專利名稱：：用于在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法本申請(qǐng)是下列申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)1)Edington的發(fā)明名稱為＂用于產(chǎn)生淀粉顆粒結(jié)合葡萄糖糖轉(zhuǎn)移酶活性缺陷的轉(zhuǎn)基因植物的方法＂的非臨時(shí)申請(qǐng)U.S.S.N.08/300,726(申請(qǐng)日是1994年9月2日)；和2)Zwick等的發(fā)明名稱為“在植物中修飾脂肪酸飽和度的組合體和方法”的臨時(shí)申請(qǐng)U.S.S.N60/001,135(申請(qǐng)日是1995年7月13日)。這兩份申請(qǐng)以其整體(包括附圖)一并被本文參考。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及用于在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法，更具體地說是利用酶促核酸分子在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法。以下是在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的簡要描述。這些討論不意味著是完全的，僅僅提供來幫助理解隨后的本發(fā)明。這一概要不是承認(rèn)以下所描述的任一工作是所要求保護(hù)的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。有各種在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的策略。反義RNA(Bourque，1995植物科學(xué)105，125-149中綜述)和共抑制(Jorgensen，1995科學(xué)268，686-691中綜述)傳統(tǒng)地已用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。基因的插入誘變也已用來沉默基因表達(dá)。然而，這一方法不能用來特異性地滅活興趣基因。申請(qǐng)人相信核酶技術(shù)可以提供一種在植物中改變基因表達(dá)的具有吸引力的新方法。十多年以前首先在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了天然存在的反義RNA(Simons和Kleckner，1983細(xì)胞34，683-691)。它被認(rèn)為是一種細(xì)菌能夠調(diào)節(jié)它們的基因表達(dá)的方式(Green等，1986生物化學(xué)年評(píng).55567-597；Simons1988基因7235-44)?；虮磉_(dá)的反義介導(dǎo)抑制作用的首次顯示被報(bào)道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(Izant和Weintraub1984細(xì)胞361007-1015)。在文獻(xiàn)中有許多利用反義RNA在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的例子。以下是一些例子Shewmaker等美國專利5,107,065和5,153,566公開了采用反義RNA在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法。有人指出，在植物中表達(dá)的反義基因能夠充當(dāng)顯性抑制基因。已產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因土豆植物，這些植物表達(dá)對(duì)土豆或木薯顆粒結(jié)合淀粉酶合酶(GBSS)反義的RNA。在這兩種情況下，都已構(gòu)建出具有降低的或者沒有GBSS活性或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。這些轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生含有具有明顯降低的直鏈淀粉水平的淀粉的土豆(Visser等1991，Mol.Gen.Genet.2252889-296；Salehuzzaman等1993，植物分子生物學(xué)23947-962)。Kull等1995，J.Genet.&amp;Breed.49，69-76報(bào)道了由顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)基因反義序列表達(dá)所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因土豆系球根中直鏈淀粉生物合成的抑制作用。然而，作者指出未能夠發(fā)現(xiàn)核酶針對(duì)GBSSRNA的任何體內(nèi)活性。已證明在canola中的針對(duì)Δ9去飽和酶的反義RNA構(gòu)建體將硬脂酸(C180)水平從2％增加至40％(Knutzon等，1992Proc.Natl.Acad.Sci.89，2624)。在一個(gè)高硬脂酸系中沒有總油含量或發(fā)芽率的降低。最近有幾個(gè)說明具有修飾的油組成的植物的實(shí)用性的綜述(Ohlrogge，J.B.1994植物生理學(xué).104，821；Kinney，A.J.1994Curr.Opin.CellBiol.5，144；Gibson等1994PlantCellEnvir.17，627)。文獻(xiàn)首先記載了在植物中的同源的轉(zhuǎn)基因滅活，其是作為一種以有義方向插入轉(zhuǎn)基因并發(fā)現(xiàn)基因和轉(zhuǎn)基因兩者被下調(diào)的出乎意料的結(jié)果(Napoli等，1990，PlantCell2279-289)。似乎存在滅活同源遺傳序列至少兩種機(jī)制。一種似乎是經(jīng)甲基化作用的轉(zhuǎn)錄滅活(基因沉默的復(fù)制DNA區(qū)信號(hào)內(nèi)源機(jī)制)。這一基因調(diào)節(jié)方法涉及引入轉(zhuǎn)基因多拷貝或者用具有與興趣基因同源性的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化植物(Ronchi等1995EMBOJ.145318-5328)。另一種共抑制機(jī)制是轉(zhuǎn)錄后的，其中從基因和轉(zhuǎn)基因兩者表達(dá)的總水平被認(rèn)為產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)錄本，它引發(fā)兩種信號(hào)的閾值誘導(dǎo)降級(jí)(vanBokland等，1994植物學(xué)雜志，6861-877)。共抑制的準(zhǔn)確分子基礎(chǔ)是未知的。遺憾地是，反義和共抑制技術(shù)兩者在所需性狀的遺傳率上存在問題(Finnegan和McElroy1994生物技術(shù)，12883-888)。當(dāng)前，沒有在植物DNA水平上特異性滅活興趣基因的容易的方法(Pazkowski等，1988，EMBO，J.74021-4026)。轉(zhuǎn)座子突變是低效的并且是不穩(wěn)定的事件，而化學(xué)誘變是高度非特異性的。申請(qǐng)人相信核酶具有有吸引力的可替性，并且由于其催化作用機(jī)制而具有超過競(jìng)爭(zhēng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。然而，在植物系統(tǒng)中證明核酶調(diào)節(jié)基因表達(dá)的有效性有困難(Mazzolini等，1992植物分子生物學(xué).20715-731；Kull等，1995J.Genet.&amp;Breed.4969-76)。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道了核酶在植物細(xì)胞中的活性，但它們幾乎都牽涉到下調(diào)外源引入的基因，例如在瞬時(shí)測(cè)定中的報(bào)道基因(Steinecke等，1992EMBOJ.111525-1530；Perriman等，1993AntisenseRes.Dev.3253-263；Perriman等，1995，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，92，6165)。也有幾種出版物[例如，Lamb和Hay，1990，J.Gen.Virol.71，2257-2264；Gerlach等，國際PCT出版物No.WO91/13994；Xu等，1992，中國科學(xué)(Ser.B)35，1434-1443；Edington和Nelson，1992，基因調(diào)節(jié)反義RNA和DNA生物學(xué)，編者R.P.Erickson和J.G.Izant，pp209-221，Raven出版社，NY.；Atkins等，國際PCT出版物No.WO94/00012；Lenee等，國際PCT出版物No.WO94/19476和WO95/03404，Atkins等，1995，J.Gen.Virol.76，1781-1790；Gruber等，1994，細(xì)胞生物化學(xué)雜志增刊18A，110(X1-406)和Feyter等，1996，Mol.Gen.Genet.250，329-338]提出利用錘頭核酶調(diào)節(jié)病毒復(fù)制、病毒基因和/或報(bào)道基因的表達(dá)。這些出版物沒有報(bào)告利用核酶調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)。Mazzolini等，1992，植物分子生物學(xué)20，715-731；Steinecke等，1992，EMBO.J.11，1525-1530；Perriman等，1995，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，92，6175-6179；Wegener等，1994，Mol.Gen.Genet.245，465-470；和Steinecke等，1994，基因，149，47-54描述了利用錘頭核酶在植物細(xì)胞中抑制報(bào)道基因的表達(dá)。Bennett和Cullimore.1992核酸研究20，831～837闡述了錘頭核酶介導(dǎo)的glna，glnb，glng和glndRNA(在Phaseolusvulgaris中編碼谷氨酰胺合成酶)的體外切割。Hitz等(WO91/18985)描述了采用大豆Δ-9去飽和酶修飾植物油組成的方法。該申請(qǐng)描述了用大豆Δ-9去飽和酶序列從其它物種分離Δ-9去飽和酶基因。以上所引用的參考文獻(xiàn)明顯不同于本發(fā)明，因?yàn)樗鼈儧]有公開和/或不涉及在玉米中使用核酶。此外，申請(qǐng)人相信這些文獻(xiàn)沒有公開用核酶下調(diào)植物細(xì)胞中的基因，和/或不能夠用核酶下調(diào)植物細(xì)胞中的基因，更不要說植物本身了。發(fā)明概要本發(fā)明的特征在于利用酶促核酸分子在植物中特異性地調(diào)節(jié)基因表達(dá)。優(yōu)選地，所說的基因是內(nèi)源基因。具有RNA切割活性的酶促核酸分子可以以錘頭、發(fā)夾、肝炎Δ病毒、I組內(nèi)含子、II組內(nèi)含子、RNA酶PRNA、脈孢菌屬VSRNA等形式，但不限于這些形式。具有RNA切割活性的酶促核酸分子可以作為單體或多體(優(yōu)選地是多體)被編碼。編碼具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸可以可操作地連接到開放讀框上?？梢酝ㄟ^用編碼具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸轉(zhuǎn)化植物來修飾任何植物中的基因表達(dá)。也有許多轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)這些技術(shù)包括但不限于用土壤桿菌屬、DNA包被微粒(coatedmicroprojectiles)轟擊、噬菌體頸須(whiskers)或電穿孔轉(zhuǎn)化?？梢杂镁幋a具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸修飾任何靶基因。這里兩種例證性的靶是Δ9去飽和酶和顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)。直到本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)才闡明了基于核酸的試劑(如酶促核酸(核酶))在植物(例如單子葉植物(如玉米))中調(diào)節(jié)和/或抑制基因表達(dá)。核酶能夠用來調(diào)節(jié)植物細(xì)胞一個(gè)特定的性狀，例如，通過調(diào)節(jié)生物化學(xué)途徑中涉及的酶活性。在某些情況下，降低特定基因的表達(dá)水平而不是完全消除其表達(dá)可能是合乎需要的，核酶能夠用來達(dá)到這一目的。本發(fā)明開發(fā)了以酶促核酸為基礎(chǔ)的技術(shù)使得可以指導(dǎo)性調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以產(chǎn)生具有改變的表型的植物細(xì)胞、植物組織或植物。核酶(即酶促核酸)是具有能夠以核苷酸堿基序列特異性方式重復(fù)切割其它不同的RNA分子的酶促活性的核酸分子。這樣的酶促RNA分子可被導(dǎo)向幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄物，并且在體內(nèi)和體外已獲得了有效的切割(Zaug等，1986，自然324，429；Kim等，1987，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)84，8788；Dreyfus，1988，EinsteinQuarrerlyJ.Bio.Med..6，92；Hascloff和Gerlach，1988，自然334585；Cech，1988，JAMA260，3030；Murphy和Cech，1989，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，86，9218；Jefferies等，1989，核酸研究17，1371)。由于它們的序列特異性，反式切割核酶可以用作在各種有機(jī)體(包括植物，動(dòng)物以及人類)中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的有效工具(Bennett等，同上；Edington等，同上；Usman&amp;McSwiggen，1995Ann.Rep.Med.Chem.30，285-294；Christoffersen和Marr；1995J.Med.Chem.38，2023-2037)。核酶能夠設(shè)計(jì)成在細(xì)胞RNA背景內(nèi)切割特定的RNA靶。這樣一種切割事件使得mRNA無功能，并且抑制了蛋白質(zhì)從RNA表達(dá)。按這種方式，與特殊的表型和/或疾病狀態(tài)相聯(lián)系的蛋白質(zhì)的合成能夠選擇性地被抑制。本發(fā)明的其它特征與優(yōu)點(diǎn)從以下描述的其優(yōu)選的實(shí)施方案以及權(quán)利要求可以看出。附圖簡要描述圖1是現(xiàn)有技術(shù)中已知的錘頭核酶區(qū)的圖示。干II可以是≥2堿基對(duì)長。每個(gè)N是任何核苷酸，每個(gè)·代表一個(gè)堿基對(duì)。圖2a是現(xiàn)有技術(shù)中已知的錘頭核酶區(qū)的圖示；圖2b是如Uhlenbeck(1987，自然，327，596-600)劃分成底物和酶部分的錘頭核酶的圖示；圖2c是顯示由Haseloff和Gerlach(1988，自然，334，585-591)劃分成兩部分的錘頭的類似圖；圖2d是顯示由Jeffries和Symons(1989，核酸研究，17，1371-1371)劃分成兩部分的錘頭的類似圖。圖3是發(fā)夾核酶的一般結(jié)構(gòu)的圖示。螺旋2(H2)具有至少4個(gè)堿基對(duì)(即n是1、2、3或4)，螺旋5可以可有可無地具有2個(gè)或多個(gè)堿基(優(yōu)選地是3-20個(gè)堿基，即m是1-20或更多)。螺旋2和5可以經(jīng)一個(gè)或多個(gè)堿基(即r是≥1個(gè)堿基)共價(jià)連接。螺旋1、4或5也可以由2個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)(如4-20個(gè)堿基對(duì))延伸，以穩(wěn)定核酶結(jié)構(gòu)，并且優(yōu)選地是蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在每一個(gè)實(shí)例中，各N和N’分別是任何正常的或修飾的堿基，各破折號(hào)代表潛在堿基配對(duì)相互作用。這些核苷酸可以在糖基、堿基以及磷酸基上被修飾。在螺旋中完全的堿基配對(duì)不是必需的，但是是優(yōu)選的。螺旋1和4可以是任何大小(即o和p各自分別是0到任何數(shù)，例如20)，只要某些堿基配對(duì)被保持。必需堿基作為結(jié)構(gòu)中特定堿基顯示，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到一個(gè)或多個(gè)堿基可以經(jīng)化學(xué)修飾(脫堿基、堿基、糖基和/或磷酸基修飾)或用沒有明顯影響的另一種堿基取代。螺旋4可以從兩個(gè)單獨(dú)分子形成，即沒有連接環(huán)。連接環(huán)在存在時(shí)可以是有或沒有堿基、糖基或磷酸基修飾的核糖核苷酸?！皅”是≥2個(gè)堿基。連接環(huán)也可以被非核苷酸接頭分子替代。H指堿基A、U、或C。Y指嘧啶堿基?！啊敝腹矁r(jià)鍵。圖4是現(xiàn)有技術(shù)中已知的肝炎Δ病毒核酶區(qū)的一般結(jié)構(gòu)的圖示。圖5是自切割VSRNA核酶區(qū)的一般結(jié)構(gòu)的圖示。圖6是RNA酶H可及性測(cè)定的示意圖。具體地說，圖6的左側(cè)是結(jié)合到靶RNA的易接近位點(diǎn)上的互補(bǔ)DNA寡核苷酸的圖?；パa(bǔ)DNA寡核苷酸由標(biāo)記有A、B和C的寬線表示。靶RNA由細(xì)的扭曲線表示。圖6的右側(cè)是來自切割的靶RNA的未切割靶RNA的凝膠分離示意圖。靶RNA的檢測(cè)通過體標(biāo)記的T7轉(zhuǎn)錄物的放射自顯影進(jìn)行。各道共同的帶代表未切割的靶RNA；各道特有的帶代表切割產(chǎn)物。圖7是GBSSRNA的RNA酶H可及性的圖示。圖8是在不同的溫度下由核酶進(jìn)行的GBSSRNA切割的圖示。圖9是由多核酶進(jìn)行的GBSSRNA切割的圖示。圖10列出了從玉米分離的Δ9去飽和酶cDNA的核苷酸序列。圖11和12是在植物中脂肪酸生物合成的圖示。圖11從Gibson等1994，PlantCellEnvir.17，627改編。圖13和14是Δ-9去飽和酶RNA的RNA酶H可及性的圖示。圖15顯示經(jīng)核酶進(jìn)行的體外Δ-9去飽和酶RNA的切割。10/10代表錘頭(HH)核酶的結(jié)合臂的長度。10/10指螺旋1和螺旋3各與靶RNA形成10個(gè)堿基對(duì)(圖1)。4/6和6/6代表發(fā)夾核酶和其靶之間的螺旋2/螺旋I相互作用。4/6指發(fā)夾(HP)核酶與靶形成4個(gè)堿基配對(duì)的螺旋2和6個(gè)堿基配對(duì)的螺旋1復(fù)合物(參見圖3)。6/6指發(fā)夾核酶與靶形成6個(gè)堿基配對(duì)的螺旋2和6個(gè)堿基配對(duì)的螺旋1復(fù)合物。切割反應(yīng)在26℃下進(jìn)行120分鐘。圖16顯示臂長度變化對(duì)HH和HP核酶體外活性的影響。7/7、10/10和12/12實(shí)質(zhì)上如以上對(duì)HH核酶的描述。6/6，6/8，6/12代表發(fā)夾核酶的變化的螺旋1長度和恒定的(6bp)螺旋2。切割反應(yīng)實(shí)質(zhì)上如以上的描述進(jìn)行。圖17、18、19和23是構(gòu)建包含多核酶基元(相同或不相同，導(dǎo)向Δ-9去飽和酶RNA內(nèi)的各種位點(diǎn))的轉(zhuǎn)錄物的非限制策略的圖示。圖20和21顯示由采用噬菌體T7RNA聚合酶從DNA模板轉(zhuǎn)錄的核酶進(jìn)行的Δ9去飽和酶RNA的體外切割。圖22是構(gòu)建包含多核酶基元(相同或不相同，導(dǎo)向GBSSRNA內(nèi)的各種位點(diǎn))的轉(zhuǎn)錄物的非限制策略的圖示。圖24顯示由核酶進(jìn)行的Δ9去飽和酶RNA的切割。453多體代表針對(duì)錘頭核酶位點(diǎn)453、464、475和484的多體核酶構(gòu)建體。252多體代表針對(duì)錘頭核酶位點(diǎn)252、271、313和326的多體核酶構(gòu)建體。238多體代表針對(duì)三個(gè)錘頭核酶位點(diǎn)252、259和271以及一個(gè)發(fā)夾核酶位點(diǎn)238(HP)的多體核酶構(gòu)建體。259多體代表針對(duì)兩個(gè)錘頭核酶位點(diǎn)271和313以及一個(gè)發(fā)夾核酶位點(diǎn)259(HP)的多體核酶構(gòu)建體。圖25說明在核酶陰性對(duì)照(C、F、I、J、N、P、Q)和活性核酶RPA63轉(zhuǎn)化體(AA、DD、EE、FF、GG、HH、JJ、KK)中GBSSmRNA的水平。圖26說明在未轉(zhuǎn)化的植物(NT)、85-06高硬脂酸植物(1、3、5、8、12、14)以及轉(zhuǎn)化的(不相干核酶)對(duì)照植物(RPA63-33、RPA63-51、RPA63-65)中的Δ9去飽和酶mRNA水平。圖27說明未轉(zhuǎn)化的植物(NTO)、85-15高硬脂酸植物(01、06、07、10、11、12)和85-15正常硬脂酸植物(02、05、09、14)中Δ9去飽和酶mRNA的水平。圖28說明未轉(zhuǎn)化的植物(NTY)、113-06無活性核酶植物(02、04、07、10、11)中Δ9去飽和酶mRNA的水平。圖29a和29b說明在玉米葉片(R0)中Δ9去飽和酶蛋白質(zhì)的水平。(a)未轉(zhuǎn)化的HiII系植物a-e和核酶失活的RPA113-17系植物1-6。(b)核酶活性的RPA85-15系植物1-15。圖30說明在RPA85-06植物葉片中的硬脂酸。圖31說明在RPA85-15植物葉片中的硬脂酸，三種試驗(yàn)的結(jié)果。圖32說明在RPA113-06植物葉片中的硬脂酸。圖33說明在RPA113-17植物葉片中的硬脂酸。圖34說明在對(duì)照植物中的葉片中的硬脂酸。圖35說明R1植物(來源于高硬脂酸植物雜交)(RPA85-15.07自交)中的葉片硬脂酸。圖36說明在下一代玉米葉片(R1)中Δ9去飽和酶的水平。*表示顯示出高硬脂酸含量的那些植物。圖37說明用反義Δ9去飽和酶轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物(308/430-012)的個(gè)體體胚中的硬脂酸。圖38說明用反義Δ9去飽和酶轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物(308/430-015)的個(gè)體體胚中的硬脂酸。圖39說明從用反義Δ9去飽和酶轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物(308/430-012)再生的植物的個(gè)體葉片中的硬脂酸。圖40說明在未轉(zhuǎn)化的對(duì)照系(Q806)和反義系308/425-12.2.1的單個(gè)谷粒中的直鏈淀粉含量。圖41說明在Southern陰性系(RPA63-0306)和Southern陽性系(RPA63-0218)的單個(gè)谷粒中的GBSS活性。圖42說明能夠用來表達(dá)本發(fā)明的酶促核酸的轉(zhuǎn)化載體。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于用于在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法，更具體地說是利用酶促核酸分子在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法。以下短語和術(shù)語定義如下＂抑制＂或＂調(diào)節(jié)＂意指酶(如GBSS和Δ9去飽和酶)活性或由這些基因編碼的mRNA水平降低到低于在不存在酶促核酸時(shí)觀察到的水平，并且優(yōu)選地是低于在存在無活性RNA分子(能夠結(jié)合到mRNA上的相同位點(diǎn)上，但不能夠切割該RNA)時(shí)觀察到的水平。“酶促核酸分子”意指在底物結(jié)合區(qū)中具有對(duì)指定基因靶的互補(bǔ)性，并且也具有特異性切割該靶的酶活性的核酸分子。即，該酶促核酸分子能夠分子間切割RNA(或DNA)并且由此使靶RNA分子失活。這一互補(bǔ)性能夠使得酶促核酸分子充分雜交到靶RNA上，使切割發(fā)生。百分之百的互補(bǔ)性是優(yōu)選的，但是在本發(fā)明中低至50-75％的互補(bǔ)性也是有用的。核酸可以在堿基、糖基和/或磷酸基上被修飾。術(shù)語酶促核酸與以下詞組可替換使用，例如核酶、催化RNA、酶促RNA、催化DNA、核苷酶(nucleozyme)、DNA酶(DNAzyme)、RNA酶、多核酶、分子剪、自接合RNA、自切割RNA、順式切割RNA、自溶RNA、內(nèi)切核糖核酸酶、小型酶、先導(dǎo)酶(leadzyme)。所有這些術(shù)語都描述具有酶促活性的核酸分子。該術(shù)語包括酶促RNA分子，包括一種或多種核糖核苷酸，并且可以包括大多數(shù)其它類型的核苷酸或脫堿基部分，如以下描述。＂互補(bǔ)性＂意指核酸能夠經(jīng)傳統(tǒng)的Watson-Crick或其它非傳統(tǒng)的類型(例如Hoogsteen類型)的堿基配對(duì)相互作用與其它RNA序列形成氫鍵。＂載體＂意指用于傳送和/或表達(dá)所需核酸的任何基于核酸和/或病毒的技術(shù)。＂基因＂意指編碼RNA的核酸。＂植物基因＂意指植物所編碼的基因。＂內(nèi)源＂基因意指通常在植物細(xì)胞基因組的天然位置發(fā)現(xiàn)的基因。＂外源＂或＂異源＂基因意指通常宿主植物細(xì)胞中不能發(fā)現(xiàn)的，但由標(biāo)準(zhǔn)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)引入的基因?！昂怂帷币庵高@樣一種分子，它可以是單鏈或雙鏈，由含有糖基、磷酸基和嘌呤或嘧啶堿基(可以相同或不同)的核苷酸組成，并且可以是修飾的或未修飾的。＂基因組＂意指包含在各有機(jī)體和/或病毒細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)。＂mRNA＂意指能夠由細(xì)胞翻譯成為蛋白質(zhì)的RNA。＂cDNA＂意指互補(bǔ)于和來源于mRNA的DNA。＂dsDNA＂意指雙鏈cDNA。＂有義＂RNA意指包含mRNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物。＂反義RNA＂意指包含互補(bǔ)于全部或部分靶RNA和/或mRNA的序列，并且通過干擾初級(jí)轉(zhuǎn)錄物和/或mRNA的加工、運(yùn)輸和/或翻譯而阻斷靶基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物?；パa(bǔ)性可以存在于靶RNA的任何部分，即，在5’非編碼序列、3’非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列上。反義RNA通常是有義RNA的鏡象。如本文所使用的＂表達(dá)＂意指植物細(xì)胞內(nèi)的酶促核酸分子、mRNA和/或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。基因的表達(dá)包括基因的轉(zhuǎn)錄和把mRNA翻譯成為前體或成熟蛋白質(zhì)。＂共抑制＂意指外源基因的表達(dá)，該外源基因與某基因具有實(shí)質(zhì)上的同源性，并且在植物細(xì)胞中引起外源和/或內(nèi)源蛋白質(zhì)產(chǎn)物的活性降低。＂改變的水平＂意指在轉(zhuǎn)基因有機(jī)體中基因產(chǎn)物的產(chǎn)生水平與正?；蚍寝D(zhuǎn)基因有機(jī)體中的不同。＂啟動(dòng)子＂意指在基因內(nèi)控制該基因的表達(dá)的核苷酸序列元件。啟動(dòng)子序列提供RNA聚合酶和有效轉(zhuǎn)錄所需的其它轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別作用。各種來源的啟動(dòng)子可以有效地用于植物細(xì)胞，以表達(dá)核酶。例如，細(xì)菌來源的啟動(dòng)子，如章魚堿合成酶啟動(dòng)子、胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子、manopine合成酶啟動(dòng)子；病毒來源的啟動(dòng)子，如花椰菜斑紋病毒(35S)；植物啟動(dòng)子，如核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亞單位(ssu)、β-conglycinin啟動(dòng)子、菜豆球蛋白啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子以及組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可以包含某些可以改進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率的增強(qiáng)子序列元件。＂增強(qiáng)子＂意指可以刺激啟動(dòng)子活性的核苷酸序列元件(Adh)。＂組成型啟動(dòng)子＂意指在所有細(xì)胞類型中和在任何時(shí)候都指導(dǎo)連續(xù)的基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件(肌動(dòng)蛋白、遍在蛋白、CaMV35S)。＂組織特異性＂啟動(dòng)子意指在特定細(xì)胞或組織類型如葉片或種子中負(fù)責(zé)基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件(玉米醇溶蛋白、油質(zhì)蛋白、napin、ACP)。＂發(fā)育特異性＂啟動(dòng)子意指在特定的植物發(fā)育階段(如早期或晚期胚胎發(fā)生)負(fù)責(zé)基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件。＂誘導(dǎo)型啟動(dòng)子＂意指負(fù)責(zé)響應(yīng)特定信號(hào)(如物理刺激(熱休克基因)；光(RUBP羧化酶)；激素(Em)；代謝物；和逆境)的基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件。＂植物＂意指真核和原核光合有機(jī)體。＂被子植物＂意指其種子包封在子房中的植物(例如咖啡、煙草、大豆、豌豆)。＂裸子植物＂意指其種子暴露而不是包封在子房中的植物(例如，松樹、云杉)。＂單子葉植物＂意指以僅存在一片子葉(胚的原始葉片)為特征的植物。例如，玉米、小麥、水稻和其它。＂雙子葉植物＂意指產(chǎn)生具有兩片子葉(胚的原始葉片)的種子的植物。例如，咖啡、canola、豌豆和其它。＂轉(zhuǎn)基因植物＂意指表達(dá)外源基因的植物。＂開放讀框＂意指沒有內(nèi)含子、編碼氨基酸序列、具有確定的翻譯起始和終止區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生一類酶促切割劑的方法，所述切割劑對(duì)所需靶的RNA具有高度的特異性。所述酶促核酸分子可被導(dǎo)向靶的高度特異性的序列區(qū)，以便可以獲得特異性的基因抑制。此外酶促核酸可被導(dǎo)向基因家族的高度保守區(qū)，以抑制相關(guān)酶家族的基因表達(dá)。所說的核酶可以在已由載體(表達(dá)本發(fā)明的核酸)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)。核酶的酶促性質(zhì)比其它技術(shù)有利，因?yàn)橛绊懼委煴匦璧暮嗣笣舛雀?。這一優(yōu)點(diǎn)反映了核酶起酶促作用的能力。這樣，一個(gè)單一的核酶分子能夠切割許多靶RNA的分子。此外，核酶是高度特異性的抑制劑，其抑制特異性不僅取決于結(jié)合到靶RNA上的堿基配對(duì)機(jī)制，而且取決于靶RNA切割機(jī)制。鄰近切割位點(diǎn)的單一錯(cuò)配或堿基取代能夠完全消除核酶的催化活性。天然存在的酶促RNA的6個(gè)基本變體目前是已知的。各變體在生理?xiàng)l件下能催化RNA反式磷酸二酯鍵的水解(并且由此可以切割其它RNA分子)。表I總結(jié)這些核酶的一些特征。一般來說，酶促核酸通過首先結(jié)合到靶RNA上起作用。通過酶促核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生這樣的結(jié)合，該部分很接近該分子起切割靶RNA作用的的酶促部分。這樣，酶促核酸首先通過互補(bǔ)堿基配對(duì)識(shí)別靶RNA，然后結(jié)合它，一旦結(jié)合到正確的位點(diǎn)，就發(fā)揮酶促作用切割靶RNA。這樣一種靶RNA的策略性切割將破壞其指導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)合成的能力。在酶促核酸結(jié)合和切割它的RNA靶后，它從該RNA釋放，尋找另一個(gè)靶，并且能夠重復(fù)結(jié)合和切割新的靶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酶促核酸分子以錘頭或發(fā)夾基元形成，但也可以以肝炎Δ病毒、I組內(nèi)含子、II組內(nèi)含子、RNA酶PRNA(與RNA指導(dǎo)序列相關(guān))或脈孢菌屬VSRNA形成。這樣的錘頭基元的例子由Dreyfus，同上，Rossi等，1992，AIDS研究和人類逆轉(zhuǎn)錄病毒8，183描述；發(fā)夾基元的例子由Hampel等，EP0360257，Hampel和Tritz，1989生物化學(xué)28，4929，F(xiàn)eldstein等1989，基因82，53，Haseloff和Gerlach，1989，基因，82，43，和Hampel等，1990核酸研究，18，299描述；肝炎Δ病毒基元的例子由Perrotta和Been，1992，生物化學(xué)，31，16描述；RNA酶P基元的例子由Guerrier-Takada等，1983細(xì)胞35，849；Forster和Altman，1990，科學(xué)249，783；Li和Altman，1996，核酸研究24，835描述；脈孢菌屬VSRNA核酶基元的例子由Collins(Saville和Collins，1990細(xì)胞，61，685-696；Saville和Collins，1991美國科學(xué)院學(xué)報(bào)88，8826-8830；Collins和Olive，1993生物化學(xué)32，2795-2799；Guo和Collins，1995，EMBO.J.14，363)描述；II組內(nèi)含子的例子由Griffin等1995，Chem.Biol.2，761；Michels和Pyle，1995，生物化學(xué)34，2965描述；I組內(nèi)含子的例子由Cech等，美國專利4,987,071描述。在本發(fā)明中這些特異性基元不是限制性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明的酶促核酸分子中重要的只是它要具有互補(bǔ)于一個(gè)或多個(gè)靶基因RNA區(qū)的特異性底物結(jié)合位點(diǎn)，并在底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)或者其周圍具有賦予分子RNA切割活性的核苷酸序列。本發(fā)明的酶促核酸分子從真核啟動(dòng)子在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[例如Gerlach等，國際PCT出版物WO91/13994；Edington和Nelson，1992，基因調(diào)節(jié)作用反義RNA和DNA生物學(xué)，編者R.P.Erickson和J.G.Izant，pp209-221，Raven出版社，NY.；Atkins等，國際PCT出版物WO94/00012；Lenee等，國際PCT出版物WO94/19476和WO9503404，Atkins等，1995，J.Gen.Virol.76，1781-1790；McElroy和Brettell，1994，TIBTECH12，62；Gruber等，1994，細(xì)胞生物化學(xué)雜志增刊18A，110(X1-406)和Feyter等，1996，Mol.Gen.Genet.250，329-338；所有這些文獻(xiàn)本文一并參考]。由本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到任何核酶都能夠在真核植物細(xì)胞中從適當(dāng)?shù)膯?dòng)子表達(dá)。核酶表達(dá)在組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。為了獲得核酶介導(dǎo)的調(diào)節(jié)，將核酶RNA引入植物。雖然以下提供了構(gòu)建用于本文說明的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒的例子，但設(shè)計(jì)許多不同類型的可以用于植物轉(zhuǎn)化中的質(zhì)粒完全在技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。參見Bevan，1984，核酸研究12，8711-8721(本文一并參考)。也有許多轉(zhuǎn)化植物的方式。在以下例子中胚胎發(fā)生玉米培養(yǎng)物用氦處理。除了利用基因槍(Cornell的美國專利4,945,050和DowElanco的美國專利5,141,131)外，植物可以用以下技術(shù)轉(zhuǎn)化土壤桿菌技術(shù)，參見Toledo大學(xué)的美國專利5,177,010，TexasA&amp;M的美國專利5,104,310、歐洲專利申請(qǐng)0131624B1、Schilperoot的歐洲專利申請(qǐng)120516、159418B1和176,112、Schilperoot的美國專利5,149,645、5,469,976、5,464,763、4,940,838和4,693,976、MaxPlanck的歐洲專利申請(qǐng)116718、290799、320500、JapanTobacco的歐洲專利申請(qǐng)604662和627752、CibaGeigy的歐洲專利申請(qǐng)0267159和0292435和美國專利5,231,019，Calgene的美國專利5,463,174和4,762,785、和Agracetus的美國專利5,004,863和5,159,135；噬菌體頸須技術(shù)，參見Zeneca的美國專利5,302,523和5,464,765；電穿孔技術(shù)，參見BoyceThompsonInstitute的WO87/06614、Dekalb的5,472,869和5,384,253、PGS的WO9209696和WO9311335；所有這些文獻(xiàn)本文一并參考。除用以轉(zhuǎn)化植物的許多技術(shù)之外，與外源物質(zhì)(典型地是包含RNA或DNA的質(zhì)粒)接觸的組織的類型也可以變化。這樣的組織包括但不限于胚胎發(fā)生組織、愈傷組織I型和II型以及對(duì)轉(zhuǎn)化和爾后再生轉(zhuǎn)基因植物可接受的任何組織。另一個(gè)可變因素是選擇選擇性標(biāo)記。優(yōu)選的特殊標(biāo)記是專業(yè)人員可以判斷的，但是任何以下的選擇性標(biāo)記都可以與本文未列出的可以作為選擇性標(biāo)記起作用的任何其它基因一同被使用。這樣的選擇性標(biāo)記包括但不限于chlorosulfuron、潮霉素、PAT和/或bar、溴草腈、卡那霉素等。bar基因可以從鏈霉菌屬分離，特別是從吸水鏈霉菌或綠色產(chǎn)色鏈霉菌種分離。bar基因編碼phosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，該酶滅活除草劑bialaphosphosphinothricin(PPT)中的活性成分。這樣，許多技術(shù)的組合可以用于采用核酶介導(dǎo)的調(diào)節(jié)。核酶可以作為單體個(gè)別地被表達(dá)，即，針對(duì)一個(gè)位點(diǎn)的一種核酶作為一種轉(zhuǎn)錄物被表達(dá)。此外，針對(duì)一個(gè)以上靶位點(diǎn)的兩種或多種核酶作為單一RNA轉(zhuǎn)錄物的一部分被表達(dá)。包含針對(duì)一個(gè)以上切割位點(diǎn)的一種以上的核酶的單一RNA轉(zhuǎn)錄物容易產(chǎn)生以獲得基因表達(dá)的有效調(diào)節(jié)。在這些多體構(gòu)建體內(nèi)的核酶是相同的或不同的。例如，多體構(gòu)建體可以包含許多錘頭核酶或發(fā)夾核酶或其它核酶基元。此外，多體構(gòu)建體可以設(shè)計(jì)成包含許多不同的核酶基元，例如錘頭和發(fā)夾核酶。更具體地說，設(shè)計(jì)這樣的多體核酶構(gòu)建體，其中一系列核酶基元在單一RNA轉(zhuǎn)錄物中串聯(lián)在一起。核酶靠核苷酸接頭序列相互連接，其中所說的接頭序列可以也可以不互補(bǔ)于靶RNA。多體核酶構(gòu)建體(多核酶)很可能改善核酶介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的有效性。核酶的活性也可以由于第二核酶將它們從初級(jí)轉(zhuǎn)錄物釋而得到增強(qiáng)(Draper等，PCTWO93/23569，和Sullivan等，PCTWO94/02595，兩者以其整體被本文一并參考；Ohkawa，J.等，1992，NucleicAcidsSymp.Ser.，27，15-6；Taira.K.等，1991，核酸研究，19，5125-30；Ventura，M.等，1993，核酸研究，21，3249-55；Chowrira等，1994生物化學(xué)雜志.269，25856)。核酶介導(dǎo)的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)能夠在多種植物(包括被子植物、裸子植物、單子葉植物以及雙子葉植物)中實(shí)施。興趣植物包括但不限于谷類，如水稻、小麥、大麥、玉米；產(chǎn)油農(nóng)作物，如大豆、canola、向日葵、棉花、玉米、可可、紅花、油棕櫚、椰子棕櫚、亞麻、蓖麻、花生；植物園農(nóng)作物，如咖啡和茶；水果，如鳳梨、番瓜、芒果、香蕉、葡萄、桔子、蘋果；蔬菜，如花椰菜、甘藍(lán)、瓜、綠胡椒、番茄、胡蘿卜、萵苣、芹菜、土豆、椰菜；豆科植物，如大豆、菜豆、豌豆；鮮花，如康乃馨、菊花、雛菊、郁金香、絲石竹、alstromeria、金盞花、矮牽牛屬、玫瑰；樹，如橄欖、軟木樹、楊樹、松樹；堅(jiān)果，如胡桃、阿月渾子樹果等。以下是描述在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中核酶的一般用途的一些非限制例子。核酶介導(dǎo)的在咖啡因合成中所涉及的基因表達(dá)的下調(diào)節(jié)能夠用來在咖啡豆中明顯改變咖啡因濃度?；?如咖啡植物中的7-甲基黃嘌呤核苷和/或3-甲基轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)能夠用核酶容易地調(diào)節(jié)，以減少咖啡因合成(Adams和Zarowitz，美國專利5,334,529；本文一并參考)。表達(dá)針對(duì)在尼古丁產(chǎn)生中涉及的基因(如N-甲基腐胺氧化酶或腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Shewmaker等，同上))的核酶的轉(zhuǎn)基因煙草植物，將產(chǎn)生具有改變的尼古丁濃度的葉片。表達(dá)針對(duì)水果成熟中涉及的基因的核酶的轉(zhuǎn)基因植物將延遲水果(如番茄和蘋果)的成熟，所述基因如乙烯形成酶、果膠甲基轉(zhuǎn)移酶、果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶、1-氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC)合酶、ACC氧化酶基因(Smith等，1988，自然，334，724；Gray等，1992，Pl.Mol.Biol.，19，69；Tieman等，1992，植物細(xì)胞，4，667；Picton等，1993，植物雜志3，469；Shewmaker等.同上；James等，1996，生物技術(shù)，14，56)。表達(dá)針對(duì)鮮花色素沉著中涉及的基因的核酶的轉(zhuǎn)基因植物將產(chǎn)生具有改變的顏色的鮮花(如玫瑰、矮牽牛)，所說基因如查耳酮合酶(CHS)、查耳酮黃烷酮異構(gòu)酶(CHI)、苯丙氨酸氨裂合酶、或脫氫黃酮醇(DF)羥化酶、DF還原酶基因(Krolvander等，1988，自然，333，866；Krolvander等，1990，Pl.Mol.Biol.14，457；Shewmaker等，同上；Jorgensen，1996，科學(xué)，268，686)。木素是對(duì)于在植物中保持細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度必需的有機(jī)化合物。雖然是必需的，但木素有一些缺點(diǎn)。它們使青貯飼料作物難消化，并且對(duì)從木漿和其他物質(zhì)生產(chǎn)紙而言是不受歡迎的。表達(dá)針對(duì)木素產(chǎn)生中涉及的基因的核酶的轉(zhuǎn)基因植物將具有改變的木素水平，所說基因如O-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶ANADPH還原酶或肉桂酰乙醇脫氫酶(Doorsselaere等，1995，植物雜志，8，855；Atanassova等，1995，植物雜志，8，465；Shewmaker等，同上；Dwivedi等，1994，Pl.Mol.Biol.26，61)。在以下文獻(xiàn)中公開了有用的核酶的其他有用的靶Draper等，國際PCT出版物WO93/23569，Sullivan等，國際PCT出版物WO94/02595，以及Stinchcomb等，國際PCT出版物WO95/31541，這些文獻(xiàn)以其整體一并被本文參考。在植物中的顆粒結(jié)合淀粉合酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)在植物中，淀粉生物合成在葉綠體(短期淀粉存儲(chǔ))和淀粉體(長期淀粉存儲(chǔ))中發(fā)生。淀粉顆粒通常由直鏈α(1-4)連接的α-D-葡萄糖單位(直鏈淀粉)和支鏈形式的由α(1-6)鍵交聯(lián)的直鏈淀粉(支鏈淀粉)組成。在植物中的淀粉合成中涉及的酶是淀粉合酶，該酶利用ADP-葡萄糖產(chǎn)生線性鏈的α(1-4)-葡萄糖。在植物中發(fā)現(xiàn)兩種主要形式的淀粉合酶顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)和一種位于葉綠體基質(zhì)中的和淀粉形成體中的一種可溶形式(可溶性淀粉合酶)。兩種形式的這種酶利用ADP-D-葡萄糖，而顆粒結(jié)合形式也利用UDP-D-葡萄糖，前者優(yōu)先。稱作蠟質(zhì)蛋白質(zhì)的GBSS在各種已確定特征的植物中具有在55到約70kDa的分子量。在幾種植物品種中影響GBSS基因的突變?cè)鴮?dǎo)致直鏈淀粉損失，而淀粉的總量保持相對(duì)不變。除GBSS活性的損失之外，這些突變種也含有改變的、降低的水平的、或沒有GBSS蛋白質(zhì)(MacDonald和Preiss，植物生理學(xué)，78849-852(1985)，Sano，Theor.Appl.Genet.68467-473(1984)，Hovenkamp-Hermelink等Theor.Appl.Genet.75217-22191987)，Shure等，細(xì)胞35，225-233(1983)，Echt和Schwartz，遺傳學(xué)，99275-284(1981))。在GBSS突變體植物和野生型植物兩者中支鏈酶以及可溶性ADP-葡萄糖淀粉糖基轉(zhuǎn)移酶的存在表明存在形成支鏈聚合物支鏈淀粉和直鏈聚合物直鏈淀粉的彼此獨(dú)立的途徑。Wx(蠟質(zhì))基因座編碼淀粉生物合成中涉及的顆粒結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶。這種酶的表達(dá)在玉米中被限制在胚乳、花粉以及胚囊中。由于突變谷粒的外觀(谷粒中直鏈淀粉組成降低所致的表型)，在這一基因座中的突變被稱為蠟質(zhì)。在玉米中，這種酶被轉(zhuǎn)運(yùn)至發(fā)育的胚乳的淀粉體之中，在那里它催化直鏈淀粉的產(chǎn)生。玉米粒約70％是淀粉，其中27％是線性直鏈淀粉，73％是支鏈淀粉。蠟質(zhì)是在編碼顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)基因中的一種隱性突變。這種隱性突變的純合植物產(chǎn)生含有100％支鏈淀粉形式的淀粉。具有催化活性和增加的位點(diǎn)特異性(如下所述)的核酶是比反義寡核苷酸更有效的、也許更特異性的抑制分子。此外，這些核酶能夠抑制GBSS活性，并且核酶的催化活性對(duì)抑制作用是必需的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，從實(shí)施例可以明顯看出，可以設(shè)計(jì)在玉米以外的植物品種中切割GBSS活性所需的靶mRNA的其他核酶。這樣，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征是抑制直鏈淀粉產(chǎn)生(例如通過降低GBSS活性)中所涉及的核酶。這些內(nèi)源表達(dá)的RNA分子包含底物結(jié)合區(qū)，它結(jié)合靶mRNA的可及區(qū)。該RNA分子也含有催化RNA切割的區(qū)。所說的RNA分子優(yōu)選地是錘頭或發(fā)夾基元的核酶。一旦結(jié)合，核酶就切割靶mRNA，阻止翻譯與蛋白質(zhì)積累。在缺少靶基因表達(dá)的情況下，直鏈淀粉產(chǎn)生被降低或被抑制。后面提供了具體的實(shí)施例。優(yōu)選的實(shí)施方案包括具有互補(bǔ)于表IIIA、VA和VB中的結(jié)合序列的結(jié)合臂的核酶。這樣的核酶的例子在表IIIB-V中顯示。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，雖然這種例子是針對(duì)一種植物(例如玉米)的mRNA設(shè)計(jì)的，但是可以制備互補(bǔ)于其它植物品種的mRNA的類似核酶。這樣互補(bǔ)意指結(jié)合臂使核酶能夠以序列特異性方式與靶RNA相互作用，從而導(dǎo)致植物mRNA靶的切割。這樣的核酶的例子基本上由表III-V中所顯示的序列組成。優(yōu)選的實(shí)施方案是核酶和將它們用于在植物中抑制淀粉顆粒結(jié)合ADP(尿苷二磷酸)-葡萄糖α-1，4-D-葡聚糖4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(即顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS))活性的方法。這是通過用核酶抑制基因表達(dá)完成的，這種抑制導(dǎo)致在植物中降低或除去GBSS活性。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，切割靶分子并且抑制直鏈淀粉產(chǎn)生的核酶從插入到植物基因組中的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)。優(yōu)選地，能夠穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組和選擇表達(dá)核酶的轉(zhuǎn)化植物系的重組載體在植物細(xì)胞中由組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)。一旦被表達(dá)，核酶就切割它們的靶mRNA，并且使它們的宿主細(xì)胞減少產(chǎn)生直鏈淀粉。在植物細(xì)胞中所表達(dá)的核酶在組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下。玉米淀粉的修飾是核酶技術(shù)的重要應(yīng)用，它能夠減少特異性基因表達(dá)。高水平的支鏈淀粉對(duì)玉米濕磨工藝是合乎需要的，也有高支鏈淀粉玉米導(dǎo)致增加的可消化性從而增加食物的能量可利用度的某些證據(jù)。約10％的濕磨淀粉具有蠟質(zhì)表型，但是由于其隱性性質(zhì)，傳統(tǒng)的蠟質(zhì)品種很難由栽培者處理。用于切割GBSSmRNA并由此降低植物特別是玉米胚乳中GBSS活性的核酶將表現(xiàn)為顯性特性，并產(chǎn)生具有較易于為栽培者處理的蠟質(zhì)表型的玉米植物。植物中脂肪酸飽和分布的修飾植物組織中脂肪酸的生物合成起始于葉綠體。脂肪酸由脂肪酸合酶復(fù)合物(FAS)作為?；d體蛋白質(zhì)(ACP)的硫酯被合成。鏈長為16個(gè)碳原子的脂肪酸遵循以下三種途徑之一1)它們緊接在合成之后被釋放，并通過葉綠體?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)變成甘油3-磷酸(G3P)，供在葉綠體內(nèi)進(jìn)一步修飾；2)從質(zhì)體輸出后，它們被釋放并被硫酯酶轉(zhuǎn)變成輔酶A(CoA)；或3)它們進(jìn)一步延長至C18鏈長。C18鏈由硬脂酰-ACP去飽和酶在C9位迅速脫飽和，接著油酸(18∶1)基在葉綠體內(nèi)立即被轉(zhuǎn)變成G3P，或從葉綠體輸出并由硫酯酶轉(zhuǎn)變成油酰輔酶A(Somerville和Browse，1991，科學(xué)，25280-87)。C16脂肪酸的大多數(shù)遵循第三途徑。在玉米種子油中，有優(yōu)勢(shì)的甘油三酯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生。大多數(shù)油酸(18∶1)和一些棕櫚酸(16∶0)從磷脂酸轉(zhuǎn)變成G3P，然后轉(zhuǎn)變成二?；视王ズ土字Ｄ憠A。由膜結(jié)合去飽和酶產(chǎn)生的磷脂酰膽堿上的?；湹倪M(jìn)一步去飽和作用發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。然后在甘油三酯的產(chǎn)生中，二和三不飽和的鏈被釋放到?；o酶A集合中，并轉(zhuǎn)移到二酰基甘油中的甘油骨架上的C3位(Frentzen，1993植物中的脂質(zhì)代謝，p.195-230，(編者M(jìn)oore，T.S.)CRC出版社，BocaRaton，F(xiàn)A.)。植物脂肪酸的生物合成途徑的示意圖在圖11和12中顯示。在玉米種子油中有優(yōu)勢(shì)的三種脂肪酸是亞油酸(18∶2，約59％)、油酸(18∶1，約26％)以及棕櫚酸(16∶0，約11％)。這些是平均值，依據(jù)基因型的不同可以有些不同。然而，過去十年所分析的USCornBelt生產(chǎn)的油的混合樣品一直具有這種組成(Glover和Mertz，1987谷粒的營養(yǎng)質(zhì)量遺傳和農(nóng)藝學(xué)改良，p183-336，(編者Olson，R.A.和FreyK.J.)，美國農(nóng)藝學(xué)會(huì)公司，Madison，WI.；Fitch-Haumann，1985美國油料化學(xué)會(huì)雜志621524-1531；Strecker等，1990，可食用的脂肪和油加工基本原理和現(xiàn)代實(shí)踐(編者Erickson，D.R.)，美國油料化學(xué)家學(xué)會(huì)，Champaign，II)。C18鏈長的這種優(yōu)勢(shì)可以反映幾種關(guān)鍵酶的豐度和活性，如負(fù)責(zé)C18碳鏈產(chǎn)生的脂肪酸合酶、負(fù)責(zé)18∶1產(chǎn)生的硬脂酰-ACP去飽和酶(Δ9去飽和酶)和負(fù)責(zé)18∶1轉(zhuǎn)變成18∶2的微粒體Δ-12去飽和酶。植物的Δ9去飽和酶(也稱為硬脂酰-ACP去飽和酶)是一種可溶性葉綠體酶，它以與?；d體蛋白(ACP)連接的C18(偶爾也采用C16)-酰基鏈為底物(McKeon，T.A.和Stumpf，P.K.，1982生物化學(xué)雜志25712141-12147)。這與哺乳動(dòng)物、低等真核以及藍(lán)細(xì)菌Δ9去飽和酶相反。大鼠和酵母Δ9去飽和酶是膜結(jié)合微粒體酶，它以?；o酶A鏈為底物，而藍(lán)細(xì)菌Δ9去飽和酶以二?；视蜕系孽；湠榈孜?。迄今已分離了幾種來源于雙子葉植物的Δ9去飽和酶cDNA克隆并確定了特征(Shanklin和Somerville，1991美國科學(xué)院學(xué)報(bào)882510-2514；Knutzon等，1991植物生理學(xué)96344-345；Sato等，1992植物生理學(xué)99362-363；Shanklin等，1991植物生理學(xué)97467-468；Slocombe等，1992植物分子生物學(xué)20151-155；Taylor等，1992植物生理學(xué)100533-534；Thompson等，1991美國科學(xué)院學(xué)報(bào)882578-2582)。不同植物的Δ9去飽和酶序列的比較顯示它是一種高度保守的酶。在氨基酸水平(約90％)和在核苷酸水平(約80％)兩者上具有高水平的等同性。然而，如從其不同的物理和酶學(xué)特征可以預(yù)料的，在植物和其他Δ9去飽和酶之間不存在序列類似性(Shanklin和Somerville，同上)。蓖麻子去飽和酶(和其他酶)的純化和特征鑒定表明Δ9去飽和酶作為同源雙體是有活性的、亞單位分子量約為41kDa。對(duì)其體外活性，該酶需要分子氧、NADPH、NADPH鐵氧還蛋白氧化還原酶以及鐵氧還蛋白。Fox等，1993(美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，902486-2490)顯示在大腸桿菌中表達(dá)的蓖麻子酶每個(gè)同源雙體包含四個(gè)催化活性亞鐵原子。氧化的酶包含兩個(gè)相同的二鐵簇，在連二亞硫酸鹽存在下它們被還原為二亞鐵狀態(tài)。在硬脂酰輔酶A和氧的存在下，該簇又回到二鐵狀態(tài)。這說明該去飽和酶屬于含有二鐵-氧簇的氧激活蛋白質(zhì)組。這一組的其他成員是核糖核苷酸還原酶和甲烷單加氧酶羥化酶。這些催化上有差異的蛋白質(zhì)的預(yù)期一級(jí)結(jié)構(gòu)的比較顯示它們都含有被約80-100個(gè)氨基酸分開的保守的氨基酸序列(Asp/Glu)-Glu-Xaa-Arg-His對(duì)。傳統(tǒng)植物培育方式顯示可以獲得對(duì)植物沒有毒害作用的提高的硬脂酸水平。在紅花中(Ladd和Knowles，1970農(nóng)作物科學(xué)，10525-527)和在大豆中(Hammond和Fehr，1984美國油料化學(xué)學(xué)會(huì)雜志611713-1716；Graef等，1985農(nóng)作物科學(xué)251076-1079)硬脂酸水平已明顯地增加。這說明在種子油的脂肪酸組成上的可變性。通過用酵母(Polashock等，1992植物生理學(xué)100，894)或大鼠(Grayburn等，1992生物技術(shù)，10，675)的Δ9去飽和酶基因轉(zhuǎn)化煙草已獲得Δ9去飽和酶活性的增加。兩組轉(zhuǎn)基因植物在脂肪酸組成上都有明顯的改變，然而表型上與對(duì)照植物相同。玉米很少用于產(chǎn)生人造黃油產(chǎn)品，因?yàn)樵趥鹘y(tǒng)上它不被用作油料作物，并且與大豆和canola比較具有較低的種子油含量。然而，玉米油具有低水平的亞麻酸(18∶3)和較高水平的棕櫚酸(16∶0)(在人造黃油中是合乎需要的)。申請(qǐng)人相信通過下調(diào)Δ9去飽和酶活性降低油酸和亞油酸水平將使玉米在飽和油市場(chǎng)有效地替換大豆和canola。人造黃油和糖食脂肪由植物(如大豆)油的化學(xué)氫化產(chǎn)生。這一過程增加了生產(chǎn)人造黃油的成本，并且也造成脂肪酸的順式和反式異構(gòu)體兩者。反式異構(gòu)體在植物產(chǎn)生的油中不是天然存在的，它增加潛在的健康危害上的擔(dān)心。申請(qǐng)人相信一種消除對(duì)化學(xué)氫化的需要的方法是對(duì)植物進(jìn)行遺傳工程操作，以下調(diào)去飽和酶。Δ9去飽和酶將第一雙鍵引入到18碳脂肪酸中，并且是實(shí)現(xiàn)脂肪酸脫飽和程度的關(guān)鍵性步驟。這樣，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在植物中改變脂肪酸組成的組合物(及其使用方法)。這是通過用核酶、反義核酸、共抑制或三螺旋DNA抑制基因表達(dá)導(dǎo)致在植物中降低或消除某些酶(例如Δ9去飽和酶)的活性而完成的。這種活性在單子葉植物(如玉米、小麥、水稻、棕櫚、椰子等)中降低。Δ9去飽和酶活性也可以在雙子葉植物(如向日葵、紅花、棉花、花生、橄欖、芝麻、萼距花屬、亞麻、希蒙得木屬、葡萄等)中降低。這樣，在一方面，本發(fā)明的特征是抑制脂肪酸脫飽和(例如通過降低Δ9去飽和酶活性)中所涉及的核酶。這些內(nèi)源表達(dá)的RNA分子包含底物結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)結(jié)合靶mRNA的可及區(qū)。該RNA分子也含有催化RNA切割的區(qū)。所說的RNA分子優(yōu)選地是錘頭或發(fā)夾基元的核酶。一旦結(jié)合，核酶就切割靶mRNA，阻止翻譯與蛋白質(zhì)積累。在缺少靶基因表達(dá)的情況下，硬脂酸水平增加，不飽和脂肪酸的產(chǎn)生被降低或被抑制。特定的例子在以下所列的表中給出。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酶具有互補(bǔ)于表VI和VIII中的序列的結(jié)合臂。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，雖然這種例子是針對(duì)一種植物(例如玉米)的mRNA設(shè)計(jì)的，但是可以制備互補(bǔ)于其它植物的mRNA的類似核酶。這樣，互補(bǔ)意指結(jié)合臂使核酶能夠以序列特異性方式與靶RNA相互作用，從而導(dǎo)致植物mRNA靶的切割。這樣的核酶的例子典型地是表VII和表V中限定的序列?；钚院嗣傅湫偷匕韧诶又械哪切┟复僦行囊约澳軌蚪Y(jié)合植物mRNA(以便切割在靶位點(diǎn)上發(fā)生)的結(jié)合臂。不干擾這樣的結(jié)合和/或切割的其它序列可以存在。在這一研究中特別有用的核酶序列在表VII和VIII中顯示。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在所述表中所列的核酶序列僅僅是許多這類序列的代表，其中核酶的酶促部分(除結(jié)合臂外的所有部分)被改變(以影響活性)。例如列于表IV中的錘頭核酶的莖環(huán)II序列(5’-GGCGAAAGCC-3’)可被改變(取代、缺失和/或插入)，以含有任何序列，優(yōu)選地是只要最小的兩個(gè)堿基配對(duì)的莖結(jié)構(gòu)可以形成。類似地，列于表V和VIII中的發(fā)夾核酶的莖環(huán)IV序列(5’-CACGUUGUG-3’)可被改變(取代、缺失和/或插入)，以含有任何序列，優(yōu)選地只要最小的兩個(gè)堿基配對(duì)的莖結(jié)構(gòu)可以形成。這些核酶等價(jià)于在所述表中具體描述的核酶。在本發(fā)明的另一方面，在植物中切割靶分子并且減少不飽和脂肪酸含量的核酶從插入到植物基因組中的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)。優(yōu)選地，能夠穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組和選擇表達(dá)核酶的轉(zhuǎn)化植物系的重組載體在植物細(xì)胞中由組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)。一旦被表達(dá)，核酶就切割它們的靶mRNA，并且使它們的宿主細(xì)胞減少產(chǎn)生不飽和脂肪酸。在植物細(xì)胞中表達(dá)的核酶在組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下。脂肪酸組成的改變是能夠降低特異性基因表達(dá)的基于核酸的技術(shù)的重要應(yīng)用。在產(chǎn)生商業(yè)上重要的油的植物中高水平的飽和脂肪酸是合乎需要的。在一個(gè)有關(guān)的方面，本發(fā)明的特征是分離玉米中編碼Δ9去飽和酶的cDNA序列的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，也描述了切割Δ9去飽和酶mRNA的發(fā)夾和錘頭核酶。從以下描述的例子本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解到，現(xiàn)在易于設(shè)計(jì)切割Δ9去飽和酶活性所需的靶mRNA的其他核酶，這些核酶在本發(fā)明的范圍內(nèi)。雖然提供了玉米R(shí)NA的具體例子，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這些教導(dǎo)不限于玉米。此外，相同的靶可以用于其他植物品種中。適于導(dǎo)向特定植物RNA序列的互補(bǔ)臂可以用于針對(duì)那種特定RNA的核酶中。本文的實(shí)施例和說明無意限制本發(fā)明，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到可以在多種不同的植物上很容易產(chǎn)生相似的實(shí)施方案，以便使用本文的描述調(diào)節(jié)各種不同植物基因的表達(dá)，并且這些內(nèi)容在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文的實(shí)施例遵循了標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。其它的信息見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，其內(nèi)容本文一并參考。實(shí)施例實(shí)施例1玉米的Δ9去飽和酶cDNA的分離針對(duì)兩個(gè)與植物Δ9去飽和酶的二鐵-氧基團(tuán)的結(jié)合有關(guān)的保守肽設(shè)計(jì)并合成簡并PCR引物。由玉米胚cDNAPCR擴(kuò)增一個(gè)276bpDNA片段，并將其克隆到載體中。此片段推測(cè)的氨基酸序列與由雙子葉植物Δ9去飽和酶蛋白的兩個(gè)保守肽分離的區(qū)的序列相似。這一片段用來篩選玉米胚cDNA文庫?？偣卜蛛x了16個(gè)克隆。進(jìn)一步的限制圖譜測(cè)定和雜交鑒定了一個(gè)克隆，對(duì)這個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序。cDNA插入片段的特性為1621ntcDNA、145nt5′和294nt3′非翻譯區(qū)(包含18nt聚A尾)；編碼44.7kD多肽的394氨基酸開放讀框；與編碼推斷的成熟蛋白質(zhì)的蓖麻子Δ-9去飽和酶基因具有85％氨基酸等同性。圖10列出了其全部序列。實(shí)施例2鑒定Δ9去飽和酶的潛在核酶切割位點(diǎn)在玉米Δ9去飽和酶mRNA中鑒定了大約250個(gè)HH核酶位點(diǎn)和大約43個(gè)HP位點(diǎn)。HH位點(diǎn)由尿苷和任何核苷酸(鳥苷(UH)除外)組成。表VI和VIII列出了HH和HP核酶切割位點(diǎn)。編號(hào)系統(tǒng)在具有圖10所示序列的Δ-9去飽和酶cDNA克隆的5′端由1開始?？梢院苋菀椎卦O(shè)計(jì)和合成核酶(如表VII和VIII中所列出的那些)，以針對(duì)以5-100或更多個(gè)堿基作為底物結(jié)合臂的切割位點(diǎn)(參見圖1-5)。在核酶中這些底物結(jié)合臂使得核酶可以與它們的靶以序列特異性方式相互作用。實(shí)施例3Δ9去飽和酶核酶切割位點(diǎn)的選擇使用算法(如M.Zuker(Zuker.M.，1989科學(xué)，244，48-52))通過計(jì)算機(jī)分析評(píng)定Δ9去飽和酶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。鑒定了不形成帶有8個(gè)以上核苷酸的RNA/RNA莖區(qū)的二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)并含有潛在的錘頭核酶切割位點(diǎn)的mRNA區(qū)。通過RNA酶H測(cè)定分析了這些位點(diǎn)的寡核苷酸可及性(參見下面的實(shí)施例4)。實(shí)施例4Δ9去飽和酶的RNA酶H測(cè)定把49個(gè)DNA寡核苷酸(每個(gè)長21個(gè)核苷酸)用于RNA酶H測(cè)定中。這些寡核苷酸覆蓋了Δ9去飽和酶RNA內(nèi)的108個(gè)位點(diǎn)。利用全長的Δ9去飽和酶cDNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行RNA酶H測(cè)定(圖6)。通過上文的Draper一般描述的方法篩選RNA的可及切割位點(diǎn)。簡言之，合成了代表核酶切割位點(diǎn)的DNA寡核苷酸。使用聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生用于從玉米cDNA克隆中產(chǎn)生T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的底物。在體外由這些模板合成標(biāo)記的RNA轉(zhuǎn)錄物。將寡核苷酸和標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物退火，加入RNA酶H，并將混合物在37℃下溫育10分鐘。終止反應(yīng)并且在測(cè)序聚丙烯酰胺凝膠上分離RNA。通過放射自顯影定量方法使用MolecularDynamics磷光體成像系統(tǒng)測(cè)定切割的底物的百分含量(圖13和圖14)。實(shí)施例5用于Δ9去飽和酶的錘頭和發(fā)夾核酶設(shè)計(jì)錘頭(HH)和發(fā)夾(HP)核酶，使之針對(duì)在RNA酶H測(cè)定中被最充分切割的寡核苷酸所覆蓋的位點(diǎn)，然后通過計(jì)算機(jī)折疊算法分析這些核酶，并且淘汰具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酶。通過化學(xué)方法合成了核酶。以前曾有人描述了RNA合成的一般過程(Usman等，1987，美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，109，7845-7854和Scaringe等，1990，核酸研究，18，5433-5341；Wincott等1995，核酸研究，23，2677)，在394型合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上使用改進(jìn)的2.5μmol規(guī)模方案(具有5分鐘的用于甲硅烷基保護(hù)的核苷酸的偶合步驟和2分鐘的用于2′-O-甲基化核苷酸的偶合步驟)進(jìn)行了小規(guī)模的合成。表II概述了用于合成循環(huán)的試劑的數(shù)量和接觸時(shí)間。在每一個(gè)偶合循環(huán)中使用了相對(duì)于結(jié)合多聚體的5′羥基6.5倍過量(0.1M，163μl＝16.3μmol)的磷酰胺和24倍過量(0.25M，238μl＝59.5μmol)的S-乙基四唑。通過三苯甲基組分比色定量分析方法測(cè)定，394型合成儀上的平均偶聯(lián)產(chǎn)率為97.5-99％。其它的用于394的寡核苷酸合成試劑脫三苯甲基溶液是溶解在二氯甲烷(ABI)中的2％三氯乙酸；使用溶解在THF(ABI)中的16％N-甲基咪唑和溶解在THF(ABI)中的10％醋酸酐/10％2，6-盧剔啶封端；氧化溶液是溶解在THF(Millipore)中的16.9mMI2、49mM吡啶、9％水。直接使用試劑瓶中B和J合成級(jí)乙腈。使用從美國國際化學(xué)藥品公司得到的固體藥品配制S-乙基四唑溶液(0.25M乙腈溶液)。按照如下的方法進(jìn)行RNA的脫保護(hù)。把結(jié)合多聚體的寡核糖核苷酸(無三苯甲基)從合成柱轉(zhuǎn)移到4mL的螺旋塞玻璃瓶中，并在65℃下于甲胺(MA)溶液中懸浮10分鐘。冷卻至-20℃后，從多聚體載體中除去上清液。把載體用1.0mlEtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗滌三次，渦旋攪拌后再把上清液加到第一份上清液中。把含有寡核糖核苷酸的結(jié)合上清液干燥成白色粉末。把堿基脫保護(hù)的寡核糖核苷酸重新懸浮在無水的TEA·HF/NMP溶液(250μl的1.5mLN-甲基吡咯烷酮溶液、750μl的TEA和1.0mLTEA·3HF(提供1.4MHF濃度))中，并且加熱到65℃保持1.5小時(shí)。在陰離子交換脫鹽之前用50mMTEAB(9ml)處理生成的全部脫保護(hù)的寡聚物。在脫保護(hù)寡聚物的陰離子交換脫鹽中，將TEAB溶液裝載到預(yù)先用50mMTEAB(10ml)洗滌的Qiagen500陰離子交換柱體(Qiagen公司)上。在用50mMTEAB(10ml)洗滌裝載的柱體后，用2MTEAB(10ml)洗脫RNA，并將其干燥成白色粉末。通過用U取代G5和U取代A14(編號(hào)源于Hertel，K.J.等(1992，核酸研究20，3252))合成無活性的錘頭核酶。如上述對(duì)錘頭RNA描述的方法合成發(fā)夾核酶。利用噬菌體T7RNA聚合酶由DNA模板也合成了核酶(Milligan和Uhlenbeck，1989，酶學(xué)方法180，51)。使用普通的方法通過凝膠電泳純化核酶或者通過高壓液相層析法(HPLC；參見上文的Wincott等，1996，其全文本文一并參考)純化核酶，并且將核酶重新懸浮在水中。在下面的表VII和VIII中顯示了用于此研究的化學(xué)方法合成的核酶的序列。實(shí)施例6Δ9去飽和酶核酶的長底物測(cè)試用于本研究的靶RNA長1621nt，并且含有針對(duì)Δ9去飽和酶RNA的所有HH和HP核酶的切割位點(diǎn)。含有Δ9去飽和酶靶序列的T7RNA聚合酶啟動(dòng)子上游的模板由cDNA克隆通過PCR擴(kuò)增。使用T7RNA聚合酶從此PCR擴(kuò)增模板轉(zhuǎn)錄靶RNA。在轉(zhuǎn)錄過程中通過加入[α-32P]CTP作為4種三磷酸核糖核苷酸之一將轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)記。在37℃下轉(zhuǎn)錄2小時(shí)后，用DNA酶-I處理轉(zhuǎn)錄混合物以便消化用于轉(zhuǎn)錄的DNA模板。把轉(zhuǎn)錄混合物在變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。在凝膠片中分離出對(duì)應(yīng)于全長RNA的帶，并且用異丙醇沉淀出RNA，把沉淀物儲(chǔ)存在4℃。在核酶過量(kcat/KM)的條件下進(jìn)行核酶切割反應(yīng)(Herschlag和Cech，1990，生物化學(xué)29，10159-10171)。簡言之，在50mMTris-HCl(pH7.5)和10mMMgCl2存在下，通過加熱至65℃并保持2分鐘分別將1mM核酶和＜10nM的內(nèi)部標(biāo)記的靶RNA變性。通過冷卻到反應(yīng)溫度(37℃、26℃或20℃)10-20分鐘將RNA復(fù)性。在合適的反應(yīng)溫度下通過把核酶與靶RNA混合開始切割反應(yīng)。在一定的時(shí)間間隔內(nèi)取出等分試樣，并且通過加入等體積的停止緩沖液使反應(yīng)停止。將樣品在4％的測(cè)序凝膠上分離。表IX、圖15和16中總結(jié)了在26℃或20℃下的核酶切割反應(yīng)結(jié)果。在所有測(cè)試的核酶中，7個(gè)錘頭和2個(gè)發(fā)夾表現(xiàn)出Δ9去飽和酶RNA的明顯切割(圖15和16)。核酶對(duì)其它位點(diǎn)表現(xiàn)出變化的活性水平。實(shí)施例7用Δ9去飽和酶的多核酶組合切割靶RNA把上述的幾種核酶結(jié)合成一個(gè)含有兩個(gè)或更多的嵌入到鄰接的互補(bǔ)RNA區(qū)段中的核酶的多聚體核酶構(gòu)建體。圖17、18、19和23顯示了多聚體核酶的非限制性例子。通過將互補(bǔ)寡核苷酸退火并克隆到含有花椰菜花葉病毒35S增強(qiáng)啟動(dòng)子(Franck等，1985細(xì)胞21，285)、玉米Adh1內(nèi)含子(Dennis等，1984，核酸研究12，3983)、Nos多腺苷酸化信號(hào)(DePicker等，1982分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志1，561)的表達(dá)載體中而產(chǎn)生所說的核酶。在圖20和21中顯示了用從這些含有多聚體的轉(zhuǎn)錄單元得到的T7轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行的切割分析。實(shí)施例8表達(dá)核酶的Δ9去飽和酶轉(zhuǎn)錄單元的構(gòu)建用來切割Δ9去飽和酶mRNA的核酶在植物體中內(nèi)源表達(dá)?；蛘哂刹迦氲街参锘蚪M上的基因來表達(dá)(穩(wěn)定轉(zhuǎn)化)，或者由屬于質(zhì)粒載體或病毒序列一部分的游離基因轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)(瞬時(shí)表達(dá))。這些核酶可以通過RNA聚合酶I、II或III、植物或植物病毒啟動(dòng)子(如CaMV)表達(dá)。啟動(dòng)子或者是組成型的、組織特異性的，或者是發(fā)育過程中表達(dá)的。Δ9259單體核酶構(gòu)建體(RPA114,115)這些是Δ9去飽和酶259單體錘頭核酶克隆。設(shè)計(jì)這些核酶，使之具有3bp長的莖干II區(qū)和20bp(全部)長的針對(duì)位點(diǎn)259的底物結(jié)合臂?；钚孕问绞荝PA114，無活性的形式是RPA115。用NotI消化親本質(zhì)粒pDAB367，并用Klenow補(bǔ)平以便產(chǎn)生平端受體位點(diǎn)。然后用HindIII限制酶消化此載體。用EcoRI切割含有核酶的質(zhì)粒，用Klenow補(bǔ)平此質(zhì)粒并且用HindIII重新切割。用凝膠純化含有整個(gè)核酶轉(zhuǎn)錄單元的插入片段，并且將它連接到pDAB367載體中。通過用SgfI/HindIII和XbaI/SstI消化來檢查此構(gòu)建體，并且通過測(cè)序加以確認(rèn)。Δ9453多聚體核酶構(gòu)建體(RPA118,119)這些是Δ9去飽和酶453多聚體錘頭核酶克隆(參見圖17)。設(shè)計(jì)這些核酶，使之具有3bp長的莖干II區(qū)。多聚體構(gòu)建體的底物結(jié)合臂的全長是42bp?；钚孕问绞荝PA118，無活性的形式是RPA119。按照上述259單體的方法產(chǎn)生構(gòu)建體。設(shè)計(jì)了多聚體構(gòu)建體，使之具有針對(duì)Δ9去飽和酶RNA中的位點(diǎn)453、464、475、484的4個(gè)錘頭核酶。Δ9252多聚體核酶構(gòu)建體(RPA85,113)這些是位于bar(phosphoinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶，Thompson等，1987EMBOJ.62519-2523)開放讀框的3′端的Δ9去飽和酶252多聚體核酶克隆。設(shè)計(jì)這些多聚體構(gòu)建體，使之具有3bp長的莖干II區(qū)。多聚體構(gòu)建體的底物結(jié)合臂的全長是91bp?；钚院嗣甘荝PA85，RPA113是無活性的。按照如下的方法構(gòu)建載體用BglII部分地消化親本質(zhì)粒pDAB367，并用凝膠純化單切割質(zhì)粒。用EcoRI重新切割此質(zhì)粒，并且重新用凝膠純化以分離出正確的BglII/EcoRI切割片段。從核酶構(gòu)建體中用凝膠分離出BamHI/EcoRI插入片段(含有核酶和NOS多聚A區(qū))，并且連接到367載體中。通過NcoI/SstI消化和測(cè)序鑒定陽性質(zhì)粒。通過標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定能夠鑒定出有用的轉(zhuǎn)基因植物?？梢酝ㄟ^下面的實(shí)施例中討論的方法來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物Δ9去飽和酶表達(dá)和Δ9去飽和酶活性的減少。實(shí)施例9GBSSRNA中潛在的核酶切割位點(diǎn)的鑒定鑒定了在玉米GBSSmRNA多肽編碼區(qū)中的241個(gè)錘頭核酶位點(diǎn)(參見表IIIA)。一個(gè)錘頭核酶位點(diǎn)由尿苷與任何核苷酸(鳥嘌呤(UH)除外)組成。以下是玉米的GBSS編碼區(qū)的序列(SEQ.I.D.No25)。編號(hào)系統(tǒng)開始于具有以下序列(5′-3′)的GBSScDNA克隆的5′端的1位GACCGATCGATCGCCACAGCCAACACCACCCGCCGAGGCGACGCGACAGCCGCCAGGAGGAAGGAATAAACT73144CACTGCCAGCCAGTGAAGGGGGAGAAGTGTACTGCTCCGTCCACCAGTGCGCGCACCGCCCGGCAGGGCTGC145216TCATCTCGTCGACGACCAGTGGATTAATCGGCATGGCGGCTCTAGCCACGTCGCAGCTCGTCGCAACGCGCG217288CCGGCCTGGGCGTCCCGGACGCGTCCACGTTCCGCCGCGGCGCCGCGCAGGGCCTGAGGGGGGGCCGGACGG289360CGTCGGCGGCGGACACGCTCAGCATTCGGACCAGCGCGCGCGCGGCGCCCAGGCTCCAGCACCAGCAGCAGC361432AGCAGGCGCGCCGCGGGGCCAGGTTCCCGTCGCTCGTCGTGTGCGCCAGCGCCGGCATGAACGTCGTCTTCG433504TCGGCGCCGAGATGGCGCCGTGGAGCAAGACCGGCGGCCTCGGCGACGTCCTCGGCGGCCTGCCGCCGGCCA505576TGGCCGCGAATGGGCACCGTGTCATGGTCGTCTCTCCCCGCTACGACCAGTACAAGGACGCCTGGGACACCA577648GCGTCGTGTCCGAGATCAAGATGGGAGACAGGTACGAGACGGTCAGGTTCTTCCACTGCTACAAGCGCGGAG649720TGGACCGCGTGTTCGTTGACCACCCACTGTTCCTGGAGAGGGTTTGGGGAAAGACCGAGGAGAAGATCTACG721792GGCCTGACGCTGGAACGGACTACAGGGACAACCAGCTGCGGTTCAGCCTGCTATGCCAGGCAGCACTTGAAG793864CTCCAAGGATCCTGAGCCTCAACAACAACCCATACTTCTCCGGACCATACGGGGAGGACGTCGTGTTCGTCT865936GCAACGACTGGCACACCGGCCCTCTCTCGTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTCCCACGGCATCTACAGGG9371008ACGCAAAGACCGCTTTCTGCATCCACAACATCTCCTACCAGGGCCGGTTCGCCTTCTCCGACTACCCGGAGC10091080TGAACCTCCCGGAGAGATTCAAGTCGTCCTTCGATTTCATCGACGGCTACGAGAAGCCCGTGGAAGGCCGGA10811152AGATCAACTGGATGAAGGCCGGGATCCTCGAGGCCGACAGGGTCCTCACCGTCAGCCCCTACTACGCCGAGG11531224AGCTCATCTCCGGCATCGCCAGGGGCTGCGAGCTCGACAACATCATGCGCCTCACCGGCATCACCGGCATCG12251296TCAACGGCATGGACGTCAGCGAGTGGGACCCCAGCAGGGACAAGTACATCGCCGTGAAGTACGACGTGTCGA12971368CGGCCGTGGAGGCCAAGGCGCTGAACAAGGAGGCGCTGCAGGCGGAGGTCGGGCTCCCGGTGGACCGGAACA13691440TCCCGCTGGTGGCGTTCATCGGCAGGCTGGAAGAGCAGAAGGGACCCGACGTCATGGCGGCCGCCATCCCGC14411512AGCTCATGGAGATGGTGGAGGACGTGCAGATCGTTCTGCTGGGCACGGGCAAGAAGAAGTTCGAGCGCATGC15131584TCATGAGCGCCGAGGAGAAGTTCCCAGGCAAGGTGCGCGCCGTGGTCAAGTTCAACGCGGCGCTGGCGCACC15851656ACATCATGGCCGGCGCCGACGTGCTCGCCGTCACCAGCCGCTTCGAGCCCTGCGGCCTCATCCAGCTGCAGG16571728GGATGCGATACGGAACGCCCTGCGCCTGCGCGTCCACCGGTGGACTCGTCGACACCATCATCGAAGGCAAGA17291800CCGGGTTCCACATGGGCCGCCTCAGCGTCGACTGCAACGTCGTGGAGCCGGCGGACGTCAAGAAGGTGGCCA18011872CCACCTTGCAGCGCGCCATCAAGGTGGTCGGCACGCCGGCGTACGAGGAGATGGTGAGGAACTGCATGATCC18731944AGGATCTCTCCTGGAAGGGCCCTGCCAAGAACTGGGAGAACGTGCTGCTCAGCCTCGGGGTCGCCGGCGGCG19452016AGCCAGGGGTCGAAGGGGAGGAGATCGCGCCGCTCGCCAAGGAGAACGTGGCCGCGCCCTGAAGAGTTCGGC20172088CTGCAGGCCGCCTGATCTCGCGGGTGGTGCAAACATGTTGGGACATCTTCTTATATATGCTGTTTCGTTTAT20892160GTGATATGGACAAGTATGTGTAGCTGCTTGCTTGTGCTAGTGTAATATAGTGTAGTGGTGGCCAGTGGCACA21612232ACCTAATAAGCGCATGAACTAATTGCTTGCGTGTGTAGTTAAGTACCGATCGGTAATTTTATATTGCGAGTA2233AATAAATGGACCTGTAGTGGTGGAAAAAAAAAAAA(SEQI.D.NO.25).在GBSSmRNA中大約有53個(gè)潛在的發(fā)夾核酶位點(diǎn)。在表V中列出了核酶和靶序列。按照以上所述，針對(duì)這些位點(diǎn)很容易設(shè)計(jì)和合成核酶，以5至100個(gè)或者更多堿基作為底物結(jié)合臂(參見圖1-5)。實(shí)施例10GBSS核酶切割位點(diǎn)的選擇通過計(jì)算機(jī)分析利用折疊算法(如M.Zuker發(fā)展的算法(Zuker，M.，1989科學(xué)，244，48-52)評(píng)估了GBSSmRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。鑒定了不形成具有超過8個(gè)核苷酸的RNA/RNA莖干的二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)且含有潛在的錘頭核酶切割位點(diǎn)的mRNA區(qū)。然后利用RNA酶H測(cè)定方法評(píng)估了這些位點(diǎn)的寡核苷酸可及性(參見圖6)。在這些測(cè)定分析中使用了58個(gè)DNA寡核苷酸(每個(gè)長21個(gè)核苷酸)。這些寡核苷酸覆蓋了85個(gè)位點(diǎn)。這些寡核苷酸的位置和命名是195、205、240、307、390、424、472、481、539、592、625、636、678、725、741、811、859、891、897、912、918、928、951、958、969、993、999、1015、1027、1032、1056、1084、1105、1156、1168、1186、1195、1204、1213、1222、1240、1269、1284、1293、1345、1351、1420、1471、1533、1563、1714、1750、1786、1806、1819、1921、1954、和1978。也覆蓋并包括了二級(jí)位點(diǎn)，為202、394、384、385、484、624、627、628、679、862、901、930、950、952、967、990、991、1026、1035、1108、1159、1225、1273、1534、1564、1558、和1717。實(shí)施例11GBSS的RNA酶H測(cè)定使用GBSS編碼區(qū)、3′非編碼區(qū)和部分5′非編碼區(qū)的全長轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行RNA酶H測(cè)定(圖7)。通過上文Draper等描述的一般方法(本文一并參考)篩選了GBSSRNA可及切割位點(diǎn)。簡言之，合成了代表錘頭核酶切割位點(diǎn)的DNA寡核苷酸。使用聚合酶鏈反應(yīng)從玉米cDNA克隆產(chǎn)生T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄底物。由這些模板在體外合成標(biāo)記的RNA轉(zhuǎn)錄物。將寡核苷酸和標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物退火，加入RNA酶H并且在37℃下將混合物溫育10分鐘。終止反應(yīng)并且在在測(cè)序聚丙烯酰胺凝膠上分離RNA。通過放射自顯影定量分析方法使用磷光體成像系統(tǒng)測(cè)定了切割的底物的百分比(圖7)。實(shí)施例12GBSS的錘頭核酶設(shè)計(jì)了針對(duì)在RNA酶H測(cè)定中最充分切割的寡核苷酸所覆蓋的位點(diǎn)的具有10/10(即在核酶的每個(gè)臂上能夠形成10個(gè)堿基對(duì))核苷酸結(jié)合臂的錘頭核酶。然后通過計(jì)算機(jī)折疊算法分析這些核酶，并且淘汰具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酶。篩選過程的結(jié)果是設(shè)計(jì)了針對(duì)GBSSmRNA中最開放區(qū)域的23個(gè)核酶，表IV中顯示了這些核酶的序列。使用化學(xué)方法合成核酶。使用的合成方法采用上述(Usman等，上文；Scaringe等；Wincott等，上文，本文一并參考)的標(biāo)準(zhǔn)RNA合成方法，并且使用了普通的核酸保護(hù)和偶聯(lián)基團(tuán)(如5′端的二甲氧基三甲苯基和3′端的磷酰胺)。平均的分步偶聯(lián)產(chǎn)率＞98％。通過用U取代G5和U取代A14(編號(hào)源于上文所述的Hertel等)合成無活性的核酶。分兩部分合成了發(fā)夾核酶，并且退火以重新構(gòu)建活性的核酶(Chowira和Burke，1992，核酸研究，20，2835-)。通過用2′-O-甲基基團(tuán)修飾5′末端和3′末端的5個(gè)核糖核苷酸改進(jìn)了所有核酶以增加穩(wěn)定性。使用普通的方法通過凝膠電泳(Ausubel等，1990分子生物學(xué)目前的方案Wiley&amp;Sons，NY)純化核酶，或者通過以上所述的高壓液相層析法純化核酶，并且將核酶重懸浮在水中。實(shí)施例13GBSS的長底物測(cè)試用于本研究的靶RNA長900nt，并且包含針對(duì)GBSSRNA的全部23個(gè)HH核酶的切割位點(diǎn)。由cDNA克隆通過PCR擴(kuò)增含有GBSS靶序列上游的T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的模板。使用T7RNA聚合酶由PCR擴(kuò)增的模板轉(zhuǎn)錄靶RNA。在轉(zhuǎn)錄過程中通過加入[c-32P]CTP作為4種三磷酸核糖核苷酸之一將轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)記。在37℃下轉(zhuǎn)錄2小時(shí)后，用DNA酶-1處理轉(zhuǎn)錄混合物以消化用于轉(zhuǎn)錄的DNA模板。把轉(zhuǎn)錄混合物在變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。在凝膠切片中分離出對(duì)應(yīng)于全長RNA的帶，并且用異丙醇沉淀出RNA，把沉淀物儲(chǔ)存在4℃的條件下。在核酶過量(kcat/KM)條件下進(jìn)行核酶切割反應(yīng)(上述的Herschlag和Cech)。簡言之，在50mMTris-HCl(pH7.5)和10mMMgCl2存在下通過加熱至90℃并保持2分鐘分別將1000nM核酶和＜10nM的內(nèi)部標(biāo)記的靶RNA變性。通過冷卻到反應(yīng)溫度(37℃、26℃和20℃)并持續(xù)10-20分鐘將RNA復(fù)性。在合適的反應(yīng)溫度下通過把核酶與靶RNA混合開始切割反應(yīng)。在一定的時(shí)間間隔內(nèi)取出等分試樣，并且通過加入等體積的停止緩沖液使反應(yīng)停止。將樣品在4％的測(cè)序凝膠上分離。圖8總結(jié)了在三種不同溫度下的核酶切割反應(yīng)結(jié)果。選出7個(gè)領(lǐng)頭(lead)核酶(425、892、919、959、968、1241和1787)?；钚院嗣钢?811)產(chǎn)生了異常的切割產(chǎn)物模式，結(jié)果它沒有被選為一種領(lǐng)頭核酶。實(shí)施例14使用多核酶組合切割GBSSRNA將四個(gè)領(lǐng)頭核酶(892、919、959、1241)在下列組合中與內(nèi)部標(biāo)記的靶RNA一起溫育892、892+919、892+919+959、892+919+959+1241。RNA切割份額以加性方式隨著切割反應(yīng)中所用核酶的數(shù)量增加而增加(圖9)。核酶切割反應(yīng)如上所述在20℃下進(jìn)行。這些數(shù)據(jù)表明定靶到同一mRNA上不同位點(diǎn)的多核酶以加性方式加劇靶RNA的減少。實(shí)施例15構(gòu)建表達(dá)核酶的GBSS轉(zhuǎn)錄單元克隆GBSS多聚體核酶RPA63(活性)和RPA64(無活性)構(gòu)建含有GBSSmRNA的四個(gè)錘頭核酶靶位點(diǎn)892、919、959和968的多聚體核酶。購買兩個(gè)有18個(gè)核苷酸重疊的DNA寡核苷酸(MacromolecularResourses，F(xiàn)ortCollins，CO)。序列如下寡核苷酸1CGCGGATCCTGGTAGGACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAATGTTGTGCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAATGCAGAAAGCGGTCTTTGCGTCCCTGTAGATGCCGTGGC寡核苷酸2CGCGAGCTCGGCCCTCTCTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGGTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGCCACGGCATCTACAGGG通過在每一種酶基元的催化中心用T取代G5和T取代A14得到上述無活性的核酶。90℃下將這些酶在1XKlenow緩沖液(Gibco/BRL)中退火5分鐘，然后慢慢冷卻到室溫(22℃)。加入NTP至濃度為0.2mM，37℃下用Klenow酶以1單位/μl將寡核苷酸延伸1小時(shí)。用苯酚/三氯甲烷提取，乙醇沉淀，然后在1XReact3緩沖液(Gibco/BRL)中重懸浮，37℃下用BamHI和SstI消化1小時(shí)。使用Qiagen凝膠提取試劑盒在2％瓊脂糖凝膠上將所說的DNA進(jìn)行凝膠純化。將DNA片段連接到BamHI/SstI消化的pDAB353中。用此連接物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5αF′細(xì)菌(Gibco/BRL)中。通過用BamHI/EcoRI消化篩選潛在的克隆。通過測(cè)序確認(rèn)這些克隆。與靶序列同源的總長度為96個(gè)核苷酸。919單體核酶(RPA66)如下所述使用10/10臂構(gòu)建針對(duì)GBSSmRNA的919位點(diǎn)的單核酶。購買下列兩個(gè)DNA寡核苷酸寡核苷酸1GATCCGATGCCGTGGCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTGGTAGTT寡核苷酸2AACTACCAGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGCCACGGCATCG將這兩個(gè)寡核苷酸在1X激酶緩沖液(Gibco/BRL)中分別進(jìn)行磷酸化，熱變性，90℃下混合10分鐘使之退火，然后慢慢冷卻到室溫(22℃)。通過用SstI消化pDAB353并用T4DNA聚合酶將末端補(bǔ)齊而制備載體。將此載體用BamHI再消化，并如上所述進(jìn)行凝膠純化。16℃下在1X連接緩沖液(Gibco/BRL)中將退火的寡核苷酸過夜連接到載體中。使用BamHI/EcoRI消化潛在的克隆，并通過測(cè)序確認(rèn)。實(shí)施例16用于Δ9核酶實(shí)驗(yàn)的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDAB367和用于GBSS核酶實(shí)驗(yàn)的pDAB353部分ApDAB367質(zhì)粒pDAB367具有以下的DNA結(jié)構(gòu)以位于pUC19(441堿基，參考文獻(xiàn)1)的SphI位點(diǎn)的最后一個(gè)C殘基后的堿基開始，并在與LacZ基因編碼鏈鄰近的鏈上閱讀，接頭序列CTGCAGGCCGGCCTTAATTAAGCGGCCGCGTTTAAACGCCCGGGCATTTAAATGGCGCGCCGCGATCGCTTGCAGATCTGCATGGGTG，CaMVDNA的7093-7344核苷酸(2)，接頭序列CATCGATG，CaMV的7093-7439核苷酸，接頭序列GGGGACTCTAGAGGATCCAG，MSV的167-186核苷酸(3)，MSV的188-277核苷酸(3)，C殘基，之后是含有外顯子1和內(nèi)含子1部分的玉米Adh1S的核苷酸119-209(4)，含有Adh1S內(nèi)含子1和外顯子2部分的核苷酸555-672(4)，接頭序列GACGGATCTG，MSV的核苷酸278-317。之后是修飾的pIJ4104BAR編碼區(qū)(5)，其中用GCC丙氨酸密碼子代替第二位置上的AGC絲氨酸密碼子，編碼區(qū)的546核苷酸由G改變成A，以便除去BglII位點(diǎn)。接下來是接頭序列TGAGATCTGAGCTCGAATTTCCCC，Nos的1298-1554核苷酸(6)，G殘基，之后是pUC19序列的其它部分(包括EcoRI位點(diǎn))。部分BpDAB353質(zhì)粒pDAB353具有以下的DNA結(jié)構(gòu)以位于pUC19(441堿基，參考文獻(xiàn)1)的SphI位點(diǎn)的最后一個(gè)C殘基后的堿基開始，并在與LacZ基因編碼鏈鄰近的鏈上閱讀，接頭序列CTGCAGATCTGCATGGGTG，CaMVDNA的7093-7344核苷酸(2)，接頭序列CATCGATG，CaMV的7093-7439核苷酸，接頭序列GGGGACTCTAGAG，含有外顯子1和內(nèi)含子1部分的玉米Adb1S的核苷酸119-209(4)，含有Adh1S內(nèi)含子1和外顯子2部分的核苷酸555-672(4)，接頭序列GACGGATCCGTCGACC，其中的GGATCC代表BamHI限制酶的識(shí)別序列。之后是pRAJ275的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因(7)(作為NcoI/SacI片段克隆)，接頭序列GAATTTCCCC，Nos核苷酸1298-1554的多聚A區(qū)(6)，G殘基，之后是pUC19序列的其它部分(包括EcoRI位點(diǎn))。以下參考文獻(xiàn)本文一并參考1.Messing，J.(1983)“酶學(xué)方法”(Wu.，R.等編輯)10120-78。2.Franck，A.，H.Guilley，G.Jonard，K.Richards，和L.Hirth(1980)花椰菜花葉病毒DNA的核苷酸序列，細(xì)胞21285-294。3.Mullineaux，P.M.，J.Donson，B.A.M.Morris-Krsinich，M.I.Boulton和J.W.Davies(1984)玉米線條病毒DNA的核苷酸序列，EMBOJ.33063-3068。4.Dennis，E.S.，W.L.Gerlach，A.J.Pryor，J.L.Bennetzen，A.Inglis，D.Llewellyn，M.M.Sachs，R.J.Ferl，和W.J.Peacock(1984)玉米乙醇脫氫酶(Adhl)基因的分子分析，核酸研究123983-4000。5.White，J.，S-YChang，M.J.Bibb，和M.J.Bibb(1990)含有吸水鏈霉菌bar基因的盒用于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，核酸研究181062。6.Depicker，A.，S.Stachel，P.Dhaese，P.Zambryski，和H.M.Goodman(1982)胭脂氨酸合成酶轉(zhuǎn)錄物圖譜測(cè)定和DNA序列，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志1561-573。7.Jefferson，R.A.(1987)分析植物中的嵌合基因GUS基因融合系統(tǒng)，植物分子生物學(xué)通報(bào)5387-405。實(shí)施例17質(zhì)粒pDAB359含有γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、反義GBSS和Nos多聚腺苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒質(zhì)粒pDAB359是一個(gè)6702bp的雙鏈環(huán)狀DNA，此質(zhì)粒含有下面的序列成分pUC18的核苷酸1-404，其中含有從第238至404堿基的乳糖操縱子序列，并且以M13mp18多接頭的HindIII位點(diǎn)結(jié)束(1，2)；核苷酸412至668的Nos多聚腺苷酸序列(3)；核苷酸的679-690的合成的銜接頭序列，此序列通過把GAGCTC變?yōu)镚AGCTT并加入CTCGAG而使SacI位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)閄hoI位點(diǎn)；從691至2953堿基的玉米顆粒結(jié)合淀粉合酶cDNA，對(duì)應(yīng)于SEQ.I.D.NO.25的核苷酸1-2255。由原來的cDNA通過增加5′的XhoI和3′的NcoI位點(diǎn)并且通過使用Klenow填充酶識(shí)別序列使內(nèi)部的NcoI和XhoI位點(diǎn)缺失而修飾質(zhì)粒pDAB359中的GBSS序列。堿基2971至4453是玉米的27kDγ-玉米醇溶蛋白基因的5′非翻譯序列，對(duì)應(yīng)于公開的序列(4)的1078至2565核苷酸。修飾了γ-玉米醇溶蛋白序列使之含有5′KpnI位點(diǎn)和3′BamH/SalI/NcoI位點(diǎn)。相對(duì)于公開的序列，在γ-玉米醇溶蛋白序列中另外的改變包括在核苷酸104的T缺失、在核苷酸613的TACA缺失、在核苷酸812的C至T的改變、在核苷酸1165的A缺失和在核苷酸1353的A插入。最后，pDAB359的核苷酸4454至6720與pUC18的堿基456至2686(其中包含從4454至4471的M13/mp18多接頭的KpnI/EcoRI/SacI位點(diǎn)、從4471至4697的lac操縱子片段和從5642至6433的β-內(nèi)酰胺酶基因(1，2))相同。下面的參考文獻(xiàn)本文一并參考pUCI8-Norrander，J.，Kempe，T.，Messing，基因雜志(1983)26101-106；Pouwels，P.H.，Enger-Valk，B.E.，Brammar，W.J.克隆載體，Elsevier1985和增刊。NosA-Depicker，A.，Staehel，S.，Dhaese，P.，Zambryski.P.，和Goodman，H.M.(1982)胭脂氨酸合酶轉(zhuǎn)錄物圖譜測(cè)定和DNA序列，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志1561-573。玉米27kDγ-玉米醇溶蛋白-Das，O.P.，Poliak，E.L.，Ward，K.，Messing，核酸研究雜志19，3325-3330(1991)。實(shí)施例18構(gòu)建含有由遍在蛋白啟動(dòng)子/內(nèi)含子(Ubil)表達(dá)的反義Δ9去飽和酶的質(zhì)粒pDAB430部分A質(zhì)粒pDAB421的構(gòu)建質(zhì)粒pDAB421含有唯一的由玉米遍在蛋白啟動(dòng)子/內(nèi)含子側(cè)接的平端SrfI克隆位點(diǎn)和胭脂氨酸合酶多聚腺苷酸化序列。通過如下方法制備pDAB421用限制酶KpnI和BamHI消化pDAB355以切下2.2kB片段上的R編碼區(qū)。凝膠純化后，將此載體連接到由兩個(gè)退火的寡核苷酸OF235和OF236組成的銜接頭上。OF235具有5′-GATCCGCCCGGGGCCCGGGCGGTAC-3′的序列，OF236具有5′-CGCCCGGGCCCCGGGCG-3′的序列。通過使用在銜接頭中而不在質(zhì)粒的其他位點(diǎn)切割的酶SrfI和SmaI消化和線性化質(zhì)粒DNA來鑒定含有銜接頭的克隆。測(cè)序了一個(gè)代表性的克隆以驗(yàn)證只有一個(gè)銜接頭插入到質(zhì)粒中。在隨后的Δ9去飽和酶反義質(zhì)粒pDAB430的構(gòu)建中使用生成的質(zhì)粒pDAB421。部分B構(gòu)建質(zhì)粒pDAB430(反義Δ9去飽和酶)通過克隆在質(zhì)粒pDAB421的平端克隆位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生存在于質(zhì)粒pDAB430中的反義Δ9去飽和酶構(gòu)建體。由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)構(gòu)建體。第一個(gè)構(gòu)建體在有義方向的遍在蛋白啟動(dòng)子后面含有Δ9去飽和酶基因，并含有用于轉(zhuǎn)基因系中過量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測(cè)的與Δ9去飽和酶開放讀框的C末端融合的c-myctag。這種構(gòu)建體用于在不能表達(dá)玉米Δ9去飽和酶的系統(tǒng)中檢測(cè)核酶。從來沒有使用過這種構(gòu)建體，但是用于擴(kuò)增和構(gòu)建Δ9去飽和酶反義基因的引物是相同的。使用兩種引物擴(kuò)增了本文描述的Δ9去飽和酶cDNA序列。N末端引物OF279具有如下序列5′-GTGCCCACAATGGCGCTCCGCCTCAACGAC-3′。具有下劃線的堿基和cDNA序列的核苷酸146-166相對(duì)應(yīng)。C末端引物OF280具有以下序列5′-TCATCACAGGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTCCTCCAGTTGGACCTGCCTACCGTA-3′，并且是序列5′-TACGGTAGGGACGTCCAACTGGAGGAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGTGATGA-3′的反向互補(bǔ)序列。在此序列中具有下劃線的堿基和cDNA序列的核苷酸1304-1324相對(duì)應(yīng)，斜體的堿基和c-myc抗原決定基序列相對(duì)應(yīng)。通過使用1.0％瓊脂糖凝膠純化1179bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且將它連接到用限制酶SrfI線性化的質(zhì)粒pDAB421上。使用集落雜交選擇含有pDAB421質(zhì)粒(帶有插入片段)的克隆。通過用診斷酶KpnI和BamHI進(jìn)行質(zhì)粒DNA的限制性消化測(cè)定插入片段的方向?；厥樟撕邢鄬?duì)于遍在蛋白啟動(dòng)子/內(nèi)含子為有義取向的Δ9去飽和酶編碼序列的克隆，并將其命名為pDAB429。把含有相對(duì)于啟動(dòng)子為反義取向的Δ9去飽和酶編碼序列的另一個(gè)克隆命名為pDAB430。對(duì)質(zhì)粒pDAB430進(jìn)行序列分析，確定了此序列含有三個(gè)PCR引起的錯(cuò)誤(和所期望的序列相比較)。在和引物OF280相應(yīng)的序列中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)錯(cuò)誤，在編碼序列內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)核苷酸改變。沒有校正這些錯(cuò)誤，因?yàn)榉戳x負(fù)調(diào)節(jié)不需要在反義轉(zhuǎn)錄物和負(fù)調(diào)節(jié)靶之間100％的序列同一性。實(shí)施例19胚胎發(fā)生的玉米培養(yǎng)物的氦轟擊和轉(zhuǎn)基因子代的后續(xù)再生部分A胚胎發(fā)生的玉米培養(yǎng)物的建立轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)使用的組織培養(yǎng)物來自基因型＂Hi-II＂的未成熟的合子胚。Hi-II是來源于B73xA188雜交的2個(gè)R3系互交所得的雜種(Armstrong等1990)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)，這種基因型產(chǎn)生稱為類型II的愈傷組織。類型II愈傷組織較脆弱，生長較快，并且顯示出長時(shí)間保持高水平胚胎發(fā)生活性的能力。類型II培養(yǎng)物來自1.5-3.0mm未成熟的胚，這些胚是通過對(duì)溫室培育的Hi-II植物進(jìn)行控制授粉而得到的。所用的起始培養(yǎng)基是含有1.0mg/l2，4-D、25mML-脯氨酸、100mg/l酪蛋白水解物、10mg/lAgNO3、2.5g/Lgelrite和2％蔗糖的N6培養(yǎng)基(Chu，1978)，pH調(diào)節(jié)到5.8。大約2-8周后選擇類型II愈傷組織，除去非胚胎發(fā)生的和/或類型I愈傷組織。一旦選擇了類型II愈傷組織，就將其轉(zhuǎn)移到不含AgNO3、L-脯氨酸含量降低到6mM的保持培養(yǎng)基上。繼代培養(yǎng)大約3個(gè)月后(其中增加了胚胎發(fā)生培養(yǎng)物的數(shù)量與質(zhì)量)，這種培養(yǎng)物被視為能夠用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中。部分B質(zhì)粒DNA的制備在用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)前，將質(zhì)粒DNA吸附到金顆粒的表面。在GBSS靶實(shí)驗(yàn)中使用了金顆粒，這些顆粒為球形，直徑在1.5-3.0微米之間(Aldrich化學(xué)公司，Milwaukee，WI)。Δ9去飽和酶靶的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)使用了1.0微米球形金顆粒(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用前，將所有的金顆粒用乙醇進(jìn)行表面消毒。通過向300μl質(zhì)粒DNA和無菌水中加入74μl2.5M氯化鈣和30μl0.1M亞精胺而完成吸附。質(zhì)粒DNA的濃度是140μg。立即將涂上DNA的金顆粒渦旋，并令其從懸浮液中沉淀出來。除去所得的澄清的上清液，并將顆粒重新懸浮在1ml100％乙醇中。用于氦轟擊的懸浮液的最終稀釋濃度為每毫升乙醇中含有7.5mgDNA/金。部分C制備組織靶并對(duì)其進(jìn)行氦轟擊將每靶大約600mg胚胎發(fā)生愈傷組織平鋪在含有類型II愈傷組織保持培養(yǎng)基加0.2M山梨醇和0.2M甘露糖醇(作為滲透劑)的培養(yǎng)皿表面。在大約4小時(shí)預(yù)處理后，將所有的組織轉(zhuǎn)移到含有2％瓊脂轟擊培養(yǎng)基(保持培養(yǎng)基+滲透劑+2％瓊脂)的培養(yǎng)皿上。氦轟擊涉及促進(jìn)懸浮的涂有DNA的金顆粒導(dǎo)向并進(jìn)入制備的組織靶中。所用的儀器是DowElanco美國專利(#5,111,131)(本文一并參考)描述的儀器的早期原型，但二者的功能相似。此儀器包括高壓氦源、含有DNA/金粉懸浮液的注射器和氣動(dòng)多功能閥門(對(duì)氦源和已經(jīng)裝載的DNA/金粉懸浮液回路之間進(jìn)行連接控制)。轟擊前，將組織靶用無菌104微米不銹鋼屏覆蓋，該屏在轟擊過程中可以保證組織位置不變。接下來真空下將靶放置在此儀器的主室中，使用1500psi氦壓在組織靶上將涂有DNA的金顆粒加速4次。每次轟擊釋放20μlDNA/金懸浮液。轟擊后，立即將靶放回到添加有滲透劑的保持培養(yǎng)基中培養(yǎng)16至24個(gè)小時(shí)(恢復(fù)期)。部分D篩選轉(zhuǎn)化的組織并由轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物再生植株轟擊12-24小時(shí)后，將組織分割成小塊并轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(保持培養(yǎng)基+30mg/lBastaTM)。每四周將組織塊無選擇地轉(zhuǎn)移到新鮮的選擇培養(yǎng)基中，共3個(gè)月。在8周至24周后，除去并分離所發(fā)現(xiàn)的任何相對(duì)于生長抑制組織正在繁殖的部分。將推定轉(zhuǎn)化的組織繼代培養(yǎng)到新鮮的選擇培養(yǎng)基中。再繼代培養(yǎng)1至3次后建立轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物。一旦BastaTM抗性愈傷組織建成為一個(gè)系，通過將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有以細(xì)胞分裂素為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上開始植株再生，然后將其在低光照(125英尺燭光)下放置一周，之后在高光照(325英尺燭光)下放置一周。誘導(dǎo)培養(yǎng)基由MS鹽和維生素(Murashige和Skoog，1962)、30g/l蔗糖、100mg/l肌肌醇、5mg/l6-苯甲氨基嘌呤、0.025mg/l2，4-D、2.5mg/lgelrite組成，pH調(diào)節(jié)到5.7。經(jīng)過兩周誘導(dǎo)后，將組織無選擇地轉(zhuǎn)移到無激素的再生培養(yǎng)基中，并保持在高光照下。再生培養(yǎng)基由MS鹽和維生素、30g/l蔗糖和2.5mg/lgelrite組成，pH調(diào)節(jié)到5.7。誘導(dǎo)和再生培養(yǎng)基都包含30mg/lBastaTM。在2-4周后組織開始分化出莖和根。取下小植株(1.5-3cm)并將其放置在含有SH培養(yǎng)基的試管中。SH培養(yǎng)基由SH鹽和維生素(Schenk和Hildebrandt，1972)、10g/l蔗糖、100mg/l肌肌醇、5ml/lFeEDTA、以及7g/l瓊脂或2.5g/lgelrite組成，pH調(diào)節(jié)到5.8。一旦小植株開始生長并發(fā)育出足夠的根系(1-2周)，將其轉(zhuǎn)移到溫室中的裝有大約0.1kgMetro-Mix360(TheScotts公司，Marysville，OH)的10cm花盆中。在3-5葉期，將植株轉(zhuǎn)移到裝有大約4kgMetro-Mix360的5加侖花盆中，培育至成熟。將這些R0植株自交和/或與非轉(zhuǎn)基因近交系雜交，以獲得轉(zhuǎn)基因的子代。為GBSS靶產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物中，重新種植了由R0授粉產(chǎn)生的R1種子。將R1植物培育至成熟，經(jīng)授粉產(chǎn)生足夠量的分析用R2種子。實(shí)施例20Δ9轉(zhuǎn)基因材料的產(chǎn)生和再生部分A轉(zhuǎn)化和分離胚胎發(fā)生愈傷組織將上文描述的針對(duì)Δ9去飽和酶的六個(gè)核酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到此處描述的可再生的類型II愈傷組織培養(yǎng)物中。這6個(gè)構(gòu)建體由3個(gè)活性/無活性對(duì)組成，即RPA85/RPA113、RPA114/RPA115和RPA118/RPA119?？偣仓苽洳⑥Z擊了1621個(gè)組織靶，并將其轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。在這些轟擊實(shí)驗(yàn)中，通過選擇分離了334個(gè)獨(dú)立的Basta抗性轉(zhuǎn)化組織(“系”)，以DNAPCR或GC/FAME作為檢測(cè)手段確定哪一個(gè)該進(jìn)行再生和哪一個(gè)該棄去，分析了大約50％的系。由于余下的50％不能再生胚胎或者已污染而沒有進(jìn)行分析。部分B由轉(zhuǎn)基因愈傷組織再生Δ9植株分析完轉(zhuǎn)基因愈傷組織后，每個(gè)核酶構(gòu)建體選擇十二個(gè)系用于再生，這樣每個(gè)系將產(chǎn)生15個(gè)R0植株。這些系一般由10個(gè)陽性系+2個(gè)陰性對(duì)照組成，然而由于一些培養(yǎng)物的再生能力差，構(gòu)建體RPA113、RPA115、RPA118和RPA119由少于12個(gè)系產(chǎn)生植株。從66個(gè)獨(dú)立的系中再生了總共854個(gè)R0植株(參見表X)。當(dāng)植株成熟時(shí)，優(yōu)先進(jìn)行自花或近緣授粉，然而當(dāng)不能進(jìn)行自花或近緣授粉時(shí)，使用近交系CQ806、CS716、OQ414或HO1作為花粉供體(有時(shí)也作為花粉受體)進(jìn)行雜交授粉。進(jìn)行了超過715個(gè)控制授粉，其中多數(shù)是自花或近緣授粉(55％)，少數(shù)是F1雜交。授粉大約45天后收獲R1種子。實(shí)施例21GBSS轉(zhuǎn)基因玉米的產(chǎn)生和再生部分A胚胎發(fā)生的玉米愈傷組織的轉(zhuǎn)化及后續(xù)的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物的選擇和建立將針對(duì)GBSS的核酶多聚體的活性/無活性對(duì)RPA63和RPA64與bar選擇質(zhì)粒pDAB308一起插入到本文描述的類型II愈傷組織中。從590個(gè)轟擊的組織靶的選擇中回收了總共115個(gè)BastaTM抗性的獨(dú)立轉(zhuǎn)化組織。對(duì)從所有轉(zhuǎn)化中建立的培養(yǎng)物愈傷組織樣品進(jìn)行了Southern分析以確定興趣基因的狀態(tài)。部分B從用針對(duì)GBSS的核酶轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物中再生植株和產(chǎn)生R2代從Southern“陽性”轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物起再生植株，并且在溫室中培育至成熟。將主要的再生植株授粉以產(chǎn)生R1種子。授粉30至45天后收獲種子，將種子干燥至正確含濕量并且將種子種植。將代表16個(gè)原始系的總共752個(gè)R1植株培育至性成熟并且授粉。大約在授粉19至22天后收獲麥穗，隨機(jī)地從每個(gè)穗中摘下30個(gè)谷粒，并且冷凍以用于以后的分析。實(shí)施例22玉米BlackMexicanSweet(BMS)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化愈傷組織中靶向GBSS的核酶的檢測(cè)部分A用GBSS穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的BMS愈傷組織和靶向GBSS的核酶的產(chǎn)生BMS不能產(chǎn)生和玉米內(nèi)源的GBSSmRNA同源的GBSSmRNA。因此研究出了一個(gè)雙轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以產(chǎn)生表達(dá)靶和核酶的轉(zhuǎn)化體。在繼代培養(yǎng)四天后，通過轉(zhuǎn)移到100×200mm培養(yǎng)皿(FisherScientific，Pittsburgh，PA)并除去部分液體培養(yǎng)基制備了＂ZM＂BMS懸浮液(從JackWidholm(Illinois大學(xué))得到，也參見W.F.Sheridan，“BlackMexicanSweet玉米用于組織培養(yǎng)”(玉米生物學(xué)研究，W.F.Sheridan編輯，大學(xué)出版社，NorthDakokta大學(xué)，GrandForks，ND，1982，pp.385-388))用于進(jìn)行氦轟擊，形成細(xì)胞薄糊。靶是由100-125mg(鮮重)生長在置于轟擊培養(yǎng)基上的1/2”抗生素盤(Schleicher和Schuell，Keene，NH)上的細(xì)胞、DN6[N6鹽和維生素(Chu等，1978)、20g/l蔗糖、1.5mg/l2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、25mML-脯氨酸，121℃下高壓滅菌20分鐘前將pH調(diào)節(jié)到5.8]組成，用2％TC瓊脂(JRH生物科學(xué)，Lenexa，Kansas)固化，鋪在60X20mm平板上。將DNA沉淀在金顆粒上。在第一次轉(zhuǎn)化中使用pDAB426(Ubi/GBSS)和pDAB308(35T/Bar)。使用DowElanco氦轟擊儀器I分別對(duì)靶進(jìn)行轟擊。在真空壓為650mmHg，靶到儀器噴口的距離為15.5cm下，以500psi用DNA/金混合物轟擊每個(gè)樣品一次。轟擊后，立即將抗生素盤轉(zhuǎn)移到由0.8％TC瓊脂組成的DN6培養(yǎng)基上，使靶組織恢復(fù)一周?；謴?fù)后，將每個(gè)靶平鋪在置于不含脯氨酸而含有3mg/lBasta(Hoechst，法蘭克福，德國)的5.5cmWhatman#4濾膜上。兩周后，將濾膜轉(zhuǎn)移到含有6mg/lBasta的新鮮選擇培養(yǎng)基上。以后每兩周進(jìn)行一次轉(zhuǎn)移。從濾膜上挑取分離物并將其置于用0.8％TC瓊脂(含有6mg/lBasta)固化的AMCF-ARM培養(yǎng)基(N6鹽和維生素、20g/l蔗糖、30g/l甘露糖醇、100mg/l酸性酪蛋白水解物、1mg/l2，4-D、24mML-脯氨酸；121℃下高壓滅菌20分鐘前將pH調(diào)節(jié)到5.8)上。每兩周將分離物轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，從而維持分離物。對(duì)表達(dá)GBSS的Basta抗性分離物進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)化。如BMS懸液那樣，在繼代培養(yǎng)4天后，通過將組織平鋪在1/2＂濾膜上制備轉(zhuǎn)基因愈傷組織的靶。然而，由于轉(zhuǎn)化體保持在AMCF-ARM選擇培養(yǎng)基上，使用含有2％TC瓊脂的AMCF-ARM用于轟擊。用無菌104μm目的屏覆蓋每一個(gè)樣品，在1500psi下進(jìn)行轟擊。用pDAB319(35S-ALS；35T-GUS)和RPA63(活性的核酶多體)或pDAB319和RPA64(無活性的核酶多體)共轟擊或單獨(dú)使用pDAB319轟擊靶組織。轟擊后，將所有的靶立即轉(zhuǎn)移到非選擇培養(yǎng)基(AMCF-ARM)中，恢復(fù)1周。接下來，將所說的靶放置在含有兩種選擇試劑6mg/LBasta和2μg/L綠黃隆(CSN)的AMCF-ARM培養(yǎng)基中。2周后，CSN的水平增加至4ug/L。按照第一次轉(zhuǎn)化的描述連續(xù)轉(zhuǎn)移濾膜并產(chǎn)生分離物，將分離物維持在含有6mg/LBasta和4μg/LCSN的AMCF-ARM培養(yǎng)基中。部分B分析表達(dá)GBSS和靶向GBSS的核酶的BMS穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體通過Northern印跡分析方法評(píng)價(jià)第一次轉(zhuǎn)化的分離物，以檢測(cè)功能性靶基因(GBSS)，并確定相對(duì)表達(dá)水平。在25個(gè)所分析的分離物中，有12個(gè)檢測(cè)到了GBSS轉(zhuǎn)錄物。觀察了表達(dá)范圍，表明轉(zhuǎn)化過程是獨(dú)立的。通過Northern印跡分析方法評(píng)價(jià)第二次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的分離物，以檢測(cè)連續(xù)的GBSS表達(dá)，通過RT-PCR篩選核酶轉(zhuǎn)錄物是否存在。所試驗(yàn)的19個(gè)來自一個(gè)原先轉(zhuǎn)化系的分離物中，18個(gè)表達(dá)活性核酶(RPA63)，所有的分離物都表達(dá)GBSS。在6個(gè)載體對(duì)照中都檢測(cè)到了GBSS；在這些樣品中核酶沒有表達(dá)。如本文所述，在表達(dá)核酶的組織和載體對(duì)照組織中進(jìn)行了RNA酶保護(hù)測(cè)定(RPA)和Northern印跡分析，以便比較在活性核酶存在和不存在情況下GBSS轉(zhuǎn)錄物的水平。使GBSS值相對(duì)內(nèi)對(duì)照(Δ9去飽和酶)標(biāo)準(zhǔn)化。Northern印跡數(shù)據(jù)如圖(25)所示。Northern印跡結(jié)果表明，與載體對(duì)照相比，在核酶存在時(shí)GBSS的水平明顯降低。RPA數(shù)據(jù)表明一些表達(dá)活性核酶的獨(dú)立樣品(＂L＂和＂O＂)與載體對(duì)照明顯不同，而與非轉(zhuǎn)化對(duì)照相似。實(shí)施例23植物和愈傷組織材料的分析在愈傷組織水平和R0水平分析用pDAB308和下列含有核酶的載體之一(pRPA63、pRPA64、pRPA85、pRPA113、pRPA114、pRPA115、pRPA118或pRPA119)共轉(zhuǎn)化的植物材料，并在F1水平分析選擇系。當(dāng)小植株達(dá)到6-8葉期時(shí)，收獲葉片材料。如Saghai-Maroof等的描述(見上文)從凍干的組織中制備植物和愈傷組織材料的DNA。使用對(duì)每一個(gè)構(gòu)建體特異性的限制性酶在廠商建議的條件(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室，Gaithersburg，MD)下消化每一種DNA(8μg)，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離。如Southern，E.(1975)的＂在通過凝膠電泳分離的DNA片段中檢測(cè)特異性序列＂(分子生物學(xué)雜志98503)和Southern，E.(1980)的＂限制性片段的凝膠電泳＂(酶學(xué)方法69152)的描述(本文一并參考)將所說的DNA印跡到尼龍膜上。將核酶編碼區(qū)特異性探針與所說的膜雜交。在將所說的探針DNA加入到帶有50微居α-32P-dCTP(Amersham生命科學(xué)，ArlingtonHeights，IL)的Ready-To-GoDNA標(biāo)記珠(PharmaciaLKB，Piscataway，NJ)之前，通過將50ng的探針DNA煮沸10分鐘，然后快速在冰上冷卻而制備探針DNA。在尼龍膜上將探針與基因組DNA雜交。60℃下，將此膜在0.25XSSC和0.2％SDS中洗滌45分鐘，吸干，并用兩個(gè)增強(qiáng)屏對(duì)XAR-5膠片曝光過夜。用限制性酶HindIII和EcoRI消化RPA63與RPA64的DNA，并將含有這些樣品的印跡與RPA63探針雜交。RPA63探針由RPA63核酶多聚體編碼區(qū)組成，當(dāng)與RPA63或RPA64物質(zhì)雜交時(shí)將產(chǎn)生單一的1.3kb雜交產(chǎn)物。這一1.3kb雜交產(chǎn)物應(yīng)含有增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子、AdhI內(nèi)含子、核酶編碼區(qū)和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。用限制酶HindIII與EcoRI消化RPA85和RPA113的DNA，并將含有這些樣品的印跡與RPA122探針雜交。RPA122是在pDAB353中取代GUS報(bào)道基因的252多聚體核酶。RPA122探針是由RPA122核酶多聚體編碼區(qū)和胭脂氨酸合酶的3′末端組成的，當(dāng)與RPA85或者RPA113物質(zhì)雜交時(shí)應(yīng)能產(chǎn)生一個(gè)單一的2.1kb雜交產(chǎn)物。此2.1kb雜交產(chǎn)物應(yīng)含有增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子、AdhI內(nèi)含子、bar基因、核酶編碼區(qū)和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。用限制性酶HindIII和SmaI消化RPA114與RPA115的DNA，并將含有這些樣品的印跡與RPA115探針雜交。RPA115探針由RPA115核酶編碼區(qū)組成，當(dāng)與RPA114或RPA115物質(zhì)雜交時(shí)應(yīng)產(chǎn)生單一的1.2kb雜交產(chǎn)物。這一1.2kb雜交產(chǎn)物應(yīng)含有增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子、AdhI內(nèi)含子、核酶編碼區(qū)和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。用限制性酶HindIII和SmaI消化RPA118與RPA119的DNA，并將含有這些樣品的印跡與RPA118探針雜交。RPA118探針由RPA118核酶編碼區(qū)組成，當(dāng)與RPA118或RPA119物質(zhì)雜交時(shí)應(yīng)產(chǎn)生單一的1.3kb雜交產(chǎn)物。這一1.3kb雜交產(chǎn)物應(yīng)含有增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子、AdhI內(nèi)含子、核酶編碼區(qū)和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。實(shí)施例24轉(zhuǎn)基因愈傷組織基因組DNA的提取將300mg旺盛生長的愈傷組織在于冰上迅速冷凍。用冷的Bessman組織粉碎器(Spectrum，Houston，TX)將愈傷組織研磨成細(xì)粉末，并用400μl2XCTAB緩沖液(2％六癸基三甲基溴化銨、100mMTrispH8.0、20mMEDTA、1.4MNaCl、1％聚乙烯吡咯烷酮)提取。60℃下將懸液溶解25分鐘，然后用等體積的三氯甲烷∶異戊醇提取。向水相中加入0.1倍體積的10％CTAB緩沖液(10％六癸基三甲基溴化銨、0.7MNaCl)。用等體積的三氯甲烷∶異戊醇提取后，向水相中加入0.6倍體積的冷異丙醇，并在-20℃下放置30分鐘。在14,000rpm下離心5分鐘后，將所得的沉淀真空干燥10分鐘。65℃下將其重懸浮在200μlTE(10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)中20分鐘。向DNA中加入20％Chelex(Biorad)使其最終濃度達(dá)到5％，56℃下將其溫育15-30分鐘以便除去雜質(zhì)。在Hoefer熒光計(jì)(Hoefer，SanFrancisco)上測(cè)量DNA濃度。實(shí)施例25基因組愈傷組織DNA的PCR分析使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)證明核酶基因穩(wěn)定地插入到轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織的染色體上。部分A用于檢測(cè)核酶DNA的方法使用AmpliTaqDNA聚合酶(GeneAmpPCR試劑盒，PerkinElmer，Cetus)如廠商方法中的描述進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。將300ng基因組愈傷組織DNA、1μl50μM下游引物(5′CGCAAGACCGGCAACAGG3′)、1ml上游引物、1μlPerfectMatch(Stratagene，Ca)PCR增強(qiáng)子的等份試樣與試劑盒組分混合。使用下列參數(shù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)94℃下變性1分鐘、55℃退火2分鐘、72℃下伸長3分鐘。在每個(gè)PCR反應(yīng)物中取0.2倍體積的等份試樣在2％3∶1瓊脂糖(FMC)凝膠上使用標(biāo)準(zhǔn)的TEA瓊脂糖凝膠條件進(jìn)行電泳。部分B用于檢測(cè)Δ9去飽和酶核酶基因的上游引物融合到BAR3′ORF的RPA85/RPA113251多體RPA114/RPA115258核酶單體RPA118/RPA119452核酶多體5′TGGATTGATGTGATATCTCCAC3′在35S啟動(dòng)子中，此引物用于橫跨EcoRV位點(diǎn)的擴(kuò)增。使用標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成方案在應(yīng)用生物系統(tǒng)394型DNA/RNA合成儀上制備引物。實(shí)施例26從轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織和植物中制備總RNA部分A從轉(zhuǎn)基因不可再生和可再生的愈傷組織中制備總RNA將300mg旺盛生長的愈傷組織在干冰上迅速冷凍。用冷的Bessman組織粉碎器(Spectrum，Houston，TX)將愈傷組織研磨成細(xì)粉末，并用RNA提取緩沖液(50mMTris-HClpH8.0、4％對(duì)氨基水楊酸、1％三異丙基萘磺酸、10mM二硫蘇糖醇和10mM偏酸式亞硫酸鈉)通過激烈渦旋提取。然后用等體積的含有0.1％8-羥基喹啉的苯酚提取勻漿。離心后，水層用等體積的含有三氯甲烷∶異戊醇(24∶1)的苯酚提取，之后用三氯甲烷∶辛醇(24∶1)提取。接下來加入7.5M乙酸銨使其最終濃度為2.5M，4℃下沉淀RNA1-3小時(shí)。4℃下以14,000rpm離心后將RNA重懸浮在無菌水中，用2.5MNH4OAc和2倍體積的100％乙醇沉淀，-20℃下過夜溫育。用70％乙醇洗滌收集的RNA沉淀，并且在真空下干燥。將RNA重懸浮在無菌水中，并儲(chǔ)存在-80℃。部分B從轉(zhuǎn)基因玉米植物制備總RNA切下5cm大小的(大約為150mg)旺盛生長的玉米葉片組織切片，在干冰上迅速冷凍。在冷的研缽中將葉片研磨成細(xì)粉末。按照廠商的說明使用QaigenRNeasy植物總RNA試劑盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)從粉末中純化總RNA。通過預(yù)加熱(50℃)無菌水(每個(gè)30μl)的兩次系列洗脫旋轉(zhuǎn)從RNeasy柱上釋放總RNA，并保存在-80℃。實(shí)施例27使用RT-PCR分析證實(shí)核酶RNA在轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織和植物中的表達(dá)部分A用于檢測(cè)核酶RNA的方法使用耐熱rTthDNA聚合酶(rTthDNA聚合酶RNAPCR試劑盒，PerkinElmerCetus)如供應(yīng)商方案的描述進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。將300ng總RNA(葉片或愈傷組織)的等分試樣和1μl15μM下游引物(5′CGCAAGACCGGCAACAGG3′)與試劑盒的RT組分混合。分三步分別于60℃、65℃和70℃下溫育5分鐘進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。為了進(jìn)行PCR反應(yīng)，將1μl對(duì)所分析的RNA具有特異性的上游引物加入到PCR組分的RT反應(yīng)中。以下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)96℃下溫育1分鐘，94℃下變性30秒，50℃下退火30秒，72℃下延伸3分鐘。將每一種RT-PCR反應(yīng)物的0.2倍體積等分試樣以標(biāo)準(zhǔn)的TAE瓊脂糖凝膠條件在2％3∶1瓊脂糖(FMC)凝膠上電泳。部分B用于檢測(cè)GBSS核酶的特異上游引物GBSS活性和無活性多體5′CAGATCAAGTGCAAAGCTGCGGACGGATCTG3′，此引物覆蓋第一個(gè)核酶臂的AdhI內(nèi)含子足跡上游。GBSS918內(nèi)含子(-)單體5′ATCCGATGCCGTGGCTGATG3′，此引物覆蓋10個(gè)堿基對(duì)的核酶臂和核酶催化域的前6個(gè)堿基。由RT-PCR確認(rèn)了GBSS核酶在轉(zhuǎn)基因愈傷組織和植物中的表達(dá)。通過核糖核酸酶保護(hù)分析也確認(rèn)了GBSS多體核酶在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化愈傷組織中的表達(dá)。部分C用于檢測(cè)Δ9去飽和酶核酶的特異上游引物融合到BAR3′ORF中的RPA85/RPA113252多體5′GATGAGATCCGGTGGCATTG3′，此引物跨越BAR基因和RPA85/113核酶的接頭。RPA114/RPA115259核酶單體5′ATCCCCTTGGTGGACTGATG3′，此引物覆蓋10個(gè)堿基對(duì)的核酶臂和核酶催化域的前6個(gè)堿基。RPA118/RPA119453核酶多體5′CAGATCAAGTGCAAAGCTGCGGACGGATCTG3′。此引物覆蓋第一個(gè)核酶臂的AdhI內(nèi)含子足跡上游。由RT-PCR確認(rèn)了Δ9去飽和酶核酶在轉(zhuǎn)基因植物系85-06、113-06和85-15中的表達(dá)。使用標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成方案在應(yīng)用生物系統(tǒng)394型DNA/RNA合成儀上制備引物。實(shí)施例28證明轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織和植株中核酶介導(dǎo)的靶mRNA水平的減少部分A使用Northern分析方法證明靶mRNA水平的減少將5μg的總RNA在真空下干燥，重懸浮在上樣緩沖液(20mM磷酸緩沖液pH6.8，5mMEDTA；50％甲酰胺16％甲醛10％甘油)中，并在65℃下變性10分鐘。50V下在20mM磷酸緩沖液(pH6.8)(緩沖液再循環(huán))中經(jīng)1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。在凝膠上用溴化乙錠對(duì)BRL0.24-9.5KbRNA系列梯(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)進(jìn)行染色。通過用無菌水進(jìn)行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移將RNA轉(zhuǎn)移到GeneScreen濾膜(DuPontNEN，BostonMA)上。如DeLeon等(1983)的描述在42℃下進(jìn)行雜交，55℃下洗滌濾膜以便除去沒有雜交的探針。依次使用靶基因的cDNA片段和內(nèi)部RNA對(duì)照基因探測(cè)印跡。使用RNA內(nèi)標(biāo)辨別靶mRNA水平由于上樣或操作錯(cuò)誤引起的與真正核酶介導(dǎo)的RNA減少的誤差。對(duì)于每一個(gè)樣品，將靶mRNA的水平與此樣品內(nèi)的對(duì)照mRNA水平比較。通過Qiaex樹脂(Qaigen公司，Chatsworth，CA)從1xTAE瓊脂糖凝膠上純化片段。使用含有α-32PdCTP的Amersham缺口翻譯試劑盒(Amersham公司，ArlingtonHeights，III.)進(jìn)行缺口翻譯。在-70℃下使用增感屏(DuPont，WilmingtonDE)進(jìn)行放射自顯影1-3大。在曝光24小時(shí)后通過密度計(jì)檢測(cè)每一個(gè)探針的放射自顯影信號(hào)，并計(jì)算靶/內(nèi)部對(duì)照RNA水平的比值。RNA酶保護(hù)測(cè)定如下進(jìn)行使用QiagenRNeasy植物總RNA試劑盒由BMS原生質(zhì)體或愈傷組織材料制備RNA。使用AmbionMaxiscript試劑盒制備探針，探針一般為108cpm/μg或更高。在使用的當(dāng)天制備探針。將這些探針進(jìn)行凝膠純化，重懸浮在無RNA酶的10mMTris(pH8)中，并保存在冰上。臨用前將探針稀釋到5×105cpm/μl。將5μg來源于愈傷組織的RNA或者20μg來源于原生質(zhì)體的RNA在4M胍緩沖液中與5×105cpm探針一起溫育。[4M胍緩沖液4M硫氰酸胍/0.5％十二烷基肌氨酸鈉/25mM檸檬酸鈉(pH7.4)]。將40μlPCR礦物油加入到每一個(gè)管中防止蒸發(fā)。將樣品加熱到95℃，保持3分鐘，立即放入45℃的水浴中。過夜溫育。向每一個(gè)樣品中加入600μlRNA酶處理混合液，并在37℃下溫育30分鐘。(RNA酶處理混合液400mMNaCl，40單位/毫升RNA酶A和T1)。每個(gè)管中加入12μl20％SDS，之后立即向每個(gè)管中加入12μl(20mg/ml)蛋白酶K。將這些管溫和地渦旋，37℃下溫育30分鐘。室溫下將750μl無RNA酶的異丙醇加入到每個(gè)管中，上下反復(fù)顛倒混合，使SDS進(jìn)入溶液中。然后室溫下用小離心機(jī)以最高速將這些樣品離心20分鐘。所得的沉淀在空氣中干燥45分鐘。將15μl的RNA電泳緩沖液加入到每個(gè)管中，激烈渦旋30秒。(RNA電泳緩沖液95％甲酰胺/20mMEDTA/0.1％溴酚藍(lán)/0.1％二甲苯胺)。將樣品加熱到95℃，保持3分鐘，然后將其上樣到8％變性丙烯酰胺凝膠上。將此凝膠進(jìn)行真空干燥，并在磷光成象屏上曝光4-12小時(shí)。部分B證明GBSSmRNA水平在表達(dá)GBSS和靶向GBSS的核酶RNA的不可再生愈傷組織中減少的結(jié)果產(chǎn)生表達(dá)GBSS靶基因的RNA和靶定到GBSSmRNA上的活性多體核酶的不可再生愈傷組織。也產(chǎn)生了表達(dá)GBSS和核酶(-)對(duì)照RNA的轉(zhuǎn)基因體。從轉(zhuǎn)基因系中制備總RNA。對(duì)7個(gè)核酶(-)對(duì)照轉(zhuǎn)化體和8個(gè)活性RPA63系進(jìn)行Northern分析。用于此分析的探針是全長玉米GBSScDNA和玉米Δ9cDNA片段。為了辨別GBSSmRNA水平由于上樣或操作錯(cuò)誤引起的與真正核酶介導(dǎo)的RNA減少的誤差，將GBSSmRNA水平與該樣品中的Δ9mRNA水平比較。比較表達(dá)核酶和沒有核酶的愈傷組織中的全長GBSS轉(zhuǎn)錄物水平，以便鑒定具有核酶介導(dǎo)的靶RNA減少的系。通過進(jìn)行兩次平行分析減少印跡間的誤差。在核酶(-)的轉(zhuǎn)基因體中觀察GBSS/Δ9的比值范圍。通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生靶mRNA，它與內(nèi)源Δ9mRNA相比在表達(dá)上可能會(huì)有更多的差異。證明活性系(RPA63)AA、EE、KK和JJ的GBSS/Δ9水平降低最明顯，如圖25所示與核酶(-)對(duì)照轉(zhuǎn)基因體相比減少多達(dá)10倍。如本文所述由RT-PCR表明這些活性系表達(dá)靶定到GBSS上的核酶。RNA酶保護(hù)測(cè)定也表明與Δ9mRNA相比，GBSSmRNA減少。部分C在表達(dá)靶定到Δ9去飽和酶mRNA上的核酶的轉(zhuǎn)基因植物中Δ9去飽和酶水平降低的證據(jù)硬脂酸含量高的轉(zhuǎn)基因體RPA85-06和RPA85-15都含有融合核酶多體基因的完整拷貝。在每個(gè)系中，通過RT-PCR篩選植物中核酶RNA的存在。使用實(shí)施例27中描述的方案。在葉片中含有高硬脂酸的植物RPA85-06和RPA85-15系中證明了RPA85核酶的表達(dá)。對(duì)每個(gè)系中的6個(gè)高硬脂酸植物以及非轉(zhuǎn)化(NT)和轉(zhuǎn)化的對(duì)照(TC)植物進(jìn)行Northern分析。用于此分析的探針是玉米Δ9去飽和酶cDNA的cDNA片段和玉米肌動(dòng)蛋白cDNA。為了辨別Δ9mRNA水平由于上樣或操作錯(cuò)誤引起的與真正核酶介導(dǎo)的RNA減少的誤差，將Δ9mRNA水平與該樣品中的肌動(dòng)蛋白mRNA水平比較。如上所述使用密度計(jì)讀數(shù)計(jì)算每個(gè)樣品的比值。計(jì)算出85-06植物的Δ9/肌動(dòng)蛋白比值在0.55-0.88之間。非轉(zhuǎn)化的對(duì)照Δ9/肌動(dòng)蛋白的平均值為2.7。在85-06和NT的葉片中的Δ9/肌動(dòng)蛋比值明顯減少了4倍。比較85-06高硬脂酸植株和TC植株之間的Δ9/肌動(dòng)蛋白比值，發(fā)現(xiàn)85-06植株的Δ9/肌動(dòng)蛋白的值平均減少3倍。這些數(shù)據(jù)在圖26中以圖表的形式顯示出來。計(jì)算了RPA85-15高硬脂酸轉(zhuǎn)基因植株的Δ9/肌動(dòng)蛋白比值，其范圍在0.35至0.53之間，平均值為0.43。在此試驗(yàn)中，NT植株的Δ9/肌動(dòng)蛋白的平均值為1.7。比較NT對(duì)照和85-15高硬脂酸植株的Δ9/肌動(dòng)蛋白的平均值，發(fā)現(xiàn)85-15的Δ9mRNA的減少了3.9倍。比較85-15高硬脂酸植株和正常硬脂酸(TC)植株的Δ9/肌動(dòng)蛋白值，發(fā)現(xiàn)在RPA85-15高硬脂酸轉(zhuǎn)基因植株的Δ9mRNA水平明顯減少了3倍。這些數(shù)據(jù)在圖27中以圖表的形式顯示出來。這些數(shù)據(jù)表明在表達(dá)RPA85核酶并在葉片中產(chǎn)生更高水平硬脂酸的轉(zhuǎn)基因植株中Δ9去飽和酶mRNA的核酶介導(dǎo)的減少。實(shí)施例29玉米葉片中由于活性核酶的活性而存在Δ9去飽和酶負(fù)調(diào)節(jié)的證據(jù)產(chǎn)生了以無活性形式的Δ9去飽和酶核酶基因轉(zhuǎn)化的植株。給出在無活性Δ9核酶轉(zhuǎn)基因系RPA113-06和113-17葉片中硬脂酸的對(duì)照水平的數(shù)據(jù)。對(duì)RPA113-06系進(jìn)行了核酶表達(dá)和Northern分析。測(cè)定了RPA113-17系植株中的Δ9去飽和酶蛋白質(zhì)水平。如本文的描述測(cè)定了核酶的表達(dá)。植株113-06-04、113-06-07和113-06-10表達(dá)了可檢測(cè)水平的RPA113無活性Δ9核酶。對(duì)RPA113-06系的5個(gè)植株進(jìn)行了Northern分析，其葉片中的硬脂酸都在對(duì)照的范圍內(nèi)，均在1.8-3.9％之間。如圖28所示，和對(duì)照相比，在RPA113-06植株中沒有發(fā)現(xiàn)與核酶表達(dá)相關(guān)的Δ9去飽和酶mRNA的減少或者葉片硬脂酸的增加。蛋白質(zhì)分析表明在RPA113-17植株中沒有與提高的葉片硬脂酸相關(guān)的Δ9去飽和酶蛋白質(zhì)水平的任何減少。這些數(shù)據(jù)在圖29(a)中以圖表的形式顯示出來。總之，兩個(gè)RPA113無活性轉(zhuǎn)基因系的數(shù)據(jù)表明核酶活性和在RPA85系中觀察到的高硬脂酸表型相關(guān)。RPA85核酶是RPA113核酶的活性形式。實(shí)施例30核酶介導(dǎo)的玉米葉片(R0)中硬脂酰-ACPΔ9去飽和酶水平減少的證明部分A玉米葉片中硬脂酰-ACPΔ9去飽和酶的部分純化除非特殊說明，所有的過程都是在4℃下進(jìn)行的。收集玉米葉片(50mg)，并用研缽和研棒將其在液N2中研成細(xì)粉末。在由25mM磷酸鈉(pH6.5)、1mM乙二氨四乙酸、1mM二硫蘇糖醇、10mM苯甲基磺酰氟、5mM亮抑蛋白酶肽和5mMantipapin組成的等體積的緩沖液A中提取蛋白質(zhì)。在10,000xg下將粗制的勻漿離心5分鐘。通過Bio-Rad蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Hercules，CA)測(cè)定上清液中的總蛋白濃度。將100μg的總蛋白加入到終體積為500μl的緩沖液A中，再加入到50μl混合的SP-瓊脂糖珠(Pharmacia生物技術(shù)公司，Piscataway，NJ)，并通過簡單渦旋重懸浮。在冰上使蛋白質(zhì)和瓊脂糖珠結(jié)合10分鐘。結(jié)合后，將Δ9去飽和酶-瓊脂糖珠物質(zhì)離心(10,000xg)10秒鐘，傾析，用緩沖液A(500μl)洗滌三次，并用200mM氯化鈉(500μl)洗滌一次。通過在50μl處理緩沖液(125mMTris-HClpH6.8、4％十二烷基硫酸鈉、20％甘油、10％2-巰基乙醇)中煮沸5分鐘來洗脫蛋白質(zhì)。把樣品離心(10,000xg)5分鐘。保存上清液以用于Western分析，并棄去含有瓊脂糖珠的沉淀。部分B使用Western分析方法正明硬脂酰-ACPΔ9去飽和酶的減少如Laemmli，U.K.(1970)，在組裝噬菌體T4頭期間對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的切割，自然227，660-685的描述在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(10％PAGE)上分離部分純化的蛋白質(zhì)。為了辨別Δ9去飽和酶水平的誤差，在每個(gè)印跡上加入作為參考的經(jīng)純化和定量的大腸桿菌過量表達(dá)的Δ9去飽和酶。通過電泳利用Pharmacia半干燥印跡紙(Pharmacia生物技術(shù)公司，Piscataway，NJ)使用Towbin緩沖液(Towbin等，1979)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到ECLTM硝酸纖維素膜(Amerham生命科學(xué)，ArlingtonHeights，Illinois)上。在磷酸緩沖液中用10％干牛奶將非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉1小時(shí)。使用抗大腸桿菌表達(dá)的玉米Δ9去飽和酶的兔抗血清，利用ECLTMWestern印跡檢測(cè)試劑(Amerham生命科學(xué)，ArlingtonHeights，Illinois)檢測(cè)免疫反應(yīng)性多肽。按照Berkeley抗體公司的標(biāo)準(zhǔn)方案產(chǎn)生抗體。第二抗體是連接到辣根過氧化物酶(BioRad)上的羊抗兔血清。用密度計(jì)掃描了放射自顯影圖并以純化的大腸桿菌Δ9去飽和酶的相對(duì)量為基礎(chǔ)定量。重復(fù)進(jìn)行這些試驗(yàn)并且記錄減少量的平均值。部分C表達(dá)靶定到Δ9去飽和酶mRNA上的核酶的R0玉米葉片中Δ9去飽和酶水平減少的證明高硬脂酸轉(zhuǎn)基因系RPA85-15含有融合多體基因的完整拷貝。利用本文所述的方案部分純化了R0玉米葉片中Δ9去飽和酶。如部分B所述，對(duì)活性核酶植株(RPA85-15)、無活性核酶植株RPA113-17和非轉(zhuǎn)化植株(HiII)進(jìn)行Western分析。通過Western分析檢測(cè)了非轉(zhuǎn)化系(HiII)的Δ9去飽和酶的天然變異(參見圖29A)。在無活性核酶系RPA113-17中發(fā)現(xiàn)Δ9去飽和酶沒有減少，以上所有植株都在非轉(zhuǎn)化系(HiII)范圍內(nèi)。和對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)RPA85-15系的6個(gè)植株Δ9去飽和酶明顯地減少50％(參見圖29B)。同時(shí)這六個(gè)植株物的硬脂酸也增加了，并且Δ9去飽和酶mRNA減少了(如實(shí)施例28和32所述)。然而，和非轉(zhuǎn)化系(HiII)和無活性核酶系(RPA113-17)相比，RPA85-15系的9個(gè)活性核酶植株的Δ9去飽和酶沒有發(fā)現(xiàn)明顯減少(圖29A和B)?？傊@些結(jié)果表明RPA85-15系的6個(gè)植株的核酶活性和減少的Δ9去飽和酶有關(guān)。實(shí)施例31玉米Δ9去飽和酶的大腸桿菌表達(dá)和純化部分A把玉米Δ9去飽和酶cDNA的成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)插入到細(xì)菌T7表達(dá)載體pET9D(Novagen公司，Madison，WI)中。成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)是從成熟蓖麻子多肽序列推測(cè)的。將32位的丙氨酸(cDNA的nt239-241)作為第一殘基。這是在序列Ala.Val.Ala.Ser.Met.Thr.中發(fā)現(xiàn)的。通過PCR將限制性內(nèi)切酶NheI位點(diǎn)經(jīng)基因工程的方法引入到玉米的序列中，結(jié)果將GCCTCC變?yōu)镚CTAGC，并把BamHI位點(diǎn)加入到3′端。這沒有改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。使用NheI和BamHI位點(diǎn)將cDNA序列克隆到pET9d載體中。將重組體質(zhì)粒命名為pDAB428。在細(xì)菌中表達(dá)的玉米Δ9去飽和酶蛋白質(zhì)在5′端具有另外的甲硫氨酸殘基。將pDAB428質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細(xì)菌菌株BL21(Novagen公司，Madison，WI)中并且接種在LB/卡那霉素(25mg/ml)培養(yǎng)皿上。將菌落重懸浮在具有卡那霉素(25mg/ml)和IPTG(1mM)的10mlLB中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)3小時(shí)。通過在4℃下在1000xg離心10分鐘收獲細(xì)胞。通過冰凍和融化細(xì)胞沉淀2X溶解細(xì)胞，接著加入1ml的溶解緩沖液(10mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、150mMNaCl、0.1％TritonX100、100μg/mlDNA酶I、100μg/mlRNA酶A和1mg/ml溶菌酶)。在37℃下將混合物培養(yǎng)15分鐘，然后在4℃在1000xg下離心10分鐘。上清液作為可溶性蛋白質(zhì)部分使用。將上清液調(diào)節(jié)到25mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)并在冰上冷卻1小時(shí)。之后通過離心除去生成的絮凝沉淀。在溶液保持清晰時(shí)，再重復(fù)冰浴步驟兩次。此后溶液仍保持澄清。將澄清的溶液裝載到用25mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡的MonoSHR10/10柱(Pharmacia)上。使用0-500mMNaCl梯度洗脫結(jié)合到柱基質(zhì)的堿性蛋白1個(gè)小時(shí)(2ml/分鐘；以2ml為一組分)。把推定的興趣蛋白進(jìn)行SDS-PAGE、吸印到PVDF膜上、考馬斯藍(lán)顯色、切除，并且送到HarvardMicrochem進(jìn)行氨基末端序列分析。把蛋白質(zhì)氨基末端序列和cDNA克隆編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較表明此蛋白質(zhì)為真正的Δ9。和表達(dá)的蛋白質(zhì)相關(guān)的二鐵氧組分(Fox等，1993美國科學(xué)院學(xué)報(bào)90，2486-2490)的分光光度分析以及使用特異性的非血紅素鐵染色劑鑒定(Leong等，1992生物化學(xué)年鑒207，317-320)都確認(rèn)此純化的蛋白質(zhì)是Δ9。部分B多克隆抗血清的產(chǎn)生通過氨基末端測(cè)序鑒定的大腸桿菌產(chǎn)生的Δ9蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE凝膠純化，切除，并放置到凝膠基質(zhì)(Berkeley抗體公司，Richmond，CA)中以便在兔體內(nèi)產(chǎn)生多克隆血清。通過Western分析使用ECL檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham公司)進(jìn)行針對(duì)Δ9的抗體效價(jià)測(cè)定。部分C玉米谷粒Δ9去飽和酶的純化蛋白質(zhì)沉淀使用Warring攪拌器在含有25mM亞硫酸氫鈉和2.5％聚乙烯吡咯烷酮的25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中勻漿后純化玉米谷粒的Δ9。通過紗布過濾粗制的勻漿，離心(10,000xg)0.25小時(shí)并且再一次用紗布過濾上清液。有時(shí)，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀(先20％v/v然后80％v/v沉淀)分級(jí)分離上清液。通過加入50％聚乙二醇溶液(mw＝8000)至終濃度為5和25％v/v來分級(jí)分離由高油種質(zhì)中獲得的提取物。在所有的情況下，以80％硫酸銨或25％聚乙二醇沉淀出Δ9蛋白，然后在25mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)將所得的沉淀進(jìn)行充分透析。陽離子交換層析通過離心澄清上述的已溶解的沉淀物質(zhì)，并加入到在25mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中平衡的MonoSHR10/10柱上。充分洗滌柱后，用0-500mMNaCl梯度洗脫結(jié)合在柱基質(zhì)上的堿性蛋白1小時(shí)(2ml/分鐘以2ml為一組分)。一般來說，通過酶和Western分析測(cè)定在260和350mMNaCl之間洗脫出的Δ9蛋白。透析后，通過?；d體蛋白(ACP)-瓊脂糖和苯基superose層析將該物質(zhì)進(jìn)一步分級(jí)分離。?；d體蛋白-瓊脂糖層析ACP從西格瑪化學(xué)公司購得，并且在連接到小珠上之前于pH4.1下經(jīng)沉淀純化(Rock和Cronan.1981，生物化學(xué)雜志，254，7116-7122)。在包裝插入物中，ACP-瓊脂糖基本上如Pharmacia，Inc.的說明書中所述由把100mgACP共價(jià)結(jié)合到溴化氰激活的瓊脂糖4B小珠上制備。在連接和用甘氨酸封阻剩余位點(diǎn)后，將ACP-瓊脂糖材料裝填進(jìn)HR5/5柱(Pharmacia，Inc.)中，并在25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中平衡。然后將以上鑒別的透析了的組分裝到柱上(McKeon和Stumpf，1982生物化學(xué)雜志257，12141-12147；Thompson等，1991美國科學(xué)院學(xué)報(bào)88，2578-2582)。在充分洗滌柱后，采用1MNaCl洗脫ACP結(jié)合蛋白質(zhì)。酶分析和western分析和接下來的氨基末端測(cè)序表明流出液含有Δ9蛋白質(zhì)。從玉米純化的Δ9蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分析確定具有大約38kDa的分子量(Hames，1981蛋白質(zhì)的凝膠電泳實(shí)用方法，編者HamesBD和Rickwood，D.，IRL出版社，牛津)。苯基瓊脂糖層析將含有從ACP-瓊脂糖柱獲得的Δ9的組分調(diào)節(jié)至0.4M硫酸銨(25mM磷酸鈉，pH7.0)，并且加到Phamacia苯基瓊脂糖柱上(HR10/10)。蛋白質(zhì)經(jīng)2毫升/分鐘的1小時(shí)梯度(0.4-0.0M硫酸銨)洗脫。通過酶分析和western分析測(cè)定時(shí)，Δ9蛋白質(zhì)典型地在60-30mM硫酸銨之間洗脫。實(shí)施例32作為用Δ9去飽和酶核酶轉(zhuǎn)化植物的結(jié)果葉片中硬脂酸增加的證據(jù)部分A用于測(cè)定植物組織中硬脂酸水平的方法。從植物組織抽提和酯化脂肪酸的方法從一種描述過的方法改進(jìn)(Browse等，1986，分析生物化學(xué)，152，141-145)。將1至20毫克的植物組織放置在Pyrex13mm螺旋塞試管中。在加入1毫升HCl甲醇溶液(Supelco，Bellefonte)后，用氮?dú)獯翟嚬懿⒚芊?。將試管?0℃下加熱1小時(shí)并使其冷卻。在HCl甲醇溶液存在下的加熱導(dǎo)致脂肪酸的抽提和酯化。通過以己烷抽提從反應(yīng)混合物除去脂肪酸甲酯。加入1毫升己烷和0.9％(W/V)NaCl，接著劇烈振蕩試管。在2000rpm下離心試管5分鐘后，移出上部己烷層，用于脂肪酸甲酯分析。通過將1微升樣品注射到HewlettPackard(Wilmington，DE)II系5890型氣相層析儀中進(jìn)行分析，該層析儀裝備有火焰電離檢測(cè)器和J&amp;WScientific(Folsom，CA)DB-23柱。爐溫在操作過程中是150℃，載氣(氦)流速是80cm/秒，操作時(shí)間是20分鐘。該條件使得可以分離5種興趣脂肪酸甲酯C160，棕櫚酸甲酯；C180，硬脂酸甲酯；C181，油酸甲酯；C182，亞油酸甲酯；和C183，亞麻酸甲酯。用HewlettPackardII系3396型積分儀和PENelson(PerkinElmer，Norwalk，CT)數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集和分析。樣品中每一種脂肪酸的百分比直接從數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)的讀數(shù)取得。每一種脂肪酸的數(shù)量用標(biāo)準(zhǔn)物(Matreya，PleasantGap，PA)的峰面積計(jì)算，所說標(biāo)準(zhǔn)物由已知量的五種已知脂肪酸甲酯組成。所計(jì)算的量用來估計(jì)在樣品中由五種脂肪酸代表的總鮮重的百分比。在抽提和酯化過程期間不調(diào)整喪失的脂肪酸。在進(jìn)行抽提和酯化過程(沒有組織存在)后，標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率在90％到100％范圍內(nèi)，取決于樣品原始的量。植物組織在抽提混合物中的存在對(duì)已知量的標(biāo)準(zhǔn)物的同收沒有任何影響。部分B由于引入Δ9去飽和酶核酶在葉片中增加硬脂酸的證明。如部分A所述試驗(yàn)個(gè)體植物葉片組織的硬脂酸。試驗(yàn)了用活性Δ9去飽和酶核酶(RPA85、RPA114、RPA118)轉(zhuǎn)化的35個(gè)系的428種植物和用Δ9去飽和酶非活性核酶(RPA113、RPA115、RPA119)轉(zhuǎn)化的31個(gè)系的406種植物。表XI總結(jié)了獲得的這些植物中的硬脂酸水平的結(jié)果。7％的活性系的植物具有高于3％的硬脂肪酸水平，2％具有高于5％的水平。僅有3％的非活性系的植物具有高于3％的硬脂肪酸水平。2％的對(duì)照植物的葉片具有高于3％的硬脂肪酸水平。對(duì)照包括49種非轉(zhuǎn)化的植物和73種用與Δ9去飽和酶不相關(guān)的基因轉(zhuǎn)化的植物。沒有非活性系植物和對(duì)照植物具有高于4％的硬脂酸。以活性Δ9去飽和酶核酶RPA85轉(zhuǎn)化的兩個(gè)系產(chǎn)生許多植物，它們顯示出葉片的硬脂酸增加。RPA85-06系15個(gè)植物中的6個(gè)測(cè)得具有在3和4％之間的硬脂酸水平，約是對(duì)照平均值的2倍(圖30)。對(duì)照植物(122種植物)的平均硬脂肪酸含量是1.69％(SD+/-0.49％)。RPA85-06系的平均硬脂酸含量是2.86％(+/-0.57％)。RPA85-15系15個(gè)植物中的6個(gè)測(cè)得具有高于對(duì)照平均水平約4倍的硬脂酸水平(圖31)。RPA85-15系平均葉片硬脂肪酸含量是3.83％(+/-2.53)。當(dāng)重復(fù)對(duì)RPA85-15植物進(jìn)行葉片分析時(shí)，以前已證明具有正常硬脂酸水平的植物葉片中的硬脂酸水平仍保持正常，具有高硬脂酸的植物葉片被再次發(fā)現(xiàn)具有高硬脂酸含量(圖31)。在圖32和33中顯示了用非活性的Δ9去飽和酶核酶RPA113轉(zhuǎn)化的兩個(gè)系的植物葉片中的硬脂酸水平。RPA113-06具有硬脂酸含量為3％或更高的3種植物。RPA113-06系的葉片的平均硬脂酸含量水平是2.26％(+/-0.65)。RPA113-17沒有葉片硬脂酸含量大于3％的植物。RPA113-17系的平均葉片硬脂酸含量是1.76％(+/-0.29％)。圖34顯示了15種對(duì)照植物的葉片的硬脂酸含量。這15種對(duì)照植物的平均硬脂肪酸含量是1.70％(+/-0.6％)。當(dāng)與對(duì)照和非活性的Δ9去飽和酶核酶數(shù)據(jù)比較時(shí)，在RPA85-06和RPA85-15中獲得的硬脂肪酸含量的結(jié)果說明由于引入Δ9去飽和酶核酶增加了硬脂酸含量。實(shí)施例33高硬脂酸性狀在葉片中的遺傳部分A高硬脂酸植物后代的硬脂酸水平的結(jié)果。如本文描述，使RPA85-15系植物授粉。在授粉后20天，從這些RPA85-15植物的未成熟谷粒上切下合子胚，并且如本文的描述置于管中培養(yǎng)基上供再生苗的生長。在植物轉(zhuǎn)移到溫室之后，對(duì)葉片組織進(jìn)行脂肪酸分析。圖35顯示了一種雜交的、自體受精的RPA85-15.07的10種不同植物葉片的硬脂酸水平。50％植物具有高的葉片硬脂酸，50％的具有正常的葉片硬脂酸。表XII顯示了5種不同雜交的RPA85-15植物的結(jié)果。具有高硬脂酸的植物的數(shù)量在20至50％的范圍內(nèi)。部分B說明在表達(dá)針對(duì)Δ9去飽和酶mRNA的核酶的下一代(R1)玉米葉片中Δ9去飽和酶水平降低的結(jié)果。在顯示高硬脂酸含量(見以上部分A)的下一代玉米植物中，采用本文描述的方案從R1玉米葉片部分純化Δ9去飽和酶。對(duì)幾種高硬脂酸植物進(jìn)行Western分析。在下一代植物的葉片中，在具有高硬脂酸含量的植物中觀察到Δ9去飽和酶降低40-50％(圖36)。該降低與R0玉米葉片差不多。這一降低在與RPA85-15花粉雜交的QQ414植物或者自交或近交的RPA85-15植物中觀察到。因此，這說明編碼所述核酶的基因是可遺傳的。實(shí)施例34采用反義Δ9去飽和酶在植物組織中增加硬脂酸部分A用于培養(yǎng)玉米體胚的方法。本文已描述了玉米胚發(fā)生愈傷組織的產(chǎn)生和再生。體胚形成大部分這類胚發(fā)生愈傷組織。體胚在愈傷組織中連續(xù)形成，因?yàn)橛鷤M織每兩周轉(zhuǎn)移一次。體胚在胚發(fā)生愈傷組織中連續(xù)增殖但是通常保持在胚胎發(fā)育的早期階段，這是由于在培養(yǎng)基中含有2，4-D。體胚再生為苗，因?yàn)橛鷤M織經(jīng)歷本文所描述的再生過程。體胚在再生期間形成根和芽，并且終上胚發(fā)育。通過特定培養(yǎng)基處理，使體胚作為種子胚發(fā)育，即，超越見于胚胎發(fā)生愈傷組織的早期發(fā)育階段并不再再生。這一培養(yǎng)基處理包含把胚胎發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS；Murashige和Skoog于1962年描述)中，該培養(yǎng)基含6％(W/V)蔗糖并不含有植物激素。將愈傷組織在具有6％蔗糖的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，然后將體胚單個(gè)地轉(zhuǎn)移到具有6％蔗糖和10μM脫落酸(ABA)的MS培養(yǎng)基中。在ABA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3到7天后，如本文的描述測(cè)定體胚的脂肪酸組成。將在上述培養(yǎng)基上培養(yǎng)的體胚的脂肪酸組成與胚發(fā)生愈傷組織和授粉后12天的玉米合子胚的脂肪酸組成比較(表XIII)。體胚的脂肪酸組成不同于胚發(fā)生愈傷組織的脂肪酸組成。胚發(fā)生愈傷組織具有較高百分比的C160和C183，以及較低百分比的C181和C182。當(dāng)與體胚比較時(shí)，胚發(fā)生愈傷組織由鮮重所代表的脂類百分比不同；0.4％對(duì)4.0％。合子胚和體胚的脂肪酸組成非常相似，它們的由鮮重所代表的脂類百分比幾乎相同。得到的結(jié)論是，以上描述的體胚培養(yǎng)系統(tǒng)將是用于試驗(yàn)?zāi)承┗驅(qū)τ衩装l(fā)育胚中脂類合成影響的有用體外系統(tǒng)。部分B作為引入反義Δ9去飽和酶基因的結(jié)果在玉米體胚中硬脂酸的增加。采用本文描述的方法從用pDAB308/pDAB430轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生愈傷組織產(chǎn)生體胚。測(cè)定16個(gè)不同系的體胚的脂肪酸組成。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)系308/430-12和308/430-15產(chǎn)生具有高水平的硬脂酸的體胚。圖37和38比較了這兩個(gè)系體胚的硬脂酸含與對(duì)照系體胚的硬脂酸含量。除了它們未被轉(zhuǎn)化外，對(duì)照系來自與轉(zhuǎn)化系所來源的系相同的系，對(duì)308/430-12系而言，體胚中的硬脂酸范圍在1至23％，而對(duì)照的范圍在0.5至3％。對(duì)308/430-15系而言，體胚中的硬脂酸范圍在2至15％，而對(duì)照的范圍在0.5至3％。在兩種轉(zhuǎn)化系中，50％以上的體胚具有高于對(duì)照范圍的硬脂酸水平。這些結(jié)果說明反義Δ9去飽和酶基因能夠用來在玉米體胚中提高硬脂酸水平。部分C由于引入反義Δ9去飽和酶基因在葉片中增加硬脂酸的證明。將308/430-12和308/430-15系的胚發(fā)生培養(yǎng)物用于再生植物。采用以前描述的方法分析這些植物葉片的脂肪酸組成。從308/430-15培養(yǎng)物僅獲得4個(gè)植物，這些植物的葉片的硬脂酸水平正常，為1-2％。308/430-12系植物的葉片中的硬脂酸水平顯示在圖39中。在308/430-12系植物中，葉片中的硬脂酸水平在1到13％的范圍內(nèi)。308/430-12系約30％的植物具有超過在對(duì)照中所觀察到的范圍(1-2％)的硬脂酸水平。這些結(jié)果表明通過引入反義Δ9去飽和酶基因可以提高玉米葉片中硬脂酸水平。＂反義＂意指通過RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白質(zhì)核酸；Egholm等，1993，自然，365，566)相互作用結(jié)合到RNA(靶RNA)上并且改變靶RNA活性(綜述見Stein和Cheng，1993，科學(xué)，261，1004)的非酶促核酸分子。實(shí)施例35玉米匯集淀粉樣品和單個(gè)谷粒直鏈淀粉含量的測(cè)定用修改的Hovenkamp-Hermelink等的方法(土豆研究31241-246)測(cè)定直鏈淀粉含量。對(duì)于匯集淀粉樣品，將10mg到100mg淀粉溶解到在塑料培養(yǎng)管中的5ml45％高氯酸中。不時(shí)渦流混合該溶液。1小時(shí)后，用水將0.2毫升淀粉溶液稀釋至10毫升。將0.4毫升稀釋的溶液與0.5毫升稀釋的Lugol’s溶液(Sigma)在1毫升小池中混合。立即獲取在618nm和550nm的讀數(shù)，并計(jì)算R比率(618nm/550nm)。采用從土豆直鏈淀粉和玉米支鏈淀粉(Sigma，St.Louis)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)的方程式P(直鏈淀粉的百分比)＝(4.5R-2.6)/(7.3-3R)，測(cè)定直鏈淀粉的含量。對(duì)于冰凍的單個(gè)谷粒樣品，除了在45％高氯酸中抽提20分鐘而不是1小時(shí)外，采用以上相同的方法。實(shí)施例36淀粉純化和顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)測(cè)定淀粉的純化和接下來的GBSS活性測(cè)定的方法從Shure等(細(xì)胞，35225-233，1983)和Nelson等(植物生理學(xué)，62383-386，1978)的方法修改而來。將玉米谷粒在2倍體積的(v/w)50mMTris-HCl，pH8.0，10mM乙二胺四乙酸中勻漿，并經(jīng)120μm尼龍膜過濾。然后將該材料在5000g下離心2分鐘。棄去上清液。通過重懸于水中并離心除去上清液洗滌沉淀3次。在洗滌之后，淀粉通過20μm尼龍膜過濾并離心。然后冷凍干燥沉淀并儲(chǔ)存在-20℃下直到用于活性測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)的GBSS反應(yīng)混合物包含在總體積200μl中的0.2MTricine，pH8.5、25mM谷胱甘肽、5mM乙二胺四乙酸、1mM14CADPG(6nci/μmol)以及10mg淀粉。反應(yīng)在37℃下進(jìn)行5分鐘，并且通過加入200μl0.1MKCl中的70％乙醇(V/V)終止反應(yīng)。離心該材料，并除去在上清液中的未摻入的ADPG。以相同的方式用1毫升水洗滌沉淀4次。在洗滌后，將沉淀懸浮在500微升水中，并置于閃爍管中，經(jīng)Beckman(Fullerton，CA)閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)所摻入的ADPG。以每分鐘摻入到每毫克淀粉中的ADPG的皮摩爾數(shù)給出比活性。實(shí)施例37反義GBSS植物的分析由于R2種子的分離，應(yīng)當(dāng)分析單個(gè)谷粒的直鏈淀粉含量以鑒別表型。由于在這種研究中產(chǎn)生大量的樣品，因此使用兩步篩選策略。在第一步驟中，從相同的穗隨機(jī)取得30個(gè)谷粒，冷凍干燥并均化成淀粉面。對(duì)這一淀粉面進(jìn)行直鏈淀粉測(cè)定。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析鑒別具有降低的直鏈淀粉含量的系。在第二步驟中，進(jìn)一步分析在具有降低的直鏈淀粉含量的系中的單個(gè)谷粒的直鏈淀粉含量(每穗25到50個(gè)谷粒)。將兩組對(duì)照用于篩選中，一組是具有相同的遺傳背景的未轉(zhuǎn)化的系，另一組是因分離而不攜帶轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化的系(Southern分析陰性系)。在匯集淀粉水平上測(cè)定代表16個(gè)轉(zhuǎn)化事件的81個(gè)系。在這些系中，鑒定出經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析具有明顯降低的直鏈淀粉含量的6個(gè)系供進(jìn)一步的單個(gè)谷粒分析。有一個(gè)系即308/425-12.2.1，顯示出明顯降低的直鏈淀粉含量(圖40)。分析CQ806(一種常規(guī)的玉米近交系)的25種單個(gè)谷粒。CQ806的直鏈淀粉含量在24.4％至32.2％的范圍內(nèi)，平均為29.1％。直鏈淀粉含量的單個(gè)谷粒分布稍微向較低直鏈淀粉含量傾斜。分析了308/425-12.2.1.1的49個(gè)單個(gè)谷粒。倘若308/425-12.2.1.1來自半合子個(gè)體的自我授粉，則預(yù)期的分布將由以相等的頻率存在的4個(gè)明顯不同的遺傳類別組成，因?yàn)榕呷槭侨扼w組織。這4個(gè)遺傳類別由攜帶0、1、2和3個(gè)拷貝的反義構(gòu)建體的個(gè)體組成。如果存在轉(zhuǎn)基因的大劑量的作用，則直鏈淀粉含量的分布將是四種形式的。形成的分布的一種形式應(yīng)該是與非轉(zhuǎn)基因親本不能區(qū)別的。如果沒有轉(zhuǎn)基因劑量作用(攜帶1、2或3個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因的個(gè)體是表型上等同的)，則分布應(yīng)該是兩種形式的，其中之一與親本相同。包含在這些形式中的個(gè)體的數(shù)量應(yīng)該是轉(zhuǎn)基因親本3∶1。308/425-12.2.1.1的分布明顯是三種形式的。中心形式大約是任一其它形式的兩倍。兩種遠(yuǎn)側(cè)形式大小大約相等。檢驗(yàn)了對(duì)1∶2∶1比例的擬合優(yōu)度，擬合良好。說明具有最高直鏈淀粉含量的形式與非轉(zhuǎn)基因親本相同的進(jìn)一步的證據(jù)是可獲得的。這采用判別式分析進(jìn)行。將CQ806和308/425-12.2.1.1數(shù)據(jù)組結(jié)合起來進(jìn)行這種分析。用于進(jìn)行分析的距離量度僅采用直鏈淀粉含量計(jì)算。在所有檢驗(yàn)中都采用個(gè)體分析所得出的估計(jì)方差。沒有采用匯集方差。檢驗(yàn)原始數(shù)據(jù)供再分類。根據(jù)判別式分析，具有最高直鏈淀粉含量的308/425-12.2.1.1分布的整個(gè)形式將更適當(dāng)?shù)胤诸悶橛H本。這有力地證實(shí)了這種分布形式屬親本。在剩下的兩種形式中，中心形式約是最低直鏈淀粉含量形式的大小的兩倍。如果中心形式包括兩種遺傳類型(具有1或2個(gè)拷貝的反義構(gòu)建體的個(gè)體)，則它是所預(yù)期的。因此，具有最低直鏈淀粉含量的形式代表反義構(gòu)建體充分純合(3個(gè)拷貝)的那些個(gè)體。檢驗(yàn)2∶1比率，根據(jù)數(shù)據(jù)不能排除該比例。這種分析表明在308/425-12.2.1.1中起作用的反義GBSS基因使玉米谷粒直鏈淀粉含量達(dá)到劑量依賴性降低。實(shí)施例38核酶GBSS植物的分析用于與反義研究(實(shí)施例37)中相同的兩步篩選策略分析核酶GBSS植物。在匯集淀粉水平上測(cè)定代表11個(gè)轉(zhuǎn)化事件的160個(gè)系。在對(duì)照系(未轉(zhuǎn)化的系和Southern陰性系兩者)中，直鏈淀粉含量在28％至19％內(nèi)變化。在攜帶核酶基因的所有系(Southern陽性系)中沒有觀察到任何明顯的降低。在單個(gè)谷粒水平上進(jìn)一步分析20個(gè)以上的選擇的系，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的直鏈淀粉降低以及分離模式。很明顯，核酶未引起表型水平的任何改變。進(jìn)一步測(cè)定轉(zhuǎn)化系的GBSS活性(如實(shí)施例36的描述)。對(duì)各系而言，從冷凍的穗取得30個(gè)谷粒，并純化淀粉。表XIV顯示在匯集淀粉樣品中代表GBSS活性一種轉(zhuǎn)化事件的9個(gè)植物的結(jié)果，在匯集淀粉樣品中直鏈淀粉含量的結(jié)果以及Southern分析的結(jié)果。將三種Southern陰性系RPA63.0283、RPA63.0236和RPA63.0219用作對(duì)照。對(duì)照系RPA63.0283、RPA63.0236和RPA63.0219的GBSS活性大約為300單位/mg淀粉。在RPA63.0211、RPA63.0218、RPA63.0209以及RPA63.0210系中，觀察到GBSS活性的降低超過30％。在這一組(表XIV的從RPA63.0314到RPA63.0210)中改變的GBSS活性與Southern分析的相關(guān)性說明降低的GBSS活性由摻入到玉米基因組中的核酶基因的表達(dá)引起。采用RPA63.0306(在匯集淀粉中Southern陰性，GBSS活性正常)作為對(duì)照，進(jìn)一步測(cè)定RPA63.0218系(在匯集淀粉中Southern陽性，GBSS活性降低)的單個(gè)谷粒水平上的GBSS活性。從每系取得約30個(gè)谷粒，從每個(gè)谷粒中分別純化淀粉樣品。圖41清楚表明與RPA63.0306比較RPA63.0218系中的GBSS活性降低。其他實(shí)施方案在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。表1天然存在的核酶的特征I組內(nèi)含子*大小～150到大于1000個(gè)核苷酸。*需要靶序列中緊靠切割位點(diǎn)5’有一個(gè)U。*在切割位點(diǎn)5’-側(cè)結(jié)合4-6個(gè)核苷酸。*反應(yīng)機(jī)理由鳥苷的3’-OH進(jìn)攻，產(chǎn)生具有3’-OH和5’-鳥苷的切割產(chǎn)物。*在某些情況下，需要附加的蛋白質(zhì)輔因子以幫助折疊和保持活性結(jié)構(gòu)[1]。*在這一類中有超過300個(gè)已知成員。在TetrahymenathermophilarRNA、真菌線粒體、葉綠體、噬菌體T4、藍(lán)綠藻等中作為一種間插序列被發(fā)現(xiàn)。*主要的結(jié)構(gòu)特征很大程度上通過種系發(fā)生比較、誘變和生物化學(xué)研究[2，3]建立。*對(duì)一種核酶建立了完全的動(dòng)力框架[4，5，6，7]。*核酶折疊和底物?？垦芯空谶M(jìn)行[8，9，10]。*重要?dú)埢幕瘜W(xué)修飾研究完全建立[11，12]。*小的(4-6nt)結(jié)合位點(diǎn)可以使得這一核酶對(duì)靶RNA切割特異性過差。然而，TetrahymenaI組內(nèi)含子已用于修復(fù)“缺陷”β半乳糖苷酶信息(通過將新的β-半乳糖苷酶序列連接到缺陷信息上)[13]。RNA酶PRNA(M1RNA)*大小～290至400個(gè)核苷酸。*一種遍在核糖核蛋白酶的RNA部分。*切割tRNA前體形成成熟的tRNA[14]。*反應(yīng)機(jī)理可能由M2+-OH進(jìn)攻，產(chǎn)生具有3’-OH和5’-磷酸的切割產(chǎn)物。*所有原核生物與真核生物中都發(fā)現(xiàn)RNA酶P。RNA亞單位已從細(xì)菌、酵母、嚙齒動(dòng)物和靈長類動(dòng)物測(cè)序。*通過將外部指導(dǎo)序列(EGS)雜交到靶RNA上，內(nèi)源RNA酶P的治療用途是可能的[15，16]。*重要的磷酸和2’-OH接觸最近被確定[17，18]。II組內(nèi)含子*大小大于1000個(gè)核苷酸。*靶RNA的反式切割最近被闡明[19，20]。*序列要求未完全確定。*反應(yīng)機(jī)理內(nèi)部腺苷的2’-OH產(chǎn)生具有3’-OH和＂套索＂RNA(含有3’-5’和2’-5’支化點(diǎn))的切割產(chǎn)物。*僅有天然核酶被證明除RNA切割和連接外參與DNA切割[21，22]。*主要的結(jié)構(gòu)特征很大程度上通過種系發(fā)生比較建立[23]。*重要的2’OH接觸開始被鑒別[24]。*動(dòng)力學(xué)框架在建立中[25]。脈孢菌VSRNA*大小～144個(gè)核苷酸。*發(fā)夾靶RNA的反式切割最近被闡明[26]。*序列要求未完全確定。*反應(yīng)機(jī)理由2’-OH進(jìn)攻易切斷的鍵的5’，產(chǎn)生具有2’，3’-環(huán)狀磷酸和5’-OH末端的切割產(chǎn)物。*結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)要求未完全確定。*這一組僅1個(gè)已知成員。在脈孢菌VSRNA中發(fā)現(xiàn)。錘頭核酶(參考文獻(xiàn)見正文)*大小～13至40個(gè)核苷酸。*要求在緊靠切割位點(diǎn)5’有靶序列UH。*在切割位點(diǎn)的兩側(cè)結(jié)合可變數(shù)量的核苷酸。*反應(yīng)機(jī)理由2’-OH進(jìn)攻易切斷的鍵的5’，產(chǎn)生具有2’，3’-環(huán)狀磷酸和5’-OH末端的切割產(chǎn)物。*這一組已知14個(gè)成員。在一些用RNA作為感染體的植物病原體(擬病毒)中發(fā)現(xiàn)。*重要的結(jié)構(gòu)特性大部分已確定，包括2種晶體結(jié)構(gòu)[]。*闡明了最小連接活性(以便通過體外選擇進(jìn)行加工)[]。*對(duì)兩種或多種核酶建立了完全的動(dòng)力學(xué)框架[]。*對(duì)重要?dú)埢幕瘜W(xué)修飾研究完全建立[]。發(fā)夾核酶*大小～50個(gè)核苷酸。*緊靠切割位點(diǎn)3’要求有靶序列GUC。*在切割位點(diǎn)的5’側(cè)結(jié)合4-6個(gè)核苷酸，在切割位點(diǎn)的3’側(cè)結(jié)合可變數(shù)量的核苷酸。*反應(yīng)機(jī)理由2’-OH進(jìn)攻易切斷的鍵，產(chǎn)生具有2’，3’-環(huán)狀磷酸和5’-OH末端的切割產(chǎn)物。*這一組已知3種成員。在一些用RNA作為感染體的植物病原體(煙草環(huán)斑病毒、arabis斑紋病毒和菊苣黃色色澤斑駁病毒的衛(wèi)星RNA)中發(fā)現(xiàn)。*重要結(jié)構(gòu)特征大部分已被限定[27，28，29，30]。*連接活性(除了切割活性外)使得核酶適合于經(jīng)體外選擇進(jìn)行加工[31]。*對(duì)一種核酶建立了完全的動(dòng)力學(xué)框架[32]。*開始了重要?dú)埢幕瘜W(xué)修飾研究[33，34]。肝炎Δ病毒(HDV)核酶*大小～60個(gè)核苷酸。*闡明了靶RNA的反式切割[35]。*雖然切割位點(diǎn)5’不需要任何序列，結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)要求未完全確定。折疊核酶包含假角蛋白結(jié)構(gòu)[36]。*反應(yīng)機(jī)理由2’-OH進(jìn)攻易切斷的鍵的5’，產(chǎn)生具有2’，3’-環(huán)狀磷酸和5’-OH末端的切割產(chǎn)物。*這一組僅2種已知成員。在人類HDV中發(fā)現(xiàn)。*HDV的環(huán)形式是活性的，并且顯示出增加的核酸酶穩(wěn)定性[37]。1.Mohr.G.；Caprara.M.G.；Guo，Q.；Lambowitz.A.M.Nature，370，147-150(1994).2.Michel，F(xiàn)rancois；Westhof，Eric.Slipperysubstrates.Nat.Struct.Biol.(1994)，1(1)，5-7.3.Lisacek，F(xiàn)rederique；Diaz，Yolande；Michel，F(xiàn)rancois.AutomaticidentificationofgroupIintroncoresingenomicDNAsequences.J.Mol.Biol.(1994)，235(4).1206-17.4.Herschlag，Daniel；Cech.ThomasR.，CatalysisofRNAcleavagebytheTetrahvmenathermophilaribozyme.1.KineticdescriptionofthereactionofanRNAsubstratecomplementarytotheactivesite.Biochemistry(1990)，29(44)，10159-71.5.Herschlag.Daniel；Cech.ThomasR.，CatalysisofRNAcleavagebytheTetrahymenathermophilaribozyme.2.KineticdescriptionofthereactionofanRNAsubstratethatformsamismatchattheactivesite.Biochemistry(1990)，29(44)，10172-80.6.Knitt.DeborahS.；Herschlag.Daniel.pHDependenciesoftheTetrahymenaRibozymeRevealanUnconventionalOriginofanApparentpKa.Biochemistry(1996).35(5).1560-70.7.Bevilacqua，PhilipC.；Sugimoto.Naoki；Turner，DouglasH.，AmechanisticframeworkforthesecondstepofsplicingcatalyzedbytheTetrahymenaribozyme.Biochemistry(1996)，35(2)，648-58.8.Li，Yi；Bevilacqua，PhilipC.；Mathews.David；Turner.DouglasH.，Thermodynamicandactivationparametersforbindingofapyrene-labeledsubstratebytheTetrahymenaribozymedockingisnotdiffusion-controlledandisdrivenbyafavorableentropychange.Biochemistry(1995)，34(44)，14394-9.9.Banerjee，AlokeRaj；Tumer.DouglasH.，ThetimedependenceofchemicalmodificationrevealsslowstepsinthefoldingofagroupIribozyme.Biochemistry(1995)，34(19)，6504-12.10.Zarrinkar，PatrickP.；Williamson.JamesR.，TheP9.1-P9.2peripheralextensionhelpsguidefoldingoftheTetrahymenaribozyme.NucleicAcidsRes.(1996)，24(5)，854-8.11.StrobeLScottA.；Cech.ThomasR.，MinorgrooverecognitionoftheconservedG.cntdot.UpairattheTetrahymenaribozymereactionsite.Science(Washington.D.C.)(1995)，267(5198)，675-9.12.Strobel.ScottA.；Cech，ThomasR.，ExocyclicAmineoftheConservedG.cntdot.UPairattheCleavageSiteoftheTetrahymenaRibozymeContributesto5′-SpliceSiteSelectionandTransitionStateStabilization.Biochemistry(1996)，35(4)，1201-11.13.Sullenger，BruceA.；Cech，ThomasC.Ribozyme-mediatedrepairofdefectivemRNAbytargetedtrans-splicing.Nature(London)(1994).371(6498)，619-22.14.Robertson.H.D.；Altman，S.；Smith，J.D.J.Biol.Chem.，247，5243-5251(1972).15.Forster，AnthonyC.；Alrman.Sidney.ExternalguidesequencesforanRNAenzyme.Science(Washington，D.C.，1883-)(1990)，249(4970)，783-6.16.Yuan，Y.；Hwang，E.S.；Altman.S.TargetedcleavageofmRNAbyhumanRNaseP.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89，8006-10.17.Harris，MichaelE.；Pace.NormanR.，IdentificationofphosphatesinvolvedincatalysisbytheribozymeRNasePRNA.RNA(1995)，1(2)，210-18.18.Pan，Tao；Loria.Andrew；Zhong.Kun.ProbingoftertiaryinteractionsinRNA2′-hydroxyl-basecontactsbetweentheRNasePRNAandpre-tRNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1995).92(26).12510-14.19.Pyle，AnnaMarie；Green.JustinB..BuildingaKineticFrameworkforGroupIIIntronRibozymeActivityQuantitationofInterdomainBindingandReactionRate.Biochemistry(1994)，33(9)，2716-25.20.Michels.WilliamJ.Jr.；Pyle，AnnaMarie.ConversionofaGroupIIlntronintoaNewMultiple-TurnoverRibozymethatSelectivelyCleavesOligonucleotidesElucidationofReactionMechanismandStructure/FunctionRelationships.Biochemistry(1995)，34(9)，2965-77.21.Zimmerly，Steven；Guo.Huarao；Eskes.Robert；Yang.Jian；Periman.PhilipS.；Lambowittz.AlanM..AgroupIIintronRNAisacatalyticcomponentofaDNAendonucleaseinvolvedinintronmobiliry.Cell(Cambridge.Mass.)(1995)，83(4)，529-38.22.Griffin.EdmundA.，Jr.；Qin，Zhifeng；Michels.WilliamsJ.，Jr.；Pyle.AnnaMarie.GroupIIintronribozymesthatcleaveDNAandRNAlinkageswithsimilarefficiency.andlackcontactswithsubstrate2’-hydroxylgroups.Chem.Biol.(1995)，2(11).761-70.23.Michel.Francois；Ferat.JeanLuc.StructureandactivitiesofgroupIIintrons.Annu.Rev.Biochem.(1995)，64，435-61.24.Abramovitz.DanaL.；Friedman.RichardA.；Pyle.AnnaMarie.Catalyticroleof2’-hydroxylgroupswithinagroupIIintronactivesite.Science(Washington，D.C.)(1996)，271(5254)，1410-13.25.Daniels.DanetteL.；Michels.WilliamJ.，Jr.；Pyle.AnnaMarie.Twocompetingpathwaysforself-splicingbygroupIIintrons；aquantitativeanalysisofinvitroreactionratesandproducts.J.Mol.Biol.(1996)，256(1)，31-49.26.Guo.HansC.T.；Collins，RichardA.Efficienttrans-cleavageofastem-loopRNAsubstratebyaribozymederivedfromNeurosporaVSRNA.EMBOJ.(1995)，14(2)，368-76.27.Hampel.Arnold；TritzRichard；Hicks.Margaret；Cruz.Phillip.′Hairpin′catalyticRNAmodelevidenceforhelixesandsequencerequitementforsubstrateRNA.NucleicAcidsRes.(1990)，18(2)，299-304.28.Chowrira，BharatM.；Berzal-Herranz，Alfredo；Burke，JohnM.，Novelguanosinerequirementforcatalysisbythehairpinribozyme.Nature(London)(1991)，354(6351)，320-2.29，Berzal-Herranz，Alfredo；Joseph，Simpson；Chowrira.BharatM.；Butcher.SamuelE.；Burke，JohnM.，Essentialnucleotidesequencesandsecondarystructureelementsofthehairpinribozyme.EMBO1.(1993)，12(6)，2567-73.30.Joseph，Simpson；Berzal-Herranz，Alfredo；Chowrira，BharatM.；Butcher.SamuelE.，Substrateselectionrulesforthehairpinribozymedeterminedbyinvitroselection.mutation.andanalysisofmismatchedsubstrates.GenesDev.(1993)，7(1)，130-8.31.Berzal-Herranz，Alfredo；Joseph，Simpson；Burke.JohnM.，InvitroselectionofactivehairpinribozymesbysequentialRNA-catalyzedcleavageandligationreactions.GenesDev.(1992)，6(1)，129-34.32.Hegg.LisaA.；Fedor，MarthaJ.，KineticsandThermodynamicsofIntermolecularCatalysisbyHairpinRibozymes.Biochemisuy(1995)，34(48)，15813-28.33.Grasby，JaneA.；Mersmann，Karin；Singh，Mohinder；Gait.MichaelJ.，PurineFunctionalGroupsinEssentialResiduesoftheHairpinRibozymeRequiredforCatalyticCleavageofRNA.Biochemistry(1995)，34(12)，4068-76.34.Schmidt.Sabine；Beigelman，Leonid；Karpeisky，Alexander；Usman.Nassim；Sorensen，UlrikS.；Gait，MichaelJ.，BaseandsugarrequirementsforRNAcleavageofessentialnucleosideresiduesininternalloopBofthehairpinribozymeimplicationsforsecondarystructure.NucleicAcidsRes.(1996)，24(4)，573-81.35.Perrotta.AnneT.；Been.MichaelD.，Cleavageofoligoribonucleotidesbyaribozymederivedfromthehepatitis.delta.virusRNAsequence.Biochemistry(1992)，31(1)，16-21.36.Perrotta，AnneT.；Been，MichaelD.，Apseudoknot-likestructurerequiredforefficientself-cleavageofhepatitisdeltavirusRNA.Nature(London)(1991)，350(6317)，434-6.37.Puttaraju.M.；Perrotta.AnneT.；Been，MichaelD.，Acirculartrans-acringhepatitisdeltavirusribozyme.NucleicAcidsRes.(1993)，21(18)，4253-8.表II2.5μmolRNA合成循環(huán)</tables>*等待時(shí)間不包括釋放期間的接觸時(shí)間。表IIIA表IIIAGBSS錘頭底物序列nt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.12CGAUCGAUCGCCACAGC26538GGUCGUCUCUCCCCGCU2768GAAGGAAUAAACUCACU28540UCGUCUCUCCCCGCUAC2973AAUAAACUCACUGCCAG30547UCCCCGCUACGACCAGU31103AGAAGUGUACUGCUCCG32556CGACCAGUACAAGGACG33109GUACUGCUCCGUCCACC34581ACCAGCGUCGUGUCCGA35113UGCUCCGUCCACCAGUG36586CGUCGUGUCCGAGAUCA37146GGGCUGCUCAUCUCGUC38593UCCGAGAUCAAGAUGGG39149CUGCUCAUCUCGUCGAC40610AGACAGGUACGAGACGG41151GCUCAUCUCGUCGACGA42620GAGACGGUCAGGUUCUU43154CAUCUCGUCGACGACCA44625GGUCAGGUUCUUCCACU45169CAGUGGAUUAAUCGGCA46626GUCAGGUUCUUCCACUG47170AGUGGAUUAAUCGGCAU48628CAGGUUCUUCCACUGCU49173GGAUUAAUCGGCAUGGC50629AGGUUCUUCCACUGCUA51186UGGCGGCUCUAGCCACG52637CCACUGCUACAAGCGCG53188GCGGCUCUAGCCACGUC54661CCGCGUGUUCGUUGACC55196AGCCACGUCGCAGCUCG56662CGCGUGUUCGUUGACCA57203UCGCAGCUCGUCGCAAC58665GUGUUCGUUGACCACCC59206CAGCUCGUCGCAACGCG60679CCCACUGUUCCUGGAGA61230CUGGGCGUCCCGGACGC62680CCACUGUUCCUGGAGAG63241GGACGCGUCCACGUUCC64692GAGAGGGUUUGGGGAAA65247GUCCACGUUCCGCCGCG66693AGAGGGUUUGGGGAAAG67248UCCACGUUCCGCCGCGG68716GAGAAGAUCUACGGGCC69292GACGGCGUCGGCGGCGG70718GAAGAUCUACGGGCCUG71308GACACGCUCAGCAUUCG72742AACGGACUACAGGGACA73314CUCAGCAUUCGGACCAG74763GCUGCGGUUCAGCCUGC75315UCAGCAUUCGGACCAGC78764CUGCGGUUCAGCCUGCU77344CCCAGGCUCCAGCACCA78773AGCCUGCUAUGCCAGGC79385GGCCAGGUUCCCGUCGC80788GCAGCACUUGAAGCUCC81386GCCAGGUUCCCGUCGCU82795UUGAAGCUCCAAGGAUC83391GUUCCCGUCGCUCGUCG84803CCAAGGAUCCUGAGCCU85395CCGUCGCUCGUCGUGUG86812CUGAGCCUCAACAACAA87398UCGCUCGUCGUGUGCGC88826CAACCCAUACUUCUCCG89425AUGAACGUCGUCUUCGU90829CCCAUACUUCUCCGGAC91428AACGUCGUCUUCGUCGG92830CCAUACUUCUCCGGACC93430CGUCGUCUUCGUCGGCG94832AUACUUCUCCGGACCAU95431GUCGUCUUCGUCGGCGC96841CGGACCAUACGGGGAGG97434GUCUUCGUCGGCGCCGA98854GAGGACGUCGUGUUCGU99473GGCGGCCUCGGCGACGU100859CGUCGUGUUCGUCUGCA101482GGCGACGUCCUCGGCGG102850GUCGUGUUCGUCUGCAA103485GACGUCCUCGGCGGCCU104863GUGUUCGUCUGCAACGA105527CACCGUGUCAUGGUCGU106888CCGGCCCUCUCUCGUGC107533GUCAUGGUCGUCUCUCC108890GGCCCUCUCUCGUGCUA109536AUGGUCGUCUCUCCCCG110892CCCUCUCUCGUGCUACC111898CUCGUGCUACCUCAAGA1121241AUGGACGUCAGCGAGUG113902UGCUACCUCAAGAGCAA1141270GGACAAGUACAUCGCCG115913GAGCAACUACCAGUCCC1161274AAGUACAUCGCCGUGAA117919CUACCAGUCCCACGGCA1181285CGUGAAGUACGACGUGU119929CACGGCAUCUACAGGGA1201294CGACGUGUCGACGGCCG121931CGGCAUCUACAGGGACG1221346GCGGAGGUCGGGCUCCC123951AGACCGCUUUCUGCAUC1241352GUCGGGCUCCCGGUGGA125952GACCGCUUUCUGCAUCC1261370CGGAACAUCCCGCUGGU127953ACCGCUUUCUGCAUCCA1281384GGUGGCGUUCAUCGGCA129表IIIAnt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.959UUCUGCAUCCACAACAU1301385GUGGCGUUCAUCGGCAG131968CACAACAUCUCCUACCA1321388GCGUUCAUCGGCAGGCU133970CAACAUCUCCUACCAGG1341421CCCGACGUCAUGGCGGC135973CAUCUCCUACCAGGGCC1361436GCCGCCAUCCCGCAGCU137985GGGCCGGUUCGCCUUCU1381445CCGCAGCUCAUGGAGAU139986GGCCGGUUCGCCUUCUC1401472GUGCAGAUCGUUCUGCU141991GUUCGCCUUCUCCGACU1421475CAGAUCGUUCUGCUGGG143992UUCGCCUUCUCCGACUA1441476AGAUCGUUCUGCUGGGC145994CGCCUUCUCCGACUACC1461501GAAGAAGUUCGAGCGCA1471000CUCCGACUACCCGGAGC1481502AAGAAGUUCGAGCGCAU1491016CUGAACCUCCCGGAGAG1501514CGCAUGCUCAUGAGCGC1511027GGAGAGAUUCAAGUCGU1521534GGAGAAGUUCCCAGGCA1531028GAGAGAUUCAAGUCGUC1541535GAGAAGUUCCCAGGCAA1551033AUUCAAGUCGUCCUUCG1561559GCCGUGGUCAAGUUCAA1571036CAAGUCGUCCUUCGAUU1581564GGUCAAGUUCAACGCGC1591039GUCGUCCUUCGAUUUCA1601565GUCAAGUUCAACGCGGC1611040UCGUCCUUCGAUUUCAU1621589CACCACAUCAUGGCCGG1631044CCUUCGAUUUCAUCGAC1641610GACGUGCUCGCCGUCAC1651045CUUCGAUUUCAUCGACG1661616CUCGCCGUCACCAGCCG1671046UUCGAUUUCAUCGACGG1681627CAGCCGCUUCGAGCCCU1691049GAUUUCAUCGACGGCUA1701628AGCCGCUUCGAGCCCUG1711057CGACGGCUACGAGAAGC1721643UGCGGCCUCAUCCAGCU1731085CGGAAGAUCAACUGGAU1741646GGCCUCAUCCAGCUGCA1751106GCCGGGAUCCUCGAGGC1761886GAUGCGAUACGGAACGC1771109GGGAUCCUCGAGGCCGA1781690CUGCGCGUCCACCGGUG1791124GACAGGGUCCUCACCGU1801703GGUGGACUCGUCGACAC1811127AGGGUCCUCACCGUCAG1821706GGACUCGUCGACACCAU1831133CUCACCGUCAGCCCCUA1841715GACACCAUCAUCGAAGG1851141CAGCCCCUACUACGCCG1861718ACCAUCAUCGAAGGCAA1871144CCCCUACUACGCCGAGG1881735GACCGGGUUCCACAUGG1891157GAGGAGCUCAUCUCCGG1901736ACCGGGUUCCACAUGGG1911160GAGCUCAUCUCCGGCAU1921751GGCCGCCUCAGCGUCGA1931162GCUCAUCUCCGGCAUCG1941757CUCAGCGUCGACUGCAA1951169UCCGGCAUCGCCAGGGG1961769UGCAACGUCGUGGAGCC1971187UGCGAGCUCGACAACAU1981787GCGGACGUCAAGAAGGU1991196GACAACAUCAUGCGCCU2001807CACCACCUUGCAGCGCG2011205AUGCGCCUCACCGGCAU2021820CGCGCCAUCAAGGUGGU2031214ACCGGCAUCACCGGCAU2041829AAGGUGGUCGGCACGCC2051223ACCGGCAUCGUCAACGG2061843GCCGGCGUACGAGGAGA2071226GGCAUCGUCAACGGCAU2081871UGCAUGAUCCAGGAUCU209表IIIAnt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.1878UCCAGGAUCUCUCCUGG2102219CGGUAAUUUUAUAUUGC2111880CAGGAUCUCUCCUGGAA2122220GGUAAUUUUAUAUUGCG2131882GGAUCUCUCCUGGAAGG2142221GUAAUUUUAUAUUGCGA2151922GUGCUGCUCAGCCUCGG2162223AAUUUUAUAUUGCGAGU2171928CUCAGCCUCGGGGUCGC2182225UUUUAUAUUGCGAGUAA2191934CUCGGGGUCGCCGGCGG2202232UUGCGAGUAAAUAAAUG2211955CCAGGGGUCGAAGGCGA2222236GAGUAAAUAAAUGGACC2231970GAGGAGAUCGCGCCGCU2242248GGACCUGUAGUGGUGGA2251979GCGCCGCUCGCCAAGGA2262012UGAAGAGUUCGGCCUGC2272013GAAGAGUUCGGCCUGCA2282033CCCCUGAUCUCGCGCGU2292035CCUGAUCUCGCGCGUGG2302055AAACAUGUUGGGACAUC2312063UGGGACAUCUUCUUAUA2322065GGACAUCUUCUUAUAUA2332066GACAUCUUCUUAUAUAU2342068CAUCUUCUUAUAUAUGC2352069AUCUUCUUAUAUAUGCU2362071CUUCUUAUAUAUGCUGU2372073UCUUAUAUAUGCUGUUU2382080UAUGCUGUUUCGUUUAU2392061AUGCUGUUUCGUUUAUG2402082UGCUGUUUCGUUUAUGU2412085UGUUUCGUUUAUGUGAU2422086GUUUCGUUUAUGUGAUA2432087UUUCGUUUAUGUGAUAU2442094UAUGUGAUAUGGACAAG2452104GGACAAGUAUGUGUAGC2462110GUAUGUGUAGCUGCUUG2472117UAGCUGCUUGCUUGUGC2482121UGCUUGCUUGUGCUAGU2492127CUUGUGCUAGUGUAAUA2502132GCUAGUGUAAUAUAGUG2512135AGUGUAAUAUAGUGUAG2522137UGUAAUAUAGUGUAGUG2532142UAUAGUGUAGUGGUGGC2542165CACAACCUAAUAAGCGC2552168AACCUAAUAAGCGCAUG2562181CAUGAACUAAUUGCUUG2572184GAACUAAUUGCUUGCGU2582188UAAUUGCUUGCGUGUGU2592197GCGUGUGUAGUUAAGUA2602200UGUGUAGUUAAGUACCG2612201GUGUAGUUAAGUACCGA2622205AGUUAAGUACCGAUCGG2632211GUACCGAUCGGUAAUUU2642215CGAUCGGUAAUUUUAUA2652218UCGGUAAUUUUAUAUUG266表IIIB表IIIB針對(duì)GBSSmRNA的錘頭核酶序列nt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.12UGGCUGUGGCCUGAUGAXGAAAUCGAUCGGU26768GCAGUGAGUUCUGAUGAXGAAAUUCCUUCCU26873GGCUGGCAGUCUGAUGAXGAAAGUUUAUUCC269103GACGGAGCAGCUGAUGAXGAAACACUUCUCC270109CUGGUGGACGCUGAUGAXGAAAGCAGUACAC271113CGCACUGGUGCUGAUGAXGAAACGGAGCAGU272146UCGACGAGAUCUGAUGAXGAAAGCAGCCCUG273149UCGUCGACGACUGAUGAXGAAAUGAGCAGCC274151GGUCGUCGACCUGAUGAXGAAAGAUGAGCAG275154ACUGGUCGUCCUGAUGAXGAAACGAGAUGAG276169CAUGCCGAUUCUGAUGAXGAAAUCCACUGGU277170CCAUGCCGAUCUGAUGAXGAAAAUCCACUGG278173CCGCCAUGCCCUGAUGAXGAAAUUAAUCCAC279186GACGUGGCUACUGAUGAXGAAAGCCGCCAUG280188GCGACGUGGCCUGAUGAXGAAAGAGCCGCCA281196GACGAGCUGCCUGAUGAXGAAACGUGGCUAG282203GCGUUGCGACCUGAUGAXGAAAGCUGCGACG283206CGCGCGUUGCCUGAUGAXGAAACGAGCUGCG284230ACGCGUCCGGCUGAUGAXGAAACGCCCAGGC285241GCGGAACGUGCUGAUGAXGAAACGCGUCCGG286247GCCGCGGCGGCUGAUGAXGAAACGUGGACGC287248CGCCGCGGCGCUGAUGAXGAAAACGUGGACG288292GUCCGCCGCCCUGAUGAXGAAACGCCGUCCG289308UCCGAAUGCUCUGAUGAXGAAAGCGUGUCCG290314CGCUGGUCCGCUGAUGAXGAAAUGCUGAGCG291315GCGCUGGUCCCUGAUGAXGAAAAUGCUGAGC292344GCUGGUGCUGCUGAUGAXGAAAGCCUGGGCG293385GAGCGACGGGCUGAUGAXGAAACCUGGCCCC294386CGAGCGACGGCUGAUGAXGAAAACCUGGCCC295391CACGACGAGCCUGAUGAXGAAACGGGAACCU296395CGCACACGACCUGAUGAXGAAAGCGACGGGA297398UGGCGCACACCUGAUGAXGAAACGAGCGACG298425CGACGAAGACCUGAUGAXGAAACGUUCAUGC299428CGCCGACGAACUGAUGAXGAAACGACGUUCA300430GGCGCCGACGCUGAUGAXGAAAGACGACGUU301431CGGCGCCGACCUGAUGAXGAAAAGACGACGU302434UCUCGGCGCCCUGAUGAXGAAACGAAGACGA303473GGACGUCGCCCUGAUGAXGAAAGGCCGCCGG304482GGCCGCCGAGCUGAUGAXGAAACGUCGCCGA305485GCAGGCCGCCCUGAUGAXGAAAGGACGUCGC306527AGACGACCAUCUGAUGAXGAAACACGGUGCC307533GGGGAGAGACCUGAUGAXGAAACCAUGACAC308536AGCGGGGAGACUGAUGAXGAAACGACCAUGA309538GUAGCGGGGACUGAUGAXGAAAGACGACCAU310540UCGUAGCGGGCUGAUGAXGAAAGAGACGACC311表IIIBnt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.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表IIIBnt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.970GCCCUGGUAGCUGAUGAXGAAAGAUGUUGUG364973CCGGCCCUGGCUGAUGAXGAAAGGAGAUGUU365985GGAGAAGGCGCUGAUGAXGAAACCGGCCCUG366986CGGAGAAGGCCUGAUGAXGAAAACCGGCCCU367991GUAGUCGGAGCUGAUGAXGAAAGGCGAACCG368992GGUAGUCGGACUGAUGAXGAAAAGGCGAACC369994CGGGUAGUCGCUGAUGAXGAAAGAAGGCGAA3701000CAGCUCCGGGCUGAUGAXGAAAGUCGGAGAA3711016AUCUCUCCGGCUGAUGAXGAAAGGUUCAGCU3721027GGACGACUUGCUGAUGAXGAAAUCUCUCCGG3731028AGGACGACUUCUGAUGAXGAAAAUCUCUCCG3741033AUCGAAGGACCUGAUGAXGAAACUUGAAUCU3751036GAAAUCGAAGCUGAUGAXGAAACGACUUGAA3761039GAUGAAAUCGCUGAUGAXGAAAGGACGACUU3771040CGAUGAAAUCCUGAUGAXGAAAAGGACGACU3781044CCGUCGAUGACUGAUGAXGAAAUCGAAGGAC3791045GCCGUCGAUGCUGAUGAXGAAAAUCGAAGGA3801046AGCCGUCGAUCUGAUGAXGAAAAAUCGAAGG3811049CGUAGCCGUCCUGAUGAXGAAAUGAAAUCGA3821057GGGCUUCUCGCUGAUGAXGAAAGCCGUCGAU3831085UCAUCCAGUUCUGAUGAXGAAAUCUUCCGGC3641106CGGCCUCGAGCUGAUGAXGAAAUCCCGGCCU3851109UGUCGGCCUCCUGAUGAXGAAAGGAUCCCGG3861124UGACGGUGAGCUGAUGAXGAAACCCUGUCGG3871127GGCUGACGGUCUGAUGAXGAAAGGACCCUGU3881133AGUAGGGGCUCUGAUGAXGAAACGGUGAGGA3891141CUCGGCGUAGCUGAUGAXGAAAGGGGCUGAC3901144CUCCUCGGCGCUGAUGAXGAAAGUAGGGGCU3911157UGCCGGAGAUCUGAUGAXGAAAGCUCCUCGG3921160CGAUGCCGGACUGAUGAXGAAAUGAGCUCCU3931162GGCGAUGCCGCUGAUGAXGAAAGAUGAGCUC3941169AGCCCCUGGCCUGAUGAXGAAAUGCCGGAGA3951187UGAUGUUGUCCUGAUGAXGAAAGCUCGCAGC3961196UGAGGCGCAUCUGAUGAXGAAAUGUUGUCGA3971205UGAUGCCGGUCUGAUGAXGAAAGGCGCAUGA3981214CGAUGCCGGUCUGAUGAXGAAAUGCCGGUGA3991223UGCCGUUGACCUGAUGAXGAAAUGCCGGUGA4001226CCAUGCCGUUCUGAUGAXGAAACGAUGCCGG4011241CCCACUCGCUCUGAUGAXGAAACGUCCAUGC4021270CACGGCGAUGCUGAUGAXGAAACUUGUCCCU4031274ACUUCACGGCCUGAUGAXGAAAUGUACUUGU4041285CGACACGUCGCUGAUGAXGAAACUUCACGGC4051294CACGGCCGUCCUGAUGAXGAAACACGUCGUA4061346CCGGGAGCCCCUGAUGAXGAAACCUCCGCCU4071352GGUCCACCGGCUGAUGAXGAAAGCCCGACCU4081370CCACCAGCGGCUGAUGAXGAAAUGUUCCGGU4091384CCUGCCGAUGCUGAUGAXGAAACGCCACCAG4101385GCCUGCCGAUCUGAUGAXGAAAACGCCACCA4111388CCAGCCUGCCCUGAUGAXGAAAUGAACGCCA4121421CGGCCGCCAUCUGAUGAXGAAACGUCGGGUC4131436UGAGCUGCGGCUGAUGAXGAAAUGGCGGCCG4141445CCAUCUCCAUCUGAUGAXGAAAGCUGCGGGA415表IIIBnt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.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.位置HH核酶序列Seq.IDNo.2068CAGCAUAUAUCUGAUGAXGAAAGAAGAUGUC4682069ACAGCAUAUACUGAUGAXGAAAAGAAGAUGU4692071AAACAGCAUACUGAUGAXGAAAUAAGAAGAU4702073CGAAACAGCACUGAUGAXGAAAUAUAAGAAG4712080ACAUAAACGACUGAUGAXGAAACAGCAUAUA4722081CACAUAAACGCUGAUGAXGAAAACAGCAUAU4732082UCACAUAAACCUGAUGAXGAAAAACAGCAUA4742085AUAUCACAUACUGAUGAXGAAACGAAACAGC4752086CAUAUCACAUCUGAUGAXGAAAACGAAACAG4762087CCAUAUCACACUGAUGAXGAAAAACGAAACA4772094UACUUGUCCACUGAUGAXGAAAUCACAUAAA4782104CAGCUACACACUGAUGAXGAAACUUGUCCAU4792110AGCAAGCAGCCUGAUGAXGAAACACAUACUU4802117UAGCACAAGCCUGAUGAXGAAAGCAGCUACA4812121ACACUAGCACCUGAUGAXGAAAGCAAGCAGC4822127UAUAUUACACCUGAUGAXGAAAGCACAAGCA4832132UACACUAUAUCUGAUGAXGAAACACUAGCAC4842135CACUACACUACUGAUGAXGAAAUUACACUAG4852137ACCACUACACCUGAUGAXGAAAUAUUACACU4862142UGGCCACCACCUGAUGAXGAAACACUAUAUU4872165AUGCGCUUAUCUGAUGAXGAAAGGUUGUGCC4882168UUCAUGCGCUCUGAUGAXGAAAUUAGGUUGU4892181CGCAAGCAAUCUGAUGAXGAAAGUUCAUGCG4902184ACACGCAAGCCUGAUGAXGAAAUUAGUUCAU4912188CUACACACGCCUGAUGAXGAAAGCAAUUAGU4922197GGUACUUAACCUGAUGAXGAAACACACGCAA4932200AUCGGUACUUCUGAUGAXGAAACUACACACG4942201GAUCGGUACUCUGAUGAXGAAAACUACACAC4952205UACCGAUCGGCUGAUGAXGAAACUUAACUAC4962211UAAAAUUACCCUGAUGAXGAAAUCGGUACUU4972215AAUAUAAAAUCUGAUGAXGAAACCGAUCGGU4982218CGCAAUAUAACUGAUGAXGAAAUUACCGAUC4992219UCGCAAUAUACUGAUGAXGAAAAUUACCGAU5002220CUCGCAAUAUCUGAUGAXGAAAAAUUACCGA5012221ACUCGCAAUACUGAUGAXGAAAAAAUUACCG5022223UUACUCGCAACUGAUGAXGAAAUAAAAUUAC5032225AUUUACUCGCCUGAUGAXGAAAUAUAAAAUU5042232UCCAUUUAUUCUGAUGAXGAAACUCGCAAUA5052236CAGGUCCAUUCUGAUGAXGAAAUUUACUCGC5062248UUUCCACCACCUGAUGAXGAAACAGGUCCAU507其中＂X＂代表HH核酶的莖II區(qū)(Hertel等，1992，核酸研究，203252)。莖II的長度可以≥2堿基對(duì)。表IV表IV針對(duì)GBSSmRNA試驗(yàn)的HH核酶序列nt.HH核酶序列序列位置I.D.425CGACGAAGACCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUUCAUGC2593CUCCCAUCUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUCUCGGACA3742GUUGUCCCUGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGUCCGUUCC4812GGUUGUUGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGGCUCAGGA5892GAGGUAGCACCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGAGAGGGCC6913GUGGGACUGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGUUGCUCUU7919GAUGCCGUGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUGGUAGUU8953UGUGGAUGCACUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAAAGCGGUCU9959AGAUGUUGUGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGCAGAAAG10968CCUGGUAGGACUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGUUGUGGA111016AUCUCUCCGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGGUUCAGCU121028AGGACGACUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAAUCUCUCCG131085UCAUCCAGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUCUUCCGGC141187UGAUGUUGUCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGCUCGCAGC151196UGAGGCGCAUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGUUGUCGA161226CCAUGCCGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGAUGCCGG171241CCCACUCGCUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUCCAUGC181270CACGGCGAUGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUUGUCCCU191352GGUCCACCGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGCCCGACCU201421CGGCCGCCAUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUCGGGUC211534CUUGCCUGGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUUCUCCUC221715UGCCUUCGAUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGGUGUCGA231787CCACCUUCUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUCCGCCG24表VA表VAGBSS發(fā)夾核酶和底物序列nt.發(fā)夾核酶序列Seq.ID底物Seq.IDNo.位置No.48CUCCUGGCAGAAGUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA508CGACAGCCGCCAGGAG509129CCCUGCCGAGAAGUGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA510GCACCGCCCGGCAGGG511468GUCGCCGAAGAAGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA512CGGCGGCCUCGGCGAC513489CGGCGGCAAGAAGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA514CGGCGGCCUGCCGCCG515496CCAUGGCCAGAAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA516CUGCCGCCGGCCAUGG517676UCUCCAGGAGAAGUGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA518CCACUGUUCCUGGAGA519737UCCCUGUAAGAAGUUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA520GAACGGACUACAGGGA521760GCAGGCUGAGAAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA522CUGCGGUUCAGCCUGC5231298GCCUCCACAGAAGUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA524CGACGGCCGUGGAGGC5251427GGGAUGGCAGAAGCCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA526UGGCGGCCGCCAUCCC5271601GCGAGCACAGAAGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA528GCGCCGACGUGCUCGC5291638CUGGAUGAAGAAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA530CUGCGGCCUCAUCCAG5311746GACGCUGAAGAAGCCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA532GGGCCGCCUCAGCGUC5331781UUCUUGACAGAAGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA534CGGCGGACGUCAAGAA5352077AUAAACGAAGAAGCAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA536AUGCUGUUUCGUUUAU537表VB表VBGBSS發(fā)夾核酶和底物序列t.位置核酶序列Seq.ID底物Seq.IDNo.No.31GUCGCCUCAGAAGGUGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA538ACCACCCGCCGAGGCGAC53948CUCCUGGCAGAAGUCGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA540CGCGACAGCCGCCAGGAG541105GUGGACGGAGAAGUACACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA542GUGUACUGCUCCGUCCAC543110CACUGGUGAGAAGAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA544CUGCUCCGUCCACCAGUG545129CCCUGCCGAGAAGUGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA546GCGCACCGCCCGGCAGGG547142ACGAGAUGAGAAGCCCUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA548CAGGGCUGCUCAUCUCGU549182GUGGCUAGAGAAGCCAUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA550CAUGGCGGCUCUAGCCAC551199UUGCGACGAGAAGCGACGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA552CGUCGCAGCUCGUCGCAA553219GACGCCCAAGAAGGCGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA554CGCGCCGGCCUGGGCGUC555233GUGGACGCAGAAGGGACGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA556CGUCCCGGACGCGUCCAC557249GGCGCCGCAGAAGAACGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA558ACGUUCCGCCGCGGCGCC559283CCGACGCCAGAAGGCCCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA560GGGGCCGGACGGCGUCGG561316GCGCGCUGAGAAGAAUGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA562GCAUUCGGACCAGCGCGC563388CGACGAGCAGAAGGAACCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA564GGUUCCCGUCGCUCGUCG565468GUCGCCGAAGAAGCCGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA566ACCGGCGGCCUCGGCGAC567489CGGCGGCAAGAAGCCGAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA568CUCGGCGGCCUGCCGCCG569493UGGCCGGCAGAAGGCCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA570GCGGCCUGCCGCCGGCCA571496CCAUGGCCAGAAGCAGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA572GCCUGCCGCCGGCCAUGG573676UCUCCAGGAGAAGUGGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA574ACCCACUGUUCCUGGAGA575725GUUCCAGCAGAAGGCCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA576CGGGCCUGACGCUGGAAC577737UCCCUGUAAGAAGUUCCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA578UGGAACGGACUACAGGGA579754UGAACCGCAGAAGGUUGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA580ACAACCAGCUGCGGUUCA581760GCAGGCUGAGAAGCAGCUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA582AGCUGCGGUUCAGCCUGC583765GCAUAGCAAGAAGAACCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA584CGGUUCAGCCUGCUAUGC585834CCCGUAUGAGAAGGAGAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA586UUCUCCGGACCAUACGGG587882CGAGAGAGAGAAGGUGUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA588CACACCGGCCCUCUCUCG589916UGCCGUGGAGAAGGUAGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA590ACUACCAGUCCCACGGCA591947AUGCAGAAAGAAGUCUUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA592AAAGACCGCUUUCUGCAU593982AGAAGGCGAGAAGGCCCUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA594AGGGCCGGUUCGCCUUCU595995UCCGGGUAAGAAGAGAAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA596CUUCUCCGACUACCCGGA5971134GUAGUAGGAGAAGACGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA598ACCGUCAGCCCCUACUAC5991298GCCUCCACAGAAGUCGACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA600GUCGACGGCCGUGGAGGC601表VB位置核酶序列Seq.ID底物Seq.IDNo.No.1372ACGCCACCAGAAGGAUGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA602ACAUCCCGCUGGUGGCGU6031415GCCAUGACAGAAGGUCCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA604GGGACCCGACGUCAUGGC6051427GGGAUGGCAGAAGCCAUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA606CAUGGCGGCCGCCAUCCC6071441UCUCCAUGAGAAGCGGGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA608UCCCGCAGCUCAUGGAGA6091468GCAGAACGAGAAGCACGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA610ACGUGCAGAUCGUUCUGC6111477CCGUGCCCAGAAGAACGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA612UCGUUCUGCUGGGCACGG6131601GCGAGCACAGAAGCGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA614CGGCGCCGACGUGCUCGC6151620CUCGAAGCAGAAGGUGACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA616GUCACCAGCCGCUUCGAG6171623GGGCUCGAAGAAGCUGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA618ACCAGCCGCUUCGAGCCC6191638CUGGAUGAAGAAGCAGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA620CCCUGCGGCCUCAUCCAG6211648UCCCCUGCAGAAGGAUGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA622UCAUCCAGCUGCAGGGGA6231746GACGCUGAAGAAGCCCAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA624AUGGGCCGCCUCAGCGUC6251781UUCUUGACAGAAGCCGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA626GCCGGCGGACGUCAAGAA6271918CGAGGCUGAGAAGCACGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA628ACGUGCUGCUCAGCCUCG6291923GACCCCGAAGAAGAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA630CUGCUCAGCCUCGGGGUC6311975CCUUGGCGAGAAGCGCGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA632UCGCGCCGCUCGCCAAGG6332014GGCCUGCAAGAAGAACUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA634GAGUUCGGCCUGCAGGCC6352029CGCGCGAGAGAAGGGGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA636GCCCCCUGAUCUCGCGCG6372077AUAAACGAAGAAGCAUAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA638AUAUGCUGUUUCGUUUAU6392113CACAAGCAAGAAGCUACAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA640UGUAGCUGCUUGCUUGUG6412207AAUUACCGAGAAGUACUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA642AAGUACCGAUCGGUAAUU643表VI表VIΔ-9去飽和酶HH核酶靶序列nt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.13CGCGCCCUCUGCCGCUU644319GUCCAGGUUACACAUUC64521CUGCCGCUUGUUCGUUC646320UCCAGGUUACACAUUCA64724CCGCUUGUUCGUUCCUC648326UUACACAUUCAAUGCCA64925CGCUUGUUCGUUCCUCG650327UACACAUUCAAUGCCAC65128UUGUUCGUUCCUCGCGC652338UGCCACCUCACAAGAUU65329UGUUCGUUCCUCGCGCU654346CACAAGAUUGAAAUUUU65532UCGUUCCUCGCGCUCGC656352AUUGAAAUUUUCAAGUC65738CUCGCGCUCGCCACCAG658353UUGAAAUUUUCAAGUCG65963ACACACAUCCCAAUCUC660354UGAAAUUUUCAAGUCGC66169AUCCCAAUCUCGCGAGG662355GAAAUUUUCAAGUCGCU66371CCCAAUCUCGCGAGGGC664360UUUCAAGUCGCUUGAUG66592AGCAGGGUCUGCGGCGG666364AAGUCGCUUGAUGAUUG667117GCCGCGCUUCCGGCUCC668371UUGAUGAUUGGGCUAGA669118CCGCGCUUCCGGCUCCC670377AUUGGGCUAGAGAUAAU671124UUCCGGCUCCCCUUCCC672383CUAGAGAUAAUAUCUUG673129GCUCCCCUUCCCAUUGG674386GAGAUAAUAUCUUGACG675130CUCCCCUUCCCAUUGGC676388GAUAAUAUCUUGACGCA677135CUUCCCAUUGGCCUCCA678390UAAUAUCUUGACGCAUC679141AUUGGCCUCCACGAUGG680398UGACGCAUCUCAAGCCA681154AUGGCGCUCCGCCUCAA682400ACGCAUCUCAAGCCAGU683160CUCCGCCUCAACGACGU684409AAGCCAGUCGAGAAGUG685169AACGACGUCGCGCUCUG686419AGAAGUGUUGGCAGCCA687175GUCGCGCUCUGCCUCUC688434CACAGGAUUUCCUCCCG689181CUCUGCCUCUCCCCGCC690435ACAGGAUUUCCUCCCGG691183CUGCCUCUCCCCGCCGC692436CAGGAUUUCCUCCCGGA693193CCGCCGCUCGCCGCCCG694439GAUUUCCUCCCGGACCC695228CGGCAGGUUCGUCGCCG696453CCCAGCAUCUGAAGGAU697229GGCAGGUUCGUCGCCGU698462UGAAGGAUUUCAUGAUG699232AGGUUCGUCGCCGUCGC700463GAAGGAUUUCAUGAUGA701238GUCGCCGUCGCCUCCAU702464AAGGAUUUCAUGAUGAA703243CGUCGCCUCCAUGACGU704475GAUGAAGUUAAGGAGCU705252CAUGACGUCCGCCGUCU706476AUGAAGUUAAGGAGCUC707259UCCGCCGUCUCCACCAA708484AAGGAGCUCAGAGAACG709261CGCCGUCUCCACCAAGG710505AAGGAAAUCCCUGAUGA711271ACCAAGGUCGAGAAUAA712515CUGAUGAUUAUUUUGUU713278UCGAGAAUAAGAAGCCA714516UGAUGAUUAUUUUGUUU715288GAAGCCAUUUGCUCCUC716518AUGAUUAUUUUGUUUGU717289AAGCCAUUUGCUCCUCC718519UGAUUAUUUUGUUUGUU719293CAUUUGCUCCUCCAAGG720520GAUUAUUUUGUUUGUUU721296UUGCUCCUCCAAGGGAG722523UAUUUUGUUUGUUUGGU723307AGGGAGGUACAUGUCCA724524AUUUUGUUUGUUUGGUG725313GUACAUGUCCAGGUUAC726527UUGUUUGUUUGGUGGGA727528UGUUUGUUUGGUGGGAG728857ACACUGCUCGUCACGCC729544GACAUGAUUACCGAGGA730860CUGCUCGUCACGCCAAG731545ACAUGAUUACCGAGGAA732873CAAGGACUUUGGCGACU733557AGGAAGCUCUACCAACA734874AAGGACUUUGGCGACUU735559GAAGCUCUACCAACAUA736882UGGCGACUUAAAGCUUG737567ACCAACAUACCAGACUA738883GGCGACUUAAAGCUUGC739575ACCAGACUAUGCUUAAC740889UUAAAGCUUGCACAAAU741580ACUAUGCUUAACACCCU742898GCACAAAUCUGCGGCAU743581CUAUGCUUAACACCCUC744907UGCGGCAUCAUCGCCUC745589AACACCCUCGACGGUGU746910GGCAUCAUCGCCUCAGA747598GACGGUGUCAGAGAUGA748915CAUCGCCUCAGAUGAGA749表VInt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.637UGGGCUGUUUGGACGAG750942AACUGCGUACACCAAGA751638GGGCUGUUUGGACGAGG752952ACCAAGAUCGUGGAGAA753680AUGGUGAUCUGCUCAAC754966GAAGCUGUUUGAGAUCG755685GAUCUGCUCAACAAGUA756967AAGCUGUUUGAGAUCGA757693CAACAAGUAUAUGUACC758973UUUGAGAUCGACCCUGA759695ACAAGUAUAUGUACCUC760986CUGAUGGUACCGUGGUC761699GUAUAUGUACCUCACUG762994ACCGUGGUCGCUCUGGC763703AUGUACCUCACUGGGAG764998UGGUCGCUCUGGCUGAC765719GGGUGGAUAUGAGGCAG7661024AAGAAGAUCUCAAUGCC767730AGGCAGAUUGAGAAGAC7681026GAAGAUCUCAAUGCCUG769742AAGACAAUUCAGUAUCU7701047CCUGAUGUUUGACGGGC771743AGACAAUUCAGUAUCUU7721048CUGAUGUUUGACGGGCA773747AAUUCAGUAUCUUAUUG7741071CAAGCUGUUCGAGCACU775749UUCAGUAUCUUAUUGGC7761072AAGCUGUUCGAGCACUU777751CAGUAUCUUAUUGGCUC7781080CGAGCACUUCUCCAUGG779752AGUAUCUUAUUGGCUCU7801081GAGCACUUCUCCAUGGU781754UAUCUUAUUGGCUCUGG7821083GCACUUCUCCAUGGUCG783759UAUUGGCUCUGGAAUGG7841090UCCAUGGUCGCGCAGAG785770GAAUGGAUCCUAGGACU7861102CAGAGGCUUGGCGUUUA787773UGGAUCCUAGGACUGAG7881108CUUGGCGUUUACACCGC789785CUGAGAAUAAUCCUUAU7901109UUGGCGUUUACACCGCC791788AGAAUAAUCCUUAUCUU7921110UGGCGUUUACACCGCCA793791AUAAUCCUUAUCUUGGU7941125CAGGGACUACGCCGACA795792UAAUCCUUAUCUUGGUU7961135GCCGACAUCCUCGAGUU797794AUCCUUAUCUUGGUUUC7981138GACAUCCUCGAGUUCCU799796CCUUAUCUUGGUUUCAU8001143CCUCGAGUUCCUCGUCG801800AUCUUGGUUUCAUCUAC8021144CUCGAGUUCCUCGUCGA803801UCUUGGUUUCAUCUACA8041147GAGUUCCUCGUCGACAG805802CUUGGUUUCAUCUACAC8061150UUCCUCGUCGACAGGUG807805GGUUUCAUCUACACCUC8061181UGACUGGUCUGUCGGGU809807UUUCAUCUACACCUCCU8101185UGGUCUGUCGGGUGAAG811813CUACACCUCCUUCCAAG8121212GCAGGACUACCUUUGCA813816CACCUCCUUCCAAGAGC8141216GACUACCUUUGCACCCU815817ACCUCCUUCCAAGAGCG8161217ACUACCUUUGCACCCUU817834GGCGACCUUCAUCUCAC8181225UGCACCCUUGCUUCAAG819835GCGACCUUCAUCUCACA8201229CCCUUGCUUCAAGAAUC821838ACCUUCAUCUCACACGG8221230CCUUGCUUCAAGAAUCA823840CUUCAUCUCACACGGGA8241237UCAAGAAUCAGGAGGCU8251292CGCUGCCUUUCAGCUGG8261494UUUGAUGUACAACCUGU8271293GCUGCCUUUCAGCUGGG8281546CAUGCCGUACUUUGUCU8291294CUGCCUUUCAGCUGGGU8301549GCCGUACUUUGUCUGUC8311303AGCUGGGUAUACGGUAG8321550CCGUACUUUGUCUGUCG8331305CUGGGUAUACGGUAGGG8341553UACUUUGUCUGUCGCUG8351310UAUACGGUAGGGACGUC8361557UUGUCUGUCGCUGGCGG8371318AGGGACGUCCAACUGUG8381571CGGUGUGUUUCGGUAUG8391331UGUGAGAUCGGAAACCU8401572GGUGUGUUUCGGUAUGU8411348GCUGCGGUCUGCUUAGA8421573GUGUGUUUCGGUAUGUU8431353GGUCUGCUUAGACAAGA8441577GUUUCGGUAUGUUAUUU8451354GUCUGCUUAGACAAGAC8461581CGGUAUGUUAUUUGAGU8471372UGCUGUGUCUGCGUUAC8481582GGUAUGUUAUUUGAGUU8491378GUCUGCGUUACAUAGGU8501584UAUGUUAUUUGAGUUGC8511379UCUGCGUUACAUAGGUC8521585AUGUUAUUUGAGUUGCU8531383CGUUACAUAGGUCUCCA8541590AUUUGAGUUGCUCAGAU8551387ACAUAGGUCUCCAGGUU8561594GAGUUGCUCAGAUCUGU8571389AUAGGUCUCCAGGUUUU8581599GCUCAGAUCUGUUAAAA8591395CUCCAGGUUUUGAUCAA8601603AGAUCUGUUAAAAAAAA8611396UCCAGGUUUUGAUCAAA8621604GAUCUGUUAAAAAAAAA863表VInt.底物Seq.ID位置No.1397CCAGGUUUUGAUCAAAU8641401GUUUUGAUCAAAUGGUC8651409CAAAUGGUCCCGUGUCG8661416UCCCGUGUCGUCUUAUA8671419CGUGUCGUCUUAUAGAG8681421UGUCGUCUUAUAGAGCG8691422GUCGUCUUAUAGAGCGA8701424CGUCUUAUAGAGCGAUA8711432AGAGCGAUAGGAGAACG8721444GAACGUGUUGGUCUGUG8731448GUGUUGGUCUGUGGUGU8741457UGUGGUGUAGCUUUGUU8751461GUGUAGCUUUGUUUUUA8761462UGUAGCUUUGUUUUUAU8771465AGCUUUGUUUUUAUUUU8781466GCUUUGUUUUUAUUUUG8791467CUUUGUUUUUAUUUUGU8801468UUUGUUUUUAUUUUGUA8811469UUGUUUUUAUUUUGUAU8821471GUUUUUAUUUUGUAUUU8831472UUUUUAUUUUGUAUUUU8841473UUUUAUUUUGUAUUUUU8851476UAUUUUGUAUUUUUCUG8861478UUUUGUAUUUUUCUGCU8871479UUUGUAUUUUUCUGCUU8881480UUGUAUUUUUCUGCUUU8891481UGUAUUUUUCUGCUUUG8901482GUAUUUUUCUGCUUUGA8911487UUUCUGCUUUGAUGUAC8921488UUCUGCUUUGAUGUACA893表VII表VIIΔ-9去飽和酶HH核酶序列nt.核酶序列Seq.IDNo.位置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表VIInt.核酶序列Seq.IDNo.位置371UCUAGCCCCUGAUGAXGAAAUCAUCAA948377AUUAUCUCCUGAUGAXGAAAGCCCAAU949383CAAGAUAUCUGAUGAXGAAAUCUCUAG950386CGUCAAGACUGAUGAXGAAAUUAUCUC951388UGCGUCAACUGAUGAXGAAAUAUUAUC952390GAUGCGUCCUGAUGAXGAAAGAUAUUA953398UGGCUUGACUGAUGAXGAAAUGCGUCA954400ACUGGCUUCUGAUGAXGAAAGAUGCGU955409CACUUCUCCUGAUGAXGAAACUGGCUU956419UGGCUGCCCUGAUGAXGAAACACUUCU957434CGGGAGGACUGAUGAXGAAAUCCUGUG958435CCGGGAGGCUGAUGAXGAAAAUCCUGU959436UCCGGGAGCUGAUGAXGAAAAAUCCUG960439GGGUCCGGCUGAUGAXGAAAGGAAAUC961453AUCCUUCACUGAUGAXGAAAUGCUGGG962462CAUCAUGACUGAUGAXGAAAUCCUUCA963463UCAUCAUGCUGAUGAXGAAAAUCCUUC964464UUCAUCAUCUGAUGAXGAAAAAUCCUU965475AGCUCCUUCUGAUGAXGAAACUUCAUC966476GAGCUCCUCUGAUGAXGAAAACUUCAU967484CGUUCUCUCUGAUGAXGAAAGCUCCUU968505UCAUCAGGCUGAUGAXGAAAUUUCCUU969515AACAAAAUCUGAUGAXGAAAUCAUCAG970516AAACAAAACUGAUGAXGAAAAUCAUCA971518ACAAACAACUGAUGAXGAAAUAAUCAU972519AACAAACACUGAUGAXGAAAAUAAUCA973520AAACAAACCUGAUGAXGAAAAAUAAUC974523ACCAAACACUGAUGAXGAAACAAAAUA975524CACCAAACCUGAUGAXGAAAACAAAAU976527UCCCACCACUGAUGAXGAAACAAACAA977528CUCCCACCCUGAUGAXGAAAACAAACA978544UCCUCGGUCUGAUGAXGAAAUCAUGUC979545UUCCUCGGCUGAUGAXGAAAAUCAUGU980557UGUUGGUACUGAUGAXGAAAGCUUCCU981559UAUGUUGGCUGAUGAXGAAAGAGCUUC982567UAGUCUGGCUGAUGAXGAAAUGUUGGU983575GUUAAGCACUGAUGAXGAAAGUCUGGU984580AGGGUGUUCUGAUGAXGAAAGCAUAGU985581GAGGGUGUCUGAUGAXGAAAAGCAUAG986589ACACCGUCCUGAUGAXGAAAGGGUGUU987598UCAUCUCUCUGAUGAXGAAACACCGUC988637CUCGUCCACUGAUGAXGAAACAGCCCA989638CCUCGUCCCUGAUGAXGAAAACAGCCC990680GUUGAGCACUGAUGAXGAAAUCACCAU991685UACUUGUUCUGAUGAXGAAAGCAGAUC992693GGUACAUACUGAUGAXGAAACUUGUUG993695GAGGUACACUGAUGAXGAAAUACUUGU994699CAGUGAGGCUGAUGAXGAAACAUAUAC995703CUCCCAGUCUGAUGAXGAAAGGUACAU996719CUGCCUCACUGAUGAXGAAAUCCACCC997730GUCUUCUCCUGAUGAXGAAAUCUGCCU998742AGAUACUGCUGAUGAXGAAAUUGUCUU999743AAGAUACUCUGAUGAXGAAAAUUGUCU1000747CAAUAAGACUGAUGAXGAAACUGAAUU1001749GCCAAUAACUGAUGAXGAAAUACUGAA1002751GAGCCAAUCUGAUGAXGAAAGAUACUG1003752AGAGCCAACUGAUGAXGAAAAGAUACU1004表VIInt.核酶序列Seq.IDNo位置754CCAGAGCCCUGAUGAXGAAAUAAGAUA1005759CCAUUCCACUGAUGAXGAAAGCCAAUA1006770AGUCCUAGCUGAUGAXGAAAUCCAUUC1007773CUCAGUCCCUGAUGAXGAAAGGAUCCA1008785AUAAGGAUCUGAUGAXGAAAUUCUCAG1009788AAGAUAAGCUGAUGAXGAAAUUAUUCU1010791ACCAAGAUCUGAUGAXGAAAGGAUUAU1011792AACCAAGACUGAUGAXGAAAAGGAUUA1012794GAAACCAACUGAUGAXGAAAUAAGGAU1013796AUGAAACCCUGAUGAXGAAAGAUAAGG1014800GUAGAUGACUGAUGAXGAAACCAAGAU1015801UGUAGAUGCUGAUGAXGAAAACCAAGA1016802GUGUAGAUCUGAUGAXGAAAAACCAAG1017805GAGGUGUACUGAUGAXGAAAUGAAACC1018807AGGAGGUGCUGAUGAXGAAAGAUGAAA1019813CUUGGAAGCUGAUGAXGAAAGGUGUAG1020816GCUCUUGGCUGAUGAXGAAAGGAGGUG1021817CGCUCUUGCUGAUGAXGAAAAGGAGGU1022834GUGAGAUGCUGAUGAXGAAAGGUCGCC1023835UGUGAGAUCUGAUGAXGAAAAGGUCGC1024838CCGUGUGACUGAUGAXGAAAUGAAGGU1025840UCCCGUGUCUGAUGAXGAAAGAUGAAG1026857GGCGUGACCUGAUGAXGAAAGCAGUGU1027860CUUGGCGUCUGAUGAXGAAACGAGCAG1028873AGUCGCCACUGAUGAXGAAAGUCCUUG1029874AAGUCGCCCUGAUGAXGAAAAGUCCUU1030882CAAGCUUUCUGAUGAXGAAAGUCGCCA1031883GCAAGCUUCUGAUGAXGAAAAGUCGCC1032889AUUUGUGCCUGAUGAXGAAAGCUUUAA1033898AUGCCGCACUGAUGAXGAAAUUUGUGC1034907GAGGCGAUCUGAUGAXGAAAUGCCGCA1035910UCUGAGGCCUGAUGAXGAAAUGAUGCC1036915UCUCAUCUCUGAUGAXGAAAGGCGAUG1037942UCUUGGUGCUGAUGAXGAAACGCAGUU1038952UUCUCCACCUGAUGAXGAAAUCUUGGU1039966CGAUCUCACUGAUGAXGAAACAGCUUC1040967UCGAUCUCCUGAUGAXGAAAACAGCUU1041973UCAGGGUCCUGAUGAXGAAAUCUCAAA1042986GACCACGGCUGAUGAXGAAACCAUCAG1043994GCCAGAGCCUGAUGAXGAAACCACGGU1044998GUCAGCCACUGAUGAXGAAAGCGACCA10451024GGCAUUGACUGAUGAXGAAAUCUUCUU10461026CAGGCAUUCUGAUGAXGAAAGAUCUUC10471047GCCCGUCACUGAUGAXGAAACAUCAGG10481048UGCCCGUCCUGAUGAXGAAAACAUCAG10491071AGUGCUCGCUGAUGAXGAAACAGCUUG10501072AAGUGCUCCUGAUGAXGAAAACAGCUU10511080CCAUGGAGCUGAUGAXGAAAGUGCUCG10521081ACCAUGGACUGAUGAXGAAAAGUGCUC10531083CGACCAUGCUGAUGAXGAAAGAAGUGC10541090CUCUGCGCCUGAUGAXGAAACCAUGGA10551102UAAACGCCCUGAUGAXGAAAGCCUCUG10561108GCGGUGUACUGAUGAXGAAACGCCAAG10571109GGCGGUGUCUGAUGAXGAAAACGCCAA10581110UGGCGGUGCUGAUGAXGAAAAACGCCA10591125UGUCGGCGCUGAUGAXGAAAGUCCCUG10601135AACUCGAGCUGAUGAXGAAAUGUCGGC1061表VIInt.核酶序列Seq.IDNo位置1138AGGAACUCCUGAUGAXGAAAGGAUGUC10621143CGACGAGGCUGAUGAXGAAACUCGAGG10631144UCGACGAGCUGAUGAXGAAAACUCGAG10641147CUGUCGACCUGAUGAXGAAAGGAACUC10651150CACCUGUCCUGAUGAXGAAACGAGGAA10661181ACCCGACACUGAUGAXGAAACCAGUCA10671185CUUCACCCCUGAUGAXGAAACAGACCA10681212UGCAAAGGCUGAUGAXGAAAGUCCUGC10691216AGGGUGCACUGAUGAXGAAAGGUAGUC10701217AAGGGUGCCUGAUGAXGAAAAGGUAGU10711225CUUGAAGCCUGAUGAXGAAAGGGUGCA10721229GAUUCUUGCUGAUGAXGAAAGCAAGGG10731230UGAUUCUUCUGAUGAXGAAAAGCAAGG10741237AGCCUCCUCUGAUGAXGAAAUUCUUGA10751292CCAGCUGACUGAUGAXGAAAGGCAGCG10761293CCCAGCUGCUGAUGAXGAAAAGGCAGC10771294ACCCAGCUCUGAUGAXGAAAAAGGCAG10781303CUACCGUACUGAUGAXGAAACCCAGCU10791305CCCUACCGCUGAUGAXGAAAUACCCAG10801310GACGUCCCCUGAUGAXGAAACCGUAUA10811318CACAGUUGCUGAUGAXGAAACGUCCCU10821331AGGUUUCCCUGAUGAXGAAAUCUCACA10831348UCUAAGCACUGAUGAXGAAACCGCAGC10841353UCUUGUCUCUGAUGAXGAAAGCAGACC10851354GUCUUGUCCUGAUGAXGAAAAGCAGAC10861372GUAACGCACUGAUGAXGAAACACAGCA10871378ACCUAUGUCUGAUGAXGAAACGCAGAC10881379GACCUAUGCUGAUGAXGAAAACGCAGA10891383UGGAGACCCUGAUGAXGAAAUGUAACG10901387AACCUGGACUGAUGAXGAAACCUAUGU10911389AAAACCUGCUGAUGAXGAAAGACCUAU10921395UUGAUCAACUGAUGAXGAAACCUGGAG10931396UUUGAUCACUGAUGAXGAAAACCUGGA10941397AUUUGAUCCUGAUGAXGAAAAACCUGG10951401GACCAUUUCUGAUGAXGAAAUCAAAAC10961409CGACACGGCUGAUGAXGAAACCAUUUG10971416UAUAAGACCUGAUGAXGAAACACGGGA10981419CUCUAUAACUGAUGAXGAAACGACACG10991421CGCUCUAUCUGAUGAXGAAAGACGACA11001422UCGCUCUACUGAUGAXGAAAAGACGAC11011424UAUCGCUCCUGAUGAXGAAAUAAGACG11021432CGUUCUCCCUGAUGAXGAAAUCGCUCU11031444CACAGACCCUGAUGAXGAAACACGUUC11041448ACACCACACUGAUGAXGAAACCAACAC11051457AACAAAGCCUGAUGAXGAAACACCACA11061461UAAAAACACUGAUGAXGAAAGCUACAC11071462AUAAAAACCUGAUGAXGAAAAGCUACA11081465AAAAUAAACUGAUGAXGAAACAAAGCU11091466CAAAAUAACUGAUGAXGAAAACAAAGC11101467ACAAAAUACUGAUGAXGAAAAACAAAG11111468UACAAAAUCUGAUGAXGAAAAAACAAA11121469AUACAAAACUGAUGAXGAAAAAAACAA11131471AAAUACAACUGAUGAXGAAAUAAAAAC11141472AAAAUACACUGAUGAXGAAAAUAAAAA11151473AAAAAUACCUGAUGAXGAAAAAUAAAA11161476CAGAAAAACUGAUGAXGAAACAAAAUA11171478AGCAGAAACUGAUGAXGAAAUACAAAA1118表VIInt.核酶序列Seq.IDNo.位置1479AAGCAGAACUGAUGAXGAAAAUACAAA11191480AAAGCAGACUGAUGAXGAAAAAUACAA11201481CAAAGCAGCUGAUGAXGAAAAAAUACA11211482UCAAAGCACUGAUGAXGAAAAAAAUAC11221487GUACAUCACUGAUGAXGAAAGCAGAAA11231488UGUACAUCCUGAUGAXGAAAAGCAGAA11241494ACAGGUUGCUGAUGAXGAAACAUCAAA11251546AGACAAAGCUGAUGAXGAAACGGCAUG11261549GACAGACACUGAUGAXGAAAGUACGGC11271550CGACAGACCUGAUGAXGAAAAGUACGG11281553CAGCGACACUGAUGAXGAAACAAAGUA11291557CCGCCAGCCUGAUGAXGAAACAGACAA11301571CAUACCGACUGAUGAXGAAACACACCG11311572ACAUACCGCUGAUGAXGAAAACACACC11321573AACAUACCCUGAUGAXGAAAAACACAC11331577AAAUAACACUGAUGAXGAAACCGAAAC11341581ACUCAAAUCUGAUGAXGAAACAUACCG11351582AACUCAAACUGAUGAXGAAAACAUACC11361584GCAACUCACUGAUGAXGAAAUAACAUA11371585AGCAACUCCUGAUGAXGAAAAUAACAU11381590AUCUGAGCCUGAUGAXGAAACUCAAAU11391594ACAGAUCUCUGAUGAXGAAAGCAACUC11401599UUUUAACACUGAUGAXGAAAUCUGAGC11411603UUUUUUUUCUGAUGAXGAAACAGAUCU11421604UUUUUUUUCUGAUGAXGAAAACAGAUC1143其中＂X＂代表HH核酶莖II區(qū)(Hertel等，1992，核酸研究203252)莖II長度可以≥2堿基對(duì)。表VIII表VIIIΔ-9去飽和酶發(fā)夾核酶和底物序列nt.核酶Seq.ID底物Seq.ID位置No.No.14GAACAAGCAGAAGAGGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1144GCCCUCUGCCGCUUGUUC114517AACGAACAAGAAGCAGAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1146CUCUGCCGCUUGUUCGUU1147108GGAAGCGCAGAAGCCGCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1148GGCGGCGGCCGCGCUUCC1149120GGAAGGGGAGAAGGAAGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1150GCUUCCGGCUCCCCUUCC1151155GUCGUUGAAGAAGAGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1152GCGCUCCGCCUCAACGAC1153176CGGGGAGAAGAAGAGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1154GCGCUCUGCCUCUCCCCG1155186CGGCGAGCAGAAGGGAGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1156UCUCCCCGCCGCUCGCCG1157189GGGCGGCGAGAAGCGGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1158CCCCGCCGCUCGCCGCCC1159196CGGCGGCGAGAAGCGAGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1160GCUCGCCGCCCGCCGCCG1161200GCGGCGGCAGAAGGCGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1162GCCGCCCGCCGCCGCCGC1163203GCGGCGGCAGAAGCGGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1164GCCCGCCGCCGCCGCCGC1165206GCUGCGGCAGAAGCGGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1166CGCCGCCGCCGCCGCAGC1167209GCUGCUGCAGAAGCGGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1168CGCCGCCGCCGCAGCAGC1169235AUGGAGGCAGAAGCGACGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1170CGUCGCCGUCGCCUCCAU1171253GUGGAGACAGAAGACGUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1172GACGUCCGCCGUCUCCAC1173256UUGGUGGAAGAAGCGGACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1174GUCCGCCGUCUCCACCAA1175406CACUUCUCAGAAGGCUUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1176CAAGCCAGUCGAGAAGUG1177442GAUGCUGGAGAAGGGAGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1178CCUCCCGGACCCAGCAUC1179508AAAUAAUCAGAAGGGAUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1180AAUCCCUGAUGAUUAUUU1181570UAAGCAUAAGAAGGUAUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1182CAUACCAGACUAUGCUUA1183625ACAGCCCAAGAAGUGGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1184CCCCACUGCCUGGGCUGU1185634CUCGUCCAAGAAGCCCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1186CUGGGCUGUUUGGACGAG1187655UUCUCCUCAGAAGUCCAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1188AUGGACUGCUGAGGAGAA1189681ACUUGUUGAGAAGAUCACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1190GUGAUCUGCUCAACAAGU1191726UCUUCUCAAGAAGCCUCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1192UGAGGCAGAUUGAGAAGA1193853GCGUGACGAGAAGUGUUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1194GAACACUGCUCGUCACGC1195916CGCUUCUCAGAAGAGGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1196CGCCUCAGAUGAGAAGCG1197表VIIInt.核酶Seq.ID底物Seq.ID位置No.No.963CGAUCUCAAGAAGCUUCUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1198AGAAGCUGUUUGAGAUCG1199979ACGGUACCAGAAGGGUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1200CGACCCUGAUGGUACCGU12011033AUCAGGUGAGAAGGCAUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1202AAUGCCUGCCCACCUGAU12031041CGUCAAACAGAAGGUGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1204CCCACCUGAUGUUUGACG12051068AGUGCUCGAGAAGCUUGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1206ACAAGCUGUUCGAGCACU12071173ACAGACCAAGAAGGCUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1208CGAGCCUGACUGGUCUGU12091182CUUCACCCAGAAGACCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1210CUGGUCUGUCGGGUGAAG12111287AGCUGAAAAGAAGCGUGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1212GCACGCUGCCUUUCAGCU12131295GUAUACCCAGAAGAAAGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1214CCUUUCAGCUGGGUAUAC12151339CAGACCGCAGAAGGUUUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1216GAA4CCUGCUGCGGUCUG12171345UCUAAGCAAGAAGCAGCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1218UGCUGCGGUCUGCUUAGA12191349CUUGUCUAAGAAGACCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1220GCGGUCUGCUUAGACAAG12211364GCAGACACAGAAGGUCUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1222AAGACCUGCUGUGUCUGC12231483UACAUCAAAGAAGAAAAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1224UUUUUCUGCUUUGAUGUA12251554CCGCCAGCAGAAGACAAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1226UUUGUCUGUCGCUGGCGG12271595UUUAACAGAGAAGAGCAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1228UUGCUCAGAUCUGUUAAA1229表IX表IX由HH核酶產(chǎn)生的Δ-9去飽和酶RNA的切割切割百分比20℃26℃nt.位置10分120分10分120分1836.37.010.4511.825225.251.233.152.925920.341.324.844.027117.252.421.556.32789.925.713.333.630710.324.29.232.431316.943.023.853.432010.623.615.031.33265.714.68.017.133810.017.510.412.935310.211.310.714.73908.68.97.89.84196.310.15.810.94537.329.08.033.84847.828.96.929.25454.88.53.68.97734.511.54.48.9102411.917.113.323.8102611.612.613.117.2123723.132.413.828.6表X表IX與對(duì)照葉片比較，用活性的和非活性的核酶轉(zhuǎn)化的植物葉片中的硬脂酸水平表XII來源于高硬脂酸植物雜交的高硬脂酸特性在葉片中的遺傳表XIII胚胎發(fā)生愈傷組織，體胚和合子胚的脂肪酸組成的比較</tables>表XIV選擇的核酸系的GBSS活性，直鏈淀粉含量和Southern分析結(jié)果系GBSS活性直鏈淀粉含量Southern(單位/mg淀粉)(％)RPA63.0283321.5±31.223.3±0.5-RPA63.0236314.6±9.227.4±0.3-RPA63.0219299.8±10.421.5±0.3-RPA63.0314440.4±17.119.1±0.8-RPA63.0316346.5±8.517.9±0.5-RPA63.0311301.5±17.419.5±0.4-RPA63.0309264.7±1921.7±0.1+RPA63.0218190.8±7.821.0±0.3+RPA63.0209203±2.422.6±0.6+RPA63.0306368.2±7.519.0±0.4-RPA63.0210195.1±722.1±0.2+權(quán)利要求1.一種具有RNA切割活性的酶促核酸分子，其中所說的核酸分子調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)。2.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的植物是單子葉植物。3.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的植物是雙子葉植物。4.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的植物是裸子植物。5.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的植物是被子植物。6.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的核酸是錘頭構(gòu)型的。7.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的核酸是發(fā)夾構(gòu)型的。8.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的核酸分子是肝炎Δ病毒、I組內(nèi)含子、II組內(nèi)含子、VS核酸或RNA酶P核酸構(gòu)型的。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的酶促核酸，其中所說的核酸包含互補(bǔ)于所說基因的RNA的12至100個(gè)堿基。10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的酶促核酸，其中所說的核酸包含互補(bǔ)于所說基因的RNA的14至24個(gè)堿基。11.權(quán)利要求6的酶促核酸，其中所說的錘頭包含長度大于或等于2個(gè)堿基對(duì)的干II區(qū)。12.權(quán)利要求7的酶促核酸，其中所說的發(fā)夾包含長度在3和7個(gè)堿基對(duì)之間的干II區(qū)。13.權(quán)利要求7的酶促核酸，其中所說的發(fā)夾包含長度大于或等于2個(gè)堿基對(duì)的干IV區(qū)。14.權(quán)利要求2的酶促核酸，其中所說的單子葉植物選自玉米、水稻、小麥和大麥。15.權(quán)利要求2的酶促核酸，其中所說的雙子葉植物選自canola、向日葵、紅花、大豆、棉花、花生、橄欖、芝麻、萼距花屬、亞麻、希蒙得木屬以及葡萄。16.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的基因是在所說的植物中的脂肪酸生物合成中所涉及的基因。17.權(quán)利要求16的酶促核酸，其中所說的基因是Δ-9去飽和酶。18.權(quán)利要求16或17的酶促核酸，其中所說的植物選自玉米、canola、亞麻、向日葵、棉花、花生、紅花、大豆以及水稻。19.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的基因是在所說的植物中的淀粉生物合成中所涉及的基因。20.權(quán)利要求19的酶促核酸，其中所說的基因是顆粒結(jié)合淀粉合酶。21.權(quán)利要求19或20的酶促核酸，其中所說的植物選自玉米、土豆、小麥以及木薯。22.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的基因是在咖啡因合成中所涉及的基因。23.權(quán)利要求22的酶促核酸，其中所說的基因選自7-甲基鳥苷和3-甲基轉(zhuǎn)移酶。24.權(quán)利要求22或23的酶促核酸，其中所說的植物是咖啡植物。25.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的基因是在所說的植物中的尼古丁產(chǎn)生中所涉及的基因。26.權(quán)利要求25的酶促核酸，其中所說的基因選自N-甲基腐胺氧化酶和腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶。27.權(quán)利要求25或26的酶促核酸，其中所說的植物是煙草植物。28.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的基因是在所說的植物的果實(shí)成熟過程中所涉及的基因。29.權(quán)利要求28的酶促核酸，其中所說的基因選自乙烯形成酶、果膠甲基轉(zhuǎn)移酶、果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶、1-氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC)-合酶以及ACC氧化酶。30.權(quán)利要求28或29的酶促核酸，其中所說的植物選自蘋果、番茄、梨、梅以及桃。31.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的基因是在所說的植物的花色素形成中所涉及的基因。32.權(quán)利要求31的酶促核酸，其中所說的基因選自查耳酮合酶、查耳酮黃烷酮異構(gòu)酶、苯丙氨酸氨裂合酶、脫氫黃酮醇羥化酶以及脫氫黃酮醇還原酶。33.權(quán)利要求31或32的酶促核酸，其中所說的植物選自玫瑰、矮牽牛屬、菊屬以及金盞花。34.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的基因是在所說的植物的木素產(chǎn)生中所涉及的基因。35.權(quán)利要求34的酶促核酸，其中所說的基因選自O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶ANADPH還原酶和肉桂酰醇脫氫酶。36.權(quán)利要求34或35的酶促核酸，其中所說的植物選自煙草、白楊、楊樹和松樹。37.一種核酸片段，該片段包含編碼玉米Δ-9去飽和酶的cDNA序列，其中所說的序列由SEQIDNO1表示。38.權(quán)利要求17的酶促核酸分子，其中所說的核酸特異性地切割表VI中限定的任何序列，其中所說核酸是錘頭構(gòu)型的。39.權(quán)利要求17的酶促核酸分子，其中所說核酸的特異性地切割表VIII中限定的任何序列，其中所說的核酸是發(fā)夾構(gòu)型的。40.權(quán)利要求38或39的酶促核酸分子，該分子基本上由選自表VII和VIII中所示的組的一種或多種序列組成。41.權(quán)利要求20的酶促核酸分子，其中所說的核酸特異性地切割表IIIA中所限定的任何序列，其中所說的核酸是錘頭構(gòu)型的。42.權(quán)利要求20的酶促核酸分子，其中所說核酸特異性地切割表VA和VB中所限定的任何序列，其中所說的核酸是發(fā)夾構(gòu)型的。43.權(quán)利要求41或42的酶促核酸分子，該分子基本上由選自表IIIB、IV、VA和VB中所示的組的一種或多種序列組成。44.權(quán)利要求41的酶促核酸分子，該分子基本上由SEQIDNO2-24中任一個(gè)所限定的序列組成。45.一種植物細(xì)胞，該細(xì)胞包含權(quán)利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一項(xiàng)的酶促核酸分子。46.一種轉(zhuǎn)基因植物和其子代，它包含權(quán)利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一項(xiàng)的酶促核酸分子。47.一種表達(dá)載體，它包含編碼權(quán)利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一項(xiàng)的酶促核酸分子的核酸，其編碼方式允許在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或釋放該酶促核酸分子。48.一種表達(dá)載體，它包含編碼權(quán)利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一項(xiàng)的許多酶促核酸分子的核酸，其編碼方式允許在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或釋放所說的酶促核酸分子。49.一種包含權(quán)利要求47的表達(dá)載體的植物細(xì)胞。50.一種包含權(quán)利要求48的表達(dá)載體的植物細(xì)胞。51.一種轉(zhuǎn)基因植物和其子代，它包含權(quán)利要求47的表達(dá)載體。52.一種轉(zhuǎn)基因植物和其子代，它包含權(quán)利要求48的表達(dá)載體。53.一種植物細(xì)胞，它包含權(quán)利要求16或17的酶促核酸。54.權(quán)利要求53的植物細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞是玉米細(xì)胞。55.權(quán)利要求53的植物細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞是canola細(xì)胞。56.一種轉(zhuǎn)基因植物和其子代，它包含權(quán)利要求16或17的酶促核酸。57.權(quán)利要求56的轉(zhuǎn)基因植物和其子代，其中所說的植物是玉米植物。58.權(quán)利要求56的轉(zhuǎn)基因植物和其子代，其中所說的植物是canola植物。59.一種包含權(quán)利要求19或20的酶促核酸的植物細(xì)胞。60.權(quán)利要求59的植物細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞是玉米細(xì)胞。61.一種轉(zhuǎn)基因植物和其子代，它包含權(quán)利要求19或20的酶促核酸。62.權(quán)利要求61的轉(zhuǎn)基因植物和其子代，其中所說的植物是玉米植物。63.一種在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，該方法包括向所說的植物施用權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的酶促核酸分子。64.權(quán)利要求63的方法，其中所說的植物是單子葉植物。65.權(quán)利要求63的方法，其中所說的植物是雙子葉植物。66.權(quán)利要求63的方法，其中所說的植物是裸子植物。67.權(quán)利要求63的方法，其中所說的植物是被子植物。68.權(quán)利要求63的方法，其中所說的基因是Δ-9去飽和酶。69.權(quán)利要求68的方法，其中所說的植物是玉米植物。70.權(quán)利要求68的方法，其中所說的植物是canola植物。71.權(quán)利要求68的方法，其中所說的基因是顆粒結(jié)合淀粉合酶。72.權(quán)利要求71的方法，其中所說的植物是玉米植物。73.權(quán)利要求47的表達(dá)載體，其中所說的載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)編碼至少一種所說的酶促核酸分子的基因；其中所說的基因以允許在所說的植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或釋放所說的酶促分子的方式可操作地連接到所說的起始區(qū)和所說的終止區(qū)上。74.權(quán)利要求47的表達(dá)載體，其中所說的載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)開放讀框；d)至少編碼一種所說的酶促核酸分子的基因，其中所說的基因可操作地連接到所說的開放讀框的3’-末端上；其中所說的的基因以允許在所說的植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或釋放所說的酶促分子的方式可操作地連接到所說的起始區(qū)、所說的開放讀框和所說的終止區(qū)上。75.權(quán)利要求47的表達(dá)載體，其中所說的載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)內(nèi)含子；d)編碼至少一種所說的酶促核酸分子的基因；其中所說的基因以允許在所說的植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或釋放所說的酶促分子的方式可操作地連接到所說的起始區(qū)、所說的內(nèi)含子和所說的終止區(qū)上。76.權(quán)利要求47的表達(dá)載體，其中所說的載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)內(nèi)含子；d)開放讀框；e)編碼至少一種所說的酶促核酸分子的基因，其中所說的基因可操作地連接到所說的開放讀框的3’-末端上，并且，其中所說的的基因以允許在所說的植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或釋放所說的酶促分子的方式可操作地連接到所說的起始區(qū)、所說的內(nèi)含子、所說的開放讀框和所說的終止區(qū)上。77.權(quán)利要求1的酶促核酸，其中所說的植物選自玉米、水稻、大豆、canola、苜蓿、棉花、小麥、大麥、向日葵、亞麻和花生。78.一種轉(zhuǎn)基因植物，該植物包含具有RNA切割活性的酶促核酸分子，其中所說的核酸分子在所說的植物中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。79.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的植物選自玉米、水稻、大豆、canola、苜蓿、棉花、小麥、大麥、向日葵、亞麻和花生。80.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的基因是顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)。81.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的基因是Δ-去飽和酶。82.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的植物是用土壤桿菌屬、DNA包被微粒轟擊、噬菌體頸須或電穿孔轉(zhuǎn)化的。83.權(quán)利要求82的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的用DNA包被微粒轟擊是用基因槍完成的。84.權(quán)利要求78或82的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的植物包含選自chlorosulfuron、潮霉素、bar基因、溴草腈以及卡那霉素等的選擇性標(biāo)記。85.權(quán)利要求78或82的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的核酸可操作地連接到啟動(dòng)子上，所說的啟動(dòng)子選自章魚堿合成酶、胭脂氨酸合酶、manopine合成酶、花椰菜斑紋病毒(35S)；核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亞單位(ssu)、β-conglycinin、菜豆素啟動(dòng)子、napin、γ玉米醇溶蛋白、球蛋白、ADH啟動(dòng)子、熱休克、肌動(dòng)蛋白以及遍在蛋白。86.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，所說的酶促核酸分子是錘頭、發(fā)夾、肝炎Δ病毒、I組內(nèi)含子、II組內(nèi)含子、VS核酸或RNA酶P核酸構(gòu)型的。87.權(quán)利要求86的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的具有RNA切割活性的酶促核酸以單體被編碼。88.權(quán)利要求86的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的具有RNA切割活性的酶促核酸以多體被編碼。89.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的編碼所說的具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸可操作地連接到開放讀框的3’末端上。90.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的基因是內(nèi)源基因。91.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，該植物以5’到3’轉(zhuǎn)錄方向包含在所說的植物中有功能的啟動(dòng)子；SEQIDNO1的編碼Δ9基因的雙鏈DNA(dsDNA)序列，其中所說的dsDNA的轉(zhuǎn)錄鏈互補(bǔ)于所說植物的內(nèi)源RNA；在所說的植物中有功能的終止區(qū)；92.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，該植物以5’到3’轉(zhuǎn)錄方向包含在所說的植物中有功能的啟動(dòng)子；SEQIDNO25的編碼顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)基因的雙鏈DNA(dsDNA)序列，其中所說的dsDNA的轉(zhuǎn)錄鏈互補(bǔ)于所說植物的內(nèi)源RNA；在所說的植物中有功能的終止區(qū)；93.權(quán)利要求1的酶促核酸分子，其中所說的基因是內(nèi)源基因。94.權(quán)利要求63的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，其中所說的基因是內(nèi)源基因。95.圖42的載體，其中所說的載體用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。全文摘要一種具有RNA切割活性的酶促核酸分子,其中所說的核酸分子在植物中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。一種包含編碼具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸的轉(zhuǎn)基因植物,其中所說的核酸分子在所說的植物中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。文檔編號(hào)C12N5/10GK1196091SQ96196925公開日1998年10月14日申請(qǐng)日期1996年7月12日優(yōu)先權(quán)日1995年7月13日發(fā)明者M(jìn)·G·維克,B·E·艾丁頓,J·A·麥斯維根,P·A·O·梅爾羅,郭立寧,T·A·斯科庫特,S·A·揚(yáng),O·福爾科茨,D·J·梅爾羅申請(qǐng)人:里伯希姆藥品公司,唐艾蘭科公司