專利名稱：：根皮層特異性基因啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組織特異性的基因啟動子，特別是涉及在植物根皮層中具有活性的啟動子。
背景技術(shù)：
：啟動子是位于轉(zhuǎn)錄基因側(cè)翼的DNA序列，并且如果要把側(cè)翼基因轉(zhuǎn)錄成信使RNA，RNA聚合酶必須與啟動子結(jié)合。啟動子可以由許多不同的調(diào)節(jié)元件組成，這些調(diào)節(jié)元件影響以不同方式可操作性地與所說的啟動子結(jié)合的結(jié)構(gòu)基因。例如，調(diào)節(jié)基因可以增強(qiáng)或抑制所結(jié)合的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，對該基因進(jìn)行發(fā)育調(diào)節(jié)或者有助于該基因的組織特異性調(diào)節(jié)。使用重組DNA方法進(jìn)行啟動子的修飾可能獲得選擇性的基因表達(dá)模式。例如參見Old和Primrose，基因操作原理(第4版，1989)。植物啟動子的一個例子是在用于矮牽牛屬的小亞基核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的基因的側(cè)翼發(fā)現(xiàn)的啟動子。參見美國專利4,962,028。另一個例子是含有小麥Em基因5′側(cè)翼區(qū)的啟動子。參見EPO申請335528。還有一個例子是在EPO申請0330479中公開的誘導(dǎo)脅迫的調(diào)節(jié)元件。盡管根部基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用在植物發(fā)育過程中具有重要的作用，但是相對來說這方面的工作做得很少。這種缺陷部分是由于缺乏容易鑒別的根特異性生化功能(可能很容易對這些基因進(jìn)行克隆和研究)。Evans等(分子基因遺傳學(xué)214，153-157(1988))試圖從豌豆分離根特異性cDNA克隆，但沒有成功，得到的結(jié)論為根特異性mRNA(如果存在)僅以非常低的水平存在于根mRNA群體中。Fuller等(美國科學(xué)院學(xué)報80，2594-2598(1983))已經(jīng)克隆并定性了大量的根瘤特異性基因。比較所說的DNA序列轉(zhuǎn)錄起始處的5′端表明在這三個檢驗(yàn)的基因中存在重復(fù)的8核苷酸。遺憾的是對于大多數(shù)豆科(Leguminaceae)缺乏有效的轉(zhuǎn)化/再生系統(tǒng)，阻礙了這些順式作用序列的功能分析。Bogusz等(自然331，178-180(1988))通過不形成瘤的植物的血紅蛋白基因與緊密相關(guān)的形成瘤的植物種類的血紅蛋白基因的同源性分離了在不形成瘤的植物的根中特異表達(dá)的血紅蛋白基因。Keller和Lamb(基因和發(fā)育3，1639-1646(1989))分離了在側(cè)根起始過程中表達(dá)的編碼細(xì)胞壁的富含羥脯氨酸的糖蛋白的基因。Lerner和Raikhel(植物生理學(xué)91，124-129(1989))最近報道了大麥根特異性凝集素的克隆和定性。許多植物病原體和害蟲破壞植物的根，造成嚴(yán)重的作物損害和損失。最常損害的根組織是根皮層，這是一層主要由貯藏薄壁組織組成的層，這些貯藏薄壁組織在表皮層下并圍繞根的中央維管束。根皮層可能還包含厚壁組織、分泌細(xì)胞、樹脂道、其它結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型。根皮層的細(xì)胞與地上莖的皮層細(xì)胞具有形態(tài)和發(fā)育的相似性。為了使用遺傳工程技術(shù)經(jīng)外源基因的表達(dá)將有用的性狀傳遞給植物，需要各種組織特異性的啟動子以便使新的性狀能夠在合適的植物組織中進(jìn)行選擇性表達(dá)。本發(fā)明是以我們與這個問題有關(guān)的持續(xù)研究為基礎(chǔ)的。發(fā)明概述本發(fā)明是以識別煙草RD2(TobRD2)啟動子為基礎(chǔ)的，這種啟動子指導(dǎo)相關(guān)基因的根皮層特異性表達(dá)。本發(fā)明的第一個方面是指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄的分離的DNA分子，這種分離的DNA分子具有選自(a)由本文提供的SEQIDNO1-9和(b)在嚴(yán)格的條件下和SEQIDNO1-9任一之序列雜交并指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄的DNA序列組成的組中的序列。本發(fā)明的另一個方面是包含煙草RD2啟動子和位于啟動子的下游并可操作性地與啟動子連接的異源DNA片段的表達(dá)盒。本發(fā)明的另一個方面是一種表達(dá)盒，這種表達(dá)盒包含根皮層特異性啟動子和異源DNA片段、從本文所提供的SEQIDNO1-9中選擇的根皮層特異性啟動子的序列和在嚴(yán)格的條件下和SEQIDNO1-9任一之序列雜交并指導(dǎo)根皮層特異性轉(zhuǎn)錄的DNA序列。本發(fā)明的另一方面還包括含有以上所述的表達(dá)盒的植物細(xì)胞、由這樣的植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法以及含有這樣轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物。圖的簡單描述圖1A顯示7天大的幼苗通過原位雜交在煙草根橫斷面中定位的煙草RD2轉(zhuǎn)錄物。圖1B顯示7天大的幼苗通過原位雜交在煙草根縱切面中定位的煙草RD2轉(zhuǎn)錄物。圖2是TobRD2的5′區(qū)的2010個堿基對序列(SEQIDNO1)。圖3圖解顯示了用于檢驗(yàn)指導(dǎo)根皮層特異性基因表達(dá)的RD2啟動子的能力的TobRD2啟動子/葡糖苷酸酶(GUS)構(gòu)建體。圖4是總結(jié)了用嵌合報道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的根(實(shí)心柱)、葉片(斜紋柱)、莖(點(diǎn)柱)中β-葡糖苷酸酶(GUS)活性的柱形圖，結(jié)果如表1所示。此圖顯示出用基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的活性，其中使用了不同的啟動子(CaMV35S；Δ2.00；Δ1.50；Δ1.40；Δ1.25；Δ0.80；Δ0.70；Δ0.60；Δ0.30)，同時只使用載體pBI101.3作為對照。以pmolMU/μg蛋白質(zhì)/分鐘表示GUS活性。圖5A是總結(jié)了用嵌合報道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的煙草植物的根、葉片中相對β-葡糖苷酸酶(GUS)活性的柱形圖，結(jié)果如表1所示，其中使用了不同的啟動子(CaMV35S；Δ2.00；Δ1.50；Δ1.40；Δ1.25；Δ0.80；Δ0.70；Δ0.60；Δ0.30)，同時只使用載體pBI101.3作為對照。以pmolMU/μg蛋白質(zhì)/分鐘表示GUS活性，所示的相對活性是根活性/葉活性。圖5B是總結(jié)了用嵌合報道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的煙草植物的根、莖中相對β-葡糖苷酸酶(GUS)活性的柱形圖，結(jié)果如表1所示，其中使用了不同的啟動子(CaMV35S；Δ2.00；Δ1.50；Δ1.40；Δ1.25；Δ0.80；Δ0.70；Δ0.60；Δ0.30)，同時只使用載體pBI101.3作為對照。以pmolMU/μg蛋白質(zhì)/分鐘表示GUS活性，所示的相對活性是根活性/莖活性。圖6A是光學(xué)顯微照片，顯示出GUS活性在由報道基因(GUS)(由Δ2.0啟動子驅(qū)動)轉(zhuǎn)化的煙草植物根的橫切面上的組化定位。圖6B是光學(xué)顯微照片，顯示出GUS活性在由報道基因(GUS)(由Δ2.0啟動子驅(qū)動)轉(zhuǎn)化的煙草植物根的根尖上的組化定位。發(fā)明的詳細(xì)描述本文只是以單鏈形式在5′-3′方向從左到右顯示了核苷酸序列。本文以IUPAC-IUB生物化學(xué)命名法委員會推薦的形式表示了核苷酸。表達(dá)抑制或者殺死特殊的害蟲或病原體的肽的轉(zhuǎn)基因植物提供了減少作物危害和損失的方法。例如，在轉(zhuǎn)基因玉米中的蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)的表達(dá)提供了對歐洲玉米螟蟲的抗性。然而，轉(zhuǎn)基因在所有植物組織中的表達(dá)(組成型表達(dá))是不利的，因?yàn)樗苁狗前杏袡C(jī)體暴露于轉(zhuǎn)基因蛋白，并且還會增加用于對轉(zhuǎn)基因蛋白具有抗性的病原體和害蟲發(fā)育的選擇性壓力。轉(zhuǎn)基因在整個植物中的高水平的表達(dá)也可能對植物的成長和產(chǎn)量有負(fù)面影響。另一個策略是只在受特定害蟲或者病原體影響的器官或組織中表達(dá)有毒的肽。由于缺乏已定性的根特異性啟動子，實(shí)施這一針對危害植物根的害蟲和病原體的策略受到阻礙。當(dāng)在RNA聚合酶和基因啟動子之間形成穩(wěn)定的復(fù)合體時，基因的轉(zhuǎn)錄就開始了。在所有轉(zhuǎn)錄單元開始的啟動子一般大約為100個堿基對長，并且位置緊靠著轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游。例如參見，Maniatis等，科學(xué)2361238(1987)。啟動子在“強(qiáng)度”上可以變化，即它們精確有效地開始轉(zhuǎn)錄的能力是可變的。認(rèn)為RNA聚合酶全酶能覆蓋緊靠著轉(zhuǎn)錄區(qū)上游大約50個堿基對的區(qū)域。有時通過與啟動子區(qū)域鄰近結(jié)合的輔助蛋白可以增加轉(zhuǎn)錄起始的強(qiáng)度，所說的啟動子區(qū)緊靠著所說的轉(zhuǎn)錄DNA的上游。例如參見Singer和Berg，基因和基因組，140-145，大學(xué)科學(xué)圖書，MillValley，CA(1991)。本發(fā)明的根皮層特異性啟動子的具體例子是具有與SEQIDNO1-9(下文將更詳細(xì)地討論)任一之序列相應(yīng)的序列的DNA分子。顯而易見，可以制備其它的比前述的序列更長或者更短的或具有最小添加、缺失、或者取代的煙草RD25′側(cè)翼區(qū)域的序列片段，這些序列也將攜帶TobRD2根皮層特異性啟動子，所有這些序列都包含在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明的另一個方面包括從其它煙草基因或者從下文所述的非煙草植物中分離的啟動子，這些啟動子與煙草RD2啟動子同源，并且能夠指導(dǎo)細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。本文使用的TobRD2啟動子指具有與在煙草RD2基因轉(zhuǎn)錄區(qū)5′端發(fā)現(xiàn)的DNA連續(xù)片段相同(或者基本上同源)的序列的DNA分子。本文給出的SEQIDNO1提供了在緊靠著TobRD2基因中轉(zhuǎn)錄開始的5’端發(fā)現(xiàn)的2kb區(qū)域的序列。TobRD2啟動子在緊靠著TobRD2轉(zhuǎn)錄區(qū)的5′端包括至少100個堿基對的區(qū)域、150個堿基對區(qū)域或者優(yōu)選的200個堿基對區(qū)域，并且指導(dǎo)根皮層特異性表達(dá)。本文使用的“基本上同源”的區(qū)域至少有75％，更為優(yōu)選的是80％、85％、90％，或者甚至95％的同源性。本文所使用的根皮層特異性啟動子是優(yōu)先指導(dǎo)根皮層組織中可操作性結(jié)合的基因表達(dá)的啟動子，這是相對于葉片或莖組織或者根的其它組織中的表達(dá)而言。其它植物的根皮層特異性啟動子序列包括那些與緊靠著轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)上游的煙草RD2啟動子的大約100個堿基片段具有至少大約75％同源性(更為優(yōu)選的是80％、85％、90％，或者甚至95％同源性)的序列，并且所說的序列能夠指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。其它植物的根皮層特異性啟動子包括那些與本文的SEQIDNo1-9所限定的TobRDa啟動子的連續(xù)部分具有至少大約75％同源性(更為優(yōu)選的是80％、85％、90％，或者甚至95％同源性)的序列，并且所說的序列能夠指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。允許異源DNA序列與本文給出的DNA序列雜交的高度嚴(yán)格的雜交條件是本領(lǐng)域公知的。例如，可以在25％甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt溶液、100μg/ml單鏈DNA、5％硫酸葡聚糖中42℃下將這些序列與本文公開的DNA雜交，洗滌條件為25％甲酰胺、5XSSC、0.1％SDS在42℃下洗滌15分鐘，以便使具有60％同源性的序列雜交。更為嚴(yán)格的條件具有更嚴(yán)格的洗滌條件0.3MNaCl、0.03M檸檬酸鈉、0.1％SDS、60℃或者甚至70℃，使用標(biāo)準(zhǔn)的原位雜交測定。(參見Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(第2版1989)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室))。一般來說，編碼根皮層特異性啟動子并與編碼本文公開的煙草RD2根皮層特異性啟動子的DNA序列雜交的植物DNA序列與編碼本文公開的煙草RD2根皮層特異性啟動子的DNA序列具有至少大約75％、80％、85％、90％或者甚至95％或更多的同源性。本發(fā)明的根皮層特異性啟動子在指導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)時是有用的。這種組織特異性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)在提供對由侵害植物根的害蟲和病原體造成的損害的抗性方面是有用的。此外，當(dāng)根皮層為光合產(chǎn)物的主要積累器官時，意在改變儲存的碳水化合物的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以由這些啟動子指導(dǎo)。對根皮層特異性表達(dá)具有特殊重要性的外源基因包含編碼與重金屬(如金屬硫蛋白)結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因；編碼對土壤中存在的害蟲和病原體有抗性的蛋白質(zhì)的基因；編碼對熱、鹽(鹽度)和干旱具有抗性的蛋白質(zhì)的基因；編碼用于脫鹽化的蛋白質(zhì)的基因；編碼將植物儲藏的化合物代謝成另外優(yōu)選的產(chǎn)物或形式的蛋白質(zhì)的基因。組織特異性啟動子也可以用于將選擇的組織位點(diǎn)上殺蟲劑原轉(zhuǎn)化成活性形式。Hsu等(殺蟲劑科學(xué)，44，9(1995))報道了包含根特異性啟動子TobRB7和β-葡糖苷酸酶基因的嵌合基因在優(yōu)先將根中的殺蟲劑原轉(zhuǎn)化成活性形式方面的用途。將滅活的殺蟲劑原(羥甲基草氨酰的葡糖苷酸)施用到葉片上，然后通過植物韌皮部將其運(yùn)輸?shù)礁?，在此由葡糖苷酸酶將其轉(zhuǎn)化成有活性的殺線蟲劑形式。另外，根皮層特異性啟動子在組織學(xué)上是有用的，可以用來通過使用報道基因(如β-葡糖苷酸酶)鑒定或者染色根皮層組織。本文使用的“可操作性地結(jié)合”的術(shù)語是指DNA序列包含在單一DNA分子上，這些DNA序列被結(jié)合以便一個DNA序列的功能可以受另一個DNA序列影響。這樣當(dāng)啟動子能夠影響基因(即此基因在所說的啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)的表達(dá)時，所說的啟動子可操作性地與該基因結(jié)合。所說的啟動子在該基因的“上游”，也可以說該基因在啟動子的“下游”。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或″表達(dá)盒″在5′-3′的轉(zhuǎn)錄方向上包含本發(fā)明的啟動子、與所說的啟動子可操作性地結(jié)合的的異源DNA片段、可有可無的轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止區(qū)(如終止信號和多腺苷酸化區(qū))。所有這些調(diào)控區(qū)都應(yīng)該能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中起作用。3′終止區(qū)可以來源于與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相同的或不同的基因。植物可以分為不含有葉綠素的植物(如真菌)和含有葉綠素的植物(如綠藻、苔)；進(jìn)而可以分成含有葉綠素和維管組織的植物(如蕨類、裸子植物、松類、單子葉植物和雙子葉植物)。后一種植物群包括那些可能具有根、莖和葉的植物。本文所用的術(shù)語“植物”包括上文所述的所有有機(jī)體。本文所用的術(shù)語“天然植物DNA”是指從沒有經(jīng)過基因工程改造的或非轉(zhuǎn)化的植物(例如通過選育而產(chǎn)生的植物品種)中分離出的DNA。本文所用的術(shù)語異源基因或者異源DNA片段是指用于經(jīng)遺傳工程技術(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因或者DNA片段，并且這種基因不可能是細(xì)胞中天然存在的。結(jié)構(gòu)基因是基因的一部分，它們包含編碼蛋白質(zhì)、多肽或其部分的DNA片段，可能包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或翻譯起始密碼子，但是缺乏啟動子。此術(shù)語也可以指天然存在于細(xì)胞中的，但是經(jīng)人工引入的結(jié)構(gòu)基因的拷貝。結(jié)構(gòu)基因可以編碼通常在植物細(xì)胞中不存在的蛋白質(zhì)，所說的細(xì)胞是此基因或者與此基因可操作性結(jié)合的啟動子一起引入的細(xì)胞。與本發(fā)明用于在植物種類中表達(dá)的啟動子可操作性結(jié)合的基因可以來源于染色體基因、cDNA、合成基因、或者它們的結(jié)合物。本文所用的術(shù)語異源DNA片段也包含編碼非蛋白質(zhì)產(chǎn)物的DNA片段(如核酶或反義RNAs)。反義RNAs是公知的(例如參見美國專利4,801,540(Calgene公司))。本發(fā)明使用的植物中的重要基因包括那些影響多種表型和非表型特征的基因。在這些表型特征中是蛋白質(zhì)(如酶)提供了對各種環(huán)境脅迫的抗性，所說的環(huán)境脅迫包括但不限于由脫水(原因是熱、鹽、干旱)、除草劑、有毒的金屬、痕量元素、害蟲和病原體引起的脅迫?？剐钥梢詺w因于靶位點(diǎn)的變化、宿主細(xì)胞中靶蛋白質(zhì)量的增加、與保護(hù)宿主免受脅迫的產(chǎn)物生物合成途徑有關(guān)的一種或多種酶量的增加等等?？梢詮脑松锘蛘哒婧松铩⒓?xì)菌、真菌(例如酵母、病毒、植物和哺乳動物)中獲得結(jié)構(gòu)基因，或者可以全部或部分合成結(jié)構(gòu)基因。具體的基因包含具有g(shù)lyphosphate抗性的3-enolpyruvylphosphoshikinate合成酶基因、腈水解酶、脯氨酸和谷氨酰胺生物合成途徑的基因和金屬硫蛋白。與本發(fā)明的啟動子可操作性地結(jié)合的結(jié)構(gòu)基因可以是那些編碼對昆蟲有毒的蛋白質(zhì)的基因，如對昆蟲有毒的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白。美國專利4,853,331公開了編碼對鞘翅目(Coleoptera)有毒的蘇云金芽孢桿菌毒素的DNA序列和這個序列的變體(其中保留了編碼毒性的部分)(也參見美國專利4,918,006和4,910,136)(本文引用的所有美國專利文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容本文一并參考)。PCT申請WO90/02804公開了蘇云金芽孢桿菌的能夠使植物對鱗翅目(Lepidoptera)有毒的基因序列。PCT申請WO89/04868公開了用載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所說的載體能促進(jìn)蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白毒素的表達(dá)，并且此載體的序列可以與本發(fā)明結(jié)合使用。PCT申請WO90/06999公開了編碼對鱗翅目有活性的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白毒素的DNA。美國專利4,918,006公開了另一個編碼殺蟲晶體蛋白的基因序列。編碼其它昆蟲毒素的基因序列的例子是在美國專利4,940,840和PCT申請WO90/07001中公開的編碼殼多糖酶(例如EC-3.2.1.14)的基因序列。在美國專利申請08/007,998中公開了編碼能誘導(dǎo)線蟲孔蛋白(這種蛋白在產(chǎn)生抗根線蟲的轉(zhuǎn)基因植物方面是有用的)的基因。在美國專利4,948,734和5,093,120(Edwards等)中公開了能夠產(chǎn)生有活性的抗線蟲的多肽毒素的蘇云金芽孢桿菌的菌株。當(dāng)所說的基因表達(dá)產(chǎn)物定位在非細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞區(qū)室中時，可以構(gòu)建這樣的結(jié)構(gòu)基因，即包含編碼使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到特定的位點(diǎn)(如細(xì)胞質(zhì)膜)或分泌到細(xì)胞的胞質(zhì)或外部環(huán)境中的特殊氨基酸序列的區(qū)域。文獻(xiàn)中描述了各種分泌性前導(dǎo)序列、膜整合序列以及指導(dǎo)所說的肽表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移序列。例如參見，Cashmore等，生物技術(shù)(1985)3803-808，Wickner和Lodish，科學(xué)(1985)230400-407?？梢砸訢NA構(gòu)建體提供所說的表達(dá)盒，這種DNA構(gòu)建體也具有至少一個復(fù)制系統(tǒng)。為了方便起見，通常含有在大腸桿菌中有功能的復(fù)制系統(tǒng)，例如ColE1、pSC101、pACYC184等等。以這種方式，在每次操作后的各階段都可以對所得的構(gòu)建體進(jìn)行克隆和測序，并檢測操作的正確性。此外，可以使用廣泛宿主范圍的復(fù)制系統(tǒng)，例如P-1不親和性質(zhì)粒的復(fù)制系統(tǒng)(例如pRK290)，或者以此代替大腸桿菌復(fù)制系統(tǒng)。除了復(fù)制系統(tǒng)外，可以至少含有一個標(biāo)記，這種標(biāo)記可以在一個或多個宿主中是有用的，或者對于不同的宿主使用不同的標(biāo)記。也就是說，在原核宿主中選擇時可以使用一個標(biāo)記，而在真核宿主(特別是植物宿主)中選擇時使用另一個標(biāo)記。所說的標(biāo)記可以提供保護(hù)以防止殺生物劑(例如抗菌素、毒素、重金屬等等)的危害，所說的標(biāo)記可以通過將原養(yǎng)型傳遞給營養(yǎng)缺陷的宿主而提供互補(bǔ)作用；或者所說的標(biāo)記可以通過在植物中產(chǎn)生新的化合物而提供可見的表型。可以使用的基因例子包含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、腈水解酶和慶大霉素抗性基因。為了進(jìn)行植物宿主的選擇，非限定的合適的標(biāo)記的例子是β-葡糖苷酸酶(GUS)(產(chǎn)生靛藍(lán))、熒光素酶(產(chǎn)生可見光)、NPTII(產(chǎn)生卡那霉素抗性或G418抗性)、HPT(提供潮霉素抗性)和突變aroA基因(提供草甘膦抗性)。通過合適的復(fù)制系統(tǒng)的限制性酶切和特定的構(gòu)建體或片段在可使用的位點(diǎn)的插入將包含各種構(gòu)建體、表達(dá)盒、標(biāo)記等的各種片段連續(xù)地引入。在連接和克隆后，可以分離所說的DNA構(gòu)建體以便用于進(jìn)一步的操作。文獻(xiàn)中通過舉例詳細(xì)地說明了這些技術(shù)。例如參見，Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，(1982)。載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體?？梢杂糜谕ㄟ^本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物組織的載體包括土壤桿菌屬載體和沖擊載體，以及適合用于DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化載體。含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的根癌土壤桿菌細(xì)胞(其中所說的DNA構(gòu)建體包含Ti質(zhì)粒)在產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的各種方法中是有用的。用根癌土壤桿菌感染植物細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，然后由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物。用于本發(fā)明的大量的土壤桿菌屬的載體系統(tǒng)是已知的。例如，美國專利4,459,355公開了用含有Ti質(zhì)粒的土壤桿菌菌株轉(zhuǎn)化敏感植物(包括雙子葉植物)的方法。美國專利4,795,855公開了使用土壤桿菌載體轉(zhuǎn)化木本植物。此外，美國專利4,940,838(Schilperoort等)公開了在本發(fā)明中有用的二元土壤桿菌載體(即這樣一種載體，在這種載體中土壤桿菌包含一種含有Ti質(zhì)粒的vir區(qū)但沒有T-DNA區(qū)的質(zhì)粒，同時包含第二種含有T-DNA區(qū)但沒有vir區(qū)的質(zhì)粒)。攜帶本發(fā)明DNA構(gòu)建體的微顆粒(這種微顆粒適用于對植物細(xì)胞的沖擊轉(zhuǎn)化)，也在產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株上是有用的。將所說的微顆粒推進(jìn)到植物細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且從這些轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植株。任何合適的沖擊細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法和儀器都可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。在Sanford和Wolf的美國專利4,945,050和Agracetus歐洲專利申請出版物0270356(題目為“花粉介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化”)公開了儀器和方法的例子。當(dāng)使用沖擊轉(zhuǎn)化方法時，可以將表達(dá)盒摻入到能夠在將要轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒中。在這些系統(tǒng)中適合使用的微顆粒的例子包括1-5μm金粉球。通過任何合適的技術(shù)(如通過沉淀)將所說的DNA構(gòu)建體沉積在這種微顆粒上。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是已經(jīng)由包含本文公開的DNA序列的構(gòu)建體(使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞?？梢允褂帽景l(fā)明的DNA構(gòu)建體通過DNA介導(dǎo)的植物細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，接下來按照本領(lǐng)域公知的方法從所說的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生植株而完成對植物的轉(zhuǎn)化。本文公開的啟動子序列可以用于在任何能夠使用此啟動子的植物種類(即該植物的RNA聚合酶能夠與本文公開的啟動子序列結(jié)合)中表達(dá)異源DNA序列。適于用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物種類的例子包括單子葉植物和雙子葉植物，包括但不限于煙草、大豆、土豆、棉花、甜菜、向日葵、胡蘿卜、芹菜、亞麻、甘藍(lán)和其它的十字花科植物、胡椒、番茄、柑桔、大豆、草莓、萵苣、玉米、苜蓿、燕麥、小麥、水稻、大麥、高粱和canola。這樣，可以用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物種類的例子是雙子葉植物，可以用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的更具體的植物種類是茄科的成員。任何爾后能夠進(jìn)行無性繁殖(或者通過器官再生或者通過胚再生)的植物組織都可以用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化。本文所用的術(shù)語“器官再生”是指一種方法，通過這種方法能夠由分生組織中心先后發(fā)育成枝條和根；本文所用的術(shù)語“胚再生”是一種方法，通過這種方法能夠由體細(xì)胞或配子以協(xié)同的方式(而不是先后)發(fā)育出枝條和根。選擇的特定組織將取決于能夠使用的(并且最好是適合于)所轉(zhuǎn)化的特定植物種類的無性繁殖系統(tǒng)。組織靶的例子包含葉盤、花粉、胚、子葉、胚軸、大配子體、愈傷組織、現(xiàn)有的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(如子葉分生組織和胚軸分生組織)。下面的實(shí)施例是為了具體說明本發(fā)明的各種特定的實(shí)施方案，而不是用來限制本發(fā)明的。實(shí)施例1分離基因組根皮層特異性RD2基因在EMBL3SP6/T7λ載體(ClonTech，PaleAlto，CA)中構(gòu)建由煙草幼苗分離的DNA的煙草(Nicotaniatabacun)基因組文庫。使用TobRD2cDNA(Conkling等，植物生理93，1203(1990))作為探針，從初級文庫中分離含有煙草RD2基因的基因組克隆。在K802細(xì)菌細(xì)胞上篩選了總數(shù)為1.2×107個重組噬菌體。將噬菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Magnagraph)上，并通過高壓滅菌(10分鐘，重力循環(huán))固定所說的DNA。所有的雜交都在65℃下于含水溶液(5XSSC[750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉]，5XDenhardt，0.5％SDS，100mg/ml變性的鮭精DNA)中進(jìn)行16小時。將濾液在60℃下于0.2XSSC和0.1％SDS中洗滌。通過篩選1.2X107個重組噬菌體鑒定了與TobRD2cDNA雜交的13個基因組克隆。分離這些克隆并通過限制圖譜進(jìn)一步定性。通過Rachwitz等(基因，30195(1984))的快速作圖方法構(gòu)建限制性圖譜。測定一個與TobRD2cDNA同源的克隆的全部序列，并確定其啟動子。通過比較TobRD2cDNA和基因組克隆的序列確定所說的轉(zhuǎn)譯區(qū)5′端的基因組克隆區(qū)。測定這一非翻譯區(qū)的序列，并鑒定推定的啟動子的TATAA框。在植物啟動子中，TATAA框一般為從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始的第-35至-29核苷酸。使用引物延伸實(shí)驗(yàn)鑒定了轉(zhuǎn)錄的5′端。圖2給出了TohRD2cDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)上游的2010個堿基對區(qū)(SEQIDNO1)。此序列包含轉(zhuǎn)錄區(qū)推測的起點(diǎn)(在第2000核苷酸處)和所說的啟動子的TATAA框(核苷酸1971-1975)。實(shí)施例2核酸測序?qū)⒎蛛x的基因組克隆(實(shí)施例1)的限制片段亞克隆到bluescript(pBSKSII+或pBSKSII+；Stratagene，LaJolla，CA)載體上。通過核酸外切酶III和S1核酸酶消化獲得用于每個克隆和兩條DNA鏈的一系列單向缺失(Henikoff，基因28，351(1984))。通過雙脫氧鏈終止法(Sanger等，美國科學(xué)院學(xué)報，74,5463(1977))使用測序酶(美國生物化學(xué)藥品公司，Cleveland，OH)測定此DNA序列。在所有情況下，對兩條DNA鏈進(jìn)行了測序。實(shí)施例3原位雜交為了確定TobRD2mRNA轉(zhuǎn)錄物在根各種組織中的空間分布，在非轉(zhuǎn)化植物中進(jìn)行原位雜交。使用如Meyerowitz(植物分子生物學(xué)報道5，242(1987))和Smith等(植物分子生物學(xué)報道5，237(1987))所述的技術(shù)將TobRD2的反義鏈與根組織中的TobRD2mRNA進(jìn)行原位雜交。將7天大的煙草(Nicotaniatabacum)幼苗根固定在磷酸緩沖的戊二醛中，包埋在ParaplastPlus(Monoject公司，St.Louis，MO)中，并將其切割成8毫米厚的段以便獲得橫切面和縱切面。將在35S-ATP存在下體外合成的反義TobRDa轉(zhuǎn)錄物用作探針。經(jīng)堿處理使標(biāo)記的RNA水解以便在使用前獲得平均長度為100-200個堿基的片段。42℃下在50％甲酰胺中雜交16小時，每毫升雜交溶液中含有大約5X106個/分鐘(cpm)標(biāo)記的RNA。曝光后，沖洗膠片并在明場和暗場顯微鏡下觀察。如圖1A和1B所示，雜交信號定位在根皮層細(xì)胞中。比較同一切片在明場和暗場下的圖象表明TobRD2轉(zhuǎn)錄物定位在根皮層的薄壁組織細(xì)胞中。在表皮或中柱中沒有觀察到雜交信號。實(shí)施例4嵌和基因的構(gòu)建通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)構(gòu)建一系列啟動子缺失。模板是經(jīng)核酸外切酶III/S1核酸酶消化(實(shí)施例2)產(chǎn)生的TobRD2基因組克隆的5′側(cè)翼區(qū)的各種缺失片段。使用同一套寡核苷酸引物擴(kuò)增所有的模板。一個引物是修飾的噬菌體M13的前引物(例如參見Sanger等，美國科學(xué)院學(xué)報74，5463(1977))；此寡核苷酸5′端包含HindIII識別序列以及使得限制酶能夠更有效切割的附加的5′序列。設(shè)計(jì)另一個引物，使之在5′末端具有BamHI位點(diǎn)(以及用于有效切割的附加核苷酸)，并且此引物與TobRD2的16核苷酸序列同源，所說的TobRD2在ATG起始密碼子的5′端有22個堿基(即此引物與SEQIDNO1的1973-1988堿基同源)。所說的PCR擴(kuò)增反應(yīng)包含模板質(zhì)粒DNA(5-10ng)；反應(yīng)緩沖液(50mMKCl；10mMTris-HCl；pH9.0[25℃]；0.1％TritonX-100；1.5mMMgCl2)；各種dATP、dGTP、dTTP、dCTP各為0.25mM；每種引物40ng；1.25單位的TaqDNA聚合酶(Promega，Madison，WS)。94℃下持續(xù)1分鐘的PCR循環(huán)使模板變性，46℃下持續(xù)1分鐘將引物退火，在72℃持續(xù)5分鐘使鏈延長。將此循環(huán)重復(fù)40次，最后的延長循環(huán)增加10分鐘。在程控?zé)嵫h(huán)儀(PCT-100，M.J.Research)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用HindIII和BamHI消化擴(kuò)增的產(chǎn)物，并將其克隆到土壤桿菌二元載體pBI101.3(R.Jefferson等，EMBOJ.6，3901-3907(1987))的HindIII和BamHI位點(diǎn)上。此載體包含β-葡糖苷酸酶(GUS)報道基因和nptII選擇標(biāo)記(其側(cè)面為T-DNA邊緣序列)。實(shí)施例5植物轉(zhuǎn)化方法基本上如An等(Belvin和R.Schilperoot編輯，植物分子生物學(xué)手冊MartinusNijhoff，Dordrecht，荷蘭，ppA3-1-19(1988))的描述將嵌合報道基因構(gòu)建體引入到攜帶緩和Ti-質(zhì)粒(LBA4404)的土壤桿菌宿主中，所說的質(zhì)粒能夠提供(intrans)vir功能(其對T-DNA轉(zhuǎn)移和在植物基因組中的整合是必要的)。經(jīng)三親本配對或電感受態(tài)的土壤桿菌細(xì)胞的電穿孔(這是本領(lǐng)域公知的技術(shù))將構(gòu)建體引入到所說的宿主中。如An等植物生理學(xué)81，301-305(1986)的描述將煙草(SR1)進(jìn)行葉盤轉(zhuǎn)化和植株再生。選擇具有卡那霉素抗性的植株進(jìn)行進(jìn)一步分析。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因植物中GUS測定方法在轉(zhuǎn)化植物的根、莖和葉的切面上進(jìn)行組化染色。在底物進(jìn)行短暫真空滲入后，37℃下將這些外植體組織在1mM5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)、25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.5％DMSO中過夜溫育。表達(dá)GUA活性的組織能切割這種底物，因此染成藍(lán)色。如Jefferson等(EMBOJ.6，3901-3907(1987))的描述進(jìn)行熒光GUS測定，以便定量GUS的表達(dá)水平。37℃下，在1mM4-甲基散形基-B-D-葡萄糖醛酸化物(MUG)存在下溫育根、葉和莖的細(xì)胞提取物。以0、5、10、15和20分鐘的間隔取樣。通過加入0.2M碳酸鈉終止酶促反應(yīng)。用10nM和100nMMUG校準(zhǔn)熒光計(jì)。按照Bradford的方法(Anal.Biochem.72，248(1976))測定樣品中的蛋白濃度。實(shí)施例7嵌合基因構(gòu)建體能夠指導(dǎo)組織特異性基因表達(dá)為了確定TobRD2基因的2010堿基對序列(SEQIDNo1)是否包括指導(dǎo)在根皮層的薄壁組織細(xì)胞中特異性表達(dá)的啟動子元件，構(gòu)建了嵌合基因。通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增1988堿基對區(qū)(SEQIDNo2)并在GUS報道基因的5’端進(jìn)行克隆(如上所述)。將嵌合基因引入煙草(如上所述)，分析轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)GUS的能力(如上所述)。表1的25-33行(轉(zhuǎn)化體325II1-325IV5)顯示了9個獨(dú)立轉(zhuǎn)化體(即每個轉(zhuǎn)化體是獨(dú)立轉(zhuǎn)化過程的產(chǎn)物)的分析結(jié)果。發(fā)現(xiàn)Δ2.0啟動子(SEQIDNO2)能夠指導(dǎo)高水平的基因表達(dá)(比一般稱作“強(qiáng)”啟動子的CaMV35S啟動子大約高4倍)(圖4)。在葉片或莖中沒有檢測到以比對照高的水平表達(dá)的報道基因(參見顯示出表1的平均活性的圖4、5A和5B)。GUS活性基本上限于根，并且如圖6所示尤其是限于根的皮層。使用驅(qū)動GUS的Δ2.0啟動子(在pBI101.3中)轉(zhuǎn)化圖6所示的植物。將多個獨(dú)立的轉(zhuǎn)化葉盤置于培養(yǎng)皿中。表1中轉(zhuǎn)化體的命名表明啟動子/編號的培養(yǎng)皿/獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體的編號。這樣，325II1指使用Δ2.0啟動子、在培養(yǎng)皿II中來自葉盤1的轉(zhuǎn)化體；而101.I1是指使用pBI101.3(無啟動子的GUS作為對照)的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)皿I中的編號為1的轉(zhuǎn)化體。在表I中，字首121指使用pBI121(帶有GUS的CaMV35S啟動子)；325是指具有GUS的Δ2.0啟動子(SEQIDNO2)；484是指具有GUS的Δ1.4啟動子(SEQIDNO3)；421是指具有GUS的Δ1.3啟動子(SEQIDNO4)；428是指具有GUS的Δ1.0啟動子(SEQIDNO5)；490是指具有GUS的Δ0.7啟動子(SEQIDNO6)；491是指具有GUS的Δ0.6啟動子(SEQIDNO7)；492是指具有GUS的Δ0.5啟動子(SEQIDNO8)；495是指具有GUS的Δ0.2啟動子(SEQIDNO9)?！錜-GUS″是指根組織中的GUS活性；″L-GUS″是指葉組織中的GUS活性；和″S-GUS″是指莖組織中的GUS活性。R/L是指根/葉的相對GUS活性；R/S是指根/莖的相對GUS活性。GUS活性以pmolMU/μg蛋白/分鐘表示。表1TobRD2啟動子分析</tables>表1TobRD2啟動子分析</tables>表1TobRD2啟動子分析</tables>表1TobRD2啟動子分析</tables>表1TobRD2啟動子分析</tables>表1TobRD2啟動子分析實(shí)施例85′啟動子-缺失對報道基因活性表達(dá)的影響以基本上與上文實(shí)施例7描述的相同的方式進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，只是用作啟動子的TobRD2側(cè)翼區(qū)的長度發(fā)生變化以便研究側(cè)翼區(qū)的各部分如何影響GUS的表達(dá)。在2010堿基對TobRD2序列(SEQIDNO1)上游區(qū)產(chǎn)生用作啟動子序列的一系列7嵌套5′-缺失突變。圖3以圖解的方式顯示了這些缺失突變體，分別稱為Δ2.0(SEQIDNO2)；Δ1.4(SEQIDNO3)；Δ1.3(SEQIDNO4)；Δ1.0(SEQIDNO5)；Δ0.7(SEQIDNO6)；Δ0.6(SEQIDNO7)；Δ0.5(SEQIDNO8)和Δ0.2(SEQIDNO9)。通過土壤桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化方法(如實(shí)施例4的描述)將實(shí)施例3描述的并且含有Δ2.00啟動子(SEQIDNO2)或截短的啟動子(SEQIDNOs3-9)的嵌合基因構(gòu)建體引入到煙草中。單獨(dú)使用土壤桿菌載體pBI101.3作為對照，CaMV35S啟動子用來提供參照標(biāo)準(zhǔn)物。分析再生植株根、葉和莖的GUS活性(表1圖4)。圖4給出了根、葉和莖中GUS活性的圖解說明，其中使用了全長TobRD2啟動子、啟動子缺失系列、花椰菜花葉病毒35S[CaMV35S)啟動子、和作為對照的載體pBI101.3。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)的6個啟動子能賦予高水平的根皮層特異性表達(dá)Δ2.00(SEQIDNO2)；Δ1.4(SEQIDNO3)；Δ1.3(SEQIDNO4)；Δ1.0(SEQIDNO5)；Δ0.7(SEQIDNO6)；Δ0.6(SEQIDNO7)。圖4顯示出表1的平均值。圖4還顯示出一個長度大約50個堿基對區(qū)的缺失(比較Δ0.6(SEQIDNO7)和Δ0.5(SEQIDNO8))大大降低了GUS表達(dá)水平。然而，此結(jié)果表明由Δ0.5啟動子(SEQIDNO8)提供的GUS在根組織中的表達(dá)水平與由CaMV35S啟動子引起的GUS表達(dá)水平相同。由Δ0.2啟動子(SEQIDNO9)提供的根皮層中的GUS表達(dá)大約為由CaMV35S啟動子提供的GUS表達(dá)的一半。圖5A和5B還說明了報道基因使用TobRD2啟動子的表達(dá)的器官特異性特征。在所有試驗(yàn)的實(shí)例中GUS活性在根中嚴(yán)格地表達(dá)，而在同一轉(zhuǎn)化煙草植株的莖或者葉中只能檢測到微乎其微的活性(如果有的話)。當(dāng)在用Δ0.60和Δ0.30啟動子轉(zhuǎn)化的根中檢測的GUS活性水平等于或少于由CaMV35S啟動子提供的GUS水平時(圖4)，圖5A和5B說明了由Δ0.60和Δ0.30啟動子指導(dǎo)的表達(dá)是根特異性的，而在莖和葉中的表達(dá)微乎其微，這一點(diǎn)與由CaMV35S啟動子指導(dǎo)的表達(dá)不同。前面的實(shí)施例是用來具體說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明的。下面的權(quán)利要求限定本發(fā)明，其中包括這些權(quán)利要求的等同物。序列表(1)一般信息(i)申請人Conkling.MarkA.Mendu，NandiniSong，Wen(ii)發(fā)明題目根皮層特異性基因啟動子(iii)序列數(shù)9(iv)通訊地址(A)地址KennethD.Sibley；Bell.Seltzer，Park和Gibson(B)街道PostOfficeDrawer34009(C)城市Charlotte(D)州北卡羅來納(E)國家美國(F)郵編代碼28234(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0.Version#1.30(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日期(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Sibley，KennethD.(B)登記號31,665(C)證書號5051-294(ix)電訊信息(A)電話919-420-2200(B)傳真919-881-3175(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)長度2010個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO1CTCGAGGATCTAAATTGTGAGTTCAATCTCTTCCCTATTGGATTGATTATCCTTTCTTTT60CTTCCAATTTGTGTTTCTTTTTGCCTAATTTATTGTGTTATCCCCTTTATCCTATTTTGT120TTCTTTACTTATTTATTTGCTTCTATGTCTTTGTACAAAGATTTAAACTCTATGGCACAT180ATTTTAAAGTTGTTAGAAAATAAATTCTTTCAAGATTGATGAAAGAACTTTTTAATTGTA240GATATTTCGTAGATTTTATTCTCTTACTACCAATATAACGCTTGAATTGACGAAAATTTG300TGTCCAAATATCTAGCAAAAAGGTATCCAATGAAAATATATCATATGTGATCTTCAAATC360TTGTGTCTTATGCAAGATTGATACTTTGTTCAATGGAAGAGATTGTGTGCATATTTTTAA420AATTTTTATTAGTAATAAAGATTCTATATAGCTGTTATAGAGGGATAATTTTACAAAGAA480CACTATAAATATGATTGTTGTTGTTAGGGTGTCAATGGTTCGGTTCGACTGGTTATTTTA540TAAAATTTGTACCATACCATTTTTTTCGATATTCTATTTTGTATAACCAAAATTAGACTT600TTCGAAATCGTCCCAATCATGTCGGTTTCACTTCGGTATCGGTACCGTTCGGTTAATTTT660CATTTTTTTTTAAATGTCATTAAAATTCACTAGTAAAAATAGAATGCAATAACATACGTT720CTTTTATAGGACTTAGCAAAAGCTCTCTAGACATTTTTACTGTTTAAAGGATAATGAATT780AAAAAACATGAAAGATGGCTAGAGTATAGATACACAACTATTCGACAGCAACGTAAAAGA840AACCAAGTAAAAGCAAAGAAAATATAAATCACACGAGTGGAAAGATATTAACCAAGTTGG900GATTCAAGAATAAAGTCTATATTAAATATTCAAAAAGATAAATTTAAATAATATGAAAGG960AAACATATTCAATACATTGTAGTTTGCTACTCATAATCGCTAGAATACTTTGTGCCTTGC1020TAATAAAGATACTTGAAATAGCTTAGTTTAAATATAAATAGCATAATAGATTTTAGGAAT1080TAGTATTTTGAGTTTAATTACTTATTGACTTGTAACAGTTTTTATAATTCCAAGGCCCAT1140GAAAAATTTAATGCTTTATTAGTTTTAAACTTACTATATAAATTTTTCATATGTAAAATT1200TAATCGGTATAGTTCGATATTTTTTCAATTTATTTTTATAAAATAAAAAACTTACCCTAA1260TTATCGGTACAGTTATAGATTTATATAAAAATCTACGGTTCTTCAGAAGAAACCTAAAAA1320TCGGTTCGGTGCGGACGGTTCGATCGGTTTAGTCGATTTTCAAATATTCATTGACACTCC1380TAGTTGTTGTTATAGGTAAAAAGCAGTTACAGAGAGGTAAAATATAACTTAAAAAATCAG1440TTCTAAGGAAAAATTGACTTTTATAGTAAATGACTGTTATATAAGGATGTTGTTACAGAG1500AGGTATGAGTGTAGTTGGTAAATTATGTTCTTGACGGTGTATGTCACATATTATTTATTA1560AAACTAGAAAAAACAGCGTCAAAACTAGCAAAAATCCAACGGACAAAAAAATCGGCTGAA1620TTTGATTTGGTTCCAACATTTAAAAAAGTTTCAGTGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGATG1680ATATAAACAAAGGGCACATTGGTCAATAACCATAAAAAATTATATGACAGCTACAGTTGG1740TAGCATGTGCTCAGCTATTGAACAAATCTAAAGAAGGTACATCTGTAACCGGAACACCAC1800TTAAATGACTAAATTACCCTCATCAGAAAGCAGATGGAGTGCTACAAATAACACACTATT1860CAACAACCATAAATAAAACGTGTTCAGCTACTAAAACAAATATAAATAAATCTATGTTTG1920TAAGCACTCCAGCCATGTTAATGGAGTGCTATTGCCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAG1980TAGTAGAAAAAATATGAACCAAAACACAAC2010(2)SEQIDNO2信息(i)序列特征(A)長度1988個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO2CTCGAGGATCTAAATTGTGAGTTCAATCTCTTCCCTATTGGATTGATTATCCTTTCTTTT60CTTCCAATTTGTGTTTCTTTTTGCCTAATTTATTGTGTTATCCCCTTTATCCTATTTTGT120TTCTTTACTTATTTATTTGCTTCTATGTCTTTGTACAAAGATTTAAACTCTATGGCACAT180ATTTTAAAGTTGTTAGAAAATAAATTCTTTCAAGATTGATGAAAGAACTTTTTAATTGTA240GATATTTCGTAGATTTTATTCTCTTACTACCAATATAACGCTTGAATTGACGAAAATTTG300TGTCCAAATATCTAGCAAAAAGGTATCCAATGAAAATATATCATATGTGATCTTCAAATC360TTGTGTCTTATGCAAGATTGATACTTTGTTCAATGGAAGAGATTGTGTGCATATTTTTAA420AATTTTTATTAGTAATAAAGATTCTATATAGCTGTTATAGAGGGATAATTTTACAAAGAA480CACTATAAATATGATTGTTGTTGTTAGGGTGTCAATGGTTCGGTTCGACTGGTTATTTTA540TAAAATTTGTACCATACCATTTTTTTCGATATTCTATTTTGTATAACCAAAATTAGACTT600TTCGAAATCGTCCCAATCATGTCGGTTTCACTTCGGTATCGGTACCGTTCGGTTAATTTT660CATTTTTTTTTAAATGTCATTAAAATTCACTAGTAAAAATAGAATGCAATAACATACGTT720CTTTTATAGGACTTAGCAAAAGCTCTCTAGACATTTTTACTGTTTAAAGGATAATGAATT780AAAAAACATGAAAGATGGCTAGAGTATAGATACACAACTATTCGACAGCAACGTAAAAGA840AACCAAGTAAAAGCAAAGAAAATATAAATCACACGAGTGGAAAGATATTAACCAAGTTGG900GATTCAAGAATAAAGTCTATATTAAATATTCAAAAAGATAAATTTAAATAATATGAAAGG960AAACATATTCAATACATTGTAGTTTGCTACTCATAATCGCTAGAATACTTTGTGCCTTGC1020TAATAAAGATACTTGAAATAGCTTAGTTTAAATATAAATAGCATAATAGATTTTAGGAAT1080TAGTATTTTGAGTTTAATTACTTATTGACTTGTAACAGTTTTTATAATTCCAAGGCCCAT1140GAAAAATTTAATGCTTTATTAGTTTTAAACTTACTATATAAATTTTTCATATGTAAAATT1200TAATCGGTATAGTTCGATATTTTTTCAATTTATTTTTATAAAATAAAAAACTTACCCTAA1260TTATCGGTACAGTTATAGATTTATATAAAAATCTACGGTTCTTCAGAAGAAACCTAAAAA1320TCGGTTCGGTGCGGACGGTTCGATCGGTTTAGTCGATTTTCAAATATTCATTGACACTCC1380TAGTTGTTGTTATAGGTAAAAAGCAGTTACAGAGAGGTAAAATATAACTTAAAAAATCAG1440TTCTAAGGAAAAATTGACTTTTATAGTAAATGACTGTTATATAAGGATGTTGTTACAGAG1500AGGTATGAGTGTAGTTGGTAAATTATGTTCTTGACGGTGTATGTCACATATTATTTATTA1560AAACTAGAAAAAACAGCGTCAAAACTAGCAAAAATCCAACGGACAAAAAAATCGGCTGAA1620TTTGATTTGGTTCCAACATTTAAAAAAGTTTCAGTGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGATG1680ATATAAACAAAGGGCACATTGGTCAATAACCATAAAAAATTATATGACAGCTACAGTTGG1740TAGCATGTGCTCAGCTATTGAACAAATCTAAAGAAGGTACATCTGTAACCGGAACACCAC1800TTAAATGACTAAATTACCCTCATCAGAAAGCAGATGGAGTGCTACAAATAACACACTATT1860CAACAACCATAAATAAAACGTGTTCAGCTACTAAAACAAATATAAATAAATCTATGTTTG1920TAAGCACTCCAGCCATGTTAATGGAGTGCTATTGCCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAG1980TAGTAGAA1988(2)SEQIDNO3信息(i)序列特征(A)長度1372個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO3TCATGTCGGTTTCACTTCGGTATCGGTACCGTTCGGTTAATTTTCATTTTTTTTTAAATG60TCATTAAAATTCACTAGTAAAAATAGAATGCAATAACATACGTTCTTTTATAGGACTTAG120CAAAAGCTCTCTAGACATTTTTACTGTTTAAAGGATAATGAATTAAAAAACATGAAAGAT180GGCTAGAGTATAGATACACAACTATTCGACAGCAACGTAAAAGAAACCAAGTAAAAGCAA240AGAAAATATAAATCACACGAGTGGAAAGATATTAACCAAGTTGGGATTCAAGAATAAAGT300CTATATTAAATATTCAAAAAGATAAATTTAAATAATATGAAAGGAAACATATTCAATACA360TTGTAGTTTGCTACTCATAATCGCTAGAATACTTTGTGCCTTGCTAATAAAGATACTTGA420AATAGCTTAGTTTAAATATAAATAGCATAATAGATTTTAGGAATTAGTATTTTGAGTTTA480ATTACTTATTGACTTGTAACAGTTTTTATAATTCCAAGGCCCATGAAAAATTTAATGCTT540TATTAGTTTTAAACTTACTATATAAATTTTTCATATGTAAAATTTAATCGGTATAGTTCG600ATATTTTTTCAATTTATTTTTATAAAATAAAAAACTTACCCTAATTATCGGTACAGTTAT660AGATTTATATAAAAATCTACGGTTCTTCAGAAGAAACCTAAAAATCGGTTCGGTGCGGAC720GGTTCGATCGGTTTAGTCGATTTTCAAATATTCATTGACACTCCTAGTTGTTGTTATAGG780TAAAAAGCAGTTACAGAGAGGTAAAATATAACTTAAAAAATCAGTTCTAAGGAAAAATTG840ACTTTTATAGTAAATGACTGTTATATAAGGATGTTGTTACAGAGAGGTATGAGTGTAGTT900GGTAAATTATGTTCTTGACGGTGTATGTCACATATTATTTATTAAAACTAGAAAAAACAG960CGTCAAAACTAGCAAAAATCCAACGGACAAAAAAATCGGCTGAATTTGATTTGGTTCCAA1020CATTTAAAAAAGTTTCAGTGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGATGATATAAACAAAGGGCA1080CATTGGTCAATAACCATAAAAAATTATATGACAGCTACAGTTGGTAGCATGTGCTCAGCT1140ATTGAACAAATCTAAAGAAGGTACATCTGTAACCGGAACACCACTTAAATGACTAAATTA1200CCCTCATCAGAAAGCAGATGGAGTGCTACAAATAACACACTATTCAACAACCATAAATAA1260AACGTGTTCAGCTACTAAAACAAATATAAATAAATCTATGTTTGTAAGCACTCCAGCCAT1320GTTAATGGAGTGCTATTGCCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAGTAGTAGAA1372(2)SEQIDNO4信息(i)序列特征(A)長度1294個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO4AAAAATAGAATGCAATAACATACGTTCTTTTATAGGACTTAGCAAAAGCTCTCTAGACAT60TTTTACTGTTTAAAGGATAATGAATTAAAAAACATGAAAGATGGCTAGAGTATAGATACA120CAACTATTCGACAGCAACGTAAAAGAAACCAAGTAAAAGCAAAGAAAATATAAATCACAC180GAGTGGAAAGATATTAACCAAGTTGGGATTCAAGAATAAAGTCTATATTAAATATTCAAA240AAGATAAATTTAAATAATATGAAAGGAAACATATTCAATACATTGTAGTTTGCTACTCAT300AATCGCTAGAATACTTTGTGCCTTGCTAATAAAGATACTTGAAATAGCTTAGTTTAAATA360TAAATAGCATAATAGATTTTAGGAATTAGTATTTTGAGTTTAATTACTTATTGACTTGTA420ACAGTTTTTATAATTCCAAGGCCCATGAAAAATTTAATGCTTTATTAGTTTTAAACTTAC480TATATAAATTTTTCATATGTAAAATTTAATCGGTATAGTTCGATATTTTTTCAATTTATT540TTTATAAAATAAAAAACTTACCCTAATTATCGGTACAGTTATAGATTTATATAAAAATCT600ACGGTTCTTCAGAAGAAACCTAAAAATCGGTTCGGTGCGGACGGTTCGATCGGTTTAGTC660GATTTTCAAATATTCATTGACACTCCTAGTTGTTGTTATAGGTAAAAAGCAGTTACAGAG720AGGTAAAATATAACTTAAAAAATCAGTTCTAAGGAAAAATTGACTTTTATAGTAAATGAC780TGTTATATAAGGATGTTGTTACAGAGAGGTATGAGTGTAGTTGGTAAATTATGTTCTTGA840CGGTGTATGTCACATATTATTTATTAAAACTAGAAAAAACAGCGTCAAAACTAGCAAAAA900TCCAACGGACAAAAAAATCGGCTGAATTTGATTTGGTTCCAACATTTAAAAAAGTTTCAG960TGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGATGATATAAACAAAGGGCACATTGGTCAATAACCATA1020AAAAATTATATGACAGCTACAGTTGGTAGCATGTGCTCAGCTATTGAACAAATCTAAAGA1080AGGTACATCTGTAACCGGAACACCACTTAAATGACTAAATTACCCTCATCAGAAAGCAGA1140TGGAGTGCTACAAATAACACACTATTCAACAACCATAAATAAAACGTGTTCAGCTACTAA1200AACAAATATAAATAAATCTATGTTTGTAAGCACTCCAGCCATGTTAATGGAGTGCTATTG1260CCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAGTAGTAGAA1294(2)SEQIDNO5信息(i)序列特征(A)長度1030個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO5GGAAACATATTCAATACATTGTAGTTTGCTACTCATAATCGCTAGAATACTTTGTGCCTT60GCTAATAAAGATACTTGAAATAGCTTAGTTTAAATATAAATAGCATAATAGATTTTAGGA120ATTAGTATTTTGAGTTTAATTACTTATTGACTTGTAACAGTTTTTATAATTCCAAGGCCC180ATGAAAAATTTAATGCTTTATTAGTTTTAAACTTACTATATAAATTTTTCATATGTAAAA240TTTAATCGGTATAGTTCGATATTTTTTCAATTTATTTTTATAAAATAAAAAACTTACCCT300AATTATCGGTACAGTTATAGATTTATATAAAAATCTACGGTTCTTCAGAAGAAACCTAAA360AATCGGTTCGGTGCGGACGGTTCGATCGGTTTAGTCGATTTTCAAATATTCATTGACACT420CCTAGTTGTTGTTATAGGTAAAAAGCAGTTACAGAGAGGTAAAATATAACTTAAAAAATC480AGTTCTAAGGAAAAATTGACTTTTATAGTAAATGACTGTTATATAAGGATGTTGTTACAG540AGAGGTATGAGTGTAGTTGGTAAATTATGTTCTTGACGGTGTATGTCACATATTATTTAT600TAAAACTAGAAAAAACAGCGTCAAAACTAGCAAAAATCCAACGGACAAAAAAATCGGCTG660AATTTGATTTGGTTCCAACATTTAAAAAAGTTTCAGTGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGA720TGATATAAACAAAGGGCACATTGGTCAATAACCATAAAAAATTATATGACAGCTACAGTT780GGTAGCATGTGCTCAGCTATTGAACAAATCTAAAGAAGGTACATCTGTAACCGGAACACC840ACTTAAATGACTAAATTACCCTCATCAGAAAGCAGATGGAGTGCTACAAATAACACACTA900TTCAACAACCATAAATAAAACGTGTTCAGCTACTAAAACAAATATAAATAAATCTATGTT960TGTAAGCACTCCAGCCATGTTAATGGAGTGCTATTGCCTGTTAACTCTCACTTATAAAAT1020AGTAGTAGAA1030(2)SEQIDNO6信息(i)序列特征(A)長度722個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEOIDNO6GTACAGTTATAGATTTATATAAAAATCTACGGTTCTTCAGAAGAAACCTAAAAATCGGTT60CGGTGCGGACGGTTCGATCGGTTTAGTCGATTTTCAAATATTCATTGACACTCCTAGTTG120TTGTTATAGGTAAAAAGCAGTTACAGAGAGGTAAAATATAACTTAAAAAATCAGTTCTAA180GGAAAAATTGACTTTTATAGTAAATGACTGTTATATAAGGATGTTGTTACAGAGAGGTAT240GAGTGTAGTTGGTAAATTATGTTCTTGACGGTGTATGTCACATATTATTTATTTAAAACTA300GAAAAAACAGCGTCAAAACTAGCAAAAATCCAACGGACAAAAAAATCGGCTGAATTTGAT360TTGGTTCCAACATTTAAAAAAGTTTCAGTGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGATGATATAA420ACAAAGGGCACATTGGTCAATAACCATAAAAAATTATATGACAGCTACAGTTGGTAGCAT480GTGCTCAGCTATTGAACAAATCTAAAGAAGGTACATCTGTAACCGGAACACCACTTAAAT540GACTAAATTACCCTCATCAGAAAGCAGATGGAGTGCTACAAATAACACACTATTCAACAA600CCATAAATAAAACGTGTTCAGCTACTAAAACAAATATAAATAAATCTATGTTTGTAAGCA660CTCCAGCCATGTTAATGGAGTGCTATTGCCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAGTAGTAG720AA722(2)SEQIDNO7信息(i)序列特征(A)長度574個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO7AGGTAAAATATAACTTAAAAAATCAGTTCTAAGGAAAAATTGACTTTTATAGTAAATGAC60TGTTATATAAGGATGTTGTTACAGAGAGGTATGAGTGTAGTTGGTAAATTATGTTCTTGA120CGGTGTATGTCACATATTATTTATTAAAACTAGAAAAAACAGCGTCAAAACTAGCAAAAA180TCCAACGGACAAAAAAATCGGCTGAATTTGATTTGGTTCCAACATTTAAAAAAGTTTCAG240TGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGATGATATAAACAAAGGGCACATTGGTCAATAACCATA300AAAAATTATATGACAGCTACAGTTGGTAGCATGTGCTCAGCTATTGAACAAATCTAAAGA360AGGTACATCTGTAACCGGAACACCACTTAAATGACTAAATTACCCTCATCAGAAAGCAGA420TGGAGTGCTACAAATAACACACTATTCAACAACCATAAATAAAACGTGTTCAGCTACTAA480AACAAATATAAATAAATCTATGTTTGTAAGCACTCCAGCCATGTTAATGGAGTGCTATTG540CCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAGTAGTAGAA574(2)SEQIDNO8信息(i)序列特征(A)長度523個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO8GTAAATGACTGTTATATAAGGATGTTGTTACAGAGAGGTATGAGTGTAGTTGGTAAATTA60TGTTCTTGACGGTGTATGTCACATATTATTTATTAAAACTAGAAAAAACAGCGTCAAAAC120TAGCAAAAATCCAACGGACAAAAAAATCGGCTGAATTTGATTTGGTTCCAACATTTAAAA180AAGTTTCAGTGAGAAAGAATCGGTGACTGTTGATGATATAAACAAAGGGCACATTGGTCA240ATAACCATAAAAAATTATATGACAGCTACAGTTGGTAGCATGTGCTCAGCTATTGAACAA300ATCTAAAGAAGGTACATCTGTAACCGGAACACCACTTAAATGACTAAATTACCCTCATCA360GAAAGCAGATGGAGTGCTACAAATAACACACTATTCAACAACCATAAATAAAACGTGTTC420AGCTACTAAAACAAATATAAATAAATCTATGTTTGTAAGCACTCCAGCCATGTTAATGGA480GTGCTATTGCCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAGTAGTAGAA523(2)SEQIDNO9信息(i)序列特征(A)長度220個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO9TAAAGAAGGTACATCTGTAACCGGAACACCACTTAAATGACTAAATTACCCTCATCAGAA60AGCAGATGGAGTGCTACAAATAACACACTATTCAACAACCATAAATAAAACGTGTTCAGC120TACTAAAACAAATATAAATAAATCTATGTTTGTAAGCACTCCAGCCATGTTAATGGAGTG180CTATTGCCTGTTAACTCTCACTTATAAAATAGTAGTAGAA220權(quán)利要求1.一種分離的DNA分子，這種DNA分子指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄，所說的分離DNA分子具有選自下組的序列(a)本文提供的SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8和SEQIDNO9；和(b)能夠在嚴(yán)格的洗滌條件(0.3MNaCl、0.03M檸檬酸鈉、0.1％SDS、60℃)下與具有上文(a)序列的分離DNA分子雜交的DNA序列，這種DNA序列能夠指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。2.一種包含表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體，這種構(gòu)建體在5′-3′的方向上包含煙草RD2啟動子和定位在此啟動子下游并與之可操作性地結(jié)合的異源DNA片段。3.一種包含表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體，這種構(gòu)建體在5′-3′的方向上包含根皮層特異性啟動子和定位在此啟動子下游并與之可操作性地結(jié)合的異源DNA片段，所說的根皮層特異性啟動子具有選自下組的序列(a)本文提供的SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8和SEQIDNO9；和(b)能夠在嚴(yán)格的洗滌條件(0.3MNaCl、0.03M檸檬酸鈉0.1％SDS、60℃)下與具有上文(a)序列的分離DNA分子雜交的DNA序列，這種DNA序列能夠指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。4.按照權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中所說的DNA構(gòu)建體還含有質(zhì)粒。5.按照權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中所說的異源DNA片段是編碼殺蟲蛋白的基因。6.按照權(quán)利要求4的DNA構(gòu)建體，其中所說的異源DNA片段編碼對昆蟲有毒的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)晶體蛋白的基因。7.一種含有權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。8.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物的方法，這種方法包括由權(quán)利要求7的植物細(xì)胞再生植株。9.一種包含權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體的根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞，其中所說的DNA構(gòu)建體還包含Ti質(zhì)粒。10.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，這種方法包括用按照權(quán)利要求9的根癌土壤桿菌感染植物細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，然后由所說的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植株。11.一種攜帶按照權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體的微顆粒，其中所說的微顆粒適合用于植物細(xì)胞的沖擊轉(zhuǎn)化。12.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，這種方法包括把按照權(quán)利要求11的微顆粒推進(jìn)到植物細(xì)胞中以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，然后由所說的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植株。13.一種含有按照權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞原生質(zhì)體。14.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，這種方法包括由按照權(quán)利要求13的植物細(xì)胞原生質(zhì)體再生植株。15.一種包含轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物，這種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞包含異源DNA構(gòu)建體，所說的構(gòu)建體在5′-3′的方向上包含根皮層特異性啟動子和定位在此啟動子下游并與之可操作性地結(jié)合的異源DNA片段，所說的啟動子指導(dǎo)所說的異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。16.按照權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化植物，其中所說的根皮層特異性啟動子是煙草RD2啟動子，這種啟動子指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。17.按照權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化植物，其中所說的啟動子具有選自下組的序列(a)本文提供的SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8和SEQIDNO9；和(b)能夠在嚴(yán)格的洗滌條件(0.3MNaCl、0.03M檸檬酸鈉、0.1％SDS、60℃)下與具有上文(a)序列的分離DNA分子雜交的DNA序列，這種DNA序列能夠指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。18.按照權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化植物，其中所說的植物是雙子葉植物。19.按照權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化植物，其中所說的植物是單子葉植物。20.按照權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化植物，其中所說的植物是煙草(Nicotianatabacum)。21.一種分離的DNA分子，這種DNA分子實(shí)質(zhì)上包含指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄的啟動子，并且具有選自由本文提供的SEQIDNO1-9組成的組中的序列。22.一種包含表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體，這種構(gòu)建體在5′-3′的方向上包含按照權(quán)利要求21的啟動子和定位在此啟動子下游并與之可操作性地結(jié)合的異源DNA片段。23.一種包含轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物，所說的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞包含按照權(quán)利要求22的DNA構(gòu)建體。全文摘要本發(fā)明的分離的DNA分子包含DNA啟動子序列,所說的啟動子序列指導(dǎo)植物細(xì)胞中下游異源DNA片段的根皮層特異性轉(zhuǎn)錄。DNA構(gòu)建體包含表達(dá)盒,所說的表達(dá)盒在5′—3′的方向上包含本發(fā)明的啟動子和定位在此啟動子下游并與之可操作性地結(jié)合的異源DNA片段。轉(zhuǎn)化的植物(如煙草)包含含有異源DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞,所說的DNA構(gòu)建體包含以上所述的表達(dá)盒。文檔編號C12N15/82GK1196753SQ96197068公開日1998年10月21日申請日期1996年7月24日優(yōu)先權(quán)日1995年7月28日發(fā)明者M(jìn)·A·果克林,N·門都,宋文申請人:北卡羅來納州大學(xué)