專利名稱：向真核細(xì)胞運(yùn)送的外源dna的改良整合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及用外源DNA轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞，以及由這樣的細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體、組織或培養(yǎng)物。
為了應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物以獲取廣泛利益，已發(fā)展了幾種將外源DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。這些方法包括例如由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的向植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移T-DNA的改良的生物學(xué)系統(tǒng)，以及電穿孔、微注射、磷酸鈣或聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的DNA攝入或細(xì)胞融合及微粒轟擊等物理學(xué)、非生物學(xué)系統(tǒng)(有關(guān)一般性的和多少有些過(guò)時(shí)的評(píng)述可參見由Blackwell Scientific Publication出版社出版(1988)，由Draper，J.等人編著的《植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Plant Genetic Transformation and Gene Expression，A Laboratory Manual)一書的第2和3章；也可參見Potrykus等人，“基因的直接轉(zhuǎn)移現(xiàn)狀和展望”，植物分子生物學(xué)報(bào)告(Plant Mol.Biol. Rep)3117-128(1985))。
使用這些已建立的方法，得以用外源DNA穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化各種植物。具體地說(shuō)，物理學(xué)技術(shù)的建立已克服了因使用生物學(xué)系統(tǒng)所帶來(lái)的明顯的宿主范圍限制。然而，這些物理學(xué)方法的共同缺陷在于，它們不能為將被輸送的DNA有序整合到植物細(xì)胞基因組中提供任何有效手段。因此這些方法必須依賴于尚不完全清楚的機(jī)制，不受控制地整合所傳送的DNA，通常使外源DNA作為隨機(jī)片段的多個(gè)拷貝被整合到植物細(xì)胞基因組的單個(gè)位點(diǎn)上。如能改善向植物細(xì)胞內(nèi)物理導(dǎo)入外源DNA所引起的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化過(guò)程的可預(yù)測(cè)性，將會(huì)顯著改善這些方法的實(shí)用性和總體效率，從而能生產(chǎn)出可穩(wěn)定地表達(dá)轉(zhuǎn)基因的遺傳上穩(wěn)定的被轉(zhuǎn)化植物。已為此目的而采用的一種手段是將生物學(xué)系統(tǒng)中促進(jìn)轉(zhuǎn)化和/或整合的蛋白質(zhì)與非生物學(xué)運(yùn)送技術(shù)結(jié)合使用。為了達(dá)到預(yù)期的效果，已考慮有必要在轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞之前將這些蛋白質(zhì)本身與外源DNA分子聯(lián)系起來(lái)，從而盡可能地模擬衍生這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)系統(tǒng)(WO 95/05471和WO 95/34647)。
已知有許多促進(jìn)外源基因穩(wěn)定地整合性轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)是在真核細(xì)胞外產(chǎn)生的并且是與外源基因聯(lián)合傳送的。本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即為了促進(jìn)穩(wěn)定地整合性轉(zhuǎn)化，這些蛋白不一定象天然狀態(tài)一樣在真核細(xì)胞外產(chǎn)生并與外源DNA結(jié)合。相反，向真核轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞輸送編碼這種蛋白質(zhì)的可翻譯的RNA或嵌合基因，也可有效地促進(jìn)共運(yùn)送的外源DNA穩(wěn)定地整合性轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的主要目的之一是提供一種用外源DNA轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞以穩(wěn)定地整合目的DNA的改良方法。該改良方法總地包括向作各轉(zhuǎn)化靶的真核細(xì)胞提供至少一種能產(chǎn)生一種或多種促進(jìn)整合的蛋白質(zhì)的嵌合基因或RNA，同時(shí)一并提供欲被整合的外源DNA。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用(a)由兩邊接有T-DNA邊緣序列的目的DNA組成的DNA片段，和(b)至少一種能在所說(shuō)的真核細(xì)胞中表達(dá)一種或多種可促進(jìn)接有T-DNA邊緣序列之DNA整合的蛋白質(zhì)的嵌合DNA或RNA分子來(lái)轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，定向整合的目的外源DNA片段可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員希望以完整形式整合到真核細(xì)胞基因組中的任何DNA片段，例如設(shè)計(jì)使之在植物細(xì)胞或所得植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)特殊生物學(xué)活性RNA(如反義RNA或核酶)或有用蛋白質(zhì)的嵌合基因。
能夠促進(jìn)所說(shuō)外源DNA整合的蛋白質(zhì)，特別是由農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒的侵入性(virulence)區(qū)域編碼的蛋白質(zhì)，可用于指導(dǎo)與T-DNA邊緣序列鄰接的目的DNA整合到真核細(xì)胞基因組中。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了用外源基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的改善方法，其聯(lián)合利用了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)移和整合，與非生物學(xué)傳送方法這兩方面的積極貢獻(xiàn)。該改良方法包括為植物細(xì)胞提供期望整合到植細(xì)胞基因組中的鄰接T-DNA邊緣的外源DNA片段，連同至少一個(gè)能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)用于促進(jìn)外源基因整合之農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)的嵌合基因或RNA。依據(jù)本發(fā)明所提供的農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)特別相應(yīng)于VirD1、VirD2、VirC1、VirC2或VirE2。優(yōu)選使用VirD2和VirD1、VirC1、VirC2、VirE2之一或其亞組合的組合。最優(yōu)選單獨(dú)使用VirD2、合用VirD1與VirD2、或合用VirD1、VirD2和VirE2。農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中的表達(dá)可使外源DNA作為有可預(yù)知終點(diǎn)的完整片段進(jìn)行整合。
依據(jù)本發(fā)明，鄰接T-DNA邊緣序列的外源DNA片段可借助電穿孔、微注射、誘導(dǎo)攝入及微粒轟擊等非生物學(xué)手段運(yùn)送到植物細(xì)胞內(nèi)。
依據(jù)本發(fā)明，農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)也可借助非生物學(xué)手段以DNA(可在植物細(xì)胞中表達(dá)的嵌合基因)或RNA(可在植物細(xì)胞中表達(dá)的RNA)的形式被傳送到植物細(xì)胞內(nèi)。
瞬時(shí)傳送外源DNA片段和DNA或RNA形式的農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)，這樣即在已傳送外源DNA之后和外源DNA被整合之前使農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)存在于植物細(xì)胞中。優(yōu)選以單一步驟經(jīng)同時(shí)傳送這些成分達(dá)到這一目的。或者，也可以從在預(yù)先已用能夠表達(dá)農(nóng)桿菌衍生之蛋白的嵌合基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物或細(xì)胞培養(yǎng)物中得到用于定向轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，可再生用分立的DNA片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以產(chǎn)生可穩(wěn)定地表達(dá)所需轉(zhuǎn)基因的可育轉(zhuǎn)基因植物，并作為孟德爾性狀將穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因的遺傳特征傳給后代。
給出下列定義旨在幫助理解本發(fā)明整合文中所使用的術(shù)語(yǔ)“整合”一般是指使傳送到真核細(xì)胞內(nèi)的外源DNA分子穩(wěn)定地整合到真核細(xì)胞的基因組DNA中的過(guò)程。
微粒轟擊文中所使用的術(shù)語(yǔ)“微粒轟擊”是指經(jīng)在微粒上包被核酸并將被包被的微粒推進(jìn)到活細(xì)胞內(nèi)，以將包括DNA和RNA在內(nèi)的核酸傳送到活細(xì)胞中的一般方法(如參見美國(guó)專利No.5,036,006的實(shí)施例1-4；WO 91/02071(描述該方法在轉(zhuǎn)化植物和其細(xì)胞方面的應(yīng)用)；另外參見美國(guó)專利No.5,302,523；Koziel等，生物技術(shù)(Biotechnology)11194-200(1993)(描述以顆粒轟擊法轉(zhuǎn)化Elite近交系玉米)；Vasil等，生物技術(shù)111553-1558(1993)；Weeks等，植物生理學(xué)(Plant Physiol)1021077-1084(1993)；Tanaka，T.等“由微粒轟擊引入的體外合成的mRNA在各種植物花粉中的成功表達(dá)”植物分子生物學(xué)(Plant Mol. Biol.)28337-341(1995)；Vasil等，生物技術(shù)10667-674(1992)；R.等，Walker. L.等，“GUS信使RNA通過(guò)微粒轟擊在植物細(xì)胞中的輸送和表達(dá)”，InVitro Cell Dev. Biol. 2670A-#218(1990)；lida，A.等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)(Appl. Microbiol. Biotechnol)33560-563(1990)；Grordon-Kamm等，植物細(xì)胞(Plant Cell)2603-618(1990)；Fromm等，生物技術(shù)8833-839(1990)；Morikawa，H.等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)31320-322(1989))。
氣溶膠束注射文中所使用的術(shù)語(yǔ)“氣溶膠束注射”是指以氣溶膠束的形式向活細(xì)胞內(nèi)物理傳送核酸的方法(參見美國(guó)專利No.5,240,842)。
電穿孔文中所使用的術(shù)語(yǔ)“電穿孔”是指在生物分子存在下，使細(xì)胞經(jīng)受電脈沖或放電，以向活細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送生物分子，特別是核酸(如DNA和RNA)的方法(例如參見美國(guó)專利No.5,231,019；“植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”一書的第3.3章，Draper，J.等人編著；Blackwell Scientific Publications出版(1988)；Saul，M. W.等，“在有無(wú)或有電穿孔下向原生質(zhì)體直接轉(zhuǎn)移DNA”，植物分子生物學(xué)手冊(cè)(Plant Molecular Biology Manual)Al1-16(1988)；J.等，Oka-da，K.等，“經(jīng)電穿孔向植物原生質(zhì)體中引入功能RNA”，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.)27(4)619-626(1986)；Shillito，R.D.等，“對(duì)植物的高效直接基因轉(zhuǎn)移”，生物技術(shù)31099-1103(1985)；EP-292 435(Ciba-Geigy所有)，EP-392225和WO 93/07278(均為Ciba-Geigy公司所有)。
微注射文中使用的術(shù)語(yǔ)“微注射”是指將生物學(xué)物質(zhì)特別是DNA和RNA直接機(jī)械注射到活細(xì)胞中的方法(例如參見上述“植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”一書的第3.4章；Graessmann，M.等，“組織培養(yǎng)細(xì)胞的微注射”，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)101482-492(1983))。
誘導(dǎo)攝入文中使用的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)攝入”一般是指誘導(dǎo)的由活細(xì)胞攝入生物學(xué)物質(zhì)特別是核酸的方法(例如參見美國(guó)專利No.5,036,006的背景部分)。這類方法具體包括聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的攝入(例如參見上述“植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”一書的第3.2章；Negrutiu等，植物分子生物學(xué)8363-373(1987))和熱休克處理(見美國(guó)專利No.5,231,019)。
VirD文中使用的術(shù)語(yǔ)“VirD”是指由Ti-或Ri質(zhì)粒的侵入性(Vir)D操縱子衍生的基因或蛋白質(zhì)，用于提供T-DNA轉(zhuǎn)移所需的功能(有關(guān)評(píng)述參見Zambryski P. C.，“農(nóng)桿菌植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移的編年史”(Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.)43465-490(1992))。來(lái)自該區(qū)域中的特定基因和相應(yīng)蛋白質(zhì)按照它們?cè)赩irD操縱子上出現(xiàn)的位置以數(shù)字表示。例如，侵入性D操縱子中的第一個(gè)基因定名為“VirD1”，第二個(gè)定名為“VirD2”，等等。
正常情況下，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)移期間，侵入性區(qū)域DNA并不被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，也不整合到植物基因組內(nèi)。而代之以Vir基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用，將T-DNA元件從細(xì)菌Ti或Ri質(zhì)粒中調(diào)動(dòng)到植物基因組中?？稍跊]有喪失功能的情況下，分離不同質(zhì)粒上的T區(qū)域和Vir區(qū)域(De Framond，A. J.等，生物技術(shù)(Bio/Technology)1262-269(1983)；Hoekerna等，自然(Nature)303179-180(1983)；Bevan，M.核酸研究(Nucleic Acids Res.)128711-8721(1984))。
由VirD座的5′側(cè)編碼的兩個(gè)多肽，即VirD1和VirD2在啟動(dòng)T-DNA從農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移所需的DNA加工中起到關(guān)鍵性作用。VirD1和VirD2蛋白質(zhì)是分別由VirD操縱子的第一個(gè)基因和第二個(gè)基因編碼的(Stachel S. E.和Nester E. W.“根癌農(nóng)桿菌A6 Ti質(zhì)粒的Vir區(qū)的遺傳及轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)”EMBO J. 51445-1454(1986))。遺傳學(xué)研究證明，T鏈形成是由VirD操縱子的產(chǎn)物介導(dǎo)的(Yanofsky等，細(xì)胞(Cell)47471-477(1986)；Stachel等，EMBOJ. 6857-863(1987))。特別是已顯示VirD操縱子的第一和第二個(gè)基因編碼T-DNA邊緣切割所需的多肽(De Vos & Zambryski，Mol. Plant Microbe Inter. 243-52(1989)；Filichkin & Gelvin，分子微生物學(xué)(Mol. Microbiol.)8915-926(1993)；Jayaswal等，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1695035-5045(1987)；Porter等，核酸研究157503-7515(1987)；Stachel等，EMBO J. 6857-863(1987))。這一活性導(dǎo)致T-DNA邊緣序列內(nèi)單鏈裂解(切口)的產(chǎn)生(Stachel S. E.等，“在T-DNA從根癌農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移的啟始階段中單鏈DNA分子的產(chǎn)生”，自然(London)322706-712(198)；Yanofsky等，細(xì)胞47471-477(1986)；Wang等，科學(xué)(Sci-ence)235587-591(1987)；Albright等，細(xì)菌學(xué)雜志1691046-1055(1987))。VirD1/VirD2在序列的第三和第四個(gè)堿基之間切割T-DNA邊緣序列。一旦產(chǎn)生出這些有切口的分子，即觀察到有T-DNA下面鏈(T鏈)的游離線性ssDNA拷貝的生成(Stachel等，自然(London)322706-712(1986)；Stachel等，EMBO J. 6857-863(1987))。VirD2仍保持與T-DNA 5′末端的共價(jià)連接(參見Zupan J.R. & Zambryski，P.“T-DNA從農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移”植物生理學(xué)1071041-1047(1995))。
對(duì)已丟失VirD2之C末端50％的VirD2突變體的研究證明，只有VirD2的N末端50％才是切割T-DNA邊緣所必需的。但該突變體不能在被感染的植物上引發(fā)腫瘤。因此C末端似乎在T-DNA于植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移上具有作用(參見Zambryski P. C.，“農(nóng)桿菌植物細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)移的編年史”Ann. Rev. Plant Physiol. PlantMol. Biol. 43465-490(1992))。該區(qū)域含有二分核定位信號(hào)(NLS)(Howard等，細(xì)胞68109-118(1992))。觀察到當(dāng)從VirD2中缺失二分NLS的2堿基結(jié)構(gòu)時(shí)，農(nóng)桿菌的致癌性顯著低降，從而進(jìn)一步證明NLS序列的生物學(xué)關(guān)聯(lián)(Shurvinton，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci.(VSA))89，11837-11841(1992))。
在體外實(shí)驗(yàn)中，單一VirD2可影響單鏈DNA上的位點(diǎn)特異性DNA切割—連接反應(yīng)，表明該蛋白具有DNA切割所需要的催化活性(Pansegrau等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9011538-11542(1993))。已報(bào)導(dǎo)結(jié)合pTiC58的VirD1和VirD的共同作用，足以在體外催化T-邊緣特異性裂解(Scheiffle等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem-istry)2701269-1276(1995)；Jasper等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91694-698(1994))。
已描述了含VirD1提取物的I型拓?fù)洚愇锩富钚?Ghai & Das，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86319-3113(1989))。這一活性歸功于VirD1，并提出其為使DNA被VirD2裂解而松弛所必需的。然而，更進(jìn)一步高度純化的VirD1蛋白質(zhì)并沒有顯示出拓?fù)洚悩?gòu)酶活性(Scheiffle等，生物化學(xué)雜志2701269-1276(1995))。
對(duì)VirD2的序列分析顯示，在攜帶章魚氨酸、胭脂氨酸、或毛根(rhizogenes)型質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株中，N末端有85％是保守的(Hi-rayama等，分子普通遺傳學(xué)(Mol. Gen. Genet.)213229-237(1988)；Wang等，細(xì)菌學(xué)雜志1724432-4440(1990)；Yanofsky等，細(xì)胞47471-477(1986))。C末端只有25％是保守的，但在后30個(gè)氨基酸中與NLS信號(hào)有最高相似性(參見Zambryski的綜述文章(1992))。
VirE文中使用的術(shù)語(yǔ)“VirE”是指從為T-DNA轉(zhuǎn)移提供所需功能的Ti-和Ri質(zhì)粒的侵入性(Vir)E操縱子衍生的基因或相應(yīng)蛋白質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“VirE2”是指已被認(rèn)定為VirE操縱子的VirE2基因產(chǎn)物的單鏈DNA(ssDNA)結(jié)合蛋白質(zhì)(Gielt，C.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)849006-9010(1987)；Citoysky等，科學(xué)240501-504(1988))。據(jù)信VirE2沿其全長(zhǎng)度包被T鏈。該蛋白質(zhì)與單鏈DNA的相互作用是非特異性的。胭脂氨酸VirE2蛋白質(zhì)(Hi-rooka等，細(xì)菌學(xué)雜志1691529-1536(1987))和章魚氨酸VirE2蛋白質(zhì)(Winans等，核酸研究15825-837(1987))含有核定位信號(hào)。據(jù)信VirE2蛋白質(zhì)是T復(fù)合物的主要部分并且其可幫助核運(yùn)輸(參見Zupan & Zambryski，植物生理學(xué)1071041-1047(1995))。表達(dá)VirE2基因的轉(zhuǎn)基因植物能夠補(bǔ)充農(nóng)桿菌的VirE突變體，從而為VirE2蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中起重要作用提供了證據(jù)(參見Zupan & Zambryski，植物生理學(xué)1071041-1047(1995))。
VirC本文所用的術(shù)語(yǔ)“VirC”是指Ti-和Ri質(zhì)粒中編碼兩種多肽，即VirC1和VirC2的VirC座(Yanofsky M. F. & Nester E.W.“根癌農(nóng)桿菌中宿主范圍決定性基因座的分子鑒定”，細(xì)菌學(xué)雜志168237-243(1986))。已顯示該座位可增強(qiáng)農(nóng)桿菌中T-DNA邊緣切割能力(Toro N.等，“超驅(qū)動(dòng)序列在農(nóng)桿菌中T-DNA邊緣切割中的作用”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)85(22)8558-8562(1988))。也已顯示當(dāng)VirD1和VirD2基因的產(chǎn)物為限制性時(shí)，VirC1可提高異源大腸桿菌系統(tǒng)中T鏈產(chǎn)生量(De Vos G. & Zam-bryski P.“農(nóng)桿菌胭脂氨酸特異性VirD1、VirD2和VirC1的表達(dá)和在大腸桿菌中產(chǎn)生T-鏈對(duì)它們的需求”，Molec. Plant Microbe In-ter. 242-52(1989))。雖然已用DNA親和層析法證明VirC1與章魚氨酸超驅(qū)動(dòng)序列相互作用，但有關(guān)VirC1的準(zhǔn)確功能尚不明了。其可與VirD1和VirD2，或與邊緣重復(fù)序列和/或與超驅(qū)動(dòng)序列相聯(lián)系，以促進(jìn)切割和T鏈產(chǎn)生(Toro N.等，“根癌農(nóng)桿菌VirC1基因產(chǎn)物與超驅(qū)動(dòng)序列結(jié)合，一種T-DNA轉(zhuǎn)移增強(qiáng)子”，細(xì)菌學(xué)雜志1716845-6849(1989))。
T-DNA邊緣本文使用的術(shù)語(yǔ)“T-DNA邊緣”是指約25bp的不完全同向重復(fù)DNA序列，借助它們?cè)贒NA片段之兩末端的存在，使該片段被識(shí)別為T-DNA并使農(nóng)桿菌蛋白質(zhì)作用其上。為方便起見，出現(xiàn)于T-DNA之各末端的T-DNA邊緣分別定名為“左”和“右”。右邊緣的共有序列是5′-GNNT-GNCAGGATATATNNNNNNGTNAN-3′(SEQ ID NO1)，左邊緣的共有序列是5′-GGTGGCAGGATATATNNNNNNTGTAAA-3′(SEQ ID NO2)(Jouanin等，植物分子生物學(xué)1275-85(1989))。這些邊緣之間的任何DNA均從農(nóng)桿菌中被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)(參見Zambryski P. C.，“農(nóng)桿菌-植物細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)移的編年史”，Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43465-490(1992))。
對(duì)不同的被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞系中T-DNA包含物的研究揭示，T-DNA向植物基因組內(nèi)的整合常常發(fā)生在(對(duì)于右邊緣而言)或接近于(對(duì)于左邊緣而言)這些邊緣重復(fù)區(qū)(Slightom等，EMBO J. 43069-3077(1985)；Gheysen等，Genes & Dev. 5287-297(1991)；Mayerhofer等，EMBO J. 10697-704(1991)；Ohta等，植物雜志(Plant J.)7157-164(1995)；Koncz等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)868467-8471(1989))。
盡管左和右邊緣之間存在結(jié)構(gòu)相似性，但對(duì)邊緣功能的研究卻顯示T-DNA邊緣的應(yīng)用是有差異的。右邊緣序列的缺失和倒位導(dǎo)致T-DNA轉(zhuǎn)移幾乎完全喪失，而缺失左邊緣重復(fù)區(qū)則幾乎沒有影響(Shaw C.H.等，“胭脂氨酸Ti質(zhì)粒的右側(cè)拷貝25bp重復(fù)序列是腫癌形成所必需的；核酸研究126031-6041(1984)；Jen G.C.& Chilfon M-D，“pTiT37 T-DNA的右側(cè)區(qū)在促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)化中固有活性大于左側(cè)區(qū)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)833895-3899(1986))。遺傳學(xué)研究顯示，T-DNA轉(zhuǎn)移是有極性的，并且極性是由邊緣重復(fù)區(qū)的方向決定的(Wang等，細(xì)胞38455-462(1984)；Peralta和Ream，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)825112-5116(1985))。這可能是由于T-鏈?zhǔn)前从抑磷蟮姆较虍a(chǎn)生的(Albright等，“根癌農(nóng)桿菌T-DNA的加工產(chǎn)生邊緣切口和線性單鏈T-DNA”，細(xì)菌學(xué)雜志，161046-1055(1987))。
T-DNA邊緣的序列環(huán)境在很大程度上影響其活性。圍繞右邊緣的序列增強(qiáng)極性DNA轉(zhuǎn)移，而左邊緣周圍的序列則消弱極性DNA轉(zhuǎn)移(Wang K.等，“T-DNA邊緣重復(fù)單元的序列環(huán)境決定其在T-DNA向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的相對(duì)活性”，分子普通遺傳學(xué)210338-346(1987))。稱為“超驅(qū)動(dòng)”的24bp順式活性序鄰近于章魚氨酸質(zhì)粒的右邊緣(Peralta等，EMBO J. 51137-1142(1986)；Shurviton & Ream，細(xì)菌學(xué)雜志1735558-5563(1991))。甚至當(dāng)定位于遠(yuǎn)離邊緣幾千個(gè)堿基對(duì)時(shí)，超驅(qū)動(dòng)仍刺激T-DNA轉(zhuǎn)移(VanHaaren M. J. J.等，“超驅(qū)動(dòng)是T-區(qū)轉(zhuǎn)移增強(qiáng)子，其刺激根癌農(nóng)桿菌中T-鏈的產(chǎn)生”，核酸研究158883-8997(1987))。但其自身不能介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)移(Peralta，E. G.等，“超驅(qū)動(dòng)，根癌農(nóng)桿菌誘癌質(zhì)粒中的一種T-DNA轉(zhuǎn)移增強(qiáng)子”，EMBO J. 51137-1142(1986)；Van Haaren M. J. J.等，“根癌農(nóng)桿菌章魚氨酸Ti-質(zhì)粒左和右側(cè)T區(qū)邊緣片段的功能分析”，植物分子生物學(xué)895-104(1987))。超驅(qū)動(dòng)序列原來(lái)定位在章魚氨酸Ti質(zhì)粒TL-DNA右邊緣重復(fù)的右側(cè)區(qū)域中。靠近章魚氨酸pTi TR區(qū)域及農(nóng)桿氨酸pRiTL和TR區(qū)域的右邊緣重復(fù)序列存在有相似序列(Slightom等，“TL-DNA毛根農(nóng)桿菌類質(zhì)粒的核苷酸分析，開放讀框的鑒定”，生物化學(xué)雜志，261108-121(1986)；Jouanin等，毛根農(nóng)桿菌株A4轉(zhuǎn)化的Convolvulus arvensis克隆的基因組中TR-DNA/植物接頭的分析”，植物分子生物學(xué)，1275-85(1989))。比較右邊緣附近的序列揭示出一個(gè)稱為核心序列的8bp區(qū)域(5′-TGTTTGTT-3′)，該核心序列以離開各個(gè)右邊緣重復(fù)區(qū)之右側(cè)的不同距離出現(xiàn)。甘露氨酸型pRi8196 T-DNA右邊緣不含任何與超驅(qū)動(dòng)序列相關(guān)的序列，但含有一個(gè)重復(fù)6次的不同8bp序列(5′-ATTAGTTC-3′)(Hansen G.等，“毛根農(nóng)桿菌pRi8196 T-DNA具有甘露氨酸合成和毛根分化相關(guān)功能的DNA序列和定位”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)887763-7767(1991))。該序列在功能上確實(shí)等同于超驅(qū)動(dòng)序列(Hansen G等，“與毛根農(nóng)桿菌pRi8196的右邊緣相鄰的T-DNA轉(zhuǎn)移增強(qiáng)序列”，植物分子生物學(xué)20113-122(1992))?？拷僦彼酺-DNA邊緣沒有密切相似于超驅(qū)動(dòng)序列的序列(Wang K.等，“T-DNA邊緣重復(fù)單元的序列環(huán)境決定其在T-DNA向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的相對(duì)活性”，分子普通遺傳學(xué)338-346(1987))，但這不排除有些存在于該區(qū)域中的序列也起到相類似的作用。
實(shí)施例中使用的25bp右邊緣序列衍生于pTiAch5(VanHaaren，M. J. J.，植物分子生物學(xué)13523-531(1989))。存在于質(zhì)粒pNeoRBluc上的左邊緣衍生于pTiT37(Bevan，核酸研究128711-8721(1984))。
雖然已顯示相鄰于右邊緣的序列能增進(jìn)DNA向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但為了盡可能小地破壞熒光素酶基因的表達(dá)，實(shí)施例中所描述的實(shí)驗(yàn)中還是選擇最小長(zhǎng)度的右邊緣序列。然而，可以使用含有增強(qiáng)子樣序列如超驅(qū)動(dòng)的較長(zhǎng)的右邊緣序列。
可使用如實(shí)施例舉例描述的常規(guī)基因工程技術(shù)來(lái)構(gòu)建能夠在真核細(xì)胞產(chǎn)生用于促進(jìn)目標(biāo)DNA整合的蛋白質(zhì)的嵌合基因。這樣的嵌合基因?qū)⒂煽刹僮鞯剡B接到適當(dāng)調(diào)節(jié)信號(hào)(例如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn))上的蛋白質(zhì)編碼DNA序列組成，所說(shuō)的調(diào)節(jié)信號(hào)指導(dǎo)可操作地連接的編碼序列在真核細(xì)胞中的表達(dá)?，F(xiàn)有技術(shù)中充分描述了這樣的編碼序列和調(diào)節(jié)信號(hào)。為了改善整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以使用在靶真核細(xì)胞中最佳化表達(dá)之編碼序列的合成變體。
如實(shí)施例所述，可以使用制備編碼所需蛋白質(zhì)的可翻譯加帽poly-A mRNA的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)，制備能夠在真核細(xì)胞中產(chǎn)生整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的mRNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解到，可以使用本領(lǐng)域現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以各種方式向植物細(xì)胞提供編碼用于促進(jìn)外源基因穩(wěn)定整合之蛋白質(zhì)的外源DNA或嵌合基因或RNA。對(duì)于將這些成分傳送到真核細(xì)胞內(nèi)的確切方式?jīng)]有嚴(yán)格限制，只要在下述相關(guān)時(shí)間內(nèi)，在帶有外源DNA片段的同一細(xì)胞中產(chǎn)生能促進(jìn)外源DNA穩(wěn)定整合的蛋白質(zhì)即可。
為了達(dá)到促進(jìn)完整形式的外源DNA片段穩(wěn)定整合的有利效果，不一定要在將外源DNA片段提供給真核細(xì)胞之前，或在外源DNA已整合到真核細(xì)胞中之后，于真核細(xì)胞中產(chǎn)生可提供這種效果的蛋白質(zhì)。相反，只要使這些蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中產(chǎn)生，從而使之在外源DNA片段被提供給真核細(xì)胞之后和外源DNA已被整合之前，在瞬時(shí)間內(nèi)以足夠量存在?？墒褂孟蛘婧思?xì)胞提供嵌合基因或可翻譯RNA的任何方法，以使所編碼的蛋白質(zhì)在此相關(guān)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。
作為本文提供的說(shuō)明性實(shí)施例，實(shí)現(xiàn)在相關(guān)時(shí)間內(nèi)以足夠量產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的一種方法是，向真核細(xì)胞中連同外源DNA片段一起導(dǎo)入編碼該蛋白質(zhì)的嵌合基因或可翻譯RNA(即同時(shí)運(yùn)送各成分)。優(yōu)選這一方法是因?yàn)樗簧婕跋虼D(zhuǎn)化真核細(xì)胞的一次性運(yùn)送核酸分子(DNA或DNA和RNA)。這種方法的另一個(gè)潛在的有利方面是，可將其用于實(shí)現(xiàn)在相關(guān)時(shí)間內(nèi)瞬時(shí)產(chǎn)生促進(jìn)整合性蛋白質(zhì)，而不是可對(duì)真核細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和發(fā)育帶來(lái)不利的穩(wěn)定地產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)。
一個(gè)方面，本發(fā)明被用于以鄰接了T-DNA邊緣的完整外源DNA片段穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，達(dá)到模擬農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化的目的。依據(jù)本發(fā)明的這一方面，向待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞提供以下成分(a)期望整合到植物細(xì)胞中去的感興趣的外源DNA片段，所說(shuō)的片段鄰接有一個(gè)或多個(gè)T-DNA邊緣(單一T-DNA邊緣即足以影響T-DNA轉(zhuǎn)移，具體地說(shuō)一個(gè)環(huán)形T-DNA中的一個(gè)邊緣即可具有右和左邊緣功能)；以及(b)至少一個(gè)嵌合基因或RNA，每個(gè)這樣的嵌合基因或RNA都能在植物細(xì)胞中產(chǎn)生農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)單獨(dú)或與其他這種蛋白質(zhì)聯(lián)合可促進(jìn)完整形式的外源DNA片段的穩(wěn)定整合。
按照本發(fā)明的這個(gè)方面，在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)包括但不僅限于由農(nóng)桿菌的Ti或Ri質(zhì)粒的侵入性區(qū)域衍生的蛋白質(zhì)。其中特別是包括VirC1、CirC2、VirD1、VirD2和VirE2。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)最好是VirD2蛋白質(zhì)或VirD2與VirD1或VirE2的組合體，或者與VirD1和VirE2兩者的組合。農(nóng)桿菌衍生的蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中的表達(dá)可使外源DNA作為有可預(yù)測(cè)的終點(diǎn)的完整的片段發(fā)生整合。所得到的被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞具有被整合到其基因組中的相似于農(nóng)桿菌T-DNA的外源DNA片段。
可使用如實(shí)施例中舉例描述的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)構(gòu)建能夠在植物細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明的農(nóng)桿菌衍生蛋白質(zhì)的嵌合基因。這樣一個(gè)嵌合基因?qū)刹僮鞯剡B接到適當(dāng)調(diào)節(jié)信號(hào)(如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn))上的編碼農(nóng)桿菌衍生蛋白質(zhì)的DNA序列，所說(shuō)的調(diào)節(jié)信號(hào)指導(dǎo)可操作地連接的編碼序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)。這樣的編碼序列和調(diào)節(jié)信號(hào)是本領(lǐng)域很容易得到的。GenBank中以登記號(hào)No. M14762提供實(shí)施例中使用的VirD1和VirD2編碼序列。
如實(shí)施例中舉例描述的，可使用制備編碼所需蛋白質(zhì)之可翻譯加帽polyA mRNA轉(zhuǎn)錄本的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)制備能在植物細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明的農(nóng)桿菌衍生蛋白質(zhì)的RNA。
按照本發(fā)明的這個(gè)方面，待整合的外源DNA片段可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員想要以完整形式整合到植物細(xì)胞基因組中的任何DNA片段，例如設(shè)計(jì)以能在植物細(xì)胞中或所得植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)特定生物學(xué)活性RNA(反義RNA或核酶)或有用蛋白質(zhì)的嵌合基因。要求只是該片段是與一個(gè)或多個(gè)T-DNA邊緣鄰接的，這樣其可被識(shí)別并經(jīng)受VirD1和VirD2蛋白質(zhì)的作用。實(shí)施例1中描述這些T-DNA邊緣與外源性DNA片段的結(jié)合。
任何對(duì)通過(guò)一種或多種本領(lǐng)域現(xiàn)有的不同機(jī)制傳送核酸敏感的真核細(xì)胞均可被用作本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法的靶細(xì)胞。其中包括真菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞。已描述了有關(guān)酵母的T-DNA轉(zhuǎn)移(參見Piers等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)931613-1618(1996))。就動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，已顯示了VirD2和VirE2(修飾其定位信號(hào)之后)進(jìn)入細(xì)胞核中的定位(參見Guralnick等，植物細(xì)胞(Plant Cell)8363-373(1996))。向各種動(dòng)物細(xì)胞運(yùn)送核酸的方法是本領(lǐng)域已知的(如參見“分子生物學(xué)現(xiàn)代方法”(Current Protocols in MolecularBiology)，Vol. 1-3；Ausubel，F(xiàn). M等人編著；John Wily & Sons，Inc出版(1995)；具體參見第9章“向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入DNA”)。
所述的轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生完整的一組或一群通常根據(jù)標(biāo)志基因的表達(dá)所鑒定出的被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然后細(xì)胞再生成植物，從而提供整個(gè)被轉(zhuǎn)化植物的組群?？筛鶕?jù)其整合過(guò)程的性質(zhì)鑒定完整一組被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞及再生之被轉(zhuǎn)化植物的特征。根據(jù)本發(fā)明的一群細(xì)胞或植物的特征在于，有5％以上的個(gè)別植物細(xì)胞或植物如同使用農(nóng)桿菌感染使它們被轉(zhuǎn)化一樣，含有借助農(nóng)桿菌右邊緣T-DNA序列連接到基因組DNA上的目的DNA。這一百分?jǐn)?shù)較好是大于10％。實(shí)際觀察到的百分?jǐn)?shù)一般為5-70％，最好為10-50％。正常情況下，一個(gè)組群的被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物是基于10個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。單一物理轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)優(yōu)選產(chǎn)生20、30、40或50個(gè)以上的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。這一組群被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和植物，以及個(gè)別植物細(xì)胞或植物的子代構(gòu)成了本發(fā)明的另一個(gè)主題。
潛在的植物靶包括單子葉和雙子葉植物或各自的植物細(xì)胞，特別是農(nóng)業(yè)上重要的農(nóng)作物如玉米或其他谷類作物如小麥、燕麥、黑麥、高梁、稻米、大麥、谷子、草炭和飼料草等，以及棉花、糖甘蔗、油菜、香蕉、楊樹、胡桃、煙草和大豆。
任何類型或來(lái)源的，作為可按本領(lǐng)域已知的任何一種或多種不同的生物學(xué)和非生物傳送機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)化的靶的植物細(xì)胞，也都可以作為按照本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化的靶。其中包括但不只限于未成熟和成熟的胚胎、花粉、原生質(zhì)體、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞、子葉或其他種子及籽苗部分，以及葉子或葉片。
按本發(fā)明的方法得到的被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞將含有被整合的完整的目標(biāo)外源DNA。該被整合的外源DNA可包括在經(jīng)過(guò)一個(gè)T-DNA插入事件后通常保留在被整合之DNA上的部分T-DNA邊緣序列。可按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用以本發(fā)明的方法制得的被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培養(yǎng)物和能育的轉(zhuǎn)基因植物。
因此本發(fā)明的再一個(gè)方面是產(chǎn)生能育的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所說(shuō)的轉(zhuǎn)基因植物具有以完整形成穩(wěn)定地整合到其基因組中的T-DNA邊緣序列鄰接的外源性DNA片段，該方法包括a)按照本發(fā)明的方法，將所說(shuō)的外源基因轉(zhuǎn)化或整合到植物細(xì)胞的基因組中；并且b)再生步驟(a)的植物細(xì)胞以產(chǎn)生所說(shuō)的能育的轉(zhuǎn)基因植物。
所說(shuō)的能育轉(zhuǎn)基因植物較好選自煙草、棉花、油菜、大豆、玉米、小麥和稻米。
工程化導(dǎo)入到所說(shuō)轉(zhuǎn)基因植物和由之產(chǎn)生的種子中的遺傳性質(zhì)，可通過(guò)有性再生或營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)傳遞下去，并因而可在子代植物中保留和繁殖。一般所說(shuō)的保留和繁殖是指利用為適合特殊目的而發(fā)展的已知農(nóng)業(yè)方法，例如耕作，播種或收獲。也可應(yīng)用專門化的方法，如液體培養(yǎng)或溫室技術(shù)。因?yàn)樯L(zhǎng)的作物容易受到因昆蟲或感染以及雜草植物的競(jìng)爭(zhēng)，所以應(yīng)采取控制雜草、植物病害、昆蟲、線蟲及其他有害條件的措施，以改善產(chǎn)量。
這些措施包括土壤耕作或去除雜草和受感染的植物，以及施用除草劑、殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、促成熟劑和殺昆蟲劑等農(nóng)藥。
利用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物和種子的優(yōu)越遺傳性質(zhì)，可進(jìn)一步在植物繁殖中發(fā)展有改善性質(zhì)的植物，這些性質(zhì)包括對(duì)病蟲害、除草劑或壓力的耐受性、改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、增加產(chǎn)量、或改善因倒伏或落花引起的結(jié)構(gòu)丟失等性質(zhì)。各種繁殖步驟的特征在于人們熟知的選擇待雜交系、對(duì)親本系直接授粉，或選擇適當(dāng)?shù)淖哟参锏热藶楦深A(yù)過(guò)程。依據(jù)所要求的性質(zhì)的不同，采取不同的繁殖手段。有關(guān)技術(shù)是本域技術(shù)人員已知的，其中包括但不只限于雜交、近親繁殖、回交育種、多系繁殖、變種融合、種間雜交、非整倍性技術(shù)等。雜交技術(shù)還包括植物不育化，以借助機(jī)械、化學(xué)或生物化學(xué)手段產(chǎn)生雄性或雌性不育植物。雄性不育植物用不同品系的花粉進(jìn)行異花授粉可保證使雄性不育但雌性能育植物的基因組均勻地獲得親本品系的遺傳性質(zhì)。因此，可使用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物來(lái)培育改良的植物品系，例如該品系增加了除草劑或殺蟲劑處理等常規(guī)方法的效力，或者由于它們的改善的性質(zhì)而得以省去所說(shuō)的方法。或者，因具有最佳化的遺傳“裝備”而獲得具有改善之壓力耐受性的新作物，產(chǎn)生出與那些不能耐受差不多的不良發(fā)育條件的產(chǎn)品有良好品質(zhì)的收獲產(chǎn)品。
在種子生產(chǎn)中，種子的萌芽質(zhì)量和均一性是基本產(chǎn)品特征，而收獲的和農(nóng)民出售的種子的發(fā)芽質(zhì)量和均一性則不是重要的。因?yàn)楹茈y保證一種作物種子中沒有其他作物和雜草種子，所以，為了控制種生病害和產(chǎn)生有良好發(fā)芽率的種子，一些在培育、條件控制及出售純種子方面有經(jīng)驗(yàn)的種子生產(chǎn)者已發(fā)展了相當(dāng)深入的和充分確定的種子生產(chǎn)實(shí)踐。因此，農(nóng)民的共同作法是購(gòu)買符合特定品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)認(rèn)定的種子，而不是使用由他自家的作物收獲的種子。作為種子使用的繁殖材料通常是用保護(hù)劑包被材料如除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺菌劑、殺線蟲劑、殺配子劑或其混合物處理的。常用的保護(hù)劑包被物包括captan、carboxin、thiram(TMTDR)、methalaxyl(ApronR)，和pirimiphos-methyl(ActellicR)等化合物。必要時(shí)，可將這些化合物與本領(lǐng)域常用的其他載體、表面活性劑或施用促進(jìn)佐劑配在一起，以提供對(duì)由于細(xì)菌、真菌或動(dòng)物害蟲所引起損害的保護(hù)作用?？梢酝ㄟ^(guò)用液體配方浸漬繁殖材料，或通過(guò)合用濕或干燥配方包被來(lái)施用保護(hù)劑涂敷物。其他的應(yīng)用方法還可包括在芽或果實(shí)上進(jìn)行定向處理。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是提供新的農(nóng)藝方法，例如上面舉例的，以使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物材料，或轉(zhuǎn)基因種子為特征的方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解到，可利用本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以各種方式為植物細(xì)胞提供該方法的各個(gè)成分(即外源DNA和用于編碼那些促進(jìn)外源DNA整合所需之蛋白質(zhì)的嵌合基因或RNA)。對(duì)向植物細(xì)胞提供這些成分的確切方式?jīng)]有嚴(yán)格限制，只要在如上文敘述的相關(guān)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生能促進(jìn)外源DNA穩(wěn)定整合的蛋白質(zhì)即可。
提供給植物細(xì)胞的各種成分的確切劑量也并不嚴(yán)格，并且可依據(jù)傳送方式及被傳送之成分的劑型而改變。必要時(shí)，技術(shù)人員可按常規(guī)改變所提供之各成分的量，以確定使用特定傳送系統(tǒng)傳送的各成分的最適劑量。實(shí)施例1中描述了一種成功地組合方式，并可以其作為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)最佳化的起始點(diǎn)。
可借助向植物細(xì)胞運(yùn)送核酸的各種已知方法完成向植物細(xì)胞運(yùn)送本發(fā)明各成分的操作，這些已知方法包括但不只限于例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化等生物學(xué)機(jī)制(如參見WO 95/35388，其發(fā)明名稱為“植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)基因植物”)，以及微粒轟擊、電穿孔、微注射、誘導(dǎo)攝入、及氣溶膠束注射等非生物學(xué)機(jī)制。在一優(yōu)選的途徑中，使用單一方法向受體植物細(xì)胞運(yùn)送本方法的所有成分(即外源DNA和用于編碼那些促進(jìn)外源DNA整合之蛋白質(zhì)的嵌合基因或RNA)。
按照本發(fā)明傳送的、編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的mRNA，可望在其被降解之前的限定時(shí)間里在植物細(xì)胞中產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)。從該mRNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可望在其通過(guò)正常細(xì)胞加工過(guò)程被降解之前的確定時(shí)間里保留在植物細(xì)胞中。因此，可將這些蛋白質(zhì)根據(jù)本發(fā)明的方法，以RNA的形式瞬時(shí)傳送給植物細(xì)胞。在持續(xù)存在這些蛋白質(zhì)可能帶來(lái)不利影響的情況下，瞬時(shí)傳送這些蛋白質(zhì)可能是優(yōu)選方式。為達(dá)到這一相同效果，可以以某種使之不能很容易地以功能形式整合到植物細(xì)胞內(nèi)的形式，轉(zhuǎn)送某編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的嵌合基因。
在通過(guò)嵌合基因向植物細(xì)胞提供整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的情況下，較好是將相應(yīng)的嵌合基因連同作為分立的DNA分子的外源DNA片段一起共傳送，但可以聯(lián)合不同的成分并作為單一DNA分子傳送之。作為分離的DNA分子傳送，便可得以改變和優(yōu)化嵌合基因與外源DNA片段的比例。這也可能更便于在分立的分子上操縱這些構(gòu)建體?？赏軌蛞耘c鄰接有T-DNA邊緣之外源DNA定向整合相關(guān)的可檢測(cè)頻率，通過(guò)隨機(jī)整合將這些嵌合基因穩(wěn)定地?fù)饺氲交蚪M中。為了便于將這種隨機(jī)整合過(guò)程與外源DNA的定向整合分開，較好是將其作為與外源DNA分離的單一DNA分子，傳送編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的嵌合基因。使用這種辦法，有可能在與定向整合T-DNA邊緣鄰接之外源DNA的不同座位上整合嵌合基因的拷貝。這樣，就很容易通過(guò)繼后培育由被轉(zhuǎn)化植物衍生的植物，將涉及外源DNA的定向整合與隨機(jī)整合的VirD1和VirD2基因分離開。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用植物病毒載體作為向植物細(xì)胞運(yùn)送編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)之嵌合DNA基因或RNA的載體。
可以從植物DNA病毒復(fù)制子，例如雙粒病毒組復(fù)制子(Ugaki，M.，核酸研究19371-377(1994))和RNA病毒載體(Sablowski，R. M.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)926901-6904(1995))來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建這樣的載體以在植物細(xì)胞中摻入并表達(dá)所需DNA或RNA。因?yàn)檫@些載體一般都可在靶植物細(xì)胞中復(fù)制，所以可以擴(kuò)增工程化構(gòu)建到這些載體中的嵌合基因或RNA，并增加由之產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量。另外，這種類型的病毒載體預(yù)期不整合到植物細(xì)胞的基因組中，因?yàn)槠鋪?lái)源病毒復(fù)制子不發(fā)生這樣的整合。因此，這種方法具有瞬時(shí)大量產(chǎn)生整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)，同時(shí)又減小編碼這些蛋白質(zhì)之嵌合基因整合危險(xiǎn)這兩方面的優(yōu)點(diǎn)。系統(tǒng)性使用這種病毒載體預(yù)先感染待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞也可能是有利的。這種方法因不必共傳送編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的DNA或RNA，從而允許傳送欲以較高量整合的外源性DNA。
也可以使用植物病毒載體作為向植物細(xì)胞運(yùn)送定向整合之外源DNA片段的載體。因?yàn)檫@些載體一般均可在靶植物細(xì)胞中復(fù)制，所以可以以這種方式用它們擴(kuò)增供整合外源DNA片段模板的數(shù)目。
當(dāng)使用植物病毒載體向植物細(xì)胞運(yùn)送待整合的外源DNA片段和編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的嵌合基因時(shí)，可使用同樣的病毒載體運(yùn)送兩種成分或可利用兩種分立的病毒載體。當(dāng)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作為用來(lái)向植物細(xì)胞傳送病毒載體的技術(shù)時(shí)，該方法被稱為“農(nóng)桿菌感染法”(參見Grimsley等，自然325177-179(1987))。
作為共傳遞編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的嵌合基因和外源DNA的一種替代方法，也可以向已經(jīng)含有這些穩(wěn)定地?fù)饺氲狡浠蚪M中之嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送外源DNA?？梢允褂靡詷?biāo)準(zhǔn)技術(shù)用包括編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)的嵌合基因在內(nèi)的DNA分子轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為這種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的來(lái)源。在使用這種辦法時(shí)，可經(jīng)繼后培育由被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞衍生的植物，將涉及外源DNA的定向整合事件與穩(wěn)定整合的嵌合基因分離開(例如參見Peerbolte，R.等，“用DNA轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體非選定的小牛胸腺載體DNA的共轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化DNA序列的減數(shù)分裂分離”，植物分子生物學(xué)5(4)235-246(1985))。
雖然本文是從轉(zhuǎn)化單個(gè)植物細(xì)胞來(lái)描述本發(fā)明的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解到，本發(fā)明所依據(jù)的傳送方法(除微注射外)一般都可應(yīng)用于以細(xì)胞培養(yǎng)物愈傷組織或從整體植物上切下的組織的形式存在的植物細(xì)胞群體。這樣，即可結(jié)合使用已建立的各種技術(shù)和這些傳送方法，以從被轉(zhuǎn)化和未被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的混合群體中鑒別和/或選擇出已被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞(如參見Dekeyser，R.等，“稻轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記的評(píng)述”，植物生理學(xué)90(1)217-223(1989))。這些技術(shù)也可按同樣方式與本發(fā)明合用。就外源DNA成分來(lái)說(shuō)，預(yù)期按照本發(fā)明的方法經(jīng)非生物傳送手段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可造成兩種基本類型的整合事件(1)由促進(jìn)整合的蛋白質(zhì)的存在指引的鄰接T-DNA邊緣之完整外源DNA片段的簡(jiǎn)單插入；以及(2)外源DNA的各個(gè)部分的隨機(jī)插入和所使用的非生物學(xué)運(yùn)送方法所特有的外源DNA的變換。可以利用標(biāo)準(zhǔn)的分子分析工具分析被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的基因組DNA，可以很容易地將這兩種類型的整合區(qū)分開，分析方法包括使用外源性DNA片段或其亞片段作為探針，對(duì)限制性酶切的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡雜交；設(shè)計(jì)以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)以檢測(cè)完整形式的外源DNA片段的存在。對(duì)于包含兩種類型插入的植物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，可以用傳統(tǒng)的培育方法分離開由之衍生的轉(zhuǎn)基因植物中的這些插入事件。如使用這些手段，即可鑒定出利用本發(fā)明產(chǎn)生的、簡(jiǎn)單插入了接有T-DNA邊緣之完整外源DNA片段的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物，并用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培養(yǎng)物和/或轉(zhuǎn)基因植物及子代。
應(yīng)明確的是，本發(fā)明不只限于改善的基于農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的整合系統(tǒng)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明修飾那些利用整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)和類似于Vir蛋白及T-DNA邊緣的識(shí)別序列的其他系統(tǒng)，以改善定向轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞中簡(jiǎn)單整合事件的發(fā)生頻率。例如，所收集到的數(shù)據(jù)提示，在從農(nóng)桿菌向植物轉(zhuǎn)移T-DNA與質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)胞接合之間存在著密切關(guān)聯(lián)。已發(fā)現(xiàn)了(1)T-邊緣的切口區(qū)和incP轉(zhuǎn)移起點(diǎn)之間；(2)VirD操縱子和松弛酶(relaxase)操縱子(Tral/TraJ)的基因族之間的序列關(guān)聯(lián)性。Tra1和VirD2以及它們的靶，即RP4oriT切口區(qū)和T邊緣重復(fù)區(qū)享有顯著的相似性(參見WO 88/03564，其發(fā)明名稱為“植物轉(zhuǎn)化”)。在體外，Tra1和VirD2各自足以在帶有其各自的相應(yīng)切口位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸中產(chǎn)生缺口(參見Pansegrau等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9011538-11542(1993))。在過(guò)量切割產(chǎn)物存在下，Tra1和VirD2也可催化連接兩個(gè)單鏈DNA小片段這種對(duì)立反應(yīng)。VirD2還能夠催化裂解oriT。也已發(fā)現(xiàn)雙粒病毒組Rep蛋白或參予細(xì)菌噬菌體和質(zhì)粒的滾環(huán)復(fù)制的蛋白質(zhì)，以及另一方面參予細(xì)菌接合DNA轉(zhuǎn)移或參予將T-DNA從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中的蛋白質(zhì)之間的功能相似性(Heyraud-Nitschke F，等，核酸研究910-916(1995))。


圖1(A-B)顯示用于實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。實(shí)施例1的材料和方法部分中描述了這些質(zhì)粒的構(gòu)成成分。RB相當(dāng)于25bp邊緣序列。其中所示限制性位點(diǎn)如下E＝EcoRI；P＝PstI。
圖2提供質(zhì)粒pNeoRBLuc的圖解說(shuō)明。LB，左邊緣；RB，右邊緣。圖中上方方框指示用于轉(zhuǎn)化子Southern印跡分析的探針。所指出的限制性位點(diǎn)為E＝EcoRI；P＝Pst；X＝XbaI；H＝HindIII?！癗OS”表示胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子?！癗PT II”表示新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II開放讀框?！癗OS T”表示胭脂酸合酶終止子?！癈aMV35S”表示來(lái)自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子?！癓US”代表熒光素酶的開放讀框?！?5S T”代表CaMV35S轉(zhuǎn)錄物的終止子。
圖3提供用pNeoRBluc、p35SD1和p35SD2轉(zhuǎn)化后對(duì)植物DNA靶點(diǎn)的序列分析。數(shù)字是靶克隆指定序號(hào)。pNeoRBluc攜帶的右邊緣序列用小寫字母寫出(Rb.接頭行)。片段1、2a、3和5的植物靶序列各自顯示與煙草的PS II(X62426，nt908)有100％同源性；與煙草的Ntp II 10(X70088，nt573)有100％同源性，與煙草的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(X02353，nt2174)有100％同源性，并與矮牽?；ǖ娜~綠素結(jié)合蛋白(M21317，nt1013)有80％同源性。
圖4(A-J)提供用于實(shí)施例3和4中的質(zhì)粒圖。實(shí)施例3的“材料和方法”部分中描述了所用的縮寫字。
圖5(A-B)圖示實(shí)施例5中所用的質(zhì)粒pwAdhD1、pwAdhD2、pwBarRBLuc、和pBARRBLuc。
圖6圖解顯示質(zhì)粒pC1B1711(見實(shí)施例1)。
圖7圖解顯示質(zhì)粒pC1B1711δB(見實(shí)施例7)。
圖8圖解顯示質(zhì)粒pC1B1711δB-H，N(見實(shí)施例7)。
圖9圖解顯示質(zhì)粒pC1B1711-H，N-B(見實(shí)施例7)。
圖10圖解顯示質(zhì)粒pC1B1711-H，N(見實(shí)施例7)。
圖11圖解顯示質(zhì)粒pBS-NC(見實(shí)施例7)。
圖12圖解顯示質(zhì)粒pBS-NC-RB(見實(shí)施例7)。
圖13圖解顯示質(zhì)粒UbiPATdI(見實(shí)施例7)。
圖14圖解顯示質(zhì)粒LB.UbiPATdI(見實(shí)施例7)。
圖15圖解顯示質(zhì)粒pAVMl(見實(shí)施例7)。
圖16圖解顯示質(zhì)粒p35SD2(見實(shí)施例8)。
圖17(A-B)圖解顯示由含有VirD2開放讀框之p35SD2的EcoRI片段制備片段A-C(見實(shí)施例8)。
圖18圖解顯示質(zhì)粒pTC182(見實(shí)施例8)。
圖19圖解顯示質(zhì)粒pTc182-A(見實(shí)施例8)。
圖20圖解顯示質(zhì)粒ptC182-A-B(見實(shí)施例8)。
圖21圖解顯示質(zhì)粒pUC21(見實(shí)施例8)。
圖22圖解顯示質(zhì)粒PC21-X(見實(shí)施例8)。
圖23圖解顯示質(zhì)粒ppUC21-C(見實(shí)施例8)。
圖24圖解顯示質(zhì)粒pUC21-VirD2(見實(shí)施例8)。
圖25圖解顯示質(zhì)粒T7polyA(見實(shí)施例8)。
圖26圖解顯示質(zhì)粒T7virD2 poly A(見實(shí)施例8)。
實(shí)施例這里使用的是J. Sambrook，E. F. Fritsch和T. Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory manual，ColdSpring Harbor laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989))和T. J.Silhavy，M. L. Berman，和L. M. Enquist，基因融合實(shí)驗(yàn)(Experi-ments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratoy，ColdSpring Harbor，WY(1984))描述的，本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)。
實(shí)施例1植物細(xì)胞的“農(nóng)桿菌轟擊”(agrolistic)轉(zhuǎn)化生物轟擊(biolistic)運(yùn)送VirD1和VirD2基因和T-DNA鄰接的可選擇標(biāo)記基因后在植物中產(chǎn)生的T鏈整合A.摘要在傳送到宿主植物細(xì)胞中，并將T-DNA插入到植物DNA中之前，須有從根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中切割T鏈所需的侵入性基因VirD1和VirD2。我們利用了質(zhì)粒DNA的生物轟擊傳送來(lái)試驗(yàn)在植物中借助VirD1和VirD2對(duì)T-DNA邊緣序列的結(jié)合和/或位點(diǎn)特異性切割。用3種質(zhì)粒的混合物包被金微粒，三種質(zhì)粒分別含有在CaMV35S啟動(dòng)子控制下的VirD1和VirD2編碼區(qū)、以及含有插入到CaMV35S啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間的右邊緣序列的試驗(yàn)基因。我們檢測(cè)了熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)，以檢驗(yàn)試驗(yàn)基因的完整性和轉(zhuǎn)錄可行性。在煙草和玉米細(xì)胞中，熒光素酶基因瞬時(shí)表達(dá)受到VirD1和VirD2質(zhì)粒共傳送的強(qiáng)有力抑制。當(dāng)VirD質(zhì)粒對(duì)試驗(yàn)基因質(zhì)粒的比例增加時(shí)抑制作用更大。邊緣序列只取一種方向時(shí)出現(xiàn)顯著抑制作用，即所取方向應(yīng)導(dǎo)致VirD2切割作為熒光素酶mRNA之模板的DNA鏈。單獨(dú)VirD1或單獨(dú)VirD2的作用較小。帶有可選擇標(biāo)志和熒光素酶試驗(yàn)基因的轉(zhuǎn)化載體加上VirD質(zhì)粒的混合物進(jìn)行的生物轟擊傳送產(chǎn)生了中等頻率的“農(nóng)桿菌轟擊”插入段，其與植物DNA的右接點(diǎn)正好有預(yù)期的T-DNA插入所預(yù)期的序列。我們?cè)谀承┺D(zhuǎn)化子品系中同時(shí)發(fā)現(xiàn)生物轟擊和“農(nóng)桿菌轟擊”事件。
B.引言經(jīng)顆粒轟擊進(jìn)行基因傳送在植物轉(zhuǎn)化中已成為有廣泛應(yīng)用的被普遍接受的技術(shù)(參見Ahl Goy和Duesing，1995)。例如，已用這一技術(shù)開發(fā)了對(duì)歐洲谷物鉆蛀蟲有抗性的玉米(Koziel等，1993)。在產(chǎn)品開發(fā)過(guò)程中，必須確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)及它們的穩(wěn)定性。最合乎需要的產(chǎn)物應(yīng)是有單一的簡(jiǎn)單插入段并且沒有外加質(zhì)粒載體DNA。但在以顆粒轟擊法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化中，有一種包含質(zhì)粒載體所導(dǎo)入基因的多拷貝整合的傾向(Klein等，1988；Klein等，1989；Gor-don-Kamm W. J.等，1990；Vasil等，1992；Wan Y.和Lemaux P，1994)。這個(gè)過(guò)程似乎在整合之前或整合期間促進(jìn)質(zhì)粒多聯(lián)體化。在生物轟擊轉(zhuǎn)化期間插入的多個(gè)拷貝一般是遺傳上連鎖的，并且在繼后繁殖期不能被分離。
轉(zhuǎn)基因的多拷貝可通過(guò)幾種機(jī)制致使它們表達(dá)不穩(wěn)定(參見Matzke M.和Matzke A.，1995)轉(zhuǎn)基因的多拷貝可相互作用通過(guò)稱為“共抑制”或“基因沉默”的后遺傳機(jī)制彼此失活相關(guān)的宿主基因。此外，同源重組可引起多拷貝的遺傳不穩(wěn)定性。鑒于這些理由，減少被插入之轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，對(duì)于維持導(dǎo)入之基因的精確度應(yīng)是有利的。
通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所導(dǎo)入的外來(lái)基因的整合模式一般明顯不同于經(jīng)顆粒轟擊植物細(xì)胞所造成的整合(Chilton，1993)。經(jīng)生物轟擊傳遞所產(chǎn)生的完整和重排的轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，通常大大超過(guò)借助農(nóng)桿菌系統(tǒng)導(dǎo)入植物中的轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。農(nóng)桿菌已逐漸形成一種使被轉(zhuǎn)移基因定位在質(zhì)粒，即所謂腫瘤誘導(dǎo)(Ti)或毛根誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒上的機(jī)制(參見kado，1993)。Ti或Ri質(zhì)粒DNA的稱為T-DNA(被轉(zhuǎn)移DNA)的特定片段，借助25bp同向重復(fù)的邊緣序列側(cè)接到Ti/Ri質(zhì)粒上，使該片段從細(xì)胞中移向植物細(xì)胞核并逐漸被整合到植物的染色體DNA中。DNA轉(zhuǎn)移的一個(gè)精細(xì)機(jī)制是由一系列侵入性(vir)基因編碼的(參見Zambryski，1992)。vir基因的激活導(dǎo)致在T-DNA邊緣重復(fù)區(qū)內(nèi)產(chǎn)生位點(diǎn)物異性缺口，并產(chǎn)生相應(yīng)于T-DNA底鏈的線性單鏈DNA分子(T鏈)。切割需要由VirD操縱子編碼的兩種多肽VirD1和VirD2(Stachel和Nester，1986；Stachel等，1987；Herrera-Estrella等，1988；DeVos和Zambryski，1989；Dur-renberger等，1989；Howard等，1989；Koukolikova-Nicola等，1993)。VirD1表現(xiàn)有DNA松弛活性(Ghai和Das，1990；Filichkin和Gelvin，1993)，而VirD2則具有裂解邊緣序列下鏈的內(nèi)切核酸酶活性(Stachel等，1986；Yanofsky等，1986；Wang等，1987；Albright等，1987)。體外實(shí)驗(yàn)也已證明，純化的VirD2特異性地裂解單鏈DNA(Pansegrau等，1993；Jasper等，1994)。超螺旋DNA和松弛的雙鏈DNA都不是單獨(dú)用VirD2體外裂解的底物(Jasper等，1994)。
VirD2通過(guò)酪氨酸殘基29(Durrenberger等，Vogel和Das，1992；Pansegrau等，1993)共價(jià)連接到帶缺口DNA的5′末端上(Ward和Barnes，1988；Young和Nester，1988；Howard等，1989)。在左邊緣序列處的第二次裂解導(dǎo)致T鏈的釋放。另外，T鏈還沿著其長(zhǎng)度被單鏈結(jié)合蛋白VirE2包被。VirD2和VirE2含有據(jù)信可將T鏈導(dǎo)入植物細(xì)胞核中的核定位信號(hào)(NLS)(Herrera-Estrella，1990；Howard等，1992；Shurvinton等，1992；Tinland等，1992；Rossi等，1993)。在煙草中和玉米中，VirD2和VirE2的NLS已被識(shí)別(Citovsky等，1994)，但它們的效率則取決于組織的發(fā)育階段。最近資料支持這樣的觀點(diǎn)，即VirD2可能參予T鏈之5′末端與植物DNA的連接(Tinland等，1995)。
在目前的研究中，我們已建立了一種新的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，其中結(jié)合了農(nóng)桿菌系統(tǒng)和已證明有高效率的生物轟擊和用于各種農(nóng)作物植物的其他傳送系統(tǒng)的某些優(yōu)點(diǎn)。其被設(shè)計(jì)用于整合不帶有載體序列的、作為T-DNA插入物的目的基因，并用于控制拷貝數(shù)。我們的辦法是使用與轉(zhuǎn)化質(zhì)粒共傳送的VirD1和VirD2的植物表達(dá)盒，其中所說(shuō)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒含有鄰接可選擇標(biāo)志的T-DNA邊緣序列。我們發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)表達(dá)的VirD1和VirD2基因產(chǎn)物確實(shí)可在植物中切割T-DNA邊緣序列，并在生物轟擊傳送后產(chǎn)生T-DNA型插入事件(“農(nóng)桿菌轟擊”事件)。
C.材料和方法1.質(zhì)粒圖1中給出了用于本研究的所有質(zhì)粒插入片段的結(jié)構(gòu)。pC1B1711是含有花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶基因的pUC衍生物。
pC1B1711的構(gòu)建pC1B1711含有連接到35S表達(dá)信號(hào)上的熒光素酶基因。在插入熒光素酶基因之前，去掉單一的限制性位點(diǎn)Pstl和Narl修飾親本載體pClB710(Rothstein等，1987)。在相鄰的SalI和Sphl限制性位點(diǎn)處切割除去位于CaMV啟動(dòng)子上游的Pstl位點(diǎn)，并連接合成的接頭[5′-TCGACATG-3′]以造成Sall位點(diǎn)并除去Sphl和Pstl位點(diǎn)。用Narl和Ndel切割掉位于CaMV聚腺苷酸化序列3′側(cè)的Narl位點(diǎn)，即切掉一個(gè)52bp片段，然后進(jìn)行Klenow消化和平端連接。質(zhì)粒pJD204(Ow等，科學(xué)234856-859(1986))和pDO0432(De Wet等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol. Cell. Biol.)7(2)725-737(1987))分別由Donald Helinski博士和Steve Howell博士提供。將含有熒光素酶基因、22bp熒光素酶5′UTL和約130bp3′末端的pJD204中的1826bp Hind III-Bam HI片段與從寡聚物5′-GATCCCTGCAGA-3′(SEQ ID NO3)和5′-AGCTTCTGCAGG-3′(SEQ ID NO4)制得的合成接頭連接到pClB710的BamHI位點(diǎn)中，以使之在35S啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間。
將熒光素酶基因片段插入到修飾的pClB710載體中得到pClB1701。用Pst和Narl消化pClB1701，并將所得質(zhì)粒與含有基因前導(dǎo)序列和5′末端的接頭R5B1連接以構(gòu)建pC1B1711。
接頭R5B1含有從下列互補(bǔ)寡聚體制得的片段5′-ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGATCCCTGCAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATG-3′(SEQ ID NO5)和5′-GATCCATAGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTGCAGGGATCCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGAT-3′(SEQ ID NO6).
為了導(dǎo)入T-DNA邊緣，將兩個(gè)相應(yīng)于LBA5269(Van Haaren等，1989)之右邊緣序列的合成寡核苷酸退火以產(chǎn)生雙鏈體5′-ATCCGGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3′(SEQ IDNO7)。將此側(cè)翼有BamHI-PstI位點(diǎn)的雙鏈體插入pC1B1711啟動(dòng)子和熒光素酶編碼序列之間的相應(yīng)位點(diǎn)中，得到pRB(+)Luc。在pRB(-)Luc中，以相對(duì)于啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)相反的方向引入右邊緣序列。設(shè)計(jì)用來(lái)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞并含有左邊緣序列、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptII)和熒光素酶基因的pNeoRBLuc，其中右邊緣被插入在pRB(+)Luc的啟動(dòng)子和熒光素酶編碼之間(圖2)。從質(zhì)粒pBin19中切掉作為2.2Kb SacII-Hind III片段的由nos(胭脂氨酸合酶)啟動(dòng)子控制的nptII基因(Bevan，1984)。從pBin19中切掉作為Bgl II-EcoRI片段的左邊緣序列。將這兩個(gè)片段插入到pRB(+)Luc的Xba I-Hind III位點(diǎn)中。pNeoLuc是在CaMV35S啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間沒有插入右邊緣序列的pNeoRBluc的等同物。
將得自pTiA6的VirD1和VirD2亞克隆到由CaMV35S啟動(dòng)子(0.5Kb)、Adh1第一內(nèi)含子(0.5Kb)，和胭脂氨酸合成酶(nos)聚腺苷酸化區(qū)域(0.25Kb)組成的(圖1)表達(dá)載體pMF6(Callis等，1987)中。將得自pAD1187(Ghai和Das，1989)的相當(dāng)于VirD1編碼序列的0.6Kb EcoRI-Pst1克隆到pMF6中產(chǎn)生p35SAdhD1。從pAD1190(Ghai和Das，1989)切下作為1.8Kb EcoR I片段的VirD2編碼序列，并克隆在pMF6中。所得到的質(zhì)粒p35SAdhD2和p35SAdhD2(rev)以有義和反義方向上攜帶VirD2編碼區(qū)。從p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhD2(rev)刪除Adh1內(nèi)含子以分別產(chǎn)生用于煙草組織實(shí)驗(yàn)的p35SD1、p35SD2和p35SD2(rev)。
pGUS是含有處于CaMV35S啟動(dòng)子控制下的β-葡糖醛酸酶(GUS)編碼序列GUS基因和蓖麻子過(guò)氧化氫酶基因內(nèi)含子的pUC衍生物(Ohta等，1990)。
2.植物材料玉米懸液細(xì)胞玉米(Zea mays L.)懸液培養(yǎng)物最初是從選自B73相關(guān)優(yōu)秀品系的未成熟胚的冷凍保存的胚發(fā)生II型愈傷組織制得的。將大約1g冷凍保存的愈傷組織(DiMaio和Shillito，1992)加到50ml添加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6液體培養(yǎng)基(Chu等，1975)(2N63S)中。于25℃暗處，在軌道振蕩器上以150rpm保溫培養(yǎng)物。每隔7天將1ml填充容積的細(xì)胞移入50ml新鮮2N63S液體培養(yǎng)基中，以傳代培養(yǎng)懸液培養(yǎng)物。
從迅速生長(zhǎng)3天的培養(yǎng)物中取出用于轟擊實(shí)驗(yàn)的玉米細(xì)胞懸液。轟擊前，在7cm濾紙(Whatman，N°4)上真空過(guò)濾約0.5ml堆積體積的細(xì)胞。然后將濾紙移到含有120g/L蔗糖的脫乙酰吉蘭糖膠固化的N6培養(yǎng)基上。使鋪敷的細(xì)胞在25℃下保持4小時(shí)，然后用于轟擊實(shí)驗(yàn)。轟擊后，將平皿于25℃下保溫24小時(shí)。
煙草懸液細(xì)胞使Nicotiana tabacum細(xì)胞系NT-1(An，1985)生長(zhǎng)于添加了2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige and Skoog)(MS3S)中。每周取5ml細(xì)胞接種物加于500ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的100ml新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置于125rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器上，27℃保溫。分取0.5ml的4天培養(yǎng)物分散于無(wú)菌濾紙(Whatman N°4)上，然后移至添加了12％蔗糖的MS培養(yǎng)基上，并于室溫下保持4小時(shí)后用于轟擊實(shí)驗(yàn)。
3.轟擊植物細(xì)胞用沉積有質(zhì)?；旌衔锏慕鹞⒘＾Z擊組織。所有情況下均以pGUS質(zhì)粒DNA作為玉米和煙草實(shí)驗(yàn)的內(nèi)部對(duì)照。為進(jìn)行共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，所用金顆粒分別攜帶有等質(zhì)量的各種質(zhì)粒DNA(每個(gè)靶平皿上各加0.5μg質(zhì)粒DNA)，或者摩爾比例為2∶1的攜帶VirD1和VirD2基因的質(zhì)粒與底物質(zhì)粒。為進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，所用轉(zhuǎn)化混合物含有5∶1摩爾比例的攜帶VirD1和VirD2基因的質(zhì)粒對(duì)nptII選擇質(zhì)粒。轟擊每個(gè)靶平皿的每一等份質(zhì)?；旌衔镉?.1μg選擇標(biāo)志物和0.5μg p35SD1或p35SD2質(zhì)粒DNA組成。以10μl的總體系混合適當(dāng)量的每種DNA，并用50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亞精胺游離堿沉淀之，以使之沉淀于50μl 1.0μm金微粒(60μg/ml)上。用PDS-1000He基因槍裝置(Dupout)進(jìn)行微粒轟擊，其中使用在制動(dòng)屏蔽架下方8cm處帶有樣品的1500psi破裂盤。
4.穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化煙草懸液細(xì)胞轟擊后24小時(shí)，將煙草細(xì)胞移至帶有300μg/ml卡那霉素的MS3S平皿上。將轟擊后約3周出現(xiàn)的獨(dú)立微小愈傷組織移至加有300μg/ml卡那霉素的新鮮平皿上。在同樣培養(yǎng)基上進(jìn)行兩次再培養(yǎng)后，將大約100mg煙草細(xì)胞接種于加有300μg/ml卡那霉素的25ml液體培養(yǎng)基中。
5.瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)按照供應(yīng)商(Luciferase assay system，Promega)推薦的方法檢測(cè)組織提取物中的熒光素酶。使用GUS-Light試劑盒(Tropix)，以化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法測(cè)定β-葡糖醛酸酶活性。使用2001型AnalyticalLuminescence發(fā)光計(jì)于25℃下積分10秒測(cè)定以光單位表示的熒光素酶和β-葡糖醛酸酶活性。
6.DNA提取和Southern印跡雜交接種后10天過(guò)濾收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并在液氮中冷凍。按已述方法(Hall等，1991)分離DNA。取大約5μg基因組DNA進(jìn)行EcoRI消化。在0.7％瓊脂糖凝膠上分離后，將DNA轉(zhuǎn)移到加有膜的基因篩上，并按照制造商所述的條件(NEN Research Products，DuPont)進(jìn)行雜交。使用Pharmacia的寡標(biāo)記試劑盒，用[a-32P]dCTP標(biāo)記DNA探針。neo探針相當(dāng)于nptII基因的2Kb PstI片段(圖2)。luc探針相當(dāng)于熒光素酶基因的0.7Kb Xba-EcoRI片段(圖2)。用0.1％SDS于100℃下沖洗5分鐘以去除膜上的探針。
7.T-DNA/植物DNA接合區(qū)的克隆用EcoRI消化轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織的DNA(30μg)并在1％Sea-plague瓊脂糖凝膠(FMC)上進(jìn)行制備性電泳。從凝膠上切下相當(dāng)于待克隆片段大小的瓊脂糖凝膠片，并用QlAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖中提取DNA。然后將所得片段克隆到pUC19的去磷酸化EcoRI位點(diǎn)中。以電穿孔法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞。使用0.5Kb CaMV35S啟動(dòng)子片段作為探針，以菌落濾膜雜交法鑒定含有正確插入片段之質(zhì)粒的菌落。使用定位在CaMV35S啟動(dòng)子中(距右邊緣序列106 bp處)的引物5′-CCACTATCCTTCGCAAGACC-3′(SEQ ID NO8)分析帶植物DNA與供體質(zhì)粒DNA接頭處的序列。
D.結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了研究在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，是否VirD1和VirD2基因產(chǎn)物能切割T-DNA邊緣序列，我們構(gòu)建了在啟動(dòng)子和熒光素酶基因的編碼區(qū)之間含有底物T-DNA邊緣序列的試驗(yàn)質(zhì)粒pRB(+)Luc。在CaMV35S啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間插入右邊緣序列并不干擾熒光素酶基因在植物組織中的表達(dá)(數(shù)據(jù)未出示)。以通過(guò)VirD1和VirD2基因產(chǎn)物引入位點(diǎn)特異性切割這種方式安排邊緣序列的位置，應(yīng)導(dǎo)致作為熒光素酶mRNA之模板的DNA鏈的斷裂，并降低熒光素酶轉(zhuǎn)錄物及酶的產(chǎn)生量。用pRB(+)Luc和攜帶VirD基因的質(zhì)粒共轟擊植物細(xì)胞后，在邊緣序列處的任何切割都可經(jīng)檢測(cè)熒光素酶活性而定量檢測(cè)出來(lái)。然而，也可以根據(jù)VirD1和VirD2基因產(chǎn)物在位于啟動(dòng)子和編碼序列之間的邊緣序列處的結(jié)合(該結(jié)合可抑制熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄)來(lái)解釋熒光素酶活性的降低。因此可試驗(yàn)在與啟動(dòng)子相反的方向上含有邊緣序列的質(zhì)粒pRB(-)Luc，以在這兩種可能性間作出區(qū)別。如果熒光素酶活性的降低是因VirD基因產(chǎn)物與邊緣序列結(jié)合所造成的，則既使以相反方向帶有邊緣序列時(shí)也可能觀察到這種降低。
因?yàn)楸仨氃赩irD1和VirD2蛋白能切開邊緣序列之前就要在被轟擊的植物細(xì)胞中瞬時(shí)產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)，所以推測(cè)這種切割應(yīng)在熒光素酶基因已開始轉(zhuǎn)錄之后發(fā)生。因此熒光素酶活性檢測(cè)可能會(huì)低估植物細(xì)胞中的VirD1和VirD2活性。
為了在植物細(xì)胞中表達(dá)VirD1和VirD2基因，應(yīng)將其各自的開放讀框(ORF)放在CaMV35S啟動(dòng)子的控制之下。也以相對(duì)于啟動(dòng)子的反義方向引入VirD2 ORF作為對(duì)照。因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)當(dāng)存在玉米醇脫氫酶1內(nèi)含子1時(shí)可增加基因在玉米中的表達(dá)(Callis等，1987)，我們還構(gòu)建了用于玉米中瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的p35SAdhD1和p35SAdhD2(分別含有插入到啟動(dòng)子和VirD1及VirD2編碼序列之間的內(nèi)含子)。每次轟擊中均包括有表達(dá)β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的質(zhì)粒pGUS，以其作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，以監(jiān)控DNA轉(zhuǎn)移的效率。在所有情況下，均以熒光素酶對(duì)GUS活性的比例來(lái)表示報(bào)導(dǎo)分子的活性，以校正DNA傳送效率的變異性。
2.檢測(cè)植物中VirD1和VirD2基因產(chǎn)物裂解邊緣序列的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)法首先用我們的與VirD1和VirD2基因共傳送的試驗(yàn)質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化玉米和煙草細(xì)胞，以試驗(yàn)它們各自通過(guò)T-DNA邊緣序列影響傳錄的能力。在將p35SD1 DNA或p35S AdhD1 DNA各自與pRB(+)LUC DNA共傳送后，在煙草和玉米組織中觀察到熒光素酶對(duì)GUS活性的80％對(duì)照水平(參見下列表1和表2)。p35SD2DNA(煙草)或p35SAdhD2 DNA(玉米)與pRB(+)LUC DNA共傳送后可見熒光素酶對(duì)GUS活性分別有50％和80％的對(duì)照水平(見表1和表2)。
表1VirD1和VirD2在煙草懸液細(xì)胞中的活性質(zhì)粒+pGUS 均值 ±SD ％對(duì)照pRB(+)LUC 1.36 ±0.06 -pRB(+)LUC+p35SD1 0.98 ±0.0372pRB(+)LUC+p35SD2 0.69 ±0.0750pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(1∶1∶1) 0.27 ±0.0520pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(1∶2∶2) 0.14 ±0.0510pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(rev)(1∶1∶1) 1.08 ±0.1380pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(rev)(1∶2∶2) 1.13 ±0.0883pRB(-)LUC 1.40 ±0.14 -pRB(-)LUC+p35SD1 1.33 ±0.1395pRB(-)LUC+p35SD2 1.19 ±0.1285pRB(-)LUC+p35SD1+p35SD2 1.56 ±0.38112表1.煙草細(xì)胞中VirD1和VirD2的活性。質(zhì)粒構(gòu)建體如圖1中所述，并用基因槍裝置運(yùn)送到煙草細(xì)胞中。括號(hào)間的數(shù)目表示質(zhì)粒的摩爾比。保溫24小時(shí)后，進(jìn)行組織勻漿化并檢測(cè)酶活性?；钚砸詿晒馑孛?Luc)對(duì)β-葡糖醛酸酶(Glu)的比例來(lái)表示。分析每次獨(dú)立的轟擊并且數(shù)據(jù)以6次重復(fù)的平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差給出。根據(jù)熒光素酶對(duì)β-葡糖醛酸酶活性的比例，對(duì)使用對(duì)照質(zhì)粒觀察到的那些活性確定出百分(％)對(duì)照值。
表2玉米懸液細(xì)胞中VirD1和VirD2基因的活性質(zhì)粒+pGUS 均值±SD ％對(duì)照pRB(+)LUC 1.26±0.27 -pRB(+)LUC+p35SAdhD1 1.32±0.28 105pRB(+)LUC+p35SAdhD2 1.02±0.15 81pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶1∶1) 0.11±0.03 8.7pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶2∶2) 0.006 ±0.007 0.5pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(rev)(1∶1∶1) 0.99±0.20 78.6pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(rev)(1∶2∶2) 0.96±0.26 76表2.玉米細(xì)胞中VirD1和VirD2的活性。按表1的腳注中所述方式表示活性。
兩種vir基因一起似乎具有協(xié)同效應(yīng)。用基因槍裝置共傳送等量的pRB(+)LUC DNA與攜帶VirD1和VirD2基因的質(zhì)粒(比例1∶1∶1)，在煙草中使熒光毒酶活性減低為約對(duì)照組的20％(表1)，而在玉米細(xì)胞中則降低至10％(表2)。在高VirD1和VirD2質(zhì)粒對(duì)試驗(yàn)質(zhì)粒比例(2∶2∶1)時(shí)，煙草細(xì)胞中熒光素酶活性進(jìn)一步降低至約10％(表1)，玉米細(xì)胞中至約1％(表2)。使用以反義方向攜帶VirD2編碼序列的對(duì)照質(zhì)粒p35SD2(rev)(煙草)或p35SAdhD2(玉米)所作的類似實(shí)驗(yàn)與單帶VirD2者所得的結(jié)果相似(表1和表2)。這證明我們的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)GUS基因是改變所傳送的總DNA濃度時(shí)所產(chǎn)生影響的有效對(duì)照物。
顛倒T-DNA邊緣在試驗(yàn)質(zhì)粒中的朝向可消除或大大降低VirD1和/或VirD2基因?qū)晒馑孛富蛩矔r(shí)表達(dá)的影響。當(dāng)將pRB(-)Luc與p35SD1和p35SD2質(zhì)粒DNA共轟擊到煙草植物中時(shí)，沒有觀察到熒光素酶活性的明顯降低。pRB(-)Luc分別與p35SD1或p35SD2進(jìn)行共傳送同樣沒有顯示出熒光素酶活性的明顯降低(表1)。這些研究結(jié)果強(qiáng)有力地說(shuō)明，用pRB(+)Luc試驗(yàn)質(zhì)粒加VirD1和VirD2基因觀察到的熒光素酶活性的降低，與在農(nóng)桿菌中觀察到的結(jié)果相似，也是由Vir基因產(chǎn)物在右邊緣序列處進(jìn)行鏈特異性切割所致(參見Zambryski，1992)。
3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的分析然后進(jìn)行煙草懸液細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，以估計(jì)在用基因槍裝置共傳送VirD1和VirD2基因與其底物DNA后，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)DNA整合模式的活性。使用pNeoRBLuc進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，該質(zhì)粒含有左T-DNA邊緣、作為可選擇標(biāo)志的npt II及帶有插入啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間的右T-DNA邊緣。在下文的結(jié)果和討論部分中，我們稱為“農(nóng)桿菌轟擊事件”的是發(fā)生在VirD1和VirD2活性作用于邊緣序列，產(chǎn)生T鏈之后的那些煙草基因組中的DNA插入。相反，我們指定為“生物轟擊事件”是代表正常出現(xiàn)在基因經(jīng)基因槍裝置傳送到植物細(xì)胞中之后發(fā)生的DNA插入。區(qū)別生物轟擊事件和推定的農(nóng)桿菌轟擊事件的最初標(biāo)準(zhǔn)是被轉(zhuǎn)化的克隆中沒有熒光素酶活性，這起因于從pNeoRBLuc中切下T-DNA而排除Luc編碼區(qū)。在分子水平上，代表農(nóng)桿菌轟擊事件的轉(zhuǎn)基因應(yīng)與neo探針雜交，而不與luc探針雜交。此外，在農(nóng)桿菌轟擊事件中，被導(dǎo)入的DNA和植物DNA之間接合的序列應(yīng)確切相當(dāng)于T鏈的右邊緣末端。兩種事件可發(fā)生在同一植物細(xì)胞中，但這樣的克隆應(yīng)總地被歸為基于有熒光素酶活性存在的生物轟擊事件。用Southern雜交法研究生物轟擊和推測(cè)的農(nóng)桿菌轟擊事件，以檢測(cè)每種類型插入的頻率。用pNeoRBLuc質(zhì)粒DNA連同p35SD1和p35SD2 DNA以1∶5∶5的比例混合包被的微粒轟擊煙草懸液細(xì)胞。作為對(duì)照，也單獨(dú)用pNeoRBLuc轟擊，并用無(wú)邊緣對(duì)照質(zhì)粒pNeoLuc與p35SD1和p35SD2共轟擊。根據(jù)在含卡那霉素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況來(lái)選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。每個(gè)被轟擊的濾膜平均出現(xiàn)40個(gè)卡那霉素抗性克隆，但每個(gè)平皿只進(jìn)一步分析了一個(gè)或兩個(gè)愈傷組織。在單用對(duì)照質(zhì)粒pNeoRBluc DNA或pNeoLuc DNA加p35SD1 DNA和p35SD2 DNA轟擊后，回收到相似數(shù)目的卡那霉素抗性愈傷組織。
可根據(jù)所分析的不表達(dá)熒光素酶的卡那霉素抗性愈傷組織總數(shù)對(duì)總卡那霉素抗性愈傷組織總數(shù)的比例來(lái)粗略估計(jì)農(nóng)桿菌轟擊事件的發(fā)生率。按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)桿菌轟擊事件的發(fā)生率約為10％；在所分析的32個(gè)愈傷組織品系中，3個(gè)沒有表達(dá)熒光素酶活性。如上面所討論的，因?yàn)樵谕瑯又参锛?xì)胞中農(nóng)桿菌轟擊事件和生物轟擊事件均可發(fā)生，所以這個(gè)數(shù)目可能低估了農(nóng)桿菌轟擊事件。
4.對(duì)照“生物轟擊”事件的Southern印跡分析對(duì)(i)單用pNeoRBLuc轟擊，和(ii)pNeoLuc質(zhì)粒與p35SD1和p35SD2 DNA共轟擊后得到的對(duì)照卡那霉素抗性愈傷組織品系的DNA進(jìn)行Southern印跡雜交。用EcoRI消化基因組DNA，結(jié)果從pEoRBLuc質(zhì)粒產(chǎn)生與neo和Luc探針同源的3.9Kb片段(圖2)。當(dāng)基因組DNA消化產(chǎn)物與neo探針雜交時(shí)，所有泳道都展現(xiàn)出有預(yù)期大小(9.3Kb)和完整片段拷貝數(shù)目的雜交帶?；谂c拷貝對(duì)照泳道的比較，可見每個(gè)核有1至10個(gè)以上的拷貝。從用p35SD1和p35SD2 DNA連同用作探針的無(wú)邊緣對(duì)照質(zhì)粒pNeoLuc共轟擊而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，對(duì)其DNA進(jìn)行Southern印跡分析后表明，在這些細(xì)胞系中存在完整的和重排的nptII基因的拷貝。在用基因槍裝置得到的轉(zhuǎn)化子中常常觀察到這種重排。
5.候選生物轟擊事件的Southern印跡分析還對(duì)使用p35SD1和p35SD2質(zhì)粒DNA作為雜交探針，與pNe-oRBLuc共轟擊后得到的16個(gè)卡那霉素抗性愈傷組織的DNA進(jìn)行Southern印跡分析。為進(jìn)行Southern印跡分析，在32個(gè)熒光素酶活性呈陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果的愈傷組織系中隨機(jī)選出13個(gè)，同時(shí)還有3個(gè)發(fā)現(xiàn)不表達(dá)熒光素酶的克隆。熒光素酶陽(yáng)性愈傷組織系的DNA含有一條與neo探針雜交的有預(yù)期大小(3.9Kb)的帶?；谂c拷貝對(duì)照泳道的雜交強(qiáng)度的比較，可見完整nptII基因拷貝的數(shù)目為每個(gè)核1到10個(gè)。在用pNeoLuc DNA和p35SD1及p35SD2 DNA轉(zhuǎn)化的愈傷組織中觀察到的拷貝數(shù)要低得多。
我們觀察了所用p35SD1和p35SD2 DNA連同pNeoRBLuc轟擊的轉(zhuǎn)基因愈傷組織的DNA中的3.4Kb帶。發(fā)現(xiàn)這個(gè)大小的片段與這些細(xì)胞系中的VirD2探針雜交。neo探針?biāo)玫钠魏幸欢我泊嬖谟趐35SD1和p35SD2構(gòu)建體中的終止子序列，但它只代表被標(biāo)記探針的1.2％，可能有許多VirD基因插入片段的拷貝并可給出大小可見的信號(hào)。
當(dāng)印跡與luc探針雜交時(shí)，可區(qū)分出3組轉(zhuǎn)基因愈傷組織品系(1)有與neo探針和luc探針雜交之插入片段的愈傷組織品系；(2)其中某些插入片段只與neo探針雜交，某些插入片段與neo和Luc探針雜交的愈傷組織品系；(iii)插入片段只與neo探針雜交的愈傷組織品系。第一組愈傷組織可能不包含農(nóng)桿菌轟擊事件。第二組愈傷組織可能含有兩種類型的事件根據(jù)與neo探針雜交的4.8Kb、4.6Kb和5Kb片段的存在所證明的農(nóng)桿菌轟擊事件，以及根據(jù)與luc探針雜交的3.9Kb片段的存在所證實(shí)的生物轟擊事件。根據(jù)其能夠只與neo探針雜交，第三組愈傷組織只表現(xiàn)有推測(cè)的農(nóng)桿菌轟擊事件。有三個(gè)愈傷組織細(xì)胞系落入這一組中一個(gè)含有3.2Kb雜交帶；第二個(gè)含有3.8Kb和5Kb這兩個(gè)雜交帶；第三個(gè)只含有一條5.5Kb帶。這三種雜交模式是獨(dú)特的、清楚地代表獨(dú)立的單一細(xì)胞轉(zhuǎn)化事件。
在用Southern雜交法分析的16個(gè)煙草細(xì)胞系中，有10個(gè)表現(xiàn)為生物轟擊事件，3個(gè)表現(xiàn)為推測(cè)的農(nóng)桿菌轟擊事件，3個(gè)兼有兩者。
6.推定的農(nóng)桿菌轟擊事件的分子分析推定的農(nóng)桿菌轟擊插入事件的性質(zhì)最終是經(jīng)確定表現(xiàn)出與這樣的推定事件相一致的雜交模式的愈傷組織品系中植物細(xì)胞與被整合DNA間接合處的序列證實(shí)的。克隆包括這些接合點(diǎn)的愈傷組織細(xì)胞系中的DNA片段并由內(nèi)向外測(cè)定T-DNA邊緣區(qū)的序列(見方法部分)。核苷酸序列揭示，其中各個(gè)片段均含有指示右邊緣/植物DNA接頭特征的序列。T-DNA的右終點(diǎn)與T-DNA之右邊緣序列的切割位點(diǎn)完全相同。
以前有人報(bào)導(dǎo)了呈cDNA形式的5例完全配對(duì)的煙草接頭序列中4個(gè)的植物核苷酸序列。令人感興趣的是，所有這4例中，就接近基因之5′未翻譯區(qū)中聚腺苷酸化位點(diǎn)的高AT區(qū)中的植物基因來(lái)說(shuō)，T-DNA的右邊緣與CaMV35S啟動(dòng)子是按反義方向插入的。在右接合位點(diǎn)處未見到附加核苷酸和重復(fù)序列。因?yàn)槲礈y(cè)定插入片段的左邊緣，所以不可能推斷出是否已發(fā)生了靶位點(diǎn)的任何缺失。
作為對(duì)照，還從表現(xiàn)有與生物轟擊DNA片段相一致雜交模式的愈傷組織品系中克隆在每一側(cè)含有右邊緣序列和相鄰區(qū)域的DNA片段。來(lái)自這些過(guò)程的核苷酸序列未顯示有任何右邊緣序列—植物DNA接頭，而是全長(zhǎng)度右邊緣序列和其后的預(yù)期熒光素酶編碼序列。
E. 結(jié)論Ti質(zhì)粒編碼的侵入性蛋白質(zhì)VirD1和VirD2是在農(nóng)桿菌中形成T鏈所必需的。在此我們提出有關(guān)在借助基因槍裝置導(dǎo)入兩個(gè)處于CaMV35S啟動(dòng)子控制下的侵入性基因VirD1和VirD2連同載有邊緣序列的質(zhì)粒之后，在植物中形成T-DNA和整合在植物細(xì)胞中的證據(jù)。大約10％的被轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織呈現(xiàn)有農(nóng)桿菌轟擊插入片段，即只在VirD1和VirD2基因產(chǎn)物的作用后整合的DNA。被轉(zhuǎn)化愈傷組織的相似級(jí)份含有農(nóng)桿菌轟擊和生物轟擊事件。農(nóng)桿菌轟擊事件中的轉(zhuǎn)基因∷植物DNA接頭證明了在右邊緣序列內(nèi)位點(diǎn)特異性切割，這與所收集到的顯示右邊緣T-DNA正好在25bp重復(fù)區(qū)的前3個(gè)核苷酸之后的數(shù)據(jù)(Gheysen等，1991；Mayerhofer等，1991；Ohba，1995)相符。整合事件的精確度被解釋為VirD2直接卷入植物細(xì)胞核中的重組過(guò)程(Tinland等，1995)。
在被轉(zhuǎn)錄區(qū)域中鑒定了農(nóng)桿菌轟擊事件的整合位點(diǎn)，這支持有關(guān)在不同的植物品種中T-DNA優(yōu)先被整合到潛在被轉(zhuǎn)錄的基因組座位中(Koncz等，1989；Herman等，1990，Kertbundir等1991)，同時(shí)T-DNA插入隨機(jī)分布在植物染色體中的資料(Chyi等，1986；Wallroth等，1986)。雖然T-DNA整合通常與植物DNA中的大的重排無(wú)關(guān)，但在T-DNA轉(zhuǎn)化期間可發(fā)生靶植物DNA序列的缺失、顛換及復(fù)制。就這里檢查的農(nóng)桿菌轟擊事件來(lái)說(shuō)，在植物靶細(xì)胞中未觀察到大的重排。
在接近已知的煙草光誘導(dǎo)的和/或光合成的基因之聚腺苷酸化信號(hào)附近進(jìn)行農(nóng)桿菌轟擊整合，與右邊緣處的CaMV35S啟動(dòng)子以反義方向指向開放讀框這一相符模式正在引起人們的興趣。在這個(gè)方向上，T-DNA結(jié)構(gòu)的插入可以產(chǎn)生能滅活相應(yīng)煙草基因表達(dá)的反義轉(zhuǎn)錄物。但這種光合成的基因不是那些非光合成的培養(yǎng)NT1細(xì)胞所需要的。
基于其中在右邊緣序列上似乎以高頻率發(fā)生的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，顯然有高百分比例的底物分子被裂解。令人驚奇的是，這一比例沒有在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中得以保持。這種情況可以解釋為在被VirD2切割后右邊緣序列處發(fā)生連接反應(yīng)所致，因?yàn)轶w外試驗(yàn)已顯示VirD2催化含有T-DNA邊緣序列之單鏈寡核苷酸內(nèi)的位點(diǎn)特異性切割一連接反應(yīng)(Pansegrau，等，1993)。另一種解釋是可能沒有有效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需的單鏈結(jié)合性VirE2。雖然可以假定植物細(xì)胞中有一個(gè)可結(jié)合并保護(hù)T-鏈的非特異性單鏈結(jié)合蛋白VirE2的等同物，但連同VirD1和VirD2一起加入VirE2基因可以改善農(nóng)桿菌轟擊事件的回收效率。我們也注意到伴隨VirD1和VirD2基因與轉(zhuǎn)化質(zhì)粒共傳送可能以高頻率生物轟擊或整合到同一被轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中的缺點(diǎn)使用基因槍裝置的共轉(zhuǎn)化是非常有效的。這些不需要的基因代表了一種不同類型的外來(lái)DNA。但鑒于它們的獨(dú)特插入機(jī)制，我們推測(cè)它們并不與“農(nóng)桿菌轟擊”插入片段相連，并且可因繼后培育轉(zhuǎn)基因植物而被除去。不能用這些不可再生的轉(zhuǎn)基因NT1細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)這一假設(shè)。
農(nóng)桿菌轟擊轉(zhuǎn)化系統(tǒng)有幾個(gè)方面的不同優(yōu)點(diǎn)(i)它不應(yīng)直接應(yīng)用于對(duì)生物轟擊轉(zhuǎn)化方法敏感的任何植物靶組織；(ii)被插入的DNA并不攜帶外來(lái)的載體DNA；(iii)被插入的目標(biāo)基因的拷貝比在沒有VirD1和VirD2基因時(shí)傳送的DNA的拷貝數(shù)少。這樣便可以盡可能地減小可導(dǎo)致不穩(wěn)定的同源性區(qū)域。
農(nóng)桿菌轟擊方法結(jié)合了生物轟擊傳送的最佳特征和農(nóng)桿菌T-DNA插入機(jī)制的精細(xì)和準(zhǔn)確度，從而為生產(chǎn)有農(nóng)業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物提供一種新的、廣泛適用的技術(shù)。
實(shí)施例2植物表達(dá)盒的構(gòu)建首先在表達(dá)盒中適當(dāng)啟動(dòng)子的后面和適當(dāng)終止子的上游組裝欲在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中表達(dá)的基因序列，以產(chǎn)生嵌合基因。然后可以很容易地按實(shí)施例3中所述方法將這些表達(dá)盒轉(zhuǎn)入植物轉(zhuǎn)化載體中。
啟動(dòng)子選擇對(duì)用于表達(dá)盒或嵌合基因中的啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的時(shí)空表達(dá)模式。所選擇的啟動(dòng)子將在特定類型細(xì)胞(例如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮質(zhì)細(xì)胞)或特定組織或器官(例如根、葉或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，并且這種選擇將影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的所需定位。此外，所選擇的啟動(dòng)子也可驅(qū)動(dòng)基因在光誘導(dǎo)的或其他瞬時(shí)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子控制下的表達(dá)。再者，所選擇的啟動(dòng)子也可以是受到化學(xué)調(diào)節(jié)的。這樣可以為只在需要時(shí)，并在用化學(xué)誘導(dǎo)物處理后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)提供可能性。
轉(zhuǎn)錄終止子有多種不同的轉(zhuǎn)錄終止子可用于表達(dá)盒中。這些終止子負(fù)責(zé)在轉(zhuǎn)基因后面終止轉(zhuǎn)錄，和其正確聚腺苷酸化。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子和在植物中的功能是已知的，其中包括CaMV35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合成酶終止子、豌豆rbcS E9終止子。這些終止子可用于單子葉和雙子葉植物中。
增強(qiáng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列已發(fā)現(xiàn)有許多序列增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)，并且這些序列可與本發(fā)明的基因接合使用以提高它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
已顯示各種內(nèi)含子序列可增進(jìn)表達(dá)，特別是在單子葉植物細(xì)胞中。例如，已發(fā)現(xiàn)玉米Adh1基因的內(nèi)含子當(dāng)被導(dǎo)入玉米細(xì)胞中時(shí)，顯著增強(qiáng)處于其同源啟動(dòng)子控制下的野生型基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1是特別有效的，并增強(qiáng)帶有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(dá)(Callis等，Genes Develop.11183-1200(1987))。在同樣的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，來(lái)自玉米bronze 1基因的內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)上具有相似的作用(Callis等，文獻(xiàn)同上)。已常規(guī)地將內(nèi)含子序列摻入到植物轉(zhuǎn)化載體中，典型的是摻入非翻譯前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。
已知許多衍生于病毒的非翻譯前導(dǎo)序列也增強(qiáng)表達(dá)。特別是已發(fā)現(xiàn)來(lái)自煙草花葉病毒(TMV，“ω序列”)，玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)，和首蓿花葉病毒(AIMV)的前導(dǎo)序列在增強(qiáng)表達(dá)上是有效的(如參見Gallie等，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物學(xué)1565-79(1990))。
實(shí)施例3影響生物轟擊傳遞的DNA中位點(diǎn)特異性重組的“斷續(xù)”法重組酶mRNA的共傳遞A.摘要我們描述一種使用基因槍裝置向植物細(xì)胞共傳遞DNA和mR-NA的方法。借助凝膠電泳，我們已證明在各種條件下沉積于微粒上的DNA和RNA的穩(wěn)定性與回收率。為了傳送活性的mRNA，單用CaCl2或CaCl2加亞精胺加Tris緩沖液進(jìn)行沉淀是有效的，同時(shí)未緩沖的亞精胺裂解RNA。
經(jīng)使用有效的沉淀方法并向玉米和煙草細(xì)胞生物轟擊傳送，我們證明了體外合成的編碼螢火蟲熒光素酶的加帽聚腺苷酸化mR-NA的表達(dá)。動(dòng)力學(xué)研究證明，熒光素酶mRNA表達(dá)比同時(shí)傳送的35S/熒光素酶DNA的瞬時(shí)表達(dá)較早達(dá)到峰值。
為了證明生物轟擊運(yùn)送的編碼R-Zygosaccharomyces rouxii的位點(diǎn)特異性重組酶—的mRNA的活性，我們向玉米細(xì)胞共傳送含有側(cè)接RS之反向拷貝的反向35S啟動(dòng)子、重組酶的31bp特異靶位點(diǎn)，然后是35S前導(dǎo)序列、熒光素酶基因及35S終止區(qū)的底物質(zhì)粒。雖然單用底物質(zhì)粒沒有出現(xiàn)明顯地?zé)晒馑孛副磉_(dá)，但與RmRNA共傳送時(shí)，其35S啟動(dòng)子被重組酶倒轉(zhuǎn)并產(chǎn)生了熒光素酶。
下面討論位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)控制轉(zhuǎn)基因插入和表達(dá)的潛在應(yīng)用，以及作為mRNA瞬時(shí)導(dǎo)入重組酶活性的優(yōu)點(diǎn)。
B.引言在使用顆粒轟擊法向植物細(xì)胞進(jìn)行基因傳送時(shí)，轉(zhuǎn)基因DNA一般在含有多拷貝的單位點(diǎn)隨機(jī)插入基因組中(Klein等，1988；Klein等，1989；Gordon-Kamm W. J.等，1990；Vasil等，1992；WanY.和Lemaux P.1994)。轉(zhuǎn)基因的排布、插入位置和常常出現(xiàn)的高拷貝數(shù)可通過(guò)幾種機(jī)制導(dǎo)致表達(dá)的不穩(wěn)定例如，轉(zhuǎn)基因的多個(gè)拷貝可通過(guò)反義或甲基化機(jī)制或其目前還不完全清楚的“沉默”機(jī)制相互作用而彼此失活(參見Matzke M.和Matzke A.，1995)。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的多個(gè)拷貝是在單一插入位點(diǎn)連接的，所以不可能通過(guò)繼后植物繁殖中的分離來(lái)減少拷貝數(shù)。對(duì)于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基礎(chǔ)研究和有農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的商業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，如何改善被導(dǎo)入之基因的排布和表達(dá)是應(yīng)特別優(yōu)先考慮的。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可作為簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)基因的插入模式，甚至將其導(dǎo)向植物基因組中的預(yù)定位點(diǎn)的有用工具(Albert等，1995)。
已證明有幾種位點(diǎn)特異性重組酶在植物細(xì)胞中是有活性的(如參見Odell和Pussell，1994)噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)、釀酒酵母2μ質(zhì)粒中的FLP/FRT重組系統(tǒng)，以及Zygosaccharomyces rouxii之pSR1質(zhì)粒中的R/RS系統(tǒng)(Matsuzaki等，1988)。由于這些系統(tǒng)簡(jiǎn)單、可充分操作、只需要單一重組酶蛋白(Cre，F(xiàn)LP，R)及其相應(yīng)的靶，短的限定的重組位點(diǎn)(分別是lox，F(xiàn)LP，RS)，故有著潛在的實(shí)用性。此外，它們的重組頻率是相當(dāng)高的。重組酶可依據(jù)識(shí)別位點(diǎn)的位置和朝向，通過(guò)其重組反應(yīng)介導(dǎo)三種類型的DNA重排。如果DNA片段邊上接有兩個(gè)彼此顛倒的識(shí)別位點(diǎn)，則可發(fā)生間隔DNA的倒轉(zhuǎn)。如果兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)是在同一方向上，則發(fā)生間隔DNA的切除和環(huán)化。當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)是在分立的DNA分子上時(shí)，會(huì)發(fā)生遺傳交換，并且如果是環(huán)形的，則該分子可線性整合到其他分子中。
可使用位點(diǎn)特異性重組酶活性簡(jiǎn)化導(dǎo)入到植物中的靶轉(zhuǎn)基因。但如果這種活性持續(xù)存在，其可致使重組體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。因此希望只是瞬時(shí)表達(dá)重組酶活性。這一點(diǎn)在最近的一項(xiàng)研究中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，該研究證明含lox的轉(zhuǎn)基因定向整合到表達(dá)Cre之轉(zhuǎn)基因植物的lox位點(diǎn)中(Albert，等，1995)。因?yàn)閘ox位點(diǎn)處在啟動(dòng)子和Cre基因編碼區(qū)之間，所以位點(diǎn)特異性重組作用導(dǎo)致Cre表達(dá)的失活，使產(chǎn)物得以穩(wěn)定?；赟outhern雜交分析，檢查的所有整合事件都是單一拷貝的。在最近的研究中，我們已采納了R/RS位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，用于生物轟擊基因傳送。已顯示R/RS系統(tǒng)可在煙草中有效地發(fā)揮其功能當(dāng)R基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到原生質(zhì)體中時(shí)，其基因產(chǎn)物借助位點(diǎn)特異性顛倒或切掉DNA而打開隱蔽性葡糖醛酸酶(GUS)基因(Onouchi等，1992)。在此我們證明，通過(guò)生物轟擊傳送的R重組酶對(duì)玉米和煙草有相似的功能，即通過(guò)倒轉(zhuǎn)其啟動(dòng)子而開啟隱蔽性熒光素酶基因，不過(guò)其效率很低(可經(jīng)完善有關(guān)參數(shù)來(lái)提高效率)。另外，使用mRNA而不是DNA產(chǎn)生重組酶可確保其在向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入DNA底物后很快產(chǎn)生。靶RS位點(diǎn)含有由14bp倒轉(zhuǎn)的被3bp不對(duì)稱核心分開的重復(fù)區(qū)組成的31bp回文核苷酸序列(Matsuzaki，等，1988)。為了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，可望利用重組酶mRNA而不是DNA，以避免R基因插入植物基因組中，從而確保重組酶只在轉(zhuǎn)化的早期階段瞬時(shí)表達(dá)。我們下面描述一種共導(dǎo)入編碼R重組酶的mRNA連同含靶RS的隱蔽性熒光素酶DNA構(gòu)建體，從而產(chǎn)生用于激活熒光素酶基因表達(dá)的瞬時(shí)重組酶活性。
C.材料和方法1.植物材料玉米細(xì)胞玉米(Zea mays L.)懸液培養(yǎng)物起始于冷凍保存的胚發(fā)生II型愈傷組織，該愈傷組織則選自與B73相關(guān)之優(yōu)秀品系的未成熟胚。迅速融解冷凍的愈傷組織(DiMaio和Shillito，1992)，取大約1g加到補(bǔ)充有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的50mL N6液體培養(yǎng)基(2N63S)(Chu，等，1975)中。在暗處，于150rpm軌道振蕩器上，25℃保溫培養(yǎng)物。每隔7天將2ml堆積體積細(xì)胞移入50ml 2N63S液體培養(yǎng)基中，以傳代培養(yǎng)懸液培養(yǎng)物。
將200mg等分的細(xì)胞均勻分散于無(wú)菌durapore濾紙上并置于添加有12％蔗糖(作為滲壓劑)的2N6培養(yǎng)基上。轟擊前將鋪敷的細(xì)胞在室溫下放置4小時(shí)，直到轟擊后24小時(shí)。
煙草細(xì)胞
使Nicotiana tabacum細(xì)胞系NT-1(An，1985)生長(zhǎng)在添加2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige & Skoog，1962)中，每周向500ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的100ml新鮮培養(yǎng)基中加5ml培種物以傳代培養(yǎng)細(xì)胞。在旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以125rpm，27℃保溫培養(yǎng)瓶。傳代培養(yǎng)后4天取0.5ml等分細(xì)胞分散于無(wú)菌濾紙(Whatman No.4)上。然后將濾紙移到加有12％蔗糖的MS培養(yǎng)基上，并于轟擊前在室溫下放置4小時(shí)，直到轟擊后24小時(shí)。
2.質(zhì)粒首先將luc連接到T7啟動(dòng)子上，然后將T7/luc片段插入帶polyA插入片段的pUC18衍生物中，以構(gòu)建用于體外轉(zhuǎn)錄螢火蟲熒光素酶mRNA的T7LUCA50模板(圖4A)。為了將T7啟動(dòng)子連接到luc編碼區(qū)上，從pET3(Rosenberg，等，1987)中切下作為Bgl II片段的T7啟動(dòng)子，并克隆到pUC19的BamHI位點(diǎn)中以形成pAT26。以PCR介導(dǎo)的缺失法用BamHI位點(diǎn)取代從+9到+26的序列以形成pAT27。作為BamHI/Asp718片段從pC1B1711(圖4C，見下文)中切下35S前導(dǎo)區(qū)—熒光素酶片段，并導(dǎo)入pAT27中以形成T7Luc。將該質(zhì)粒中的T7/luc插入段作為Xbal/Asp718片段移入pUC18A50X中。pUC18A50X是含有一寡核苷酸對(duì)的pUC18衍生物，其中50A殘基側(cè)接有Asp718(5′)和Hind III(3′)突出端，用合成的寡核苷酸將其EcoRI位點(diǎn)轉(zhuǎn)變成XbaI位點(diǎn)。
pT7RecA50(圖4B)是含T7啟動(dòng)子、35S前導(dǎo)區(qū)和重組酶編碼區(qū)及其PolyA編碼區(qū)的pUC18A50X衍生物。從pRec(見下文)上切下作為BamHI/Asp718片段的35S前導(dǎo)區(qū)/重組酶片段并連接到pAT27中，以形成pT7Rec。然后將pT7Rec中的XbaI/KpnI片段插入到pUC18A50X中以形成pT7Rec A50。
pClB1711(圖4C)是pClB710(Rothstein等，1987)的衍生物，在pClB710中，來(lái)自pJD204(de Wet，等1987)的熒光素酶編碼區(qū)作為Hind III-BamHI片段被導(dǎo)入在5′末端帶有BamHI/Pstl/Mind III寡銜接頭的載體的HamHI位點(diǎn)中，以形成pClB1701。經(jīng)用pDO435(Ow，等，1986)的片段取代其EcoRV-BamHI片段，將所得質(zhì)粒的35S啟動(dòng)子/前導(dǎo)區(qū)裁剪使其BamHI位準(zhǔn)確地位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，以形成pClB1700。通過(guò)luc基因中的NarI在PstI位點(diǎn)處從pClB1700除去雜合體35S前導(dǎo)區(qū)(50bp)/熒光素酶前導(dǎo)區(qū)(22bp)，并用相應(yīng)于58bp 35S前導(dǎo)區(qū)和luc ORF之起始區(qū)(該構(gòu)建的細(xì)節(jié)見Carozzi等，待出版)的合成寡核苷酸置換之。
pRec(圖4D)是保留35S啟動(dòng)子、前導(dǎo)區(qū)和終止子序列，并具有被重組編碼區(qū)取代之熒光素酶編碼區(qū)的pC1B1711的衍生物。為得到該質(zhì)粒，將來(lái)自pGAHR(Onouchi等，1991)的重組酶基因的5′端作為BamHI/Bgl II片段克隆到pSP72(Promega)的相應(yīng)位點(diǎn)中，并用寡核苷酸5′-TCGAGTTGCATGCAG-3′(SEQ ID NO9)取代載體Xho1和插入片段Pvu II位點(diǎn)間的DNA，這樣重組酶的起始密碼子(劃下線處)就轉(zhuǎn)變成SphI位點(diǎn)。同樣按下述方法修飾pClB1711載體，以在35S前導(dǎo)區(qū)的末端加入一個(gè)Sph1位點(diǎn)將含有35S啟動(dòng)子/前導(dǎo)區(qū)的Pst1/EcoRI片段亞克隆到pSGpoly11載體中以使其BamHI位點(diǎn)成為單一位點(diǎn)。用BamHI/Xbal消化后，導(dǎo)入含SphI位點(diǎn)的接頭5′-GATCGCAGCATGC(CTAG)-3′(SEQ IDNO10；括號(hào)內(nèi)部分表示寡核苷酸互補(bǔ)鏈上的序列)。經(jīng)3途徑連接將所得修飾的Pst1/EcoRI片段回復(fù)至pClB1711骨架中。因內(nèi)部SphI位之故，以兩次相繼連接導(dǎo)入重組酶基因以代替luc基因。
p1RSLuc(圖4E)是pClB1711的衍生物。后者中，已在熒光素酶基因的35S啟動(dòng)子和35S前導(dǎo)區(qū)之間導(dǎo)入了31bp RS位點(diǎn)。首先將HindIII和PstI位點(diǎn)間的啟動(dòng)子片段亞克隆到pSGpoly7中，以形成pSG35S，并將相應(yīng)于下列帶RS(黑體)和HindIII位點(diǎn)(劃下線)序列的寡核苷酸對(duì)連接到單一的BamHI位點(diǎn)中5′-GATCAAGCTTTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA(GATC)-3′ (SEQ IDNO11)選擇經(jīng)測(cè)序確定其插入的寡核苷酸為順時(shí)針?lè)较虻目寺?，并?jīng)3途徑連接將其含RS的XbaI/PstI亞片段回復(fù)至pC1B1711的骨架中，以形成p1RSLuc。
p2RSLuc(圖4F)是pC1B1711的衍生物。后者中，已在35S啟動(dòng)子的兩側(cè)以相反方向?qū)肓撕铣傻腞S位點(diǎn)，并且其中整個(gè)35S啟動(dòng)子被倒轉(zhuǎn)為與Luc基因的其余部分相反的方向。用Hind III/XbaI消化上述35S啟動(dòng)子亞克隆pSG35S，并導(dǎo)入相應(yīng)于下列帶RS(黑體)和PstI位點(diǎn)(劃下線)之序列的寡核苷酸對(duì)5′-AGCTACTGCAGTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA(CTAG)-3′(SEQ IDNO12)用BamHI消化所得克隆，經(jīng)連接在上述括號(hào)中所述的寡核苷酸對(duì)中，導(dǎo)入RS的第二個(gè)拷貝。選擇其中第二個(gè)RS位點(diǎn)的方向與第一個(gè)的方向相反的克隆(即5′-GATCAAGCTTTTGATGAAAG-AATACGTTATTCTTTCATCAA(GATC)-3′(SEQ ID NO13)是呈反時(shí)針?lè)较虻?。由劃下線的非中心對(duì)稱三核苷酸CGT(或另一鏈上的ACG)限定回交RS序列的方向。從所得2RS啟動(dòng)子克隆中切下HindIII/PstI片段，并經(jīng)2途徑連接回復(fù)到pClB1711骨架中，倒轉(zhuǎn)35S啟動(dòng)子片段的方向以形成p2RSLuc。
3.mRNA合成用Hind III在poly(A)延伸部的緊下游將T7luc A50和T7RecA50質(zhì)粒(圖4A和4B)切成線性。用苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀線性化的DNA。用含有[m7G(5′)ppp(5′)]的T7Cap-Scribe試劑盒(Boehringer)中的T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄線性化的DNA。對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)，于RNasin(1u/ml，Promega)存在下，用無(wú)DNase的NRase(0.03u/ml，Worthington Biochemical)直接處理轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(37℃，5分鐘)，并在最后用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀。用瓊脂糖電泳法測(cè)定mRNA的完整性和濃度。
4.生物轟擊工具的消毒將60mg金顆粒(1.0μm-Biorad，0.3μm-Heraeus)放在100％乙醇和0.1％DEPC中進(jìn)行消毒。用無(wú)RNase水將顆粒沖洗3次，然后重懸于1ml無(wú)RNase水中或1ml無(wú)RNase50％甘油溶液中。用50μl等分的已制好的顆粒進(jìn)行6次射擊。將微載體浸于100％乙醇和0.1％DEPC中，然后在100％乙醇中淋洗3次并風(fēng)干。高壓消毒制動(dòng)屏板。
5.核酸沉淀按照BioRad的說(shuō)明書將DNA沉淀到50μl金顆粒的懸液上(60mg/ml)。于下面指出的各種條件下，將mRNA沉淀到50μl金顆粒的懸液上。所有沉淀試劑都是無(wú)RNase的，并且在4℃下連續(xù)渦旋期間加到金顆粒懸液中。加入所有試劑后，繼續(xù)渦旋3分鐘，然后經(jīng)簡(jiǎn)單的微量離心(1分鐘)沉降顆粒。去除上清并用冷的100％乙醇將顆粒洗1次，并重懸于60μl100％乙醇中。渦旋該混合物，將10μl等分的混合物用吸管移至微載體園盤上，并在層流罩中風(fēng)干。
6.向植物細(xì)胞微粒遞送使用在離發(fā)射組件5.5cm位置有樣品的1100-1550psi破裂盤，用顆粒加速器(PDS-1000/He裝置)將微粒運(yùn)送到植物細(xì)胞中。將100μm目不銹鋼篩放在制動(dòng)板和組織正中間。轟擊靶板1次(煙草細(xì)胞)或2次(玉米細(xì)胞)。
7.熒光素酶檢測(cè)按照供應(yīng)商推薦的方法，用Promega的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)組織提取物中的熒光素酶。于25℃下用Analytical Luminescence2001型發(fā)光計(jì)檢測(cè)10秒鐘并以光單位表示熒光素酶活性。為了計(jì)算比活性，使用Rio-Rad蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
D.結(jié)果1.完整mRNA在金顆粒上的沉淀為了達(dá)到mRNA傳送和繼后表達(dá)的最佳化，試驗(yàn)了幾種在金顆粒沉積mRNA的方法，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析沉淀物和上清中mRNA的條件與回收率。各部分別指示“上清”(從初始沉淀部分中直接抽吸的)、“金”(mRNA沉淀后懸浮于水中的金顆粒)和“水洗脫物”(離心懸浮于水中的mRNA包被的金顆粒后的上清)。檢查水洗脫物以確定在傳送到植物細(xì)胞上之后，如何可容易地再溶解已沉淀的mRNA。
當(dāng)經(jīng)受加有1.0M CaCl2和16mM亞精胺的DuPont DNA沉淀方法時(shí)，mRNA受到嚴(yán)重降解(數(shù)據(jù)未示出)。亞精胺游離堿很可能引起RNA的堿水解。因此，試驗(yàn)了不加亞精胺的各種不同濃度的CaCl2(1.0M，0.3M和0.07M)能否將mRNA沉淀到金顆粒上。1.0M CaCl2得到良好效果，發(fā)現(xiàn)在1.0M CaCl2中，于-20℃下過(guò)夜保溫帶RNA的金顆粒可改善效率達(dá)90-100％。經(jīng)兩次乙醇淋洗后比只洗1次，可能由于除掉了CaCl2，所以更容易將mRNA從顆粒溶解到水中。
2.生物轟擊傳送后熒光素酶mRNA的瞬時(shí)表達(dá)為了確定以這種方式沉淀到金顆粒上的mRNA是否能經(jīng)受得住生物轟擊傳送過(guò)程并可在植物細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)發(fā)揮功能，將體外合成的熒光素酶mRNA傳送到植物細(xì)胞中。將CaMV35S前導(dǎo)序列和帶有50個(gè)腺苷酸殘基的poly(A)尾摻入到T7Luc A50模板構(gòu)建體中，以努力提高熒光素酶在植物細(xì)胞中的表達(dá)。用1.0M CaCl2將加帽的熒光素酶mRNA沉淀到金顆粒上并用-20℃下保溫過(guò)夜，然后將顆粒轟擊到玉米和煙草懸液細(xì)胞中。傳送后2.6和24小時(shí)進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。結(jié)果示于下列表3中。到2小時(shí)，檢到明顯的熒光素酶活性。到第6小時(shí)活性增加，但到24小時(shí)時(shí)活性則降低。相反，用Rio-Rad DNA體系沉淀到金顆粒上的，含有35S-熒光素酶基因的DNA質(zhì)粒的瞬時(shí)表達(dá)則在24小時(shí)為最高。
轟3用熒光素酶RNA轟擊后煙草細(xì)胞和玉米細(xì)胞中熒光素酶活性的證明。顯示轟擊后2小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)熒光素酶活性檢測(cè)的結(jié)果(光單位/μg蛋白)說(shuō)明 時(shí)間煙草 玉米熒光素酶RNA RNA 2小時(shí)980 21006小時(shí)5300 240024小時(shí) 700 400pClB1711DNA 熒光素酶DNA 2小時(shí)78500 10006小時(shí)198000690024小時(shí) 1034600 14800T7-Luc A50DNA 模板 6小時(shí) 30 300無(wú)RNA-DNA 24小時(shí) 0 1003.玉米中R/RS重組酶系統(tǒng)之功能的證明顛倒反向的啟動(dòng)子以打開熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)為了試驗(yàn)得自Z. rouxii的位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)R/RS是否可在玉米中如已報(bào)導(dǎo)的如其在煙草中(Onouchi等，1991)一樣發(fā)揮功能，使用雙重瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)法，其中需要存在玉米細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的R-重組酶來(lái)顛倒啟動(dòng)子，以打開共傳送的隱蔽性熒光素酶基因的瞬時(shí)表達(dá)。作為陽(yáng)性對(duì)照，則在煙草細(xì)胞中試驗(yàn)雙重瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)法。借助微粒轟擊，將含有35S-重組酶基因的pRec質(zhì)粒(圖4D)與隱蔽性熒光素酶質(zhì)粒p2RSLuc(圖4F)共傳送到玉米細(xì)胞中。倒轉(zhuǎn)p2RS的啟動(dòng)子應(yīng)在啟動(dòng)子和luc基因之間留下一個(gè)RS(31bp)的拷貝(其對(duì)luc表達(dá)的影響尚不明確)。因此我們還構(gòu)建了一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒p1RSLuc(圖4E)，以刺激由重組酶反轉(zhuǎn)p2RSLuc的預(yù)期產(chǎn)物。p1RSLuc含有正確定向的但被前導(dǎo)區(qū)中的單一RS位點(diǎn)分開的CaMV35S啟動(dòng)子和熒光素酶編碼序列。發(fā)現(xiàn)p1RSLuc在煙草和玉米中以與pClB1711相似的水平被表達(dá)(數(shù)據(jù)未示出)；因此基因中的RS“足跡”對(duì)luc表達(dá)只有很小的影響。
用BioRad方法將質(zhì)粒p2RSLuc和pRec的混合物，以及單獨(dú)對(duì)照質(zhì)粒p2RSLuc，p1RSluc和p1RSLuc加pRec沉淀到金顆粒上，并轟擊到煙草和玉米細(xì)胞中(表4)。雖然R-重組酶以到24小時(shí)達(dá)到至少4％的效率(26,000對(duì)597,000光單位/μg蛋白)開啟了煙草中的Luc基因，但該方法似乎在玉米中的效率很小，只有0.27％(53對(duì)20,000光單位/μg蛋白)。確實(shí)發(fā)現(xiàn)在玉米中檢測(cè)到的很低活性是明顯的和可再現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的玉米中的特征限制性重組酶活性可能是核(慢轉(zhuǎn)錄、錯(cuò)誤切接位點(diǎn)、沒有從核中引出mRNA)或胞漿過(guò)程(翻譯障礙、稀有密碼子使用、mRNA不穩(wěn)定性等)。如果問(wèn)題出在核中，我們預(yù)測(cè)可通過(guò)生物轟擊傳送重組酶mRNA回避之，推測(cè)可直接向胞漿內(nèi)導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄物。
表4轟擊后煙草和玉米細(xì)胞中的重組酶活性。由6份煙草細(xì)胞和3份玉米細(xì)胞測(cè)得的熒光素酶活性(光單位/μg蛋白)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示煙草玉米無(wú)DNA 16＜1p2RSLuc1300±2300 4±1p2RS+pRec 26100±2600 53±4p1RSLuc 852000±9100015700±4100p1RSluc+pRec 597000±12200020700±2600先前已將Z. rouxii重組酶的靶位點(diǎn)縮窄到包括本文所用31bp回文序列在內(nèi)的58bp區(qū)域(Matsuzaki等，分子和細(xì)胞生物學(xué)8，955-962(1988))。我們的結(jié)果顯示，31bp回文序列足可使R基因介導(dǎo)的我們的隱蔽性熒光素酶構(gòu)建體的啟動(dòng)子倒轉(zhuǎn)。因此，該簡(jiǎn)短的RS序列對(duì)于煙草和玉米中的位點(diǎn)特異性重組是足夠的。
4.通過(guò)重組酶mRNA活性瞬時(shí)表達(dá)熒光素酶DNA在有利于RNA回收的條件下，將p2RSLuc DNA與重組酶mR-NA共沉淀到金顆粒上1.0M CaCl2并于-20℃下保溫過(guò)夜。將顆粒轟擊到玉米細(xì)胞中并在2小時(shí)和24小時(shí)后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果如下列表5中所示。轟擊后2小時(shí)的熒光素酶表達(dá)量小到可忽略不計(jì)。到24小時(shí)，熒光素酶表達(dá)對(duì)mRNA重組酶處理和35S-重組酶DNA作用于2RS隱藏性熒光素酶質(zhì)粒來(lái)說(shuō)都是很明顯的。當(dāng)?shù)罐D(zhuǎn)反應(yīng)接近平衡時(shí)，即以50％“接通”和50％“斷開”啟動(dòng)子的方向達(dá)到穩(wěn)態(tài)。因此預(yù)期熒光素酶表達(dá)的最大水平應(yīng)是p1RSLuc活性的50％。mRNA驅(qū)動(dòng)的倒轉(zhuǎn)達(dá)到最大理論值的67％這一極高效率。DNA驅(qū)動(dòng)的倒轉(zhuǎn)的效率也得到顯著改善，但p1RSLuc表達(dá)的水平卻極低，這表明為mRNA建立的沉淀方法對(duì)于DNA是很不夠的。因此進(jìn)一步嘗試其他沉淀?xiàng)l件，以尋求對(duì)DNA和RNA都有效的最適折衷方案。
表5玉米細(xì)胞中重組酶RNA活性的證明。用每μg蛋白質(zhì)的光單位表示熒光素酶活性，并在轟擊后2小時(shí)和24小時(shí)檢測(cè)說(shuō)明 2小時(shí) 24小時(shí)p2RSluc 僅用靶 5.3 6.4p2RSluc+T7-RecA50 僅用靶+模板 4.5 7.8p2RSluc+RecRNA靶+rec RNA 6.734.8p2RSluc+RecDNA靶+rec DNA 5.015.6p1RSluc 陽(yáng)性對(duì)照 37.489.65.在金顆粒上有效地共沉淀mRNA和DNA在改善DNA與mRNA共傳送效率的嘗試中，我們?cè)诔恋砘旌衔镏惺褂脕喚愤M(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，但也包括加入Tris緩沖液以降低pH和盡可能地避免RNA降解。在50mM Tris緩沖液(pH7.5)存在下，使用1.0M CaCl2和2、4、10或16mM亞精胺將DNA和mRNA共沉淀到顆粒上。按上述方法用瓊脂糖凝膠電泳法檢查核酸沉淀的效率。在所有亞精胺濃度下，完整的DNA和mRNA被有效地沉降在顆粒上(數(shù)據(jù)未示出)。瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的一個(gè)可能的優(yōu)點(diǎn)是，以最低濃度可使更多的DNA和mRNA從顆粒上重新溶解到水中。
在最后的完善中，我們改變了Tris緩沖液的濃度并按生物學(xué)活性判定法進(jìn)行效率試驗(yàn)使用加有5mM(處理A)或50mM(處理B)Tris緩沖液(pH7.5)的2mM亞精胺沉淀Luc mRNA，并轟擊到玉米細(xì)胞中。在轟擊后5小時(shí)，處理A和B的瞬時(shí)表達(dá)水平分別為1，091和8,000光單位/μg蛋白質(zhì)。使用50mM Tris獲得較高的mR-NA活性，這代表了比以前使用1.0M CaCl2和-20℃過(guò)夜保溫的沉淀?xiàng)l件下效率改善了3-4倍(表1)。
用處理A和B沉淀重組酶mRNA與p2RSLuc DNA，然后將其轟擊到玉米和煙草細(xì)胞中。于24小時(shí)測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果如下列表6中所示。使用5mM和50mM Tris改善了DNA表達(dá)，但水平并未達(dá)到使用BioRad沉淀方法所達(dá)到的水平(表4)。有利于mRNA表達(dá)的條件，即使用50mM Tris，則使玉米和煙草中重組酶活性分別達(dá)到18.9％和9.4％的最高效率。雖然重組酶效率比表5中所看到的低些，但對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化DNA表達(dá)的較高水平才是重要的。我們的結(jié)論是，沉淀RNA可使用Tris緩沖的低濃度亞精胺，并可改善DNA表達(dá)。
表6煙草和玉米細(xì)胞中的重組酶mRNA表達(dá)。將mRNA(4μg/6次發(fā)射)、p2RSLuc DNA(2μg/6次發(fā)射)和p1RSLucDNA(2μg/6次發(fā)射)轟擊到煙草和玉米細(xì)胞中。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中使用從β-葡糖醛酸基因合成的mRNA。在轟擊后24小時(shí)檢測(cè)熒光素酶活性，并以光單位數(shù)/μg蛋白表示之。
煙草 玉米5mM 50mM5mM 50mMp2RSLuc+139±2.8 311±1819±1.7 20±0.07RecmRNAp2RSLuc+57±10 34±2 3.5±0.2 3.8±0.9mRNAp1RSLuc+16683±14606644±1565 426±5 211±40mRNAE.討論本文中我們報(bào)導(dǎo)了通過(guò)顆粒轟擊共運(yùn)送mRNA和DNA的方法，其可使mRNA編碼的蛋白質(zhì)瞬時(shí)作用于DNA分子。共運(yùn)送mRNA和DNA允許將反式作用功能導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，而沒有因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所造成的持續(xù)表達(dá)可能性。在短暫的運(yùn)送期間內(nèi)，mRNA編碼的重組酶只是瞬時(shí)有活性的?？捎眠@種方法將供體DNA位點(diǎn)特異性地導(dǎo)入植物基因組的RS位點(diǎn)中，而在所得植物中不伴有重組酶表達(dá)的問(wèn)題。
瓊脂糖凝膠電泳和熒光素酶表達(dá)研究表明，有利于DNA傳送的條件對(duì)于mRNA不是最佳的，且反之亦然。經(jīng)選擇不同的沉淀?xiàng)l件，可優(yōu)化其中之一使靶植物細(xì)胞中達(dá)到最適水平的重排DNA。沉淀后電泳分析金顆粒上的核酸，證明這是一種對(duì)不同沉淀?xiàng)l件的效率進(jìn)行定性和定量估測(cè)的精細(xì)手段。可用這種方法進(jìn)一步改進(jìn)通過(guò)顆粒轟擊進(jìn)行核酸傳送的條件。然后，最終的條件判定必須是生物學(xué)活性水平，因?yàn)槟z電泳只能查驗(yàn)大體損失。
就已知在有效的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)中起作用的三個(gè)特征來(lái)設(shè)計(jì)本研究中外源導(dǎo)入的mRNA分子。在5′末端加帽為結(jié)合真核抑制因子這一翻譯過(guò)程中的早期和基本的步驟提供了識(shí)別位點(diǎn)。在體外轉(zhuǎn)錄期間，在3′末端上合成有50個(gè)腺苷酸殘基的poly(A)尾部，因?yàn)槲聪佘账峄膍RNA在電穿孔的煙草、胡蘿卜、玉米和水稻原生質(zhì)體中翻譯效率要比其腺苷酸化的對(duì)應(yīng)物低100-200倍(Gallie等，1989，植物細(xì)胞)。也已顯示在有5′帽時(shí)聚腺苷酸化mRNA的效率提高一個(gè)數(shù)量級(jí)(Gallie，1991)。分子中包括有CaMV35S的非翻譯前導(dǎo)序列，并已顯示其可提高煙草和玉米中的表達(dá)水平(Gallie等，1989植物細(xì)胞；Dowson Day等，1993)。
直接向植物細(xì)胞運(yùn)送mRNA為研究細(xì)胞功能提供了便利條件。可不依賴于轉(zhuǎn)錄因子、加工和向胞漿的運(yùn)輸于體內(nèi)檢查mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率。已證明電穿孔(Higgs & Colbert，1993)和聚乙二醇(Gallie，1993植物細(xì)胞報(bào)告(Plant cell reports))是向植物原生質(zhì)體中導(dǎo)入mRNA的有用和有效的方法。但這些運(yùn)送方法只限于原生質(zhì)體，而生物轟擊傳送則對(duì)許多種植物細(xì)胞和器官都是適用的。在轉(zhuǎn)基因植物中穩(wěn)定地表達(dá)的蛋白質(zhì)可能是不利的或很有害的，這時(shí)可從借助生物轟擊傳送的mRNA瞬時(shí)表達(dá)這些蛋白質(zhì)。例如，在R/RS植物中的重組酶表達(dá)可導(dǎo)致切割的鑲嵌模式，這正象含重組酶基因的植物和含靶位點(diǎn)的植物間的遺傳雜交一樣，常常導(dǎo)致F1植物中的嵌合重組活動(dòng)和鑲嵌表達(dá)(Russell等，1992，Onouchi等，1995)。
為了在作物植物中產(chǎn)生成功改良的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，可以使用R/RS系統(tǒng)在舊基因的確切位置上置換新的基因。因此可用帶有不同的可選擇標(biāo)志的第二個(gè)轉(zhuǎn)基因盒取代第一個(gè)轉(zhuǎn)基因盒和其可選擇標(biāo)志(側(cè)翼接有RS位點(diǎn))。而第二個(gè)最終又可被第三個(gè)轉(zhuǎn)基因盒取代(其中再次使用第一個(gè)可選擇標(biāo)志)。這種方法可減少所需的可選擇標(biāo)志的數(shù)目并可避免轉(zhuǎn)基因盒上發(fā)生位置效應(yīng)變異。
在植物中使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)為更大程度地控制轉(zhuǎn)基因插入和表達(dá)提供了可能。重組酶系統(tǒng)已可使插入發(fā)生在基因組中的預(yù)定位置，并可繞過(guò)所謂的“位置效應(yīng)”(Fukushige和Sauer，1992；Lakso等，1992；O’Gorman等，1991)。重組酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因缺失和顛倒過(guò)程得以控制基因表達(dá)并除去可選擇標(biāo)志基因(如參見Odell& Russell，1994)。以mRNA的形式導(dǎo)入重組酶活性可通過(guò)強(qiáng)制在轉(zhuǎn)化過(guò)程中早期重組事件的發(fā)生，減少鑲嵌的危險(xiǎn)來(lái)擴(kuò)展這一應(yīng)用。此外，mRNA傳送可在設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性整合中提供更大程度的靈活性，以避免向基因組中導(dǎo)入重組酶遺傳信息。
實(shí)施例4向煙草和玉米細(xì)胞內(nèi)共轟擊編碼整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)VirD1和VirD2的mRNA與DNA如在本發(fā)明的詳細(xì)描述中指出的，可期望在可翻譯RNA被降解之前的有限時(shí)間里產(chǎn)生通過(guò)可翻譯RNA傳送到待轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞中的整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)。
預(yù)期從該RNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能在其通過(guò)正常細(xì)胞加工被降解前的有限時(shí)間里保留在植物細(xì)胞中。因此以可翻譯RNA的形式運(yùn)送整合促進(jìn)性蛋白質(zhì)代表了運(yùn)送這種瞬時(shí)作用蛋白質(zhì)的一種方式。在持續(xù)存在這些蛋白可能有不利影響的情況，瞬時(shí)運(yùn)送這些蛋白質(zhì)可能是有益的。下列實(shí)施例描述這種向植物細(xì)胞運(yùn)送VirD1和VirD2蛋白質(zhì)連同周邊接有T-DNA邊緣序列之DNA片段的方法。所報(bào)告的結(jié)果表明。產(chǎn)生了這些Vir蛋白質(zhì)并為DNA片段提供它們的相關(guān)整合促進(jìn)活性。
所用的植物材料
玉米細(xì)胞玉米(Zea mays L.)懸液培養(yǎng)物起始于冷凍保存的胚發(fā)生II型愈傷組織，該組織選自于與B73相關(guān)的良種(2717)的未成熟胚。使細(xì)胞生長(zhǎng)于加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6液體培養(yǎng)基(2N63S)(Chu等，1975)中。在25℃下暗處，于軌道振蕩器上以150rpm保溫培養(yǎng)物。每7天取1ml堆積體積細(xì)胞移入50ml新鮮2N63S液體培養(yǎng)基中。從迅速生長(zhǎng)3天的培養(yǎng)物中取出用于轟擊實(shí)驗(yàn)的玉米細(xì)胞。轟擊前，取大約0.5ml堆積體積細(xì)胞在7cm濾紙(Whatman，N°4)上真空過(guò)濾。
煙草細(xì)胞使Nicotiana tabacum細(xì)胞系NT-1(An，1985)生長(zhǎng)于加有2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中。每周向裝在500ml培養(yǎng)瓶中的100ml新鮮培養(yǎng)基內(nèi)加入5ml接種物以傳代培養(yǎng)細(xì)胞。27℃下，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以125rpm保溫培養(yǎng)瓶。傳代培養(yǎng)后每4天取0.5ml細(xì)胞懸液散布于無(wú)菌濾紙(WhatmanNo.4)上。然后將濾紙移到MS培養(yǎng)基上。
質(zhì)粒構(gòu)建1-含有T7啟動(dòng)子和poly A尾的載體的構(gòu)建將多接頭(SphI-EcoRI-NheI-ClaI-Bgl II-Asp718-HindIII-XhoI-Hind*III，失活Hind III位點(diǎn))插入pT7RecA50(見實(shí)施例3)的SphI-Mind III位點(diǎn)中。然后將寡聚Asp718-A(50)-DraI-Hind III片段插入相應(yīng)位點(diǎn)，得到pT7-A50。
2-pT7D1A50的構(gòu)建將含有預(yù)先克隆到pSG5(得自p35SAdh1D1的EcoRI-BamHI片段)之EcoRI-BamHI中的VirD1編碼區(qū)的EcoRI-BgI II片段插入到用EcoRI和Bg1 II消化的pT7A50中。
3-pT7D2A50的構(gòu)建將VirD2編碼區(qū)的兩個(gè)片段，即EcoRI-BamHI(5′末端)和Ba-mI-ClaI(3′末端)克隆到pTA-A50的EcoRI-ClaI中。首先將3′末端作為BamHI-Hae III片段克隆到pBluescript質(zhì)粒pSK的BamHI-EcoRV中，以將其轉(zhuǎn)變?yōu)锽amHI-Clal片段。
mRNA合成用直接切割poly(A)段緊下游的XhoI將T7D1A50和T7D2A50質(zhì)粒切成線性。用酚/氯仿提取并用乙醇沉淀切成線性的DNA。使用含有[m7G(5′)ppp(5′)]的T7Cap-Scribe試劑盒(Boehringer)中的T7聚合酶于體外轉(zhuǎn)錄線性化的DNA。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)編碼VirD1和VirD2的mRNA的完整性與濃度。
生物轟擊工具的消毒將60mg金顆粒(0.3μm-Heraeus)放在100％乙醇和0.1％DE-PC中進(jìn)行消毒。用無(wú)核酸酶的水將顆粒淋洗3次，然后重懸于1ml無(wú)核酸酶的50％甘油溶液中。用每等分50μl制備好的顆粒進(jìn)行6次發(fā)射。將微載體浸入100％乙醇中0.1％DEPC中，然后在100％乙醇中沖洗3次并風(fēng)干。高壓消毒制動(dòng)屏。
核酸沉淀連續(xù)加入0.5μl Tris緩沖液(1M)、50μl CaCl2(2.5M)和2.5μl0.1M亞精胺，以將DNA(1μg)和mRNA(約8μg4μg virD1和4μgVirD2或8μg作為對(duì)照的非特異性mRNA)沉淀到50μg金顆粒懸液(60μg/ml；0.3μm)上。加入所有試劑后，連續(xù)渦旋3分鐘，然后經(jīng)短時(shí)微量離心(1分鐘)沉淀出顆粒。去掉上清并再用冷100％乙醇將顆粒洗1次，然后重懸于60μl 100％乙醇中。渦旋該混合物，將10μl等分的混合物吸移到微載體園盤上，并在層流罩中風(fēng)干。
微粒運(yùn)送到植物細(xì)胞內(nèi)使用在離發(fā)射組件5.5cm處置有樣品的1100psi破裂盤，用顆粒加速器(PDS-He 1000；DuPont)將微粒運(yùn)送到植物細(xì)胞內(nèi)。將100μm目不銹鋼篩放在制動(dòng)板和組織正中間。轟擊靶板2次。
熒光素酶檢測(cè)按照供應(yīng)商推薦的方法，用Promega的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)組織提取物中的熒光素酶。于25℃下用Analytical Luminescence2001型發(fā)光計(jì)檢測(cè)10秒鐘并以光單位表示熒光素酶活性。為了計(jì)算比活性，使用Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
結(jié)果于轟擊后24小時(shí)進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。用VirD1和VirD2的mRNA與在35S啟動(dòng)子和熒光素酶編碼序列間插入有右邊緣序列的p35SRBLuc一起共轟擊。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用p35SRBLuc與非特異性mRNA一起轟擊。下列表7中示出了初始實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)施例8中描述繼后實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并示于表14中。
表7用VirD1和VirD2 mRNA轟擊植物細(xì)胞。插號(hào)內(nèi)的數(shù)字指示質(zhì)粒對(duì)mRNA的摩爾比。各實(shí)驗(yàn)中也用pGUS共轟擊。保溫24小時(shí)后，制備組織勻漿并檢測(cè)酶活性。以熒光素酶(Luc)對(duì)β-葡糖醛酸酶(Glu)的比例表示活性。分析各獨(dú)立的轟擊結(jié)果并將所得數(shù)據(jù)表示為3次重復(fù)的平均值加或減標(biāo)準(zhǔn)差。
煙草 玉米均值±SD 均值±SDpRB(+)Luc 9.3 ±0.48.6±1.0pRB(+)Luc+D1 mRNA 7.6 ±0.58.6±0.2pRB(+)Luc+D2 mRNA 8.4 ±0.18.3±0.1pRB(+)Luc+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶1∶1)5.6 ±0.16.5±0.9pRB(+)Luc+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶2∶2)4.3 ±0.24.7±0.4pCIB1711 8.8 ±0.810.5 ±1.4pCIB1711+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶1∶1) 9.2 ±0.58.9±0.3pCIB1711+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶2∶2) 8.6 ±0.411.8 ±1.9結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中，將VirD1 mRNA和VirD2 mRNA與pRB(+)LucDNA共運(yùn)送后，可見熒光素酶活性降低50％(表7)。作為mRNA向植物細(xì)胞運(yùn)送的兩種Vir基因似乎有協(xié)同作用。這些觀察強(qiáng)有力地表明，所見熒光素酶活性的降低是由VirD1和VirD2蛋白質(zhì)在右邊緣序列處進(jìn)行鏈特異性切割的結(jié)果。
實(shí)施例5植物內(nèi)產(chǎn)生的玉米基因組中的T鏈整合摘要建立了一種本文中稱為“農(nóng)桿菌轟擊”的新的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，該技術(shù)得以只整合如在T-DNA插入片段中那樣不帶載體序列的有用基因，并可控制拷貝數(shù)。該方法是使用植物表達(dá)盒，用以表達(dá)通過(guò)基因槍裝置與含有T-DNA邊緣序列(其側(cè)翼接有一可選擇標(biāo)志)的載體共傳送的侵入性基因。在目前的研究中，選擇小麥矮化病毒(WDV)作為復(fù)制載體，以將植物可表達(dá)的侵入性基因(VirD1、VirD2和VirE2)和側(cè)接左和右邊緣序列的可選擇標(biāo)志基因?qū)胗衩准?xì)胞中。發(fā)現(xiàn)VirD1和VirD2基因確實(shí)可在植物中切割T-DNA邊緣序列，并在生物轟擊傳送后產(chǎn)生T-DNA型插入(“農(nóng)桿菌轟擊”事件)。
引言農(nóng)桿菌被廣泛用作遺傳操作或經(jīng)轉(zhuǎn)化對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行工程改造的工具。轉(zhuǎn)移其病原質(zhì)粒的特定區(qū)域；即T-DNA，并穩(wěn)定地整合到植物基因組中。T-DNA是由25bp稱為邊緣序列的同向重復(fù)序列定界的(參見Zupan & Zambryski，1995)。定位在兩邊緣之間的任何DNA序列都可從農(nóng)桿菌有效地轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中。然而，T-DNA轉(zhuǎn)移和整合卻受到細(xì)菌的宿主范圍的限制，其可有效地轉(zhuǎn)化大多數(shù)雙子葉植物，而只轉(zhuǎn)化很少數(shù)單子葉植物(參見Chilton，1994)。
為了填充因農(nóng)桿菌的有限宿主范圍造成的缺口，期望找到一種對(duì)單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的有效方法。一種可能的方法包括為植物細(xì)胞提供重建復(fù)合物所需的所有工具，以在植物體內(nèi)產(chǎn)生T復(fù)合物。這些工具是1)側(cè)翼接有邊緣序列的目的基因，和2)處在植物表達(dá)盒控制下的侵入性基因。VirD1和VirD2基因產(chǎn)物對(duì)于T-DNA加工的關(guān)鍵性步驟是必不可少的(如參見Zupan & Zambryski，1995)。VirD2是鏈特異性核酸內(nèi)切酶，其在VirD1的幫助下特異性地識(shí)別邊緣序列。切割后，VirD2仍共價(jià)連接到單鏈DNA或T-鏈的5′末端上。T-鏈?zhǔn)艿絾捂溄Y(jié)合蛋白VirE2的保護(hù)。所得核蛋白復(fù)合物被輸出到植物細(xì)胞。VirD2含有核定位信號(hào)，供以將T-鏈導(dǎo)向植物細(xì)胞的核內(nèi)。 VirD2可參予T鏈5′端與植物基因組的連接(Tinland等，1995)。
在本研究中，選擇小麥矮化病毒(WDV；Ugaki等，1987)作為植物中的復(fù)制載體，以研究植物中T鏈的形成及其向植物基因組內(nèi)的整合。使用這樣一種載體的目的是為了使雙粒病毒組在植物細(xì)胞中以高拷貝數(shù)增殖，并以高水平表達(dá)之。
材料和方法質(zhì)粒(有關(guān)圖解說(shuō)明參見圖5)pC1B1711是含有由花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶基因的pUC衍生物。實(shí)施例3中已對(duì)其作了描述。
pwiBarRBLuc是為穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化玉米懸液細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，并含有左邊緣序列、由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Bar基因(Thompson等，1987)和熒光素酶基因及插入到啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間的右邊緣序列。從pC1B3064(Koziel等，1993)切下作為Hind III-EcoRI片段的bar基因。從pBin19上切下作為B91 II-EcoRI片段的左邊緣序列(Bevan，1984)。
首先將來(lái)自pTiA6的VirD1和VirD2亞克隆到由CaMV35S啟動(dòng)子(0.5Kb)、Adh1第一內(nèi)含子(0.5Kb)和胭脂氨酸合酶(nos)聚腺苷酸化區(qū)(0.25Kb)組成的表達(dá)載體pMF6(Callis et al.，1987)中。將得自pAD1187(Vogel和Das，1992)中的0.6Kb EcoRI-PstI片段和得自pAD1190中的1.8Kb片段克隆到pMF6中，分別產(chǎn)生p35SAdhD1和p35SAdhD2。將含有處于35S啟動(dòng)子控制下之VirD1基因的p35SAdhD1中的XbaI-NotI片段亞克隆到經(jīng)修飾的pwi-11的NheI-NotI位點(diǎn)中。在pwi-11(Ugaki等，1987)的單-BamHI-Sa1位點(diǎn)中導(dǎo)入一個(gè)多接頭(NheI-NotI-SpeI-KnpI-Bg1 II)。將含有處于35S啟動(dòng)子控制下之VirD2編碼序列的p35SAdhD2中的NatI片段亞克隆到pwi-11的單一NotI位點(diǎn)中。
從含有農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTiA6(登記號(hào)X04784)(Winans等，1987)之3Kb XhoI片段的pW108中切下VirE2編碼區(qū)。首先將pw108的687bpSacI-SmaI片段克隆到pBluescript KS-(Strata-gene，Inc)的相應(yīng)位點(diǎn)中，得到pKS3′E2。使得自pw108中的924bpHaeIII-SacI與來(lái)自pKS3′E2中的SacI-PstI片段和側(cè)接EcoRI粘端及平端的退火的DNA寡核苷酸對(duì)(5′-AATTCATG-GATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3′，SEQ ID NO14)相結(jié)合，并克隆到pBluescript KS-的EcoRI-PstI位點(diǎn)中，得到pKSE2。然后將復(fù)蓋整個(gè)VirE2編碼區(qū)的XhoI-PstI片段亞克隆到pMF6的XhoI-PstI中，得到p35SAdhE2。將含有35S啟動(dòng)子、Adh1內(nèi)含子、VirE2編碼區(qū)和Nos終止子的NotI-XbaI片段克隆到pwi-11的NotI-NheI位點(diǎn)中。pGUS是含有處于CaMV35S啟動(dòng)子控制下之β-葡糖醛酸酶(GUS)編碼序列和蓖麻子過(guò)氧化氫酶基因內(nèi)含子(Ohta等，1990)的pUC衍生物。
玉米懸液細(xì)胞將玉米(Zea Mays cv. Black Mexican Sweet(BMS))的懸液培養(yǎng)物維持在加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6培養(yǎng)基(2N63S)(Chu等，1975)中。從迅速生長(zhǎng)3天的培養(yǎng)物中取玉米細(xì)胞懸液，用于轟擊實(shí)驗(yàn)。轟擊前，在7cm濾紙上真空過(guò)濾(Whatman，N°4)約0.5ml堆積保積的細(xì)胞。轟擊前將鋪敷的細(xì)胞在含有120g/L蔗糖的植物瓊脂固化的2N6培養(yǎng)基上保留4小時(shí)。為了穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，于轟擊后24小時(shí)將濾紙移到2N63S固化培養(yǎng)基上。然后以8天間隔期隨增加Basta濃度在新鮮培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移濾膜，直到培養(yǎng)物中的大部分細(xì)胞停止生長(zhǎng)。這種現(xiàn)象是在含8-10mg/L Basta的平皿上經(jīng)過(guò)4-6周選擇后逐漸出現(xiàn)的。然后將濾膜上發(fā)育的單獨(dú)的愈傷組織移至加有Basta(10mg/L)的植物瓊脂固化的培養(yǎng)基上。在同樣培養(yǎng)基上進(jìn)行兩次傳代培養(yǎng)后，將大約100mg玉米細(xì)胞接種到25mL添加了Basta(10mg/L)的液體培養(yǎng)基中，從中產(chǎn)生用于DNA分離的懸浮培養(yǎng)物。
轟擊植物細(xì)胞用上面已沉積了質(zhì)?；旌衔锏慕鹞⒘＾Z擊組織。在瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中使用pGUS質(zhì)粒DNA作為內(nèi)部對(duì)照。為進(jìn)行共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，金顆粒應(yīng)攜帶等質(zhì)量的所有各質(zhì)粒DNA(每個(gè)靶平板有0.5μg各質(zhì)粒DNA)。為進(jìn)行穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，共轉(zhuǎn)化混合物含有分別攜帶侵入性基因的質(zhì)粒和bar選擇質(zhì)粒，這些質(zhì)粒的摩爾比為1∶1或2∶1。轟擊每個(gè)靶平板的每一等份質(zhì)粒混合物分別含有0.4μg選擇標(biāo)志和0.4μg或0.8μg pwi35SAdhD1和pwiAdh35SD2，和/或pwiAdh35SE2質(zhì)粒DNA。以10μl的總?cè)莘e混合適當(dāng)量的每種DNA，用50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亞精胺游離堿沉淀，以使DNA沉積在50μl 0.3μm金微載體上(60mg/ml)。使用在制動(dòng)屏板下方8cm處置有樣品的1100psi破裂盤以PDS-1000He基因槍裝置(DuPont)進(jìn)行微粒轟擊。
瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)按照供應(yīng)商(Luciferase assay system，Promega)推薦的方法檢測(cè)組織提取物中的熒光素酶。用GUS-Light試劑盒(Tropix)以化學(xué)發(fā)光法測(cè)定β-葡糖醛酸酶活性。使用Analytical Luminescence2001型發(fā)光計(jì)于25℃下積分10秒種測(cè)定熒光素酶和β-葡糖醛酸酶活性，并以光單位數(shù)表示之。
DNA提取和Southern印跡雜交接種后10天，經(jīng)過(guò)濾收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，并放在液氮中冷凍保存。按已述方法(Hall等，1991)分離DNA。
用EcoRI消化約10μg基因組DNA。在0.7％瓊脂糖凝膠上分離后，將DNA轉(zhuǎn)移到Amersham Hybonel膜上并按照制造商(Amer-sham)所述的條件進(jìn)行雜交。使用Pharmacia的Oligo標(biāo)記試劑盒，用[α-32P]dCTP標(biāo)記DNA。Bar探針相當(dāng)于Bar基因的0.5KbBg1 II片段。luc探針相當(dāng)于熒光素酶基因的0.7Kb XbaI-EcoRI片段。為了除去探針，于100℃下用0.1％SDS溶液將膜洗提5分鐘。
T-DNA/植物DNA接頭的克隆用EcoRI消化得自轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織中的DNA(30μg)，并在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行制備性電泳。從凝膠上切掉相應(yīng)于欲克隆之片段大小的瓊脂糖凝膠片，并用基因清除(gene clean)試劑盒從中提取DNA。然后將這些片段克隆到pUC18的去磷酸化EcoRI位點(diǎn)中。以電穿孔法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞。使用0.5Kb Bar片段作為探針，以菌落濾膜雜交法鑒定有正確插入片段的質(zhì)粒。然后用BamHI-EcoRI消化得自陽(yáng)性克隆的DNA。BamHI在距離右邊緣序列3bp處有一個(gè)切割位點(diǎn)。將此片段重新克隆到pUC18的相應(yīng)位點(diǎn)中。使用通用引物分析供體質(zhì)粒DNA與植物DNA接合處的序列。
結(jié)果試驗(yàn)植物中由VirD1和VirD2基因產(chǎn)物切割邊緣序列的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)法為了研究VirD1和VirD2基因產(chǎn)物在植物中表達(dá)時(shí)是否能切割T-DNA邊緣序列，對(duì)試驗(yàn)質(zhì)粒pwiRBLuc和pRBLuc進(jìn)行檢測(cè)分析。它們都含有位于啟動(dòng)子和熒光素酶基因編碼區(qū)之間的底物T-DNA邊緣序列。pRBLuc是pUC衍生物，而pwi是小麥矮化病毒(WDV)衍生的載體，其可在玉米細(xì)胞中復(fù)制，并由兩個(gè)互補(bǔ)性有義ORF，即病毒復(fù)制所需的C1和C2，及大腸桿菌中的p15A復(fù)制原點(diǎn)組成。該載體不含有參予病毒傳播和病狀發(fā)展的ORFV1和OR-FV2(Ugaki等，1991)。由VirD1和VirD2基因產(chǎn)物引入位點(diǎn)特異性切口將導(dǎo)致作為熒光素酶mRNA之模板的DNA鏈斷裂，并因此而減少熒光素酶轉(zhuǎn)錄物和酶的產(chǎn)生。用pRBLuc或pwiRBLuc與攜帶VirD基因(其處于CaMV35S啟動(dòng)子的控制下)的質(zhì)粒共轟擊后，在邊緣序列上的任何缺口都應(yīng)能通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性而定量檢測(cè)出來(lái)。
用pRBLuc DNA或用pwiRBLuc DNA轟擊的玉米細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了熒光素酶基因的高水平表達(dá)。將pwiD1 DNA和pwiD2 DNA與pRBLuc DNA或與pwiRBLuc DNA一起共運(yùn)送到玉米細(xì)胞中，可使熒光素酶對(duì)GUS活性降低10倍(表8)。共運(yùn)送pwiD2 DNA與pwiRBLuc DNA也可使熒光素酶對(duì)GUS活性降低10倍。這一結(jié)果可解釋為WDV具有由一個(gè)環(huán)形單鏈DNA構(gòu)成的基因組，它們通過(guò)一個(gè)居中的雙鏈在被感染細(xì)胞核中擴(kuò)增，前者繼后被用作病毒鏈DNA滾環(huán)復(fù)制的模板(Saunders等，1991；Stenger等，1991)。已證明VirD2可在體外切割單鏈寡核苷酸(Pansegrau等，1993，Jasper等，1994)切割雙粒病毒組中的ssDNA并不需要VirD1。
對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的分析穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化玉米懸液細(xì)胞，以估測(cè)在使用基因槍裝置共輸送VirD1和VirD2基因與其底物DNA之后，VirD2和VirD2基因產(chǎn)物對(duì)DNA整合模式的作用。為進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，我們使用了含有左T-DNA邊緣、作為可選擇標(biāo)志的Bar基因，及在啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間插入了右T-DNA邊緣的35SRBLuc基因的pwiBarRBluc和pBBarRBLuc。對(duì)VirD介導(dǎo)的整合事件的篩分是基于被轉(zhuǎn)化克隆中沒有熒光素酶活性，這是因?yàn)閺膒wiBarLuc中或從pBarRBLuc上切斷T-DNA進(jìn)而排除Luc編碼區(qū)而產(chǎn)生的。這種在Vir基因產(chǎn)物作用于邊緣序列產(chǎn)生T-鏈后出現(xiàn)事件被稱為“農(nóng)桿菌轟擊”事件。相反，“生物轟擊事件”則是玉米基因組中的插入片段，其代表了借助生物轟擊工具將基因傳送到植物細(xì)胞內(nèi)之后正常出現(xiàn)的事件。
用比例為1∶1∶1或1∶2∶2的pBarRBLuc或pwiBarRBLuc質(zhì)粒DNA連同pwiD1和pwiD2DNA包被的微粒轟擊玉米懸液細(xì)胞。作為對(duì)照組，還單獨(dú)用pwiBarRBLuc和pBarRBLuc質(zhì)料進(jìn)行轟擊。通過(guò)在含Basta的培養(yǎng)基上培養(yǎng)來(lái)選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。轟擊后3-4周每個(gè)濾膜上平均出現(xiàn)了8-10個(gè)Basta抗性克隆，但對(duì)每個(gè)平板上的一小組克隆作進(jìn)一步分析。當(dāng)p35AdhE2質(zhì)粒DNA與其他侵入性基因共傳送時(shí)，每個(gè)濾膜回收到稍高數(shù)目的愈傷組織(12-15個(gè))。可根據(jù)經(jīng)分析表明不表達(dá)熒光素酶的Basta抗性愈傷組織的總數(shù)對(duì)Basta愈傷組織的總數(shù)的比例來(lái)粗略估計(jì)農(nóng)桿菌轟擊事件的頻率。按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)pBarRBLuc與pwi35SAdhD1和pwi35SAdhD2質(zhì)粒DNA共運(yùn)送時(shí)，農(nóng)桿菌轟擊事件的發(fā)生率約為20％。當(dāng)所用的靶質(zhì)粒是pwiBarRBLuc時(shí)，這一發(fā)生率提高到大約40％。當(dāng)pwi35SAdhE2也與上述質(zhì)粒共運(yùn)送時(shí)，這一發(fā)生率增加到約50％。
Southern分析就分子水平來(lái)說(shuō)，代表農(nóng)桿菌轟擊事件的插入片段應(yīng)與Bar探針雜交，而不與luc探針雜交。此外，在農(nóng)桿菌轟擊事件中，被導(dǎo)入的DNA和植物DNA間接頭的序列準(zhǔn)確地相應(yīng)于T鏈的右邊緣末端。在同一植物中可發(fā)生兩種類型的事件，但這樣的克隆一般被記為基于熒光素酶活性存在的生物轟擊事件。以Southern雜交法研究生物轟擊和假定的農(nóng)桿菌轟擊事件，以檢測(cè)每種類型插入的發(fā)生頻率。
對(duì)用下列質(zhì)粒DNA轟擊后得到的Basta抗性愈傷組織細(xì)胞系進(jìn)行Southern印跡雜交(i)pwiBarRBLuc DNA；(ii)pwiBarRBLuc、pwiD1和pwiD2 DNA，(iii)pwiBarRBLuc、pwiD1、pwiD2和pwiE2DNA，(iv)pBarRBLuc DNA和(v)pBarRBLuc、pwiD1、pwiD2 DNA。
如在表9中總結(jié)的，印跡分析揭示出三組轉(zhuǎn)基因愈傷組織細(xì)胞系(i)其中一些愈傷細(xì)胞系與bar和neo探針雜交的愈傷組織細(xì)胞系；(ii)其中某些插入片段只與bar探針雜交，而某些插入片段則與兩種探針雜交的愈傷組織細(xì)胞系；(iii)具有只與bar探針雜交的插入片段的愈傷組織細(xì)胞系。第一組愈傷組織可能不包含農(nóng)桿菌轟擊事件。第二組愈傷組織可能包含兩種類型的事件；農(nóng)桿菌轟擊事件和生物轟擊事件。第三組愈傷組織只表現(xiàn)有假定的農(nóng)桿菌轟擊事件。例如，在pwiBarRBLuc、pwiD1和pwiD2轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析的10個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米中，有3個(gè)包含生物轟擊事件，6個(gè)含有假定的農(nóng)桿菌轟擊事件，1個(gè)兼有兩者。分立細(xì)胞系的雜交模式獨(dú)特地顯示，愈傷組織細(xì)胞系具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)化過(guò)程。
對(duì)假定的農(nóng)桿菌轟擊事件的分子分析經(jīng)檢測(cè)被整合DNA和植物DNA之間的接頭序列，證實(shí)假定的農(nóng)桿菌轟擊事件的性質(zhì)。核苷酸序列分析表明，其中每個(gè)片段都含有右邊緣/植物DNA接頭。如預(yù)期的生物轟擊事件那樣，被插入片段的右終點(diǎn)完全相同于T-DNA之右邊緣序列的切割位點(diǎn)。
表8玉米細(xì)胞中VirD1和VirD2的活性質(zhì)粒 均值±SDpwi35SRBLuc 15.0±1.2pwi35SRBLuc+pwi35SAdhD1(1∶1) 8.1 ±1.1pwi35SRBLuc+pwi35SAdhD2(1∶1) 0.7 ±0.3p3wi35SRBLuc+pwi35SAdhD1+pwi35SAdhD2(1∶1∶1) 0.2 ±0.1p35SRBLuc 17.6±1.2p35SRBLuc+pwi35SAdhD1+pwi35SAdhD2(1∶1∶1) 0.8 ±0.1p35SRBLuc+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶1∶1) 1.0 ±0.2無(wú)DNA 0.2借助生物轟擊裝置將DNA運(yùn)送到玉米細(xì)胞中。括號(hào)內(nèi)數(shù)字代表質(zhì)粒的比例。保溫24小時(shí)后，制備組織勻漿并測(cè)定酶活性。作為DNA轉(zhuǎn)移效率的對(duì)照，各次轟擊中均包括表達(dá)β-葡糖醛酸酶(GUS)的質(zhì)粒(pGUS)，并以熒光素酶對(duì)GUS活性的比例來(lái)表示報(bào)導(dǎo)基因的活性。分析獨(dú)立的轟擊并以三次重復(fù)的平均值加或減標(biāo)準(zhǔn)差的形式給出有關(guān)數(shù)據(jù)。
表9對(duì)用靶質(zhì)粒和/或Vir基因轟擊BMS細(xì)胞后回收的Bastar抗性愈傷組織的分析質(zhì)粒 愈傷組織熒光素Southern事件類型酶活性pwiBarRBLuc(0.2μg)16 15Luc(+)55B1Luc(-)pwiBarRBLuc+pwiD1+pwiD219 10Luc(-)10 3B，6A，1A+B(0.4μg+0.4μg+0.4μg)9Luc(+) 98B，1B+ApwiBarRBLuc+pwiD1+pwiD211 8Luc(-) 41B，2A，1B+A(0.4μg+0.8μg+0.8μg)3Luc(+) 11BpwiBarRBLuc+pwiD1+pwiD2+ 21 10Luc(-)41B，2ApwiE2 11Luc(+)55B(0.4μg+0.4μg+0.4μg+0.4μg)pBarRBLuc(0.4μg) 10 9 Luc(+)22BpBarRBLuc+pwiD1+pwiD2 38 7 Luc(-)44B(0.4μg+0.4μg+0.4μg)31 Luc(+) 54B，1B+A括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的DNA的濃度。
B＝生物轟擊事件；A＝農(nóng)桿菌轟擊事件；Southern＝用Southern雜交法分析的愈傷組織的數(shù)目；愈傷組織＝分析熒光素酶活性的愈傷組織的數(shù)目。
實(shí)施例6玉米和煙草細(xì)胞中VirD1和VirD2在單一啟動(dòng)子下的表達(dá)為了實(shí)現(xiàn)細(xì)菌基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)，細(xì)菌基因的個(gè)別編碼區(qū)必須融合到分立的植物啟動(dòng)子上，因?yàn)檎婧藛?dòng)子不允許在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。雖然使每個(gè)基因融合到一個(gè)分立的啟動(dòng)子上是可以作得到的，但目前還存在幾個(gè)困難例如，如將同一啟動(dòng)子用于不同的基因則可出現(xiàn)基因沉默。本實(shí)施例中已證明的一個(gè)戰(zhàn)略是將兩基因串聯(lián)連接到一個(gè)植物啟動(dòng)子上。該多基因信息包括均屬于農(nóng)桿菌之VirD操縱子的VirD1和VirD2兩個(gè)編碼序列。
由VirD操縱子的5′半側(cè)編碼的兩個(gè)多肽在啟動(dòng)DNA加工，以從農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移T-DNA中起著關(guān)鍵性作用。VirD2是鏈特異性內(nèi)切核酸酶，其在VirD1的幫助下于第三和第四個(gè)堿基之間切割T-DNA邊緣序列。VirD2保持共價(jià)連接到T-DNA的5′末端，并據(jù)信引導(dǎo)T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞，并參予使T-DNA的5′端連接到植物基因組中。已表明當(dāng)鉤連到植物啟動(dòng)子上時(shí)，這兩個(gè)蛋白質(zhì)是有功能的。
在本實(shí)施例中，工程化構(gòu)建由單個(gè)植物啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的VirD1和VirD2基因組成的表達(dá)單位，已證明其在植物內(nèi)是能功能性表達(dá)的。作為轉(zhuǎn)錄融合體或翻譯融合體連接個(gè)別基因，并顯示在后一種情況下可在植物細(xì)胞中保留它們的酶促活性。
材料的方法D1-D2或D2-D1融合體的構(gòu)建構(gòu)建兩種類型的融合體1)轉(zhuǎn)錄融合體使用在VirD1和VirD2編碼區(qū)之間存在有小間隙(33nt)的VirD1和VirD2編碼區(qū)的序列。將p35SD1的1.1Kb Not1-Pst1片段和p35D2的1.5Kb Pst1-Xba1片段克隆到pSK+的Not1-Spe1位點(diǎn)中，以得到p35StpD1D2。
2)翻譯融合體也通過(guò)一個(gè)中間序列使侵性基因VirD1和VirD相融合，以充許兩蛋白質(zhì)自由運(yùn)動(dòng)，并使之對(duì)翻譯后切割敏感。對(duì)于p35SD1D2來(lái)說(shuō)，VirD1編碼區(qū)是在融合體的5′端，而p35SD2D1則在啟動(dòng)子之后直接含有VirD2區(qū)。所有修飾都得到DNA測(cè)序的證實(shí)。
p35SD1D2的構(gòu)建為了產(chǎn)生編碼VirD1和VirD2的VirD1-VirD2融合體，去除VirD1的終止密碼子和VirD2的起始密碼子。為此將一個(gè)退火的DNA寡核苷酸對(duì)克隆到pUC21的EcoR1-HindIII中，在p35SD1的0.48Kb EcoR1-BanI片段上和p35SD2的0.25Kb Pvu1-Hind III片段上側(cè)連上BanI粘端和pvuI粘端。退火的核苷酸對(duì)由下列寡核苷酸組成5′-GTGCCTTGCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACACCTAGCCCCGAT-3′(SEQ ID NO15)和5′-CGGGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAGGGAGTTGGGGGAGTAGAAGGCAAG-3′(SEQ ID NO16).
然后將包括VirD1編碼區(qū)、接頭和VirD2編碼區(qū)之5′端的該構(gòu)建體的EcoRI-PstI片段插入到p35SD2的EcoRI-PstI位點(diǎn)中，得到p35SD1D2。
p35SD2D1的構(gòu)建同樣，質(zhì)粒pD2D1含有在pD2D1的5′端上含有VirD2編碼區(qū)，其在框內(nèi)通過(guò)同樣的中間序列連接到VirD1編碼區(qū)上。首先從重疊寡核苷酸重新構(gòu)建VirD1的N末端編碼序列，以在5′端提供EcoR1位點(diǎn)，并刪去VirD1的第一個(gè)密碼子(5′-AATTCTCAAAACACACCAGAGTCACGTCGAGTGAGACT-GCCATCAACCAGCAT-3′；SEQ ID NO17)。將這些退火的寡核苷酸克隆到pBluescript KS+(Stratagene，lnc)中，以產(chǎn)生pKS5′D1。然后將p35SD2中的1.3Kb Sac II-BfaI片段和Sac II-EcoR1切割的pKS5′D1質(zhì)粒DNA與一接頭連接，所說(shuō)的接頭在5′端包含Bfal位點(diǎn)的改變，從而使之缺少VirD2的天然終止密碼子。
(5′-TATCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACAC-CTAGC-3′(SEQ ID NO18) 和 5′-AATTGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAG-GGAGTTGGGGGAGTAGAAGGA-3′(SEQ ID NO19))，然后將包括VirD2編碼區(qū)、接頭和VirD1編碼區(qū)之5′端的EcoRI-ClaI片段克隆到p35SD1的EcoR1-Cla1位點(diǎn)中，得到p35SD2D1。
試驗(yàn)質(zhì)粒的構(gòu)建pwBarBLuc、pRBLuc的構(gòu)建如實(shí)施例5中所述。
植物材料如上面實(shí)施例中所述制備以生物轟擊裝置進(jìn)行轟擊的玉米(B73衍生株)和煙草(NT-1)懸液細(xì)胞。
轟擊植物細(xì)胞
用已沉積了質(zhì)?；旌衔锏慕鹞⒘＾Z擊組織。為進(jìn)行共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，金顆粒攜帶有0.5μg或1μg試驗(yàn)質(zhì)粒，以及總共2μg(煙草細(xì)胞)或4μg(玉米細(xì)胞)輔助質(zhì)粒?；旌线m當(dāng)量的pUV18質(zhì)粒DNA以使混合物中保有等質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(見表10和表11)。用2.5MCaCl2和0.1M亞精胺游離堿將DNA沉淀到50μl 0.3μm金微載體上(60mg/ml)。使用在制動(dòng)屏架下方8cm處理有樣品的1550psi破裂盤，以PDS-1000 He生物轟擊裝置(DuPont)進(jìn)行微粒轟擊。
瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)按照供應(yīng)商(Luciferase assay system，Promega)推薦的方法檢測(cè)組織提取物中的熒光素酶。于25℃用Analytical Luminescence 2001型發(fā)光計(jì)(積分10秒鐘)檢測(cè)光單位并以其表示熒光素酶活性。為了計(jì)算比活性，使用Bio-Rad蛋白檢測(cè)盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。
結(jié)果和討論融合設(shè)計(jì)策略VirD1和VirD2基因是從根癌農(nóng)桿菌的章魚氨酸pTiA6質(zhì)粒衍生的。p35StpD1D2攜帶的轉(zhuǎn)錄融合體含有VirD1和VirD2的編碼區(qū)，連同存在于VirD操縱子中的天然中間序列。
p35SD1D2和p35SD2D1攜帶的翻譯融合體含有通過(guò)中間序列融合的VirD1和VirD2編碼區(qū)，所說(shuō)的中間序列充許兩蛋白質(zhì)自由運(yùn)動(dòng)并且對(duì)翻譯后切割敏感。
多基因在植物內(nèi)的功能性表達(dá)為了檢測(cè)轉(zhuǎn)錄和翻譯融合體的功能性表達(dá)，用生物轟擊裝置將p35StpD1D2、p35SD1D2和p35SD2D1與試驗(yàn)質(zhì)粒共運(yùn)送到植物細(xì)胞內(nèi)。試驗(yàn)質(zhì)粒含有插入啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間的右邊緣序列，以這樣一種方式使鏈特異性切割發(fā)生在該序列之內(nèi)，從而導(dǎo)致熒光素酶表達(dá)的降低。在玉米細(xì)胞檢測(cè)兩種類型的試驗(yàn)質(zhì)粒pUC衍生質(zhì)粒(pRBLuc)和小麥矮化雙粒病毒組衍生的質(zhì)粒(pwBar-RBLuc)。
為了試驗(yàn)VirD1和VirD2基因通過(guò)T-DNA邊緣序列影響轉(zhuǎn)錄的能力，首先用共運(yùn)送的試驗(yàn)質(zhì)粒與分別由不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的VirD1和VirD2基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化玉米和煙草細(xì)胞。將p35SD1 DNA和p35SD2 DNA與pRBLuc或pwBarRBLuc DNA共運(yùn)送后，觀察到煙草和玉米組織中熒光素酶活性分別為對(duì)照組水平的0.3％和1％(表10，11和12)。
轉(zhuǎn)錄融合體的兩種Vir基因在一起似乎稍有活性。用生物轟擊裝置共運(yùn)送等量的pRBLuc和p35StpD1D2 DNA(1∶1比例)，在煙草中使熒光素酶活性約降低到對(duì)照組的57％(表12)，玉米細(xì)胞中降低到60-80％(表10和11)。p35StpD1D2質(zhì)粒與試驗(yàn)質(zhì)粒的比例較高(2∶1)時(shí)，熒光素酶活性沒有明顯的進(jìn)一步降低。
使用攜帶翻譯融合體的p35SD1D2質(zhì)粒進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)顯示，煙草細(xì)胞(表12)和玉米細(xì)胞(表10和11)中熒光素酶活性分別降低到對(duì)照組的約12％和22-47％。當(dāng)p35SD1D2質(zhì)粒和試驗(yàn)質(zhì)粒的比例較高(2∶1)時(shí)，所有情況下熒光素酶活性都進(jìn)一步降低到大約2-5％。
倒轉(zhuǎn)翻譯融合體p35SD2D1中侵入性基因的天然定向，產(chǎn)生與使用p35SD1D2相似的結(jié)果(表10、11和12)。
這些觀察強(qiáng)有力地表明，翻譯融合體在植物內(nèi)是有功能的。
表10用pUC衍生載體作為試驗(yàn)質(zhì)粒時(shí)，轉(zhuǎn)錄和翻譯融合體在玉米細(xì)胞中的活性運(yùn)送到玉米細(xì)胞中的質(zhì)粒熒光素酶活性 ％對(duì)照pRBLuc+pUC18 12333±543100(1μg+4μg)pRBLuc+p35SD1+p35SD2 182±43 1.5(1μg+2μg+2μg)pRBLuc+p35SD1D2+pUC18 5744±290 47(1μg+2μg+2μg)pRBLuc+p35SD1D2 300±12 2.4(1μg+4μg)pRBLuc+p35SD2D1+pUC18 5920±813 48(1μg+2μg+2μg)
pRBLuc+p35SD2D1 329±59 2.6(1μg+4μg)pRBLuc+p35StpD1D2+pUC18 7312±1091 60(1μg+2μg+2μg)pRBLuc+p35StpD1D26436±61552(1μg+4μg)表10用生物轟擊裝置將DNA運(yùn)送到玉米細(xì)胞中。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示質(zhì)粒的比例。保溫24小時(shí)后，制備組織勻漿并檢測(cè)熒光素酶活性，該活性以光單位/μg蛋白質(zhì)表示。分析獨(dú)立的轟擊結(jié)果，并以3次重復(fù)的平均值加或減標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)給出所得數(shù)據(jù)表11用雙粒病毒組衍生載體作為試驗(yàn)質(zhì)粒時(shí)，轉(zhuǎn)錄和翻譯融合體在玉米細(xì)胞中的活性運(yùn)送到玉米細(xì)胞中的質(zhì)粒 熒光素酶活性 ％對(duì)照pwBarRBLuc+pUC18531±38 100(1μg+4μg)pwBarRBLuc+p35SD1+p35SD25±3 1(1μg+2μg+2μg)pwBarRBLuc+p35SD1D2+pUC18 115±23 22(1μg+2μg+2μg)pwBarRBLuc+p35SD1D2 32±4 6(1μg+4μg)pwBarRBLuc+p35SD2D1+pUC18 60±1011(1μg+2μg+2μg)pwBarRBLuc+p35SD2D1 19±3 3.6(1μg+4μg)pwBarRBLuc+p35StpD1D2+pUC18 431±115 81(1μg+2μg+2μg)pwBarRBLuc+p35StpD1D2 380±53 72(1μg+4μg)腳注內(nèi)容同表10。
表12轉(zhuǎn)錄和翻譯融合體在煙草細(xì)胞中的活性運(yùn)送到玉米細(xì)胞中的質(zhì)粒 熒光素酶活性 ％對(duì)照pRBLuc+pUC18 21611±760100(0.5μg+2μg)pRBLuc+p35SD1+p35SD2 60±1 0.3(0.5μg+1μg+1μg)pRBLuc+p35SD1D2+pUC182494±44 12(0.5μg+1μg+1μg)pRBLuc+p35SD1D2 1179±183 5.4(0.5μg+2μg)pRBLuc+p35SD2D1+pUC181603±422 7.4(0.5μg+1μg+1μg)pRBLuc+p35SD2D1 1071±113 5(0.5μg+2μg)pRBLuc+p35StpD1D2+pUC18 12240±1417 57(0.5μg+1μg+1μg)pRBLuc+p35StpD1D211627±2491 54(0.5μg+2μg)腳注內(nèi)容同表10。
實(shí)施例7VirE2在轉(zhuǎn)化效率中的作用在玉米細(xì)胞中試驗(yàn)“修復(fù)”載體增加農(nóng)桿菌轟擊發(fā)生頻率的能力。所使用的這一載體含有位于T-DNA結(jié)構(gòu)內(nèi)，右邊緣序列左側(cè)的聚腺苷酸化信號(hào)。
在實(shí)驗(yàn)的第二部分，VirE2與VirD1和VirD2基因共運(yùn)送。已顯示該蛋白質(zhì)是有效地轉(zhuǎn)移T-DNA所需要的，但不影響T-DNA產(chǎn)生(Stachel等，1986)。VirE2在體外協(xié)同和非特異地結(jié)合到單鏈DNA上。VirE2可參予保護(hù)T鏈。VirE2蛋白質(zhì)是誘導(dǎo)侵入性基因后在根癌農(nóng)桿菌中產(chǎn)生的最豐富蛋白質(zhì)(Stachel等，1986)。因?yàn)閂irE2具有核定位信號(hào)，并且是在植物內(nèi)被識(shí)別的(例如參見Zupan和Zambryski，1995)，所以期望在植物內(nèi)引入該基因時(shí)獲得較高的轉(zhuǎn)化率。
材料和方法在右邊緣處含有聚腺苷酸化信號(hào)的載體pAVM1的構(gòu)建(見圖6-15)A.pC1B1711-HN的構(gòu)建用BamHI消化pC1B1711并重新連接成1711δB，其中EcoR1位點(diǎn)(現(xiàn)為獨(dú)有的)被切斷并經(jīng)插入一個(gè)同時(shí)產(chǎn)生的HindIII和NotI位點(diǎn)而被破壞。經(jīng)序列分析，我們鑒定出一個(gè)其中這些位點(diǎn)的朝向(在Sac1位點(diǎn)后)是KpnI然后是HindIII的克隆。為了恢復(fù)原質(zhì)粒中丟失的部分，我們首先插入以正確方向攜帶Luc編碼區(qū)的大的BamHI片段，形成1711-HN-B；然后我們用原pC1B1711的相應(yīng)部分取代其Xba1插入片段，重新導(dǎo)入丟失的前導(dǎo)序列。
B.在EcoRI和Luc編碼區(qū)末端的BamH1位點(diǎn)之間導(dǎo)入合成的寡核苷酸邊緣序列，我們將Not1/Cla1片段亞克隆到pBluescript中，以在插入片段中提供單一的EcoR1和BamHI位點(diǎn)。插入邊緣寡核苷酸后形成pBS-NC-RB，我們將其經(jīng)修飾的Not1/Cla1插入片段送回pC1B1711-HN骨架上，形成pC1B1711-HN-RB。
C.將左邊緣T-DNA插入pUbiPATδ1中為了除掉pUC1AC的內(nèi)含子中的不需要的EcoR1位點(diǎn)，我們用Cla1消化該質(zhì)粒(生長(zhǎng)于dam-菌株SCS110中)，去掉兩個(gè)包括EcoR1位點(diǎn)的小片段。然后引入一個(gè)用來(lái)去掉Cla1位點(diǎn)并造成Sph1位點(diǎn)的寡核苷酸，形成質(zhì)粒pUbiPATδ1。我們將pTiT37(在從一個(gè)末端計(jì)起的68堿基對(duì)位置上攜帶有T-DNA左邊緣的胭脂氨酸型Ti質(zhì)粒，Yadav，N. S.，Vanderleyden，J.，Bennet，D. Barnes，W. M.，和Chilton，M. -D.，1982)的EcoRI片段29克隆到嵌合PAT基因之末端上的新的單一EcoR1位點(diǎn)中。短的同向重復(fù)序列側(cè)接胭脂氨酸Ti質(zhì)粒上的T-DNA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)79，6322-6326)，形成LB-UbiPATδ1。
D.pAVM1的組裝切掉pC1B1711-HN-RB的HindIII插入片段，并連接到LB-UbiPATδ1的HindIII位點(diǎn)中。經(jīng)基因作圖，我們鑒定了一個(gè)左和右邊緣側(cè)接PAT基因，并且有轉(zhuǎn)移所需正確方向的構(gòu)建體。所得到的質(zhì)粒具有Luc基因啟動(dòng)子和處在T-DNA之外的編碼區(qū)，但其終止子正好在右邊緣之內(nèi)。
玉米懸液細(xì)胞使玉米(Zea Mays cv. Black Mexican Sweet(BMS))的懸液培養(yǎng)物維持于加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6培養(yǎng)基(2N63S)中(Chu等，1975)。從迅速生長(zhǎng)3天的培養(yǎng)物中取出用于轟擊實(shí)驗(yàn)的玉米細(xì)胞懸液。轟擊前，在7cm濾紙(Whatman，N°4)上真空過(guò)濾約0.5ml堆積體積的細(xì)胞。轟擊前將鋪敷的細(xì)胞在含有120g/L蔗糖的植物瓊脂固化的2N6培養(yǎng)基上25℃放置4小時(shí)。為了穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，轟擊后24小時(shí)將濾紙轉(zhuǎn)到2N63S固化培養(yǎng)基上。然后以8天間隔期相繼將濾膜轉(zhuǎn)移到有漸增濃度的Bastar的新鮮培養(yǎng)基上，直到培養(yǎng)物中的大部分細(xì)胞停止生長(zhǎng)為止。這種情況一般是在含有8-10mg/L Basta的平板上選擇4-6周后出現(xiàn)。然后將濾紙上發(fā)育的獨(dú)立的愈傷組織轉(zhuǎn)到加有Bas-ta(10mg/L)的植物瓊脂固化的培養(yǎng)基上。在同樣培養(yǎng)基上兩次亞培養(yǎng)后，將大約100mg玉米細(xì)胞接種到25ml添加有Basta(10mg/L)的液體培養(yǎng)基中以制備用于分離DNA的懸液培養(yǎng)物。
轟擊植物細(xì)胞用其上面沉積有質(zhì)?；旌衔锏慕鹞⒘＾Z擊組織。共轉(zhuǎn)化混合物含有比例為1∶1.3的攜帶侵入性基因的質(zhì)粒和bar選擇質(zhì)粒。轟擊每個(gè)靶平板的每一等份質(zhì)?；旌衔锞?.6μg選擇標(biāo)志和各0.8μgp35SAdhD1及p35SAdhD2和/或p35SAdhE2質(zhì)粒DNA組成。以總?cè)莘e10μl昆合適當(dāng)量的各種DNA，并用50μl 2.5M CaCl2和20μl0.1M亞精胺游離堿使之沉淀于50μl 0.3μm金微載體(60mg/L)上。使用制動(dòng)屏架下方8cm處置有樣品的1100psi破碎盤，用pDS-1000He生物轟擊裝置(DuPont)進(jìn)行微粒轟擊。
DNA提取和Southern印跡雜交接種后10天過(guò)濾收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并將其置于液氮中冷凍保存。按已述方法(Hall等，1991)提取DNA。
用EcoR1消化大約10μg基因組DNA。在0.7％瓊脂糖凝膠上分離后，將DNA轉(zhuǎn)移至Amersham Hybond+膜上并按照制造商(Amersham)所述的條件進(jìn)行雜交。使用Pharmacia的oligo標(biāo)記試劑盒，用[a-32P]dCTP標(biāo)記DNA探針。PAT探針相應(yīng)于pat基因的0.7Kb PstI片段。luc探針相應(yīng)于熒光素酶基因的0.7Kb XbaI-EcoRI片段。為了除去探針，于100℃下將膜用0.1％SDS的溶液沖洗5分鐘。
結(jié)果分析穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體對(duì)玉米懸液細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，以估計(jì)在用生物轟擊裝置隨侵入性基因共運(yùn)送pAVM1載體后該載體對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。前種載體具有處于右邊緣內(nèi)的35S啟動(dòng)子，其方向可以很容易地為表達(dá)其中插入了T鏈的反義基因提供一種手段。在這一新型的載體中，35S啟動(dòng)子被右邊緣內(nèi)的35S終止子取代，其取向應(yīng)是使其插入在3′末端，從而得以“修復(fù)”靶基因。
為進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)而使用了pAVM1，該載體含有右T-DNA邊緣、作為可選擇標(biāo)志的PAT、35S終止子、右T-DNA邊緣，和處于T-DNA樣結(jié)構(gòu)以外的熒光素酶基因。我們稱為“農(nóng)桿菌轟擊事件”的是那些DNA插入玉米基因組中發(fā)生在Vir基因產(chǎn)物作用于邊緣序列，產(chǎn)生T鏈之后。相反，我們稱為“生物轟擊事件”的則是那些代表了借助生物轟擊裝置將基因運(yùn)送到植物細(xì)胞中后出現(xiàn)的正常事件的DNA插入。區(qū)分生物轟擊事件和假想的農(nóng)桿菌轟擊過(guò)程的最初標(biāo)準(zhǔn)是被轉(zhuǎn)化的克隆中沒有熒光素酶活性，這是由于從pAVM1中切掉T-DNA進(jìn)而排除Luc編碼區(qū)引起的。
用pAVM1質(zhì)粒DNA連同p35SAdhD1、p35SAdhD2和/或p35SAdhE2DNA包被的微粒轟擊玉米懸液細(xì)胞。作為對(duì)照，還單獨(dú)用pAVM1轟擊。在含Basta培養(yǎng)基上選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。單用pAVM1轟擊后每個(gè)濾膜約可回收到5-8個(gè)愈傷組織。用pAVM1、p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhE2 DNA轟擊玉米細(xì)胞后4-5周每個(gè)濾膜平均可回收10個(gè)Basta抗性克隆。每個(gè)平板只對(duì)某些克隆作進(jìn)一步分析。用pAVM1、p35SAdhD1和p35SAdhD2 DNA轟擊的濾膜上出現(xiàn)大約2-3個(gè)愈傷組織。這種差異可能是起因于VirE2基因的存在，該基因編碼參予保護(hù)T鏈的單鏈DNA結(jié)合蛋白。已顯示該蛋白質(zhì)是有效地轉(zhuǎn)移T-DNA所必需的，而T-DNA生成則不需要其參予(Stachel等，1986)。
可以用經(jīng)分析表明有表達(dá)熒光素酶的Basta抗性愈傷組織的總數(shù)對(duì)總Basta抗性愈傷組織數(shù)的比例來(lái)估計(jì)農(nóng)桿菌轟擊事件的發(fā)生頻率。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)pAVM1與p35SAdhD1和p35SAdhD2DNA共運(yùn)送時(shí)，農(nóng)桿菌轟擊事件的發(fā)生頻率約為25％。當(dāng)pwiE2也與上述質(zhì)粒共運(yùn)送時(shí)這一頻率稍有增加，達(dá)到約50％。
Southern分析在分子水平上，代表農(nóng)桿菌轟擊事件的轉(zhuǎn)基因應(yīng)與Bar探針雜交，而不與luc探針雜交。兩種事件可發(fā)生在同一植物細(xì)胞中，但基于熒光素酶活性的存在，這樣的克隆一般應(yīng)記為生物轟擊事件。用Southern雜交法研究生物轟擊和假想的農(nóng)桿菌轟擊事件，以估測(cè)每種類型插入的發(fā)生頻率。用(i)pAVM1 DNA和(ii)pAVM1，p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhE2 DNA轟擊后得到Basta抗性愈傷組織，并對(duì)其DNA進(jìn)行Southern印跡雜交。結(jié)果總結(jié)于下列表13中。
表13對(duì)用pAVM1加或不加Vir基因轟擊玉米細(xì)胞后回收的Basta抗性愈傷組織的分析質(zhì)粒 愈傷組織 熒光素酶活性 Southern事件類型pAVM114 14Luc(+) 33BpAVM1+D1+D2 10 2Luc(-) 未分析8Luc(+)pAVM1+D1+D2+E24414Luc(-) 74A，1A+B，2B30Luc(+) 33B結(jié)論a)用pAVM1轟擊時(shí)農(nóng)桿菌轟擊事件對(duì)生物轟擊事件的比例約為35％，并且是在常見的20-40％這一百分比范圍內(nèi)。
b)VirE2的存在可改善轉(zhuǎn)化效率。
因?yàn)閂irE2具有核定位信號(hào)并且是在植物內(nèi)被識(shí)別的(如參見Zupan和Zambryski，植物生理學(xué)1071041-1047(1995))，所以當(dāng)將該基因?qū)胫参镏袝r(shí)獲得了預(yù)期的較高轉(zhuǎn)化率。表達(dá)VirE2基因的轉(zhuǎn)基因植物能夠彌補(bǔ)農(nóng)桿菌的VirE突變，從而為VirE2蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中起重要作用提供了證據(jù)。
實(shí)施例8VirD1和VirD2 mRNA轟擊玉米細(xì)胞本實(shí)施例描述向植物細(xì)胞運(yùn)送作為mRNA的VirD1和VirD2基因，及它們作用于T-DNA邊緣序列的活性。
材料和方法玉米細(xì)胞從選自B73相關(guān)優(yōu)良品系之未成熟胚的冷凍保存的胚發(fā)生II型愈傷細(xì)胞開始制備玉米(Zea mays L.)的懸液培養(yǎng)物，并使之生長(zhǎng)于添加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6液體培養(yǎng)基(2N63S)(Clu等，1975)中。在暗處25℃下，于150rpm軌道振蕩器上保溫培養(yǎng)物。每7天從懸液培養(yǎng)物中取1ml堆積細(xì)胞移入50ml新鮮2N63S液體培養(yǎng)基中進(jìn)行亞培養(yǎng)。取3天齡迅速生長(zhǎng)的培養(yǎng)物，作為用于轟擊實(shí)驗(yàn)的玉米懸液。轟擊前，在7cm濾紙(Whatman，N°4)上真空過(guò)濾約0.5ml堆積細(xì)胞。
煙草細(xì)胞將Nicotiana tabacum細(xì)胞系NT-1培養(yǎng)在添加有2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murachige和Skoog培養(yǎng)基中。向加在50ml培養(yǎng)瓶中的100ml新鮮培養(yǎng)基內(nèi)加入5ml接種物，將細(xì)胞每周亞培養(yǎng)1次。在125rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，于27℃下保溫培養(yǎng)瓶。亞培養(yǎng)后4天取0.5ml等份的細(xì)胞散布于無(wú)菌濾紙(Whatman，N4)上。然后將濾膜移到MS培養(yǎng)基上。
質(zhì)粒構(gòu)建含有T7啟動(dòng)子和polyA尾的載體的構(gòu)建將含有下限制性位點(diǎn)(SphI-EcoRI-NheI-ClaI-Bgl II-Asp718-Hind III-XhoI-Hind*III，最后的HindIII作為殺傷位點(diǎn))的多接頭插入到pT7RecA50的SphI-Hind III位點(diǎn)中。然后將指定的Asp718-A(50)-Dra1-Hind III寡聚體插入到相應(yīng)位點(diǎn)中，得到pT7-A50。該寡聚體的互補(bǔ)鏈具有下示結(jié)構(gòu)(SEQ ID NO20)5′-CGAATTCGCTAGCATCGATAGATCTGGTACCAAAGCTTCTCGAGT-3′|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||3′-GTACGCTTAAGCGATCGTAGCTATCTAGACCATGGTTTCGAAGAGCTCATCGA-5′(SEQ ID NO21)pT7D1A50的構(gòu)建將D1編碼區(qū)的EcoR1-Bgl II片段預(yù)先克隆到pSG5(來(lái)自p35SAdh1D1的EcoR1-BamHI片段)的EcoR1-BamH1中。
pT7D2polyA的構(gòu)建(參見圖16-26)A.分離修剪的片段用EcoRI從p35SD2上切下VirD2編碼區(qū)，以制備性凝膠電泳法分離并從瓊脂糖中提取DNA。內(nèi)部位點(diǎn)使得有必要在亞片段上對(duì)VirD2的5′和3′末端進(jìn)行修剪。用PvuI修整從5′末端分離的HindIII/EcoRI片段，以產(chǎn)生片段A。用HaeIII修整從3′末端分離的BamH1/EcoRI片段以產(chǎn)生片段C。經(jīng)Hind III/BamHI消化得到中央片段B。
B.片段A和B的克隆用HindIII和SphI消化載體pTC182，并將片段A加上SphI末端的銜接頭寡核苷酸(其恢復(fù)起始密碼子)連接到適當(dāng)?shù)奈恢?，以形成pTC182-A。用HindIII和BamHI消化該質(zhì)粒，并將片段B連接到A的3′端。切下結(jié)合的片段AB并在用BamHI/Sph1消化所得質(zhì)粒pTC182-A-B后進(jìn)行凝膠純化。
C.在修飾的pUC21載體中克隆片段AB和C去掉BamHI和XbaI之間pUC21多接頭的部分并用寡核苷酸對(duì)取代之，以恢復(fù)大多數(shù)位點(diǎn)，包括我們的構(gòu)建中所需要的Bg1 II位點(diǎn)。用BamHI和EcoRV消化所得到的質(zhì)粒pUC21-X，并將片段C連接到該載體中以形成pUC21-C。然后用BamHI和Sph1消化該產(chǎn)物并連接如上分離的片段AB，以構(gòu)建VirD2。用Sph1和Bg1 II消化所得到的質(zhì)粒pUC21-VirD2后，我們用凝膠純化了含有修剪的VirD2 ORF的片段ABC。
D.將VirD2克隆到T7轉(zhuǎn)錄載體中用SphI和Bg1 II消化上述轉(zhuǎn)錄載體T7polyA，并將片段ABC(＝VirD2)連接到T7啟動(dòng)子下游和42A殘基區(qū)段之上游的位置。
mRNA合成用XhoI(其在poly(A)段的緊下游切割)將T7D1A50和T7D2A50質(zhì)粒切成線性。用苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀線性化DNA。使用含有[m7G(5′)ppp(5′)]和T7Cap-Scribe藥盒(Boehringer)中的T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄線性化DNA。以瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定mRNA的完整性和濃度。
生物轟擊工具的消毒將60mg金顆粒(0.3μm-Heraeus)放在100％乙醇和0.1％DE-PC中消毒。將顆粒用無(wú)核酸酶的水淋洗3次，然后重懸于1ml無(wú)核酸酶的50％甘油溶液中。50μl等分的制備好的顆粒用于6次發(fā)射。將微載體浸沒在100％乙醇和0.1％DEPC中，然后用100％乙醇洗3次并風(fēng)干。高壓消毒制動(dòng)屏。
核酸沉淀依次加入0.5μl Tris緩沖液(1M)、50μl CaCl2和2.5μl 0.1M亞精胺，以使DNA(1μg)和mRNA(約8μg∶4μg D1、4μgD2或8μg非特異性mRNA)沉淀在50μl金顆粒懸液(60mg/ml；0.3μm)上。所有試劑都加完之后，連續(xù)旋轉(zhuǎn)3分鐘，之后經(jīng)簡(jiǎn)單離心(1分鐘)沉降出顆粒。去掉上清并用冷的100％乙醇將顆粒洗一次，然后重懸于60μl100％乙醇中。旋轉(zhuǎn)該混合物，抽取10μl等份加到微載體盤上并在層流罩中風(fēng)干。
向植物細(xì)胞微粒運(yùn)送使用在離發(fā)射組件5.5cm處置有樣品的1550psi破碎盤，以顆粒加速器(PDS-He1000；DuPont)將微粒運(yùn)送到植物細(xì)胞。100μm目不銹鋼屏放在制動(dòng)板和組織正中間。轟擊靶平板2次。
熒光素酶檢測(cè)使用Promega的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)，按供應(yīng)商推薦的方法檢測(cè)組織提取物中的熒光素酶和Gus。于25℃下用Analytical Lumines-cence 2001型發(fā)光計(jì)測(cè)光單位(10秒鐘)，并以其表示熒光素酶和β-葡糖醛酸酶活性。
結(jié)果轟擊后24小時(shí)進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)試驗(yàn)。D1和D2的mRNA與p35SRBLuc(其含有插入在35S啟動(dòng)子和熒光素酶編碼序列之間的右邊緣序列)共轟擊。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，將p35SRBluc與非特異性mRNA一起轟擊，或者D1和D2mRNA與不含任何邊緣序列的pLUC DNA共運(yùn)送。結(jié)果顯示于下列表14中。
表14向玉米細(xì)胞中共傳遞D1和D2 mRNA與靶質(zhì)粒靶質(zhì)?！續(xù)RNA均值 ±SD ％對(duì)照pRB(+)Luc 3.2 ±0.3100％pRB(+)Luc+D1mRNA2.7 ±0.284％pRB(+)Luc+D2mRNA1.4 ±0.244％pRB(+)Luc+D1mRNA+D2mRNA(1∶1∶1)0.6 ±0.218％pRB(+)Luc+D1mRNA+D2mRNA(1∶2∶2)0.4 ±0.112％pRB(+)Luc+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶1∶1) 0.1 ±0.13％pLuc3.6 ±0.2100％pLuc+D1mRNA+D2mRNA(1∶1∶1) 3.7 ±0.3102％保溫24小時(shí)后，制備組織習(xí)漿并檢測(cè)酶活性。各次轟擊中均包括表達(dá)β-葡糖醛酸酶(GUS)的質(zhì)粒pGUS作為DNA轉(zhuǎn)移效率的對(duì)照，并以熒光素酶對(duì)GUS活性的比例表示報(bào)導(dǎo)分子的活性。分析各獨(dú)立的轟擊，結(jié)果以3次重復(fù)的平均值加或減標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)熒光素酶對(duì)β-葡糖醛酸酶活性(用對(duì)照質(zhì)粒觀察到的那些活性)的比例確定％對(duì)照值。
結(jié)論與pRB(+)Luc DNA一起共運(yùn)送D1 mRNA和D2 mRNA后，觀察到熒光素酶活性降低10倍。作為mRNA向植物細(xì)胞運(yùn)送的兩種Vir基因似乎具有協(xié)同作用。這些觀察結(jié)果強(qiáng)有力地表明，熒光素酶活性的降低似乎是Vir基因產(chǎn)物在右邊緣序列上進(jìn)行鏈特異性切割的結(jié)果。
mRNA運(yùn)送的優(yōu)點(diǎn)在于其效應(yīng)必然是瞬時(shí)的。沒有輔助質(zhì)粒的外來(lái)DNA。
實(shí)施例9原生質(zhì)體中的“農(nóng)桿菌轟擊”轉(zhuǎn)化技術(shù)是遺傳操作和改善作物品種的重要工具(Raskin，1996)。多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可將外來(lái)遺傳材料直接轉(zhuǎn)移到能夠產(chǎn)生能育植物的細(xì)胞內(nèi)。這些系統(tǒng)包括借助電穿孔或直接DNA攝入將DNA運(yùn)送到原生質(zhì)體中、微注射到細(xì)胞內(nèi)，以及用DNA包被的微粒轟擊進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移(參見Morrish和Fromm，1992)。在已有的運(yùn)送系統(tǒng)中，有一個(gè)整合外來(lái)基因的多個(gè)拷貝的傾向。因此需要有一種方法，能夠形成一種在沒有載體序列的情況整合外來(lái)基因的簡(jiǎn)單模式。
本文描述的稱為“農(nóng)桿菌轟擊”的轉(zhuǎn)化方法有可能產(chǎn)生以簡(jiǎn)單模式插入外來(lái)基因并且不包括載體序列的轉(zhuǎn)基因材料。該方法是使用適于侵入性基因的植物表達(dá)盒，所說(shuō)的基因在形成和保護(hù)與含有側(cè)接可選擇標(biāo)志之T-DNA邊緣序列共運(yùn)送的T-DNA(VirD1、VirD2和VirE2)中起著關(guān)鍵性作用。在前面的實(shí)施例中，已證明在借助生物轟擊裝置將所有這些元件運(yùn)送到植物細(xì)胞中時(shí)，該技術(shù)是可行的。
本實(shí)施例中，我們利用直接向原生質(zhì)體運(yùn)送DNA的方法運(yùn)送所有這些元件。我們已發(fā)現(xiàn)，以這種方式運(yùn)送的VirD1和VirD2基因產(chǎn)物確實(shí)可產(chǎn)生T-DNA型插入事件，并且VirE2基因產(chǎn)物的卷入可增加轉(zhuǎn)化的頻率。
材料和方法質(zhì)料pClB1711是pUC衍生物，其含有由花柳菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蟲熒光素基因，并已在實(shí)施例3中作了描述。為了導(dǎo)入T-DNA邊緣，將相應(yīng)于LBA5269(Van Haaren等，1989)之右邊緣序列的兩個(gè)合成的寡核苷酸退火，得到雙鏈體5′-ATCCGGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3′(SEQID NO22)。將此側(cè)接BamHI-Pst1位點(diǎn)的雙鏈體在啟動(dòng)子和熒光素酶編碼序列之間插入pC1B1711的相應(yīng)位點(diǎn)中，得到pRBLuc(參見圖2)。pNeoRBLuc含有左邊緣序列、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt II)和熒光素酶基因，后者帶有插入到啟動(dòng)子與來(lái)自pRB(+)Luc的熒光素酶編碼區(qū)之間的右邊緣序列。作為2.2Kb SacII-HindIII)片段從質(zhì)粒pBin19上切下由nos(胭脂氨酸合酶)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的nptII基因。將這些片段一起插入pRB(+)Luc的Xba1-HindIII位點(diǎn)中。pNeoLuc是沒有插入在CaMV35S啟動(dòng)子和熒光素酶編碼區(qū)之間的右邊緣序列的pNeoRBLuc的等同物。
將來(lái)自pTiA6的VirD1和VirD2基因亞克隆到表達(dá)載體pMF6(Callis等，1987)中，該載體由CaMV35S啟動(dòng)子(0.5Kb)、Adh1第一內(nèi)含子(0.5Kb)和胭脂氨酸合酶(nos)聚腺苷酸化區(qū)(0.25Kb)組成(圖1)。將相當(dāng)于VirD1編碼序列的來(lái)自pAD1187的EcoR1-Pst1片段克隆到pMF6中，得到p35SAdhD1。從pAD1190(Ghai &Das，1989)中切掉作為1.8Kb EcoR1片段的VirD2編碼序列并克隆到pMF6中，得到p35SAdhD2。
從含有農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTiA6(登記號(hào)X04784)(Winans等，1987)之3Kb XhoI片段的pw108中克隆VirE2編碼區(qū)。首先將pw108的687 bp SacI-Sma1片段克隆到pKS(-)的相應(yīng)位點(diǎn)中，得到pKS3′E2。將pw108中的924bp HaeIII-SacI與pKS3′E2中的SacI-PstI片段和側(cè)接EcoRI粘端及平端的退火的DNA寡核苷酸對(duì)(5′-AATTCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3′；SEQ ID NO23)結(jié)合，并克隆到pBluescript KS-(Stratagene，Inc)的EcoR1-Pst1位點(diǎn)中，得到pKSE2。然后將復(fù)蓋整個(gè)VirE2編碼區(qū)的Xho1-Pst1片段亞克隆到pMF6的Xho1-Pst1中，得到p35SAdhE2。
植物材料玉米懸液細(xì)胞將玉米(Zea Mays cv Black Mexican Sweet(BMS))的懸液培養(yǎng)物保持在添加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6培養(yǎng)基(2N63S)(Chu等，1975)中。用于實(shí)驗(yàn)的玉米細(xì)胞懸液取自3天齡迅速生長(zhǎng)的培養(yǎng)物。
按照“黑墨西哥甜玉米的組織培養(yǎng)應(yīng)用，生物研究用的玉米”，W. F. Sheridan編著，Charlottesville，Va.植物分子生物學(xué)會(huì)(1982)p.385-388中所述的方法，從玉米近交系BMS(Black mex-ican sweet)的細(xì)胞懸液培養(yǎng)物中分離原生質(zhì)體。轉(zhuǎn)化后2天在培養(yǎng)基中加入巴龍霉素(200mg/L)。將轉(zhuǎn)化后約4周顯現(xiàn)的獨(dú)立的小愈傷組織轉(zhuǎn)移到加有200μg/ml巴龍霉素的新鮮平板上。在同樣培養(yǎng)基上進(jìn)行兩次亞培養(yǎng)后，將大約100mg玉米細(xì)胞接種到25ml加有200μg/ml巴龍霉素的液體培養(yǎng)基中以制備懸液培養(yǎng)物。用如表15中所述的不同濃度的pNeoRBLuc DNA加或不加p35SAdhD1、p35SAdhD2和/或p35SAdhE2轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。
DNA提取和Southern印跡雜交接種后10天過(guò)濾收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并冷凍在液氮中。按已述方法(Mall等，1991)分離DNA。
用EcoR1消化約10μg基因組DNA。在0.7％瓊脂糖上分離后，將DNA轉(zhuǎn)移到Mybond+膜上并按照制造商(Amersham)所述的條件進(jìn)行雜交。使用Pharmacia的寡標(biāo)記試劑盒，用[α-32P]dCTP標(biāo)記DNA探針。neo探針相應(yīng)于npt11基因的0.3KB PstI-SphI片段。luc探針相應(yīng)于熒光毒酶基因的0.7Kb XbaI-EcoRI片段。為了去掉探針，于100℃下將膜用0.5％SDS溶液浸洗5分鐘。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)載體以便可借助遺傳學(xué)試驗(yàn)篩選VirD1和VirD2介導(dǎo)的插入事件。載體pNeoRBluc含有來(lái)自Ti質(zhì)粒的天然左邊緣、nos-NPT11-nos(帶有胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子和終止子序列的嵌合新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因)、35S啟動(dòng)子、合成的右邊緣序列和熒光素酶編碼區(qū)。通過(guò)通常機(jī)制轉(zhuǎn)化的巴龍霉素抗性玉米愈傷組織一定總是含有熒光素酶基因并表達(dá)熒光素酶。相反，沒有表達(dá)任何熒光素酶的克隆才是VirD1和VirD2介導(dǎo)的切除和T鏈整合的候選產(chǎn)物。為了在植物細(xì)胞中表達(dá)VirD1、VirD2和VirE2，它們各自的開放讀框(ORF)都應(yīng)處在CaMV35S啟動(dòng)子的控制之下。
分析穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體用不同比例的pNeoRBluc質(zhì)粒DNA與p35SAdhD1和p35SAdhD2和/或p35SAdhE2 DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。作為對(duì)照，還單獨(dú)運(yùn)送pNeoRBLuc質(zhì)粒。根據(jù)在含巴龍霉素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)pNeoRBLuc與VirD1和VirD2基因共運(yùn)送時(shí)，每個(gè)板上平均出現(xiàn)120個(gè)巴龍霉素抗性克隆，但只對(duì)其中30個(gè)愈傷組織作進(jìn)一步分析。當(dāng)向侵入性基因的混合物中加入VirE2時(shí)，巴龍霉素抗性愈傷組織的數(shù)目可達(dá)到250個(gè)。
分析每組實(shí)驗(yàn)中的30個(gè)巴龍霉素抗性克隆，發(fā)現(xiàn)大約10-40％不表達(dá)熒光素酶，提示VirD1-VirD2介導(dǎo)的整合發(fā)生頻率約為10-40％。這可能對(duì)“農(nóng)桿菌轟擊”事件的發(fā)生頻率估計(jì)不足，因?yàn)樵?0％的熒光素酶陽(yáng)性組中包括含兩種插入片段的克隆。從加或不加VirE2基因的實(shí)驗(yàn)中回收的不表達(dá)熒光素酶的愈傷組織頻率沒有明顯差異。
對(duì)轉(zhuǎn)化體克隆的Southern印跡分析對(duì)用下列質(zhì)粒轟擊后得到的對(duì)照巴龍霉素抗性愈傷組織系的DNA進(jìn)行Southern印跡雜交分析(i)單獨(dú)pNeoRBLuc；(ii)pNeoR-BLuc質(zhì)粒與p35SAdhD1和p35SAdhD2 DNA共轉(zhuǎn)化；(iii)pNeoR-BLuc質(zhì)粒與p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhE2DNA共轉(zhuǎn)化。
用EcoRI消化基因組DNA，結(jié)果由pNeoRBLuc質(zhì)粒產(chǎn)生一個(gè)與neo和luc探針同源的3.9Kb片段。EcoRI片段具有一個(gè)在pNe-oRBLuc的T-DNA結(jié)構(gòu)部分內(nèi)的位點(diǎn)，且另一個(gè)在熒光素酶編碼區(qū)中。
從單用pNeoRBLuc轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體回收的對(duì)照轉(zhuǎn)化體呈現(xiàn)出預(yù)期的3.9Kb EcoR1片段，該片段與luc和neo兩探針雜交。第一個(gè)片段的拷貝數(shù)大于5，而可見有重排的和/或分離的DNA的多個(gè)拷貝。
表15中給出對(duì)共運(yùn)送pNeoRBLuc與p35SAdhD1、p35SAdhD2和/或p35SAdhE2質(zhì)粒DNA后得到的巴龍霉素抗性愈傷組織系的DNA所作Southern印跡分析結(jié)果。為進(jìn)行Southern印跡分析，選擇經(jīng)試驗(yàn)顯示熒光素酶活性為陰性的愈傷組織系。例如，對(duì)實(shí)驗(yàn)#8中回收的8個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米系進(jìn)行Southern雜交分析，4個(gè)表現(xiàn)有生物轟擊事件，4個(gè)表現(xiàn)有假想的農(nóng)桿菌轟擊事件。正如根據(jù)與包括在同一雜交濾膜中的拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品所作比較判定的，估計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)化體基因組的NPTII基因拷貝數(shù)一般為1或2個(gè)。包含與neo探針和luc探針雜交的基因組DNA的愈傷組織系比單用pNeoLuc DNA轉(zhuǎn)化后回收的愈傷組織系呈現(xiàn)出較少的拷貝。
表15轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)愈傷實(shí)驗(yàn)# 靶質(zhì)?！纕ir基因 Luc(-)/30 Southern 事件類型組織#1 pNeoRBLuc 3(5μg)#2 pNeoRBLuc 20(10μg)#3 pNeoRBLuc 85 4[luc+] 4B(20μg)#4 pNeoRBLuc+p35AdhD1 101 5Luc(-) 2 1NT，1B+p35AdhD2(5μg+20μg+20μg)#5 pNeoRBLuc+p35AdhD1+ 123 5Luc(-) 1B+A，p35AdhD2 3B，1NT(10μg+20μg+20μg)
#6 pNeoRBLuc+p35AdhD1+147 6Luc(-) 6 1A，2B，p35AdhD23NT(20μg+20μg+20μg)#7 pNeoRBLuc+p35AdhD1+219 9Luc(-) 5 2A，1Bp35AdhD2+p35AdhE2 1NT(5μg+20μg+20μg+20μg)#8 pNeoRBLuc+p35AdhD1+245 14Luc(-) 9 4A，4B，p35AdhD2+p35AdhE2 1NT(10μg+20μg+20μg+20μg)#9 pNeoRBLuc+p35AdhD1+ 268 7Luc(-) 1 1Ap35AdhD2+p35AdhE2(10μg+20μg+20μg+20μg)表中給出了轉(zhuǎn)化后4周記錄的個(gè)體愈傷組織的數(shù)目。
結(jié)論這些結(jié)果清楚地表明，本技術(shù)可簡(jiǎn)化運(yùn)送到原生質(zhì)體的外來(lái)基因整合的模式。VirD1-VirD2介導(dǎo)的整合發(fā)生頻率約為20-30％。此外，加入VirE2可改善轉(zhuǎn)化效率。本技術(shù)將有助于回收被轉(zhuǎn)化的植物，目的基因整合的模式簡(jiǎn)單且沒有多余DNA。
實(shí)施例10經(jīng)直接轟擊未成熟合子胚來(lái)轉(zhuǎn)化CG00526基因型玉米并使用膦絲菌素作為選擇劑分離被轉(zhuǎn)化的愈傷組織制備使用生物轟擊裝置轟擊的DNA可按照Koziel等人(生物技術(shù)11194-200，1993，其中相關(guān)部分列為本文參考文獻(xiàn))所述的方法轉(zhuǎn)化玉米的未成熟胚或I型愈傷組織。
基本上按照已公開的方法，于微米大小金顆粒(一般1.0mm或0.3mm直徑)存在下經(jīng)化學(xué)沉淀制備用于微粒轟擊的DNA。除了金顆粒外，也可使用其他微米大小的致密顆粒，如鎢或鉑顆粒。在一改進(jìn)的方法中，首先將顆粒本身懸浮在水中并進(jìn)行超聲處理以制備之。然后離心沉淀超聲處理的顆粒并重新懸浮于50％甘油的含水溶液中。然后將按這種方法制備的顆粒以50μl容積平均分配到每管約含有約3mg金顆粒的各試管中。根據(jù)待用質(zhì)粒數(shù)、其大小，及所需的DNA終濃度，以不同的量向每個(gè)試管中加入DNA。
然后，依次向各管內(nèi)加入約50μl 2.5M CaCl2和約20μl 0.1M亞精胺，同時(shí)渦旋約3分鐘。然后輕輕離心DNA/金復(fù)合物。去除上清。用250μl無(wú)水乙醇將顆粒洗一次，再次離心沉淀，并重新懸浮于約75μl新鮮無(wú)水乙醇中。以這種方法制備的每管DNA/金復(fù)合物可使用PDS-1000/He裝置“發(fā)射”6次。于無(wú)振動(dòng)環(huán)境中將10μl充分懸浮的DNA/金復(fù)合物吸移到各個(gè)微載體片上。
在PDS-1000/He裝置中，因打破在不同程度壓力下應(yīng)用的塑料園盤而釋放出一股氦。例如，可以獲得在每平方英吋氦200、450、650、900、1000、1350、1550、1800、2000和2200磅的猝發(fā)壓力下破壞的單個(gè)盤或組合盤。這股氣體推動(dòng)微載體片后者由不銹鋼屏制動(dòng)。屏可以是有不同篩目的，例如10×10、16×16、24×24等。其他設(shè)定是微載體飛行距離、缺口距離和顆粒飛行距離。制造商提供的使用說(shuō)明書中詳細(xì)描述了這些設(shè)定。一般使用的缺口距離約為5.5mm，微載體飛行距離約為10mm，顆粒飛行距離約為6-9cm。此外，可將—屏或隔板插在制動(dòng)屏和靶板之間的顆粒飛行距離之內(nèi)。這樣的屏可干擾從膨脹氣體發(fā)出的沖擊波，從而減小對(duì)靶的損害。在一個(gè)實(shí)例中，使用有大約100μm開口的不銹鋼屏。也可使用有其他開口大小和材料組分的屏。
可以按不同圖形將未成熟胚或I型胚發(fā)生愈傷組織安排在靶板上。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，建立了適于不成熟胚的最佳排布圖形。在一種最佳圖形中，將未成熟胚按直徑約2cm的環(huán)形排列。將未成熟胚放在環(huán)的外周。每個(gè)靶板上放大約25個(gè)未成熟胚。此外，靶板可與微載體發(fā)射組件有一定的角度。這樣可保證使未成熟胚的向基部被散出顆粒最大程度地飽和。未成熟胚的向基部分是產(chǎn)生胚發(fā)生反應(yīng)的部分。
在轟擊I型胚發(fā)生愈傷組織的一個(gè)實(shí)例中，將愈傷組織放在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上約1cm直徑環(huán)的外周上。轟擊裝置的機(jī)械設(shè)定可放在與上面列舉的轟擊未成熟胚的設(shè)定相似或相同的位置上。
應(yīng)指出的是，靶圖形和發(fā)射槍設(shè)定是相互關(guān)聯(lián)的。換句話說(shuō)，在微粒轟擊裝置上使用其他機(jī)械設(shè)定可產(chǎn)生受體組織在靶板上的其他最佳排布。機(jī)械設(shè)定和靶圖形的其他組合包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
轉(zhuǎn)化自花授粉后約14獲得未成熟胚。以每靶板25個(gè)未成熟胚，在含有能夠誘導(dǎo)和支持胚發(fā)生愈傷組織生成之培養(yǎng)基的不同靶板間分配未成熟合子胚。用使用PDS1000/He裝置(BioRad)，用質(zhì)粒p35SAdhD1、p35SAdhD2和T-DNA靶質(zhì)粒(pbarRBLuc或pAVM1)的混合物轟擊未成熟合子胚。也可包括用作VirE2基因的可表達(dá)DNA?；旧习凑杖缟厦枋龅囊压_方法使質(zhì)粒沉淀在0.3或1μm金顆粒上。使用1100-1300磅的猝發(fā)壓力，每個(gè)靶板用質(zhì)粒和金顆粒制劑射擊兩次。
因?yàn)橘|(zhì)粒pbarRBluc含有編碼抗膦絲菌素(Phosphinothricin)抗性的嵌合基因，所以可用該物質(zhì)體外選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。轟擊后1天以3mg/L應(yīng)用這種選擇劑，并總共維持8-12周。于1mg/L膦絲菌素存在下繁殖如此得到的胚發(fā)生愈傷組織。
按照美國(guó)專利申請(qǐng)07/759,243(申請(qǐng)日1991年9月13日，其相關(guān)部分列為本文參考文獻(xiàn))中所述，用氯酚紅(CR)試驗(yàn)檢查所有愈傷組織的抗PPT抗性。該試驗(yàn)是利用pH敏感指示劑染料顯示那些于PPT存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞。生長(zhǎng)的細(xì)胞引起培養(yǎng)基中的pH改變，并使指示劑氯酚紅從紅變黃。該試驗(yàn)中很容易鑒定出表達(dá)抗PPT抗性基因的植物。用PCR法檢驗(yàn)CR試驗(yàn)陽(yáng)性的植物，以分析bar基因的存在。
檢驗(yàn)含有可選擇標(biāo)志基因的植物中熒光素酶的表達(dá)情況。沒有熒光素酶活性即指示愈傷組織可能是農(nóng)桿菌轟擊的。農(nóng)桿菌轟擊事件是其中DNA以與T-DNA插入相類似的方式整合到玉米DNA中，而沒有農(nóng)桿菌的介導(dǎo)。用Southern印跡法分折熒光素酶基因表達(dá)呈陰性的植物。經(jīng)Southern印跡分析觀察到的帶形表明這些轉(zhuǎn)化體的性質(zhì)是農(nóng)桿菌轟擊的。
實(shí)施例11經(jīng)直接轟擊未成熟合子胚轉(zhuǎn)化A188基因型玉米并使用膦絲菌素作為選擇劑分離被轉(zhuǎn)化的植物使188基因型玉米的復(fù)穗狀花序自花授粉并于大約12-14天后得到未成熟合子胚。將未成熟合子胚鋪敷在2JMS+5Dc加Ag-NO3培養(yǎng)基上。16-20小時(shí)后，將未成熟合子胚轉(zhuǎn)移到含有12％蔗糖的同一培養(yǎng)基上。3-5小時(shí)后，借用PDS1000/He裝置用質(zhì)粒p35SAdhD1、p35SAdhD2和T-DNA靶質(zhì)粒(pbarRBluc或pAVM1)的混合物轟擊未成熟合子胚。轟擊材料中還可包括VirE2基因的可表達(dá)DNA?；旧习凑杖缟衔拿枋龅腂ioRad已公開的方法使質(zhì)粒沉淀在0.3或1μm金顆粒上。使用1100-1300磅的氦猝發(fā)壓力傳送顆粒。每個(gè)靶板用質(zhì)粒和金顆粒制劑擊射兩次。保溫過(guò)夜后，將未成熟胚轉(zhuǎn)移到新鮮的含有2％蔗糖和5-10mg/L膦絲菌素的培養(yǎng)基上，并大約每?jī)芍茉谕瑯优囵B(yǎng)基上亞培養(yǎng)一次。于1mg/L膦絲菌素存在下再生如此得到的胚發(fā)生愈傷組織。
用氯酚紅(CR)試驗(yàn)法檢驗(yàn)所有再生植物的抗PPT的抗性。對(duì)PPT有抗性的葉片改變培養(yǎng)基中的pH并使指示劑從紅變黃。該試驗(yàn)中很容易鑒定出表達(dá)抗PPT抗性基因的植物。用PCT法分析CR試驗(yàn)呈陽(yáng)性的植物中bar基因的存在。
檢測(cè)含有可選擇標(biāo)志基因的植物中熒光素酶基因的表達(dá)情況。沒有熒光素酶活性即指示愈傷組織可能是農(nóng)桿菌轟擊的。農(nóng)桿菌轟擊過(guò)程是其中DNA以與T-DNA插入相類似的方式整合到玉米DNA中，而沒有農(nóng)桿菌的介導(dǎo)。用Southern印跡法分析熒光素酶基因表達(dá)呈陰性的植物。Southern印跡上的帶形表明這些轉(zhuǎn)化體的性質(zhì)是農(nóng)桿菌轟擊的。
實(shí)施例12經(jīng)轟擊由未成熟合子胚衍生的I型愈傷組織以轉(zhuǎn)化CG00526基因型玉米并使用膦絲菌素作為選擇劑來(lái)分離被轉(zhuǎn)化的愈傷組織使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)從未成熟合子胚得到I型愈傷組織。為了進(jìn)行基因運(yùn)送，經(jīng)用解剖刀片切割而制備約300mg I型愈傷組織，用含有18％蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基淋洗3次并直接放在也含18％蔗糖的半固體培養(yǎng)基上。大約4小時(shí)后，使用BioRad的PDS-1000/He生物轟擊裝置轟擊組織。使用BioRad推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法將質(zhì)粒沉淀到0.3或1μm金顆粒上?；蜻\(yùn)送后大約16-20小時(shí)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有2％蔗糖和10mg/L膦絲菌素(作為Basta)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上。在選擇培養(yǎng)基上亞培養(yǎng)8周，然后將存活并生長(zhǎng)的愈傷組織移至標(biāo)準(zhǔn)再生培養(yǎng)基上以生產(chǎn)植物。
用氯酚紅(CR)試驗(yàn)法檢驗(yàn)所有再生的植物對(duì)PPT的抗性。該試驗(yàn)利用pH敏感性指示劑染料顯示那些可在PPT存在時(shí)生長(zhǎng)的細(xì)胞。生長(zhǎng)的細(xì)胞使培養(yǎng)基的pH發(fā)生改變并使指示劑從紅色變成黃色。用該試驗(yàn)很容易鑒定出表達(dá)抗PPT抗性的植物。用PCR法分析CR試驗(yàn)呈陽(yáng)性的植物中有無(wú)bar基因。
檢測(cè)含可選擇性標(biāo)志基因的植物中熒光素酶的表達(dá)。沒有熒光素酶活性即指示愈傷組織可能是農(nóng)桿菌轟擊的。農(nóng)桿菌轟擊事件是其中DNA以與T-DNA插入相類似的方式整合到玉米DNA中，而沒有農(nóng)桿菌的介導(dǎo)。以Southern印跡法分析熒光素酶基因表達(dá)陰性的植物。Southern印跡上的帶形表明這些轉(zhuǎn)化體的性質(zhì)是農(nóng)桿菌轟擊的。
實(shí)施例13經(jīng)轟擊從未成熟合子胚衍生的易碎懸液培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)化衍生于B73的玉米基因型的愈傷組織，并使用膦絲菌素作為選擇劑分離被轉(zhuǎn)化的愈傷組織按美國(guó)專利No.5,350,689(其列為本文參考文獻(xiàn))所述方法，平板接種衍生于B73的基因型未成熟胚，得到易碎愈傷細(xì)胞。在N6培養(yǎng)基中每周亞培養(yǎng)懸液培養(yǎng)物。通過(guò)710μm不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，收獲亞培養(yǎng)后3-5天的細(xì)胞，然后將其分布于Durapore(見CGC1280/81)膜的表面上。每個(gè)47mm直徑膜的表面上分布約0.4g細(xì)胞。將膜放在含12％蔗糖的N6培養(yǎng)基上，3-5小時(shí)后借助PDS1000/He裝置用攜帶vir基因的質(zhì)粒(35SAdhD1，p35SAdhD2)和T-DNA靶質(zhì)粒(pbarRBlue或pAVM1)的混合物轟擊。向細(xì)胞運(yùn)送等量(1∶1∶1)的VirD1、VirD2和35S-bar靶T-DNA(兩次沖擊總共各1.3μg)，或過(guò)量Vir基因(2次沖擊2∶2∶1μg)。這些實(shí)驗(yàn)中也可包括VirE2基因的可表達(dá)DNA。
基本上按照如前所述的BioRad的公開方法將質(zhì)粒沉淀到0.3或1μm金顆粒上。和用1100-1300磅的氦猝發(fā)壓力傳送顆粒。每個(gè)靶板接受兩次沖擊。過(guò)夜保溫后，將帶有愈傷組織的膜移到含有2％蔗糖和膦絲菌素(3mg/L)的新鮮維持液中。3周后將每個(gè)濾膜上的細(xì)胞分散于3塊含10mg/L Basta 2N6培養(yǎng)基的平板表面上。4周后，將生長(zhǎng)的集落移到含3mg/L Basta的新鮮2N6中，一周后用氯酚紅(CR)試驗(yàn)法檢驗(yàn)如此得到的愈傷組織是否有抗PPT抗性。該試驗(yàn)利用pH敏感性指示劑染料顯示于PPT存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞。生長(zhǎng)的細(xì)胞使培養(yǎng)基的pH發(fā)生改變，并使指示劑由紅色變成黃色。該試驗(yàn)很容易鑒定出表達(dá)抗PPT抗性的愈傷組織。使培養(yǎng)基變成黃色或桔黃色的陽(yáng)性葉片表明至少對(duì)PPT有一定的抗性，然后將它們放在含5mg/L Basta的2N6培養(yǎng)基上。
用PCR法分析CR試驗(yàn)陽(yáng)性的愈傷組織是否有bar或PAT基因。
表16鑒定玉米愈傷組織的被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系處理 黃色 桔黃色對(duì)照(1)0 1對(duì)照(2)0 02∶2∶10 1*1∶1∶1(1)21 2§1∶1∶1(2) 4 0表中(1)和(2)是進(jìn)行兩次重復(fù)處理*該集落是熒光素酶陽(yáng)性的§其中之一是推測(cè)的農(nóng)桿菌轟擊事件檢測(cè)含可選擇性標(biāo)志基因的愈傷組織中熒光素酶的表達(dá)。沒有熒光素酶活性即指示愈傷組織可能是農(nóng)桿菌轟擊的。農(nóng)桿菌轟擊事件是其中DNA以與T-DNA插入相類似的方式整合到玉米DNA中，而沒有農(nóng)桿菌的介導(dǎo)。以Southern印跡法分析熒光素酶基因表達(dá)陰性的愈傷組織。Southern印跡(圖)上的帶形表明這些轉(zhuǎn)化體的性質(zhì)是農(nóng)桿菌轟擊的。
表17分析用適于將T-DNA運(yùn)送到玉米細(xì)胞的構(gòu)建體轟擊玉米細(xì)胞后回收的玉米愈傷組織細(xì)胞系熒光素酶檢測(cè) 分析的數(shù)目農(nóng)桿菌轟擊 生物轟擊 農(nóng)桿菌/(Southern) (假定的) 生物轟擊luc+ 12 6 6luc- 11 9 4 3 2未分析的5該表顯示，本實(shí)驗(yàn)中分析的23個(gè)細(xì)胞系中，11個(gè)沒有熒光素酶活性，并且用Southern印跡法分析的9個(gè)細(xì)胞系中，4個(gè)只含有T-DNA樣插入片段，2個(gè)含有T-DNA樣插入片段和使用非生物(本例中為生物轟擊)方法運(yùn)送DNA后發(fā)現(xiàn)的典型插入片段。
實(shí)施例14經(jīng)轟擊由未成熟合子胚衍生的1型愈傷組織來(lái)轉(zhuǎn)化CG00526基因型玉米的愈傷組織，并使用膦絲菌素作為選擇劑以分離被轉(zhuǎn)化的愈傷組織按照Koziel等人(生物技術(shù)11194-200，1993)所述的方法平板接種基因型CG00526的未成熟胚，得到愈傷組織。
每周將培養(yǎng)物亞培養(yǎng)于維持液(2DG4+0.5mg/L 2，4-D)上，亞培養(yǎng)后2-3天取出細(xì)胞塊并在含12％蔗糖的2DG4培養(yǎng)基上放3-5小時(shí)。每個(gè)板上以8-10mm直徑的環(huán)形排列16片靶愈傷組織。使用攜帶Vir基因(35SAdhD1，35SAdhD2)的質(zhì)粒和T-DNA靶質(zhì)粒(pbarRBluc或pAVM1)，借助PDS1000/He裝置轟擊愈傷組織。將等量(1∶1∶1)的VirD1、VirD2和35S-bar靶T-DNA(2次沖擊，總共各1.3μg)或過(guò)量的Vir基因(2∶2∶1μg作兩次沖擊)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)。也可包括VirE2基因的可表達(dá)DNA。
基本上按照如上所述的BioRad公開的方法將質(zhì)粒沉淀到0.3或1μm金顆粒上。使用650磅的氦猝發(fā)壓力傳送顆粒。每個(gè)靶板接受2次沖擊。保溫過(guò)夜后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有2％蔗糖的新鮮維持液中。再過(guò)2周后將希望要的愈傷組織(顯示有典型的I型形態(tài))移到含有120mg/L Basta(PPT)的維持液中亞培養(yǎng)。4周后，將生長(zhǎng)的愈傷組織移到含30mg/L Bastar的新鮮維持液中。
經(jīng)過(guò)共8周選擇性亞培養(yǎng)愈傷組織后，將存活并生長(zhǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)再生培養(yǎng)基上以產(chǎn)生植物。用氯酚紅(CR)檢驗(yàn)法檢驗(yàn)再生的植物是否有抗PPT抗性。該試驗(yàn)利用pH敏感性指示劑染料顯示于PPT存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞。生長(zhǎng)的細(xì)胞改變培養(yǎng)基的pH并使指示劑由紅色變成黃色。該試驗(yàn)很容易鑒定出表達(dá)抗PPT抗性的愈傷組織。用PCR法分析CR試驗(yàn)呈陽(yáng)性的植物細(xì)胞中是否存在bar基因。
檢測(cè)含可選擇性標(biāo)志基因的植物中熒光素酶的表達(dá)。沒有熒光素酶活性即指示愈傷組織可能是農(nóng)桿菌轟擊的。農(nóng)桿菌轟擊事件是其中DNA以與T-DNA插入相類似的方式整合到玉米DNA中，而沒有農(nóng)桿菌的介導(dǎo)。以Southern印跡法分析熒光素酶基因表達(dá)陰性的植物。Southern印跡上的帶形表明這些轉(zhuǎn)化體的性質(zhì)是農(nóng)桿菌轟擊的。
實(shí)施例15用Vir基因和T-DNA靶序列轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體美國(guó)專利No.5,350,689中描述了從玉米的懸液培養(yǎng)物制備原生質(zhì)體及用DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。
例如用于轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的DNA可由質(zhì)粒p35SAdhD1、p35SAdhD2和T-DNA靶質(zhì)粒(pbarRBluc或pAVM1)的混合物組成。也可包括VirE2基因的可表達(dá)DNA(見實(shí)施例7)。從原生質(zhì)體回收愈傷組織，并按已述方法，使用膦絲菌素作為選擇劑再生植物。一般在用DNA處理后10天開始施用3-5mg/L PPT，以選擇被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體衍生的細(xì)胞。
用氯酚紅(CR)試驗(yàn)法檢驗(yàn)所有再生的植物對(duì)PPT的抗性。該試驗(yàn)利用pH敏感性指示劑染料顯示那些可在PPT存在時(shí)生長(zhǎng)的細(xì)胞。生長(zhǎng)的細(xì)胞使培養(yǎng)基的pH發(fā)生改變并使指示劑從紅色變成黃色。用該試驗(yàn)很容易鑒定出表達(dá)抗PPT抗性的植物。用PCR法分析CR試驗(yàn)呈陽(yáng)性的植物中有無(wú)bar基因。
檢測(cè)含可選擇性標(biāo)志基因的植物中熒光素酶的表達(dá)。沒有熒光素酶活性即指示愈傷組織可能是農(nóng)桿菌轟擊的。農(nóng)桿菌轟擊事件是其中DNA以與T-DNA插入相類似的方式整合到玉米DNA中，而沒有農(nóng)桿菌的介導(dǎo)。以Southern印跡法分析熒光素酶基因表達(dá)陰性的植物。Southern印跡上的帶形表明轉(zhuǎn)化體具有一個(gè)T-DNA樣插入片段?？梢赃M(jìn)行邊緣序列的克隆和測(cè)序，以進(jìn)一步證實(shí)插入片段的性質(zhì)。
雖然上文已描述了本發(fā)明的有限數(shù)目的實(shí)施例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)很容易理解到，在沒有從實(shí)質(zhì)上背離本發(fā)明的新技術(shù)和優(yōu)點(diǎn)的前提下可對(duì)這些實(shí)例作許多改動(dòng)。因此，所有這類改動(dòng)都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例中所列參考文獻(xiàn)的目錄Ahl Goy，P. & Duesing J.H.(1995)生物技術(shù)13，454-458。Albert，H.，Dale，E.C.，Lee，E. & Ow，D.W.(1995)植物雜志7，649-659。Albright，L.M.，Yanosky，M.F.Leroux，B.，Ma D.，& Nester，E. W.(1987)細(xì)菌學(xué)雜志169，1046-1055。An，G.(1985)植物生理學(xué)79，568-570。Bevan，M.(1984)核酸研究12，8711-8721。Callis，J.，F(xiàn)romm，M.E.，Walbot，V.(1987)Genes & Dev. 1，1183-1200。Chilton M-D.(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90，3119-3120。Chu，C.C.，Wang，C.C. Sun，C.S. Hsu，C.，Yin，K.G.，Chu，C.Y.& Bi，F(xiàn).Y.(1975)Sci. Sin. 18，659-668。Chyi，Y.S.，Jorgensen，R.A.，Golstein，D.，Tanksley，S.D. &Loaiza-Figueroa，F(xiàn).(1986)分子普通遺傳學(xué)(Mol. Gen. Genet.)204，64-69。Citovsky V.，Warnick，D. & Zambryski，P.(1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91，3210-3214.deWet，J.R，Wood，K.V.，DeLuca，M.，Helsinki，D.R.和Subra-mani，S.(1987)，”螢火蟲熒光素酶基因的結(jié)構(gòu)和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)”，分子細(xì)胞生物學(xué)7725-737。DiMaio，J.J. & Shillito，R.D.(1992)組織培養(yǎng)方法雜志(J. TissueCult. Methods)12，163-169。Dowson Day，M.J.，Ashurst，J.L.，Mathias，S.F.，Watts，J.W.，Wilson T.M.A.，& Dixon，R.A.(1993)植物分子生物學(xué)23，97-109。Durrenberger，F(xiàn).，Crameri，A.，Hohn，B.，& Koukolikova-Nico-la，Z.(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86，9154-9158。Filichkin，S.A. & Gelvin，S.B.(1993)分子微生物學(xué)(Mol.Micro-biol.)8，915-926。Fukushige，S. & Sauer，B.(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)89，7905-7909。Gallie，D.R.，Lucas，W.J. & Walbot，V.(1989)植物細(xì)胞1，301-311。Gallie，D.R.(1991)Genes & Dev. 5，2108-2116。Gallie，D.R.(1993)，植物細(xì)胞報(bào)道(Plant Cell reports)13，119-122。Ghai，J. & Das A.(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)8，3109-3113。Gheysen，G.，Villaroel，R. & Van Montagu，M.(1991)Genes &Dev. 5，287-297。Gordon-Kamm，W. J.，Spencer，T. M.，Mangano，M. L.，Adams，T.R.，Daines，R.J.，Start，W.G.，O’Brien，J.V. Cham-bers，S.A.，Adams，R.A.，Willets，N.G.，Rice，T.B.，Mackey，C.J.，Krueger，R.W.，Kausch，A.P. & Lemaux，P.G.(1990)植物細(xì)胞(Plant Cell)2，603-618.Hall，G.，Allen，G.C.，Loer，D.S.，Thompson，W.F. & Spiker，S.(1991)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，9320-9324。Herman，L.，Jacobs，A.，Van Montagu，M.，& Depicker，A.(1990)分子普通遺傳學(xué)224，248-256。Herrera-Estrella，A.，Chen，Z.，Van Montagu，M.，& Wang，K.，(1988)EMBO J.7，4055-4062。Herrera-Estrella，A.，van Montagu，M. & Wang，K.(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87，9534-9537。Higgs，D.C. & Colbert，J.T.(1993)植物細(xì)胞報(bào)道12，445-452。Howard，E.A.，Winsor，B.，De Vos，G.，& Zambryski，P.(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86，4017-4021。Howard，E.A.，Zupan，J.R.，Citovsky，V. & Zambryski，P.(1992)細(xì)胞68，109-118。Jasper，F(xiàn).，Koncz，C.，Schell，J. & Steinbiss，H.-H.(1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91，694-698。Kado，C.I.(1993)細(xì)菌接合(Bacterial conjugation)，Clewell，D.B.編(Plenum，New York)，pp.243-254。Kertbundit，S.，De Greve，H.，Deboeck，F(xiàn).，Van Montagu，M. &Hernalsteens，J. -P.(1991)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，5212-5216。Klein，T. M.，Harper，E. C.，Svab，Z.，Sanford，J. C.，F(xiàn)romm，M.E. & Maliga，P.(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)85，8502-8505。Klein，T.M.，Kornstein，L.，Sanford，J.C.， & Fromm，M.E.(1989)植物生理學(xué)，91，440-444。Koncz，C.，Martini，N.，Mayerhofer，R.，Koncz-Kalman，Zs.，Krber，H.，Redei，G.P. & Schell，J.(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86，8467-8471。Koukolikova-Nicola，Z.，Raineri，D.，Stephens，K.，Ramos，C.，Tinland，B.，Nester，E.，& Hohn，B.(1993)細(xì)菌學(xué)雜志175，723-731。Koziel，M.G.，Beland，G.L.，Bowman，C.，Carozzi，N.B.，Cren-shaw，R.，Crossland，L.，Dawson，J.，Desai，N.，Hill，M.，Kad-well，S.，Launis，K.，Lewis，K.，Maddox，D.，McPherson，K.，Meghji，M.R.，Merlin，E.，Rhodes，R.，Warren，G.W.，Wright，M. & Evola，S.V.(1993)生物技術(shù)11，194-200。Lakso，M. Sauer，B.，Mosinger，B.，Lee，E.J.，Manning，R.W.，Yu，S.H.，Mulder，K.L. & Westphal，H.(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)896232-6236。Matsuzaki，H.，Araki，H. & Oshima，Y.(1988)分子細(xì)胞生物學(xué)8，955-962。Matsuzaki，H.，Nakajima，R.，Nishiyama，J.，Araki，H. & Oshi-ma，Y.(1990)細(xì)菌學(xué)雜志172，610-618。Matzke，M.A. & Matzke，A.J.M.(1995)植物生理學(xué)107，679-685。Mayerhofer，R.，Koncz-Kalman，Z.，Nawrath，C.，Bakkeren，G.，Crameri，A.，Angelis，K.，Redei，G.P.，Schell，J.，Hohn.B. & Koncz，C.(1991)EMBO J.10，697-704。Morrish F.M.和Fromm M.E.1992生物技術(shù)中的現(xiàn)行觀點(diǎn)(Cur-rent Opinion in Biotechnology)3141-146。Murashige，T. & Skoog，F(xiàn).(1962)植物生理15，473-497.Odell，J. T. & Russell S.H.(1994)《植物中的同源重組和基因沉默》Paszkowski，J.編(Kluwer Academic Publishers)pp.219-270。O’Gorman，S.，F(xiàn)ox，D.T. & Wahl，G.M.(1991)科學(xué)251，1351-1355。Ohba，T.，Yoshioka，Y.，Machida，C. & Machida，Y.(1995)植物雜志J.7，157-164.Ohta，S.，Mita，S.，Hattori，T. & Nakamura，K.(1990)植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.)31，805-813.Onouchi，H.，Yokoi，K.，Machida，C.，Matsuzaki，H.，Oshima，Y.，Matsuoka，K.，Nakamura，K. & Machida，Y.(1991)核酸研究19，6373-6378。Onouchi，H.，Nishihama，R.，Kudo，M.，Machida，Y. & Machi-da，C.(1995)分子普通遺傳學(xué)247，653-660。Ow，D.W.，Wood，K.V.，DeLuca，M.，deWet，J.R.，Helinski，D.R. & Howell，S.H.(1986)科學(xué)234，856-859。Pansegrau，W.，Schoumacher，F(xiàn).，Hohn，B. & Lanka，E.(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90，11538-11542。Raskin，I.1996美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)933164-3166。Rothstein，S. J.，Lahners，K. N.，Lotstein，R. J.，Carozzi，N.B.，Jayne，S. M. & Rice，D. A.(1987)基因53，153-161。Rosenberg，A.H.，Lade，B.N.，Chui，D-S.，Lin，S-W.，Dun，J.J.，Studier，F(xiàn).W.(1987)基因，125-135.Rossi，L.，Hohn，B. & Tinland，B.(1993)分子普通遺傳學(xué)239，345-353。Russell，S.H.，Hoopes，J.L.& Odell，J.T.(1992)分子普通遺傳學(xué)234，49-59。Saunders，K.，Lucy，A.，和Stanley，J.(1991)核酸研究19，2325-2330。Shurvinton，C.E.，Hodges，L. & Ream，W.(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)89，11837-11841。Stachel，S.E.，Timmermann，B. & Zambryski，P.(1986)自然(倫敦)322，706-712。Stachel et al.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)83379-383(1986)。Stachel，S.，Timmerman，B.，& Zambryski，P.(1987)EMBO J.6，857-663。Stenger，D.C.Revington，G.N.，Stevenson，M.C.，和Bisaro，D，M.(1991)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，8029-8033。Thompson，C.J. Movva，N.R.Tizard，R.，Crameri，R.，Davies，J.E. Lauweereys，M.和Botterman，J.(1987)EMBO J. 62519-2523。Tinland，B.，Koukolikova-Nicola，Z.，Hall，M.N. & Hohn，B.(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)89，8000-8004。Tinland，B.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)918000-8004(1994)。Tinland，B.，Schoumacher，F(xiàn).，Gloeckler，V.，Bravo Angel，A.M.B. & Hohn，B.(1995)EMBO J. 14，3585-3595。Ugaki，M.，Ueda，T.，Timmermans，M.C.P.，Vieira，J.，Ellis-ton，K.O.和Messing，J.(1991)核酸研究19，371-377。Van Haaren，M.J.J.，Sedee，N.J.A.，De Boer，H.A.，Schliper-oort，R.A. & Hooykaas，P.J.J.(1989)植物分子生物學(xué)13，523-531。Vasil，V.，Castillo，A.M.，F(xiàn)romm，M.E. & Vasil，I.K.(1992)生物技術(shù)10，667-674。Vogel，A.M. & Das，A.(1992)細(xì)菌學(xué)雜志174，303-312。Wallroth，M.等分子普通遺傳學(xué)2026-15(1986)。Wan，Y. & Lemaux，P.G.(1994)植物生理學(xué)104，37-48。Wang，K.，Stachel，S.E.，Timmerman，B.，Van Montagu，M.，& Zambryski，P.(1987)科學(xué)235，587-591。Ward，E.R. & Barnes，W.M.(1988)科學(xué)242，927-930。Winans等，核酸研究(1987)15825-837。Yanofsky，M.F.，Porter，S.G.，Young，C.，Albright，L.M.，Gordon，M.P. & Nester，E.W.(1986)細(xì)胞47，471-477.Young，C. & Nester，E.W.(1988)細(xì)菌學(xué)雜志8，3367-3374。Yusibov，V.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)912994-2998(1994)。Zambryski，P.(1992)植物生理學(xué)年鑒(Annu. Rev. Plant Physiol.)43，465-490。Zupan J.R. & Zambryski P.(1995)植物生理學(xué)1071041-1047。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)國(guó)家瑞士(F)郵編(ZIP)4002(G)電話+41 61 69 11 11(H)傳真+41 61 696 79 76(I)電報(bào)962 991(ii)發(fā)明名稱輸送給真核細(xì)胞的外源DNA的改良整合方法(iii)序列數(shù)23(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO1GNNTGNCAGG ATATATNNNN NNGTNAN 27(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO2GGTGGCAGGA TATATNNNN NTGTAAA 27(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO3GATCCCTGCA GA12(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO4AGCTTCTGCA GG 12(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度150堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO5ATCTCCACTG ACGTAAGGGA TGACGCACAA TCCCACTATC CTTCGCAAGA CCCTTCCTCT 60ATATAAGGAA GTTCATTTCA TTTGGAGAGG GATCCCTGCA GGACACGCTG AAATCACCAG120TCTCTCTCTA CAAATCTATC TCTCTCTATG 150(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度154堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO6GATCCATAGA GAGAGATAGA TTTGTAGAGA GAGACTGGTG ATTTCAGCGT GTCCTGCAGG 60GATCCCTTCC CAAATGAAAT GAACTTCCTT ATATAGAGGA AGGGTCTTGC GAAGGATAGT120GGGATTGTGC GTCATCCCTT ACGTCAGTGG AGAT154(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO7ATCCGGCAGG ATATATACCG TTGTAATTCT GCA33(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO8CCACTATCCT TCGCAAGACC20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO9TCGAGTTGCA TGCAG 15(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO10GATCGCAGCA TGCCTAG 17(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO11GATCAAGCTT TTGATGAAAG AATCGTTAT TCTTTCATCA AGATC 45(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO12AGCTACTGCA GTTGATGAAA GAATACGTTA TTCTTTCATC AACTAG 46(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO13GATCAAGCTT TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTTTCATCA AGATC 45(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO14AATTCATGGA TCTTTCTGGC AATGAGAAAT CCAGG35(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO15GTGCCTTGCC TTCTCTCCC CCAACTCCCT CTCCTAGCAC GCCTCCGACA CCTAGCCCCG60AT 62(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度56堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO16CGGGGCTAGG TGTCGGAGGC GTGCTAGGAG AGGGAGTTGG GGGAGTAGAA GGCAAG 56(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO17AATTCTCAAA ACACACCAGA GTCACGTCGA GTGAGACTGC CATCAACCAG CAT53(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO18TATCCTTCTA CTCCCCCAAC TCCCTCTCCT AGCACGCCTC CGACACCTAG C 51(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO19AATTGGCTAG GTGTTCGGAGG CGTGCTAGGA GAGGGAGTTG GGGGAGTAGA AGGA54(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO20CGAATTCGCT AGCATCGATA GATCTGTAC CAAAGCTTCT CGAGT45(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO21AGCTACTCGA GAAGCTTTGG TACCAGATCT ATCGATGCTA GCGAATTCGC ATG 53(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO22ATCCGGAGG ATATATACCG TTGTAATTCT GCA33(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO23AATTCATGGA TCTTTCTGGC AATGAGAAAT CCAGG3權(quán)利要求
1.將目的DNA整合到真核細(xì)胞基因組中的方法，該方法包括用a)由鄰接有T-DNA邊緣序列的目的DNA組成的DNA片段；和b)至少一個(gè)能夠在所說(shuō)的真核細(xì)胞中表達(dá)一種或多種促進(jìn)鄰接有T-DNA邊緣序列的DNA整合之蛋白質(zhì)的嵌合DNA或RNA分子轉(zhuǎn)化所說(shuō)的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)和b)是同時(shí)進(jìn)行的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的真核細(xì)胞是植物細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)嵌合DNA或RNA分子構(gòu)成編碼一種或多種蛋白質(zhì)的嵌合核酸分子，其中所說(shuō)蛋白質(zhì)是由農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒的侵入性區(qū)域編碼的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的嵌合DNA或RNA分子編碼VirD2、VirD1、VirC1、VirC2或VirE2。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所說(shuō)的嵌合DNA或RNA分子編碼單一VirD2、或VirD1和VirD2的組合、或VirD1、VirD2和VirE2的組合。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所說(shuō)的嵌合DNA或RNA分子編碼VirD2。
8.權(quán)利要求3的方法，其中鄰接有T-DNA邊緣序列的目的DNA是植物病毒載體的一部分。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的DNA基因是植物病毒載體的一部分。
10.權(quán)利要求3的方法，其中鄰接有T-DNA邊緣序列的目的DNA和所說(shuō)的DNA基因是植物病毒載體的一部分。
11.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的植物細(xì)胞是雙子葉植物的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所說(shuō)的雙子葉植物選自煙草、棉花、油籽油菜和大豆。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的植物細(xì)胞是單子葉植物的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的單子葉植物選自玉米、小麥和稻。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的目的DNA包括嵌合基因。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)的嵌合基因能夠在所說(shuō)的真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的鄰接有T-DNA邊緣序列的目的DNA和所說(shuō)的DNA基因是單一DNA分子的成分。
18.生產(chǎn)能育的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所說(shuō)的植物具有整合到基因組中的鄰接T-DNA邊緣序列的DNA，該方法包括a)根據(jù)權(quán)利要求3的方法將所說(shuō)的DNA轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞的基因組中；并且b)將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成能育的轉(zhuǎn)基因植物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所說(shuō)的能育的轉(zhuǎn)基因植物選自煙草、棉花、油籽油菜、大豆、玉米、小麥和稻。
20.編碼農(nóng)桿菌侵入性蛋白質(zhì)的基因在指導(dǎo)鄰接有T-DNA邊緣序列的目的DNA整合到真核細(xì)胞基因組中的轉(zhuǎn)化方法中的應(yīng)用。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中所說(shuō)的基因是編碼VirD2、VirD1、VirC1、VirC2或VirE2的嵌合基因。
22.在物理轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中得到的整組轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物，其中5％或更多所說(shuō)的植物細(xì)胞或植物包含通過(guò)農(nóng)桿菌右邊緣T-DNA序列連接到基因組DNA上的目的DNA。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的一組植物細(xì)胞或植物，其通過(guò)微粒轟擊法獲得。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的一組植物細(xì)胞或植物，其中10％至70％的所說(shuō)的植物細(xì)胞或植物包含通過(guò)農(nóng)桿菌右邊緣T-DNA序列連接到植物基因組DNA上的目的DNA。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的一組植物細(xì)胞或植物，其由20個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件得到。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的一組植物細(xì)胞或植物，其由10個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件得到。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的植物細(xì)胞或植物的子代。
全文摘要
本發(fā)明提供一種實(shí)現(xiàn)將完整形式的外源DNA片段穩(wěn)定地整合到真核細(xì)胞,特別是植物細(xì)胞的基因組中的改良方法。該方法包括提供外源DNA連同一種或多種蛋白質(zhì),其中蛋白質(zhì)促進(jìn)外源DNA整合到定向轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞中并以能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的嵌合基因或可翻譯RNA的形式提供。該方法特別適用于植物細(xì)胞,以利用衍生于農(nóng)桿菌的整合促進(jìn)性蛋白實(shí)現(xiàn)鄰接T－DNA邊緣的完整形式的外源DNA片段的穩(wěn)定整合?？蓮陌凑毡景l(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物、組織和整個(gè)生物體,特別是轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1197482SQ96197185
公開日1998年10月28日 申請(qǐng)日期1996年9月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月25日
發(fā)明者G·漢森, M·D·奇爾唐 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司