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調(diào)節(jié)病理通透性改變的抑制分泌因子肽的制作方法

文檔序號(hào):450185閱讀:517來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:調(diào)節(jié)病理通透性改變的抑制分泌因子肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及新的具有流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)特性以及多核(polynucleic)調(diào)節(jié)特性的抑制分泌因子和編碼該因子的多聚核酸及其使用。
身體的所有細(xì)胞和組織關(guān)鍵依賴于一個(gè)穩(wěn)定而正常的流體環(huán)境加上充足的血液供應(yīng)。這些支持系統(tǒng)中一個(gè)或兩個(gè)紊亂可迅速致命。關(guān)于流體失衡,主要存在兩種不同的系統(tǒng)A.水腫,其特征在于在細(xì)胞間組織或體腔中不正常的流體積累,或B.脫水,在嚴(yán)格的意義上,其意思為僅僅水的丟失,但實(shí)際上通常用于描述水和離子的共同丟失。
水腫或脫水的最常見形式有腹瀉、炎癥型內(nèi)臟病(inflammatory bowel diseases)、腦水腫、哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎、青光眼、不同形式的病理性顱內(nèi)壓(增加或減低)、中耳內(nèi)壓力改變?nèi)鏜orbus Meniere、皮炎、皮膚或皮膚相鄰腺體的化學(xué)或物理紊亂如乳腺炎、多種形式的內(nèi)分泌紊亂如尿崩癥、原發(fā)性醛甾酮過(guò)多癥、Cushing’s綜合癥和Morbus Addison、腎病如腎盂腎炎和腎小球性腎炎、代謝疾病如粘液性水腫和急性間歇性卟啉癥、以各種藥物如抗糖尿病藥、三環(huán)抗抑郁藥(tricyclic antidepressants)、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑(cytostatics)、巴比妥酸鹽、麻醉劑及其類似物處理過(guò)程中的副作用。
腹瀉由腸道中電解質(zhì)和水的通透性改變所致。該紊亂常由細(xì)菌腸毒素如大腸桿菌,空腸彎曲桿菌,霍亂弧菌,痢疾桿菌和艱難梭菌產(chǎn)生的毒素所致。該紊亂也可由腸感染所致。由于水的攝入與電解質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的攝入相偶聯(lián),幫頻繁腹瀉的動(dòng)物患有營(yíng)養(yǎng)不良,導(dǎo)致正在生長(zhǎng)動(dòng)物每日體重獲得的延緩。身體通過(guò)神經(jīng)激素機(jī)制抵消這些反應(yīng)如腸粘膜(intestinal mucosa)中的中間神經(jīng)元釋放抑生長(zhǎng)素(somatostatin)和麻醉肽(opiate peptides)。這些多肽能夠逆轉(zhuǎn)流體分泌和腹瀉。
最近描述的抑制分泌因子(AF)部分地從豬垂體腺中得到純化并顯示逆轉(zhuǎn)由多種腸毒素誘導(dǎo)的病理性分泌。母豬奶中高水平的AF保護(hù)哺乳小豬免受新生腹瀉。
抗菌藥已廣泛地在人和獸醫(yī)藥中用于腹瀉治療。它們也用作豬、小牛及小雞的飼料添加劑。然而,由于抗性細(xì)菌在消化道中迅速形成,抗腸炎抗生素的使用一般不被接受進(jìn)人類藥物中且它們的使用在獸醫(yī)藥中也減少。
其它的止瀉劑抵消腸系膜的分泌。由于這些藥物是針對(duì)宿主動(dòng)物的,故抗藥性形成不可能。這類藥包括神經(jīng)活性藥如苯硫胺素(phenothiamines)和硫呫噸(thioxanthenes)。由于一些嚴(yán)重的副作用在大多數(shù)國(guó)家不接受這類藥用于治療腹瀉。其它藥物有鴉片制劑的衍生物如可待因和loperamide。由于這些藥物主要通過(guò)抑制腸的活動(dòng)性(mobility)而起作用,故它們也抑制消化道中病原菌的清除且肯定不應(yīng)推薦為抗痢疾桿菌或寄生蟲。最近已引入抑生長(zhǎng)素衍生物,但由于藥物施用的困難和與生長(zhǎng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)可能的相互作用,到目前為止僅具有有限的使用。
由于獲得純化抑制分泌因子蛋白的困難,該因子到目前為止還沒(méi)有直接用于治療腹瀉和營(yíng)養(yǎng)不良。然而,在施以特定食物(SE Patent No.9000028-2)的家養(yǎng)動(dòng)物中誘導(dǎo)類似的蛋白是可能的。施以這種飼料的豬獲得高水平的AK樣蛋白且與匹配的對(duì)照相比及生長(zhǎng)速率有顯著的提高。用艱難梭菌毒素A攻擊的大鼠中的AF不僅保護(hù)其抑制腸的分泌而且免受消化道發(fā)炎和出血。
本發(fā)明的主要目的是提供一種新的重組蛋白和其同源物及其片段(肽)用于使病理性流體的運(yùn)輸正?;_@些蛋白和肽統(tǒng)稱為抑制分泌因子(AF)。AF的使用也部分抑制、或完全排除各種病因炎癥反應(yīng)的形成?;謴?fù)到正常(流體運(yùn)輸或炎癥)通過(guò)使用蛋白或肽加以獲得。此外AF蛋白或肽通過(guò)各種粘膜有效地吸收而不丟失活性(當(dāng)與靜脈內(nèi)用藥相比較時(shí))。因此,存在多種處方,并且正確地施用蛋白或肽使迅速重建紊亂流體(水和離子)的平衡、炎癥反應(yīng)或者同時(shí)重建二者成為可能。
總之,重組AF(rAF)和其同源物及片段可用于免疫檢測(cè)、作為飼養(yǎng)動(dòng)物的飼料添加劑和止瀉劑以及抗包括水腫、脫水和/或炎癥疾病的藥物。
本發(fā)明的目的如下基本上具有由SEQ ID No.1中顯示氨基酸序列的重組蛋白或其同源物或片段。
顯示于SEQ ID NO.1中重組蛋白的片段,該片段選自包括SEQ IDNO.1中顯示氨基酸序列中下面的氨基酸序列a)氨基酸nos.35-42b)氨基酸nos.35-46c)氨基酸nos.36-51d)氨基酸nos.36-80e)氨基酸nos.1-80肽X1VCX2X3KX4R相應(yīng)于包括顯示于SEQ ID NO.1重組蛋白中no.35-42氨基酸的片段,其中X為I或空缺,X2為H、R或K,X3為S、L或別的中性氨基酸且X4為T或A。
抗體,抗基本上具有SEQ ID NO.1中顯示氨基酸序列的重組蛋白或其同源物或其片段。
結(jié)合抗體的蛋白,該抗體對(duì)基本上具有SEQ ID No.1中顯示氨基酸序列的重組蛋白或其同源物或其片段是特異性的。
用于使病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正?;慕M合物,包括有效量的基本上具有SEQ ID NO.1中顯示氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段作為活性成分。
基本上具有SEQ ID NO.1中顯示氨基酸序列的重組蛋白、同源物或其片段用于制備使病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正?;慕M合物。
用于使脊椎動(dòng)物動(dòng)物病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正?;娘暳希渲邪ɑ旧暇哂蠸EQ ID NO.1中顯示氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段,或者能夠產(chǎn)生這種蛋白或同源物或其片段的生物作為活性劑。
使脊椎動(dòng)物病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正常化的方法,包括向脊椎動(dòng)物施用有效量的基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段,或者產(chǎn)生所述蛋白或同源物或片段的生物。
抗基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段的特異性抗體用于檢測(cè)生物體中所述蛋白或片段。
編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中的序列的重組蛋白或同源物或其片段的核酸。
編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段的核酸用于制備相應(yīng)蛋白或同源物或其片段。
源自編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中序列的重組蛋白或同源物或其片段的核酸的探針或引物用于檢測(cè)生物體中核酸的存在。
包括編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段的核酸的載體。
除了人類以外的宿主,其包含有編碼基本上具有顯示于SEQ IDNO.1中氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段的核酸的載體。
除了人類以外的生物品種、它能夠產(chǎn)生基本上具有顯示于SEQ IDNO.1中氨基酸序列的重組蛋白或同源物或其片段。
作為能夠產(chǎn)生重組蛋白使用的生物體可由不同類型的生物體所組成,如重組細(xì)菌和真核生物,如酵母、植物和除人類以外的脊椎動(dòng)物。
盡管嘗試了10年通過(guò)?,F(xiàn)的生化技術(shù)純化AF,但還不可能獲得均一形式的AF。然而,通過(guò)一種新的制備半純AF的方法通過(guò)免疫組化方法用于免疫和篩選抗血清篩選到一種合適的抗血清。用這種抗血清在大腸桿菌中克隆表達(dá)AF的重組人類cDNA是可能的。
該新cDNA序列被測(cè)定并顯示出為獨(dú)特的。通過(guò)該序列信息,構(gòu)建與人類和豬垂體RNA雜交的寡核苷酸探針。約1400個(gè)堿基對(duì)的該RNA的大小符合包括1309個(gè)堿基對(duì)測(cè)序cDNA的大小加上多聚(A)尾部。已顯示大鼠垂體腺的部分cDNA序列與人類的cDNA一致反映不同種AF基因?yàn)楸J氐钠胀ńY(jié)構(gòu)。該相似使應(yīng)用相同的寡苷酸探針從不同種中鑒定編碼AF的RNA和DNA成為可能。
此外表達(dá)生物活性形式的rAF是可能的。與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶呈融合蛋白形式的AF蛋白在大腸桿菌中大量表達(dá)并通過(guò)親和層析純化到均質(zhì)。經(jīng)凝血酶裂解融合蛋白后,重組AF(rAF)顯示出極大的活性,44ng(10-12摩爾)導(dǎo)致大鼠腸中霍亂毒素誘導(dǎo)的流體分泌的半最大化(half-maximal)抑制。
通過(guò)基因技術(shù)制備更小的rAF片段。顯示其活性在于由7到8個(gè)氨基酸所組成的小序列。這借助于化學(xué)固相合成加以證實(shí),通過(guò)該技術(shù)制備出八肽并且顯示出基于相同的摩爾數(shù)其與rAF幾乎具有相同的生物活性。在定點(diǎn)合成的幫助下構(gòu)建多種活性位點(diǎn)內(nèi)的序列并顯示替代某些氨基酸,而沒(méi)有消除生物活性是可能的。
通過(guò)腸袢環(huán)模型(intestinal loop model)測(cè)量流體分泌小腸節(jié)段(袢環(huán))通過(guò)兩條縫合線(satures)連接;在袢環(huán)中注射一定量的腸毒素。如果測(cè)試抑制分泌藥物將它們?cè)诙舅毓舻囊恍r(shí)前和二小時(shí)后之間注射。注射通過(guò)三條不同的途徑完成;靜脈內(nèi),腸內(nèi)和鼻內(nèi)。毒素攻擊后5小時(shí)流體在袢環(huán)中積累。根據(jù)每厘米腸積累流體的重量計(jì)算分泌。
既直接通過(guò)氨基酸測(cè)序又間接通過(guò)從cDNA序列的推導(dǎo)測(cè)定蛋白的序列。
重組AF似乎產(chǎn)生很少的毒性或系統(tǒng)效應(yīng),因?yàn)樵谑┯韪哂趯?dǎo)致半最大化抑制100倍的劑量的大鼠中沒(méi)有注意到明顯的毒性反應(yīng)。由于注射于小腸中時(shí)其是有效的故可以口服施用。
與被測(cè)試的似乎是僅當(dāng)在毒素接觸注射時(shí)有效的天然AF制劑相反,重組AF在毒素攻擊后注射時(shí)也抑制分泌。因此,rAF既可用于預(yù)防上又可用于治療上。
此外,已顯示rAF和其肽段抑制由艱難梭菌毒素A導(dǎo)致腸道中的細(xì)胞毒反應(yīng)和炎癥。借助于著色通透性測(cè)試顯示rAF和其片段不僅在腸粘膜而且在調(diào)節(jié)腦流體壓的plexus choroideus中逆轉(zhuǎn)由霍亂毒素誘導(dǎo)的病理性通透性改變。
在兔子中制備抗rAF的抗血清并用于酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。此分析可用于測(cè)量身體流體或飼料中的AF。
通過(guò)瓊脂糖偶聯(lián)rAF柱的親和層析純化抗AF(天然或重組)抗體的方法報(bào)告如下。
該抗體對(duì)于通過(guò)免疫組化技術(shù)對(duì)組織中AF的檢測(cè)和在Western-雜交中對(duì)AF的檢測(cè)顯示是有效的。
通過(guò)下面非限制性實(shí)施例加上伴隨的附圖現(xiàn)將更進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1.制備用于cDNA克隆的抗AF抗體通過(guò)瓊脂糖上的親和層析和等電聚焦方法從豬血中制備抑制分泌因子。向1升豬血(含有抗凝物質(zhì))中加入1g硫代硫酸鈉和1mg苯甲磺酰氟。離心分離血細(xì)胞并將清徹的血漿經(jīng)具有瓊脂糖凝膠6B(發(fā)瑪西亞LKB生物技術(shù)Stockholm)的柱洗脫,凝膠柱相應(yīng)于約10%的溶液體積。以3倍柱床體積的磷酸緩沖鹽(PBS=0.15M Nacl,0.05M磷酸鈉,pH7.2)沖洗后,將柱以2倍柱床體積溶解于水PBS中的1M α-甲基-D-葡糖苷洗脫。將洗脫液濃縮并用“Ω10K flow through”濾膜(Filtron技術(shù)公司)在水中透析。隨后將餾傷在400ml等電聚焦柱(LKB,瑞典)中pH4-6的兩性電解質(zhì)(發(fā)瑪西亞)梯度中通過(guò)等電聚焦分離。收集具有4.7~4.9等電點(diǎn)的餾份并于PBS中透析。因此,將部分純化的AF分成小的等份試樣并用于按前述方法在兔中制備抗血清。
將兔免疫并測(cè)試其血清染色人類垂體腺切片中細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的能力(實(shí)施例6中描述的方法)。僅一種血清顯示特異的且明顯的細(xì)胞內(nèi)染色而不染色細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。選擇該抗血清用于篩選在大腸桿菌中表達(dá)蛋白的人垂體腺cDNA/λ噬菌體GT11文庫(kù)。
實(shí)施例2.篩選人垂體腺和腦的cDNA文庫(kù)正常人垂體腺(源自從9個(gè)白種人庫(kù)中獲得的組織)的5′-段cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech Laboratories。為了篩選該文庫(kù),將噬菌體以在大腸桿菌Y1090中每150mm盤中3×104個(gè)噬菌斑形成單位涂板。將前述的抗豬AF的兔抗血清以0.5體積的大腸桿菌Y1090裂解液于23℃吸附4小時(shí)并稀釋至1∶400的比例且根據(jù)Young和Davis(1)完成篩選。堿性磷酸酶交聯(lián)的羊抗兔抗體用作2級(jí)抗體(Jackson)。挑取陽(yáng)性噬菌斑洗脫入噬菌體懸液介質(zhì)[20mm TrisHcl(pH7.5),100mM Nacl,10mM MgSO4,2%明膠],重新涂板并篩選,直到所有測(cè)試的噬菌斑均為陽(yáng)性為止。
cDNA再次克隆-以Wizard Lambda Preps(Promega)分離AF重組子噬菌體DNA并以EcoRⅠ消化。以Sephagles Band Prep試劑盒(發(fā)瑪西亞)純化插入子、再次按制造商所述克隆入pGex-1λT載體(發(fā)瑪西亞)并轉(zhuǎn)染到Epicurian Coli XL-Blue、Top1細(xì)胞或BL21細(xì)胞(三種均來(lái)自Stratagen)。沒(méi)有特別說(shuō)明時(shí)在BL21細(xì)胞中制備rAF或重組肽(rpeptides)(2)。
通過(guò)PCR的cDNA擴(kuò)增-為了獲得丟失的cDNA5′-末端進(jìn)行一種稱為RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)的基于PCR的方法。產(chǎn)生具有連接到人類腦cDNA分子3′-末端的錨定寡核苷酸的5′-RACE-即用cDNA的修飾RACE方法購(gòu)自Clontech Laboratories。用互補(bǔ)于錨定物的5′引物和2條嵌套式(nested)基因特異性3′PCR引物A和B(A=堿基429-411且B=堿基376-359);圖(a)從5′-RACE-即用cDNA中用兩步PCR擴(kuò)增步驟來(lái)擴(kuò)增5′-末端。為了表達(dá)相應(yīng)的肽并測(cè)試它們的生物學(xué)特性進(jìn)一步擴(kuò)增各種更小部分的RACE片段。在這些寡核苷酸片段和它們相應(yīng)肽的頭部和尾部堿基和氨基酸的位置顯示于表1。豬和牛cDNA(Clontech Laboratories)用作擴(kuò)增相應(yīng)于表1中N3片段的模板。序列變異也通過(guò)定點(diǎn)誘變?nèi)斯げ迦耄渲泻铣闪讼鄳?yīng)于位置168-193的各種寡苷酸以逐一替代氨基酸35-42(如SEQ ID No.1中顯示的位置)。通過(guò)用植入錨定物中的EcoRⅠ位點(diǎn)和基因特異性引物將擴(kuò)增的DNA片段克隆入pGex-1aT載體。為了驗(yàn)證通過(guò)RACE方法而獲得的序列,用含有額外EcoRⅠ-切割位點(diǎn)的引物對(duì)C/D(圖1b)擴(kuò)增人類垂體腺和腦的雙鏈cDNA(Clontech)。設(shè)計(jì)引物以允許整個(gè)開放閱讀框(ORF)被擴(kuò)增。以EcoRⅠ消化預(yù)其大小的垂體和腦PCR產(chǎn)物,分離并克隆入質(zhì)粒pGex-1λT載體。
DNA測(cè)序和寡核苷酸-質(zhì)粒pGex-1λT的DNA用作模板用于通過(guò)雙脫氧鏈終止方法(15)用測(cè)序酶2.0做試劑盒(美國(guó)生化公司)對(duì)插入子進(jìn)行測(cè)序??截惥o接于插入DNA上游和下游pGex-1λT區(qū)域的起始正向和反向引物獲自發(fā)碼西亞。隨后的引物根據(jù)獲得的序列信息合成(Scandinavian基因合成AB)。為了避免在5′-RACE方法中Taq聚合酶的堿基改變將三種不同的PCR克隆測(cè)序。
通過(guò)用MacVector 4.1(Eastman化學(xué)公司)編輯和分析核苷酸序列及推導(dǎo)的蛋白序列數(shù)據(jù)。為了預(yù)測(cè)cDNA插入子相應(yīng)的氨基酸序列,比較不同閱讀框密碼子的使用并得出一個(gè)大的并放閱讀框。通過(guò)用Entrez CD-ROM盤(美國(guó)生物技術(shù)信息中心,Bethesda,美國(guó))完成DNA和蛋白序列的查詢。
分子克隆和cDNA序列的分析-豬的多價(jià)抗AF蛋白抗血清用于篩選人類垂體腺cDNA。分離兩個(gè)表達(dá)免疫反應(yīng)AF的克隆,從噬菌體λ中營(yíng)救出來(lái)并按發(fā)碼西亞提供的試劑盒中的描述將其重新克隆λ載體pGex-1λT的EcoRⅠ位點(diǎn)。限制性分析分別得到1100和900bp大小的插入子。兩個(gè)克隆的DNA-測(cè)序顯示除了一個(gè)替代外同源性是完全的(圖1,在位置1011C替代T)??寺?-5′端上游序列通過(guò)RACE方法獲得。該片段具有376bp的總長(zhǎng)度(不包括5′-末端的合成核苷酸臂)。全長(zhǎng)重建cDNA含有1309個(gè)堿基對(duì)接著一個(gè)多聚A尾部,其接著一個(gè)多聚A信號(hào)(圖1,位置1289-1295)。鑒定出1146bp(位置63-1208)的開放閱讀框(ORF)。
實(shí)施例3.哺乳動(dòng)物AF蛋白在重組質(zhì)粒中的表達(dá)融合蛋白的純化和構(gòu)建-通過(guò)免疫學(xué)篩選和全長(zhǎng)cDNA的PCR擴(kuò)增而獲得的cDNA-克隆連接到pGex-1λT。該載體允許外源蛋白融合到Schistosoma japonicum 26KDa谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的C-末端而在大腸桿菌中表達(dá),谷胱甘肽可在非變性條件借助于發(fā)碼西亞提供的試劑盒加以親和純化。簡(jiǎn)言之,以重組pGex-1λT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋于新鮮培養(yǎng)基中并于37℃進(jìn)一步培養(yǎng)3小時(shí)。通過(guò)0.1mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)誘導(dǎo)蛋白表達(dá),并經(jīng)30℃進(jìn)一步培養(yǎng)4小時(shí)后,沉淀細(xì)胞并重懸于PBS。將細(xì)胞通過(guò)超聲裂解,以1%Triton x-100處理并以12000×g離心10分鐘;含有表達(dá)融合蛋白的上清通過(guò)將裂的液經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖(發(fā)碼西亞)加以純化。融合蛋白或者通過(guò)以無(wú)谷胱甘肽的競(jìng)爭(zhēng)洗脫或者以10U的牛凝血酶切割過(guò)夜以從GST親和尾部去除AF-蛋白。用pGex質(zhì)粒和純化重組蛋白或肽的整個(gè)方法通過(guò)發(fā)碼西亞提供的試劑盒方法加以完成。
重組AF蛋白的序列和大小-為了證實(shí)編碼序列,通過(guò)用PCR擴(kuò)增垂體和腦的cDNA而分離全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄子。用引物對(duì)C/D,分離1215bp的與克隆4序列一致的序列(圖-1)。該開放閱讀框編碼具有41.14KDa計(jì)算分子量和4.9計(jì)算PI的氨基酸。
將AF克隆1、2和3以及寡核苷酸N1-N5(圖-1和表1)連接到pGex-1λT質(zhì)粒載體從而使ORF在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白的閱讀框內(nèi)。該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化λ大腸桿菌,并以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。用抗豬抑制分泌因子的抗血清將純化的融合蛋白和凝血酶切割的AF蛋白或肽進(jìn)行SDS-PAGE并進(jìn)行Western印跡(圖2)。蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色顯示出每種蛋白的分離帶,除了GST-AF-1蛋白被證明降解成更小的成分。
固相肽合成一個(gè)應(yīng)用系統(tǒng)肽合成儀中的固相上制備(K.J.Ross-Petersen AS)更大的肽(表1中的P7到P8)。根據(jù)用于水/乙腈中0.1%三氟乙酸的線性梯度于Deltapak C18,300A中的反相HPLC估計(jì)每種肽的純度為93-100%。
氨基酸測(cè)序-為了進(jìn)一步證實(shí)鑒定的ORF進(jìn)行蛋白序列分析。將純的AF蛋白在10%大板(macro-slab)凝膠SDS-PAGE(14)中走膠并通過(guò)電印跡(伯樂(lè))將蛋白轉(zhuǎn)移至Problot膜(應(yīng)用生物系統(tǒng))上。通過(guò)Ponceau S染色觀察到的點(diǎn)從印跡中切下并通過(guò)自動(dòng)Edman降解于自動(dòng)測(cè)序儀(應(yīng)用系統(tǒng))上測(cè)序蛋白的前20個(gè)氨基酸。
測(cè)定克隆-2和克隆-3的N-末端序列并顯示分別與預(yù)期序列的63-75和130-140氨基酸完全匹配。
與從GenBank中得到的其它蛋白序列相比較顯示rAF序列(圖1)在其所有部分中都是獨(dú)一無(wú)二的且沒(méi)有報(bào)導(dǎo)類似的序列。
當(dāng)根據(jù)Kyte-Doolittle(22)分析時(shí)該蛋白的起初10個(gè)殘基似乎是相對(duì)疏水的且可能構(gòu)成信號(hào)肽,其在蛋白的細(xì)胞外分泌之前被切除。這種解釋由Western印跡分析所支持(圖3),其中重組蛋白似乎較從垂體腺中提取的蛋白具有略高的分子量。然而,這些差異中的有些也可能是由于在重組蛋白中構(gòu)成融合蛋白的凝血酶切割位點(diǎn)的額外5個(gè)氨基酸所致。
實(shí)施例4.制備和測(cè)度抗rAF抗血清抗重組GST-AF融合蛋白的抗血清-在兔子中制備用于ELISA、Western印跡和免疫組化研究的抗純化融合蛋白GST-AF-1、GST-AF-2和凝血酶切割的純AF-1蛋白(=rAF)抗體。每只兔子施以1mlPBS中100μg抗原混合以等體積的Frend氏完全佐劑;每次免疫分8-10部分注射于背部皮內(nèi)。在第3和第5周注兩次具有50μg抗原的增強(qiáng)劑量,最后一次沒(méi)有Frend氏完全佐劑。最后一次增強(qiáng)免疫6天后將兔放血并制備血清貯存于-20℃。以點(diǎn)印跡分析測(cè)試血清的敏感性。將GST-AF-2應(yīng)用于1/5稀釋液中的ECL硝酸纖維素膜,并將抗血清稀釋1∶1000。將該膜以PBS中1%的牛血清蛋白(BSA)于4℃封閉16小時(shí),并且然后與兔抗-GST-AF的1∶800稀釋液或豬AF抗血清孵育1.5小時(shí)。用堿性磷酸酶交聯(lián)的羊抗-兔免疫球蛋白接著以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽和P-硝基藍(lán)四唑鎓(寶靈曼)形成印跡。在該測(cè)試中估計(jì)抗原檢測(cè)的極限為約1ng。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡-人類和豬垂體腺提取物和純AF-蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在10%的丙烯酰胺微板膠中完成,基本上按Laemmli(4)的描述,具有以下的修改,即以相應(yīng)的摩爾數(shù)以N,N′-二烯丙基酒石二酰胺(diallyltartardiamide)替代作為交聯(lián)物的雙丙烯酰胺(bis-acrylamide)。派若寧(Pyronin Y)(Sigma)用作電泳前沿標(biāo)記。預(yù)染的分子量參照購(gòu)自BDH。然后將蛋白或者以考馬斯亮藍(lán)染色或電泳轉(zhuǎn)移至0.45mm孔徑的ECL硝酸纖維素(Amersham)用于免疫印跡。隨后與BSA的孵育、交聯(lián)抗-IgG和磷酸酶底物與前述用于點(diǎn)印跡的方法相同。
按上述考馬斯亮藍(lán)染色顯示出沒(méi)有GST-AF-1蛋白的分離帶,這也許是由于蛋白水解降解成更小的成分。然而,在Western印跡分析中全長(zhǎng)蛋白較降解產(chǎn)物得到強(qiáng)得多的信號(hào)(圖2b)。與抗豬AF抗血清的強(qiáng)烈反應(yīng)顯示該重組蛋白的確與AF具有相同的免疫反應(yīng)性。全長(zhǎng)蛋白的分子量似乎約60KDa,其高于根據(jù)氨基酸組成估計(jì)的41139Da的真實(shí)摩爾重量(true mol.wt)。此外,該蛋白也以產(chǎn)生的抗GST-AF-2并結(jié)合到凝血酶切割蛋白上的抗血清進(jìn)行免疫印跡和檢測(cè)(圖3)。
抗重組GST-AF-2抗血清與表觀分子量為60KDa的自然產(chǎn)生AF蛋白和一些更小的成分(可能為酶促降解產(chǎn)物)起反應(yīng)(圖3a)。
AF-濃度的ELISA測(cè)定-根據(jù)前述方法(5)用抗-AF-1和抗-AF-2進(jìn)行ELISA分析。如圖3b所示,以粗抗血清測(cè)試的靈敏度在1-10μg之間而以親和純化抗體測(cè)試具有5-50μg蛋白的靈敏度。
實(shí)施例5.垂體腺RNA的Northern印跡分析Northern印跡分析,人類垂體腺獲自sahlgrenska醫(yī)院死后的病人(postmortem)(得到瑞典健康委員會(huì)允許;2§transplantationslagen,1975:190)。為了獲得RNA,以硫氰酸胍RNA根據(jù)Chomcynski和Sacchi(6)提取垂體腺。多聚腺苷酸化RNA通過(guò)商業(yè)上可得到的試劑盒(發(fā)瑪西亞)用Ohigo dT-纖維素柱加以篩選。此外,使用了購(gòu)自Clontech 107個(gè)個(gè)體的人類垂體mRNA庫(kù)。5μg的每種poly(A+)RNA樣品以乙二醛處理并在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳(7)。在0.05M NaOH中毛細(xì)堿性轉(zhuǎn)移3小時(shí)至HybondN+尼龍膜(Amersham)后,預(yù)雜交和雜交每個(gè)于42℃進(jìn)行24小時(shí)。雜交液中含50%的甲醛,5×SSPE,10×Denhard’s溶液并具有250μg/ml變性低分子量DNA和50μg/ml多聚腺苷酸。印跡以四種不同的反義28bp寡核苷酸檢測(cè),包括序列(圖1)中的位置132-105(引物E),297-270(引物F),748-721(引物G)和833-806(引物H);探針以末端轉(zhuǎn)移酶(寶靈曼)加上[α32P]ddATP(Amersham)進(jìn)行3′末端標(biāo)記并于Nick柱(發(fā)瑪西亞)上純化。以5×SSPE/0.1%SDS-0.5×SSPE/O.1%SDS于42℃洗5次,每次30分鐘。最后重復(fù)洗一次。將濾膜與Hyperfilm MP(Amersham)曝光7天。
在垂體腺中的表達(dá)-以與克隆的cDNA不同序列雜交的四種寡核苷酸探針的混合物進(jìn)行Northern印跡分析(圖4)。在垂體腺分離的mRNA中探針與約1400bp的單個(gè)帶雜交。以人為材料獲得了最強(qiáng)的信號(hào),但豬材料也交叉反應(yīng)。
實(shí)施例6.垂體腺切片中AF的分布物種及組織-人類垂體腺獲自Sahlgrenska醫(yī)院的死后病人(得到瑞典健康委員會(huì)允許;§2 transplantationslagen,1975:190)。腺體除了用于組織學(xué)檢查的外冷凍于-70℃,組織學(xué)檢查的于溶于磷酸緩沖鹽中(PBS=O.15M Nacl,0.05M磷酸鈉,pH7.2)4%的多聚甲醛中固定24小時(shí)并之后轉(zhuǎn)移至7.5%PBS中的蔗糖中。獲自屠宰場(chǎng)5-7月齡的豬垂體腺在運(yùn)輸過(guò)程中置于干冰上且直到使用前保持冰凍于-70℃。2-3月齡的Sprague-Dawley大鼠獲自瑞典Bsck大學(xué)AB,Sollentuna。用于免疫的兔子(New Zealand White(獲自瑞典的LidkopingKaninform)。
免疫組化-將固定過(guò)的垂體腺冰凍于液氮中并制備7μm厚的冰凍切片。每個(gè)樣本中包括腺體不同部分的5-10張切片固定于顯微鏡載玻片上。將切片用5%脫脂奶粉封閉并與1∶4000-1∶8000稀釋的第一兔抗血清(抗-GST-AF-2融合蛋白)于濕室中于4℃孵育過(guò)夜。以緩沖液沖洗后,將標(biāo)本與堿性磷酸酶-交聯(lián)的1∶50稀釋的豬抗兔免疫球蛋白(Dako A/S)于23℃孵育1小時(shí)。按別處所述(8)以磷酸酶底物觀察免疫反應(yīng)。對(duì)照切片與以過(guò)多GST-AF-2蛋白或以除第一抗體以外的所有孵育步驟吸附的免疫血清一起孵育。
垂體腺切片中AF的分布人類垂體腺切片中AF的分布以免疫組化技術(shù)加以研究(圖5)。在所有研究的標(biāo)本中,腺垂體中適當(dāng)數(shù)目的細(xì)胞被染色;免疫染色的物質(zhì)似乎位于細(xì)胞質(zhì)中的顆粒中;以過(guò)多GST-AF-2蛋白免疫血清的預(yù)吸附(Preabsorption)抹去了信號(hào)。在后部分(神經(jīng)垂體)中沒(méi)有觀察到染色。
在垂體腺中免疫反應(yīng)物質(zhì)的分布證明僅在前葉(腺垂體)的分泌細(xì)胞中有AF的細(xì)胞內(nèi)分布。從該葉中釋放的蛋白包括生長(zhǎng)激素、促甲狀腺素、催乳素和黃體生成素。這些激素從細(xì)胞內(nèi)位置到血管系統(tǒng)的通路由下丘腦中神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的釋放因子所激發(fā)。實(shí)施例7.rAF的生物學(xué)活性抑制分泌活性、在前述的大鼠腸袢環(huán)模型中測(cè)量抑制分泌活性(9)。將空腸袢環(huán)用3μg霍亂毒素攻擊。用霍亂毒素攻擊之前或之后注射不同劑量的純化AF-1-蛋白或PBS(對(duì)照)。5小時(shí)后記錄腸袢環(huán)中積液的重量(mg/cm)。每種AF制品在至少六只大鼠中測(cè)試。Fisher’sPLSD用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
rAF蛋白的生物學(xué)活性-在大鼠模型中測(cè)試大腸桿菌中產(chǎn)生的克隆-1純r(jià)AF蛋白的生物學(xué)活性。在腸用霍亂毒素攻擊之前20-30秒靜脈內(nèi)注射時(shí)rAF抑制腸流體分泌的能力顯示于圖6。在僅以緩沖液注射的對(duì)照動(dòng)物中,霍亂毒素導(dǎo)致明顯的分泌,每cm腸412±9mg流體。純r(jià)AF導(dǎo)致與對(duì)緩沖液反應(yīng)明顯不同的霍亂分泌劑量依賴性抑制(P<0.01,n=6)。9ng克隆-1蛋白足以減少反應(yīng)34%,而44ng(10-12mol)和220ng分別減少反應(yīng)46%和78%。重組AF的生物學(xué)活性大于任何我們已知的腸毒素的生物學(xué)活性且大于任何改變水和電解質(zhì)運(yùn)輸腸激素或神經(jīng)肽的生物學(xué)活性。此外,人類rAF在大鼠中的活性水平驚人地高,這也許反映在不同物種rAF分子中保守的普遍結(jié)構(gòu)。此假說(shuō)由在Western印跡和Northern印跡分析獲得的人類與豬材料的交叉反應(yīng)性所支持。
在霍亂毒素攻擊前20-30秒和攻擊后90分鐘靜脈內(nèi)注射時(shí)0.5μg rAF抑制腸分泌的能力進(jìn)行了比較(圖7)。與對(duì)照動(dòng)物相比兩次施用得到了顯著的抑制(P<0.01,n=6)。因此,與天然AF相比,當(dāng)毒素攻擊后施用時(shí)重組蛋白也有效,這使得rAF對(duì)腹瀉的治療是有用的。
將3μg的rAF注射入8-10cm長(zhǎng)的袢環(huán)中,該環(huán)位置緊鄰用霍亂毒素攻擊的環(huán)。rAF在毒素攻擊前20-30秒或之后90分鐘被誘導(dǎo)。在圖8中顯示與對(duì)照組相比兩個(gè)測(cè)試組獲得了流體分泌的顯著減少(P<0.01,n=6);兩個(gè)測(cè)試組之間沒(méi)有觀察到差異。該實(shí)驗(yàn)表明rAF在口服后是有活性的并且如果沒(méi)有獲得嚴(yán)重的副作用可用作動(dòng)物飼料添加劑。
在上述實(shí)施例中,rAF在Epicurian Coli XL-1細(xì)胞中制備。在這些細(xì)胞中許多制備的rAF被降解成更小的肽。當(dāng)rAF在BL21細(xì)胞中制備時(shí)僅小部分rAF被降解而在Topl細(xì)胞中沒(méi)有觀察到降解。令人驚奇的是生物學(xué)活性與降解程度成比例,即,更多的降解導(dǎo)致更高的活性。因此制備各種較短的片段以測(cè)試它們可能的生物學(xué)活性。
如表1中所示。在霍亂毒素攻擊之前按前述用于完整rAF相同的方法靜脈內(nèi)測(cè)試這些片段。測(cè)試克隆2和3表達(dá)的0.1,1和10μg量的肽對(duì)毒素反應(yīng)沒(méi)有影響。相反由RACE片段(克隆4)表達(dá)的1微克肽具有顯著的效應(yīng)。從RACE片段中制備許多較短的構(gòu)建體并在pGex-1-λ中表達(dá)。如表1中所示,發(fā)現(xiàn)活性位點(diǎn)位于氨基酸殘基35到51之間。為了更準(zhǔn)確地測(cè)定活性位點(diǎn)通過(guò)固相肽合成制備三段小肽。它們中的兩個(gè)是有活性的,肽35-46(P3)和肽35-42(P1);后者的八肽IVCHSKTR(P1)在不到1ng的劑量與相同摩爾數(shù)(in a molar basis)的完整rAF幾乎具有相同的活性。相反較短的六肽VCHSKT(P2)當(dāng)于1ng和10μg之間的劑量測(cè)試時(shí)沒(méi)有效應(yīng)。
相應(yīng)于人類片段P1但具有某些改變和/或缺失的肽X1VCX2X3KX4R也通過(guò)定點(diǎn)誘變加以制備并測(cè)試其生物學(xué)活性。牛和豬cDNA序列也進(jìn)行了比較。這些研究顯示出下面的改變和/或缺失X1為I或缺如X2為H,R或KX3為S,L或別的中性氨基酸X4為T或A。
表1
*在從AF cDNA和pGeX-1-λ中制備的構(gòu)建體中表達(dá)的SEQID NO.1中的堿基對(duì)位置**合成肽的起點(diǎn)與末端在AF中氨基酸殘基的位置(SEQ IDNO.1),***在連接的大鼠腸袢環(huán)中霍亂毒素誘導(dǎo)的流體分泌的抑制;導(dǎo)致半最大化抑制(ED50)的量(pmol)指活性肽。
*****這些肽通過(guò)固相合成制備。
在腸粘膜中rAF對(duì)炎癥的效應(yīng)也在大鼠腸袢環(huán)模型中加以測(cè)試。因此,將20只大鼠用0.5μg艱難梭菌的毒素A(10)攻擊并分別于2.5和5小時(shí)后(10+10只大鼠)測(cè)量炎癥和流體分泌。每組大鼠中一半在攻擊前30秒靜脈內(nèi)接受100ng rAF;另一半接受PBS緩沖液作為對(duì)照。殺死大鼠后,解剖出袢環(huán),并將袢環(huán)中部的2-3cm部分冷凍于干冰上。然后通過(guò)用Leica cryostat將冷凍標(biāo)本切成8μm厚的切片。染色切片以通過(guò)酶組織化學(xué)顯示堿性磷酸酶。堿性磷酸酶通過(guò)腸上皮細(xì)胞表達(dá)且染色允許對(duì)腸上皮組織整合的估計(jì)。
結(jié)果顯示(圖9)對(duì)照大鼠顯示出腸粘膜廣泛的損傷2.5小時(shí)后觀察到上皮細(xì)胞從基底膜脫落以及壞死的組織,而5小時(shí)后觀察到廣泛的出血。相反,以rAF處理的動(dòng)物沒(méi)有形成脫落壞死或出血。毒素A誘導(dǎo)的流體分泌也在2.5小時(shí)后從199±4抑制到137±5mg/cm(P<0.01)且6小時(shí)后從421±3抑制到203±6mg/cm(5只大鼠/組,P<0.01)。
以0.5μg肽IVCHSKT(=P1)替代rAF蛋白進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。該八肽得到了對(duì)毒素A-誘導(dǎo)的腸炎和流體分泌相同的效應(yīng)如圖9所示。
毒性,為了測(cè)試rAF的毒性,以50μg每只大鼠的高劑量注射。在一周的觀察期間沒(méi)有記錄到明顯的毒性反應(yīng)。實(shí)施例8 rAF對(duì)腸通透性的生物學(xué)活性為了評(píng)估rAF對(duì)溶于血液中有機(jī)物質(zhì)通透性的效應(yīng),根據(jù)前述方法(11)進(jìn)行以Evans藍(lán)染色的測(cè)試。實(shí)驗(yàn)起始按上面實(shí)施例7和圖5所述完成,在霍亂毒素攻擊前靜脈注射rAF。然而,沒(méi)有測(cè)量到流體分泌但毒素攻擊后90分鐘將PBS中1ml 1.5%的Evans藍(lán)染色液靜脈內(nèi)注射。允許染料循環(huán)5分鐘的時(shí)間。之后將大鼠在醚麻醉狀態(tài)下以200ml 4℃的PBS/Alsevier’s(1/1比例)溶液在約150秒期間經(jīng)左心室-右心房進(jìn)行跨心臟灌注(transcardial perfusion)(用蠕動(dòng)泵[Cole ParmerInstruments,Chiacago,Ⅲ.,美國(guó)])。施行該方法是為了去除所有存在于血管系統(tǒng)中的EB,僅留下EB在腸組織中以通過(guò)染料的甲醛提取加以檢測(cè)。
在表2中的結(jié)果顯示CT-攻擊顯著(P<O.01)增加可從腸組織中提取EB的量,約43%,而在霍亂毒素攻擊之前靜脈注射1BrT阻止這種增加,即,組1中(對(duì)照)從組織提取EB的量與組3(1rAF+CT)沒(méi)有差異。
表2組攻擊 ngEB/g腸組織×10-0.7%EB-konc的增加1PBS+PBS6 29.3±1.0 -2PBS+CT 6 51.8±1.3 43(P<0.001)31rAF+CT6 29.6±1.5 0NS顯示在圖10和11中的結(jié)果顯示在腸用霍亂毒素攻擊后,在具有或不具有以PI(IVCHSKTR)對(duì)大鼠的預(yù)處理的情況下在小腸或大腦側(cè)室相應(yīng)的脈絡(luò)叢中偶氮染料Evans藍(lán)的外滲(extravasation)。
實(shí)驗(yàn)以下面的方式完成重350g的雄性Sprague-Davley大鼠在實(shí)驗(yàn)前饑餓18小時(shí),但自由進(jìn)水。大鼠用于六只的組。根據(jù)表3施用肽P1、霍亂毒素(CT)和PBS。
表3組 iV ing 1*po.inj*iV.inj.2*AP1 CT EBBPBS CT EBCPBS PBSEB*P1(iv.)注射1施以2mlPBS體積,經(jīng)口腔(po.)注射施以5ml體積,靜脈內(nèi)注射2由溶于PBS的1.5ml 3%Evans藍(lán)所組成。在所有注射過(guò)程中醚用于麻醉。
P1(0.5μg)或PBS的i.v注射在以100μgCT或以PBS的口腔攻擊前10-15秒進(jìn)行;口腔攻擊60分鐘后,將大鼠以醚麻醉并以Evans藍(lán)注射。允許染料再平衡30分鐘,之后將大鼠再次以醚麻醉并以250ml Alsevers溶液/PBS=50/50經(jīng)左心室心內(nèi)灌注以去除存在于血管系統(tǒng)中所有的染料。此約2-3分鐘中完成的灌注處理以后,記錄到的熒光應(yīng)該代表僅存在于外周血管系統(tǒng)的染料。
取樣大腦和部分小腸并于干冰上冷凍且制備8μm厚的冰凍切片(cryostat sections)。將切片空氣干燥并固定于含二甲苯的固定介質(zhì)中。用與用于若丹明(rhodamin)發(fā)射熒光相同的濾片(filter)組合用Zeiss熒光顯微鏡觀察切片。
圖10和11中的結(jié)果顯示熒光密度(白色)在組A(P1iv+CTpo)和C(PBSiv+PBSpo)中在小腸(圖10)和脈絡(luò)叢(圖11)中具有相似的大小。與組B(PBSiv+CTpo)中的小腸及脈絡(luò)叢中的高熒光強(qiáng)度相比,該結(jié)果清楚地顯示在毒素攻擊前注射八肽抑制CT-誘導(dǎo)的Evans藍(lán)的血管外穿透。該結(jié)果表明該結(jié)果不僅在小腸的血管系統(tǒng)中如此,而且在大腦側(cè)室的脈絡(luò)叢中也是如此。
結(jié)論靜脈內(nèi)八肽IVCHSKTR的施用效應(yīng)抑制小腸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)脈絡(luò)叢中霍亂毒素誘導(dǎo)的Evans藍(lán)血管外穿透。因此,rAF和其肽衍生物的作用不僅僅局限于小腸,而且影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管的通透性。這些發(fā)現(xiàn)表明rAF和其肽衍生物可用于逆轉(zhuǎn)病理性質(zhì)內(nèi)壓、中耳內(nèi)的壓力改變和血管中各種形式的通透性變化。
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圖1a和相繼的圖1b,新的人類蛋白的核酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。證實(shí)的氨基酸序列下被劃線。圖1c顯示克隆cDNA和寡核苷酸引物的水平圖譜。圖2考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-聚丙烯酰胺微型凝膠(A)和以抗豬AF抗血清檢測(cè)的免疫印跡(B)。不帶有單引號(hào)(unprimed)數(shù)字的泳道含有谷胱甘肽-瓊脂糖-純化的GST-AF融合蛋白AF-1,AF-2和AF-3,而帶有單引號(hào)(primed)數(shù)字的泳道含有以凝血酶切割的融合蛋白。分子量參照(R),(BDH)顯示于左側(cè)。GST-AF-1融合蛋白被高度降解但免疫印跡分析僅顯示全長(zhǎng)蛋白和自發(fā)性凝血酶切割產(chǎn)物的檢測(cè)。在GST-AT-3蛋白中有26KDa的產(chǎn)物,可能是已獨(dú)立表達(dá)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶尾部。圖3a用抗重組蛋白AF-2抗血清的Western印跡。在左側(cè),使用的為豬(P)和三個(gè)人類(H1,H2,H3)垂體腺;且在右側(cè),使用的為三個(gè)重組蛋白AF-1,AF-2和AF-3(見圖2);中部為分子量標(biāo)準(zhǔn)(R)。圖3b用在兔子中產(chǎn)生的粗抗血清和親和純化的抗體對(duì)rAF的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。圖4人類和豬垂體腺RNA Northern印跡的放射自顯影CP混合的(Pooled)且i=個(gè)體材料)。每道(basin)中使用了5μg純化mRNA;使用3’-末端標(biāo)記的寡核苷酸探針且7天后放射自顯影顯色。圖5以抗重組蛋白GST-AF-2抗血清染色的腺垂體的凍凍切片。A.與免疫血清孵育的切片顯示具有不同程度陽(yáng)性免疫反應(yīng)性的分散細(xì)胞(實(shí)心箭頭)。許多細(xì)胞完全缺乏染色(空心箭頭)。B.與從過(guò)量重組蛋白GST-AF-2預(yù)吸附的免疫抗血清孵育的A系列切片(Serial sections to A),沒(méi)有細(xì)胞的特異性染色。C和D。顯示內(nèi)分泌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染色的免疫陽(yáng)性細(xì)胞的較大的放大。n核,c=細(xì)胞質(zhì)。圖6測(cè)試霍亂毒素誘導(dǎo)的流體分泌抑制的重組蛋白AF-1的生物學(xué)活性。不同級(jí)別劑量的蛋白于大鼠靜脈內(nèi)注射;將3μg霍亂毒素注射到腸袢環(huán)中;5小時(shí)后測(cè)量袢環(huán)中的積液(mg/cm腸)。每個(gè)值代表6只動(dòng)物一組的平均值±S.A.E。圖7靜脈內(nèi)注射rAF-1的生物學(xué)活性;在用3μg霍亂毒素攻擊前20-30秒或90分鐘后施用0.5μg rAF于大鼠腸袢環(huán)中。圖8管腔內(nèi)(intraluminarly)注射rAF-1的生物學(xué)活性;在用3μg霍亂毒素前20-30秒或90分鐘后將3μg rAF注射λ大鼠腸袢環(huán)中;在相鄰于被注射毒素的袢環(huán)約5cm處注射rAE。圖9A(×2.5)為對(duì)照(PBS)環(huán),顯示腸腔(L)內(nèi)的細(xì)胞碎片,但剩余的粘膜沒(méi)有染色,這表明上皮內(nèi)襯(Lining)的完全破壞。B(毒素攻擊前O.5μl P1)顯示形成絨毛的清晰排列的上皮內(nèi)襯,表明受保護(hù)的且正常的腸粘膜。L=腸腔。橫線=500μm。C(×10)顯示在PBS處理的對(duì)照組中破壞的粘膜,和D顯示在實(shí)驗(yàn)(P1-處理)組中相應(yīng)的粘膜。黑箭頭指向上皮襯里,LP=固有層,mm=肌肉粘膜,空心箭頭指向隱窩(Crypt)細(xì)胞。橫線=100μm。E(×2.5)顯示對(duì)照組(PBS-處理)中破壞的粘膜,且F顯示在毒素攻擊前經(jīng)P1處理大鼠的相應(yīng)放大。橫線=50μm。圖10以霍亂毒素(CT)或?qū)φ站彌_液(PBS)處理三組大鼠空腸標(biāo)本的Evans藍(lán)熒光;以抑制分泌肽P1或?qū)φ站彌_液(PBS)進(jìn)行預(yù)處理。LP=固有層。黑箭頭表示上皮細(xì)胞襯里;空心箭頭表示隱窩細(xì)胞。橫線=100μm。圖11顯示于圖10中大鼠脈絡(luò)叢標(biāo)本的Evans藍(lán)熒光,橫線=50μm。
序列表SEQ ID NO:1序列類型具有相應(yīng)蛋白的核苷酸序列長(zhǎng)度1309個(gè)堿基對(duì)加上多聚(A)尾部鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型cDNA最初來(lái)源生物人類立即表達(dá)來(lái)源垂體腺特征從63到1208為成熟蛋白從1289-1295為多聚(A)信號(hào)序列AATTGGAGGAGTTGTTGTTAGGCCGTCCCGGAGACCCGGTCGGGAGGGAGGAAGGTGGCAAG ATG GTC TTG GAA AGC ACT ATG GTG TGT GTG GAC AAC AGT 101Met Vol Leu Glu Ser Thr Met Vol Cys Vol Asp Asn Ser>
5 10GAG TAT ATG CGG AAT GGA GAC TTC TTA CCC ACC AGG CTG CAG GCC CAG 149Glu Tyr Met Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Alo Gln>
15 20 25CAG GAT GCT GTC AAC ATA CTT TGT CAT TCA AAG ACC CGC AGC AAC CCT 197Gln Asp Alg Vol Asn Ilc Vol Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro>30 35 40 45GAG AAC AAC GTG GGC CTT ATC ACA CTG GCT AAT GAC TGT GAA GTG CTG 245Glu Asn Asn Vol Gly Leu Ile Thr Leu Alo Asn Asp Cys Glu Vol Leu>
50 55 60ACC ACA CTC ACC CCA GAC ACT GGC CGT ATC CTG TCC AAG CTA CAT ACT 293Thr Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile leu Ser Lys Leu His Thr>
65 70 75GTC CAA CCC AAG GGC AAG ATC ACC TTC TGC ACG GGC ATC CGC GTG GCC 341Vol Gln Pro Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Vol Alo>
80 85 90CAT CTG GCT CTG AAG CAC CGA CAA GGC AAG AAT CAC AAG ATG CGC ATC 389His Leu Alo Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ilc>
95 100 105ATT GCC TTT GTG GGA AGC CCA GTG GAG GAC AAT GAG AAG CAT CTG GTG 437Ile Alo Phe Vol Gly Ser Pro Vol Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Vol>110 115 120 125AAA CTG GCT AAA CGC CTC AAG AAG GAG AAA GTA AAT CTT GAC ATT ATC 485Lys Leu Alo Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Vol Asn Vol Asp Ile Ile>
130 135 140AAT TTT GGG GAA GAG GAG GTG AAC ACA GAA AAG CTG ACA GCC TTT GTA 533Asn Phe Gly Glu Glu Glu Vol Asn Thr Glu Lys Leu Thr Alo Phe Vol>
145 150 155AAC ACG TTG AAT GGC AAA GAT GGA ACC GGT TCT CAT CTG GTG ACA GTG 581Asn Thr Leu Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Vol Thr Vol>
160 165 170CCT CCT GGG CCC AGT TTG GCT GAT GCT CTC ATC AGT TCT CCG ATT TTG 629Pro Pro Gly Pro Ser Leu Alo Asp Alo Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu>
175 180 185GCT GGT GAA GGT GGT GCC ATG CTG GGT CTT GGT GCC AGT GAC TTT GAA 677Alo Gly Glu Gly Gly Alo Met Leu Gly Leu Gly Alo Ser Asp Phe Glu>190 195 200 205TTT GGA GTA GAT CCC AGT GCT GAT CCT GAG CTG GCC TTG GCC CTT CGT 725Phe Gly Vol Asp Pro Ser Alo Asp Pro Glu Leu Alo Leu Alo Leu Arg>
210 215 220GTA TCT ATG GAA GAG CAG CGG CAC GCA GGA GGA GGA GCG CGG CGG GCA 773Vol Ser Met Glu Glu Gln Aro His Alo Gly Gly Gly Alo Arg Arg Alo>
225 238235GCT CGA GCT TCT GCT GCT GAG GCC GGG ATT GCT ACG ACT GGG ACT GAA 821Alo Arg Alo Ser Alo Alo Glu Alo Gly Ile Alo Thr Thr Gly Thr Glu>
240 245 250GAC TCA GAC GAT GCC CTG CTG AAG ATG ACC ATC AGC CAG CAA GAG TTT 859Asp Ser Asp Asp Alo Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe>
255 260 265GGC CGC ACT GGG CTT CCT GAC CTA AGC AGT ATG ACT CAG GAA GAG CAG 917Gly Arg Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln>270 275 280 285ATT GCT TAT GCC ATG CAG ATG TCC CTG CAG GGA GCA GAG TTT GGC CAG 965Ile Alo Tyr Alo Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Alo Glu Phe Gly Gln>
290 295 300GCG GAA TCA GCA GAC ATT GAT GCC AGC TCA GCT ATG GAC ACA TCT GAG 1013Alo Glu Ser Alo Asp Ile Asp Alo Ser Ser Alo Met Asp Thr Ser Glu>
305 310 315CCA GCC AAG GAG GAG GAT GAT TAC GAC GTG ATG CAG GAC CCC GAG TTC 1061Pro Alo Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Vol Met Gln Asp Pro Glu Phe>
320 325 330CTT CAG AGT GTC CTA GAG AAC CTC CCA GGT GTG GAT CCC AAC AAT GAA 1109Leu Gln Ser Vol Leu Glu Asn Leu Pro Gly Vol Asp Pro Asn Asn Glu>
335 340 345GCC ATT CGA AAT GCT ATG GGC TCC CTG CCT CCC AGG CCA CCA AGG ACG 1157Alo Ile Arg Asn Alo Met Gly Ser Leu Pro Pro Arg Pro Pro Arg Thr>350 355 360 365GCA AGA AGG ACA AGA AGG AGG AAG ACA AGA AGT GAG ACT GGA GGG AAA 1205Alo Arg Arg Thr Arg Arg Arg Lys Thr Arg Ser Glu Thr Gly Gly Lys>
370 375380GGG TAGCTGAGTCTGCTTAGGGGACTGCATGGGAAGCACGGAATATAGGGTTAGATGTGTGTGly>TATCTGTAACCATTACAGCCTAAATAAAGCTTGGCAACTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白,基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中的氨基酸序列,或其同源物或片段。
2.顯示于SEQ ID NO.1中的重組蛋白的片段,該片段選自包括下面顯示于SEQ ID NO.1中的氨基酸序列a)氨基酸nos.35-42b)氨基酸nos.35-46c)氨基酸nos.36-51d)氨基酸nos.36-80e)氨基酸nos.1-80
3.相應(yīng)于包括顯示于SEQ ID NO.1中的重組蛋白氨基酸no.35-42片段的肽X1VCX2X3KX4R,其中的X1為I或缺如,X2為H、R或K,X3為S、L或別的中性氨基酸且X4為T或A。
4.對(duì)基上具有顯示于SEQ ID No.1中氨基酸序列的蛋白或其同源物或片段具有特異性的抗體。
5.一種蛋白,它結(jié)合對(duì)基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或其同源物或片段具有特異性的抗體。
6.用于使動(dòng)物包括人類的病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正?;囊环N組合物,包括有效量的顯示于SEQ ID NO.1中的重組蛋白或其具有相同活性的同源物或片段作為活性成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物,其中的片段選自顯示于SEQ ID NO.1中的包括下面氨基酸序列的組a)氨基酸nos.35-42b)氨基酸nos.35-46c)氨基酸noS.36-51d)氨基酸nos.36-80e)氨基酸nos.1-80
8.基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或其具有相同活性的同源物或片段的應(yīng)用,它用于制備使動(dòng)物包括人類的病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正常化的組合物。
9.一種用于使脊椎動(dòng)物中的病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正?;娘暳?,包括基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或其具有相同活性的同源物或片段或者能夠制備所述重組蛋白、同源物或片段的生物體作為活性劑。
10.一種使動(dòng)物包括人類中的病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)正?;姆椒?,包括向動(dòng)物施用有效量的基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的蛋白或其具有相同活性的同源物或片段,或者能夠制備所述蛋白或類似物或片段的生物體。
11.根據(jù)權(quán)利要求12的方法,其中的片段選自顯示于SEQ ID NO.1中包括下面氨基酸序列的組a)氨基酸nos.35-42b)氨基酸nos.35-46c)氨基酸nos.36-51d)氨基酸nos.36-80e)氨基酸nos.1-80
12.抗基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸的重組蛋白或其同源物或片段的特異性抗體的應(yīng)用,它用于檢測(cè)生物體中所述的蛋白或其同源物或片段。
13.核酸,其編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中序列的重組蛋白或其同源物或片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸,其中編碼的片段選自顯示于SEQ IDNO.1中包括下面氨基酸序列的組a)氨基酸nos.35-42b)氨基酸nos.35-46c)氨基酸nos.36-51d)氨基酸nos.36-80e)氨基酸nos.1-80
15.編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中序列的重組蛋白或其同源物或片段的核酸的應(yīng)用,它用于制備相應(yīng)的蛋白或同源物或片段。
16.源自編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或其同源物或片段的探針或引物的使用,用于檢測(cè)生物體中核酸的存在。
17.載體,包括編碼基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的蛋白或其同源物或其片段的核酸。
18.除人類以外的宿主,包含含有編碼基本上具有顯示于SEQ IDNO.1中氨基酸序列的重組蛋白或其同源物或片段的核酸的載體。
19.除人類以外的生物體品系(Strain),它能夠制備基本上具有顯示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白或其同源物或片段。
全文摘要
本說(shuō)明書描述了一種新的稱為抑制分泌因子的重組蛋白(rAF)和其同源物及肽段。該蛋白和其同源物及肽段對(duì)于使包括人類的動(dòng)物病理性流體運(yùn)輸和/或炎癥反應(yīng)的正?;怯杏玫?。還描述了抗AF或其同源物或其片段的抗體。也描述了編碼該蛋白或其同源物或其片段的核酸以及包括該核酸的載體和宿主。rAF和其源物及片段可用于免疫檢測(cè)。作為飼養(yǎng)動(dòng)物的飼料添加劑和止瀉劑(antidiarrheal)以及抗包括水腫、脫水和/或炎癥疾病的藥物。
文檔編號(hào)C12R1/91GK1208420SQ96197300
公開日1999年2月17日 申請(qǐng)日期1996年8月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月24日
發(fā)明者I·倫羅思, S·蘭格, E·約翰森, E·詹尼斯, C·倫羅思 申請(qǐng)人:瑞典農(nóng)業(yè)專利公司
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