專利名稱：：編碼番茄β－半乳糖苷酶多肽的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及編碼多肽的新植物基因家族，所述多肽的特征在于其水解β-D-半乳糖苷的末端非還原性3-D-半乳糖基殘基的能力。更具體地說，提供得自稱為pZBG2-1-4(在美國臨時(shí)申請(qǐng)第60/088,805中稱為pTomβgal4)的cDNA克隆的多核苷酸序列，它編碼稱為β-半乳糖苷酶Ⅱ的特有植物多肽。還提供編碼六種其它同源多肽的cDNA克隆、使用這些cDNA克隆生產(chǎn)本發(fā)明β-D-半乳糖苷多肽的方法以及通過使用本發(fā)明的多核苷酸或多肽改進(jìn)果實(shí)品質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：涉及呼吸高峰果實(shí)采集后品質(zhì)的最顯著和最重要的處理是在成熟期間發(fā)生的結(jié)構(gòu)、顏色、味道和芳香味的改變。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)方面的有害變化對(duì)品質(zhì)和采集后保存期限具有重要影響，所以已經(jīng)著重研究了與在番茄果實(shí)成熟期間發(fā)生的硬度損失有關(guān)的機(jī)制。盡管果實(shí)軟化可能與膨壓、解剖學(xué)特性和細(xì)胞壁完整性的變化有關(guān)，但一般認(rèn)為導(dǎo)致細(xì)胞壁完整性喪失的細(xì)胞壁分解是關(guān)鍵因素。在組成成分和大小方面最明顯的變化發(fā)生在細(xì)胞壁的果膠部分(參見在Seymour和Gross,1996中的參考文獻(xiàn))。已知在果實(shí)成熟期間發(fā)生在細(xì)胞壁果膠部分的變化包括可溶性、解聚作用、脫酯化作用增加以及含有側(cè)鏈的中性糖的顯著凈損失(Huber,1983；Fischer和Bennett,1991；Seymour和Gross,1996)。最充分特征鑒定的果膠修飾酶是多聚半乳糖醛酸酶(內(nèi)切-α1→4-D-聚半乳糖醛酸水解酶；E.C.3.2.1.15；PG)和果膠甲酯酶(E.C.3.1.1.11；PME)。盡管PG和PME在番茄果實(shí)成熟期間相對(duì)充裕并具有豐富活性，但在轉(zhuǎn)基因植物中PG(Smith等1988,1990)或PME(Tieman等1992；Hall等1993)基因表達(dá)和酶活性被顯著下調(diào)的果實(shí)仍然發(fā)生軟化，盡管稍微延遲。而且，PG在非成熟突變體rin番茄果實(shí)中的過量表達(dá)沒有造成軟化，即使果膠明顯發(fā)生明顯解聚和溶解(Ginvannoni等，1989)。在其它已知的于果實(shí)發(fā)育期發(fā)生的果膠變化之中，最充分特征鑒定的一個(gè)變化是在許多成熟果實(shí)的細(xì)胞壁中發(fā)生的半乳糖基殘基的顯著凈損失(Gross和Sams,1984；Seymour和Gross,1996)。盡管半乳糖基殘基的一些損失可能是由PG的作用間接造成，但β-半乳糖苷酶(外切-β(1→4)-D-吡喃半乳糖苷；E.C.3.2.1.23)是在高等植物中鑒定出的唯一一個(gè)能夠直接切割β(1→4)半乳聚糖鍵的酶，并可能在半乳聚糖側(cè)鏈損失中起作用(DeVeau等，1993；Carey等，1995；Carrington和Pressey,1996)。尚未在高等植物中鑒定出內(nèi)切作用的半乳聚糖酶。在成熟期的番茄中，β-半乳糖苷酶活性產(chǎn)物游離半乳糖(Gross,1984)急劇增加，并且叫做β-半乳糖苷酶Ⅱ的特定酶的活性相應(yīng)增加(Carey等，1995)，這些現(xiàn)象支持β-半乳糖苷酶在成熟期對(duì)由細(xì)胞壁釋放半乳糖基殘基起作用的觀點(diǎn)。據(jù)認(rèn)為，β-半乳糖苷酶活性對(duì)細(xì)胞壁代謝重要(Carey等，1995)。通常使用人工底物，諸如對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、4-甲基傘形基-β-D-吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL)，檢測(cè)β-半乳糖苷酶。然而，顯然β-半乳糖苷酶Ⅱ也具有對(duì)天然底物即β(1→4)半乳聚糖的活性(Carey等，1995；Carrington和Pressey,1996；Pressey,1983)。在許多其它果實(shí)中已純化和特征鑒定了β-半乳糖苷酶蛋白，所述果實(shí)包括獼猴桃(Ross等，1993)、咖啡(Golden等，1993)、柿子(Kang等，1994)和蘋果(Ross等，1994)。Carey等(1995)能夠從成熟番茄果實(shí)中純化出三種以前鑒定的β-半乳糖苷酶(Pressey,1983)，但只有一種(β-半乳糖苷酶Ⅱ)對(duì)β(1→4)半乳聚糖有活性。雖然他們能夠鑒定出推定的β-半乳糖苷酶cDNA克隆，但所述cDNA的推斷的氨基酸序列沒有一個(gè)匹配所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的氨基末端序列。盡管已經(jīng)純化了存在于成熟期番茄(LycopersiconesculentumMill.)果實(shí)中并能夠降解番茄果實(shí)半乳聚糖的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白，但仍難以獲得相應(yīng)基因的克隆。利用幾種方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物基因表達(dá)的改進(jìn)。分子生物學(xué)家可以由一系列降低或增加基因表達(dá)或改變特定基因的空間和時(shí)間表達(dá)的已知方法中選擇。例如，已經(jīng)利用特異性反義RNA或部分(截短的)有義RNA的表達(dá)降低植物中不同靶基因在植物中的表達(dá)(如Bird和Ray,1991,BiotechnologyandGenetic-EngineeringReviews9:207-227所論述)。這些技術(shù)包括將用來表達(dá)反義或有義RNA的合成基因加入到植物的基因組中。它們已成功用于向下調(diào)節(jié)與番茄果實(shí)的發(fā)育和成熟有關(guān)的一系列個(gè)體基因的表達(dá)(Gray等，1992,PlantMolecularBiology,i9:69-87)。還開發(fā)了增加靶基因表達(dá)的方法。例如可以將用來表達(dá)含有所述靶基因的完全編碼區(qū)的RNA的另外的基因加入到所述植物的基因組中，以“過量表達(dá)”所述基因產(chǎn)物。已知各種其它改變基因表達(dá)的方法；例如使用可變調(diào)節(jié)序列。以上提及的每個(gè)參考文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容都通過引用完整結(jié)合到本文中。因此存在一種需要即克隆β-半乳糖苷酶Ⅱ和相關(guān)多肽的基因，并使用已知的改變植物基因表達(dá)的方法從而提供改變果實(shí)品質(zhì)的方法，尤其是通過改變細(xì)胞壁，從而直接影響所述果實(shí)成熟的方法。發(fā)明概述本發(fā)明是基于對(duì)得自編碼β-半乳糖苷酶的基因家族的cDNA克隆的新DNA序列的發(fā)現(xiàn)。在圖1A、B中顯示了基于對(duì)本發(fā)明DNA序列的共有氨基酸序列同一性的系統(tǒng)樹。在圖2中顯示了5個(gè)cDNA克隆和2個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)克隆，本文稱為TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，它們分別具有稱為SEQIDNO1-7的核苷酸序列，經(jīng)鑒定它們與其它已知β-半乳糖苷酶具有高度共有序列同一性。對(duì)應(yīng)的氨基酸序列本文分別稱為SEQIDNO8-16，并示于圖2和3。SEQIDNO1-7的核苷酸序列收錄于GenBank，獲得以下相應(yīng)的收錄號(hào)SEQIDNO:1TGB1AF0238471997年9月10日收錄SEQIDNO:2TGB2AF1544201999年5月19日收錄SEQIDNO:3TGB3AF1544211999年5月20日收錄SEQIDNO:4TGB4AF0203901997年8月21日收錄SEQIDNO:5TGB5AF1544231999年5月20日收錄SEQIDNO:6TGB6AF1544241999年5月20日收錄SEQIDNO:7TGB7AF1544221999年5月20日收錄在以下的整個(gè)論述中，應(yīng)當(dāng)理解無論在本發(fā)明說明書中何處論及TBG4,TBG1-3和5-7也包括在該敘述中，除非另有說明。還提供一種方法，該方法通過克隆編碼本發(fā)明蛋白(諸如β-半乳糖苷酶Ⅱ)的cDNA(例如pZBG2-1-4)，或通過由基因組DNA獲得所述DNA序列，或通過用所述cDNA序列作為引導(dǎo)序列從頭開始合成DNA序列，從而提供本發(fā)明的DNA序列。還提供改變細(xì)胞壁代謝的方法，該方法包括改變至少一種半乳糖苷酶的活性并因此改變所述果實(shí)的品質(zhì)。本發(fā)明還提供DNA構(gòu)建物，它包括在植物中有效的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)控制下的部分或全部示范性β-半乳糖苷酶DNA序列，以使該構(gòu)建物可以在植物細(xì)胞中產(chǎn)生RNA。還發(fā)現(xiàn)了與編碼β-半乳糖苷酶的基因的表達(dá)相關(guān)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子。本發(fā)明還涉及重組載體(它包括本發(fā)明的分離的核酸分子)、包含所述重組載體的宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生這樣的載體和宿主細(xì)胞的方法和使用它們通過重組技術(shù)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶多肽或肽的方法。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建物的植物細(xì)胞；由其產(chǎn)生具有改變的β-半乳糖苷酶基因表達(dá)的植物；和由這樣的植物產(chǎn)生的種子。本發(fā)明的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白已顯示了其在導(dǎo)致組織完整性喪失和果實(shí)軟化的細(xì)胞壁分解中的酶活性。所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白可能還涉及細(xì)胞壁代謝，細(xì)胞壁代謝可能與細(xì)胞延長(zhǎng)和/或擴(kuò)張有關(guān)，并因此與植物生長(zhǎng)和發(fā)育有關(guān)。β-半乳糖苷酶可以通過水解細(xì)胞壁中的半乳糖使成熟開始和/或發(fā)展，因?yàn)榘肴樘强赡苌婕皢为?dú)或與非結(jié)合N-聚糖一起刺激乙烯產(chǎn)生。本發(fā)明的β-半乳糖苷酶可能涉及在果實(shí)成熟期間通過降解葉綠體膜半乳糖脂將葉綠體(綠色-葉綠素)轉(zhuǎn)變?yōu)樯|(zhì)體(紅色-番茄紅素)。預(yù)期由示于圖2的核苷酸序列代表的基因家族編碼一組相似的酶，它們具有相同類型的水解活性，但具有不同的組織和/或底物特異性或細(xì)胞區(qū)室類型。本發(fā)明的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白以及其它由示于圖2的核苷酸序列編碼的蛋白可用來制備果膠或其它得自細(xì)胞壁的具有降低的半乳糖基含量的聚合物，用于需要較低或較高交聯(lián)或粘度特性的生物膜和溶液(例如澄清的果汁)。本發(fā)明還提供β-半乳糖苷酶用作酶混合物組成成分，用于分離原生質(zhì)體。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B顯示了在番茄β-半乳糖苷酶克隆TGB1-7和其它已知植物β-半乳糖苷酶多肽之間的基于共有氨基酸序列同一性的系統(tǒng)樹。圖2顯示本發(fā)明的7個(gè)β-半乳糖苷酶基因(TGB1、TGB2、TGB3、TGB4、TGB5、TGB6和TGB7)的cDNA序列[分別為SEQIDNO:1-7]。圖3顯示番茄果實(shí)cDNA克隆TGB1、TGB2、TGB3、TGB4、TGB5、TGB6和TGB7的推斷氨基酸序列[分別為SEQIDNO:8-16]和各種植物β-半乳糖苷酶cDNA克隆的推斷氨基酸序列的多重序列對(duì)比。圖4顯示對(duì)在各種植物組織(花、葉、根和莖)中表達(dá)的TBG進(jìn)行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖5顯示對(duì)在處于不同發(fā)育階段的果實(shí)組織中表達(dá)的TBG進(jìn)行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖6顯示對(duì)在果實(shí)組織(青熟(maturegreen)或轉(zhuǎn)換期(turningstage)果實(shí)的果皮、外果皮(outerpericarp)、內(nèi)果皮(innerpericarp)和子房室(locular))中表達(dá)的TBG進(jìn)行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖7顯示對(duì)在正常和突變果實(shí)組織中表達(dá)的TBG進(jìn)行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖8顯示對(duì)在乙烯處理的青熟果實(shí)組織中表達(dá)的TBG進(jìn)行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖9顯示對(duì)酵母表達(dá)的TBG4的蛋白質(zhì)印跡分析。圖10顯示對(duì)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)的pZBG2-1-4的β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)。圖11A-E(1-4)顯示包含抑制TBG4mRNA的反義構(gòu)建物的番茄植物果實(shí)和親代系果實(shí)的結(jié)構(gòu)檢測(cè)的對(duì)比結(jié)果。圖12A-B顯示對(duì)在包含TBG4反義構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因果實(shí)中表達(dá)的TBG4的RNA印跡分析。圖13顯示用于轉(zhuǎn)化植物和以反義方向表達(dá)TBG4(pZBG2-1-4)的雙元構(gòu)建物(Binaryconstruct)。發(fā)明詳述下文的詳細(xì)描述涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并意欲說明每個(gè)本發(fā)明其它DNA序列。本發(fā)明提供含有編碼β-半乳糖苷酶多肽(尤其是具有示于圖2的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽)的多核苷酸的分離的核酸分子。本發(fā)明的示范性β-半乳糖苷酶ⅡcDNA克隆的DNA序列由編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ的cDNA克隆pZBG2-1-4測(cè)定，收錄于GenBank，獲得的收錄號(hào)為AF020390。不是所有的β-半乳糖苷酶都對(duì)提取的細(xì)胞壁物質(zhì)由包含β(1→4)-D-半乳聚糖的細(xì)胞壁聚合物中經(jīng)釋放半乳糖具有體外活性。已經(jīng)表明，由示范性β-半乳糖苷酶Ⅱ克隆pZBG2-1-4表達(dá)的多肽具有β-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶(exogalactinase)活性。如圖2所示，本發(fā)明的示范性β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白和由以下cDNA克隆推斷的氨基酸序列具有序列同源性，所述cDNA克隆為β-半乳糖苷酶cDNA克隆TBG2-7和蘆筍(收錄號(hào)P45582)、蘋果(收錄號(hào)P48981)和康乃馨(收錄號(hào)Q00662)果實(shí)的cDNA克隆，本發(fā)明的示范性β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白還和分離自成熟‘AilsaCraig’果實(shí)的番茄β-半乳糖苷酶cDNA克隆(命名為pTomβgall，獲得的收錄號(hào)為P48980)的先前公開序列的β-半乳糖苷酶cDNA克隆序列具有序列同源性(Carey等，1995)。本發(fā)明人在此公開的TBG1克隆(收錄號(hào)AF023847)的ORF與先前由Carey等描述的cDNA幾乎相同。如圖2所示，在所有公開的植物β-半乳糖苷酶的7個(gè)克隆(TBG1-7)和其它植物β-半乳糖苷酶中都具有高共有推斷序列同一性。對(duì)所述數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索也表明，在植物β-半乳糖苷酶與哺乳動(dòng)物和真菌β-半乳糖苷酶的域之間存在明顯的共有序列同一性，但用細(xì)菌β-半乳糖苷酶檢測(cè)幾乎沒有共有序列同一性。如在圖1中所示，TBG1和TBG3具有高共有氨基酸同一性。TBG4也非常類似于TBG1和3。TBG2和7的氨基酸序列是獨(dú)特的，因?yàn)榘被岵迦氲膸讉€(gè)區(qū)似乎遍及其序列(圖3)。核酸分子除非另有說明，否則通過測(cè)序本文的DNA分子確定的所有核苷酸序列都使用基于PCR的雙脫氧核苷酸終止法和ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀(諸如AppliedBiosytems,Inc.,FosterCity,CA的373型測(cè)序儀)測(cè)定，而所有的由本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的氨基酸序列都通過翻譯如上測(cè)定的DNA序列推算。因此，如本領(lǐng)域?qū)νㄟ^此自動(dòng)方法測(cè)定任何DNA序列的了解，本文測(cè)定的任何核苷酸序列可能包含一些錯(cuò)誤。通過自動(dòng)裝置測(cè)定的核苷酸序列與所測(cè)序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列通常具有至少約90％同一性，更通常至少約95％至至少約99.9％同一性。通過其它方法可以更精確的測(cè)定實(shí)際序列，包括在本領(lǐng)域廣為人知的手工DNA測(cè)序法。本領(lǐng)域還知道，與實(shí)際序列相比，在所測(cè)定的核苷酸序列中單個(gè)的插入或缺失將在翻譯所述核苷酸序列時(shí)產(chǎn)生移碼，使得推算的由所測(cè)定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列與由所測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列從此插入或缺失點(diǎn)開始完全不同。所述核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”對(duì)于DNA分子或多核苷酸而言意指脫氧核糖核苷酸序列，而對(duì)于RNA分子或多核苷酸而言意指相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列(A、G、C和U)，其中在特定脫氧核糖核苷酸序列中的每個(gè)胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T)都置替換為尿嘧啶核糖核苷酸(U)。可以使用本文提供的信息，諸如示于圖2的示范性核苷酸序列[SEQIDNO:4]，使用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選方法，諸如那些使用mRNA作為原料克隆cDNA的方法，獲得編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的本發(fā)明核酸分子。在圖2[SEQIDNO:4]中描述的作為本發(fā)明實(shí)例的核酸分子發(fā)現(xiàn)于得自‘Rutgers’番茄植物的花端著色(breaker)、轉(zhuǎn)換和粉紅色果實(shí)的果皮的cDNA文庫。pZBG2-1-4的cDNA插入片段的全序列可由GenBank(AF020390)獲得并示于圖2[SEQIDNO:4]。該cDNA插入片段為2532個(gè)核苷酸(nt)長(zhǎng)，并包含單一的長(zhǎng)可讀框(ORF)，估計(jì)它在位于核苷酸64的框內(nèi)的第一個(gè)ATG開始，并在核苷酸2238的TAA終止。此ORF編碼724個(gè)氨基酸長(zhǎng)的79kD的蛋白。推斷的pZBG2-1-4的氨基酸序列和在資料庫中所有公開的植物β-半乳糖苷酶序列(圖1A、B)具有明顯的氨基酸同一性。當(dāng)將每個(gè)β-半乳糖苷酶基因的完整ORF與pZBG2-1-4對(duì)比時(shí)，共有序列同一性就番茄pTomβgal1(P48980)而言約為64％，就蘋果(P48981)而言約為67.6％，就蘆筍(P45582)而言約為63％，而就康乃馨(Q00662)而言約為55％。一般技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，由于上文論述的可能出現(xiàn)的測(cè)序錯(cuò)誤，包含約724個(gè)氨基酸并由所收錄的cDNA編碼的實(shí)際的完全β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽可能略短或略長(zhǎng)。更一般地說，實(shí)際的可讀框可能在±20個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)的任何位置，更可能是在±10個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)，由這二者中的任一個(gè)預(yù)測(cè)它為示于圖2[SEQIDNO:4]的N端的第一個(gè)蛋氨酸密碼子。在任何情況下，如下文的進(jìn)一步論述，本發(fā)明進(jìn)一步提供在完全多肽的N端缺失各種殘基的多肽，包括在本文所述的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的N端缺少一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的多肽。前導(dǎo)序列和成熟序列對(duì)pZBG2-1-4的推斷氨基酸序列的分析表明，基于疏水性前導(dǎo)序列、前導(dǎo)序列切割位點(diǎn)和三個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)分泌的可能性很高。使用PSORT(版本6.4,Nakai和Kanehisa,1992，通過引用結(jié)合到本文中)和SignalP(版本1.1,Nielsen等，1997，通過引用結(jié)合到本文中)程序推算，所述ORF包含應(yīng)在分別于位置23和24的丙氨酸和絲氨酸殘基之間被切割的疏水性前導(dǎo)序列，而所述成熟多肽具有胞外定位。所述成熟多肽在編號(hào)282、459和713的天冬酰胺處包含三個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)，然而在位置713的天冬酰胺由于在位置714的脯氨酸而不大可能被糖基化。估測(cè)未糖基化成熟多肽的分子量為75kD,pⅠ為8.9。因此，本發(fā)明的完全β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的氨基酸序列包括前導(dǎo)序列和成熟蛋白，如圖3[SEQIDNO:4]所示。更具體地說，本發(fā)明提供編碼成熟形式的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的核酸分子。因此，按照信號(hào)假說，分泌性蛋白具有由所述完全多肽切下的信號(hào)或分泌前導(dǎo)序列，以產(chǎn)生分泌性“成熟”形式的蛋白。在某些情況下，對(duì)分泌性蛋白的切割不完全一致，這產(chǎn)生了兩種或兩種以上的成熟蛋白。此外，很早就知道分泌性蛋白的切割特異性最終通過完全蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，即它是在多肽的氨基酸序列中固有的。所以，本發(fā)明提供編碼成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列，所述多肽具有由示于圖2[SEQIDNO:4]并收錄于GenBank(收錄號(hào)AF20390)的cDNA編碼的氨基酸序列。所述“具有由示于圖2[SEQIDNO:4]的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽”是指通過在植物細(xì)胞中表達(dá)由示于圖2[SEQIDNO:4]并收錄于GenBank(收錄號(hào)AF20390)的克隆的cDNA序列編碼的完全可讀框生產(chǎn)的成熟形式的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白。本發(fā)明的示范性β-半乳糖苷酶ⅡcDNA(TBG4)已經(jīng)在大腸桿菌菌株XLIblueMR(1acZ)(Stratagene,LaJolla,CA)中表達(dá)，如下文所述(參見實(shí)施例)。對(duì)表示本發(fā)明其它β-半乳糖苷酶基因的cDNA克隆的推斷氨基酸序列的分析也揭示了可讀框，并在某些情況下顯示分泌所編碼蛋白的可能性很高。推測(cè)所有的全長(zhǎng)cDNA克隆都具有信號(hào)序列(圖2)。使用兩個(gè)預(yù)測(cè)程序SignalP和PSORT，由兩個(gè)程序預(yù)測(cè)都顯示TBG4是分泌性的。用SignalP預(yù)測(cè)顯示TBG1、2和3具有可切割的信號(hào)序列，但PSORT預(yù)測(cè)TBG1、2和3具有不可切割的信號(hào)序列。利用PSORT顯示TBG7靶向葉綠體。基于利用所述程序PSORT(版本6.4)和SingalP(版本1.1)預(yù)測(cè)的疏水性前導(dǎo)序列的存在，對(duì)所述7個(gè)克隆中的每一個(gè)的具體觀察如下TBG1起始密碼子位于306[SEQIDNO:1],ORF=835個(gè)氨基酸[SEQIDNO:8]，信號(hào)序列位于1-24；TBG2起始密碼子未確定[SEQIDNO:2],ORF=888個(gè)氨基酸[SEQIDNO:9]，信號(hào)序列位于1-25；TBG3起始密碼子位于32[SEQIDNO:3],ORF=838個(gè)氨基酸[SEQIDNO:10]，信號(hào)序列位于1-22；TBG5起始密碼子未確定[SEQIDNO:5],ORF=251個(gè)氨基酸[SEQIDNO:12]，信號(hào)序列未確定；TBG6起始密碼子未確定[SEQIDNO:6],ORF=248個(gè)氨基酸[SEQIDNO:13]，信號(hào)序列未確定；TBG7起始密碼子位于104[SEQIDNO:7],ORF=870個(gè)氨基酸[SEQIDNO:14]，信號(hào)序列位于1-35。還使用程序DNAsis對(duì)所述7個(gè)克隆的推斷的氨基酸序列進(jìn)行分析，在表Ⅰ中概述了預(yù)測(cè)的分子量、細(xì)胞尋靶、pⅠ和潛在的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)。表1．番茄β-半乳糖苷酶(TBG)cDNA序列數(shù)據(jù)?？寺?個(gè)全長(zhǎng)和2個(gè)部分長(zhǎng)度的cDNA并測(cè)序。所述DNA和推定的氨基酸序列數(shù)據(jù)如下克隆mRNA(kb)kDpⅠN聯(lián)靶TBG13.290.86.22ER/OUTTBG23.097.06.26PMTBG32.890.58.21ER/OUTTBG42.677.98.93OUTTBG5～3TBG6～3TBG73.093.38.06CHLORN聯(lián)=可能的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)；ER=內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；OUT=分泌的；PM=限于質(zhì)膜；CHLOR=葉綠體正如所示，本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式，諸如mRNA,或是DNA形式，包括例如通過克隆獲得的或合成產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA。所述DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈，也叫做有義鏈，或者可以是非編碼鏈，也叫做反義鏈。所述“分離的”核酸分子是指已經(jīng)脫離其天然環(huán)境的核酸分子DNA或RNA。例如對(duì)于本發(fā)明來說，包含于載體中的重組DNA分子被認(rèn)為是分離的。更多分離的DNA分子的實(shí)例包括保持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或在溶液中的(部分或大致)純化的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄本。按照本發(fā)明的分離的核酸分子進(jìn)一步包括所述合成產(chǎn)生的分子。本發(fā)明的分離的核酸分子包括包含可讀框(ORF)的DNA分子，所述ORF的起始密碼子位于示于圖2的核苷酸序列[SEQIDNO:4]的位置64。還包括包含成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的編碼序列的DNA分子，所述編碼序列示于圖2[SEQIDNO:4]的位置135-2532。另外，本發(fā)明的分離的核酸分子包括包含一種序列的DNA分子，所述序列大體上不同于以上描述的那些序列，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性仍可編碼所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白。當(dāng)然，所述遺傳密碼和種特異性適宜密碼子在本領(lǐng)域是眾所周知的。因此，產(chǎn)生上述的簡(jiǎn)并變異體，例如最佳化密碼子表達(dá)于特定宿主(例如將植物mRNA的密碼子改變?yōu)橹T如大腸桿菌的細(xì)菌宿主優(yōu)選的那些密碼子)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言應(yīng)是常規(guī)操作。最好是，該核酸分子將編碼由上述收錄cDNA克隆編碼的成熟多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供具有示于圖2的核苷酸序列[SEQIDNO:4]的分離的核酸分子或具有上述序列的互補(bǔ)序列的核酸分子。這樣的分離分子，尤其是DNA分子，通過和染色體原位雜交用作基因作圖的探針，以及例如通過RNA印跡分析用于檢測(cè)所述β-半乳糖苷酶Ⅱ基因在植物組織中的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本文所述的部分核苷酸序列的核酸分子以及涉及本文所述的分離的核酸分子的片段。具體而言，本發(fā)明提供具有代表圖2[SEQIDNO:4]的部分的核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包括圖2[SEQIDNO:4]的位置1-2538。另外，本發(fā)明提供具有涉及圖2[SEQIDNO:4]的多個(gè)部分(extensiveportions)的核苷酸序列的另外的核酸分子，所述核苷酸序列已經(jīng)由以下的相關(guān)cDNA克隆確定如圖3所示的TBG1-3和TBG5-7,SEQNO1-3和5-7。另一方面，本發(fā)明提供包含一種多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下與上述的本發(fā)明核酸分子(例如示于圖2[SEQIDNO:4]的cDNA克隆)中的一部分多核苷酸雜交。所述“嚴(yán)格雜交條件”是指在溶液中(包含50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl,15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml剪切變性的鮭精DNA)于42℃過夜溫育，接著在約65℃以0.1×SSC漂洗濾膜。正如所述，編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的本發(fā)明核酸分子包括但不限于，單獨(dú)編碼所述成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子；所述成熟多肽的編碼序列和另外的序列(諸如編碼約1-23氨基酸的前導(dǎo)序列的序列)，如前蛋白或蛋白原或前蛋白原序列；所述成熟多肽的編碼序列有或沒有上述另外的編碼序列。還發(fā)現(xiàn)了與編碼β-半乳糖苷酶的基因表達(dá)相關(guān)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子。本發(fā)明人已特征鑒定了TBG2mRNA的表達(dá)形式，并已克隆了λ基因組cDNA。TBG2在果實(shí)成熟開始之前表達(dá)并在整個(gè)成熟期中保持在同一水平上。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TBG2在所有的果實(shí)組織中表達(dá)，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其是果實(shí)特異性的。試驗(yàn)已經(jīng)顯示TBG2不受乙烯的影響。在開花期后正常時(shí)序時(shí)間TBG2表達(dá)于成熟突變體rin、nor和Nr。所發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子對(duì)在有義或反義方向表達(dá)任何基因均有用，尤其是在番茄果實(shí)中，在所有的番茄果實(shí)組織中表達(dá)都在成熟過程之前開始并持續(xù)整個(gè)成熟過程。所述啟動(dòng)子還可以用于在成熟突變體rin、nor和Nr中表達(dá)任何基因，而不需要用外來的乙烯氣體處理所述果實(shí)。變異體和突變體多核苷酸本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明核酸分子的變異體，它編碼所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的部分、類似物或衍生物。變異體可以天然產(chǎn)生，諸如天然等位基因變異體。所述“等位基因變異體”是指在生物體的染色體上占據(jù)特定基因座的基因的幾種可選形式之一。GenesⅡ,Lewin,B.編輯，JohnWiley&Sons，紐約(1985)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生非天然產(chǎn)生的變異體。這樣的變異體包括通過核苷酸置換、缺失或添加產(chǎn)生的變異體。所述置換、缺失或添加可以包括一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。所述變異體可以在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或這二者中改變。在所述編碼區(qū)的改變可以產(chǎn)生保守或非保守的氨基酸置換、缺失或添加。在這其中特別優(yōu)選的是沉默置換、添加和缺失，它們不改變所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白或其部分的特性和活性。在這點(diǎn)上還特別優(yōu)選保守置換。最高度優(yōu)選的是編碼具有示于圖2的氨基酸序列的成熟蛋白核酸分子(如pZBG2-l-4)或由所收錄的cDNA克隆編碼的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ氨基酸序列的核酸分子。進(jìn)一步的實(shí)施方案包括含有一種多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸和選自以下的多核苷酸具有至少90％、更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性(a)編碼具有示于圖2[SEQIDNO:4]的完全氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有示于圖2[SEQIDNO:4]的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列；(c)與以上(a)或(b)中的任一核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的分離的DNA分子的載體、用所述重組載體進(jìn)行基因工程操作的宿主細(xì)胞以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽或其片段。所述載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是復(fù)制型或復(fù)制缺陷型。在后一種情況下，病毒繁殖通常只在互補(bǔ)型宿主細(xì)胞中發(fā)生。所述多核苷酸可以連接至包含選擇標(biāo)記的載體，用于在宿主中繁殖。一般來說，在沉淀(諸如磷酸鈣沉淀)中或在具有帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中引入質(zhì)粒載體。如果所述載體是病毒，則可以使用合適的包裝細(xì)胞系將其體外包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。所述DNA插入片段應(yīng)當(dāng)操作性連接至合適的啟動(dòng)子，諸如噬菌體λPL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、trp、phoA和tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子和反轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子，在此僅舉幾個(gè)例子。其它適合的啟動(dòng)子是熟練技術(shù)人員已知的。所述表達(dá)構(gòu)建物將進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)以及在轉(zhuǎn)錄區(qū)中的用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由所述構(gòu)建物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的編碼部分最好包括位于要翻譯的多肽的開始部分的翻譯起始密碼子和在該多肽末端的合適位置的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。正如所述，所述表達(dá)載體最好包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括用于真核生物細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性基因和用于在大腸桿菌和其它細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。合適宿主的代表性實(shí)例包括但不限于，細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌、StrepZBG2-1-4yces和鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)細(xì)胞；真菌細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅屬S2細(xì)胞和草地夜蛾Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，諸如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。適于上述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選用于細(xì)菌的載體包括由QIAGEN,Inc.，同上，獲得的pQE70、pQE60和pQE-9；可由Stratagene獲得的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可由Pharmacia獲得的ptrc99a、pKK233-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核生物載體是可由Stratagene獲得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可由Pharmacia獲得的pSVK3、pBVP、pMSG和pSVL。其它合適的載體對(duì)技術(shù)熟練人員而言將是顯而易見的?？梢酝ㄟ^磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法實(shí)現(xiàn)將所述構(gòu)建物引入到所述宿主細(xì)胞中。在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中都描述了這些方法，諸如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)。實(shí)施例使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法在溫室中培育番茄載培品種Rutgers(LycopersiconesculentumMill.,cv.‘Rutgers')植株。所述成熟突變體成熟抑制劑(rin)、非成熟(nor)和永不成熟(Nr)(Tigchelaar等，1978)都出自所述‘Rutgers’。在開花時(shí)對(duì)花做標(biāo)記，而果實(shí)就按照開花后的天數(shù)(dpa)或基于如前所述的其成熟期的表面顏色采集(Mitcham等，1989)，該文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容在此通過引用完整結(jié)合到本文中。關(guān)于基因表達(dá)研究，由溫室培育的植物采集各種葉、花和莖組織，并由基礎(chǔ)組織培養(yǎng)基中培育的幼苗采集根，該幼苗在種子萌芽后培育4周。RNA提取于溫室采集果實(shí)后立即對(duì)其進(jìn)行以下加工在冰上冷卻、切除各種組織并使它們?cè)谝旱袃鼋Y(jié)。使用臼和杵磨碎組織樣品，并儲(chǔ)存在-80℃。使用在Verwoerd等(1989)中描述的方法提取RNA。使用寡聚物(dT)柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)由總的RNA中純化聚腺苷酸化RNA。通過使用雙光束分光光度計(jì)檢測(cè)A260定量RNA。RT-PCR基于我們?cè)谔O果(收錄號(hào)P48980)、蘆筍(P445582)和康乃馨(Q00662)的β-半乳糖苷酶cDNA克隆之間發(fā)現(xiàn)的最高共有推斷氨基酸序列同一性，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。用于第一個(gè)反應(yīng)的兩個(gè)引物是BG5＇E1(WSNGGNWSNATHCAYTAYCC)和BG3＇E(CCRTAYTCRTCNADNGGNGG)。使用BG5＇Ⅰ1(ATHCARACNTAYGTNTTYTGG)和BG3＇E對(duì)第一個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行第二個(gè)反應(yīng)。所述引物序列的簡(jiǎn)并密碼是N=a+t+c+g；H=a+t+c；B=t+c+g；D=a+t+g；V=a+c+g；R=a+g；Y=c+t；M=a+c；K=t+g；S=c+g；和W=a+t。所述5＇和3＇引物分別對(duì)應(yīng)于所述蘋果克隆的氨基酸72-78和321-315。使用AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer,Norwalk,CT)和標(biāo)準(zhǔn)PCR條件，使用由以下所述的第一個(gè)cDNA文庫(Ausubel等，1987)制得的cDNA作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。在瓊脂糖凝膠中分離PCR產(chǎn)物，純化預(yù)期大小(約750bp)的片段，將其克隆入pCRscript(Stratagene,LaJolla,CA)中并測(cè)序。cDNA文庫構(gòu)建兩個(gè)cDNA文庫。第一個(gè)包含分離自‘Rutgers'植物的花端著色、轉(zhuǎn)換和粉紅色的果實(shí)果皮的聚腺苷酸化(poly(A))RNA。根據(jù)生產(chǎn)商的ZAP-cDNAGigapackⅡGold克隆試劑盒(Stratagene)的說明書精確地進(jìn)行cDNA合成和文庫構(gòu)建，該說明書的全部公開內(nèi)容通過引用完整結(jié)合到本文中。使用多脫氧胸苷酸(poly(dT))引物引發(fā)cDNA第一鏈的合成，并使用EcoRⅠ和XhoⅠ限制位點(diǎn)將插入片段直接克隆到Uni-ZapXR載體中。第二個(gè)文庫包含分離自‘Rutgers’植物的生綠色(immaturegreen)、青熟、花端著色、轉(zhuǎn)換、粉紅色、紅色-成熟和過熟果實(shí)的所有果實(shí)組織(種子除外)的聚腺苷酸化RNA。根據(jù)生產(chǎn)商對(duì)用于cDNA合成和·克隆的SuperScriptλ系統(tǒng)(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的說明書精確地進(jìn)行cDNA合成和文庫構(gòu)建。使用寡脫氧胸苷酸引物引發(fā)cDNA第一鏈的合成，并使用SalⅠ和NotⅠ限制位點(diǎn)將cDNA插入片段直接克隆到·ZipLox克隆載體中。擴(kuò)增兩個(gè)文庫并使用生產(chǎn)商提供的宿主菌株按照其說明書保持。使用一種所述克隆(RT-PCR2-1)以低嚴(yán)格性(在無甲酰胺的情況下于45℃雜交，并用0.2×SSC于42℃最后漂洗)由番茄果實(shí)cDNA文庫中篩選106噬菌斑。鑒定30個(gè)陽性cDNA克隆并部分測(cè)序。對(duì)所述RT-PCR和cDNA克隆的完全測(cè)序和特征鑒定揭示了7種可能的獨(dú)特的β-半乳糖苷酶基因。DNA和RNA凝膠印跡分析使用每個(gè)全長(zhǎng)克隆的3＇UTR和RT-PCR克隆作為探針對(duì)限制酶消化的基因組DNA進(jìn)行DNA分析?；旧先缭赟mith和Fedoroff(1995)中的描述進(jìn)行DNA凝膠印跡分析，除了用于每次消化的是3μg基因組DNA。對(duì)應(yīng)于所述克隆的基因似乎作為單一拷貝存在(未提供數(shù)據(jù))。上述探針使用重組近交系的RFLP用于所述7個(gè)基因中的6個(gè)的作圖，基因座名稱和圖位示于表Ⅱ(JamesGioviannone,TexasA&MUniversity，個(gè)人通信)。表Ⅱ．TBG基因座圖位。使用重組近交系的RFLP通過DNA分析對(duì)基因作圖基因染色體圖位TBG112★IL12-2、IL12-3的重疊TBG29IL9-3TBG33IL3-5TBG412★IL12-2、IL12-3的重疊TBG511IL11-3TBG62IL2-4、IL2-5的重疊TBG7無RFLP★TBG1和4是松散連鎖在甲醛/Mops瓊脂糖凝膠中分離總的RNA(20μg/泳道)，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜(Amersham,ArlingtonHeights,IL)，通過于80℃溫育2小時(shí)固定，在雜交培養(yǎng)箱(RobbinsScientific,Sunnyvale,CA)中使用Church和Gilben(1984)描述的緩沖液過夜雜交，最終的漂洗嚴(yán)格條件為含0.2％SDS的0.1×SSC、65℃，并基本按照Ausubel等(1987)所述放射自顯影。使用RNA梯標(biāo)準(zhǔn)品(GibcoBRL)測(cè)定所述RNA的長(zhǎng)度。使用用32p-dATP作為標(biāo)記的隨機(jī)引物試劑盒(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)合成探針。使用每個(gè)全長(zhǎng)克隆的3＇UTR和RT-PCR克隆作為探針合成的模板進(jìn)行RNA分析。至于加樣量對(duì)照，剝離RNA印跡并使用大豆26SrDNA片段(Turano等，1997)在降低雜交和漂洗嚴(yán)格條件下再探測(cè)RNA印跡。對(duì)于所有的雜交，將32p-(dATP)標(biāo)記的探針稀釋至1-2×106dpm/mL。以上參考文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容都通過引用完整結(jié)合到本文中。序列分析使用基于PCR的雙脫氧核苷酸終止法和ABI自動(dòng)測(cè)序儀(AppliedBiosystems,Fostercity,CA)在Iowa州立大學(xué)測(cè)序中心(Ames,IA)進(jìn)行測(cè)序。通過引物步移(primerwalking)對(duì)cDNA插入片段的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序。使用BLAST搜索(Altschul等，1990)對(duì)核苷酸序列和推斷的氨基酸序列與所述數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比。使用DNAStrider1.2(Marck,1988)和MacDNAsis(Hitachi,SanBruno,CA)軟件分析序列數(shù)據(jù)并進(jìn)行對(duì)比。以上參考文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容都通過引用完整結(jié)合到本文中。RNA印跡分析組織特異性表達(dá)進(jìn)行RNA印跡分析，以揭示所述β-半乳糖苷酶基因的RNA具有(如果有的話)果實(shí)特異性表達(dá)模式。除了TBG2以外，在非果實(shí)組織中檢測(cè)到所有克隆的轉(zhuǎn)錄本(圖4)。在所有的測(cè)試組織中都檢測(cè)到TBG1、4、5和6的轉(zhuǎn)錄本。在根和莖組織中檢測(cè)到低水平的TBG3轉(zhuǎn)錄本，而在花和莖組織中檢測(cè)到TBG7轉(zhuǎn)錄本。在果實(shí)中的時(shí)間表達(dá)模式使用提取自除種子之外的所有果實(shí)組織的RNA檢測(cè)所述7個(gè)基因在果實(shí)組織中的時(shí)間表達(dá)模式。在果實(shí)發(fā)育的幾個(gè)階段檢測(cè)所有7個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本(圖5)。TBG1和3具有相似的表達(dá)模式，并在花端著色至過熟階段的整個(gè)過程中都檢測(cè)到它們的轉(zhuǎn)錄本。TBG2具有獨(dú)特的表達(dá)模式，由30dpp至過熟階段檢測(cè)到其恒定水平的轉(zhuǎn)錄本。TBG4表達(dá)模式類似于TBG1和3，但不同之處在于轉(zhuǎn)錄本水平在轉(zhuǎn)換階段明顯較高。TBG5在發(fā)育的成熟階段具有和TBG4相似的表達(dá)模式，但在果實(shí)發(fā)育的所有較早期的過程中也檢測(cè)到TBG5轉(zhuǎn)錄本。TBG6的表達(dá)模式令人關(guān)注，只是在所測(cè)試的所有成熟前階段檢測(cè)到其高水平的轉(zhuǎn)錄本。TBG7也具有獨(dú)特的表達(dá)模式，在所測(cè)試的所有階段中檢測(cè)到的其轉(zhuǎn)錄本水平都非常低，而在10dpp和過熟階段檢測(cè)到中等水平的轉(zhuǎn)錄本。在果實(shí)中的空間表達(dá)模式還進(jìn)行RNA印跡分析，以測(cè)定在各種果實(shí)組織中的轉(zhuǎn)錄物累積。因?yàn)樗鯰BG基因的時(shí)間表達(dá)模式不同，所以使用青熟階段和轉(zhuǎn)換階段果實(shí)進(jìn)行RNA提取(圖6)。在所測(cè)試的所有青熟果實(shí)組織中都檢測(cè)到TBG2和TBG6轉(zhuǎn)錄本。TBG7轉(zhuǎn)錄本存在于所測(cè)試的所有果實(shí)組織中，子房室除外。在由所有轉(zhuǎn)換階段果實(shí)組織中提取出的RNA樣品中都檢測(cè)到TBG1和TBG4轉(zhuǎn)錄本。值得注意的是，TBG4轉(zhuǎn)錄本在果皮中更加豐富。TBG3和TBG5的表達(dá)模式是獨(dú)特的，分別除了外果囊皮和子房室之外，在所有的組織中都檢測(cè)到它們的轉(zhuǎn)錄本。對(duì)比正常和突變果實(shí)的表達(dá)為了更好地了解所述TBG產(chǎn)物的潛在作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，使用來自成熟突變體rin、nor和N′的果實(shí)組織進(jìn)行RNA分析。該分析是重要的，因?yàn)樗赡塬@得初步確定任一所述TBG可能具有任何潛在的成熟和/或軟化作用的線索。突變果實(shí)的RNA分析的結(jié)果提示，在突變果實(shí)組織中TBG1、2、3、5和7的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)未受影響，它們的轉(zhuǎn)錄本以正常的時(shí)序(dpp)模式存在(圖7)。然而在所述突變果實(shí)中TBG4和6轉(zhuǎn)錄本的豐度是不同的。在N′果實(shí)組織中未檢測(cè)到TBG4轉(zhuǎn)錄本，而在rin和nor中檢測(cè)到比野生型果實(shí)組織低得多的TBG4轉(zhuǎn)錄本水平。通常在果實(shí)發(fā)育的早期過程中檢測(cè)到高水平的TBG6轉(zhuǎn)錄本，但在青熟階段(40-42dpp)之后檢測(cè)不到TBG6轉(zhuǎn)錄本。在所有三種突變體的果實(shí)中TBG6轉(zhuǎn)錄本甚至持續(xù)至50dpp。用乙烯調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄使用突變體和野生型果實(shí)進(jìn)行的RNA分析表明，乙烯可能上調(diào)節(jié)TBG4表達(dá)，而可能下調(diào)節(jié)TBG6表達(dá)。為了評(píng)價(jià)此假說，采集青熟果實(shí)，使其經(jīng)受連續(xù)氣流的混合在空氣中的10ppm乙烯。在1、2、12和24小時(shí)使用對(duì)照和乙烯處理的果實(shí)進(jìn)行RNA提取。該試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了突變果實(shí)RNA分析的發(fā)現(xiàn)。正如所料，TBG1、2、3、5和7轉(zhuǎn)錄本的存在和豐度在經(jīng)受外來乙烯處理的青熟組織中基本不受影響(圖8)。然而，在乙烯存在的情況下，在青熟組織中的TBG4轉(zhuǎn)錄本豐度增加。根據(jù)給出的數(shù)據(jù)，用外來乙烯處理是否降低TBG6轉(zhuǎn)錄本的豐度并不清楚，因?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄本水平通常在果實(shí)發(fā)育的這個(gè)階段降低。酶活性為了確定所述TBG編碼產(chǎn)物的作用，我們使用異源表達(dá)系統(tǒng)開始表達(dá)cDNA編碼的酶的試驗(yàn)。試驗(yàn)了幾種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但由于毒性(參見下文實(shí)施例)產(chǎn)物的得率非常低。因此我們使用分泌成熟氨基末端FLAG融合蛋白至培養(yǎng)基中的酵母表達(dá)系統(tǒng)。首先測(cè)試所述TBG4cDNA，結(jié)果導(dǎo)致每50ml培養(yǎng)物產(chǎn)生約1mgTBG4活性蛋白。首先使用TBG4是因?yàn)樵揷DNA編碼所述酶β-半乳糖苷酶Ⅱ，該酶純化自番茄果實(shí)并已相當(dāng)詳細(xì)地特征鑒定(Carey等1995,Smith等1998)。所以我們能夠?qū)Ρ犬愒聪到y(tǒng)表達(dá)的蛋白和純化自番茄的天然酶的活性。使用抗FLAG親和樹脂成功地親和純化了所述TBG4蛋白(圖9)。證實(shí)所述親和純化的TBG4酶利用其水解合成底物對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的能力(Smith等，1998)具有β(1→4)-D-半乳糖苷酶活性。該酶可切割各種細(xì)胞壁底物中的半乳糖基殘基并因此具有外切半乳聚糖酶活性(表Ⅲ)。目前對(duì)其余成功表達(dá)活性酶的全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行了試驗(yàn)。初步的結(jié)果已顯示TBG1編碼的酶還具有β-D-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶活性(表Ⅲ)。表Ⅲ．在酵母中表達(dá)的TBG4和TBG1的細(xì)胞壁降解活性。由純化自番茄果實(shí)的螯合劑可溶性果膠(CSP)和堿溶性果膠(ASP)以及半纖維素(HCF)細(xì)胞壁部分中去除半乳糖基殘基。釋放的半乳糖μg酶底物煮熟的新鮮的aTBG4CSP05ASP014.5HCF04bTBG1ASP01.22mg底物；于37℃4小時(shí)a.005單位酶/rxb.0005單位酶/rx編碼β-半乳糖苷酶的pZBG2-1-4將TBG4ORF按閱讀框架克隆入阻遏/誘導(dǎo)型細(xì)菌表達(dá)載體pFLAG-CTC。宿主菌株XL1-BlueMR是突變株，既不含內(nèi)源β-半乳糖苷酶活性，也不含α互補(bǔ)。在30-37℃，用(IPTG)誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄使大腸桿菌生長(zhǎng)立即停止。然而，在20℃誘導(dǎo)確實(shí)能使某些大腸桿菌有限生長(zhǎng)。當(dāng)在20C培養(yǎng)包含pZBG2-1-44ORF的克隆并用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，所述細(xì)胞在包含所述β-半乳糖苷酶底物X-GAL的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)36小時(shí)后緩慢變藍(lán)(圖10)。如果不用IPTG誘導(dǎo)，則即使是在包含X-GAL的培養(yǎng)基中延時(shí)培養(yǎng)之后也未觀察到藍(lán)色。至于另外的陰性對(duì)照，在用或不用IPTG誘導(dǎo)的情況下，即使是在培養(yǎng)7天后，由用所述FLAG載體單獨(dú)轉(zhuǎn)化的XL1-BlueMR組成的克隆也從未顯示任何β-半乳糖苷酶活性(圖10)。至于最大β-半乳糖苷酶活性的陽性對(duì)照(得自大腸桿菌β-半乳糖苷酶)，將克隆載體pGEM轉(zhuǎn)化到宿主菌株DH5α中，結(jié)果也示于圖10。圖10顯示對(duì)在大腸桿菌中表達(dá)的pZBG2-1-4的β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)。收獲細(xì)胞并每隔12小時(shí)制備提取物，檢測(cè)A615。將培養(yǎng)物在外加顯色底物X-GAL(空心符號(hào))或X-GAL和轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑IPTG(實(shí)心符號(hào))的所述培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。用作大腸桿菌β-半乳糖苷酶活性陽性對(duì)照的載體是pGEM(■)，而用作陰性對(duì)照和用于表達(dá)的載體是或不含(○,●)或含pZBG2-1-4ORF(△,▲)的pFLAG-CTC。對(duì)植物組織結(jié)構(gòu)的作用為進(jìn)一步證實(shí)TBG4編碼的β-半乳糖苷酶Ⅱ的功能，進(jìn)行以下的試驗(yàn)。包含抑制TBG4mRNA的反義構(gòu)建物的番茄植物果實(shí)與親代系果實(shí)相比，堅(jiān)硬度最多大40％(比較圖11A-11E(1-4)中的親代系#1和反義系#2的平均值)。在所述轉(zhuǎn)化體中具有最堅(jiān)硬果實(shí)的株系也具有最低的總TBG4mRNA水平(圖12A、B)。這種相關(guān)性表明TBG4mRNA的減少與果實(shí)堅(jiān)硬度的增加有關(guān)。較堅(jiān)硬的果實(shí)可以導(dǎo)致(1)較少運(yùn)輸損傷(a)較少緣于損傷的損失和(b)能夠在產(chǎn)生較好味道的較后階段采集上市；(2)對(duì)于市場(chǎng)和顧客而言都具有較長(zhǎng)的保存期限；(3)對(duì)于新鮮切片銷售而言果實(shí)品質(zhì)更好；在較堅(jiān)硬時(shí)粉紅色/紅色階段的果實(shí)更好切割。方法為測(cè)定TBG4編碼的β-半乳糖苷酶Ⅱ的功能，使用組成型表達(dá)的35SCaMV啟動(dòng)子制備反義構(gòu)建物，以表達(dá)TBG4反義RNA(圖13)。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建物移入番茄中。為了評(píng)價(jià)TBG4抑制對(duì)加工的番茄(cv‘UC82b')果泥品質(zhì)的作用，已經(jīng)轉(zhuǎn)化了4個(gè)番茄栽培品種和3個(gè)新的精選栽培品種。所述新的精選栽培品種中的一個(gè)品種是軟果實(shí)鮮櫻桃色番茄(softfruitlargecherrytomato)(cv‘AilsaCraig')，第二個(gè)是軟果實(shí)老繁殖系(cv‘Rutgers')，而第三個(gè)是最新研制的稍微堅(jiān)硬的載培品系‘NewRutgers'。在這些其中TBG4mRNA受到抑制的品系當(dāng)中，我們期望發(fā)現(xiàn)硬度和果泥粘性增加。結(jié)構(gòu)盡管此項(xiàng)目接近完成，但還未完成全部的生物化學(xué)和分子分析。對(duì)所述‘NewRutgers’載培品系分析的初步結(jié)果列于圖11A-E(1-4)和12A、B。在此實(shí)施例中使用叫做‘NewRutgers’的新精選栽培品系。培養(yǎng)購買種子植株并使其自交，產(chǎn)生的種子用作親代對(duì)照(系1)。培養(yǎng)7個(gè)包含TBG4反義構(gòu)建物的獨(dú)立轉(zhuǎn)化植物(系2-8)并使其自交。通過DNA印跡分析證實(shí)轉(zhuǎn)化(T-DNA插入片段)(未列出數(shù)據(jù))。培養(yǎng)每種轉(zhuǎn)化系的各5株植物連同10株親代系植物。在花端著色階段(第一次發(fā)生顏色變化)對(duì)果實(shí)進(jìn)行標(biāo)記并在花端著色+7天采集。使用每種系的15-20個(gè)果實(shí)收集數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)果實(shí)都進(jìn)行兩次每種類型的結(jié)構(gòu)檢測(cè)，使用StableMicroSystem的TA-XT2i結(jié)構(gòu)分析儀對(duì)果實(shí)進(jìn)行4種類型的結(jié)構(gòu)檢測(cè)。所述4種檢測(cè)是1、2英寸平板壓至3mm(圖11A)，2、4mm球形硬度試驗(yàn)壓頭(indenter)壓至3mm(圖11B),3、4mm圓柱形硬度試驗(yàn)壓頭壓至3mm(圖11C)和4、4mm圓柱形硬度試驗(yàn)壓頭穿刺至10mm(圖11D)。這些數(shù)據(jù)的概述于圖11E(1-4)。在圖11A-E(1-4)中，系1是親代系，而系2-8每個(gè)都代表獨(dú)立的包含1個(gè)T-DNA拷貝的所述TBG4反義構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化體。對(duì)所述數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Duncans和Scheffé)揭示，轉(zhuǎn)化系3、7和8的果實(shí)和親代系沒有明顯不同，但轉(zhuǎn)化系2、4、5和6明顯比親代系果實(shí)更堅(jiān)硬。最值得注意的是轉(zhuǎn)化系2的果實(shí)的平均硬度比所述親代系的果實(shí)堅(jiān)硬40％(圖11A-D)。RNA印跡分析目前我們正在研究其中TBG4mRNA水平被抑制的果實(shí)中的生物化學(xué)成分的任何變化。這些試驗(yàn)用來顯示在果實(shí)硬度增加和TBG4mRNA抑制、TBG4編碼的酶活性抑制、細(xì)胞壁可能的改變(例如半乳糖基殘基含量增加)以及在果實(shí)成熟過程中游離半乳糖水平降低之間的關(guān)系。這些試驗(yàn)雖然不完整，但進(jìn)行了一些初步的RNA印跡試驗(yàn)，數(shù)據(jù)示于圖12A、B。在圖12A、B中沒有顯示親代或不成對(duì)的對(duì)照果實(shí)RNA，因?yàn)檫@些植物最后培養(yǎng)，并且RNA提取現(xiàn)在正在進(jìn)行。作為對(duì)比的正常果實(shí)TBG4mRNA水平參見以上圖5。圖5的數(shù)據(jù)顯示TBG4mRNA水平在青熟階段較低，在轉(zhuǎn)換階段達(dá)到峰值，并在紅色階段減少。除系2和3之外所有的品系都表達(dá)反義TBG4mRNA(圖12A、B)。所述反義轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)為兩條帶，在長(zhǎng)度上比內(nèi)源mRNA小。這兩條帶可能原因是1、由NOS終止子提供預(yù)期的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和2、在所述反義TBG4cDNA中的隱藏轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。最值得注意的結(jié)果是在系2中于轉(zhuǎn)換階段未檢測(cè)到TBG4mRNA。系2也具有最堅(jiān)硬的紅色果實(shí)(參見圖11A-D)。沒有可檢測(cè)的TBG4mRNA可能是由內(nèi)源和反義mRNA二者共抑制造成。當(dāng)與較早的印跡(例如圖4)相比時(shí)，所有的所述品系似乎都具有大體降低的TBG4mRNA水平，但在同一RNA分析中沒有親代和不成對(duì)對(duì)照RNA的情況下，所以不可能賦予此說明以具體數(shù)值。本說明書公開了β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽參與果實(shí)成熟過程中的細(xì)胞壁果膠的降解。在本發(fā)明中，說明了番茄中β-半乳糖苷酶在果實(shí)成熟和軟化過程中的作用，并描述了對(duì)編碼表達(dá)于成熟番茄果實(shí)組織中的β(1→4)半乳聚糖降解酶的β-半乳糖苷酶cDNA克隆的克隆。本發(fā)明研究指出，pZBG2-1-4是得自所述TBG4基因轉(zhuǎn)錄本的cDNA，它編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ是由于以下原因首先，預(yù)期的成熟pZBG2-1-4翻譯產(chǎn)物的高度保守的氨基末端部分的推斷的氨基酸序列和由Carey等(1995)純化并命名為TOMAA的β-半乳糖苷酶Ⅱ的氨基末端序列幾乎完全匹配(30個(gè)氨基酸中的28個(gè)匹配)。重要的是，在所述β-半乳糖苷酶Ⅱ序列(TOMAA)中不匹配本發(fā)明的pZBG2-1-4推斷氨基酸序列的兩個(gè)氨基酸(KY)據(jù)信是不正確的，因?yàn)樵跀?shù)據(jù)庫中的所有植物β-半乳糖苷酶序列和4個(gè)另外的從番茄鑒定的β-半乳糖苷酶相關(guān)cDNA同pZBG2-1-4推斷氨基酸序列在這兩個(gè)相同的氨基酸(ST)位置上全部匹配或具有保守置換(圖3)。其次，在檢測(cè)到β-半乳糖苷酶Ⅱ活性的同時(shí)也用pZBG2-1-4在正常成熟果實(shí)中檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本(圖5；Carey等，1995)。而且，在45和50dpa的所述突變體nor、rin和Nr的果實(shí)中幾乎未檢測(cè)到或未檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本(圖7)。這個(gè)觀測(cè)結(jié)果也與Carey等(1995)提供的數(shù)據(jù)一致β-半乳糖苷酶Ⅱ活性保持在和青熟果實(shí)相等的水平上，并在45-65dpa的nor或rin植物的果實(shí)中沒有升高。令人關(guān)注的是Carrington和Pressey(1996)已經(jīng)報(bào)道在成熟的轉(zhuǎn)換階段之后只在‘Rutgers’果實(shí)中檢測(cè)到β-半乳糖苷酶Ⅱ活性。在本發(fā)明中的RNA數(shù)據(jù)表明，最大的β-半乳糖苷酶Ⅱ活性僅在轉(zhuǎn)換階段后出現(xiàn)，假定mRNA水平表示可提取的酶活性(圖5)。第三，由所述pZBG2-1-4序列預(yù)測(cè)的成熟蛋白表觀分子量為77.9kD,pⅠ為8.9，這與以下對(duì)β-半乳糖苷酶Ⅱ的測(cè)定結(jié)果相似Pressey(1983)通過凝膠過濾柱層析測(cè)定的分子量為62Kd和通過等電聚焦測(cè)定的pⅠ為7.8，另一方面Carey等(1995)通過SDS-PAGE測(cè)定的分子量為75kD，通過等電聚測(cè)定的pⅠ為9.8。第四，使用異種酵母表達(dá)系統(tǒng)由pZBG2-1-4ORF產(chǎn)生的酶具有β-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶活性。所引用的參考文獻(xiàn)AltschulSF,GishW,MillerW,MeyersEW,LipmanDJ(1990)Basiclocalalignmentsearchtool.JMolBiol215:403-410AusubelF,BrentR,KingstonR,MooreD,SeidmanJ,SmithJ,StruhlK,eds,(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSons,NewYorkCareyAT,HoltK,PicardS,WildeR,TuckerGA,BirdCR,SchuchW,SeymourGB(1995)Tomatoexo-(1→4)-β-D-galactanase.Isolation,changesduringripeninginnormalandmutanttomatofruit,andcharacterizationofarelatedclone.PlantPhysiol108:1099-1107CarringtonCM,PresseyR(1996)β-galactosidaseⅡactivityinrelationtochangesincellwallgalactosylcompositionduringtomatoripening.JAmerSocHortSci121:132-136ChurchGM,GilbertW(1984)Genomicsequencing.ProcNatlAcadSciUSA81:1991-1995DeVeauEJ,GrossKC,HuberDJ,WatadaAE(1993)Degradationandsolubilizationofpectinbyβ-galactosidasespurifiedfromavocadomesocarp.PhysiolPlant87:279-285FischerRL,BennettAB(1991)Roleofcellwallhydrolasesinfruitripening.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBio42:675-703GiovannoniJJ,DellaPennaD,BennettAB,FischerRL(1989)Expressionofachimericpolygalacturonasegeneintransgenicrin(ripeninginhibitor)tomatofruitresultsinpolyuronidedegradationbutnotfruitsoftening.PlantCell1:53-63GoldenKD,JohnMA,KeanEA(1993)β-GalactosidasefromCoffeaarabicaanditsroleinfruitripening.Phytochemistry34:355-360GrossKC(1984)Fractionationandpartialcharacterizationofcellwallsfromnormalandnon-ripeningmutanttomatofruit.PhysiolPlant62:25-32GrossKC,SamsCE(1984)Changesincellwallneutralsugarcompositionduringfruitripening:Aspeciessurvey.Phytochemistry23:2457-2461GrossKC,WallnerSJ(1979)Degradationofcellwallpolysaccharidesduringtomatofruitripening.PlantPhysiol63:117-121HallLN,TuckerGA,SmithCJS,WatsonCF,SeymourGB,BundickY,BoniweilJM,FletcherJD,RayJA,SchuchW,BirdCR,GriersonD,(1993)Antisenseinhibitionofpectinesterasegeneexpressionintransgenictomatoes.PlantJ3:121-129HuberDJ(1983)Theroleofcellwallhydrolasesinfruitsoftening.HortRev5:169-219KangIK,SuhSG,GrossKC,ByunJK(1994)N-terminalaminoacidsequenceofpersimmonfruitβ-galactosidase.PlantPhysiol105:975-979KimJ,GrossKC,SolomosT(1991)Galactosemetabolismandethyleneproductionduringdevelopmentandripeningoftomatofruit.PostharvBiolTechnol1:67-80MarckC(1988)DNAStrider:a“C”programforthefastanalysisofDNAandproteinsequencesontheAppleMacintoshfamilyofcomputers.NucleicAcidsRes16:1829-1836MitchamEJ,GrossKC,NgTJ(1989)Tomatofruitcellwallsynthesisduringdevelopmentandsenescence.Invivoradiolabelingofcellwallfractionsusing[14C]sucrose.PlantPhysiol89:477-481NakaiK,KanehisaM(1992)Aknowledgebaseforpredictingproteinlocalizationsitesineukaryoticceils.Genomics14:897-911NielsenH,EngelbrechtJ,BrunakS,vonHeijneG(1997)Identificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites.ProteinEngineering10:1-6PresseyR(1983)β-Galactosidasesinripeningtomatoes,PlantPhysiol71:132-135RossGS,RedgwellRJ,MacRaeEA(1993)Kiwifruitβ-galactosidase:isolationandactivityagainstspecificfruitcell-wallpolysaccharides.Planta189:499-506RossGS,WegrzynT,MaeRaeEA,RedgwellRJ,(1994)Appleβ-galactosidase.ActivityagainstcellwallpolysaccharidesandcharacterizationofarelatedcDNAclone.PlantPhysiol106:521-528SeymourGB,GrossKC(1996)Cellwalldisassemblyandfruitsoftening.PostharvestNewsInfo7:45N-52NSmithCJS,WatsonCFS,RayJ,BirdCR,MorrisPC,SchuchW,GriersonD(1988)AntisenseRNAinhibitionofpolygalacturonasegeneexpessionintransgenictomatoes.Nature334:724-726SmithDL,FedoroffNV(1995)LRPl,agenee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2．用于改進(jìn)植物中β-半乳糖苷酶基因表達(dá)的方法，該方法包括用權(quán)利要求1或權(quán)利要求22要求保護(hù)的核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物、培育所轉(zhuǎn)化的植物并選擇相比于未轉(zhuǎn)化植物具有改進(jìn)的β-半乳糖苷酶基因表達(dá)的植物。全文摘要提供新β－半乳糖苷酶基因家族和得自編碼這些基因產(chǎn)物的cDNA的克隆的DNA序列,以由cDNA克隆pZBG2－1－4編碼的β－半乳糖苷酶Ⅱ蛋白作為實(shí)例。還提供改變細(xì)胞壁代謝的方法,該方法包括改變至少一個(gè)β－半乳糖苷酶的活性并因此改變所述果實(shí)的品質(zhì)。本發(fā)明還提供DNA構(gòu)建物,該構(gòu)建物包括在植物中有效的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)控制下的部分或全部β－半乳糖苷酶DNA序列,以使其可以在植物細(xì)胞中產(chǎn)生RNA和可選地產(chǎn)生β－半乳糖苷酶多肽。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的分離的核酸分子的重組載體、包含所述重組載體的宿主細(xì)胞以及制備這樣的載體和宿主細(xì)胞的方法和使用它們通過重組技術(shù)生產(chǎn)β－半乳糖苷酶多肽或肽的方法。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建物的植物細(xì)胞;由其產(chǎn)生的具有修飾的β－半乳糖苷酶基因表達(dá)的植物;和由這樣的植物產(chǎn)生的種子。文檔編號(hào)C12N9/38GK1311816SQ99809249公開日2001年9月5日申請(qǐng)日期1999年6月8日優(yōu)先權(quán)日1998年6月9日發(fā)明者K·C·格羅斯,D·L·史密斯申請(qǐng)人:美國政府農(nóng)業(yè)部