20)具有中等程度的反應(yīng)性；I26識別的結(jié)構(gòu)域其大部分與D5重疊，對以一環(huán)形肽AA235-AA251為特征的第三結(jié)構(gòu)域較具反應(yīng)性。以純化的rsCD4或充分確定的rsCD4-gp120復(fù)合物免疫接種小鼠所得的前兩組抗體，其對天然CD4分子有很強的反應(yīng)性且對CD4分子中的各個結(jié)構(gòu)域具有較強的反應(yīng)性，因此可視為真正的抗-CD4的抗體。最后，第三組的單克隆抗體B4及M2，如rsCD4ELISA試驗中所示即使在飽和濃度下(50μg/mL)仍可對天然CD4分子表現(xiàn)出中等程度的反應(yīng)性(表4)，對于衍生自CD4分子中許多的肽如AA1-AA20、AA79-AA96、AA118-AA165、AA213-AA226、AA235-AA251、AA297-AA351和AA361-AA375則只有非常弱的反應(yīng)性。有趣的是，B4對CDR2的第一結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)性，即已知抗-CD4抗體Leu3A和OKT4A結(jié)合的位點在其與其它肽的反應(yīng)性比較時喪失。因此第三組中的這兩個抗體屬于可識別分散的、不連續(xù)構(gòu)象的表位的抗體。會干擾B4-rsCD4與M2-rsCD4反應(yīng)的模擬肽的檢定為進一步破譯CD4分子可能的與B4和M2兩抗體接觸的位點，于rsCD4ELISA試驗中測試衍生自靠近B4-rsCD4或M2-rsCD4結(jié)合反應(yīng)結(jié)構(gòu)域(表4)的肽其抑制B4-rsCD4與M2-rsCD4反應(yīng)的能力。將rsC4ELISA試驗中終反應(yīng)濃度(即，對B4為10μg/mL，對M2則是20μg/mL)所產(chǎn)生的信號作為競爭性肽結(jié)合實驗中的陽性對照組。表5顯示在rsCD4ELISA試驗結(jié)果中所得的抑制百分比，其中CD4肽經(jīng)過一系列的稀釋并分別在B4與固態(tài)結(jié)合的rsCD4結(jié)合之前與0.1mL10μg/mL的B4一起溫育。將肽以1.67mg/mL、167μg/mL和16.7μg/mL(分別稱濃度1、濃度2和濃度3)的濃度用于競爭性抑制實驗中。只有對B4-rsCD4反應(yīng)顯示出極強抑制或增強效果的肽才顯示出來以用于比較。增強效果是以抑制的負值來表示。表6顯示在rsCD4ELISA試驗中所得結(jié)果的抑制百分比，其中選定的CD4肽以如表5的程序進行一系列的稀釋并分別在M2與固態(tài)結(jié)合的rsCD4結(jié)合之前與0.1mL20μg/mL的M2一起溫育。只有對M2-rsCD4反應(yīng)顯示出極強抑制或增強效果的肽才顯示出來以用于比較。如表5所示，B4與rsCD4的結(jié)合可被衍生自CD4分子的AA1-AA20、AA6-AA20、AA81-AA92、AA79-AA88、AA154-AA165和AA297-AA351的肽強烈抑制，顯示這些結(jié)構(gòu)域參與與CD4相關(guān)構(gòu)象的表位的形成。與Y.Chiba(出處同前)的單克隆抗體Leu3A及Jameson等人(出處同前)的單克隆抗體OKT4A報告不同的是，來自AA36-AA47結(jié)構(gòu)域的肽可明顯增強B4與rsCD4的結(jié)合，因此暗示AA30-AA47對B4的結(jié)合可能是空間上的相近而非直接參與。抑制位點通常位于分子內(nèi)二硫鍵的周圍(表5)。對于M2抗體也可觀察到各類僅略有不同的CD4肽類似的抑制及增強模式(表6)。表5特定CD4肽對＂B4-rsCD4＂反應(yīng)的競爭性抑制或增強*環(huán)形肽表6特定CD4肽對＂M2-rsCD4＂反應(yīng)的競爭性抑制或增強*環(huán)形肽實施例7單克隆抗體在表達CD4的細胞的細胞表面的結(jié)合性質(zhì)將9種能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體及豚鼠抗-rsCD4血清用于各種間接免疫熒光分析中以檢測在HPB-ALL細胞表面上其表位的細胞表面表達及檢測HIV-1gp120與能被各種CD4反應(yīng)性抗體識別的CD4表位之間的空間關(guān)系。結(jié)果表7總結(jié)了由三個融合實驗中所培育的鼠單克隆抗體的結(jié)果，其涉及(1)它們的亞型；(2)在rsCD4ELISA試驗中它們與rsCD4的反應(yīng)性；(3)在間接免疫熒光分析中其與表面CD4的反應(yīng)性，以細胞反應(yīng)性的百分比，染色程度(0-3+)及結(jié)合模式表示；(4)已結(jié)合的HIV-gp120干擾抗體與含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合的能力；(5)已結(jié)合的抗體抑制HIVgp120與含CD4宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合的能力，和(6)抗體中和HIV-1原代分離物，如23135，的能力。已結(jié)合在細胞膜所結(jié)合的CD4上的HIVgp120結(jié)合位點與能被各類可和CD4反應(yīng)的單克隆抗體識別的CD4表位之間的空間關(guān)系特別詳列于表7中的第(3)、(4)和(5)項中。以用FITC標記的抗小鼠IgG、用FITC標記的抗豚鼠IgG或用FITC標記的gp120對HPB-ALL細胞進行間接免疫熒光染色來顯示其與CD4之間的結(jié)合模式。模式顯示了在無gp120(3)存在下抗-CD4小鼠單克隆抗體的結(jié)合，在有已結(jié)合的單克隆抗體(5)存在下FITC標記的gp120的結(jié)合，及在有已結(jié)合的gp120(4)存在下單克隆抗體的結(jié)合。單克隆抗體B4和M2其獨特的中和活性與其它七種抗CD4單克隆抗體在CD4上的結(jié)合位點不同，但有時靠近B4結(jié)合位點，顯示于第(5)及第(6)項中。表7單克隆抗體與rsCD4及表面CD4受體復(fù)合物的反應(yīng)性以及單克隆抗體對HIVgp120與CD4細胞結(jié)合的抑制能識別一衍生自CD4gp120結(jié)合位點中與CDR2部位重疊的第一結(jié)構(gòu)域(AA41-AA55)的約15個氨基酸大小的線性表位(Wang等人，自然，1990348:411和Ryu等人，自然，1990,348:419)的單克隆抗體E6，可與rsCD4蛋白質(zhì)及HPB-ALL細胞強烈反應(yīng)，顯示此HIV結(jié)合位點更多地暴露于表面的本質(zhì)。然而，即使真正的抗-CD4單克隆抗體J33、H5、和E2在rsCD4ELISA試驗中可對rsCD4分子呈現(xiàn)較強烈的反應(yīng)活性，但在HPB-ALL細胞上卻只觀察到約中等程度的染色活性。對這些單克隆抗體而言，分數(shù)1+代表在細胞表面CD4抗原復(fù)合物中其表位的暴露程度較小。此外，先前表征過能高度識別來自rsCD4及第1、2和4結(jié)構(gòu)域的免疫表位的豚鼠抗-rsCD4血清(實施例6)，在間接免疫熒光試驗中也只對HPB-ALL細胞表達出中等程度的染色活性，再一次顯示在CD4陽性細胞表面上對于CD4分子較低的暴露機率。相反，單克隆抗體B4和M2卻均能對細胞造成高度的染色，雖然其與rsCD4的反應(yīng)活性僅為中等程度，此結(jié)果顯示接觸位點除了CD4外可能尚有共同受體的參與，共同受體與CD4一同形成含有CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物。此點也可由B4-rsCD4反應(yīng)可被數(shù)種衍生自CD4的肽所抑制而看出(表5)，顯示細胞表面上有一大的包含CD4蛋白質(zhì)的抗原復(fù)合物(圖3)且其整體結(jié)構(gòu)與rsCD4及含CD4的細胞表面抗原復(fù)合物的結(jié)構(gòu)不同。以單克隆抗體抑制gp120與CD4細胞間的結(jié)合這些單克隆抗體的結(jié)合特性的進一步評估是通過評定其抑制HIV與能表達CD4的HPB-ALL細胞結(jié)合的能力。方法是在細胞已先和個別單克隆抗體(100μL濃度為50μg/mL的飽和濃度)作用的條件下，或是以PBS作為負對照組，隨后將細胞溫育在100μL，以1∶200稀釋的FITC標記的HIV-gp120中。在與原代分離物和標記的二級抗體溫育的過程之間清洗細胞2次。對先以PBS，接著以FITC-gp120進行溫育的細胞，可觀察到其細胞表面亮度值為1+的特征小簇狀染色模式(表7及圖3)。此種FITC-gp120-HPB-ALL特征染色模式也可在先以單克隆抗體H5、E31、J33、D5、E2或I26溫育后接著以FITC-gp120染色的細胞中觀察到，因此顯示這些抗體缺乏抑制FITC-gp120結(jié)合的能力，且說明了gp120的結(jié)合位點與這些抗-CD4抗體的結(jié)合位點并無關(guān)聯(lián)。然而，先以單克隆抗體B4、M2或E6染色卻可完全抑制FITC-gp120的特征染色模式，顯示這些抗體對CD4-gp120結(jié)合的強烈抑制活性，也說明了gp120的結(jié)合位點與B4、M2和E6的結(jié)合位點相互關(guān)聯(lián)。與E6不同，抗體B4或M2無法識別CD4上HIV的結(jié)合位點(即，CDR2部位)，因此一般認為此種B4或M2的抑制活性是由于空間位阻所造成的。通過gp120抑制單克隆抗體與表達CD4的細胞間的結(jié)合對先以gp120結(jié)合到表達CD4的細胞上，再評價能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體結(jié)合所產(chǎn)生的效果。先將1×106HPB-ALL細胞與來自HIV-1ⅢB株(AmericanBiotechnologies,Inc.,Cambridge,MA)的過量的10μggp120在37℃下溫育45分鐘。以清洗緩沖液將經(jīng)gp120處理過的HPB-ALL細胞清洗2次后依上述間接免疫熒光染色步驟與特定單克隆抗體一起溫育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有E6與表達CD4的細胞間的結(jié)合因先與gp120結(jié)合而被完全抑制(表7,(4))。E6所識別的表位位置靠近那些能被OKT4A及Leu3A識別的位點。單克隆抗體B4和M2與表達CD4的細胞間的結(jié)合則不因先與gp120結(jié)合而受到顯著影響，顯示此兩種抗體在HIV結(jié)合后仍能與表達CD4的細胞結(jié)合。此項觀察結(jié)果為實施例16中(參見表16和17)在病毒結(jié)合后抗體B4所呈現(xiàn)出的體外中和活性水平以及在hu-PBL-SCID小鼠模型中(參見實施例18，表20)以B4體內(nèi)接觸之后預(yù)防HIV的功效提供了一種可能的機理。實施例8以單克隆抗體中和HIV原代分離物結(jié)果當(dāng)9種能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體及豚鼠抗-rsCD4血清以上述的MT-2微小空斑試驗(實施例1)來測試其中和HIV-1原代分離物23135的能力時，只有B4和M2顯出頗強的抑制活性，分別在0.21和0.38μg/mL的濃度下產(chǎn)生50％的抑制效果(表7,(6))?？贵wE6可識別的位點靠近HIVgp120結(jié)合位點，同時也接近OKT4A和Leu3A可識別的位點，而H5主要識別CD4第一結(jié)構(gòu)域中位于CDR3部位的一個位點，兩者均只有微弱的中和活性，50％終點濃度分別是59和45.5μg/mL。與單克隆抗體B4和M2不同，其它真正的抗-CD4單克隆抗體在抑制微小空斑形成的試驗中(即，以HIV-1原代分離物抑制細胞融合與感染)未呈現(xiàn)對原代分離物明顯的中和活性。盡管豚鼠抗-rsCD4血清與rsCD4強烈反應(yīng)，此血清即使在高抗血清稀釋濃度下(＜1∶10)也無法抑制HIV所引發(fā)的細胞融合及感染。實施例9用于篩選雜交瘤的最佳免疫接種及篩選方法基于表7中的信息，我們可在此及表12中得出如下結(jié)論當(dāng)小鼠以新鮮清洗過的不含佐劑的CD4細胞進行超免疫接種時可成功制造出能分泌對含CD4宿主細胞抗原復(fù)合物有高度反應(yīng)性抗體的雜交瘤。為提高能與表達CD4的細胞反應(yīng)的雜交瘤細胞系的產(chǎn)生機率，首先將HPB-ALL或SUPT1細胞與抗T細胞表面抗原的單克隆抗體混合物一起溫育，包括能抗HLAA-B、C、CD3、T細胞受體、CD8、CD6、CD2和CD5抗原的抗體，以避免除了含CD4的抗原復(fù)合物外的HPB-ALL細胞表面抗原暴露于宿主免疫系統(tǒng)，因此可使宿主免疫反應(yīng)較易針對細胞表面含CD4的抗原的復(fù)合物，此抗原復(fù)合物包含HIV受體及共同受體。一種簡便的篩選方法包含了三個步驟，首先是在ELISA試驗中篩選能與rsCD4反應(yīng)和/或相對于rsCD4偏好與事先已用一衍生自趨化因子受體第三外部結(jié)構(gòu)域的肽，p2047，溫育過的rsCD4反應(yīng)的雜交瘤；隨后是在能與rsCD4/p2047和rsCD4反應(yīng)的細胞系中以間接免疫熒光分析來篩選出可和能表達CD4的細胞(例如HPB-ALL和SUP-T1細胞)進行強烈反應(yīng)的細胞系；接著是由能和表面CD4反應(yīng)的雜交瘤中篩選能分泌具有HIV-1原代分離物中和活性的抗體的雜交瘤，如標準MT2微小空斑減少分析所測。實施例10能與CD4反應(yīng)且其結(jié)合特性類似B4的單克隆抗體的篩選結(jié)合特性類似B4的單克隆抗體的鑒別可通過競爭性免疫抑制分析從CD4反應(yīng)性抗體中容易的鑒別出，此法可由(1)以下述rsCD4ELISA系統(tǒng)制備的偶聯(lián)有HRP的單克隆抗體B4，或(2)在如間接免疫熒光分析系統(tǒng)中伴隨FITC-抗生物素染色的HPB-ALL細胞制備生物素化的單克隆抗體B4，以檢測陽性B4信號的產(chǎn)生。以琥珀酰亞胺制備生物素化單克隆抗體B4以蛋白A親和層析法純化單克隆抗體B4并調(diào)整其濃度為每mLPBS中1mg。將0.71mgN-羥基琥珀酰亞胺生物素(Biotin-X-NHS,BoehringerMannheimBiochemicals,Indianapolis,IN,Cat.No.1008960)溶于0.31mL二甲基亞砜(DMSO)(BoehringerMannheimBiochemicals,Cat.No.1418165)中，隨后加入5mg溶于5mLPBS中的B4以使生物素與B4之摩爾比達50比1?；旌衔镉谑覝叵聰嚢?小時接著在2-8℃下對PBS充分透析，使B4的終濃度為0.71mg/mL。在競爭性免疫熒光染色分析中以生物素化B4作為示蹤劑來觀察各種單克隆抗體對＂表達B4-CD4的細胞＂反應(yīng)的抑制情形。過碘酸鹽法來制備偶聯(lián)辣根過氧化物酶的單克隆抗體B4酶與抗體間的偶聯(lián)反應(yīng)基本上依Wilson及Nakane所述方法，(Knapp等人，eds,1978Elisevier/North-HollandBiomedical出版社，免疫熒光及相關(guān)染色技術(shù)(ImmunofluorescenceandRelatedStainingTechniques),p215)，在酶與抗體間的摩爾比為0.48∶1的條件下來進行。在偶聯(lián)反應(yīng)后于PBS中對辣根過氧化物酶偶聯(lián)的單克隆抗體B4充分透析使抗體終濃度為0.18mg/mL。在競爭性ELISA試驗中此偶聯(lián)物以50μg/mL的濃度來抑制各種單克隆抗體對＂B4-CD4細胞＂的反應(yīng)。競爭性抑制及其檢測表8顯示9種抗-CD4單克隆抗體(單克隆抗體B4、M2、E6、H5、J33、E31、D5、E2和I26)和豚鼠抗-rsCD4血清在＂生物素化B4與表面含有CD4的復(fù)合物＂間反應(yīng)的競爭性抑制結(jié)果。以間接免疫熒光分析來進行競爭性抑制分析研究，其中在每一測試中將0.5×106能表達CD4的HPB-ALL細胞與以每100μL含飽和濃度10μg/mL的特定抗體或1∶50稀釋的豚鼠血清一起溫育，充分清洗后，再以100μL生物素化B4(由0.71mgB4/mL的溶液的1∶1000的稀釋液)作第二種染色，充分清洗后，再以100μL溶于PBS(pH8.2)中1∶250稀釋的FITC-抗生物素蛋白質(zhì)示蹤劑進行第三次染色(PierceChemicalCo..RockfordIL,Cat.21221)。表9顯示9種抗-CD4單克隆抗體(單克隆抗體B4、M2、E6、H5、J33、E31、D5、E2和I26)與＂HRPB4-rsCD4＂反應(yīng)的競爭性抑制的結(jié)果。以直接的rsCD4ELISA試驗來進行競爭性抑制反應(yīng)，其中固相所用rsCD4包被的孔已先用CD4肽1624a預(yù)處理以提高B4的結(jié)合信號。rsCD4包被的孔于120μL、50μg/mLHRP偶聯(lián)的單克隆抗體B4存在下加入30μL各類抗體(每一孔100μL，濃度為50μg/mL)。結(jié)果如表8所示，在所有測試過的單克隆抗體及豚鼠抗-rsCD4血清中，在間接免疫熒光分析中只有B4和M2能有效地抑制HPB-ALL細胞的生物素化B4(1∶1000稀釋)及FITC-抗生物素蛋白質(zhì)染色(PierceChemicalCo.,1∶250稀釋)。同樣如表9所示，在所有測試過的單克隆抗體中，在rsCD4ELISA分析中只有單克隆抗體B4和M2能對HRP-B4與rsCD4分子之間的結(jié)合呈現(xiàn)出高于45％的抑制效果。因此可以HRP偶聯(lián)的或生物素化的B4作為示蹤劑，以競爭性免疫分析來有效篩選得到能分泌結(jié)合活性(包括其對HIV原代分離物的中和活性)類似B4的抗體的雜交瘤，此篩選法較體外功能性篩選法例如標準MT2微小空斑中和分析試驗更加容易。更重要的是，7種真正的抗-CD4單克隆抗體中(即，單克隆抗體E6、H5、J33、E31、D5、E2和I26)沒有一種能有效的與B4競爭對rsCD4及對細胞表面上CD4受體復(fù)合物的結(jié)合位點的反應(yīng)(表8及9)。表8通過能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體抑制＂生物素化單克隆抗體B4與細胞表面上CD4受體復(fù)合物＂之間的反應(yīng)</tables>表9通過能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體抑制＂HRP偶聯(lián)的單克隆抗體B4與rsCD4＂之間的反應(yīng)1．以每孔0.1mL0.25μg/mL的rsCD4在4℃下過夜包被孔來進行競爭性ELISA試驗。以每孔0.1mL,50μg/mL的合成肽1624(表1)在37℃下處理孔板1小時以提高反應(yīng)性。2．測試個別單克隆抗體其對過氧化物酶偶聯(lián)的單克隆抗體B4(B4-HRP)與rsCD4結(jié)合的競爭性抑制作用。將120μL50μg/mL、120μL的B4-HRP與30μL50μg/mL的單克隆抗體混合。以30mLPBS而非所測試的單克隆抗體作為對照組。將每孔100μL的混合物移至rsCD4包被的孔板中以測試＂B4-HRP-rsCD4＂的反應(yīng)性。3．抑制％計算如下[(PBS對照組的A492nm-含有競爭性單克隆抗體的樣品的A492nm)÷PBS對照組的A492nml×100實施例11通過rsCD4抑制＂B4-rsCD4＂而非＂B4-表面含CD4的復(fù)合物＂的反應(yīng)單克隆抗體是與含CD4的宿主抗原復(fù)合物反應(yīng)結(jié)果表10顯示在間接rsCD4ELISA試驗中以rsCD4作為固相抗原(0.25μg/mL,0.1mL/孔，4℃，過夜包被)，并以0.2μg/mL,0.1mL/孔的條件純化B4以得到A492nm讀數(shù)為0.679為陽性對照組，測定“B4-rsCD4”的競爭性抑制所得結(jié)果。將濃度由0.008至25μg/mL的rsCD4與純化的B4于室溫下在與固相rsCD4溫育前預(yù)先溫育1小時。如表10所示，1μg/mL的rsCD4與2μg/mL的B4的預(yù)混物可抑制B4與固相rsCD4之間的50％反應(yīng)。表11顯示在間接免疫熒光分析中以HPB-ALL細胞(每次測試用0.1mL，其中含0.2-0.5×106細胞)作為靶細胞且將每次測試用0.1mL濃度0.71μg/mL的生物素化B4以使95％呈陽性反應(yīng)的細胞其染色強度達到3+，將濃度由0.005至50μg/mL的rsCD4在與表達CD4的HPB-ALL細胞作用前預(yù)先與生物素化B4于室溫下溫育1小時。如表11所示，與rsCD4ELISA試驗相反，即使當(dāng)rsCD4濃度高達50μg/mL時也不會抑制染有B4的HPB-ALL細胞。與真正抗CD4抗體的未修飾的CD4位點相比，此種反應(yīng)顯示在含CD4細胞表面抗原復(fù)合物上存在有一新的可被B4識別的位點。此結(jié)果也可由HPB-ALL細胞的免疫熒光分析所得結(jié)果來證實，其通過事先用rsCD4吸附完全去除真正抗CD4單克隆抗體(結(jié)果未顯示)。所有在能與CD4反應(yīng)的單克隆抗體與rsCD4、衍生自CD4的合成肽，及可表達CD4的HPB-ALL細胞上的結(jié)合反應(yīng)性的觀察，可總結(jié)為以下四點(1)如表4所示，單克隆抗體B4和M2可與rsCD4中等程度反應(yīng)類似與分子的一種部分反應(yīng)性，而在rsCD4ELISA試驗中7種真正的抗-CD4單克隆抗體中有5種(即，E6、H5、J33、E2和I26)以及豚鼠抗-rsCD4血清可與rsCD4有較強的反應(yīng)；(2)如表7所示，所有真正的抗-CD4單克隆抗體和豚鼠抗-rsCD4血清與HPB-ALL細胞間微弱的反應(yīng)呈現(xiàn)特征性＂不規(guī)則斑點狀＂結(jié)合模式(模式B)，與單克隆抗體B4和M2的＂帽狀＂結(jié)合模式不同(模式A)；(3)如表8所示，先以飽和濃度20μg/mL的真正的抗-CD4單克隆抗體或豚鼠抗-rsCD4血清的1∶50飽和稀釋液與能表達CD4的HPB-ALL細胞一起溫育，不會抑制后續(xù)生物素化B4與HPB-ALL細胞間之結(jié)合，而對單克隆抗體B4和M2則會影響；且(4)如表10和11所示，可用2μg/mLB4與1μg/mLrsCD4反應(yīng)來抑制＂B4-rsCD4＂間50％的反應(yīng)，而即使0.71μg/mL生物素化的B4與濃度高達50μg/mL的rsCD4反應(yīng)也不會抑制＂B4-含CD4宿主細胞抗原復(fù)合物＂之間的反應(yīng)?；谝陨纤狞c發(fā)現(xiàn)，可得出單克隆抗體B4和M2的結(jié)合特異性可通過其包括了延伸超過單獨的CD4蛋白質(zhì)位點以包括含有CD4的宿主細胞表面抗原復(fù)合物的位點很容易與其它真正的抗-CD4抗體加以區(qū)分，其中CD4僅是宿主細胞抗原復(fù)合物的一部分。表10通過rsCD4抑制＂B4a-rsCD4b＂間的反應(yīng)a純化的單克隆抗體B4=2μg/mLb4℃下以0.25μg/mLrsCD4包被過夜c％抑制=[(對照組的A492nm-抑制濃度的A492nm)/對照組的A492nm]×100表11通過rsCD4c抑制＂B4a-表面含CD4的復(fù)合物b＂間的反應(yīng)a每一測試中以100μL、0.71μg/mL生物素化B4進行染色。b每一測試中使用100μL、0.2-0.5×106細胞。c在與HPB-ALL細胞溫育之前先將100μL、2倍于指定濃度的rsCD4與100μL生物素化的B4在室溫下一起溫育1小時。實施例12由來自表達CD4的人類T細胞系進行免疫的HC1和/或HC2轉(zhuǎn)基因小鼠中制備人類免疫球蛋白之單克隆抗體本實施例敘述由小鼠同種接合子制備人雜交瘤的過程，此同種接合子包括去活化的內(nèi)源性免疫球蛋白部位及編碼人類重鏈及輕鏈氨基酸序列的轉(zhuǎn)基因人序列。依上述實施例3的免疫程序由這些以表達CD4的人類T細胞系進行免疫接種的轉(zhuǎn)基因鼠制備的雜交瘤可以分泌包含人類重鏈及輕鏈氨基酸序列的單克隆抗體。由這些雜交瘤中所篩選出的細胞系，依表12的規(guī)則，其可分泌能與含CD4蛋白質(zhì)的人宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合的抗體，該抗體對于所有分化體HIV-1的原代分離物以及HIV-2和SIV的各類原代分離物均具有廣泛的交叉中和活性，同時對單克隆抗體B4也有類似的抗體結(jié)合性質(zhì)。表12制備由雜交瘤所分泌可有效中和HIV-1原代分離物的含CD4宿主細胞抗原復(fù)合物的抗體的優(yōu)選的免疫接種及篩選程序更明確地說，如Smith等人于WO93/12227中所述的具有HC1或HC2基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠，其同種接合子中有一在功能上不連續(xù)的JH基因座且含一能重組以編碼人類重鏈及輕鏈序列的轉(zhuǎn)基因，此類小鼠以來自能表達CD4的人類白血病T細胞系，HPB-ALL，的細胞進行免疫。在第0天將約100μl含5-10×106細胞的PBS以腹膜注射法，或更優(yōu)選的以靜脈注射或兩法同時使用，導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。每隔一周便追加注射一次，至少重復(fù)四次，最后一次注射三天后進行融合的步驟。將脾臟切下且將約150×106的脾細胞與約30×106融合伴侶細胞(P3×63Ag8.653細胞系；ATCC)依Kohler和Milstein，自然，1975,256:495-97所述的標準程序進行融合。在接下來的數(shù)周進行多次融合，每一次之后都再接著每兩周和或每個月加強免疫一次且每次都是在最后一次注射后三天進行融合。如實施例3以ELISA試驗來測試長大的雜交瘤及其上清液與rsCD4結(jié)合的能力。以偶聯(lián)過氧化物酶的抗人類免疫球蛋白的二級抗體來檢測人類抗體的存在與否。一級雜交瘤是由以限制性稀釋法所培養(yǎng)出的單細胞克隆并評估其是否能分泌可與rsCD4反應(yīng)的人類單克隆抗體。為測定這些單克隆抗體是否也能識別含CD4蛋白質(zhì)的宿主細胞抗原復(fù)合物，以類似檢測B4與HPB-ALL或SUP-T細胞系間反應(yīng)的間接免疫熒光染色來測試能與rsCD4反應(yīng)的細胞系的上清液的反應(yīng)性。生長良好及能否產(chǎn)生大量單克隆抗體這兩點在篩選值得培育的雜交瘤細胞系時也是重要的因素。在所有生長良好且能分泌大量可與rsCD4及表達CD4的細胞反應(yīng)的抗體的細胞系中，進一步測試這些細胞系的上清液其中和HIV原代分離物的活性。更明確的來說，以前述的MT2微小空斑中和試驗分析來測試針對，例如HIV-1分化體B的原代分離物23135的50％及90％終點稀釋度，起始稀釋濃度為1∶2。選擇那些具有對HIV-1很強中和活性的細胞系進行進一步的亞克隆。所篩選的雜交瘤可分泌人類免疫球蛋白，其對能中和HIV和SIV原代分離物的含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物上不連續(xù)構(gòu)象的表位具有特異性的結(jié)合活性。這些人類單克隆抗體是用于接觸HIV之前和之后預(yù)防HIV感染的候選抗體。實施例13抗含CD4的宿主細胞抗原復(fù)合物的抗體對所有類型HIV-1分化體的廣泛交叉中和活性的證明結(jié)果將抗體對實驗室株MN和HIV-1A,B,C,D和E型分化體的原代分離物的中和活性互相作一比較。將這些原代分離物培養(yǎng)在PBMC中，而HIV-1MN則培養(yǎng)在如實施例1所述的H9細胞中。以MT2微小空斑法(實施例1)來進行中和分析，結(jié)果列于表13。表13比較了由第5、9組和實施例4(表3)的第15組的單克隆抗體、實施例1所述的αgp120CD4-BS的單克隆抗體IgG1b12、實施例2(表3)所述第6組的抗-gp120N-端V3多克隆抗體和市售對大部分HIV-1B型分化體的N-端序列有特異性的小鼠抗-gp120N-端V3單克隆抗體50.1對HIV-1所有類型分化體之間的交叉中和活性。單克隆抗體50.1(Repligen公司，CambridgeMA)是以衍生自HIV-1MNgp120的N-端V3環(huán)尖端的合成肽作為免疫原所制備的。此單克隆抗體可識別的表位是Lys-Arg-Ile-X-Ile-Gly-Pro(Wrin等人，病毒學(xué)雜志(JVirol),1995,69:39-48)。表13中和HIV-1A,B,C,D,E型分化體的原代分離物#(MT-2微小空斑中和測定)*與相應(yīng)于表2的抗體組有同樣的抗體組成的抗體混合物-未測試#各型HIV-1原代分離物分化體是由WHO艾滋病的全球計劃所提供?？贵wB4(第5組)對HIV-1A-E型分化體的原代分離物分化體具有很強的中和活性，但對實驗室改造的MN株的中和活性則很弱。將B4與其它抗細胞抗體及抗-N-端V3抗體一起使用只會減弱B4對原代分離物的中和活性(第9和15組)。其它對原代分離物有效的抗體，IgG1b12(其能與gp120的CD4結(jié)合位點相結(jié)合)，對各型分化體原代分離物呈現(xiàn)的交叉中和活性較B4弱(＂IgG1b12＂組)，且只對A,B,和D型分化體的原代分離物有較微弱的中和活性。只能中和兩種B型分化體原代分離物的一種。相反，抗-N-端V3抗體、單克隆抗體50.1及抗-N-端V3MN多克隆抗體(第6組和＂單克隆抗體50.1＂)對適應(yīng)了實驗室環(huán)境的病毒株有很強的中和活性，但對原代分離物(包括同型B型分化體的原代分離物)的中和活性則很微弱。只有合并使用B4及抗-N-端V3抗體(第15組)才能同時對實驗室株及原代分離物表達出很強的中和活性?？傊?，抗-gp120N-端V3抗體對適應(yīng)了實驗室環(huán)境的病毒株的中和活性較強，而本發(fā)明的獨特的B4抗體則對A-E型分化體的原代分離物有較強的中和活性。而且，相對于αgp120CD4-BS抗體，(其是少數(shù)已知的能對某些HIV-1原代分離物呈現(xiàn)交叉中和活性的抗體之一)，本發(fā)明的抗體是唯一一種能對HIV-1之A,B,C,D，和E型分化體原代分離物有很強中和活性的抗體。實施例14本獨特抗體對HIV-2或SIV的中和活性的證明以抗體來測定病毒中和活性的特殊步驟p27抗原中和試驗分析將滴定的病毒原液與一系列抗體稀釋液混合并以此感染用促細胞分裂劑刺激過的人PBMC細胞，且將感染后的細胞溫育5天(Gardner等人，AIDSResHumRetroviruses,1995,11:843-854)。通過p27ELISA試驗來測試所培育的PBMC細胞中所累積的SIVp27抗原以定量測定病毒的最大感染力及中和活性(CoulterSIVp27EIA,CoulterImmunology,Hialeah,FL)。以抗體濃度來表示中和活性百分比，表示相對于未處理過(最大值)的培養(yǎng)物中p27濃度所累積的p27濃度的減少。感染力降低分析(IRA)進行IRA試驗(white-Scharf等人，病毒學(xué)(Virology),1993,192:197-206)。改變用來感染PBMC細胞的病毒量，在固定量抗體存在下(此處為10μg/mL)以測定IRA中和活性。以被10μg/mL抗體去活化＞95％的感染單位來表示IRA的結(jié)果。病毒HIV-2ROD是培養(yǎng)在H9細胞中的病毒株(NIHAIDSResearchandReferenceREagentProgramCatalogno.207)。HIV-2287，是由一實驗室感染的猴子血漿所分離出的一種原代分離物，SIV251,SIV239，和HIV-1/SIV重組SHIVⅢB和SHIV89.6是在人T細胞系中傳代的實驗室株，由DavidMontefiori(Duke大學(xué)，Durham,NC)所提供。其中SIV251的一管濃縮液已在靈長類PBMC細胞中傳代過。重組SHIVⅢB，和SHIV89.6為帶有衍生自所示HIV-1B型分化體的HIV-1外殼蛋白質(zhì)的SIV。結(jié)果表14的實驗是B4(實施例4，表3的第5組)和多克隆抗-N端-V3MN抗體(表3的第6組)對各類HIV-2、SIV和重組SHIV分離物的中和活性的比較。表中顯示出各分離物的名稱。以感染力降低分析(IRA)來測定HIV-2287的中和活性(White-Scharf等人，病毒學(xué)(Virology),1993,192:197-206)。以被10μg/mL抗體去活化之＞95％的感染單位來表示IRA結(jié)果。以實施例1中所述之MT-2分析來測定HIV-2ROD的中和活性。SIV251、SIV239，和HIV-1/SIV重組體SHIVⅢB和SHIV89.6的中和活性由p27抗原中和分析來測定，(Gardner等人，AIDSResHumRetroviruses,1995,11:843-854)對感染的PBMC培養(yǎng)物在50％終點濃度測定，其中有一組B4對在PBMC中培養(yǎng)的SIV251的中和活性的測定在80％終點濃度測定。50％和80％終點濃度是在以抗體處理過的培養(yǎng)物中與未處理過的培養(yǎng)物相比中可檢測到的p27抗原的部分。表14以單克隆抗體B4中和SIV,SHIV和HIV-2*使用10μg/mL的單克隆抗體B4在感染力降低分析中#使用MT-2微小空斑中和分析試驗@使用p27抗原中和分析試驗B4對所有表14中的HIV-2、SIV和SHIV株均有中和活性。相比之下，前述能有效中和實驗室株的抗N-端V3MN抗體(實施例1和13，表2和13)的中和活性卻對任一重組SHIV均無效，即使這些基因重組株處于適應(yīng)實驗室生長條件的狀況。因此，顯然，獨特的且具很強中和活性的抗體其交叉中和活性可延伸到包括HIV-2和SIV，無論其是適應(yīng)了實驗室環(huán)境的病毒株或原代分離物，也無論其是以T細胞系或PBMC來培養(yǎng)，均是本發(fā)明獨特的特性。此觀察顯示本發(fā)明的抗體可用于SIV感染的恒河猴和以SIV和HIV-2感染的豬尾恒河猴的動物模型測試，以測試抗體的保護效果。實施例15獨特抗體對已適應(yīng)黑猩猩的HIV-1的中和活性的證明結(jié)果比較B4及前已表征的IgG1b12(抗-gp120CD4結(jié)合位點)抗體對B型分化體HIV-1原代現(xiàn)場分離物，HIV-1DH-12，(生長在黑猩猩的PBL)的中和活性，結(jié)果顯示于表15中。以MT-2及IRA法來測定B4的中和活性，而只以IRA法測定IgG1b12的中和活性。對B4以被10μg/mL抗體去活化的＞95％的感染單位表示IRA的結(jié)果，且對IgG1b12以被25μg/mL抗體去活化的＞95％的感染單位表示IRA的結(jié)果。比較現(xiàn)有MT-2分析結(jié)果與表3和13(第5組)的結(jié)果顯示一獨特可與CD4反應(yīng)的抗體，B4，可對已適應(yīng)黑猩猩的HIV-1呈現(xiàn)相當(dāng)于以人類PBMC培育的初級分離株的中和活性。比較IRA的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B4可對已適應(yīng)黑猩猩的HIV-1呈現(xiàn)較抗-gp120CD4結(jié)合位點抗體IgG1b12高出多于一倍的中和活性。因此，本發(fā)明的一種抗體顯然較已知有原代分離物中和活性的單克隆抗體對已適應(yīng)黑猩猩的HIV-1更具活性。這些結(jié)果表明本發(fā)明的抗體可用于在黑猩猩體內(nèi)HIV-1感染的測試模型，用以測試抗體的保護效果。表15抗體對黑猩猩PBL培育的HIV-1原代分離物DH-12(B型分化體)的中和*通過感染力降低分析#通過MT-2微小空斑中和分析試驗實施例16通過B4中和HIV-1原代分離物的動力學(xué)研究結(jié)果表16和17顯示用B4中和HIV-123135(一種B型分化體的原代分離物)的動力學(xué)研究。表16顯示在MT-2微小空斑中和分析試驗中，于病毒加入后0至24小時期間內(nèi)兩種不同濃度B4、2和20μg/mL的中和活性的動力學(xué)分析。以添加所示病毒稀釋液后的存活百分比來表示中和活性。表17顯示向細胞加入病毒后0至96小時期間加入20μg/mLB4來中和HIV-123135的動力學(xué)研究。由于延長時間因此需要以p24抗原中和分析試驗來檢定對所示稀釋濃度的所加病毒的中和活性(Wrin等人，病毒學(xué)雜志(JVirol),1995,69:39-48)。在此p24檢定中，以一系列滴定過的病毒稀釋液感染PBMC并將被感染細胞溫育四天。在指定時間加入一定濃度的抗體。通過p24ELISA試驗(CoulterImmunology,HialeahFL)測定PBMC培養(yǎng)物中所累積的p24抗原以定量病毒的感染力及其中和活性。以相對于未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中p24濃度，用抗體處理過的培養(yǎng)物中可檢測到的p24濃度百分比來表示所得結(jié)果，即，結(jié)果相當(dāng)于以微小空斑計數(shù)的病毒存活百分率，雖然p24的測量較易受到背景的影響。表16顯示在感染后1小時，B4可完全中和以2μg/mL的濃度所加入的病毒。在20μg/mL濃度下，抗體的作用可持續(xù)至24小時后。表17顯示當(dāng)時間延長至96小時的結(jié)果且顯示在感染后長達48小時后，以20μg/mLB4可有效中和病毒。這些結(jié)果顯示構(gòu)建了即使在細胞已接觸病毒之后可防止體外感染的一種獨特抗體，且提示此抗體對于接觸HIV后的預(yù)防治療可能有效。表16單克隆抗體B4所介導(dǎo)的對HIV原代現(xiàn)場分離物23135(B型分化體)中和活性的動力學(xué)(0-24小時)(MT-2微小空斑中和分析試驗)表17單克隆抗體B4所介導(dǎo)的對HIV原代現(xiàn)場分離物23135(B型分化體)中和活性的動力學(xué)分析(0-96小時)(p24抗原中和活性分析試驗)實施例17針對SIVmac251感染的恒河猴被動免疫測定保護不受SIV感染的特定步驟上述有關(guān)本發(fā)明抗體中和活性的研究表征了濃度、動力學(xué)及對于中和HIV-2和SIV原代分離物以及HIV-1所有類型分化體的原代分離物的B4的中和活性范圍。這些體外特性以及在靈長類動物間CD4氨基酸序列高度的保守性，提示本發(fā)明B4的實施例在體內(nèi)針對3種免疫缺陷病毒的感染有與體外高度相似的保護效果。因此，本發(fā)明的保護效果可用B4針對以SIV感染的試驗性恒河猴，一種對于人類艾滋病極佳的動物模型的感染實驗，來加以評估。病毒濃縮液及體內(nèi)SIV感染用來進行感染的病毒濃縮液是獲自RDesrosiers的原型SIVmac251株(NewEnglandRegionalPrimateResearchCenter,SouthboroughMA)。所有感染均以靜脈注射方式完成接種，以由恒河猴PBMC中所分離的約10AID50未經(jīng)克隆的SIVmac251分離物來進行(Desrosiers等人，PNASUSA,1989,86:6353-6357)。對照組中未接種的兩只猴子均以靜脈注射給予同樣劑量的病毒濃縮液且發(fā)現(xiàn)其均被持久性感染。在感染后定期對動物取血并以檢測病毒抗原血癥及血清轉(zhuǎn)變的血清學(xué)檢測，及用來檢測病毒PBMC和血漿共培育的血清學(xué)檢測來監(jiān)測其感染。SIV的血清學(xué)分析血清轉(zhuǎn)變是被SIV感染后的一種結(jié)果，可以酶免疫分析(EIA)檢測，此是基于可和SIV產(chǎn)生交叉反應(yīng)的HIV-2肽抗原(HIV-1,2EIA；UnitedBiomedical,Inc.,HauppaugeNY)，且其可被用來測定SIV跨膜蛋白質(zhì)(gp36)上一主要免疫N端結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列588-603)的血漿抗體的終點滴度。SIVp27抗原分析以一種SIV特異性單克隆抗體為底物的抗原捕獲EIA分析(CoulterImmunology,Hialeah,FL)來檢測體內(nèi)及體外的復(fù)制性病毒感染。對于未稀釋血漿體內(nèi)陽性反應(yīng)結(jié)果以＞0.05ng/mL值來表示。SIV分離及終點稀釋分析將恒河猴PBMC以Ficoll-Hypaque梯度由全血中分離。將2mL未稀釋的澄清的血漿或分離的PBMC加入到用促細胞分裂劑刺激的人類PBMC中。在添加了20U/mLIL-2及200U/mL抗干擾素α(兩者均購自CollaborativeResearch.Waltham,MA),2.5×10-2mM2-巰基乙醇和2μg/mLPolybrene(兩者均購自Sigma)，且含10％胎牛血清(Sigma,St.LouisMO)的RPM1-1640的生長培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)物，并保持在37℃,5％CO2下。每周對培養(yǎng)上清液進行兩次分析并持續(xù)4-6周以測定是否存在p27抗原。如果某一上清液樣品在連續(xù)三次測試中其p27抗原均呈陽性則確定該培養(yǎng)物為陽性(CoulterSIVp27EIA,CoulterImmunology,Hialeah,FL)。為定量猴子PBMC中SIV的感染程度，將PBMC系列稀釋并以類似的方法與人PBMC共培育。在第14天對培養(yǎng)物進行終點稀釋分析同時測定p27抗原。設(shè)計及方法6只用于下述研究中的猴子是由TSI靈長類動物中心梅森實驗室(WorcesterMA)成群培養(yǎng)的成年恒河猴及年輕的恒河成猴。他們對SIV、SRV-1、SRV-2、SRV-5和STLV-1的抗體呈血清陰性。這些動物飼養(yǎng)于室內(nèi)且依美國實驗室動物協(xié)會的管理照料標準及遵守該標準由華盛頓特區(qū)實驗室資源研究院實驗室動物照管及使用委員會所訂定的實驗室動物照管及使用原則來照顧及使用。將動物依體重隨機分為對照組及治療組。第1組中的兩只猴子給予PBS，第2組中的4只猴子在由靜脈給予10AID50的SIVmac251之前先由靜脈灌注4mg/kg以蛋白A親和層析法所分離的單克隆抗體B4。結(jié)果收集處理前、攻擊前及攻擊后1小時、1、3、15、22、29和36天后的血液。以rsCD4酶免疫分析測定所有樣品中抗-CD4/趨化因子受體抗體的血漿水平，發(fā)現(xiàn)在灌注后第1天即已降低至最大值的一半，此很可能由于滲透及猴子外周血及淋巴組織中表達CD4的細胞的結(jié)合已達飽合之故。在第15、22和29天，收集所有猴子的血漿樣品并以SIVp27抗原分析測試其中的p27抗原。在第15天，發(fā)現(xiàn)對照組中的兩只猴子(第1組中第170和110號)受到感染，顯示為其血清中SIVp27抗原呈陽性(表18)。相比之下，在第15天，接受4mg/kgB4注射的實驗組第2組中的四只猴子只有1只受到感染(表18)。接下來，在第22和29天以p27免疫分析來分析所有猴子體內(nèi)收集的血漿樣品，這些結(jié)果確證了猴子體內(nèi)在第15天所觀察到的SIV抗原血癥的結(jié)果。另一項評估SIV感染的參數(shù)是監(jiān)測動物的免疫狀態(tài)是否有SIV反應(yīng)性的血清轉(zhuǎn)變發(fā)生。在對照組第1組的兩只猴子均產(chǎn)生抗-SIV抗體，此由病毒攻擊后2-3周內(nèi)開始的HIV1,2(SIV)EIA測試來加以檢測(表19)。當(dāng)血清的吸光值超過由未經(jīng)免疫接種未受感染的猴子體內(nèi)所得無反應(yīng)性對照血清(NRC)的吸光值的四倍時，被定義為血清反應(yīng)陽性。表19中劃有下劃線的數(shù)值代表其有血清轉(zhuǎn)變。一并列出供參考具有強反應(yīng)性的對照組血清(SRC)的數(shù)值。實驗組第2組中受保護的3只猴子(DW3,GN-端V3和NU3)在整個測試期間其血清均呈陰性反應(yīng)。因此，在實驗組中通過p24抗原血癥發(fā)現(xiàn)唯一受SIV感染的猴子(G4B)，在測試期間也產(chǎn)生抗-SIV抗體。于第15,22和29天收集兩組中6只猴子體內(nèi)的PBMC細胞。將這些天所得血漿及PBMC樣品與以促細胞分裂劑刺激的人類PBMC一起混合并以病毒培育來檢測SIV感染。連續(xù)培育3周并分析共培養(yǎng)物上清液中是否存在p27抗原。同樣，對照組中的兩只猴子(第170和110號)及實驗組中未受保護的一只猴子(G4B)均受到感染，其證據(jù)為PBMC及血漿樣品之病毒培育均呈現(xiàn)陽性(表18)。結(jié)論這結(jié)果顯示以中等劑量(4mg/kg)的單克隆抗體B4為恒河猴進行被動免疫接種可有效地保護大部分(75％)的猴子不受SIV原代分離物及接下來以一定的SIVmac251劑量攻擊所造成的感染，此劑量可有效地感染在所有先前實驗動物及本實驗中2只對照組動物中的2只動物。表18以單克隆抗體B4為恒河猴進行被動免疫隨后用SIVmac251攻擊*p27抗原血癥呈陽性的三只動物在整個監(jiān)測期間其結(jié)果均呈陽性(直到141天)，而3只受保護的動物在同樣監(jiān)測期間均保持陰性。#以限制性稀釋所作的共同培養(yǎng)的結(jié)果是用第15和22天所取樣本所作。@真正的轉(zhuǎn)變時間請參見表19。表19恒河猴以SIVmac251攻擊后其血清轉(zhuǎn)變狀況SRC=0.777NRC=0.078Cutoff=4×NRC=0.312實施例18單克隆抗體B4介導(dǎo)的針對由人類免疫缺陷病毒原代分離物的感染的接觸之前和接觸之后的保護已證明單克隆抗體(MAbs)和多克隆血清可保護非人之靈長類及以人類外周血淋巴細胞重組的SCID(hu-PBL-SCID)小鼠不受HIV-1(Emini等人，病毒學(xué)雜志(JVirol),1990,64:3674；Prince等人，AIDSResHumRetroviruses,1991,7:971；Emini等人，自然(Nature),1992,355:728；Safrit等人，AIDS,1993,7:15)和SIV(Putkonen等人，自然(Nature),1991,352:436；Lewis等人，疫苗(Vaccine),1993,11:1347)的感染，這支持了以免疫預(yù)防來對抗HIV-1感染的觀念。然而發(fā)現(xiàn)這些研究使用的抗病毒抗原的單克隆或多克隆抗體卻只能中和衍生自T細胞系的實驗室株，而對免疫缺陷病毒的原代分離物卻無效。在本研究中，以單克隆抗體B4來測定以本發(fā)明的單克隆抗體，即，針對含CD4蛋白質(zhì)和趨化因子受體的宿主細胞抗原復(fù)合物上不連續(xù)構(gòu)象的表位且對所有HIV原代分離物均具有廣泛的中和活性的抗體，進行被動免疫接種是否具有體內(nèi)保護不受HIV-1原代分離物引起的感染的能力。本研究的目的是證明施用B4可保護帶有嚴重合并免疫缺陷(SCID)及用正常人類外周血淋巴細胞(hu-PBL)移植的小鼠(稱為hu-PBL-SCID小鼠)不受以可抗中和的HIV原代分離物攻擊所造成的感染。選用hu-PBL-SCID小鼠模型進行效果評估是因許多涉及多只動物的實驗組可在相對短的時間內(nèi)以合理的花費完成，這是唯一HIV-1感染保護研究的替代動物模型，即用HIV-1感染的猩猩，所無法提供的優(yōu)點。在SCID小鼠體內(nèi)重建人類免疫系統(tǒng)及測定保護不受HIV-1感染的詳細步驟單克隆抗體用于本研究的對照抗體是小鼠骨髓瘤細胞系PRC5.4(ATCCNo.TIB12)分泌的小鼠IgG2a，其結(jié)合特異性目前仍未知。B4和IgG2aPRC5.4均用蛋白A親和層析柱純化并在使用前重新以2mg/mL的濃度懸浮于無菌PBS中。所有抗體都是以腹膜注射方式注射到hu-PBL-SCID小鼠體內(nèi)。SCID小鼠的重構(gòu)將用于本研究的CB.17scid/scid小鼠保持在特定的無病原菌的狀態(tài)。經(jīng)由腹膜注射2×107懸浮于0.5mLPBS中剛分離出的正常人類PBL細胞以重建非滲漏型基因型。在注射PBL2周后，以ELISA試驗(SangStat,MenloPark,CA)分析小鼠血清中是否有人類免疫球蛋白存在以確定重構(gòu)過程是否成功。只有人類免疫球蛋白呈陽性的小鼠才用于本HIV-1感染研究中。病毒濃縮液用前述受感染的PBL的上清液制備HIV-1AD6病毒濃縮液(Ho等人，NEnglJMed,1989,321:1621-5)并滴定出其在hu-PBL-SCID小鼠體內(nèi)的感染力。以每毫升50％小鼠受感染的劑量(MID50)來表示。病毒中和分析以前述p24抗原分析來測定HIV-1的中和性(Ho等人，病毒學(xué)雜志(JVirol),199165:489-493)。以相對于未經(jīng)抗體處理的對照孔的經(jīng)抗體處理過的培養(yǎng)孔釋放至培養(yǎng)上清液中的p24抗原降低的百分比來定義中和活性。hu-PBL-SCID小鼠的病毒攻擊選擇已知對大部分中和性抗體具有抗性的AD6作為本研究中HIV-1的原代分離物。所有感染步驟及hu-PBL-SCID小鼠的維持均在符合第3級生物安全的動物房中進行。在PBL重構(gòu)后2周對hu-PBL-SCID小鼠進行感染。對小鼠由腹膜注射0.5mL含10MID50不含細胞的HIV-1病毒稀釋液。在此之前已在hu-PBL-SCID小鼠中以滴定法確定病毒接種物可感染至少80％的hu-PBL-SCID小鼠。以共培養(yǎng)法檢測HIV-1在以病毒感染后3周，處死小鼠并以前述方法(Safrit等人，AIDS1993,7:15-21)由腹腔灌洗液及脾臟中收集細胞。將這些來自小鼠的2×105腹腔灌洗液細胞或5×106脾細胞(10倍系列稀釋)與來自HIV-1血清陰性捐贈者的2×106PHA活化的人PBL細胞在終點稀釋培養(yǎng)物中溫育。每周觀察此共培養(yǎng)物上清液中是否有HIV-1p24核心抗原存在，連續(xù)觀察4周。如果單一樣品中含＞1000pg/mL或連續(xù)兩個樣品含＞200pg/mL的p24抗原，則認為培養(yǎng)物是HIV-1陽性。以含有可檢測得到的受感染細胞的最高稀釋度的孔作為反應(yīng)終點，病毒滴度以每106細胞中組織細胞感染劑量來表示。單克隆抗體B4在接觸病毒之前和接觸之后的有效預(yù)防劑量和動力學(xué)研究實驗1設(shè)計及方法為評價接觸病毒之前預(yù)防的保護效果，在接種HIV-1之前1小時由腹膜中注射溶于0.5mLPBS的單克隆抗體B4。有兩組小鼠注射了單克隆抗體B4(第2和3組，每組n=6，濃度分別是50mg/kg和5mg/kg)，一組則注射了來自骨髓瘤RPC5.4的不相關(guān)IgG2a(第1組，n=4濃度是50mg/kg)。由腹膜對先前經(jīng)免疫接種的小鼠感染10MID50的HIV-1原代分離物AD6。為評價在接觸病毒之后的保護效果，將第4組的動物用病毒攻擊后30分鐘注入濃度為50mg/kg的B4。每只小鼠平均重20g。在以病毒攻擊后3周處死小鼠并從腹腔灌洗液及脾臟中收集細胞，以病毒培育法來測定感染性。結(jié)果在任何一組動物中均未發(fā)現(xiàn)由抗體所引發(fā)的毒性。如表20A所示，由與PHA活化的人類PBL細胞共培養(yǎng)4周后的腹腔灌洗液細胞或脾細胞上清液中收獲HIV-1，這些人類PBL細胞來自第1組以對照50mg/kgIgG2a刺激的4只小鼠中的3只(第4296,4297和4303號)，顯示此對照組中75％的感染率。在以病毒攻擊前1小時(第2和3組)或病毒攻擊后0.5小時(第4組)(表20A)，注射50mg/kg(第3和4組)或5mg/kg(第2組)B4的18只小鼠體內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)病毒。實驗2設(shè)計及方法為此接觸病毒后的保護實驗，在施用任何抗體前由腹膜注射10MID50的HIV-1原代分離物AD6以感染小鼠。在以HIV-1感染后，立即對對照組第1組的小鼠(n=5)腹膜注射5mg/kg小鼠IgG2a(RPC5.4)。第2組的小鼠(n=4)在以病毒攻擊后立刻注射50mg/kgB4。在2、4和24小時后，在第3、4和5組的動物(每組n分別是4,4,5)注射50mg/kgB4；且1小時后，在第6和7組的動物(每組n是4)分別注射15mg/kg和5mg/kg的B4。每只小鼠平均重20g。在以病毒攻擊后3周處死小鼠并由腹腔灌洗液及脾臟收集細胞，并以病毒培育法來測定感染性。結(jié)果在任何一組動物中均未發(fā)現(xiàn)由抗體所引發(fā)的毒性。如表20B所示，由與PHA活化的人類PBL細胞共培養(yǎng)4周后的腹腔灌洗液細胞和脾細胞上清液中收獲HIV-1，這些人類PBL細胞來自第1組以5mg/kgIgG2a(RPC5.4)刺激的5只小鼠中的3只(第4467,4471和4473號)，顯示對照組中60％的感染率。在病毒攻擊后0、2或4小時后曾接受50mg/kg(第2,3和4組)B4；或在病毒攻擊后1小時中曾接受15mg/kg(第6組)和5mg/kg(第7組)的后兩組小鼠(共21只)體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)HIV-1，如表20B所示。在第5組的4只小鼠中有2只小鼠(第4469和4472號)可用病毒培養(yǎng)物檢測到HIV-1，此組動物在病毒攻擊后24小時曾接受50mg/kgB4。然而，只在第4469號動物的腹膜沖洗液中發(fā)現(xiàn)有HIV-1(表20B)。實驗3設(shè)計及方法特別的，接觸病毒后的保護實驗，以所測的最低濃度的B4(5mg/kg)重復(fù)，直到接觸后4小時。在施用任何抗體前由腹膜注射10MID50的HIV-1原代分離物AD6攻擊小鼠。在以HIV-1攻擊后，立即由腹膜對對照組第1組的小鼠(n=5)注射5mg/kg的小鼠IgG2a(RPC5.4)。第2組的小鼠(n=5)在以病毒攻擊后立刻注射5mg/kg的單抗B4。在1、2和4小時后，分別向第3、4和5組的動物(每組n是5)注射濃度為5mg/kg的單抗B4。每只小鼠平均重約20g。在以病毒攻擊后3周處死小鼠并由腹腔灌洗液及脾臟收集細胞，以病毒培育法來測定感染性。結(jié)果在任何一組動物中均未發(fā)現(xiàn)由抗體所引發(fā)的毒性。如表20C所示，由與PHA活化的人PBL細胞共培養(yǎng)4周后的腹腔灌洗液細胞或脾細胞上清液中收獲HIV-1，這些人PBL細胞來自第1組以5mg/kgIgG2a(RPC5.4)刺激的5只小鼠，顯示對照組中100％的感染率。在病毒攻擊后0、1、2或4小時后曾接受5mg/kgB4的第2、3、4和5組的20只小鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)HIV-1(表20C)。表20A以單克隆抗體B4在hu-PBL-SCID小鼠中接觸之前和接觸之后HIV-1AD6感染的預(yù)防實驗1表20B實驗2表20C實驗3以單克隆抗體B4在hu-PBL-SCID小鼠中接觸之前與接觸之后HIV-1AD6感染的預(yù)防總之，由以上三個連續(xù)的實驗中所得的結(jié)果顯示在體內(nèi)動物模型中無論是在接觸病毒以前或以后，以單克隆抗體B4來對動物進行被動免疫接種，可完全保護動物體不受代表性HIV-1原代分離物的感染。由于人類因職業(yè)之故而暴露于HIV-1之下的情況極為罕見，估計因意外而造成的接觸＜1人體感染劑量。因此，可以用濃度遠低于目前用于SCID小鼠實驗中(本實施例5和50mg/kg的劑量分別造成＞10μg/mL和＞100μg/mL的血清抗體濃度)的血清抗體濃度保護人體因職業(yè)之故接觸HIV所造成的感染。在接觸病毒之前的模式中，觀察到5mg/kg,15mg/kg和50mg/kg的濃度可完全保護動物體不受高劑量(10MID50)HIV-1原代分離物AD6的感染。在接觸病毒之后的模式中，觀察到50mg/kg劑量在大于4小時但少于24小時的間隔中的完全保護效果，5mg/kg劑量的效果則至少為4小時。這些結(jié)果顯示了單克隆抗體B4在本發(fā)明實施例中可用于因職業(yè)性接觸HIV-1長達4小時后的預(yù)防保護效果。實施例19以代表趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的合成肽研究＂單克隆抗體B4-rsCD4-趨化因子受體結(jié)構(gòu)域＂之間的反應(yīng)合成趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽列于表21和22中的趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽是以Merrifield固相合成技術(shù)以Fmoc化學(xué)法在應(yīng)用生物系統(tǒng)自動肽合成儀(型號430、431和433A)上合成的。在所需的肽裝配完成后，依標準程序以三氟醋酸處理樹脂以將肽由樹脂上切出，并去除氨基酸側(cè)鏈上的保護基團。標有≠號的肽中也含有甘氨酸-甘氨酸間隔基以及來自B型肝炎病毒的T細胞輔助表位。被切出、萃取且清洗過的肽以HPLC進行純化并以質(zhì)譜儀及反相HPLC來表征。以特定ELISA試驗來定量＂單克隆抗體B4-rsCD4-趨化因子受體結(jié)構(gòu)域＂之間的反應(yīng)除了抗原包被的步驟外，以類似于此處所述的rsCD4ELISA(實施例3)步驟進行特定的ELISA試驗，其中于4℃下如表22中已和0.25μg/mLrsCD4預(yù)溫育過的各種濃度(0、0.016、0.063、0.25、1和4μg/mL)的趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽過夜包被微孔板。結(jié)果在特定ELISA試驗中未發(fā)現(xiàn)單克隆抗體B4(濃度分別為10,1、0.1和0.01μg/mL)可和任何單獨的趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽作用，其中微孔在rsCD4不存在的情況下于37℃用5μg/mL指定的趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽包被1小時。表21以趨化因子受體結(jié)構(gòu)域肽來研究＂單克隆抗體B4-rsCD4-趨化因子受體結(jié)構(gòu)域＂之間的反應(yīng)#:HBVTh(FFLLTRILTIPQSLD)代表肽片段，其中帶有衍生自HBsAg之雜亂的T輔助細胞功能。GG:(Gly-Gly)為插在趨化因子受體結(jié)構(gòu)域與T輔助細胞表位間的間隔基。*趨化因子受體胞外域肽抗原是依由核酸序列中所推出的氨基酸編碼系統(tǒng)命名的表22代表如“單克隆抗體B4-rsCD4”結(jié)合反應(yīng)中的趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽的結(jié)構(gòu)描述以rsCD4ELISA試驗只能檢測到單克隆抗體B4和rsCD4之間非常微弱的反應(yīng)，其中微孔在4℃下與用0.25μg/mL的rsCD4包被過夜。然而，當(dāng)rsCD4(0.25μg/mL)與各種濃度的每一種指定趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽預(yù)溫育時，由特定的ELISAOD492讀數(shù)可觀察到rsCD4與單克隆抗體B4間不同的結(jié)合模式。在先的rsCD4與某種趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽(如，CC-CKR2b的第2和3結(jié)構(gòu)域，CC-CKR5的第3結(jié)構(gòu)域，CC-CKR3第四結(jié)構(gòu)域)作用，可顯著增加rsCD4與單克隆抗體B4之間的結(jié)合。此種增強效果與所用肽的濃度相關(guān)。在所有10,1,0.1和0.01μg/mL的單克隆抗體B4濃度中均可觀察到此種增強的＂單克隆抗體B4-rsCD4＂間的反應(yīng)。增強程度，如單克隆抗體B4-rsCD4結(jié)合的OD492讀數(shù)所測得的增加，用特定的趨化因子受體結(jié)構(gòu)域肽的最佳濃度來計算通常為1μg/mL,當(dāng)與0.25μg/mL的單克隆抗體B4單獨同rsCD4結(jié)合相比時。如下表23所示，基于0.1μg/mL單克隆抗體B4的最佳濃度的特定的信號增加百分比將結(jié)果分成0至8個等級。表23總結(jié)了8種趨化因子受體中所有4個外部結(jié)構(gòu)域?qū)慰寺】贵wB4結(jié)合的貢獻。如表23中所示，單克隆抗體B4與rsCD4間的結(jié)合可被數(shù)種趨化因子受體結(jié)構(gòu)域的肽增強，當(dāng)其受到與各種共同受體接觸的干擾時，其對CD4構(gòu)象產(chǎn)生雜亂的信號。對一涉及多重免疫調(diào)控功能分子如CD4而言，我們可以合理地假設(shè)其暴露的表面存在此種動態(tài)性質(zhì)。此發(fā)現(xiàn)也可用來解釋為什么定位可被單克隆抗體B4識別的表位如此困難。其不連續(xù)且散布的表位無法輕易的以如表4中所示由CD4肽表示的線性或不連續(xù)的位點加以表征。通過表23中的數(shù)據(jù)也可知其也涉及由如表22中各種趨化因子受體結(jié)構(gòu)域肽所代表的位點?？傊?，可被B4識別的位點是一高度散布構(gòu)象的表位，其中包含來自與趨化因子受體接觸的CD4，一種HIV的共同受體的位點，且此表位對宿主細胞與HIV的結(jié)合和/或HIV的入侵十分重要，這由其在接觸病毒后作為中和病毒主要靶位的地位所反應(yīng)出。表23以趨化因子受體結(jié)構(gòu)域來增強單克隆抗體B4與rsCD4間的結(jié)合濃度為1μg/mL肽時的增強程度*濃度為4μg/mL肽時的增強程度0-50％0250-3005+50-1001+300-3506+100-1502+350-4007+150-2003+＞4008+200-2504+實施例20rsCD4和趨化因子受體之間的反應(yīng)及單克隆抗體親和性的研究以趨化因子受體CC-CKR5第3結(jié)構(gòu)域的肽增進rsCD4與抗-CD4中和性抗體之間的親和性實施例19的表23清楚顯示以CC-CKR2b(第2和3結(jié)構(gòu)域)可增強＂單克隆抗體B4-rsCD4＂間的結(jié)合程度＞4+，以CC-CKR3(第4結(jié)構(gòu)域)為8+，以CC-CKR5(第3結(jié)構(gòu)域)為5+，至于以相當(dāng)于CXC-CKR4(亦稱Fusin或LESTR)的肽則只有微弱效果。近來，F(xiàn)eng等人(科學(xué)(Science),1996,272:872)報告稱受體CXC-CKR4是使親T細胞的HIV-1株有效侵入靶細胞的共同受體，但一連串后續(xù)報導(dǎo)中(Doranz等人，細胞(Cell),1996,85:1149；Dragic等人，自然(Nature),1996,381:667；Choe等人，細胞(Cell),1996,85:1135；Deng等人，自然(Nature),1996,381:661；Alkhatib等人，科學(xué)(Science),1996,272:1955)則詳述了β-趨化因子受體CC-CKR5、CC-CKR2b和CC-CKR3是親M型HIV-1(即造成感染的原代分離物)的共同受體。如表13中第5組所示，單克隆抗體B4對中和所有各類型分化體的原代分離物比對中和親T型實驗室株MNH9更有效。因此有必要檢查由于趨化因子受體肽所增加的抗CD4抗體與rsCD4之間的親和力與原代分離物中和活性兩者之間的相關(guān)或不相關(guān)的關(guān)系。在此增強效果實驗中使用了代表親M型HIV-1原代現(xiàn)場分離物共同受體CC-CKR5第3結(jié)構(gòu)域的肽2047a及四種濃度為0.1μg/mL的抗CD4單克隆抗體，以及具中和活性的單克隆抗體B4及M2和無中和活性的單克隆抗體E6及J33。如圖4所示，只有兩種中和性抗體(亦即單克隆抗體B4及M2)在以由肽2047a增強的＂單克隆抗體B4-rsCD4＂間結(jié)合性質(zhì)時表達出明顯的劑量相關(guān)性。此種強化效果在用1μg/mL的肽2047a與0.25μg/mLrsCD4預(yù)溫育后可達最佳。定量單克隆抗體B4對rsCD4/趨化因子受體CC-CKR5肽混合物所增強的親和力與單獨使用rsCD4時所增強的親和力ELISA抑制試驗分析在以rsCD4(0.25μg/mL)或事先與CC-CKR5第3結(jié)構(gòu)域(D3)肽2047a(1μg/mL)預(yù)溫育的rsCD4(0.25μg/mL)包被的微孔板上進行rsCD4誘導(dǎo)的單克隆抗體B4結(jié)合反應(yīng)的抑制。單克隆抗體B4在rsCD4和rsCD4/CC-CKR5-D3包被的微孔板上的終點結(jié)合濃度，在基于能使特定的孔OD492讀數(shù)為1.0的單克隆抗體B4濃度下，分別預(yù)定為2μg/mL和0.1μg/mL。對單克隆抗體B4與特定的包被的微孔結(jié)合的抑制是用0至10μg/mL的rsCD4稀釋樣品與預(yù)定終點濃度的單克隆抗體B4(即，對rsCD4包被的孔為2μg/mL，而對rsCD4/CC-CKR5-D3包被的孔則為0.1μg/mL)在37℃下預(yù)溫育1小時，再以實施例3所述的標準的rsCD4ELISA試驗來進行測定。如圖5所示，在濃度為2μg/mL及0.1μg/mL的特定的單克隆抗體B4存在下，能造成單克隆抗體B4-rsCD4和單克隆抗體B4-rsCD4/CC-CKR5-D3反應(yīng)50％抑制(IC50)的rsCD4濃度分別為0.72μg/mL和0.047μg/mL。因此，單克隆抗體B4對混有CC-CKR5-D3(肽2047a)的rsCD4與單克隆抗體對單獨存在rsCD4相比，所增加的單克隆抗體B4的親和力定量為增加15倍。實施例21通過用SUP-T免疫CD1小鼠產(chǎn)生抗含CD4宿主細胞抗原復(fù)合物的單克隆抗體SUP-T細胞(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgramCatalogNo.100)，(是衍生自人淋巴瘤的T-細胞系)，被用來免疫CD1小鼠。起始注射為10×106個溶于弗氏完全佐劑中的細胞，經(jīng)腹膜注射。之后如實施例3所述多次加強免疫，每隔兩周以腹膜注射5-10×106個細胞。最后兩次加強免疫帶有弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑。其余的加強免疫則施用清洗過的溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的細胞。在最后一次免疫接種后施行脾切除。如實施例3所述制備單核脾細胞，以與NS-1小鼠骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤并進行克隆。之后雜交瘤上清液以rsCD4ELISA試驗篩選反應(yīng)性，且以rsCD4/p2047aELISA試驗篩選增強的反應(yīng)性。肽2047a(p2047a)是實施例19,20及表21所描述的CC-CKR5第三結(jié)構(gòu)域的肽。rsCD4/p2047aELISA試驗在0.25μg/mLrsCD4及1μg/mLp2047a包被的孔中進行，如實施例20所述對其進行優(yōu)化。雜交瘤中之一所分泌的抗體命名為B13，它在rsCD4ELISA試驗中的A492值為0.353，在rsCD4/p2047aELISA試驗中的A492值為1.526。即B13在ELISA試驗中呈現(xiàn)出對rsCD4/p2047a的反應(yīng)比對rsCD4強。B13雜交瘤再經(jīng)10次稀釋及篩選亞克隆，每一次循環(huán)得到的克隆可分泌rsCD4反應(yīng)性單克隆抗體，且其在ELISA試驗中對rsCD4/p2047a有增強反應(yīng)。單克隆抗體B13(MAbB13)的特性屬于IgG2a亞型，與MAbB4的亞型相同。單克隆抗體B13再以實施例11中所述的競爭性間接免疫熒光分析法進一步分析表明B13對單克隆抗體B4與含CD4宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合的抑制能力。生物素化的單克隆抗體B4與先與B13上清液或小鼠抗CD4抗血清溫育后的SUP-T靶細胞一同溫育。對照組的細胞被染色至FITC染色強度為+3，細胞染色陽性率為95％。相反，在抗CD4血清中預(yù)溫育后，大于95％的SUP-T細胞染色強度為1.5至2.0，而先與B13上清液溫育后的細胞則觀察不到被染色。因此可得出結(jié)論象單克隆抗體B4一樣，B13能特異地與含CD4宿主細胞抗原復(fù)合物結(jié)合。單克隆抗體B13與單克隆抗體B4的相似性也可由其對各類型的HIV-1原代分離物的中和活性的比較證明。單克隆抗體B13與單克隆抗體B4中和活性的比較是通過對HIV-1A、B、C、D和E各型分化體的中和活性來比較。病毒、宿主細胞及MT-2微小空斑中和分析實驗如實施例13所述。B13和B4對各類型病毒間交叉中和活性的相似性如表24所示。表24單克隆抗體B13對HIV-1A、B、C、D、E各型分化體初級分離物的中和作用(MT-2微小空斑中和分析)*加入Th036的病毒數(shù)很少。這通常比加入與其它實驗相當(dāng)時的病毒數(shù)會產(chǎn)生明顯較高的中和活性。因此，此結(jié)果是針對TH036中和活性的定性表示，不應(yīng)與其他的HIV-1分離物所得結(jié)果做定量比較。序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人王長怡(Wang,ChangYi)(ⅱ)發(fā)明名稱針對宿主細胞抗原復(fù)合物且能在接觸HIV前后保護宿主細胞不受HIV感染的抗體(ⅲ)序列數(shù)目2(ⅳ)通訊地址(A)收件人Morgan&amp;Finnegan,L.L.P.(B)街道345公園大道(C)城市紐約(D)州紐約(E)國別美國(F)郵政編碼10154-0053(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利出版#1.0，第1.25版(ⅵ)目前申請資料(A)申請?zhí)柎付?B)申請日1997年6月3日(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/808,374(B)申請日1997年2月28日(C)分類(ⅶ)母案申請資料(A)申請?zhí)?8/657,149(B)申請日1996年6月3日(C)分類424(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名瑪利亞C.H.林(B)注冊號碼29,323(C)參考/證書號1151-4145PC(ⅸ)電訊資料(A)電話(212)415-8745(B)傳真(212)751-6849(2)SEQIDNO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度433個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:1AsnLysValValLeuGlyLysLysGlyAspThrVal510GluLeuThrCysThrAlaSerGlnLysLysSerIle1520GlnPheHisTrpLysAsnTrpAsnGlnIleLysIle253035LeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyPro4045SerLysLeuAsnAspArgAlaAspSerArgArgSer505560LeuTrpAspGlnGlyAsnPheProLeuIleIleLys6570AsnLeuLysIleGluAspSerAspThrTyrIleCys7580GluValGluAspGlnLysGluGluValGlnLeuLeu859095ValPheGlyLeuThrAlaAshSerAspThrHisLeu100105LeuGlnGlyGlnSerLeuThrLeuThrLeuGluSer110115120ProProGlySerSerProSerValGlnCysArgSer125130ProArgGlyLysAsnIleGlnGlyGlyLysThrLeu135140SerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGlyThr145150155TrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysVal160165GluPheLysIleAspIleValValLeuAlaPheGln170175180LysAlaSerSerIleValTyrLysLysGluGlyGlu185190GlnValGluPheSerPheProLeuAlaPheThrVal195200GluLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrpGln205210215AlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleIle220225PheAspLeuLysAsnLysGluValSerValLysArg230235240ValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLys245250LeuProLeuHisLeuThrLeuProGlnAlaLeuPro255260GlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAlaLeu265270275GluAlaLysThrGlyLysLeuHisGlnGluValAsn280285LeuValValMetArgAlaThrGlnLeuGlnLysAsn290295300LeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLys305310LeuMetLeuSerLeuLysLeuGluAsnLysGluAla315320LysValSerLysArgGluLysProValTrpValLeu325330335AsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSer340345AspSerGlyGlnValLeuLeuGluSerAshIleLys350355360ValLeuProThrTrpSerThrProValGlnProMet365370AlaLeuIleValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuLeu375380LeuPheIleGlyLeuGlyIlePhePheCysValArg385390395CysArgHisArgArgArgGlnAlaGluArgMetSer400405GlnIleLysArgLeuLeuSerGluLysLysThrCys410415420GlnCysProHisArgPheGlnLysThrCysSerPro425430Ile(2)SEQIDNO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2PhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProGln510SerLeuIle1權(quán)利要求1．含CD4趨化因子受體的宿主細胞抗原復(fù)合物的抗體的制備方法，包括a．使用表達CD4的T細胞作為免疫原，這些T細胞選自下列組中?。x自由外周血單核T細胞，胸腺細胞或脾細胞組成的組的正常T淋巴細胞；或ⅱ．選自由SUP-T和HPB-ALL組成的組的衍生自T淋巴瘤或白血病的T細胞系細胞；b．分離并以PBS清洗表達CD4的T細胞；c．以腹膜內(nèi)注射方式對動物進行免疫接種，這些動物包括BALB/c小鼠，CD1小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠，大鼠，或恒河猴，這些動物均注射有5-10x106分離且以PBS清洗過的PBS或弗氏完全佐劑中的T細胞，接著每周或每兩個月以5-10x106分離且以PBS清洗過的不含佐劑的T細胞進行多次腹膜內(nèi)強化注射，總共3至6個月，最后一次強化注射是在進行融合以形成雜交瘤之前3天以靜脈內(nèi)方式進行的；d．測試接受免疫接種動物的血清是否含可與rsCD4結(jié)合的抗體；e．將曾接受免疫接種且其血清在步驟d中呈陽性的動物的脾臟切除以獲得脾細胞；f．將脾細胞與無限增殖惡性細胞系的細胞進行融合以形成雜交瘤，克隆此雜交瘤并篩選能分泌具有下列特性的抗體的雜交瘤?。crsCD4結(jié)合；ⅱ．在免疫熒光測定中可與表達CD4的細胞結(jié)合，其中結(jié)合的模式在高分辨率熒光顯微鏡下呈＂帽狀＂；ⅲ抑制HIVgp120與表達CD4的細胞間的結(jié)合；ⅳ．與已結(jié)合了HIVgp120的表達CD4的細胞結(jié)合；及ⅴ．在體外微小空斑測定中于＜10μg/mL的濃度下可中和HIV原代分離物，對50％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.01-10μg/mL之間，而對90％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.1-35μg/mL之間。2．如權(quán)利要求1所述的方法，其中分泌出的抗體的特點進一步包含ⅵ．以HIV或SIV原代分離物對靈長類動物或hu-PBL/SCID小鼠進行感染提供被動免疫，其ED50為＜50mg/kg。3．如權(quán)利要求2所述的方法，其中分泌出的抗體的特點進一步包含ⅶ．與以下肽代表的CD4的4個胞外域中的任一個結(jié)合AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。4．如權(quán)利要求3所述的方法，其中分泌出的抗體的特點進一步包含ⅷ．優(yōu)先與rsCD4/趨化因子受體而非rsCD4結(jié)合。5．如權(quán)利要求4所述的方法，其中趨化因子受體是CC-CKR5D3肽。6．如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中表達CD4的細胞是SUP-T細胞。7．如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中表達CD4的細胞是HPB-ALL細胞。8．如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中動物是BALB/c或CD1小鼠。9．如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中動物是含有編碼人類重鏈及輕鏈的轉(zhuǎn)基因人類序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。10．以權(quán)利要求1所述的方法制備出的抗體，具有以下的特性?。crsCD4結(jié)合；ⅱ．在免疫熒光測定中可與表達CD4的細胞結(jié)合，其中結(jié)合的模式在高分辨率熒光顯微鏡下呈＂帽狀＂；ⅲ抑制HIVgp120與表達CD4的細胞間的結(jié)合；ⅳ．與已結(jié)合了HIV-1gp120的表達CD4的細胞結(jié)合；及ⅴ．在體外微小空斑測定中于＜10μg/mL的濃度下可中和HIV原代分離物，對50％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.01-10μg/mL之間，而對90％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.1-35μg/mL之間。11．以權(quán)利要求10的方法制備出的抗體，其中所分泌出的抗體的特點進一步包含ⅵ．以HIV或SIV原代分離物對靈長類動物或hu-PBL/SCID小鼠進行感染提供被動免疫，其ED50是＜50mg/kg。12．以權(quán)利要求11的方法制備出的抗體，其中分泌出的抗體的特點進一步包含ⅶ．與以下肽所代表的CD4的4個胞外域中的任一個結(jié)合AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。13．以權(quán)利要求12的方法制備出的抗體，其中分泌出的抗體的特點進一步包含ⅷ．優(yōu)先與rsCD4/趨化因子受體而非rsCD4結(jié)合。14．以權(quán)利要求13的方法制備出的抗體，其中趨化因子受體是CC-CKR5D3肽。15．一種能分泌出如權(quán)利要求10、11、12、13或14的抗體的雜交瘤。16．一種具有以下特性的抗體?。crsCD4結(jié)合；ⅱ．在免疫熒光測定中可與表達CD4的細胞結(jié)合，其中結(jié)合的模式在高分辨率熒光顯微鏡下呈＂帽狀＂；ⅲ抑制HIVgp120與表達CD4的細胞間的結(jié)合；ⅳ．與已結(jié)合了HIVgp120的表達CD4的細胞結(jié)合；及ⅴ．在體外微小空斑測定中于＜10μg/mL的濃度下可中和HIV原代分離物，對50％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.01-10μg/mL之間，而對90％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.1-35μg/mL之間。17．如權(quán)利要求16的抗體，其進一步的特點是ⅵ．以HIV或SIV原代分離物對靈長類動物或hu-PBL/SCID小鼠進行感染提供被動免疫，其ED50是＜50mg/kg。18．如權(quán)利要求17的抗體，其進一步的特點是ⅶ．與以下肽代表的CD4的4個胞外域中的任一個結(jié)合AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。19．如權(quán)利要求18的抗體，其進一步的特點是ⅷ．優(yōu)先與rsCD4/趨化因子受體而非rsCD4結(jié)合。20．如權(quán)利要求19的抗體，其中趨化因子受體是CC-CKR5D3肽。21．如權(quán)利要求16、17、18、19或20的抗體，其中抗體是M2或B13。22．一種能分泌如權(quán)利要求16、17、18、19或20之抗體的雜交瘤。23．一種能分泌如權(quán)利要求16、17、18、19或21項的抗體的雜交瘤。24．一種包含如權(quán)利要求16、17、18、19或20的抗體的藥物制劑。25．一種包含抗體的藥物制劑，此抗體選自由B4,M2和B13組成的組。26．如權(quán)利要求25的藥物制劑，其中包含B4。27．如權(quán)利要求25的藥物制劑，其中包含M2。28．如權(quán)利要求25的藥物制劑，其中包含B13。29．一種通過腹膜內(nèi)注射來施用含有具有以下特性的抗體的藥物制劑在哺乳動物體內(nèi)對HIV提供被動免疫的方法?。crsCD4結(jié)合；ⅱ．在免疫熒光測定中可與表達CD4的細胞結(jié)合，其中結(jié)合的模式在高分辨率熒光顯微鏡下呈＂帽狀＂；ⅲ抑制HIVgp120與表達CD4的細胞間的結(jié)合；ⅳ．與已結(jié)合了HIVgp120的表達CD4的細胞結(jié)合；及ⅴ．在體外微小空斑測定中于＜10μg/mL的濃度下可中和HIV原代分離物，對50％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.01-10μg/mL之間，而對90％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.1-35μg/mL之間。30．如權(quán)利要求29的方法，其中抗體的進一步特點是ⅵ．以HIV或SIV原代分離物對靈長類動物或hu-PBL/SCID小鼠進行感染提供被動免疫，其ED50是＜50mg/kg。31．如權(quán)利要求30的方法，其中抗體的進一步特點是ⅶ．與以下肽代表的CD4的4個胞外域中的任一個結(jié)合AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。32．如權(quán)利要求31的方法，其中抗體的進一步特點是ⅷ．優(yōu)先與rsCD4/趨化因子受體而非rsCD4結(jié)合。33．如權(quán)利要求31的方法，其中趨化因子受體是CC-CKR5D3肽。34．如權(quán)利要求29、30、31、32、或33的方法，其中藥物制劑通過靜脈注射來施用。35．如權(quán)利要求29、30、31、32或33的方法，其中藥物制劑是以每公斤體重1mg至100mg的劑量范圍來施用的。36．如權(quán)利要求34的方法，其中藥物制劑是以每公斤體重5mg至50mg的劑量范圍來施用的。37．如權(quán)利要求35的方法，其中藥物制劑是以每公斤體重5mg的劑量來施用的。38．一種嵌合抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自具有下列特性的抗體ⅰ．與rsCD4結(jié)合；ⅱ．在免疫熒光測定中可與表達CD4的細胞結(jié)合，其中結(jié)合的模式在高分辨率熒光顯微鏡下呈＂帽狀＂；ⅲ抑制HIVgp120與表達CD4的細胞間的結(jié)合；ⅳ．與已結(jié)合了HIVgp120的表達CD4的細胞結(jié)合；及ⅴ．在體外微小空斑測定中于＜10μg/mL的濃度下可中和HIV原代分離物，對50％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.01-10μg/mL之間，而對90％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.1-35μg/mL之間。39．如權(quán)利要求38的嵌合抗體，其進一步的特點是ⅵ．以HIV或SIV原代分離物對靈長類動物或hu-PBL/SCID小鼠進行感染提供被動免疫，其ED50是＜50mg/kg。40．如權(quán)利要求39的嵌合抗體，其進一步的特點是ⅶ．與以下肽代表的CD4的4個胞外域中的任一個結(jié)合AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。41．如權(quán)利要求40的嵌合抗體，其進一步的特點是ⅷ．優(yōu)先與rsCD4/趨化因子受體而非rsCD4結(jié)合。42．如權(quán)利要求41的嵌合抗體，其中的趨化因子受體是CC-CKR5D3肽。43．一種嵌合抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自M2。44．一種嵌合抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自B4。45．一種嵌合抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自B13。46．一種人源化抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自具有下列特性的抗體?。crsCD4結(jié)合；ⅱ．在免疫熒光測定中可與表達CD4的細胞結(jié)合，其中結(jié)合的模式在高分辨率熒光顯微鏡下呈＂帽狀＂；ⅲ抑制HIVgp120與表達CD4的細胞間的結(jié)合；ⅳ與已結(jié)合了HIVgp120的表達CD4的細胞結(jié)合；及ⅴ．在體外微小空斑測定中于＜10μg/mL的濃度下可中和HIV原代分離物，對50％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.01-10μg/mL之間，而對90％中和活性而言濃度優(yōu)選的是在0.1-35μg/mL之間。47．如權(quán)利要求46所述的人源化抗體，其進一步的特點是ⅵ．以HIV或SIV原代分離物對靈長類動物或hu-PBL/SCID小鼠進行感染提供被動免疫，其ED50是＜50mg/kg。48．如權(quán)利要求47所述的人源化抗體，其進一步的特點是ⅶ．與以下肽代表的CD4的4個胞外域中的任一個結(jié)合AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。49．如權(quán)利要求48所述的人源化抗體，其進一步的特點是ⅷ．優(yōu)先與rsCD4/趨化因子受體而非rsCD4結(jié)合。50．如權(quán)利要求49的人源化抗體，其中趨化因子受體是CC-CKR5D3肽。51．一種人源化抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自M2。52．一種人源化抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自B4。53．一種人源化抗體，其中可變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自B13。54．如權(quán)利要求46、47、48、49、50、51、52或53的人源化抗體，是以基因重組方式制備而成的。55．如權(quán)利要求16、17、18、19或20的抗體片段，其中的片段選自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重鏈單體或二聚物，輕鏈單體或二聚物，由一重鏈和一輕鏈所組成的二聚物所組成的組中。56．抗體B4的片段，其中的片段選自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重鏈單體或二聚物，輕鏈單體或二聚物，由一重鏈和一輕鏈所組成的二聚物所組成的組中。57．如權(quán)利要求38、39、40、41、42、43、44或45的抗體片段，其中的片段選自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重鏈單體或二聚物，輕鏈單體或二聚物，由一重鏈和一輕鏈所組成的二聚物所組成的組中。58．如權(quán)利要求46、47、48、49、50、51、52或53的抗體片段，其中的片段選自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重鏈單體或二聚物，輕鏈單體或二聚物，由一重鏈和一輕鏈所組成的二聚物所組成的組中。59．通過酶促消化如權(quán)利要求16、17、18、19或20的抗體獲得的片段。60．通過酶促消化B4獲得的片段。61．通過酶促消化如權(quán)利要求38、39、40、41、42、43、44或45的抗體獲得的片段。62．通過酶促消化如權(quán)利要求46、47、48、49、50、51、52或53的抗體獲得的片段。全文摘要本發(fā)明涉及按照所述的方法及篩選步驟以能表達CD4的T淋巴細胞，例如外周血單核T細胞，胸腺細胞，脾細胞和白血病或淋巴瘤衍生的T細胞系例如HPB－ALL或SUP－T細胞作為免疫原生產(chǎn)的單克隆抗體。本發(fā)明單克隆抗體的特性在于其能在體內(nèi)或體外中和人類免疫缺陷病毒(HIV)及相關(guān)的免疫缺陷病毒的原代分離物。此抗體是針對含有與趨化因子受體的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CD4蛋白質(zhì)的宿主細胞抗原復(fù)合物的，對第一型的HIV(HIV－1)所有分化體的原代分離物和第二型的HIV(HIV－2)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的原代分離物具有廣泛的中和活性。本發(fā)明也涉及篩選及制造此種抗體的方法，能分泌此類抗體的雜交瘤，含有此抗體的藥物組合物和在靈長類，包括人類中，用此類抗體在接觸病毒前后預(yù)防免疫缺陷病毒所造成的感染，此類抗體的原靶為可表達CD4的淋巴細胞。文檔編號C12N5/10GK1227610SQ9719702公開日1999年9月1日申請日期1997年6月3日優(yōu)先權(quán)日1996年6月3日發(fā)明者王長怡申請人:美國聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司