專利名稱：調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白質(zhì)，特別是突變體PARP蛋白質(zhì)或其部分，以及編碼它們的基因在生產(chǎn)具有改變的程序性細(xì)胞死亡的真核細(xì)胞和有機(jī)體，特別是植物細(xì)胞和植物中的用途。提供了真核細(xì)胞和有機(jī)體，特別是植物細(xì)胞和植物，其中或者在至少部分細(xì)胞，優(yōu)選所選細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡(PCD)得到激發(fā)，或者相反，通過調(diào)節(jié)PARP蛋白質(zhì)在有機(jī)體的細(xì)胞或至少部分細(xì)胞中PARP蛋白質(zhì)的水平或活性而將這些細(xì)胞中的PCD抑制。本發(fā)明還涉及表達(dá)這些基因的真核細(xì)胞和有機(jī)體，特別是植物細(xì)胞和植物。
相關(guān)技術(shù)描述程序性細(xì)胞死亡(PCD)為生理性細(xì)胞死亡過程，涉及動(dòng)物和植物在發(fā)育過程中或響應(yīng)環(huán)境指示時(shí)所選細(xì)胞的除去(參見Ellis等人，1991；Pennell和Lamb.1997)。經(jīng)歷PCD的細(xì)胞分解在形態(tài)上伴隨著細(xì)胞質(zhì)和核的濃縮、收縮和斷裂，通常成為小的密封囊(Cohen 1993,Wang等人，1996)。在生物化學(xué)上，PCD的特征在于將核DNA一般斷裂成代表大約50kb片段的寡核小體，以及誘導(dǎo)半胱氨酸蛋白酶和核酸內(nèi)切酶。DNA的斷裂可以通過在細(xì)胞切片中DNA 3’-OH基團(tuán)的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)來檢測(Gavrieli等人，1992)。通過PCD的細(xì)胞死亡與通過壞死的細(xì)胞死亡完全不同，后者涉及細(xì)胞膨脹、細(xì)胞內(nèi)容物溶解和漏出。
在動(dòng)物中，PCD涉及不需要的細(xì)胞的除去或死亡，這些細(xì)胞例如有處于變態(tài)的蝌蚪尾細(xì)胞、在脊椎動(dòng)物中發(fā)育的指之間的細(xì)胞、過量生產(chǎn)的脊椎動(dòng)物神經(jīng)元、細(xì)胞特化過程中的細(xì)胞如角膜細(xì)胞等。不再能正常行使其功能的損壞細(xì)胞也可以通過PCD除去，防止它們繁殖和/或擴(kuò)散。PCD,或其缺乏，還涉及人體中大量的病理狀態(tài)(AIDS、Alzheimer病、Huntington病、Lou Gehring病、癌癥)。
在植物中，已證實(shí)或據(jù)信PCD涉及大量發(fā)育過程，例如，在胚發(fā)育過程中胚柄細(xì)胞的除去、單子葉種子發(fā)芽之后糊粉細(xì)胞的除去、種子發(fā)芽和幼苗生長之后根冠細(xì)胞的除去、在木質(zhì)部管狀分子或細(xì)胞列發(fā)育中見到的細(xì)胞特化過程中的細(xì)胞死亡、或者單性花中花器官敗育。在低氧條件下在根中形成通氣組織以及在一些植物中葉裂片或穿孔的形成似乎也涉及PCD。在植物中當(dāng)葉或其它器官衰老時(shí)發(fā)生細(xì)胞大規(guī)模死亡。在植物中的過敏反應(yīng)，換句話說在無毒力病原體進(jìn)入部位發(fā)生細(xì)胞快速死亡產(chǎn)生限制性病斑，為響應(yīng)環(huán)境指示的PCD的另一例子。
動(dòng)物或植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)物，特別是在低密度細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中死亡也證實(shí)了PCD的特征。
已暗示涉及PCD或細(xì)胞程序死亡中的酶為聚(ADP-核糖)聚合酶。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，也稱之為聚(ADP-核糖)轉(zhuǎn)移酶(ADPRT)(EC2.4.2.30)，是在大多數(shù)真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核中的酶，這些真核細(xì)胞包括脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、粘菌、腰鞭毛蟲、真菌和除酵母之外的其它低等真核細(xì)胞。在許多植物中也已證實(shí)了其酶活性(Payne等人，1976；Willmitzer和Wagner,1982；Chen等人，1994；O’Farrell,1995)。
PARP催化將來自NAD+的ADP-核糖部分主要轉(zhuǎn)移到靶蛋白質(zhì)的谷氨酸殘基的羧基上，隨后進(jìn)行ADP-核糖聚合。主要靶蛋白質(zhì)為PARP本身，但是已顯示組蛋白、高速遷移率族染色體蛋白質(zhì)、拓?fù)洚悩?gòu)酶、內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶經(jīng)受該修飾。
來自動(dòng)物的PARP蛋白質(zhì)為113-120kDa的核內(nèi)蛋白，它在大多數(shù)細(xì)胞類型中都豐富，由三個(gè)主要的功能域組成包括兩個(gè)Zn-指結(jié)構(gòu)域的氨基末端DNA結(jié)合域、羧基端催化域和經(jīng)過自動(dòng)修飾的內(nèi)結(jié)構(gòu)域(de Murcia和Menissier de Murcia,1994；Kameshita等人，1984；Lindahl等人，1995)。當(dāng)結(jié)合到DNA的單鏈斷裂處時(shí)其體外酶活性大大增加。其體內(nèi)活性通過最終導(dǎo)致DNA斷裂的條件誘導(dǎo)(Alvarez-Gonzalez和Althaus,1989lkejima等人，1990)。中心域的自動(dòng)修飾顯然用作PARP的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。
通過檢測來自標(biāo)記NAD+的3H摻入根尖細(xì)胞的細(xì)胞核中首次證實(shí)了植物細(xì)胞中的PARP活性(Payne等人，1976；Willmitzer和Wagner,1982)。還從玉米幼苗中將該酶活性部分提純并發(fā)現(xiàn)與表觀分子量為113kDa的蛋白質(zhì)有關(guān)，這暗示植物PARP可能與來自動(dòng)物的該酶相似(Chen等人，1994；O’Farrell,1995)。
相應(yīng)于PARP蛋白質(zhì)的cDNA已從包括哺乳動(dòng)物、雞、非洲蟾蜍屬、昆蟲和Caenorhabditis elegans的幾個(gè)種中分離。Chen等人(1994)已報(bào)道了玉米細(xì)胞核中的PARP活性并且將該酶活性與玉米細(xì)胞核的提取液中存在約114kDa蛋白質(zhì)聯(lián)系起來。O’Farrel(1995)報(bào)道了在從玉米中分離的RNA上的RT-PCR-擴(kuò)增(使用基于最高保守序列的簡并引物)產(chǎn)生一300bp片段，在氨基酸水平上與人PARP蛋白質(zhì)顯示出有60％的相同性。Lepiniec等人(1995)已從編碼具有與脊椎動(dòng)物PARP的催化域高度相似的72kDa蛋白質(zhì)的擬南芥中分離并克隆了全長cDNA。該蛋白質(zhì)的N端域未顯示與來自脊椎動(dòng)物的PARP的相應(yīng)域相似的任意序列，但是由四個(gè)氨基酸鏈(命名為A1、A2、B和C)組成，顯示出與大量核內(nèi)蛋白和DNA結(jié)合蛋白的N-末端具有相似性。A1和A2的推斷的二級(jí)結(jié)構(gòu)為螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)。
該基因庫數(shù)據(jù)庫包括兩個(gè)來自玉米的cDNA序列，其翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列或者與傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)具有同源性(AJ22589)或者與擬南芥屬中所鑒定的非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)具有同源性(AJ222588)。
在真核細(xì)胞中PARP和聚-ADP核糖基化的功能不完全清楚。PARP涉及或據(jù)信直接或間接涉及大量細(xì)胞過程，如DNA修復(fù)、復(fù)制和重組、細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化或者在基因組整合中有義改變的信號(hào)途徑中。由于PARP活性可以大大降低細(xì)胞NAD+庫，因此這也暗示該酶可以在程序性細(xì)胞死亡中起至關(guān)重要的作用(Heller等人，1995；Zhang等，1994)。而且，已暗示導(dǎo)致NAD+水解或通過聚-ADP-核糖葡糖水解酶的聚-ADP-核糖的轉(zhuǎn)換產(chǎn)物的煙酰胺可以是真核細(xì)胞中的應(yīng)激響應(yīng)信號(hào)。
目前以植物PARP的生物功能獲得的信息來自涉及PARP抑制劑的實(shí)驗(yàn)，由于施加3-氨基苯甲酰胺(3ABA)后在煙草中同源染色體重組的速度增加(Puchta等人，1995)，這暗示PARP抑制劑在預(yù)防在DNA損傷位置同源重組上的體內(nèi)作用。而且，已顯示，使用PARP抑制劑如3ABA、煙酰胺和6(5H)-菲啶酮分化Zinnia或Helianthus tuberosum的細(xì)胞，可預(yù)防管狀分子發(fā)育(Hawkins和Phillips,1983；Phillips和Hawkins,1985；Shoji等人，1987；Sugiyama等人，1995)，它被認(rèn)為是程序性細(xì)胞死亡在植物中的例子。
PCT申請WO97/06267描述了PARP抑制劑在提高真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化(定性或定量)中的用途。
Lazebnik等人(1994)鑒定了具有與白介素1-β-轉(zhuǎn)化酶相似性能的蛋白酶能夠裂解PARP，它是動(dòng)物細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的早期事件。Kuepper等人(1990)和Molinette等人(1993)描述了46kDa人PARPDNA-結(jié)合域及其不同突變體形式在轉(zhuǎn)染CV-1猴細(xì)胞或人成纖維細(xì)胞中的過量生產(chǎn)，并且已證實(shí)殘留PARP活性的反式顯性抑制和這些細(xì)胞中堿基切除DNA修復(fù)的隨后抑制。
Ding等人(1992)和Smulson等人(1995)描述了通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的反義RNA表達(dá)排除PARP并觀察到延遲了DNA鏈斷裂連接和抑制了3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。
Menissier de Murcia等人(1997)和Wang等人(1995,1997)已產(chǎn)生在PARP基因中突變的轉(zhuǎn)基因“敲除”小鼠，這說明PARP不是必需蛋白質(zhì)。然而，PARP缺陷型小鼠的細(xì)胞對DNA損傷更敏感并在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的某些方面與正常動(dòng)物的細(xì)胞不同(Heller等人，1995)。
發(fā)明簡述和目的本發(fā)明提供了一種在真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡的方法，包括使用ZAP類的PARP基因的核苷酸序列和NAP類的PARP基因的核苷酸序列降低真核細(xì)胞中總PARP活性的功能水平，優(yōu)選降低內(nèi)源性PARP基因的表達(dá)，以降低內(nèi)源性PARP基因所編碼的蛋白質(zhì)的表觀活性或改變內(nèi)源性PARP基因的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的方法，包括將第一和第二PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)胝婧思?xì)胞，優(yōu)選植物細(xì)胞中，其中該第一PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)啟動(dòng)子，在真核細(xì)胞中可操作；DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，該分子或者可以降低ZAP類含Zn-指的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；或者可以被翻譯成肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)表達(dá)時(shí)該肽或蛋白質(zhì)降低ZAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；以及涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)；并且其中該第二PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DAN區(qū)啟動(dòng)子，在真核細(xì)胞中可操作；DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，該分子或者可以降低NAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；或者可以被翻譯成肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)表達(dá)時(shí)該肽或蛋白質(zhì)降低NAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；以及涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)；并且其中真核細(xì)胞中的總表觀PARP活性被大大降低，(優(yōu)選總表觀PARP活性比真核細(xì)胞中正常表觀PARP活性降低約75％到約90％，并且防止該真核細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡)或者幾乎完全(優(yōu)選總表觀PARP活性比真核細(xì)胞中正常表觀PARP活性降低約90％到約100％，并且該細(xì)胞經(jīng)程序性細(xì)胞死亡被殺死)。
優(yōu)選第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)或者第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)或者兩者都包括至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，這些核苷酸與ZAP或NAP類的內(nèi)源PARP基因的有義DNA鏈有75％的相同性，并且這些區(qū)域編碼能夠降低ZAP或NAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)的有義RNA分子。
在本發(fā)明提供的調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡的另一方法中，第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)或第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)或者二者都包括至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，這些核苷酸與ZAP或NAP類的內(nèi)源PARP基因的有義DNA鏈的互補(bǔ)鏈有75％的相同性，并且這些區(qū)域編碼能夠降低ZAP或NAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)的RNA分子。
在本發(fā)明提供的調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡的又一方法中，第一和/或第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼包括至少約100個(gè)核苷酸的有義核苷酸序列的RNA分子，這些核苷酸與ZAP或NAP類的內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA有75％的相同性，并且該RNA分子還包括至少約100個(gè)核苷酸的反義核苷酸序列，這些核苷酸與ZAP或NAP類的內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的互補(bǔ)體有75％的相同性，其中有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區(qū)，并且其中RNA分子能夠降低ZAP或NAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
在本發(fā)明提供的調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡的又一方法中，第一和/或第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼顯性陰性PARP突變體，該突變體能夠降低被ZAP或NAP類的內(nèi)源PARP基因編碼的PARP蛋白質(zhì)的表觀活性，該突變體優(yōu)選包括選自SEQ ID No 4氨基酸序列中氨基酸1-159或SEQ ID No 6氨基酸序列中氨基酸1-138的氨基酸序列或者包括選自SEQ ID No 2氨基酸序列中氨基酸1-370、SEQ ID No 11氨基酸序列中氨基酸1-98或氨基酸序列SEQ ID No 2中氨基酸1-88被SEQ ID No 11的氨基酸序列取代的該氨基酸序列中氨基酸1-370的氨基酸序列。
第一和第二嵌合PCD調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子或兩者，可以是組織特異性或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如啟動(dòng)子選自真菌響應(yīng)啟動(dòng)子、線蟲響應(yīng)啟動(dòng)子、花藥選擇性啟動(dòng)子、柱頭選擇性啟動(dòng)子、裂開區(qū)選擇性啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡的方法，包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)胨鲋参锛?xì)胞中，其中該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)植物表達(dá)的啟動(dòng)子，DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，該分子或者能夠降低內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；或者能夠被翻譯成肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)表達(dá)時(shí)該肽或蛋白質(zhì)降低植物細(xì)胞中的表觀PARP活性，以及涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)，其中植物細(xì)胞中的總表觀PARP活性比植物細(xì)胞中的正常表觀PARP活性降低約75％到約100％。
本發(fā)明的另一目的是提供一級(jí)和二級(jí)嵌合PCD調(diào)節(jié)基因以及真核細(xì)胞，特別是包括第一和第二嵌合PCD調(diào)節(jié)基因的植物細(xì)胞和非人真核有機(jī)體，特別是包括這些細(xì)胞的植物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡的方法，包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)胫参锛?xì)胞中，其中該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)植物表達(dá)的啟動(dòng)子，DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，該分子能夠降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；以及涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
本發(fā)明還涉及增加植物生長速度的方法，包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)胫参锛?xì)胞中，其中該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)植物表達(dá)的啟動(dòng)子，DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，該分子能夠降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；以及涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
本發(fā)明的又一目的是提供一種生產(chǎn)耐逆境的植物細(xì)胞的方法，包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)胫参锛?xì)胞中，其中該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)植物表達(dá)的啟動(dòng)子，DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，該RNA分子能夠降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；以及涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
本發(fā)明還涉及編碼具有PARP活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選ZAP類的PARP蛋白質(zhì)的核苷酸序列在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞或植物中編程性細(xì)胞死亡或生產(chǎn)耐逆境植物細(xì)胞或植物或增加植物細(xì)胞或植物的生長速度中的用途。
附圖簡述

圖1植物聚(ADP-核糖)聚合酶的推斷N-末端氨基酸序列。
(A)在Arabidopsis thaliana APP(A.th.APP；EMBL登記號(hào)Z48243；SEQ ID No 6)和玉米同源物NAP(Z.m.NAP；EMBL登記號(hào)AJ222588；SEQ IDNo 4)中發(fā)現(xiàn)的NAD+-結(jié)合域上游的序列對比。所顯示的該域分裂正如以前所提出的(Lepiniec等人，1995)。位于該B域的核定位信號(hào)(NLS)通過括號(hào)顯示。在雙子葉植物和單子葉植物之間B域的序列不是非常保守。C域在功能上可以與來自動(dòng)物的PARP的自動(dòng)修飾域相比。不完全重復(fù)的A1和A2也存在于玉米NAP中。為了說明重復(fù)序列中內(nèi)部不完全的兩重對稱性，在如下的序列中氨基酸殘基的性能被突出顯示補(bǔ)平環(huán)，親油殘基；開環(huán)，甘氨酸；(+)，正電荷殘基；(-)，負(fù)電荷殘基；波狀線，任意殘基。通過垂直箭頭指示對稱軸，并且箭頭線標(biāo)記具有氨基酸側(cè)鏈性能轉(zhuǎn)化重復(fù)性的區(qū)域。
(B)小鼠PARP和玉米ZAP的DNA-結(jié)合域和自動(dòng)催化域的序列對比。含Zn-指的玉米ZAP1和ZAP2(通過5’RACE PCR分析發(fā)現(xiàn)的部分cDNA)分別被指示為Z.m.ZAP(EMBL登記號(hào)AJ222589；SEQ ID No 2)和Z.m.ZAP(race)(SEQ ID No 11中氨基酸位置1-氨基酸位置98)，以及小鼠PARP,M.m.ADPRT(Swissprot登記號(hào)P11103)。該小鼠酶的Zn-指和一式兩份的NLS通過括號(hào)指示，通過星號(hào)顯示Caspase 3裂解位點(diǎn)，并且在下面玉米序列中通過粗體括號(hào)顯示ZAP蛋白質(zhì)中的推定NLS。將在所有序列中保守的氨基酸序列用方框表示；將具有相似物理-化學(xué)性能的氨基酸殘基用最上面的序列遮蔽作為參考。
圖2小鼠PARP和植物PARP蛋白質(zhì)的NAD+-結(jié)合域的對比?！癙ARP特征”的范圍如上面序列所示。名稱和序列對比如圖1。
圖3nap和zap基因的基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄大小的評(píng)價(jià)。
變種LG2080的(A)和(B)玉米基因組DNA，用所示限制性內(nèi)切核酸酶消化、通過瓊脂糖凝膠電泳分離、印跡、并與由nap和zap cDNA的5’域制備的放射性標(biāo)記的DNA探針雜交，它不編碼NAD+-結(jié)合域。用nap探針(A)獲得的雜交圖簡單且在玉米基因組中顯示單一nap基因。正如從雜交圖(B)中可以看到的，可以有至少兩個(gè)zap基因。為了檢測由zap和nap基因編碼的轉(zhuǎn)錄物的大小，在用乙二醛變性之后在瓊脂糖凝膠上分離約1μg從6天齡幼苗的根(路線1)和枝條(路線2)提取的聚(A)+RNA，印跡并用nap(C)和zap(D)32P-標(biāo)記的cDNA雜交。使用λDNA的33P5’末端標(biāo)記的BstEⅡ片段作為DNA和RNA凝膠印跡試驗(yàn)中的分子量標(biāo)記物；它們的位置以kb示于每個(gè)方格的左邊。
圖4在酵母中分析APP表達(dá)。
(A)在pV8SPA中的表達(dá)盒的示意圖。通過嵌合酵母啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)appcDNA的表達(dá)，該啟動(dòng)子由包括cyc1基因(CYC1)的啟動(dòng)區(qū)和gal10基因(GAL10)的上游激活啟動(dòng)區(qū)的最小TATA盒組成，后者通過半乳糖提供啟動(dòng)子激活。下游調(diào)節(jié)序列是由編碼磷酸甘油激酶(3PGK)編碼的基因獲得的(Kuge和Jones,1994)。app編碼區(qū)由假定域中的分區(qū)獲得，正如早期所提出的(Lepiniec等人，1995)；A1和A2相應(yīng)于不完全27-氨基酸重復(fù)，其中有一序列(B域)，富含正電荷氨基酸并類似于大量DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合域。該B域的氨基酸序列顯示如下圖并且以粗體畫出了可以起NLS功能的精氨酸和賴氨酸殘基的鏈?？梢云鸱g啟動(dòng)密碼子功能的甲硫氨酸殘基(M1、M72)如上圖所示。C域富含谷氨酸殘基，在其組成上，但不是在其序列上類似于，來自動(dòng)物的PARP自動(dòng)修飾域。
(B)DY(pYeDP1/8-2)和DY(pV8SPA)菌株的免疫印跡(Western印跡)和Northern印跡分析，分別如(載體)和(app)所示。菌株在補(bǔ)充有葡萄糖(GLU)、半乳糖(GAL)、半乳糖和3mM的3ABA(GAL+3ABA)、或半乳糖和5mM煙酰胺(GAL+NIC)的SDC培養(yǎng)基中生長。從相同培養(yǎng)物中提取所有RNA或所有蛋白質(zhì)。10個(gè)微生物的總蛋白質(zhì)通過電泳在10％SDS-PAGE上分離、電印跡、并用抗-APP抗血清探測。5個(gè)微生物的總RNA通過電泳在1.5％瓊脂糖凝膠上分離，印跡在尼龍膜上并與得自app cDNA的32p-標(biāo)記的DNA片段雜交。分子量標(biāo)記帶的位置以千對堿基(kb)和千道爾頓(kDa)計(jì)顯示在左邊。
圖5APP蛋白質(zhì)的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。
(A)總蛋白質(zhì)提取液是由在帶有2％半乳糖的SDC(載體GAL)上生長的DY(pYeDP1/8-2)以及在帶有2％葡萄糖的SDC(app GLU)、帶有2％半乳糖的SDC(app GAL)、或帶有2％半乳糖和3mM 3ABA的SDC(app GAL+3ABA)上生長的DY(pV8SPA)制備的。為了檢測在這些提取液中合成的聚(ADP-核糖)，在室溫下將樣品用32P-NAD+培養(yǎng)40分鐘。進(jìn)行兩個(gè)對照反應(yīng)將100ng經(jīng)過提純的人PARP或者僅在反應(yīng)緩沖劑(PARP)中培養(yǎng)(泳道5)，或者用由在葡萄糖上生長的DY(pYeDP1/8-2)培養(yǎng)物制備的蛋白質(zhì)提取液(載體GLU+PARP)培養(yǎng)(泳道6)。顯示在將該干凝膠曝光到X-Omat Kodak膠片上后獲得的放射自顯影照片。ORi相應(yīng)于測序凝膠的開始。
(B)通過來自DY(pV8SPA)的蛋白質(zhì)提取液中的DNA刺激聚(ADP-核糖)合成。以μml-1顯示加入到缺失酵母提取液的核酸中的超聲鮭精DNA的量。通過3ABA阻斷聚(ADP-核糖)的合成，在這些反應(yīng)每個(gè)以3mM的濃度加入3ABA(泳道5)。為了確保聚(ADP-核糖)的最大回收，在沉淀步驟中包括20μg糖原作為載體；然而，正如所看到的，這樣將導(dǎo)致大量夾帶未加入的標(biāo)記。
圖6圖示了包括本發(fā)明PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的T-DNA載體。P35S:CaMV35S啟動(dòng)子；L:cab22前導(dǎo)區(qū)；ZAP；ZAP類的PARP基因的編碼區(qū)；5’ZAP以逆取向的ZAP類的PARP基因的編碼區(qū)的N-端部分；3’35S:CaMV35S 3’末端轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和聚腺苷酸化信號(hào)；pACT2肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)區(qū)；pNOS；胭脂氨酸合成酶基因啟動(dòng)子；gat慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶；bar膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶；3’NOS胭脂氨酸合成酶基因的3’末端轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和聚腺苷酸化信號(hào)；APP:NAP類的PARP基因的編碼區(qū)；5’APP以逆取向的NAP類的PARP基因的編碼區(qū)的N端部分；LB左T-DNA邊界；RB右T-DNA邊界；pTA29花藥特異性啟動(dòng)子，pNTP303花粉特異性啟動(dòng)子。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳述為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“植物表達(dá)的啟動(dòng)子”意思是能夠在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。它包括植物源的任意啟動(dòng)子，但是也包括能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的非植物源的任意啟動(dòng)子，例如病毒或細(xì)菌源的某些啟動(dòng)子如CaMV35S或T-DNA基因啟動(dòng)子。
術(shù)語“基因的表達(dá)”是指在調(diào)節(jié)區(qū)特別是啟動(dòng)子的控制下DNA區(qū)轉(zhuǎn)錄成有生物活性的RNA(即或者能夠與另一核酸或蛋白質(zhì)相互作用，或者能夠翻譯成生物活性的多肽或蛋白質(zhì))的過程。據(jù)說當(dāng)該基因表達(dá)的最終產(chǎn)物為生物活性RNA如反義RNA或核酶時(shí)基因編碼RNA。據(jù)說當(dāng)該基因表達(dá)的最終產(chǎn)物為生物活性蛋白質(zhì)或多肽時(shí)基因編碼蛋白質(zhì)。
術(shù)語“基因”意思是包括在細(xì)胞中在適宜調(diào)節(jié)區(qū)如植物表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如mRNA)的DNA區(qū)(“轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)”)的任意DNA片段。因此一基因可以包括幾個(gè)可操縱地連接的DNA片段如啟動(dòng)子、5’前導(dǎo)區(qū)序列、編碼區(qū)和包括聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’區(qū)。內(nèi)源植物基因?yàn)樵谥参锓N中天然發(fā)現(xiàn)的基因。嵌合基因?yàn)樵谡Ｇ闆r下在植物種中不能發(fā)現(xiàn)的任意基因，或者啟動(dòng)子在自然狀態(tài)下與部分或全部轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)或者與至少一個(gè)該基因的其它調(diào)節(jié)區(qū)不相聯(lián)的任意基因。
本文所用的“包括”解釋成限定存在所述特征、整體、步驟或組分，但是不排除存在或添加一種或多種特征、整體、步驟或組分或其組合。因此，例如，包括核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)可以包括比實(shí)際所指的多的核苷酸或氨基酸，即包括在更大核酸或蛋白質(zhì)中。包括以功能或結(jié)構(gòu)定義的DNA區(qū)的嵌合基因可以包括其它DNA區(qū)等。
本發(fā)明一方面基于發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞，更具體地說是Zeamays細(xì)胞同時(shí)含有至少兩個(gè)功能性主PARP蛋白質(zhì)同種型(類)，它們在大小和氨基酸序列上都不同，還都能夠結(jié)合DNA，特別是具有單鏈裂口的DNA，并且都具有聚-ADP核糖基化活性。另一方面，本發(fā)明人已意識(shí)到，真核細(xì)胞，特別是植物中編程性細(xì)胞死亡可以通過改變PARP的表達(dá)水平或者通過遺傳改變編碼蛋白質(zhì)的活性來調(diào)節(jié)，并且特別是為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，兩個(gè)基因的表達(dá)都需要改變或者兩類蛋白質(zhì)之一在其活性上需要改變。
很顯然，現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)在于真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞包括兩個(gè)功能同種型的PARP蛋白質(zhì)，它們通過不同類基因編碼，在這些細(xì)胞中通過重組DNA法阻礙PARP活性的有效調(diào)節(jié)。這些方法和手段的不同實(shí)施方式通過本說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書來表示。
因此，本發(fā)明涉及通過改變PARP基因表達(dá)的水平，或者通過改變PARP蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的活性或表觀活性，調(diào)節(jié)，即提高或抑制真核細(xì)胞，優(yōu)選植物細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡。方便地，PARP基因表達(dá)的水平或PARP蛋白質(zhì)的活性通過加入改變PARP基因表達(dá)的PCD調(diào)節(jié)嵌合基因和/或通過加入改變PARP蛋白質(zhì)的表觀活性的PCD調(diào)節(jié)嵌合基因和/或通過改變內(nèi)源PARP編碼基因來遺傳控制。
本文所用的關(guān)于特定細(xì)胞的“提高的PCD”是指通過本發(fā)明方法刺激的這些細(xì)胞的死亡，由此當(dāng)與未通過本發(fā)明方法修飾的正常植物的相似細(xì)胞相比，在相似條件下該殺死細(xì)胞預(yù)定不經(jīng)歷PCD。
關(guān)于特定細(xì)胞的“抑制PCD”應(yīng)理解為在特定條件下正常(沒有通過本發(fā)明方法干預(yù))經(jīng)受編程性細(xì)胞死亡的大部分這些細(xì)胞或細(xì)胞族在這些條件下保持活的。
因此引入PCD調(diào)節(jié)嵌合基因或經(jīng)過修飾的內(nèi)源基因的表達(dá)將影響PARP蛋白質(zhì)的功能水平，并間接干擾編程性細(xì)胞死亡。PARP蛋白質(zhì)功能水平的適度降低導(dǎo)致抑制編程性細(xì)胞死亡，特別是預(yù)防編程性細(xì)胞死亡，同時(shí)PARP蛋白質(zhì)的功能水平嚴(yán)重降低將導(dǎo)致誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選為了抑制或預(yù)防真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡，將PARP蛋白質(zhì)和/或其活性或表觀活性的組合水平大大降低，但是避免以以下方式抑制DNA修復(fù)(通過PARP直接或間接支配)細(xì)胞中PARP蛋白質(zhì)的功能被抑制，細(xì)胞不能從DNA損傷恢復(fù)或者不能保持其基因組整合性。優(yōu)選地，在靶細(xì)胞中的PARP蛋白質(zhì)的水平和/或活性應(yīng)降低靶細(xì)胞中正常水平和/或活性的約75％，優(yōu)選約80％，特別是約90％，以便在該靶細(xì)胞中保留約25％，優(yōu)選約20％，特別是約10％的PARP的正常水平和/或活性。還應(yīng)考慮PARP蛋白質(zhì)的水平和/或活性降低不應(yīng)超過95％，優(yōu)選不超過該靶細(xì)胞中正?；钚院?或水平的90％。測定特定蛋白質(zhì)如PARP蛋白質(zhì)的含量的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說為公知，并包括，但不限于使用特定抗體(組織化學(xué))定量這些蛋白質(zhì)。在現(xiàn)有技術(shù)中還可以獲得定量PARP活性的方法，包括上述的TUNEL測定(體內(nèi))或Collinge和Althaus(1994)描述用于合成聚(ADP-核糖)的體外測定(參見實(shí)施例)。
還根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選為了觸發(fā)真核細(xì)胞特別是植物細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡，PARP蛋白質(zhì)和/或其活性或表觀活性的組合水平大大降低，優(yōu)選幾乎完全降低，以便DNA修復(fù)和基因組整合性的保持不再成為可能。優(yōu)選地，靶細(xì)胞中PARP蛋白質(zhì)的組合水平和/或活性應(yīng)降低該靶細(xì)胞中正常水平和/或活性的至少約90％，優(yōu)選約95％，更優(yōu)選約99％，特別是應(yīng)完全抑制PARP活性。特別優(yōu)選兩類PARP蛋白質(zhì)的功能水平分別降低至所述水平。
為了本發(fā)明目的，PARP蛋白質(zhì)被定義為具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選包括所謂“PARP特征”。該P(yáng)ARP特征為在PARP蛋白質(zhì)間高度保守的氨基酸序列，該氨基酸序列被de Murcia和Menussier deMurcia(1994)定義為從Mus musculus PARP蛋白質(zhì)的氨基酸第858位延伸至氨基酸第906位。該域相應(yīng)于Zea mays(ZAP1；SEQ ID No 2)的傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的第817-865位的氨基酸序列，或者相應(yīng)于Zea mays(ZAP1；SEQ ID No 11)的傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的第827-875位的氨基酸序列，或者相應(yīng)于玉米(SEQ ID No 4)的非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的第500-547位的氨基酸序列，或者相應(yīng)于Arabidopsis thaliana(SEQ ID No 6)的非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的第485-532位的氨基酸序列。該氨基酸序列在不同PARP蛋白質(zhì)之間高度保守(具有約90％-100％序列相同性)。在來自Mus musculus的PARP蛋白質(zhì)的第891位(相應(yīng)于SEQ ID No 2的第850位，SEQ ID No 11的第861位，SEQ ID No 4的第532位，SEQ ID No 6的第517位)的賴氨酸特別保守，它被認(rèn)為是涉及PARP蛋白質(zhì)的催化活性。特別是可以獲得Musmusculus的PARP蛋白質(zhì)的第865、866、893、898和899位或其它序列的相應(yīng)位置的氨基酸。PARP蛋白質(zhì)還可以包括N端DNA結(jié)合域和/或核定位信號(hào)(NLS)。
目前，已描述了兩類PARP蛋白質(zhì)。本文中定義的第一類包括含有Zn-指的所謂的典型PARP蛋白質(zhì)(ZAP)。這些蛋白質(zhì)大小范圍在113-120kDA，還通過位于蛋白質(zhì)N-端域中，特別是位于蛋白質(zhì)中前面約355至約375個(gè)氨基酸中存在至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)Zn-指域來鑒定。該Zn-指定義為具有能夠絡(luò)合Zn原子的序列CxxCxnHxxC(其中n可以為26-30)的肽序列。來自ZAP類的PARP蛋白質(zhì)的氨基酸序列的例子包括在登記號(hào)為P18493(Bos taurus)、P26466(Gallus gallus)、P35875(Drosophilamelanogaster)、P09874 (Homo sapiens)、P11103(Mus musculus)、Q08824(Oncorynchus masou)、P27008(Rattus norvegicus)、Q11208(Sarcophagaperegrina)、P31669(Xenopus laevis)的PIR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)的序列和目前鑒定的來自Zea mays的ZAP1和ZAP2的序列(SEQ ID No 2/SEQID No 11)。
相應(yīng)cDNA的核苷酸序列可以在登記號(hào)為D90073(Bos taurus)、X52690(Gallus gallus)、D13806(Drosophila melanogaster)、M32721(Homosapiens)、X14206(Mus musculus)、D13809(Oncorynchus masou)、X65496(Rattus norvegicus)、D16482(Sarcophaga peregrina)、D14667(Xenopuslaevis)的EMBL數(shù)據(jù)庫中以及SEQ ID No 1和10(玉米)中發(fā)現(xiàn)。
本文中定義的第二類包括所謂的非經(jīng)典PARP蛋白質(zhì)(NAP)。這些蛋白質(zhì)較小(72-73kDa)并且其它特征是在該蛋白質(zhì)的N-端缺少Zn-指結(jié)構(gòu)域，但存在包括具有與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)相似的氨基酸段的N-端結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，這類PARP蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)約30-32個(gè)氨基酸的氨基酸序列，該序列包括序列RG××××G×K×××××RL(以標(biāo)準(zhǔn)一字母碼代表氨基酸，由此×代表任意氨基酸；SEQ ID No 7)。甚至更優(yōu)選這些PARP蛋白質(zhì)包括至少1個(gè)約32個(gè)氨基酸的具有序列×L×V×××R××L××RGL×××GVK××LV×RL××AI(SEQ ID No 8)的氨基酸序列(所謂的A1結(jié)構(gòu)域)或者至少1個(gè)約32個(gè)氨基酸的具有序列GM×××EL×××A××RG××××G×KKD××RL××(SEQ ID No 9)(所謂A2結(jié)構(gòu)域)或者兩者。特別地，該A1和A2結(jié)構(gòu)域能夠形成螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)。這些PARP蛋白質(zhì)還可以包括堿性“B”結(jié)構(gòu)域(約35-約56個(gè)氨基酸的富含K/R的氨基酸序列，涉及將該蛋白質(zhì)導(dǎo)向該核仁)和/或一酸性“C”結(jié)構(gòu)域(約36個(gè)氨基酸的富含D/E的氨基酸序列)。來自該NAP類的蛋白質(zhì)序列的例子包括來自擬南芥的APP蛋白質(zhì)(可從登記號(hào)為Q11207的PIR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中得到；SEQ ID No 6)和來自玉米的NAP蛋白質(zhì)(SEQ ID No 4)。相應(yīng)cDNA的序列可在登記號(hào)為Z48243的EMBL數(shù)據(jù)庫(SEQ ID No 5)和SEQ ID No 3中發(fā)現(xiàn)。該第二類PARP蛋白質(zhì)為真正的功能性PARP蛋白質(zhì)，即能夠催化DNA依賴性聚(ADP-核糖)聚合，這已得到本發(fā)明人證實(shí)(參見實(shí)施例2)。
本發(fā)明人還證實(shí)了真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)編碼來自這兩類PARP蛋白質(zhì)的基因。
顯而易見，為了本發(fā)明目的，編碼來自所定義的這兩類的PARP蛋白質(zhì)的其它基因或cDNA，或其部分，可以將其從其它真核種或變體中分離，特別是從其它植物種或變體中分離。這些PARP基因或cDNA例如可以使用具有上述PARP基因或cDNA，或其部分，優(yōu)選被保守的部分如含有編碼如上所述PARP特征的核苷酸序列的基因片段的核苷酸序列的DNA片段作為探針通過Southern雜交(或者低嚴(yán)格或者高嚴(yán)格雜交，這依賴人們打算分離該P(yáng)ARP基因的種和探針最終所得自的種之間的關(guān)系)分離。相應(yīng)于來自植物基因編碼的PARP蛋白質(zhì)的PARP特征的核苷酸序列是來自SEQID No 1的核苷酸2558-2704的核苷酸序列或來自SEQ ID No 3的核苷酸1595-1747的核苷酸序列或來自SEQ ID No 5的核苷酸1575-1724的核苷酸序列。如果在這些類PARP基因之間進(jìn)行鑒定時(shí)，應(yīng)優(yōu)選使用對這類特異性的PARP基因部分，如在催化域之前的N-端域或其部分。
另外，編碼PARP蛋白質(zhì)或其部分的基因或cDNA，還可以使用適宜引物如具有相應(yīng)于SEQ ID No 13、SEQ ID No 14中所示序列的核苷酸序列的簡并引物或具有相應(yīng)于SEQ ID No 15-20中所示序列的核苷酸序列的引物通過PCR擴(kuò)增分離。但是，很顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)其它低聚核苷酸用于PCR，或者可以使用包括至少20個(gè)，優(yōu)選至少約30個(gè)，特別是至少約50個(gè)核苷酸序列的低聚核苷酸、任意PARP基因的保守核苷酸以通過PCR擴(kuò)增分離這些基因或其部分。
很顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合在部分片段和其核苷酸序列的基礎(chǔ)上分離基因或cDNA的這些技術(shù)或其它技術(shù)(包括例如RACE-PCR)，例如通過PCR擴(kuò)增獲得的，可以將其用于分離適宜用于本發(fā)明方法的PARP基因或其部分。
而且，編碼其中一些氨基酸已替換為其他化學(xué)上相似的氨基酸(所謂保守替換)的PARP蛋白質(zhì)的PARP基因或合成PARP基因(根據(jù)遺傳密碼的簡并性，編碼與天然PARP基因相似的蛋白質(zhì)但具有不同核苷酸序列)及其部分也適宜本發(fā)明方法。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，在真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞中的PCD通過適當(dāng)降低這些真核細(xì)胞中的PARP功能水平來抑制。
在本發(fā)明該第一個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方式中，在真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞中的PARP的功能水平通過在這些細(xì)胞中加入至少一個(gè)PCD調(diào)節(jié)嵌合基因來降低，該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因包括能夠引導(dǎo)在這些細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，優(yōu)選植物表達(dá)的啟動(dòng)子，和可操縱地連接到DNA區(qū)的功能性3’轉(zhuǎn)錄端和聚腺苷酸化區(qū)域，當(dāng)該DNA區(qū)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生能夠降低這兩類PARP基因編碼的內(nèi)源PARP活性的功能水平的生物活性RNA分子。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中，將至少2個(gè)這樣的PCD調(diào)節(jié)嵌合基因加入這些細(xì)胞中，由此通過第一PCD調(diào)節(jié)嵌合基因編碼的生物活性RNA降低該NAP類編碼的內(nèi)源PARP活性的功能水平，由此第二PCD調(diào)節(jié)嵌合基因編碼的生物活性RNA降低該ZAP類基因編碼的內(nèi)源PARP活性的功能水平，因此結(jié)合的PARP活性被適度降低。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因降低通過降低內(nèi)源PARP基因的表達(dá)水平的內(nèi)源PARP活性的功能水平。為此，該轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼降低編碼NAP和ZAP類PARP蛋白質(zhì)的mRNA的生物活性RNA，它可以通過翻譯獲得。這可以通過例如反義RNA、共抑制或核酶作用的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
本文中所用的“共抑制”是指RNA以序列特異性方式積聚的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄后抑制，使得同源內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的表達(dá)得到抑制。
通過引入包括可操縱地連接到DNA區(qū)的強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因，由此所得轉(zhuǎn)錄RNA為包括具有與編碼或轉(zhuǎn)錄DNA序列(有義)或待抑制其表達(dá)的PARP基因部分的互補(bǔ)鏈(反義)有至少75％，優(yōu)選至少80％，特別是至少85％，更特別至少90％，特別是至少95％序列相同性或與其相同的核苷酸序列的有義RNA或反義RNA。優(yōu)選該轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)不編碼功能蛋白質(zhì)。特別地，該轉(zhuǎn)錄區(qū)不編碼蛋白質(zhì)。而且，有義或反義區(qū)的核苷酸序列應(yīng)優(yōu)選為至少約100個(gè)核苷酸長，更優(yōu)選至少約250個(gè)核苷酸，特別是至少約500個(gè)核苷酸，但是可以延伸至待減少其表達(dá)的基因的編碼區(qū)的全長。
為了本發(fā)明目的，兩個(gè)相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的“序列相同性”，以百分比表示，是指具有相同殘基的兩個(gè)最佳對比序列的位置數(shù)除以比較位置數(shù)(×100)。缺口，即殘基在一個(gè)序列但不在另一個(gè)序列中的對比位置被認(rèn)為是具有不相同殘基的位置。使用20個(gè)核苷酸或氨基酸的窗口大小、字長2個(gè)氨基酸和缺口扣4分的Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann,1983)進(jìn)行兩個(gè)序列的對比。序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)輔助分析和解釋，包括如上所述的序列對比，可以使用商購軟件包如IntelligeneticsTMSuite程序(Intelligenetics Inc.,CA)方便地進(jìn)行。
顯而易見，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用一個(gè)或多個(gè)有義或反義PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)。當(dāng)使用一個(gè)有義或反義PCD調(diào)節(jié)嵌合基因時(shí)，該基因必須能夠同時(shí)降低這兩類PARP基因的表達(dá)。這例如可以通過以通過一有義或反義RNA調(diào)節(jié)兩類基因的表達(dá)的方式選擇該嵌合基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)實(shí)現(xiàn)，即通過選擇相應(yīng)于兩類PARP基因的最高同源性DNA區(qū)的靶子區(qū)并加入相應(yīng)于兩類靶子區(qū)的同義或反義轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)，保證如上所述用于有義和反義RNA的條件。或者，不同同義或反義RNA區(qū)，每個(gè)特異性地調(diào)節(jié)一類PARP基因的表達(dá)，可以將其合并到一個(gè)RNA分子中，通過一個(gè)PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼。顯而易見，可以加入對調(diào)節(jié)一類PARP基因的表達(dá)特異性的不同有義或反義RNA區(qū)作為單個(gè)PCD調(diào)節(jié)嵌合基因。
優(yōu)選的有義和反義編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)包括相應(yīng)于至少約100個(gè)選自PARP基因的N-端域的保守核苷酸的核苷酸序列(序列相同性約束如上所述)，優(yōu)選相應(yīng)于至少約100個(gè)選自SEQ ID No 1的核苷酸位置113-1189的保守核苷酸的序列，SEQ ID No 3的核苷酸位置107-583的序列、SEQ ID No 5的核苷酸位置131-542的序列或SEQ ID No 10的核苷酸位置81-1180的序列。但是，很顯然，可以使用含有相應(yīng)于PARP基因的N-端域的全序列，甚至相應(yīng)于PARP基因的全序列，特別是其蛋白質(zhì)編碼區(qū)的序列的有義或反義編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)。而且優(yōu)選含有相應(yīng)于至少約100個(gè)保守核苷酸的核苷酸序列(序列相同性約束如上所述)的有義和反義編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)，該保守核苷酸選自PARP基因的C-端催化域，優(yōu)選至少100個(gè)含有PARP特征編碼核苷酸序列的核苷酸的序列，特別是如上所述的PARP特征編碼核苷酸序列。而且，很顯然，可以使用含有相應(yīng)于PARP基因的C-端域的全序列的序列的有義或反義編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)。
在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因通過降低兩類內(nèi)源PARP的表觀活性水平降低內(nèi)源PARP活性的功能水平。為此，這些轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼生物活性RNA，它翻譯成抑制NAP或ZAP類PARP蛋白質(zhì)或兩者的蛋白質(zhì)或肽，如無活性抗體或顯性陰性PARP突變體。
“PARP蛋白質(zhì)的無活性抗體”為特異性地至少結(jié)合PARP蛋白質(zhì)的一些表位的抗體或其部分，例如覆蓋來自ZAP1的位置111-118的部分ZN指Ⅱ的肽或在ZAP2中的相應(yīng)肽，并且它抑制靶蛋白的活性。
本文中所用的“顯性陰性PARP突變體”是含有至少部分PARP蛋白質(zhì)(或其變體)的蛋白質(zhì)或肽，優(yōu)選與真核靶宿主細(xì)胞內(nèi)源的PARP蛋白質(zhì)，它沒有PARP活性，并且當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)對內(nèi)源PARP蛋白質(zhì)的活性具有抑制影響。優(yōu)選的顯性陰性PARP突變體為含有功能性DNA結(jié)合域(或其變體)或由其組成的蛋白質(zhì)，但沒有催化域(例如含有約355-約375個(gè)ZAP類的PARP氨基酸的N-端Zn-指，特別是含有SEQ ID No 2的氨基酸1-370的氨基酸序列的DNA結(jié)合蛋白域或含有SEQ ID No 11的氨基酸1-98的氨基酸序列的DNA結(jié)合蛋白域，或者含有SEQ ID No 2的氨基酸1-370的氨基酸序列的DNA結(jié)合蛋白域，其中氨基酸1-88的氨基酸序列被SEQ ID No 11的氨基酸1-98的氨基酸序列替換，或者例如含有約135-160個(gè)NAP類的PARP氨基酸的N-端DNA結(jié)合蛋白域，特別是含有SEQ ID No 4的氨基酸1-159的氨基酸序列的DNA結(jié)合蛋白域或含有SEQ ID No 6的氨基酸1-138的氨基酸序列的DNA結(jié)合蛋白域)或者沒有功能催化域(例如無活性PARP突變體，在所謂PARP特征方面突變，特別是在SEQ ID No 2的第850位置、SEQ ID No 4的第532位置、SEQ ID No 6的第517位置的保守賴氨酸突變)。優(yōu)選地，顯性陰性PARP突變體應(yīng)保留其DNA結(jié)合活性。顯性陰性PARP突變體可以被融合到載體蛋白質(zhì)如β-葡糖醛酸糖苷酶(SEQ ID No 12)上。
再者，可以使用編碼一種或多種顯性陰性PARP突變體的一種或多種PCD調(diào)節(jié)基因?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)。當(dāng)使用一個(gè)PCD調(diào)節(jié)嵌合基因時(shí)，該基因必需能夠同時(shí)降低兩類PARP基因的表達(dá)。
在本發(fā)明第一方面的另一實(shí)施方式中，真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞中PARP的功能水平通過調(diào)節(jié)這些細(xì)胞中內(nèi)源PARP基因的核苷酸序列來降低，這樣編碼突變體PARP蛋白質(zhì)保留約10％的活性。實(shí)現(xiàn)內(nèi)源PARP基因的這種調(diào)節(jié)的方法包括同源重組將該內(nèi)源PARP基因變成突變體PARP基因，例如通過US5527695中所述的方法。在一優(yōu)選實(shí)施方式中通過如WO96/22364或US5565350中所述加入嵌合DNA/RNA低聚核苷酸來實(shí)現(xiàn)該內(nèi)源PARP基因的核苷酸的這種位置介導(dǎo)調(diào)節(jié)。
對植物細(xì)胞來說，然而已發(fā)現(xiàn)加入一種PCD調(diào)節(jié)嵌合基因，優(yōu)選編碼在降低一類PARP基因，特別是ZAP類的PARP基因的表達(dá)起作用的生物活性RNA，根據(jù)本發(fā)明的第一方面可以足夠降低這些植物細(xì)胞中的總PARP活性，即抑制或預(yù)防這些植物細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡。
在本發(fā)明的該實(shí)施方式中，該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因優(yōu)選包括編碼生物活性RNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，該RNA包括至少一個(gè)RNA區(qū)，優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸長，根據(jù)本文提到的標(biāo)準(zhǔn)分類成用于內(nèi)源PARP基因之一的有義RNA，并且該有義RNA含有至少一個(gè)其它RNA區(qū)，優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸長，根據(jù)本文提到的標(biāo)準(zhǔn)分類成用于內(nèi)源PARP基因之一的反義RNA，由此該反義和有義RNA區(qū)能夠組成雙鏈區(qū)，優(yōu)選長度為至少約100個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，希望加入可以降低一類PARP蛋白質(zhì)，特別是本文所述的ZAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能性或表觀水平的一種PCD調(diào)節(jié)嵌合基因，同樣可以足夠降低植物細(xì)胞中的總PARP活性。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，包括至少一個(gè)PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的植物細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的降低或抑制可以導(dǎo)致對不利條件的提高的抗性，如用化學(xué)物質(zhì)處理的應(yīng)激抗性，低溫應(yīng)激抗性，病原體和瘟疫賦予的應(yīng)激抗性、抗旱性、高溫應(yīng)激抗性等。
在本發(fā)明的另一方面，真核細(xì)胞，優(yōu)選所選細(xì)胞，特別是所選植物細(xì)胞的程序性死亡通過PARP的功能水平的嚴(yán)重降低，優(yōu)選幾乎完全降低得到提高，這樣該DNA不再能修復(fù)并且該基因組完整性不再能保持。
在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方式中，通過將至少一個(gè)PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)胝婧思?xì)胞，特別是植物細(xì)胞中，這些細(xì)胞中PARP的功能水平嚴(yán)重降低，特別是幾乎完全被消除，該嵌合基因包括能夠介導(dǎo)在這些細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，優(yōu)選植物表達(dá)的啟動(dòng)子，和功能性3’轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化區(qū)，可操縱地連接到DAN區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生生物活性RNA分子，該RNA分子能降低被兩類PARP基因編碼的內(nèi)源PARP活性的功能水平。
在本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，將至少兩種這樣的PCD調(diào)節(jié)嵌合基因?qū)脒@些細(xì)胞中，由此由第一PCD調(diào)節(jié)嵌合基因編碼的生物活性RNA降低由NAP類的基因編碼的內(nèi)源PARP活性的功能水平，并且由此由第二PCD調(diào)節(jié)嵌合基因編碼的生物活性RNA降低由ZAP類的基因編碼的內(nèi)源PARP活性的功能水平，這樣組合PARP活性大大降低，特別是幾乎完全被消除。
正如本發(fā)明第一方面所提到的，PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼生物活性RNA，它能夠干擾內(nèi)源PARP基因的表達(dá)(例如通過反義作用、共抑制或核酶作用)或者該生物活性RNA還可以被翻譯成肽或蛋白質(zhì)，它能夠抑制NAP和ZAP類的PARP蛋白質(zhì)，如無活性抗體或顯性陰性PARP突變體。
在本發(fā)明第二方面的特別優(yōu)選實(shí)施方式中，PCD調(diào)節(jié)嵌合基因(PCD增強(qiáng)嵌合基因)的轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼生物活性RNA，該RNA含有至少一個(gè)RNA區(qū)(優(yōu)選至少約100個(gè)核苷酸長)，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)分類成用于至少一個(gè)內(nèi)源PARP基因的有義RNA和至少一個(gè)其它RNA區(qū)(優(yōu)選至少約100個(gè)核苷酸長)，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)分類成用于至少一個(gè)內(nèi)源PARP基因的反義RNA，由此反義和有義RNA區(qū)能夠組合成雙鏈RNA區(qū)(優(yōu)選以至少約100個(gè)核苷酸的距離)。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，兩個(gè)這樣的PCD調(diào)節(jié)基因，一個(gè)靶向降低NAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平，另一個(gè)靶向降低ZAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平，將其導(dǎo)入真核細(xì)胞或有機(jī)體，優(yōu)選植物細(xì)胞或植物中。
很顯然，可以不同組合使用本發(fā)明的嵌合PCD調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)的不同實(shí)施方式，從而達(dá)到本發(fā)明的目標(biāo)。例如，第一嵌合PCD調(diào)節(jié)基因可以設(shè)計(jì)成編碼降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)的有義RNA，同時(shí)該第二嵌合PCD調(diào)節(jié)基因可以設(shè)計(jì)成編碼降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)的顯性陰性PARP突變體。
PCD調(diào)節(jié)嵌合基因是否引入真核細(xì)胞中將最終導(dǎo)致這些細(xì)胞中組合PARP的功能水平適度降低還是嚴(yán)重降低，即PCD的抑制或PCD的增強(qiáng)將總是由這些PCD調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平來決定(或者以轉(zhuǎn)錄水平或者以組合轉(zhuǎn)錄/翻譯水平)。對PCD調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平有影響的主要因素為啟動(dòng)區(qū)的選擇，盡管其它因素(例如，但不限于，3’端的選擇、內(nèi)含子的存在、轉(zhuǎn)錄區(qū)的密碼子選擇、mRNA穩(wěn)定性、在翻譯開始位置周圍的共有序列、5’和3’未翻譯RNA區(qū)的選擇、PEST序列的存在、圍繞穩(wěn)定整合PCD調(diào)節(jié)基因的插入位置的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響、引入的PCD調(diào)節(jié)基因的拷貝數(shù)等)或其組合也對PCD調(diào)節(jié)基因的最終表達(dá)水平有影響。一般來說，可以假設(shè)組合PARP功能水平的適度降低可以通過含有相當(dāng)弱的啟動(dòng)子的PCD調(diào)節(jié)基因?qū)崿F(xiàn)，然而組合PARP的功能水平的嚴(yán)重降低可以通過含有相當(dāng)強(qiáng)的啟動(dòng)子的PCD調(diào)節(jié)基因?qū)崿F(xiàn)。但是，含有特異性啟動(dòng)子的PCD調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平和最終對PCD的影響可以隨其它影響因素的功能變化，如已敘及的。
為了本發(fā)明具體實(shí)施方式
的目的，該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因可以包括組成型啟動(dòng)子，或者在整個(gè)有機(jī)體，特別是整個(gè)植物中所有或主要細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子，如得自T-DNA基因的啟動(dòng)區(qū)，特別是農(nóng)桿菌屬Ti-或Ri-質(zhì)粒的冠癭氨基酸(例如，nos、ocs啟動(dòng)子)、或者病毒基因的啟動(dòng)區(qū)(例如CaMV35S啟動(dòng)子或其變體)。
還可以有利地隨意或相響環(huán)境提示控制PCD調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，例如通過包括可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，它可以通過例如(但不限于)使用化合物(如安全劑、除草劑、糖皮質(zhì)素)、光條件、暴露于無生命逆境(例如傷害、重金屬、極端溫度、鹽度或旱度)或有生命逆境(例如病原體或瘟疫感染，包括通過真菌、病毒、細(xì)菌、昆蟲、線蟲、菌質(zhì)和支原體類有機(jī)體等)的外界刺激激活。適宜本發(fā)明的植物表達(dá)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的例子有可線蟲誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(WO 93/19188,WO 96/28561)、在使用例如地塞米松的糖皮質(zhì)素之后誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、或在使用四環(huán)素之后呈現(xiàn)或激活的啟動(dòng)子(Gatz等人，1988；Weimann等人，1994)。
在本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方式，特別是本發(fā)明的第二方面(即提高的PCD)中，可以方便地或按需要限制程序性細(xì)胞死亡對有機(jī)體，特別是植物的特定細(xì)胞亞類的影響，因此該P(yáng)CD調(diào)節(jié)基因可以包括組織特異性或細(xì)胞類特異性啟動(dòng)子。選擇性地在特定組織或細(xì)胞類型中表達(dá)的適宜植物表達(dá)的啟動(dòng)子的例子在本領(lǐng)域?yàn)楣?但不限于)種子特異性啟動(dòng)子(例如WO89/03887)、器官-原基特異性啟動(dòng)子(An等人，1996)、莖特異性啟動(dòng)子(Keller等人，1988)、葉特異性啟動(dòng)子(Hudspeth等人，1989)、葉肉特異性啟動(dòng)子(例如光誘導(dǎo)的Rubisco啟動(dòng)子)、根特異性啟動(dòng)子(Keller等人，1989)、塊莖特異性啟動(dòng)子(Keil等人，1989)、血管組織特異性啟動(dòng)子(Peleman等人，1989)、分生組織特異性啟動(dòng)子(例如SHOOTMERISTEMLESS(STM)基因的啟動(dòng)子，Long等人，1996)、原基特異性啟動(dòng)子(例如Antirrhinum CycD3a基因的啟動(dòng)子，Doonan等人，1998)、花藥特異性啟動(dòng)子(WO 89/10396、WO9213956、WO9213957)、柱頭特異性啟動(dòng)子(WO 91/02068)、裂開區(qū)特異性啟動(dòng)子(WO 97/13865)、種子特異性啟動(dòng)子(WO 89/03887)等。
優(yōu)選本發(fā)明的嵌合PCD調(diào)節(jié)基因伴隨著標(biāo)記基因，優(yōu)選含有標(biāo)記DNA的嵌合標(biāo)記基因，該標(biāo)記DNA可操縱地連接在植物表達(dá)的啟動(dòng)子的5’端，優(yōu)選組成型啟動(dòng)子如CaMV 35S啟動(dòng)子，或者光誘導(dǎo)啟動(dòng)子如編碼Rubisco的小亞基的基因的啟動(dòng)子；以及可操縱地連接在適宜植物轉(zhuǎn)錄3’端形成和聚腺苷酸化信號(hào)的3’端。所需標(biāo)記DNA的選擇不是至關(guān)重要的，并且可以使用任意適宜的標(biāo)記DNA。例如，標(biāo)記DNA可以編碼賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞區(qū)別“顏色”的蛋白質(zhì)，如A1基因(Meyer等人，1987)或綠色熒光蛋白質(zhì)(Sheen等人，1995)，可以賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞除草劑抗性，例如，bar基因，編碼膦絲菌素抗性(EP 0242246)，或者可以賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞抗生素抗性，如aac(6’)基因，編碼慶大霉素抗性(WO94/01560)。
將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因引入真核細(xì)胞的方法，特別是轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中為公知，并且據(jù)信對本發(fā)明方法不重要。轉(zhuǎn)化獲得或者過渡型或者穩(wěn)定型轉(zhuǎn)化細(xì)胞(由此將該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因穩(wěn)定地插入該細(xì)胞的基因組，特別是該細(xì)胞的核基因組中)。
很顯然，本發(fā)明中所述改變真核細(xì)胞和有機(jī)體，特別是植物細(xì)胞和植物中編程性細(xì)胞死亡的方法和手段具有幾種重要的應(yīng)用可能性。通過本發(fā)明方法和手段的PCD的抑制，可以被用于減輕在轉(zhuǎn)化過程中施加給這些細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞的壓力并因此增加轉(zhuǎn)化效率，如WO97/06267中所述。PCD的抑制還可以被用于提高真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。使用本發(fā)明手段和方法的特別是細(xì)胞類型的PCD的觸發(fā)，可以被用于號(hào)召使用細(xì)胞毒素的方法。由于PCD為細(xì)胞死亡的“天然”途徑，因此本發(fā)明的PCD增強(qiáng)性嵌合基因的用途構(gòu)成對其它細(xì)胞毒素基因如RNAse或?qū)е录?xì)胞溶解的白喉毒素基因的用途的改進(jìn)。而且，PCD增強(qiáng)性基因在不同于定向細(xì)胞的細(xì)胞中的低水平表達(dá)，將導(dǎo)致PARP活性在這些細(xì)胞中適度降低而不是嚴(yán)重降低，因此實(shí)際上抑制了非靶細(xì)胞中的PCD。
對植物來說，PCD增強(qiáng)性嵌合基因的優(yōu)選應(yīng)用包括，但不限于1、產(chǎn)生防止真菌感染的植物，由此所述PCD增強(qiáng)性嵌合基因包括如WO 93/19188或WO 96/28561中所述的真菌響應(yīng)性啟動(dòng)子。
2、產(chǎn)生線蟲抗性植物，由此所述PCD增強(qiáng)性嵌合基因包括如WO92/21757中所述的線蟲誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。
3、產(chǎn)生雄性或雌性無子植物，由此所述PCD增強(qiáng)性嵌合基因包括花藥特異性啟動(dòng)子(如WO 89/10396、WO9213956、WO9213957中所述)或柱頭特異性啟動(dòng)子(如WO91/02068中公開的)。
4、產(chǎn)生種子掉果特征得到提高的植物，由此所述PCD增強(qiáng)性嵌合基因包括開裂區(qū)特異性啟動(dòng)子(如WO97/13865中公開的)。
出人意料地，已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明第一方面通過引入PCD調(diào)節(jié)嵌合基因，優(yōu)選調(diào)節(jié)ZAP類的PARP基因的表達(dá)的嵌合基因，特別是調(diào)節(jié)ZAP類的PARP基因的表達(dá)的嵌合基因，在該ZAP類中轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼同時(shí)含有如本文所述的有義和反義RNA的生物活性RNA，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物愈傷組織和植物呈現(xiàn)出提高的生長。
盡管不打算將本發(fā)明限制在具體操作模式中，但是據(jù)信該生長的改善是由于細(xì)胞數(shù)降低的結(jié)果，這些細(xì)胞可以通過增加信號(hào)抑制性細(xì)胞分裂的閾值經(jīng)受編程性細(xì)胞死亡，因此使植物更茂盛地生長。這些植物還具有較好的如本申請其它地方解釋的逆境抗性。
因此，在第三個(gè)方面，本發(fā)明還涉及提高含有至少一種根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的PCD調(diào)節(jié)嵌合基因，優(yōu)選調(diào)節(jié)ZAP類的PARP基因的表達(dá)的嵌合基因的植物細(xì)胞、植物組織和植物的生長，優(yōu)選營養(yǎng)生長的方法，在該ZAP類中轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼同時(shí)含有有義和反義RNA的生物活性RNA。
很顯然，盡管基本上可以將本發(fā)明用于所有植物種和變種中，但是本發(fā)明應(yīng)特別適宜于改變具有商業(yè)價(jià)值的植物中的程序性細(xì)胞死亡?？梢允褂帽景l(fā)明的特別優(yōu)選的植物為玉米、油籽性油菜、亞麻籽、小麥、草類、苜蓿、豆類、蕓苔植物、西紅柿、萵苣、棉花、水稻、大麥、馬鈴薯、煙草、甜菜、向日葵和觀賞植物如康乃馨、菊花、玫瑰、郁金香等。
可以將所得的轉(zhuǎn)化植物用于傳統(tǒng)育種計(jì)劃，以生產(chǎn)具有相同特征的更多轉(zhuǎn)化的植物或?qū)⒈景l(fā)明的嵌合細(xì)胞分裂控制基因引入相同或相關(guān)植物種的其它變種中。由該轉(zhuǎn)化植物獲得的種子含有作為穩(wěn)定的基因組插入片段的本發(fā)明的PCD調(diào)節(jié)基因。
以下非限制性實(shí)施例描述了嵌合細(xì)胞程序死亡控制基因的構(gòu)建和這些基因在調(diào)節(jié)真核細(xì)胞和有機(jī)體程序性細(xì)胞死亡中的用途。在這些實(shí)施例中除非另有說明，根據(jù)Sambrook等人(1989)在“分子克隆實(shí)驗(yàn)手則”第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，NY以及Ausubel等人(1994)的“分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，現(xiàn)代方法”美國的第1卷和第2卷中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行所有重組DNA技術(shù)。植物分子研究的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述在英國BIOS科學(xué)出版有限公司和英國Blackwell科學(xué)出版社共同出版的R.D.D.Croy的“Plant Molecular Biology Labfax”(1993)中。
整個(gè)說明和實(shí)施例，參考了以下序列SEQ ID No 1玉米的ZAP基因的DNA序列(zap 1)SEQ ID No 2玉米的ZAP蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列(ZAP 1)SEQ ID No 3玉米的NAP基因的DNA序列(nap)SEQ ID No 4玉米的NAP蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列(NAP)SEQ ID No 5擬南芥的NAP基因的DNA序列(app)SEQ ID No 6擬南芥的NAP蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列(APP)SEQ ID No 7非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的A結(jié)構(gòu)域的共有序列SEQ ID No 8非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的A1結(jié)構(gòu)域的共有序列SEQ ID No 9非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的A2結(jié)構(gòu)域的共有序列SEQ ID No 10玉米的第二ZAP基因的DNA序列(Zap 2)SEQ ID No 11玉米的ZAP蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列(ZAP 2)SEQ ID No 12在APP的DNA結(jié)合域和GUS蛋白質(zhì)之間的融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列SEQ ID No 13簡并的PCR引物SEQ ID No 14簡并的PCR引物SEQ ID No 15PCR引物SEQ ID No 16PCR引物SEQ ID No 17PCR引物SEQ ID No 18PCR引物SEQ ID No 19PCR引物SEQ ID No 20PCR引物SEQ ID No 21app啟動(dòng)子-gus翻譯融合序列表自由內(nèi)容在本申請的序列表部分中使用以下自由內(nèi)容<223>人工序列的描述非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的A域<223>人工序列的描述非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的A1域<223>人工序列的描述非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)的A2域<223>人工序列的描述在APP N-端域和GUS蛋白質(zhì)之間的融合蛋白質(zhì)<223>人工序列的描述簡并PCR引物<223>人工序列的描述用作PCR引物的寡聚核苷酸<223>人工序列的描述APP啟動(dòng)子與β-葡萄糖醛酸酶基因的融合<223>翻譯起始密碼子實(shí)施例實(shí)驗(yàn)步驟酵母和細(xì)菌菌株使用啤酒糖酵母菌株DY(MATa his3 can1-10 ade2 leu2 trp1 ura3::(3×SV40 AP1-lacZ)(Kuge和Jones,1994)表達(dá)APP蛋白質(zhì)。根據(jù)Dohmen等人(1991)進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。菌株在基礎(chǔ)SDC培養(yǎng)基(0.67％酵母氮堿、0.37％酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、50mg/l的腺嘌呤和40mg/l的色氨酸)上生長。為了誘導(dǎo)APP表達(dá)，在SDC中的葡萄糖用2％半乳糖替換。
將大腸桿菌菌株XL-1(Stratagene,La Jolla,CA)用于質(zhì)粒操作和文庫篩選，它是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Ausubel等人，1987；Sambrook等人，1989)進(jìn)行的。將大腸桿菌BL21(Studier和Moffat,1986)用于APP蛋白質(zhì)表達(dá)并將根癌土壤桿菌C58C1RifR(pGV2260)(Deblaere等人，1985)用于植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
聚(ADP-核糖)聚合酶活性測定在如下制備的酵母菌株的總蛋白質(zhì)提取液中測定APP的酶活性。在30℃下在150rpm的轉(zhuǎn)動(dòng)搖床上將DY(pV8SPA)或DY(pYeDP1/8-2)在50ml的SDC培養(yǎng)基中生長過夜。通過在1000×g下離心收獲酵母細(xì)胞，用150ml的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH6.5)沖洗3次，并再懸浮于5ml山梨醇緩沖液(1.2M山梨醇、0.12M K2HPO4,0.033M檸檬酸，pH5.9)中。將溶細(xì)胞酶(Boehringer,Mannheim，德國)添加到細(xì)胞懸浮液中至最終濃度為30Uml-1，并將細(xì)胞在30℃下培養(yǎng)1小時(shí)。然后將酵母原生質(zhì)球用山梨醇緩沖液沖洗3次，并再懸浮于2ml的冰冷溶胞緩沖液(100mM Tris-HCl,pH7.5,400mM NaCl,1mM EDTA,10％甘油，1mM DTT)中。超聲處理之后，在4℃下將該溶胞產(chǎn)物在20000×g下離心20分鐘，上清液在用反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl,pH8.0,10mM MgCl2,1mM DTT)平衡的Econo-PackTM10DG柱(Bio-Rad,Richmond,CA)上脫鹽。為了減少蛋白質(zhì)的蛋白水解降解，用蛋白酶抑制劑混合物(Boehringer)以每50ml一片補(bǔ)充該溶胞和反應(yīng)緩沖液。通過加入NaCl和硫酸魚精蛋白至最終濃度分別為600mM和10mg ml-1將核酸從該總提取液中除去。在室溫下培養(yǎng)10分鐘之后，通過在4℃、20000×g下離心15分鐘除去沉淀物。在Econo-PackTM10DG柱上通過凝膠過濾將上清液的緩沖液交換為反應(yīng)緩沖液。
合成聚(ADP-核糖)的測定是由Collinge和Althaus(1994)改良而來的。將約500μg總酵母蛋白質(zhì)在補(bǔ)充有30μCi的32P-NAD+(500 Ci mmol-1)、至60μm最終濃度的未標(biāo)記的NAD+和10μg ml-1超聲處理的鮭精DNA的反應(yīng)緩沖液中培養(yǎng)。在室溫下培養(yǎng)40分鐘之后，加入500μl的終止緩沖液(200mM Tris-HCl,pH7.6,0.1M NaCl,5mM EDTA,1％Na+-N-月桂酰-肌氨酸和20μg ml-1蛋白酶K)，在37℃下將反應(yīng)物培養(yǎng)過夜。酚和酚/氯仿提取之后，將聚合物用2.5體積帶有0.1M NaAc(pH5.2)的乙醇沉淀。用70％乙醇沖洗該顆粒，干燥并溶于70％甲酰胺、10mM EDTA、0.01％溴酚藍(lán)和0.01％二甲苯腈藍(lán)中。樣品在80℃下加熱10分鐘，然后上樣到12％聚丙稀酰胺/6M脲的測序凝膠上。將凝膠在3MM紙(Whatman International,Maidstone,UK)上干燥，將其或者曝光在柯達(dá)X-Omat X射線膠片(EastmanKodak,Richmond,NY)上或者使用一PhosphorlmagerTM445SI(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)掃描。
免疫學(xué)技術(shù)在用1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)500ml的大腸桿菌BL21(pETΔNdeSPA)的培養(yǎng)液之后，編碼從氨基酸Met310到His637的APP多肽的截短的app cDNA表達(dá)為在N端上有6個(gè)組氨酸殘基的翻譯融合物。在變性條件(在有6M鹽酸胍的情況下)下在Ni-NTA-瓊脂糖柱上根據(jù)廠家方案(Qiagen,Chatsworth,CA)通過親和色譜將該APP多肽提純至將近同質(zhì)。用PBS透析之后，按照標(biāo)準(zhǔn)免疫方案(Harlow和Lane,1988)使用可溶性和不溶性APP多肽混合物免疫兩只新西蘭白兔。為了Western印跡分析，通過變性SDS-PAGE(Sambrook等人，1989；Harlow和Lane,1988)溶解蛋白質(zhì)，并使用Semi-Dry BlotterⅡ(Kem-En-Tec,Copenhagen,Denmark)將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Hybond-C；Amersham)上。
如所述(Harlow和Lane,1988)進(jìn)行酵母細(xì)胞內(nèi)的原位抗原定位。為了在酵母原生質(zhì)球中定位該APP蛋白質(zhì)，在Tris緩沖鹽水-BSA緩沖液中以1∶3000-1∶5000稀釋抗-APP血清。將特異性地識(shí)別聚(ADP-核糖)聚合物(Ikajima等人，1990)的10H單克隆抗體以1∶100稀釋度用于PBS緩沖液中。用1∶200稀釋度的與熒光素異硫氰酸鹽偶聯(lián)的羊抗-小鼠IgGF(ab’)2(Sigma)檢測該小鼠抗體。用1∶200的稀釋度的CY-3共軛的羊抗-兔IgG羊F(ab’)2片斷(Sigma)檢測兔IgG。為了觀察DNA，將載玻片在有10μg ml-1的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma)的PBS中培養(yǎng)1分鐘。在一Axioskop落射熒光顯微鏡(Zeiss,Jena,Germany)上進(jìn)行熒光成像。為了觀察FITC和CY-3熒光染料，分別使用23和15濾光片。細(xì)胞用富士彩色-100優(yōu)質(zhì)正膠片照相。
植物材料和組織化學(xué)分析按照將葉片與根癌土壤桿菌C58C1RifR(pGCNSPAGUS)共同培養(yǎng)(DeBlock等人，1987)的方法將煙草(Nicotiana tabacum)SR1(Maliga等人，1975)用于產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。用在35S CaMV的控制下的真正GUS轉(zhuǎn)化的煙草SR1株系用作對照。按照原位滲濾方法將擬南芥生態(tài)型Columbia用于app-啟動(dòng)子-GUS融合體的轉(zhuǎn)化。
為了進(jìn)行GUS活性的原位組織化學(xué)染色，在30分鐘內(nèi)將植物樣品固定在冰冷的90％丙酮中，用0.1M K2HPO4(pH7.8)沖洗，然后在染色緩沖液(0.1M K2HPO4,pH7.8,2mM X-Gluc,20mM Fe3+-EDTA)中在37℃下培養(yǎng)。將染色過的植物組織貯藏在4℃下70％的乙醇中。必要時(shí)，因酚氧化的組織變暗可以通過用乳酸酚(Beeckman和Engler,1994)的培養(yǎng)降低。在Jenalumar光學(xué)顯微鏡(Zeiss)下檢測該GUS染色。植物組織用富士彩色-100優(yōu)質(zhì)正膠片照相。
其它方法根據(jù)USB生物化學(xué)提供的方案(Cleveland,OH)進(jìn)行的DNA測序常規(guī)地驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建步驟。由準(zhǔn)備引物DNA標(biāo)記盒(Amersham)合成用于核酸雜交的32P-標(biāo)記的DNA探針。為了DNA和RNA雜交實(shí)驗(yàn)，使用Church和Gilbert的緩沖系統(tǒng)(1984)(0.25M磷酸鈉，pH7.2,7％SDS,1％BSA,1mMEDTA)。為了Western印跡分析，基本上如用于植物組織所述的(Hurkman和Tanaka,1986)用酚提取酵母總蛋白。為了Northern印跡分析，如所述(Ausubel等人，1987)用熱酚提取總酵母RNA。在用乙二醛變性之后，將RNA溶于1.5％瓊脂糖凝膠上(Sambrook等人，1989)。使用Hybond-N尼龍濾膜(Amersham)用于核酸印跡。
實(shí)施例1編碼玉米PARP同源物的基因的分離為了分離編碼PARP同源物的玉米cDNA，進(jìn)行兩個(gè)試驗(yàn)。首先，在低度嚴(yán)格DNA-DNA雜交條件下使用由擬南芥屬app cDNA制備的DNA探針篩選玉米cDNA文庫。其次，使用作為模板的第一鏈cDNA和根據(jù)“PARP特征”的序列-所有已知PARP蛋白質(zhì)中最保守的氨基酸序列設(shè)計(jì)的兩個(gè)簡并引物，進(jìn)行部分玉米PARP的PCR擴(kuò)增。
來自近交系B734的玉米(Zea mays L.)葉的λZAP(Stratagene)cDNA文庫。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟(Sambrook等人，1989)篩選噬菌斑(500000)。在用擬南芥屬app探針篩選之后，提純一個(gè)1.4kbp的非全長cDNA。在原始cDNA文庫用該app探針篩選以及接著cDNA末端的5’快速擴(kuò)增(RACE)PCR分析之后，鑒定該nap基因-該擬南芥屬app的玉米同源物。對5’RACE PCR來說，用Marathon試劑盒(Clontech,Palo Alto,CA)和0.5μg從1周齡玉米幼苗的內(nèi)鞘、外鞘和葉分離的玉米聚(A)+RNA制備該模板。用于PCR擴(kuò)增的該基因特異性嵌套引物為nap引物的5’-GGGACCATGTAGTTTATCTTGACCT-3’(SEQ ID No 15)和5’-GACCTCGTACCCCAACTCTTCCCCAT-3’(SET ID No 16。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)亞克隆和測序。用允許重組2295-bp-長nap cDNA序列(SEQ ID No 3)的nap特異性引物擴(kuò)增一800bp的片段。
該NAP蛋白質(zhì)為653個(gè)氨基酸長(分子量約73kDa；SEQ ID No 4)并與該APP高度相似(61％序列相同性和69％相似性)。最重要的是，NAP具有N-末端與APP一致的結(jié)構(gòu)(圖1A)，這暗示在植物中在APP類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)上相當(dāng)嚴(yán)格的選擇壓力。該nap基因在玉米基因組中是唯一的(圖2A)并編碼2.4kb的轉(zhuǎn)錄物(圖2C)。
使用以“PARP特征”的非常高度保守的區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)的簡并引物和來自玉米的第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增一310bp片段。對用具有Y=C/T、R=A/G、N=A/G/C/T的簡并引物5’-CCGAATTCGGNTAYATGTTYGGNAA-3’(SEQ ID No 13)和5’-CCGAATTCACNATRTAYTCRTTRTA-3’(SEQ ID No 14)的該P(yáng)CR來說，使用第一鏈cDNA作為模板并使用5μg來自玉米嫩葉的聚(A)+RNA和MuMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成。用在100μl體積中的Taq DNA聚合酶使用以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增在95℃下1分鐘，在45℃下2分鐘，在72℃下3分鐘，接著在95℃下1分鐘、45℃下2分鐘、72℃下3分鐘循環(huán)38次，最后在72℃下培養(yǎng)10分鐘。
該310bp片段的序列顯示出在相同區(qū)域內(nèi)與人PARP的55％的序列相同性和64％的序列相似性，但是，無論如何，與nap cDNAD的序列有差異。在用通過PCR用簡并引物獲得的310-bp片段篩選之后鑒定了三個(gè)zapcDNA。這三個(gè)提純的cDNA都得自相同轉(zhuǎn)錄物，這是因?yàn)樗鼈兙哂邢嗤?’非編碼區(qū)；將最長克隆(#9)在兩條鏈(SEQ ID No 1)上測序。該cDNA編碼689個(gè)氨基酸的PARP同源多肽(SEQ ID No 2；分子量-109kDa)，將其命名為ZAP1(圖1B)。由于ZAP1的第一Zn-指具有序列CKSCxxxHASV(不含第三個(gè)半胱氨酸殘基)，因此它可能為非功能性。
如上所述使用以下zap特異性引物5’-AAGTCGACGCGGCCGCCACACCTAGTGCCAGGTCAG-3’(SEQ ID No 17)和5’-ATCTCAATTGTACATTTCTCAGGA-3’(SEQ ID No 18)進(jìn)行來自玉米品系LG2080(由近交系B734制備該篩選cDNA文庫)的zap轉(zhuǎn)錄物的5’RACE PCR分析。在用zap-特異性引物的PCR之后獲得450-bp PCR產(chǎn)物。由于在其5’端的長度略有差異，因此將用zap-特異性引物產(chǎn)生的8個(gè)獨(dú)立的5’RACEPCR片段測序。在來自LG2080玉米植物的所有轉(zhuǎn)錄物中，在編碼區(qū)中存在其它序列的插入片段，它使該ZAP蛋白質(zhì)增長11個(gè)氨基酸(980個(gè)氨基酸，分子量約110.4kDa)。該ZAP2的Zn-指Ⅰ為標(biāo)準(zhǔn)且可讀為CKSCxxxHARC(圖1B；SEQ ID No 11)。該序列差異可能是由于或者玉米變種之間的差異、兩個(gè)同源基因的表達(dá)、或者可變剪接。事實(shí)上，玉米可能具有至少兩個(gè)zap基因(圖2B)，它編碼3.4-3.5kb的轉(zhuǎn)錄物(圖2D)。用該zap cDNA制備的探針的該DNA凝膠印跡試驗(yàn)顯示了同源基因存在于擬南芥屬中。
結(jié)構(gòu)性ZAP與來自動(dòng)物的PARP非常相似。它具有由兩個(gè)Zn-指組成的良好保守的DNA結(jié)合域(與小鼠PARP的DNA結(jié)合域具有36％的相同性和45％的相似性)。甚至通過僅比較這些Zn-指的序列--在小鼠酶(44％相同性和54％相似性)中的Ala1-Phe162，或者來自核定位信號(hào)(NLS)的亞結(jié)構(gòu)域下游-在小鼠PARP(40％相同性和50％相似性)中的Leu237-Ser360，顯示出較高的同源性。鑒于在ZAP中不能鑒定哺乳動(dòng)物PARP的二分核定位信號(hào)特征，因此該序列KRKK配備一分NLS(圖1B)。該推定自動(dòng)修飾域比小鼠PARP中的保守性差且在ZAP中短。在ZAP、NAP、APP和小鼠PARP之間催化域的同源性編輯顯示在圖2中。應(yīng)說明的是，與APP和NAP中的(分別為40％和42％序列相同性)相比，ZAP的NAP+-結(jié)合域與哺乳動(dòng)物酶(48％相同性)更相似，然而APP和NAP在其催化域中為68％相同和76％相似。
實(shí)施例2證實(shí)非傳統(tǒng)PARP蛋白質(zhì)具有DNA-依賴性聚(ADP-核糖)聚合酶活性APP為DNA-依賴性聚(ADP-核糖)聚合酶進(jìn)行APP蛋白質(zhì)(在酵母中表達(dá)的)的更詳細(xì)研究，以了解來自該NAP類的PARP樣蛋白質(zhì)的活性。選擇酵母作為用于擬南芥屬APP蛋白質(zhì)的表達(dá)和酶分析的有機(jī)體有許多原因。作為真核細(xì)胞啤酒酵母更適宜來自其它真核有機(jī)體的天然蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且不同于大多數(shù)其它真核細(xì)胞，因此它不具有內(nèi)源PARP活性(Lindahl等人，1995)。
在半乳糖誘導(dǎo)的酵母啟動(dòng)子的控制下按以下方式將全長app cDNA導(dǎo)入pYeDP1/8-2中。該全長app cDNA從pC3(Lepiniec等人，1995)作為Xhol-EcoRⅠ片段切除。將末端用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填充，并將該片段亞克隆到酵母表達(dá)載體pYeDP1/8-2的Smal位置(Cullin和Pompon,1988)。將所得表達(dá)載體pV8SPA(圖4A)轉(zhuǎn)化進(jìn)啤酒酵母菌株DY。
為了在大腸桿菌中的APP表達(dá)，用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)使用引物5’-AGGATCCCATGGCGAACAAGCTCAAAGTGAC-3’(SEQ ID No 19)和5’-AGGATCCTTAGTGCTTGTAGTTGAAT-3’(SEQ ID No 20)將該app cDNA的全編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以BamHl片段亞克隆進(jìn)pET19b(Novagene,Madison,WI)，獲得pETSPA。在大腸桿菌BL21中由pETSPA的全長APP的表達(dá)非常差。為了獲得更好的表達(dá)，用Ncol和Ndel或用Smal將pETSPA消化，末端通過DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填充，然后將這些質(zhì)粒自連接。所得質(zhì)粒pETΔNdeSPA和pETΔSmaSPA中僅pETΔNdeSPA在大腸桿菌BL21中滿意地表達(dá)了截短的APP多肽(Met310-His637)。
通過Northern和Western印跡分析評(píng)價(jià)該APP在酵母中的表達(dá)。(圖4)由于當(dāng)細(xì)胞在葡萄糖上生長和在含半乳糖的培養(yǎng)基上去抑制時(shí)pV8SPA中的啟動(dòng)子無活性，因此希望該表達(dá)緊密地受該碳源調(diào)節(jié)。然而，RNA的Northern印跡分析和與含空白載體的對照DY菌株比較的蛋白質(zhì)在DY(pV8SPA)中的免疫印跡分析顯示出，甚至當(dāng)在含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)app mRNA和APP蛋白質(zhì)在酵母中表達(dá)(圖4B，泳道2)。在含葡萄糖的培養(yǎng)基上觀察到的表達(dá)特異性在于app mRNA和APP蛋白質(zhì)比在用半乳糖誘導(dǎo)后檢測到的(在圖4B中的對比泳道2和4)短。盡管這些細(xì)胞也表達(dá)截短的mRNA和蛋白質(zhì)，但是在含半乳糖的培養(yǎng)基上僅檢測到分子量較高的APP多肽(顯然是全長蛋白質(zhì))。這種發(fā)現(xiàn)的最可靠的解釋是當(dāng)該DY(pV8SPA)菌株在葡萄糖上生長時(shí)，存在來自表達(dá)盒的滲漏表達(dá)，這是由于在半乳糖誘導(dǎo)之后觀察到從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)200-300bp下游開始轉(zhuǎn)錄。該較短mRNA可能不編碼APP的第一個(gè)甲硫氨酸(Met1)，因此在Met72開始翻譯。這應(yīng)解釋來自在葡萄糖或半乳糖上生長的菌株的APP多肽的分子量中所觀察的約5kDa差異(計(jì)算差為7.5kDa)。通過在有PARP抑制劑如3ABA和煙酰胺的情況下生長菌株，排除了分子量中的差異通過聚(ADP-核糖)化可能對自修飾有利的可能性(圖4B，將泳道6和8與泳道4相比)。
為了檢測聚(ADP-核糖)的合成，從在不同條件下生長并在有放射活性標(biāo)記的NAD+下培養(yǎng)的酵母菌株中提取總蛋白質(zhì)。為了防止APP在體內(nèi)合成聚(ADP-核糖)和可能的自動(dòng)修飾，菌株也在有3ABA、PARP的可逆抑制劑的情況下生長，然后在脫鹽過程中將它們從蛋白質(zhì)提取液中除去。圖5顯示了聚(ADP-核糖)是通過在半乳糖上生長的DY(pV8SPA)的蛋白質(zhì)提取物合成的(圖5A，泳道1和2)，但不通過含空白載體的菌株合成(圖5A，泳道4)。還可以看出，擬南芥屬APP能夠合成長度高達(dá)40個(gè)殘基的聚合物(圖5A，泳道1)，大多數(shù)放射活性以10-15-聚物加入。該觀察與其它專家(Chen等人，1994)所檢測的聚合物大小一致。當(dāng)該酵母菌株與3ABA一起生長時(shí)加入聚合物的放射活性比沒有3ABA的多(圖5A，泳道1與泳道2相比)；原因可能是或者從抑制培養(yǎng)物提取的該APP的自動(dòng)修飾少(據(jù)信自動(dòng)修飾抑制PARP的活性)，或者標(biāo)記的NAD+被來自用于現(xiàn)存聚合物的延伸的未抑制培養(yǎng)物的酶所使用，導(dǎo)致整體特異性活性降低。在相同反應(yīng)條件下或者僅在反應(yīng)緩沖液中或者在有來自DY(pYeDP1/8-2)的酵母總蛋白質(zhì)提取物的情況下通過人PARP合成的聚(ADP-核糖)(圖5A，分別為泳道5和6)顯示出鏈更長，可能高達(dá)400-聚體(de Murcia和Menissierde Murcia,1994)。
通過帶缺口的DNA刺激酶活性為來自動(dòng)物的PARP的公知性能(Alvarez-Gonzalez和Althaus,1989)。因此我們試驗(yàn)是否APP蛋白質(zhì)的活性為DNA依賴性。在除去酵母核酸(DNA、RNA)和半乳糖生長的DY(pV8SPA)蛋白質(zhì)提取物中一些堿性蛋白質(zhì)之后，在遞增濃度的超聲鮭精DNA下分析聚(ADP-核糖)的合成。從圖5B中可以看出，存在于32P-NAD+的反應(yīng)和加入中的DNA量之間有直接相關(guān)性。磷圖像掃描說明，加入含40μg ml-1DNA的反應(yīng)混合物中的聚(ADP-核糖)的放射活性比具有2μgml-1DNA的多約6倍(圖5B，分別為泳道4和2)。在反應(yīng)混合物中聚合物的合成對3ABA過敏(圖5B，泳道5)。
APP為核內(nèi)蛋白在動(dòng)物細(xì)胞中PARP活性位于細(xì)胞核內(nèi)(Schreiber等人，1992)。如果細(xì)胞核的話，APP的胞內(nèi)定位可以提供重要的其它指示APP為真實(shí)植物PARP。為此，使用抗-APP抗血清分析該APP多肽在酵母細(xì)胞中的定位。在半乳糖上生長的酵母中合成的APP多肽發(fā)現(xiàn)主要在該核心中。存在于PARP抑制劑的培養(yǎng)基中對該定位沒有影響。
此外，我們試驗(yàn)了APP在酵母細(xì)胞中的活性是否一致，而人PARP的已有報(bào)道(Collinge和Althaus,1994)。本文中，將固定酵母原生質(zhì)球用單克隆10H抗體培養(yǎng)，該抗體特異性地識(shí)別聚(ADP-核糖)聚合物(Kawamitsu等人，1984)。具有10H抗體的陽性淺黃色-綠色熒光信號(hào)位于該核心中并且僅在半乳糖上生長的DY(pV8SPA)中觀察到。在有PARP抑制劑-3ABA和煙酰胺的情況下生長的細(xì)胞陽性染色大大降低。
為了鑒定APP在植物細(xì)胞中的胞內(nèi)定位，試驗(yàn)在植物研究中廣泛適用的方法，即檢測正在討論的蛋白質(zhì)和報(bào)道基因之間形成的融合蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，曾經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生該蛋白質(zhì)融合(Citovsky等人，1994；Sakamoto和Nagatani,1996；Terzaghi等人，1997；von Arnim和Deng,1994)。制備GUS與具有從Met1到Pro407延伸的部分APP多肽的N-端翻譯融合體。APP與細(xì)菌GUS的翻譯融合體的構(gòu)建如下。將質(zhì)粒pETSPA用Smal切割，經(jīng)堿性磷酸酶處理，并連接到來自pGUS1(Plant Genetic Systems N.V.,Gent,Belgium)的平端Ncol-Xbal片段上。將該連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1中并將細(xì)胞移植在補(bǔ)充有0.1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、40μg ml-15-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸化物和100μg ml-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。在這種方式中，選擇pETSPAGUS作為藍(lán)色集落。通過原位GUS活性凝膠證實(shí)在大腸桿菌中表達(dá)約110kDa融合蛋白質(zhì)(Lee等人，1995)。在CaMV的35S啟動(dòng)子的控制下放置該APP-GUS融合體(將來自pETSPAGUS的Klenow平端BamHⅠ片段亞克隆至Smal消化的pJD330；Gallie和Walbot,1992)，所得表達(dá)盒以Xbal片段亞克隆到pCGN1547二元載體的Xbal位置(McBride和Summerfelt,1990)中，從而獲得pGCNSPAGUS。最后通過冷凍-復(fù)蘇轉(zhuǎn)化步驟將該pGCNSPAGUS導(dǎo)入根癌土壤桿菌C58C1RifR(pGV2260)中。
在大腸桿菌中驗(yàn)證該融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。在35S CaMV啟動(dòng)子的控制下將該嵌合cDNA穩(wěn)定地整合到煙草基因組中。在原位組織化學(xué)染色之后分析來自四個(gè)非依賴性轉(zhuǎn)基因煙草植物的子代的GUS活性的亞細(xì)胞分布。在2天齡幼芽中在子葉和根中可以檢測到GUS活性，但是在下胚軸和根端部不能檢測到。由于根組織的透過性，GUS染色清楚地位于根毛和表皮細(xì)胞的核心。此外，看到其它根細(xì)胞的一些散開、未定位的染色，特別是沿維管柱。該非核GUS染色在葉組織中更顯著。鑒于幼嫩真葉或子葉呈現(xiàn)出該核心強(qiáng)的藍(lán)色染色，因此也存在細(xì)胞質(zhì)的一些分散染色。然而，在整個(gè)展開葉中，GUS染色與CaMV 35S啟動(dòng)子的控制下用GUS轉(zhuǎn)化的對照植物的染色均勻和相似，其中GUS在該細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。最后，除了維管束之外，較老葉和子葉實(shí)際上呈現(xiàn)出組織化學(xué)不能檢測出的GUS活性，其中該GUS染色不能被限制在任意特定細(xì)胞小室中。
DNA連接酶Ⅰ的缺陷誘導(dǎo)該app基因的表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞中的PARP是最豐富的核內(nèi)蛋白之一，其活性通過蛋白質(zhì)因結(jié)合到損傷的DNA上的變構(gòu)變化來調(diào)節(jié)。我們發(fā)現(xiàn)，擬南芥屬中的app基因具有相當(dāng)?shù)退降谋磉_(dá)，這暗示該基因的轉(zhuǎn)錄激活可能對APP在體內(nèi)的功能是不可缺少的。為了試驗(yàn)該假設(shè)，在通過DNA連接酶Ⅰ缺陷造成的體內(nèi)基因組去穩(wěn)定化過程中研究該app基因的表達(dá)。提前將該擬南芥屬DNA連接酶Ⅰ基因中的T-DNA插入突變系SK1B2分離(Babiychuk等人，1997)。該突變在純合狀態(tài)是致命的，但是該突變體等位基因顯示出通過配子的正常傳遞。因此我們希望用于該突變純合的細(xì)胞將因細(xì)胞循環(huán)的S相過程中不完全DNA合成，不久以后該突變體胚囊用突變體花粉受精而死亡。
app啟動(dòng)子-GUS翻譯融合體，其中GUS的編碼區(qū)與APP的前5個(gè)氨基酸在閱讀框中融合并構(gòu)建2kb的app 5’閱讀框序列(SEQ ID No 21)。將編碼融合蛋白質(zhì)的該基因轉(zhuǎn)移到擬南芥屬中。在與野生型2次回交之后，用app啟動(dòng)子-GUS轉(zhuǎn)化的雜合植物與擬南芥屬品系SK1B2雜交。對照植物和用于該連接酶突變雜合的植物的花序被染色GUS活性。盡管我們沒有有力的證據(jù)證實(shí)所有調(diào)節(jié)序列存在于所用的構(gòu)建體中，但是大多數(shù)在老化組織中測定的該GUS染色圖譜可以反映該app基因的表達(dá)。在對照植物的花序中該圖譜都是相同的，不運(yùn)送用于突變雜合的突變體連接酶基因和植物。在基因融合蛋白質(zhì)的突變植物中約1/4的胚珠為GUS陽性。更嚴(yán)密的顯微鏡檢測顯示，在GUS陽性胚珠中僅配子體染色。在對照植物和突變植物之間的唯一差異是在DNA連接酶基因中的突變。因此我們推斷該app基因或者因?yàn)镈NA斷裂的積聚或者因?yàn)橛猛蛔兓ǚ凼芫耐蛔兣吣业乃劳龆徽T導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)在授粉之后24小時(shí)內(nèi)或者因此受精之后很快出現(xiàn)胚囊的GUS染色。
實(shí)施例3構(gòu)建PCD調(diào)節(jié)嵌合基因和將含有這些PCD調(diào)節(jié)基因的T-DNA載體引入土壤桿菌屬菌株中3.1.構(gòu)建p35S:(dsRNA-APP)和p35S:(dsRNA-ZAP)基因使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，可操縱地連接以下DNA區(qū)，如圖6中圖示所列(構(gòu)建體1和5)對p35S:(dsRNA-ZAP)嵌合基因來說·一CaMV 35S啟動(dòng)區(qū)(Odell等人，1985)·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼ZAP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 10的擬南芥同源物，通過雜交分離)·約500bp的以逆取向編碼ZAP的DNA區(qū)2的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)對p35S:(dsRNA-APP)嵌合基因來說·一CaMV 35S啟動(dòng)區(qū)(Odell等人，1985)·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼APP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 5)·約500bp的以逆取向編碼APP的DNA區(qū)的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)3.2.構(gòu)建pNOS:(dsRNA-APP)和pPOS:(dsRNA-ZAP)基因使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，可操縱地連接以下DNA區(qū)，如圖6中圖示所列(構(gòu)建體2和6)對pNOS:(dsRNA-ZAP)嵌合基因來說·一NOS啟動(dòng)區(qū)(Herrera-Estrella等人，1983)
·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼ZAP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 10的擬南芥同源物，通過雜交分離)·約500bp的以逆取向編碼ZAP的DNA區(qū)2的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)對pNOS:(dsRNA-APP)嵌合基因來說·一NOS啟動(dòng)區(qū)(Herrera-Estrella等人，1983)·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼APP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 5)·約500bp的以逆取向編碼APP的DNA區(qū)的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)3.3.構(gòu)建pTA29:(dsRNA-APP)和pTA29:(dsRNA-ZAP)基因使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，可操縱地連接以下DNA區(qū)，如圖6中圖示所列(構(gòu)建體3和7)對pTP29:(dsRNA-ZAP)嵌合基因來說·一TP29啟動(dòng)區(qū)(WO 89/10396)·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼ZAP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 10的擬南芥同源物，通過雜交分離)·約500bp的以逆取向編碼ZAP的DNA區(qū)2的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)對pTP29:(dsRNA-APP)嵌合基因來說·一TA29啟動(dòng)區(qū)(WO 89/10396)·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼APP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 5)·約500bp的以逆取向編碼APP的DNA區(qū)的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)3.4.構(gòu)建pNTP303:(dsRNA-APP)pNTP303:(dsRNA-ZAP)基因使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，可操縱地連接以下DNA區(qū)，如圖6中圖示所列(構(gòu)建體4和8)對pNTP303:(dsRNA-ZAP)嵌合基因來說·一NTP303啟動(dòng)區(qū)(Wetering 1994)·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼ZAP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 10的Arabidopsis thaliana同源物，通過雜交分離)·約500bp的以逆取向編碼ZAP的DNA區(qū)2的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)對pNTP303:(dsRNA-APP)嵌合基因來說·一NTP303啟動(dòng)區(qū)(Wetering,1994)·一Cab22前導(dǎo)區(qū)(Harpster等人，1988)·一編碼APP的DNA區(qū)(約整個(gè))(SEQ ID No 5)·約500bp的以逆取向編碼APP的DNA區(qū)的5’端·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)3.5.構(gòu)建嵌合標(biāo)記基因使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，可操縱地連接以下DNA區(qū)，如圖6中圖示所列對gat標(biāo)記基因來說·一Act2啟動(dòng)區(qū)(An等人，1996)·一編碼氨基苷類6’-乙?；D(zhuǎn)移酶的DNA(WO 94/26913)·一胭脂氨酸合成酶基因的3’端區(qū)(Depicker等人，1982)對bar標(biāo)記基因來說·一Act2啟動(dòng)區(qū)(An等人，1996)·一編碼膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的DNA(US5646024)·一胭脂氨酸合成酶基因的3’端區(qū)(Depicker等人，1982)3.6.構(gòu)建含有該P(yáng)CD調(diào)節(jié)嵌合基因的T-DNA載體使用適當(dāng)限制酶，將3.1-3.5下所述的嵌合PCD調(diào)節(jié)基因切除并引入來自或者與gat標(biāo)記基因或bar標(biāo)記基因一起的pGSV5(WO 97/13865)的T-DNA載體的T-DNA邊界之間的多接頭中。所得T-DNA載體圖示于圖6中。
3.7.將T-DNA載體引入土壤桿菌屬中通過Walkerpeach和Velten(1995)所述的電穿孔將T-DNA載體引入根癌土壤桿菌C58C1Rif(pGV4000)中并使用壯觀霉素和鏈霉素選擇轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例4用實(shí)施例3中的T-DNA載體對擬南芥進(jìn)行土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化運(yùn)用Valvekens等人(1992)所述的根轉(zhuǎn)化法使用土壤桿菌屬菌株轉(zhuǎn)化擬南芥變種C24。將這些外植體用分別含有dsRNA-APP和dsRNA-ZAP構(gòu)建體的土壤桿菌屬菌株共感染。將該dsRNA-APP構(gòu)建體與pact∶bar基因組合使用。將該dsRNA-ZAP構(gòu)建體與pact∶gat基因組合使用。選擇具有膦絲菌素抗性的轉(zhuǎn)化體。通過卡那霉素抗性的篩選檢測這些再生根轉(zhuǎn)基因系存在其它T-DNA。將含有兩種T-DNA的轉(zhuǎn)基因系轉(zhuǎn)移到溫室中。將表型T0-轉(zhuǎn)基因系計(jì)數(shù)并進(jìn)一步更詳細(xì)地研究該T1-代。
實(shí)施例5用實(shí)施例3的T-DNA載體對Brassica napus進(jìn)行土壤桿菌屬介導(dǎo)轉(zhuǎn)化除了以下修飾之外，運(yùn)用主要由De Block等人(1989)所述的下胚軸轉(zhuǎn)化法使用土壤桿菌屬菌株轉(zhuǎn)化該Brassica napus變種N90-740-將下胚軸外植體在A2培養(yǎng)基[MS、0.5g/l Mes (pH5.7)、1.2％葡萄糖、0.5％瓊脂糖、1mg/l 2,4-D、0.25mg/l萘乙酸(NAA)和1mg/l 6-芐氨基嘌呤(BAP)]上預(yù)培養(yǎng)1天。
-感染培養(yǎng)基A3為MS、0.5g/l Mes(pH5.7)、1.2％葡萄糖、0.1mg/lNAA、0.75mg/l BAP和0.01mg/l偽赤霉酸(GA3)。
-選擇培養(yǎng)基A5G為MS、0.5g/l Mes (pH5.7)、1.2％葡萄糖、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、0.5％瓊脂糖、0.1mg/l NAA、0.75mg/l BAP、0.01mg/l GA3、250mg/l羧芐青霉素、5mg/l硝酸銀三周。在該時(shí)期之后連續(xù)選擇在A25J培養(yǎng)基(與A5G相似但有3％蔗糖)上。
-再生培養(yǎng)基A6為MS、0.5g/l Mes(pH5.7)、2％蔗糖、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l PVP、0.5％瓊脂糖、0.0025mg/l BAP和250mg/ltriacillin。
將健康枝條轉(zhuǎn)移到在1升容器中的A9的生根培養(yǎng)基中半濃縮的MS、1.5％蔗糖(pH5.8)、100mg/l triacillin、0.6％瓊脂。
MS代表Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog,1962)。
為了將dsRNA-APP和dsRNA-ZAP T-DNA構(gòu)建體都引入相同植物細(xì)胞中，運(yùn)用共轉(zhuǎn)化法，主要如De Block和Debrouwer(1991)所述。在含膦絲菌素的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化植物系，之后通過檢測再生根枝條的卡那霉素抗性篩選存在的二級(jí)T-DNA。在這些共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，將該dsRNA-APP構(gòu)建體與pact∶bar基因組合使用。將該dsRNA-ZAP構(gòu)建體與pact∶gat基因組合使用。將含有兩種T-DNA的轉(zhuǎn)基因系轉(zhuǎn)移到溫室中。將表型T0-轉(zhuǎn)基因系計(jì)數(shù)壁掛對該T1-代進(jìn)行進(jìn)一步更詳細(xì)的研究。
實(shí)施例6測定植物品系活力的體外測定6.1.Brassica napus的健康測定培養(yǎng)基和反應(yīng)緩沖液播種培養(yǎng)基半濃縮的Murashige和Skoog鹽2％蔗糖pH5.80.6％瓊脂愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基A2SMS培養(yǎng)基、0.5g/l Mes (pH5.8)、3％蔗糖、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l瓊脂糖、1mg/l 2,4-D、0.25mg/l NAA、1mg/l BAP培育培養(yǎng)基25mM K-磷酸鹽緩沖液pH5.82％蔗糖每25ml培養(yǎng)基1滴吐溫20反應(yīng)緩沖液50mM K-磷酸鹽緩沖液pH7.410mM氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)(=3.35mg/ml)每25ml培養(yǎng)基1滴吐溫20
種子的滅菌和幼苗的生長將種子在70％乙醇中浸泡2分鐘，然后在含0.1％吐溫20的次氯酸鈉溶液(具有約6％的活性氯)中表面滅菌15分鐘。最后，將這些種子用1升無菌蒸餾水沖洗。1升含約75ml播種培養(yǎng)基的容器(Weck)中放7粒種子。在23℃和30μEinstein/s-1m-2及日長16小時(shí)下這些種子發(fā)芽。
株系N90-740總是包括試驗(yàn)之間的標(biāo)準(zhǔn)化。
下胚軸外植體的預(yù)培養(yǎng)-播種后12-14天，將這些下胚軸切成約7mm段。
25個(gè)下胚軸/Optilux陪替氏培養(yǎng)皿(Falcon S1005)-在培養(yǎng)基A2S上在23-25℃將這些下胚軸外植體培養(yǎng)4天(在30μEinstein/s-1m-2下)。
-附注每株系需要約150-300個(gè)下胚軸外植體進(jìn)行該測定-將這些下胚軸外植體轉(zhuǎn)移到含30ml培育培養(yǎng)基的Optilux陪替氏培養(yǎng)皿(Falcon S1005)中。
-在24℃下在黑暗中培育約20小時(shí)。
TTC-測定-將150個(gè)下胚軸外植體轉(zhuǎn)移到一50ml的Falcon管中。
-用反應(yīng)緩沖液(不含TTC)沖洗。
-每只管中添加25ml-30ml的反應(yīng)緩沖液。
管1沒有添加TTC*用于測定本底吸收*每個(gè)試驗(yàn)一個(gè)株系就足夠管2+10mM TTC(外植體必需被浸沒，但不要真空浸潤！)-上下顛倒管-在黑暗中在26℃下培育約1小時(shí)(不結(jié)束反應(yīng)！)-用去離子水沖洗下胚軸-除去水-在-70℃下冷凍30分鐘在室溫下復(fù)蘇(在黑暗中)-添加50ml乙醇(工業(yè)用)-通過搖晃1小時(shí)提取還原TTC-H-在485nm下測定提取物的吸光度附注還原TTC-H不穩(wěn)定保持在黑暗中并盡快測定O.D.485O.D.485(TTC-H)=(O.D.485+TTC)-(O.D.485-TTC)-可以通過在不同試驗(yàn)中將N90-740的TTC-還原能力設(shè)置為100％來進(jìn)行不同非依賴性試驗(yàn)的樣品間的TTC-還原能力的比較。
-具有高TTC-還原能力的株系生長茂盛，然而具有低TTC-還原能力的株系生長不茂盛。
6.2.擬南芥屬健康測定培養(yǎng)基和反應(yīng)緩沖液植物培養(yǎng)基半濃縮的Murashige和Skoog鹽1.5％蔗糖pH5.80.6％瓊脂→高壓滅菌15分鐘。
加入經(jīng)過濾滅菌的-100mg/l肌醇-0.5mg/l維生素B6-0.5mg/l煙酸-1mg/l硫胺素培育培養(yǎng)基10mM K-磷酸鹽緩沖液pH5.82％蔗糖每25ml培養(yǎng)基1滴吐溫20反應(yīng)緩沖液50mM K-磷酸鹽緩沖液pH7.410mM氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)(=3.35mg/ml)每25ml緩沖液1滴吐溫20擬南芥屬植物-擬南芥屬種子的滅菌
2分鐘70％乙醇10分鐘漂白劑(6％活性氯)+每20ml溶液1滴吐溫20用無菌水沖洗5次附注在2ml eppendorf管中進(jìn)行滅菌擬南芥屬種子浸沒在管底，通過1ml自動(dòng)移液器移去液體-擬南芥屬植物的生長以1粒種子/網(wǎng)格將種子播種在含±100ml植物培養(yǎng)基的“IntergridTissue Culture disks of Falcon”(nr.3025)中。
植物在23℃、40μEinstein s-1m-2、16小時(shí)光照-8小時(shí)黑暗下生長約3周(植物開始形成花蕾)。
→附注*每株系需要約90-110株植物進(jìn)行該測定*包括用于校準(zhǔn)的對照株系(C24；Columbia；…)預(yù)培育-通過切割根收獲擬南芥屬枝條(利用剪刀)立即將每個(gè)枝條放入培育培養(yǎng)基中(枝條必需被浸沒，但不要真空浸潤)培育培養(yǎng)基±150ml于“Intergrid Tissue Culture disks ofFalcon”(nr.3025)中a)培育培養(yǎng)基用于定量本底吸收(參見TTC-測定)b)培育培養(yǎng)基c)培育培養(yǎng)基+2mM煙酰胺30-35個(gè)枝條/陪替氏培養(yǎng)皿(但是對所有株系以及每種條件使用相同量的枝條)-在24℃下在黑暗中培育±20小時(shí)TTC-測定-將枝條轉(zhuǎn)移到50ml的Falcon管中-用反應(yīng)緩沖液(不含TTC)沖洗-每只管中添加30-35ml的反應(yīng)緩沖液a)不加TTC(用于本底吸收測定)
b)和c)+10mM TTC(枝條必需被浸沒，但不要真空浸潤！)-在黑暗中在26℃下培育約2小時(shí)(不結(jié)束反應(yīng)！)-用去離子水沖洗枝條-除去水-在-70℃下冷凍30分鐘在室溫下復(fù)蘇(在黑暗中)-添加50ml乙醇(工業(yè)用)-通過搖晃1小時(shí)提取還原TTC-H-在485nm下測定提取物的吸光度附注還原TTC-H不穩(wěn)定→保持在黑暗中并盡快測定O.D.485-比較試驗(yàn)株系與對照株系的還原圖譜(相對30-35個(gè)植物的種群)O.D.485(TTC-H)=(O.D.485+TTC)-(O.D.485-TTC)-可以通過在不同試驗(yàn)中將對照株系(C24；Columbia；…)的TTC-還原能力設(shè)置為100％來進(jìn)行不同非依賴性試驗(yàn)的樣品間的TTC-還原能力的比較。
-具有高TTC-還原能力的株系生長茂盛，然而具有低TTC-還原能力的株系生長不茂盛。
-如果將煙酰胺添加到培育培養(yǎng)基中導(dǎo)致更高TTC-還原能力，說明其健康狀況更低(如C24和Columbia所示)。
實(shí)施例7含dsRNA-APP和dsRNA-ZAP構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因株系的表型分析計(jì)數(shù)在花藥或花粉特異性啟動(dòng)子的控制下含dsRNA-APP和dsRNA-ZAP的T0-株系的花表型和花粉生存力(Alexander染色(Alexander,1969)和發(fā)芽測定)。對擬南芥屬來說，通過自花授精或者如果該植物為雄性不育使用未轉(zhuǎn)化野生型植物的花粉通過回交獲得T1-子代。對Brassica napus來說，總是使用未轉(zhuǎn)化植物通過回交獲得T1-子代。
T1-種子在含卡那霉素的培養(yǎng)基上發(fā)芽，之后通過膦絲菌素抗性的氨多孔測定(De Block等人，1995)計(jì)數(shù)抗性植物。將含有兩種T-DNA的一半植物轉(zhuǎn)移到溫室中，計(jì)數(shù)植物的雄性生育力，同時(shí)使用另一半通過健康測定定量植物的活力。
對在35S或NOS啟動(dòng)子的控制下含有PCD調(diào)節(jié)基因的組合(APP/ZAP)的植物來說，在許多轉(zhuǎn)基因株系中觀察到高活力。
對在TA29的控制下含有PCD調(diào)節(jié)基因的組合(APP/ZAP)的植物來說，在許多轉(zhuǎn)基因株系中觀察到雄性生育力。
對在NTP303的控制下含有PCD調(diào)節(jié)基因的組合(APP/ZAP)的植物來說，在許多轉(zhuǎn)基因株系中觀察到不育花粉。
實(shí)施例8含PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的植物的表型分析使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，通過可操縱地連接以下DNA區(qū)構(gòu)建另一實(shí)例p35S::(dsRNA-ZAP)嵌合基因·一CaMV 35S2啟動(dòng)區(qū)(Odell等人，1985)·一編碼Cab22前導(dǎo)區(qū)的DNA (Harpster等人，1988)·一具有SEQ ID No 10從核苷酸第279位置至核苷酸第1728位置的核苷酸序列的從Hincll位置到SnaBl位置的玉米的編碼ZAP2的DNA區(qū)·以逆取向從Hincll位置到EcoRV位置的ZAP2編碼區(qū)的5’端(具有SEQID No 10從核苷酸第279位置至核苷酸第792位置的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)將該嵌合基因引入來自與bar標(biāo)記基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA載體的T-DNA邊界之間的多接頭中，并產(chǎn)生T-DNA載體pTYG33，通過所述的電穿孔將其引入土壤桿菌C58C1Rif(pGV4000)。
使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，通過可操縱地連接以下DNA區(qū)構(gòu)建另一實(shí)例pNos::(dsRNA-ZAP)嵌合基因·一胭脂氨酸合成酶啟動(dòng)區(qū)(Herrera-Estrella等人，1985)·一編碼Cab22前導(dǎo)區(qū)的DNA (Harpster等人，1988)·一具有SEQ ID No 10從核苷酸第279位置至核苷酸第1728位置的核苷酸序列的從Hincll位置到SnaBl位置的玉米的編碼ZAP2的DNA區(qū)·以逆取向從Hincll位置到EcoRV位置的ZAP2編碼區(qū)的5’端(具有SEQID No 10從核苷酸第279位置至核苷酸第792位置的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)將該嵌合基因引入來自與bar標(biāo)記基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA載體的T-DNA邊界之間的多接頭中，并產(chǎn)生T-DNA載體pTYG34，通過所述的電穿孔將其引入土壤桿菌C58C1Rif(pGV4000)。
使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，通過可操縱地連接以下DNA區(qū)構(gòu)建另一實(shí)例p35S::(dsRNA-APP)嵌合基因·一CaMV 35S2啟動(dòng)區(qū)(Odell等人，1985)·一編碼Cab22前導(dǎo)區(qū)的DNA (Harpster等人，1988)·一具有SEQ ID No 5從核苷酸第189位置至核苷酸第1349位置的核苷酸序列的從Scal位置到Smal位置的擬南芥的編碼APP的DNA區(qū)·以逆取向從Scal位置到Haelll位置的ZAP2編碼區(qū)的5’端(具有SEQID No 5從核苷酸第189位置至核苷酸第784位置的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)將該嵌合基因引入來自與bar標(biāo)記基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA載體的T-DNA邊界之間的多接頭中，并產(chǎn)生T-DNA載體pTYG29，通過所述的電穿孔將其引入土壤桿菌C58C1Rif (pGV4000)。
使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA步驟，通過可操縱地連接以下DNA區(qū)構(gòu)建另一實(shí)例pNos::(dsRNA-APP)嵌合基因·一胭脂氨酸合成酶啟動(dòng)區(qū)(Herrera-Estrella等人，1985)·一編碼Cab22前導(dǎo)區(qū)的DNA(Harpster等人，1988)·一具有SEQ ID No 5從核苷酸第189位置至核苷酸第1349位置的核苷酸序列的從Scal位置到Smal位置的擬南芥屬的編碼APP的DNA區(qū)·以逆取向從Scal位置到Haelll位置的ZAP2編碼區(qū)的5’端(具有SEQID No 5從核苷酸第189位置至核苷酸第784位置的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)·一CaMV35S 3’端區(qū)(Mogen等人，1990)
將該嵌合基因引入來自與bar標(biāo)記基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA載體的T-DNA邊界之間的多接頭中，并產(chǎn)生T-DNA載體pTYG30，通過所述的電穿孔將其引入土壤桿菌C58C1Rif(pGV4000)。
所得土壤桿菌菌株被用于將不同PCD調(diào)節(jié)基因分別引入實(shí)施例4和5所述的Brassica napus和擬南芥(Columbia和C24)植物中。
通過T0子代(T1子代)自花授精獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物在含膦絲菌素的培養(yǎng)基上發(fā)芽。進(jìn)一步培育抗性轉(zhuǎn)基因植物。
含有基于pTYG33的pNOS::(dsRNA-ZAP)構(gòu)建體或基于pTYG34的p35S::(dsRNA-ZAP)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因T1植物(都來自Columbia或C24)的生長，明顯快于通過沒有PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的T-DNA載體的T-DNA轉(zhuǎn)化的對照轉(zhuǎn)基因植物的(參見表1)。
通過將小植物漂浮在或10或50mg/L的水楊酸溶液上或作為對照的水上評(píng)價(jià)擬南芥屬T1轉(zhuǎn)基因植物(來自Columbia)的逆境耐性。逆境敏感的植物在培育1-2天之后長出漂白且卷曲的葉，然而耐逆境植物保持完整持續(xù)至少5天。另外，含有基于pTYG33的pNOS::(dsRNA-ZAP)構(gòu)建體或基于pTYG34的p35S::(dsRNA-ZAP)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，明顯比對照轉(zhuǎn)基因植物更耐逆境(參見表1)。
由通過pTYG29、pTYG30、pTYG33或pTYG34的dsRNA-ZAP或dsRNA-APP轉(zhuǎn)化的Brassica napus獲得的抗PPT的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，在含50mg/L阿司匹林的培養(yǎng)基上培育2天。2天之后，測定這些愈傷組織的重量并將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到?jīng)]有阿司匹林的培養(yǎng)基上并且再培育5天。在這5天之后，測定這些愈傷組織的重量，將重量增加以培育2天后的重量的百分比表示。作為對照，將通過沒有PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的T-DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因愈傷組織通過相同步驟呈現(xiàn)，只是在2天培育中沒有添加阿司匹林。結(jié)果匯總于表Ⅱ中，這些結(jié)果說明了含有PCD調(diào)節(jié)嵌合基因的轉(zhuǎn)基因Brassica napus細(xì)胞比對照細(xì)胞耐逆境。
表1轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物(T1子代)的評(píng)價(jià)
**A．thalina Columbia對阿司匹林有一定程度的天然耐性。
表2在阿司匹林上培育之后轉(zhuǎn)基因Brassica calli的再生長
平均標(biāo)準(zhǔn)誤差＜5％。
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ctg gtg gag 218Ala Glu Arg Gly Leu Ser Thr Thr Gly Val Lys Ala Val Leu Val Glu15 20 25 30agg ctt gaa gag gct atc gca gaa gac act aag aag gaa gaa tca aag 266Arg Leu Glu Glu Ala Ile Ala Glu Asp Thr Lys Lys Glu Glu Ser Lys35 40 45agc aag agg aaa aga aat tct tct aat gat act tat gaa tcg aac aaa 314Ser Lys Arg Lys Arg Asn Ser Ser Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Asn Lys50 55 60ttg att gca att ggc gaa ttt cgt ggg atg att gtg aag gaa ttg cgt 362Leu Ile Ala Ile Gly Glu Phe Arg Gly Met Ile Val Lys Glu Leu Arg65 70 75gag gaa gct att aag aga ggc tta gat aca aca gga acc aaa aag gat 410Glu Glu Ala Ile Lys Arg Gly Leu Asp Thr Thr Gly Thr Lys Lys Asp80 85 90ctt ctt gag agg ctt tgc aat gat gct aat aac gtt tcc aat gca cca 458Leu Leu Glu Arg Leu Cys Asn Asp Ala Asn Asn Val Ser Asn Ala Pro95 100 105 110gtc aaa tcc agt aat ggg aca gat gaa gct gaa gat gac aac aat ggc 506Val Lys Ser Ser Asn Gly Thr Asp Glu Ala Glu Asp Asp Asn Asn Gly115 120 125ttt gaa gaa gaa aag aaa gaa gag aaa atc gta acc gcg aca aag aag 554Phe Glu 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4380gctgccccga gaattatgca gcattttttt ggtgtatgtg ggccccaaat gaagtgcagg 4440tcaaaccttg acagtgacga caaatcgttg ggcgggtcca gggcgaattt tgcgacaaca 4500tgtcgaggct cagcaggact ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcactggccg 4560tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 4620cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 4680aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 4740tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 4800agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 4860tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 4920tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcga 494權(quán)利要求
1．一種調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括使用(Ⅰ)ZAP類的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的核苷酸序列，和(Ⅱ)NAP類的PARP基因的核苷酸序列，以降低所述真核細(xì)胞中總PARP活性的功能水平。
2．權(quán)利要求1的方法，還包括通過使用ZAP類的所述PARP基因的所述核苷酸序列和NAP類的所述PARP基因的核苷酸序列降低與所述真核細(xì)胞同源的PARP基因的表達(dá)。
3．權(quán)利要求1的方法，還包括通過使用ZAP類的所述PARP基因的所述核苷酸序列和NAP類的所述PARP基因的核苷酸序列降低由內(nèi)源PARP基因編碼的蛋白質(zhì)的表觀活性。
4．權(quán)利要求1的方法，還包括用ZAP類的所述PARP基因的所述核苷酸序列和NAP類的所述PARP基因的核苷酸序列改變同源的PARP基因的核苷酸序列。
5．一種調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡(PCD)的方法，包括將第一和第二PCD調(diào)節(jié)嵌合基因引入所述真核細(xì)胞中，其中所述第一PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)a)第一啟動(dòng)子，在所述真核細(xì)胞中可操作；b)第一DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子或者ⅰ)可以降低ZAP類含Zn-指的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；或者ⅱ)可以被翻譯成肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)表達(dá)時(shí)該肽或蛋白質(zhì)降低ZAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；c)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)；并且其中所述第二PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DAN區(qū)a)第二啟動(dòng)子，在所述真核細(xì)胞中可操作；b)第二DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子或者ⅰ)可以降低NAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；或者ⅱ)可以被翻譯成肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)表達(dá)時(shí)該肽或蛋白質(zhì)降低NAP類的PARP蛋白質(zhì)的功能水平；c)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)；其中所述真核細(xì)胞中的總表觀PARP活性被顯著或者幾乎完全降低。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼有義RNA分子，所述DNA區(qū)含有與ZAP類的內(nèi)源PARP基因的有義DNA鏈具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述有義RNA分子能夠降低ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
7．權(quán)利要求5的方法，其中所述第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼有義RNA分子，所述DNA區(qū)含有與NAP類的內(nèi)源PARP基因的有義DNA鏈具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述有義RNA分子能夠降低NAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼有義RNA分子，所述DNA區(qū)含有與ZAP類的內(nèi)源PARP基因的有義DNA鏈具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述有義RNA分子能夠降低ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
9．權(quán)利要求5的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼反義RNA分子，所述DNA區(qū)含有與ZAP類的內(nèi)源PARP基因的DNA鏈的互補(bǔ)序列具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述反義RNA分子能夠降低ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
10．權(quán)利要求5的方法，其中所述的第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼反義RNA分子，所述DNA區(qū)含有與NAP類的內(nèi)源PARP基因的有義DNA鏈的互補(bǔ)體具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述反義RNA分子能夠降低NAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼反義RNA分子，所述DNA區(qū)含有與ZAP類的內(nèi)源PARP基因的有義DNA鏈的互補(bǔ)鏈具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述反義RNA分子能夠降低ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
12．權(quán)利要求5的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼RNA分子，所述RNA分子含有與由ZAP類的內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的有義核苷酸序列，所述RNA分子還含有與由ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄獲得的所述mRNA的互補(bǔ)鏈具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的反義核苷酸序列，其中所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區(qū)，并且其中所述RNA分子能夠降低ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
13．權(quán)利要求5的方法，其中所述第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼RNA分子，所述RNA分子含有與由NAP類的內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的有義核苷酸序列，所述RNA分子還含有與由NAP類的所述內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄獲得的所述mRNA的互補(bǔ)鏈具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的反義核苷酸序列，其中所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區(qū)，并且其中所述RNA分子能夠降低NAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
14．權(quán)利要求10的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼RNA分子，所述RNA分子含有與由ZAP類的內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的有義核苷酸序列，所述RNA分子還含有與由ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因轉(zhuǎn)錄獲得的所述mRNA的互補(bǔ)鏈具有75％相同性的至少約100個(gè)核苷酸的反義核苷酸序列，其中所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區(qū)，并且其中所述RNA分子能夠降低ZAP類的所述內(nèi)源PARP基因的表達(dá)。
15．權(quán)利要求5的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼顯性陰性PARP突變體，該突變體能夠降低由ZAP類的內(nèi)源PARP基因編碼的PARP蛋白質(zhì)的表觀活性。
16．權(quán)利要求5的方法，其中所述第二轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼顯性陰性PARP突變體，該突變體能夠降低由NAP類的內(nèi)源PARP基因編碼的PARP蛋白質(zhì)的表觀活性。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)編碼顯性陰性PARP突變體，該突變體能夠降低由ZAP類的內(nèi)源PARP基因編碼的PARP蛋白質(zhì)的表觀活性。
18．權(quán)利要求16的方法，其中所述顯性陰性PARP突變體含有選自SEQID No 4從氨基酸1到159的氨基酸序列或SEQ ID No 6從氨基酸1到138的氨基酸序列的氨基酸序列。
19．權(quán)利要求17的方法，其中所述顯性陰性PARP突變體含有選自SEQID No 2從氨基酸1到370的氨基酸序列、SEQ ID No 11從氨基酸1到98的氨基酸序列或SEQ ID No 2從氨基酸1到370的氨基酸序列的氨基酸序列，其中該氨基酸序列從氨基酸1到88被SEQ ID No 11的氨基酸序列替換。
20．權(quán)利要求5的方法，其中所述第一或所述第二啟動(dòng)子為組織特異性或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
21．權(quán)利要求20的方法，其中所述第一或所述第二啟動(dòng)子選自真菌響應(yīng)性啟動(dòng)子、線蟲響應(yīng)性啟動(dòng)子、花藥選擇性啟動(dòng)子、柱頭選擇性啟動(dòng)子、開裂區(qū)選擇性啟動(dòng)子。
22．權(quán)利要求5-21任一項(xiàng)的方法，其中所述總表觀PARP活性從所述真核細(xì)胞中正常表觀PARP活性的約75％降低至約90％，并且其中所述真核細(xì)胞防止了程序性細(xì)胞死亡。
23．權(quán)利要求5-21任一項(xiàng)的方法，其中所述總表觀PARP活性比所述真核細(xì)胞中正常表觀PARP活性降低約90％至約100％，并且其中所述真核細(xì)胞受程序性細(xì)胞死亡殺死。
24．權(quán)利要求22的方法，其中所述真核細(xì)胞為植物細(xì)胞。
25．權(quán)利要求23的方法，其中所述真核細(xì)胞為植物細(xì)胞。
26．一種調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的方法，包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因引入所述植物細(xì)胞中，其中所述PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)a)植物表達(dá)的啟動(dòng)子；b)DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子或者ⅰ)能夠降低內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；或者ⅱ)能夠被翻譯成肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)表達(dá)時(shí)該肽或蛋白質(zhì)降低所述植物細(xì)胞中的表觀PARP活性；以及c)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)；其中所述植物細(xì)胞中的總表觀PARP活性比所述植物細(xì)胞中的正常表觀PARP活性降低約75％至約100％。
27．權(quán)利要求5-21任一所述的第一和第二嵌合PCD調(diào)節(jié)基因。
28．含有權(quán)利要求27的第一和第二嵌合PCD調(diào)節(jié)基因的真核細(xì)胞。
29．權(quán)利要求28的真核細(xì)胞，它為植物細(xì)胞。
30．含有權(quán)利要求28的真核細(xì)胞的非人真核有機(jī)體。
31．含有權(quán)利要求29的植物細(xì)胞的植物。
32．權(quán)利要求31的植物的種子，含有權(quán)利要求27的第一和第二嵌合PCD調(diào)節(jié)基因。
33．一種調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因引入所述植物細(xì)胞中，其中所述PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)a)植物表達(dá)的啟動(dòng)子；b)DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子能夠降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；和c)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
34．一種增加植物生長速度的方法，所述方法包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因引入所述植物細(xì)胞中，其中所述PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)a)植物表達(dá)的啟動(dòng)子；b)DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子能夠降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；和c)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
35．一種生產(chǎn)植物的耐逆境細(xì)胞的方法，所述方法包括將PCD調(diào)節(jié)嵌合基因引入所述植物細(xì)胞中，其中所述PCD調(diào)節(jié)嵌合基因包括以下可操縱地連接的DNA區(qū)a)植物表達(dá)的啟動(dòng)子；b)DNA區(qū)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子能夠降低ZAP類的內(nèi)源PARP基因的表達(dá)；和c)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
36．編碼具有PARP活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞或植物中程序性細(xì)胞死亡的用途。
37．根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其中所述具有PARP活性的蛋白質(zhì)為ZAP類的PARP蛋白質(zhì)。
38．編碼具有PARP活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列在產(chǎn)生耐逆境植物細(xì)胞或植物的用途。
39．根據(jù)權(quán)利要求38的用途，其中具有PARP活性的所述蛋白質(zhì)為ZAP類的PARP蛋白質(zhì)。
40．編碼具有PARP活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列在增加植物細(xì)胞或植物生長速度的用途。
41．根據(jù)權(quán)利要求40的用途，其中具有PARP活性的所述蛋白質(zhì)為ZAP類的PARP蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過引入影響內(nèi)源聚－ADP－核糖聚合酶(PARP)基因表達(dá)和/或表觀活性的“PCD調(diào)節(jié)嵌合基因”調(diào)節(jié)真核細(xì)胞和有機(jī)體,特別是植物細(xì)胞和植物中程序性細(xì)胞死亡(PCD)的手段和方法?？梢砸种苹虼碳こ绦蛐约?xì)胞死亡。本發(fā)明特別涉及編碼具有PARP活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列在調(diào)節(jié)PCD、提高產(chǎn)生耐逆境細(xì)胞和有機(jī)體的生長速度中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1309714SQ99808747
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月17日
發(fā)明者E·巴比楚克, S·庫什尼爾, M·德布羅克 申請人:阿溫提斯作物科學(xué)公司