專利名稱：：糖皮質(zhì)素對基因表達的增強作用的制作方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及藥物作用、細胞調(diào)控和基因治療領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新發(fā)現(xiàn)，即當(dāng)用陽離子脂質(zhì)或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時，糖皮質(zhì)素可增強報道基因活性。相關(guān)技術(shù)的描述在最近2年中，將基因治療作為遺傳缺陷或基因調(diào)節(jié)異常所導(dǎo)致疾病的治療方法而進行的人類臨床試驗，已經(jīng)顯示了其前途并獲得了動力。幾種在肺中表現(xiàn)出主要癥狀的疾病已經(jīng)被定為可使用基因治療，其中包括囊性纖維變性和肺癌。這些試驗或者使用重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或者使用腺病毒載體以及陽離子脂質(zhì)來將基因運輸和傳送給細胞。然而，細胞轉(zhuǎn)化及隨后的基因表達低，因而會達不到治療水平的基因表達。此外，針對病毒載體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答會限制其使用。盡管陽離子脂質(zhì)在輸送方面比腺病毒載體的效率低，但是更新的化學(xué)設(shè)計已產(chǎn)生了比最初設(shè)計大為改善的陽離子脂質(zhì)。多個動物和人類試驗已表明，在陽離子脂質(zhì)的典型轉(zhuǎn)染濃度下，不產(chǎn)生有害的副作用或免疫應(yīng)答。用氣溶膠將基因治療直接輸送給肺，可以使基因被直接輸送給靶組織。幾個研究小組已表明了，可用偶聯(lián)于陽離子脂質(zhì)體的報道基因DNA，在體內(nèi)進行氣溶膠輸送并轉(zhuǎn)染動物肺。在這些研究中提及的突出特征是沒有毒性，而且基因表達的時間可約為1個月?；虮磉_仍然較低；在小鼠肺中即使是適中的轉(zhuǎn)染也需要至少0.5-12毫克高純度的DNA。正如報道的那樣，用這些方法進行的基因治療對人是不可行的。另一種提高轉(zhuǎn)染效率的方法，是對質(zhì)粒攝入以及影響轉(zhuǎn)染基因在靶組織中表達的各因素有更好的理解。在最近的有關(guān)炎癥在肺細胞基因轉(zhuǎn)染中所起作用的研究中，已表明，在用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染之前，將A549人肺癌細胞暴露于免疫刺激物脂多糖或細胞因子IL-1β，可使β-gal蛋白質(zhì)的水平降低到低于僅用培養(yǎng)基處理的細胞中所觀察到的水平。已有技術(shù)中缺乏將轉(zhuǎn)染基因在治療水平上進行輸送的有效手段。本發(fā)明填補了本領(lǐng)域的這一長期需求。發(fā)明概述對于陽離子脂質(zhì)-DNA復(fù)合體被細胞攝入的機制，以及這些復(fù)合體在細胞中的命運如何，所知甚少。對于在原位影響DNA攝入、或持續(xù)輸送以及一旦進入組織DNA表達的各種因素，知道得更少，尤其是在患慢性肺炎疾病或其他免疫情況的病人中。本發(fā)明顯示了2個發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)現(xiàn)對細胞培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)染有重要影響，而且在體內(nèi)是平行相關(guān)的。首先，本發(fā)明表明，細胞因子IL-1β和免疫刺激物脂多糖(LPS)會抑制通過陽離子脂質(zhì)進行的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染入A549人肺癌細胞系或原代大鼠肺細胞的pCMVβ-gal的表達。其次，局部抗炎的糖皮質(zhì)素如倍氯米松雙丙酸酯(BEC)可逆轉(zhuǎn)IL-1β和脂多糖的抑制效應(yīng)，而且甚至可以增強報道基因的表達，使其高于或超過在未處理的感染細胞(即未用脂多糖或IL1β等處理的細胞)中所見的表達。這種效應(yīng)對糖皮質(zhì)素是特異性的，這與其他類型的類固醇相反，但是也不是對特定的糖皮質(zhì)素特異。這一效應(yīng)對糖皮質(zhì)素如抗炎藥也是特異的，因為用另一免疫抑制劑環(huán)孢菌素A進行預(yù)處理的細胞時沒有觀察到該效應(yīng)。糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因活性的增強情況與所用的啟動子、報道基因和陽離子脂質(zhì)無關(guān)。糖皮質(zhì)素增強報道基因的表達的機制，并不涉及更高的質(zhì)粒-脂質(zhì)攝入，相反涉及一種不牽涉新蛋白質(zhì)合成的細胞內(nèi)機制。此外，在無脂多糖或IL-1β的情況下，在轉(zhuǎn)染之前用合成的局部用糖皮質(zhì)素對原代大鼠肺細胞進行預(yù)處理，可使β-gal蛋白質(zhì)的水平高于未處理的對照。本發(fā)明描述了有關(guān)研究，這些研究涉及質(zhì)粒DNA的糖皮質(zhì)素-增強轉(zhuǎn)染的機制。因此，本發(fā)明直接涉及基因治療的體內(nèi)應(yīng)用。在本發(fā)明的一個例子中，提供了一種在將合適載體中的基因輸送給動物之后，提高該基因在生物組織中細胞表達的方法，該方法包括步驟給該動物施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。在本發(fā)明的另一個例子中，提供了一種治療人病理狀態(tài)的方法，它是通過在將基因輸送給需要這種治療的人的生物組織之后，提高該基因的細胞表達，其中該方法包括步驟給人施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。本發(fā)明其他的和進一步的方面、特征和優(yōu)點，通過下列有關(guān)本發(fā)明目前的優(yōu)選實施例的描述，會變得很明顯。這些實施例是為了說明而給出的。附圖簡述因此，可以獲得并詳細理解上述的本發(fā)明特征、好處和目的以及其他明顯之處，并可結(jié)合其某些在附圖中闡述的實施例對上面簡要概述過的本發(fā)明作更具體的描述。這些附圖是本說明書的一部分。然而，應(yīng)理解，附圖闡述用于闡述本發(fā)明的優(yōu)選實施例而不應(yīng)認為用于限制本發(fā)明范圍。圖1顯示，在用pCMVβ-gal-陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的A549細胞中，脂多糖和IL-1β會抑制β-半乳糖苷酶(β-gal)活性。A549細胞用培養(yǎng)基、0.5微克/毫升脂多糖或100U/毫升重組的人IL-1-β處理4小時。在處理之后，用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染細胞。β-gal活性用可特異性地測量β-半乳糖苷酶活性的(CPRG)比色計微量滴定分析法加以測得。結(jié)果為3次試驗的平均值及標(biāo)準差。倍數(shù)-變化＝脂多糖或IL-1樣品中的β-gal活性/用培養(yǎng)基處理的樣品中的β-gal活性。圖2顯示，在轉(zhuǎn)染的A549細胞中，糖皮質(zhì)素可增強β-gal活性。A549細胞用糖皮質(zhì)素處理4小時。圖2A顯示轉(zhuǎn)染細胞對倍氯米松的劑量反應(yīng)，其中劑量為10-7-10-6M。圖2B顯示幾種其他的局部用糖皮質(zhì)素在10-6M時也能誘導(dǎo)提高β-gal的活性布地奈德，BUD；氟尼縮松，F(xiàn)LUN；倍氯米松-雙丙酸酯-二月桂酰磷脂酰膽堿，倍氯米松-DLPC。在處理之后，用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染細胞。β-gal活性用微量滴定分析法加以測得。結(jié)果為3次試驗的平均值及標(biāo)準差。倍數(shù)-變化＝糖皮質(zhì)素處理的細胞中的β-gal活性/用培養(yǎng)基處理的細胞中的β-gal活性。圖3顯示，在轉(zhuǎn)染的A549細胞中，倍氯米松可逆轉(zhuǎn)脂多糖和IL-1β對β-gal活性的抑制效應(yīng)。A549細胞僅用培養(yǎng)基、或用倍氯米松(10-6M)、IL-1β(100U/毫升)或脂多糖(0.5微克/毫升)處理4小時。在第一個4小時之后，去除上清液然后按指定用培養(yǎng)基、IL-1β、脂多糖，或用倍氯米松再處理4小時(即，倍氯米松，脂多糖；用倍氯米松先處理第一個4小時，然后用脂多糖處理第二個4小時)。在第二次處理之后，用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染細胞。β-gal活性用微量滴定分析法加以測得。結(jié)果為2次試驗的平均值及標(biāo)準差。倍數(shù)-變化＝倍氯米松、脂多糖、IL-1處理的或混合處理的細胞中的β-gal活性/用培養(yǎng)基處理的細胞中的β-gal活性。圖4顯示，在原代大鼠肺細胞中，倍氯米松可增強β5-gal活性。從用酶消化的大鼠肺中分離出原代大鼠肺細胞，然后以1.0×10-5細胞/孔置于細胞孔組織培養(yǎng)皿中。細胞用10-7-10-6M濃度范圍內(nèi)的倍氯米松、脂多糖(0.5微克/微升)或倍氯米松+脂多糖(4小時倍氯米松+4小時脂多糖)處理4小時。然后，用3微克DNA和12微克DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染。48小時之后，β-gal活性用CPRG微量滴定分析法加以測得。結(jié)果為3(*2)次試驗的平均值及標(biāo)準差。倍數(shù)-變化＝倍氯米松、脂多糖、倍氯米松+脂多糖處理的細胞中的β-gal活性/用培養(yǎng)基處理的細胞中的β-gal活性。圖5顯示，倍氯米松介導(dǎo)的增強作用并不限制于陽離子脂質(zhì)、載體啟動子或載體報道基因，這種增強作用對糖皮質(zhì)素是特異的。A549細胞用倍氯米松或其他類固醇(圖5B，類固醇雌激素，E2；黃體酮，PROG；膽固醇，CHOL)處理4小時。在處理之后，細胞用下列物質(zhì)進行轉(zhuǎn)染在圖5A中用1微克/毫升pCMVβ-gal和3微克/毫升DOSPA/DOPE；在圖5B中用1微克/毫升pSVβ和4微克/毫升DMRIE/DOPE或1微克/毫升pCMVβ-gal和4微克/毫升DMRIE；以及在圖5C中用1微克/毫升pCMVHICAT和4微克/毫升DMRIE/DOPE。β-gal活性用微量滴定分析法加以測得。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphicolacetyltransferase，CAT)活性用TLC氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶分析法進行測定，其中同位素14C乙?；穆让顾乇籘LC所分辨，然后用設(shè)定于檢測14C的貝塔掃描器測定14C的摻入量。圖5A和圖5C中的結(jié)果是3次試驗的平均值及標(biāo)準差。圖5B中的結(jié)果表示了3次試驗。倍數(shù)-變化＝倍氯米松或類固醇處理的細胞中的β-gal活性或CAT活性/用培養(yǎng)基處理的細胞中的β-gal或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。圖6顯示，倍氯米松并不增加A549細胞中質(zhì)粒的攝入量。用培養(yǎng)基或固定劑量的倍氯米松預(yù)處理A549細胞4小時，然后用3H-胸苷標(biāo)記的pCMVβ-gal進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染2小時后，細胞被洗滌、稍用胰蛋白酶消化，并離心沉淀。然后裂解沉淀物，再懸浮，然后加入液閃混合液。測定每個樣品的3H-胸苷標(biāo)記的pCMVβ-gal的攝入量(CPM)。結(jié)果為4次試驗的平均值及標(biāo)準差，其中每個試驗點重復(fù)一次。倍數(shù)-變化＝倍氯米松預(yù)處理樣品中的CPM/用培養(yǎng)基預(yù)處理的樣品中的CPM。圖7顯示了受倍氯米松增強的報道基因表達過程的動力學(xué)。A549細胞用10-6M倍氯米松或培養(yǎng)基處理不同時間。用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染細胞。β-gal活性用CPRG微量滴定分析法加以測得。結(jié)果為2次試驗的平均值及標(biāo)準差。倍數(shù)-變化＝倍氯米松處理的細胞中的β-gal活性/用培養(yǎng)基處理的細胞中的β-gal活性。圖8顯示，倍氯米松介導(dǎo)的對β-gal活性的增強作用并不需要蛋白質(zhì)的合成。細胞用培養(yǎng)基或CHX(10微克/毫升)處理30分鐘。用培養(yǎng)基預(yù)處理過的細胞，隨后用培養(yǎng)基或10-6M倍氯米松處理4小時。用CHX預(yù)處理過的細胞，隨后用CHX或10-6M倍氯米松+CHX處理4小時。用1微克/毫升pCMVβ-gal和4微克/毫升DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染細胞。β-gal活性用CPRG微量滴定分析法加以測得。結(jié)果為2次試驗的平均值及標(biāo)準差。使用BEC時的倍數(shù)-變化＝倍氯米松處理的細胞中的β-gal活性/用培養(yǎng)基處理的細胞中的β-gal活性。使用倍氯米松+CHX時的倍數(shù)-變化＝倍氯米松+CHX處理的細胞中的β-gal活性/用CHX處理的細胞中的β-gal活性。圖9顯示，在A549細胞中，倍氯米松提高了穩(wěn)定態(tài)的mRNA水平。A549細胞用10-6M倍氯米松或培養(yǎng)基處理4小時。用1微克/毫升pCMVβ-gal和4微克/毫升DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染后指定的時間(小時)，收獲總RNA，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，而特異性的β-gal信使RNA用如下所述的RS-PCR進行擴增。RS-PCR樣品在1％TAE瓊脂糖凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至尼龍濾膜上。將濾膜與32P-標(biāo)記的β-gal探針雜交。用貝塔掃描器分析濾膜，并且對適當(dāng)大小的條帶進行計數(shù)。倍數(shù)-變化＝倍氯米松處理的細胞中β-gal的CPM/用培養(yǎng)基處理的細胞中β-gal的CPM。發(fā)明詳述在本發(fā)明中，使用下列縮寫，脂多糖鼠傷寒沙門氏桿菌脂多糖；IL-1β白細胞介素-1-β；GC糖皮質(zhì)素；E2雌二醇；PROG黃體酮；CHOL膽固醇；BUD布地奈德；BEC倍氯米松雙丙酸酯；FLUN氟尼縮松；DLPC二月桂酰磷脂酰膽堿；β-gal大腸桿菌β-半乳糖苷酶CAT氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶DMRIE/DOPEN-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十四烷氧基(tetradecytoxy))-1-丙銨溴化物/二油酰磷脂酰乙醇胺；DOSPA/DOPE2，3-二油酰氧N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸二油酰磷脂酰乙醇胺DMEMDulbecco′s極限必需培養(yǎng)基；FBS胎牛血清；CHX環(huán)己酰亞胺；RS-PCRRNA-特異性聚合酶鏈反應(yīng)；CPRG氯酚-β-D-吡喃半乳糖苷；cAMP環(huán)腺苷一磷酸；CREBcAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白。本發(fā)明涉及一種在將基因輸送給動物之后，提高該基因在細胞中細胞表達的方法，該方法包括步驟給該動物施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。在本發(fā)明還涉及一種治療人病理狀態(tài)的方法，它是通過在將基因輸送給需要這種治療的動物的生物組織之后，提高該基因的細胞表達，其中該方法包括步驟給該動物施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。一般，任何的糖皮質(zhì)素都可用于本發(fā)明方法，但是很明顯不是任何的消炎藥都適用，因為在環(huán)孢菌素A處理的細胞中沒有觀察到這種效應(yīng)。代表性的糖皮質(zhì)素包括氫可的松、潑尼松、潑尼松龍、曲安西龍、倍他米松、布地奈德、氟尼縮松和地塞米松。糖皮質(zhì)素可以是合成的或非合成的糖皮質(zhì)素。一般，糖皮質(zhì)素的施用量約為0.6-50毫克/千克，這取決于所輸送的糖皮質(zhì)素種類(因為存在藥效差異)以及輸送的是生理劑量還是藥理劑量。在本發(fā)明方法中，糖皮質(zhì)素可以是液體可溶形式、醇可溶形式或水可溶形式，其中任何一種都可被摻入到脂質(zhì)體中。一般，糖皮質(zhì)素的給藥方式是使糖皮質(zhì)素的增強所輸送基因活性的能力最優(yōu)化。例如，糖皮質(zhì)素的給藥可以與該基因的輸送同時進行，或者在該基因的輸送之前或之后進行。給藥途徑可以是任何本領(lǐng)域中合適的途徑，其中包括氣溶膠、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)給藥等。不論將基因輸送到哪種生物組織，本發(fā)明方法是有效的。例如，如果將基因輸送到諸如肝、白細胞、肺、腸胃道、腎、骨骼肌肉、平滑肌、神經(jīng)組織、皮膚細胞、癌細胞、眼、骨髓和腫瘤之類的組織中，那么基因活性可以被增強?；虻妮斔涂梢杂萌魏瓮緩竭M行。例如，可以通過注射、口服給藥、皮膚給藥或氣溶膠給藥來輸送基因。在另一例子中，糖皮質(zhì)素被包裹在中性的或帶電荷的脂質(zhì)體中，如本領(lǐng)域中已知的那樣。或者，基因被溶解在溶劑如乙醇中。本發(fā)明在任何動物中都有效，不論在人還是非人的動物中。即，盡管本發(fā)明方法主要用于人，但是對于那些本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言可以在各種獸醫(yī)上的應(yīng)用是顯而易見的。在本發(fā)明方法中，基因可以用已知方法進行轉(zhuǎn)染。將基因轉(zhuǎn)染入生物組織的代表性方法例子包括病毒轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、以及采用受體和陽離子胺如聚-L-賴氨酸的靶向基因治療。事實上，不論是重組基因、天然基因、cDNA還是寡聚體，用本方法可以增強任何基因的活性。糖皮質(zhì)素增強在翻譯前的啟動子階段或某個細胞調(diào)控階段中載體的活性。下列實施例的給出是用于闡述本發(fā)明的各種例子，而不是用于以任何方式限制本發(fā)明。實施例1細胞和細胞培養(yǎng)物A549細胞得自ATCC。A549被維持在Dulbecco′s極限必需培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO-LifeTechnologies)中，其中加有10％含低脂多糖的確定的胎牛血清(FBS，Hyclone)、200mML-谷氨酰胺和50微克/毫升慶大霉素。對于大多數(shù)轉(zhuǎn)染，細胞以3×10-4細胞/毫升接種于12孔簇培養(yǎng)皿上(Corning)。這一濃度的細胞，在細胞轉(zhuǎn)移24小時后，會形成匯合度約30％的單細胞層。原代大鼠肺細胞是如下制備的。從成年的Sprague-Dawley雌性大鼠獲得肺，并充分粉碎。粉碎后的肺被再懸浮于0.5×胰蛋白酶在Hank′s平衡鹽溶液中的溶液1小時，然后懸浮于含100U/毫升膠原酶(C.Perfringens，IV，SigmaChemical)、100U/毫升DNaseI(Sigma)、添加有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中。組織在搖床上于37℃溫育1.5小時。解離的細胞通過幾層無菌紗布而過濾，然后以1.0×106細胞/孔被置于含DMEM+10％FBS的6孔簇培養(yǎng)皿(Corning)中。細胞在37℃，潮濕和5％CO2的培養(yǎng)箱中溫育13-24小時，然后進行轉(zhuǎn)染。實施例2化學(xué)物質(zhì)和試劑環(huán)己酰亞胺、脂多糖(鼠傷寒沙門氏桿菌的脂多糖)、布地奈德(BUD)和氟尼縮松(FLU)也是從SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO購買的。所有的糖皮質(zhì)素被溶解在無水乙醇中。倍氯米松雙丙酸酯是OrionPharmaceuticals，Kuopio，F(xiàn)inland的贈品。倍氯米松(在中性脂質(zhì)體中)、二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC，AvantiPolarLipids，Birmingham，AL)的制備是通過將0.5毫克倍氯米松和25毫克DLPC，溶在37℃的叔丁醇中。然后將樣品在乙醇和干冰中急速冷凍，并凍干。脂質(zhì)體在無菌的、沒有內(nèi)毒素的水中重新構(gòu)成。人重組IL-1β是從GenzymeCorp.(Carbridge，MA)購得。實施例3cDNApCMVβ-gal和pCMVHICAT是從GenzymeCorp.獲得的，pSVβ是從Clontech(CA)購買的。用Qiagen柱純化系統(tǒng)(Qiagen，Chatsworth，CA)抽提和純化質(zhì)粒DNA。用E-TOX柱(Sterogene，CA)將大多數(shù)脂多糖從質(zhì)粒制劑中去除。用Biowhitaker/MicrobiologicalAssociates(Bethesda，MD)的LAL試劑盒評估質(zhì)粒的內(nèi)毒素。DNA濃度的確定是通過A260讀數(shù)并將類似濃度的質(zhì)粒純化DNA與用氯化銫純化的DNA進行比較而得出的。在260納米下1個OD單位吸光度對應(yīng)于50微克/毫升DNA。實施例4脂質(zhì)2，3-二油酰氧N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸(DOSPA)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(DOSPA/DOPE，Lipofectamine)是從GIBCO/BRL購買的。N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十四烷氧基(tetradecytoxy))-1-丙銨溴化物(DMRIE)/DOPE是從GenzymeCorp.(Framingham，MA)獲得的。實施例5DNA-陽離子脂質(zhì)體制劑DNA-脂質(zhì)比是如下進行優(yōu)化的。將質(zhì)粒cDNA(2.5微克)與水中的各種濃度的陽離子脂質(zhì)進行混合，以產(chǎn)生一系列的DNA脂質(zhì)比率。讓DNA-脂質(zhì)混合物在室溫下溫育15分鐘，然后在1％瓊脂糖凝膠上，于1×Tris-乙酸鹽(40mM)-EDTA(2mM)(TAE)緩沖液中，通過電泳而將復(fù)合物分離出。最佳比率被認為是這樣的DNA脂質(zhì)濃度，在該濃度下，所有的DNA都被脂質(zhì)所結(jié)合，從而被保留在凝膠起始處。如下所述，通過轉(zhuǎn)染A549細胞而對比率進行驗證。對每種脂質(zhì)和質(zhì)粒組合，以及各批DNA和脂質(zhì)之間，都對最佳的DNA脂質(zhì)比率進行驗證。對于DOSPA/DOPE，最佳的DNA脂質(zhì)重量比為1微克DNA3微克脂質(zhì)，而對于DMRIE/DOPE為1微克DNA4微克脂質(zhì)。實施例6轉(zhuǎn)染所有的轉(zhuǎn)染都在OPTIMEM(GIBCO-LifeTechnologies)中進行。將1微克pCMVβ-gal與在1毫升OPTIMEM中的4微克DMRIE/DOPE或3微克DOSPA/DOPE合并，然后在室溫下溫育15分鐘。單細胞層在無血清的培養(yǎng)基中洗滌2次，然后用1毫升轉(zhuǎn)染混合物加以覆蓋，并在37℃，于潮濕、5％CO2的條件下溫育2.5小時。用DMEM+10％FBS替換DNA-脂質(zhì)體覆蓋物，然后再溫育細胞48小時。收獲細胞裂解物，并根據(jù)制造商的說明(BCA分析，PierceChemical，Rockfield，IL)測定總蛋白，而且將氯酚(chlorophenored)-β-D-吡喃半乳糖苷(galactopyranoside)比色微量滴定法作為所述的(CPRG)分析法(Boerhinger-Mannheim，Germany)，測定β-半乳糖苷酶活性。具體而言，單細胞層用PBS洗滌，然后用2％甲醛-0.2％戊二醛固定，然后在20mM氰鐵酸鉀、20mM氰亞鐵酸鉀和2mM氯化鎂中，用X-gal(40微克/毫升，5′-3′Inc.Boulder，CO)進行染色。實施例7DNA-脂質(zhì)的攝入研究通過將1mCi3H-TdR(3H-TdR，74GBq/mmol，Amersham)加入到25毫升用pCMVβ-gal-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α菌株的過夜培養(yǎng)物中，從而制得3H-胸苷標(biāo)記的pCMVβ-gal質(zhì)粒。用Qiagen吸嘴柱(tipcolumn)(100微克大小，Chatsworth，CA)，按制造商的說明，將標(biāo)記的質(zhì)粒分離出。如下確定標(biāo)記DNA的飽和結(jié)合。將1微克-0.125微克3H-TdR標(biāo)記DNA的、一系列稀釋物加至A549細胞中，然后溫育2、6或24小時。單細胞層被洗滌，用1×胰蛋白酶漂洗，稍被胰蛋白酶消化，然后通過離心使細胞沉淀。沉淀物在100微升裂解緩沖液(0.1MTRIS和0.5％TritonX-100)中裂解，加入液閃混合物(BCS，Amersham)，然后通過液閃測定3H-質(zhì)粒標(biāo)記的數(shù)量。對于攝入試驗，用糖皮質(zhì)素或培養(yǎng)基對A549細胞預(yù)處理4小時。用飽和濃度的3H-標(biāo)記的質(zhì)粒+脂質(zhì)處理細胞2.5小時。如上測定攝入情況。實施例8RNA-特異性PCR(RS-PCR)按本領(lǐng)域熟知的那樣進行RS-PCR。簡而言之，用10-6M倍氯米松預(yù)處理細胞，然后如上進行轉(zhuǎn)染。在溫育結(jié)束之后，用酸化的、含0.75M檸檬酸鈉和1％十二烷基肌氨酸鈉(sarkosyl)的異硫氰酸胍(FlukaChemical)進行裂解。用RNAeasy系統(tǒng)(Qiagen，Chatsworth，CA)收獲RNA。用A260測定總RNA量，然后將0.5微克RNA在凝膠上進行電泳以確定RNA的完整性。用0.3微克總RNA，采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO，LifeTechnologies)、寡聚dT的置換引物T30D20-gal(GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATACACCTCGCGGAAACCGACAT)而制得cDNA。該引物含有20個與mRNA3′端互補的堿基對和30個不相關(guān)的堿基。此外，每個反應(yīng)摻人2.5μCi32Pα-dCTP作為示蹤物。反應(yīng)在37℃溫育1小時。當(dāng)溫育結(jié)束時，用Qiaquick離心(spin)PCR純化試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)收獲DNA-RNA雜合體，從而去除引物和未摻入的同位素。將1微升cDNA滴在2個相同的硝酸纖維素膜上并通過LSC進行計數(shù)。對于PCR，每個樣品用25,000CPM。除此之外，按下述進行PCR。PCR混合物含有500mM氯化鉀、50mMTris-HCl，pH9.0、50mM氯化鈉，10mM氯化鎂、20μMdNTP和1單位TaqDNA聚合酶(Promega，MadisonWI)。引物是5β-gal(GAGAATACCGACGGGTTGTTACT)和T30-gal(GAACATCGATGAACAAGCTTAGGTATCGATA)，它為T30D20-gal寡聚體末端的30個核苷酸。引物的使用濃度為1.25μM。針對引物和模板的組合，對PCR循環(huán)進行優(yōu)化(33個循環(huán))。在PCR結(jié)束之后，將產(chǎn)物在1％TAE瓊脂糖凝膠進行分離，然后印跡至尼龍濾膜上。濾膜用32P-標(biāo)記的pCMVβ-gal探針進行雜交過夜，然后洗滌以除去未雜交的計數(shù)。用Betagen貝塔掃描器評估印跡，然后測定正確大小的條帶的CPM。實施例9細菌脂多糖和白細胞介素-1β對轉(zhuǎn)染效率的影響細菌細胞中的脂多糖是一種有力的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，它能夠引發(fā)級聯(lián)事件，其中包括細胞因子的產(chǎn)生和細胞征集(recruitment)。在以前的研究中，已表明，通過正調(diào)控IL-1βmRNA(脂多糖)以及誘導(dǎo)IL-8mRNA(IL-1β)，A549細胞會對脂多糖和IL-1β產(chǎn)生應(yīng)答。在本發(fā)明中，用100單位/毫升IL-1β或0.5微克/毫升脂多糖處理A549細胞4小時，然后用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染。如圖1所示，與用培養(yǎng)基處理的A549細胞相比，IL-1β和脂多糖都明顯地降低了β-gal活性。實施例10在pCMVβ-gal-陽離子脂質(zhì)-轉(zhuǎn)染的A549細胞中局部用的糖皮質(zhì)素增強β-半乳糖苷酶活性在轉(zhuǎn)染之前，用劑量為10-7至10-6M合成的、局部用糖皮質(zhì)素倍氯米松或用培養(yǎng)基預(yù)處理A549細胞4小時。在5×10-7M至10-6M范圍內(nèi)的倍氯米松時，可一直觀察到2-4倍的增強情況，而對于10-7M僅觀察到稍微增強(圖2A)。此外，其他局部用類固醇如布地奈德、FLUN和倍氯米松的中性脂質(zhì)體形式(即倍氯米松-DLPC)也可增強A549細胞中的β-gal活性(圖2b)。10-6M的倍氯米松-DLPC也可將β-gal活性提高到類似于乙醇中布地奈德或倍氯米松所達到的程度(圖2A)，這表明脂質(zhì)體分子并不影響這一效果。FLUN總是表現(xiàn)出較低的增強效果，這與糖皮質(zhì)素的效力是相符的。實施例11糖皮質(zhì)素處理可逆轉(zhuǎn)IL-1β和脂多糖對基因表達的抑制作用倍氯米松表現(xiàn)出，已逆轉(zhuǎn)了這兩種免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的不良效應(yīng)。為了更具體地顯示這一現(xiàn)象，用10-6M倍氯米松預(yù)處理A549細胞4小時，然后用脂多糖或IL-1β處理4小時，再用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染。如前所見，IL-1β和脂多糖會抑制β-gal表達的程度，而倍氯米松會增強β-gal活性2.5倍。在用倍氯米松預(yù)處理，然后用IL-1β或脂多糖處理(倍氯米松，脂多糖；倍氯米松，IL-1β)的細胞中，β-gal的表達超過未處理細胞2倍，并接近“僅用倍氯米松”預(yù)處理的細胞中的水平。這暗示，倍氯米松中斷了IL-1β或脂多糖的抑制效應(yīng)。因為許多進行基因治療的病人患有慢性的革蘭氏陰性細菌感染，因此，在輸送基因或倍氯米松之前，就可能存在脂多糖和IL-1β的抑制效應(yīng)。為了確定倍氯米松對β-gal表達的增強效應(yīng)是否可在用脂多糖或IL-1β預(yù)處理過的細胞中克服β-gal活性的抑制作用，先用脂多糖或IL-1β預(yù)處理A549細胞4小時，然后用倍氯米松處理4小時，接著用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染(IL-1β、BEC；脂多糖、BEC)。圖3顯示，即使在用脂多糖或IL-1β處理細胞，從而早已建立起抑制過程(參見僅用脂多糖、IL-1β處理的情況)的情況下，倍氯米松雙丙酸酯處理不僅可恢復(fù)β-gal活性，而且可以將β-gal活性增加到高于用培養(yǎng)基處理的轉(zhuǎn)染細胞。在用脂多糖或IL-1β預(yù)處理過然后用倍氯米松處理的細胞中，β-gal活性水平不能很好地達到在僅用倍氯米松預(yù)處理的細胞中所見到的β-gal活性的增加水平。這暗示，某些方面的脂多糖或IL-1β-誘導(dǎo)的抑制活性被保留了。因此，本發(fā)明表明，即使在已發(fā)生感染的情況下，倍氯米松處理也可提高DNA-陽離子脂質(zhì)法的基因轉(zhuǎn)染作用。實施例12糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的報道基因活性增強的定性研究為了確定糖皮質(zhì)素所導(dǎo)致的β-gal活性增強是否是一種更普遍的現(xiàn)象，將大鼠原代肺細胞分離出，然后用培養(yǎng)基或糖皮質(zhì)素預(yù)處理4小時，接著再用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染。如圖4中所示，可看出對幾種不同的大鼠細胞制備物的綜合結(jié)果，即β-gal活性提高2倍。與A549細胞相比，大鼠原代肺細胞似乎對倍氯米松更敏感，其中發(fā)現(xiàn)β-gal活性的最佳增強是在10-7M。與在A549細胞中所觀察到的結(jié)果相似，脂多糖抑制β-gal活性。同樣，用倍氯米松預(yù)處理然后用脂多糖進行刺激，可以將β-gal活性恢復(fù)到用培養(yǎng)基預(yù)處理細胞中的活性水平；超過對照的增強情況較輕微。因此，在大鼠原代肺細胞的異質(zhì)群體中，糖皮質(zhì)素也可逆轉(zhuǎn)脂多糖對β-gal活性的抑制效應(yīng)，這暗示，糖皮質(zhì)素也可在體內(nèi)增強對類似細胞類型的轉(zhuǎn)染糖皮質(zhì)素效應(yīng)并不是對陽離子脂質(zhì)DMRIE/DOPE特異，因為在先用倍氯米松預(yù)處理然后用pCMVβ-gal和DOSPA/DOPE(另一種陽離子脂質(zhì))轉(zhuǎn)染的細胞中β-gal表達也上升(圖5A)。此外，該效應(yīng)對載體中的CMV啟動子也不是特異的，因為當(dāng)A549細胞先用倍氯米松雙丙酸酯預(yù)處理，然后用pSVβ-DMRIE/DOPE(一種含有SV40啟動子的載體)轉(zhuǎn)染時，也觀察到糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的增強情況(圖5B)。最后，糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的基因表達增強也不限于β-gal報道基因，因為當(dāng)報道基因是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)時也觀察到了類似結(jié)果(圖5C)。為了排除其他類固醇也可能提高β-gal活性的可能性，在通過陽離子DMRIE/DOPE用pCMVβ-gal或pSVβ進行轉(zhuǎn)染之前，用各種劑量的雌激素(雌二醇)、黃體酮、膽固醇或者用倍氯米松處理4小時。僅在用倍氯米松處理的細胞中觀察到β-gal的增強效應(yīng)，這表明，在A549細胞中增強效應(yīng)是糖皮質(zhì)素特異性的。使用不同的脂質(zhì)、啟動子或報道基因時的倍氯米松介導(dǎo)的增強作用的劑量應(yīng)答，與用pCMVβ-gal+DMRIE/DOPE在A549細胞中所見的情況相似，在5×10-7至10-6M時產(chǎn)生最大增強的報道基因活性。本發(fā)明這些研究的綜合結(jié)果表明，這種糖皮質(zhì)素對細胞的效應(yīng)是一種普遍的現(xiàn)象，它并不限于特定的糖皮質(zhì)素、報道基因、啟動子、脂質(zhì)或細胞系。該效應(yīng)在原代肺細胞中是劑量依賴型的，表現(xiàn)出對倍氯米松更高的敏感性。因為該效應(yīng)并不是特定糖皮質(zhì)素所特有的，所以溶解在乙醇中的倍氯米松可用于本文下述的其余研究工作。實施例13倍氯米松雙丙酸酯-介導(dǎo)的報道基因表達增強的機制載體攝入一種使報道基因表達提高的可能性是更高的載體攝入。這一可能性可以用兩種方法來處理確定β-gal染色的細胞數(shù)目對活性，以及放射性標(biāo)記的質(zhì)粒-陽離子脂質(zhì)的攝入。對于染色的細胞，將相同的A549細胞培養(yǎng)物用倍氯米松雙丙酸酯或僅用培養(yǎng)基處理4小時，然后用DMRIE/DOPE和pCMVβ-gal進行轉(zhuǎn)染。在48小時時，將一組培養(yǎng)物進行裂解，并測定β-gal活性，而另一組則用中性緩沖的甲醛固定并用β-gal染色(對于每種處理有重復(fù)的孔)。計數(shù)在1×1平方厘米面積內(nèi)的染色細胞。如表I所示，當(dāng)在β-gal分析中β-gal活性增加的同時，被β-gal染色的細胞數(shù)目，在用培養(yǎng)基預(yù)處理過的細胞和用倍氯米松雙丙酸酯預(yù)處理過的細胞之間是相近的。這暗示，更高的β-gal表達并不是因為有更多數(shù)目的細胞攝入了質(zhì)粒。表I</tables>因為有可能染色技術(shù)不夠靈敏以致于不能檢測出質(zhì)粒攝入的增加，所以用下列方法來解決這一問題，即將用倍氯米松處理過和培養(yǎng)基處理過的細胞中放射性標(biāo)記質(zhì)粒的攝入量進行比較。為了保證在標(biāo)記中質(zhì)?；旧衔幢桓淖儯ㄟ^在質(zhì)粒制備(參見上面內(nèi)容)過程中向細菌培養(yǎng)物中加入3H-胸苷而使質(zhì)粒被代謝標(biāo)記。在對標(biāo)記材料確定了飽和結(jié)合和攝入動力學(xué)之后，用數(shù)種濃度的倍氯米松雙丙酸酯處理A549細胞4小時，然后用3H標(biāo)記的DNA-DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染。在2小時后，用胰蛋白酶處理細胞、裂解并通過LSC確定放射性標(biāo)記質(zhì)粒的攝入情況。在圖6中所示的結(jié)果證實了用染色法所見的結(jié)果；倍氯米松并不增加攝入量，因此倍氯米松必然是通過某種其他機制起作用，從而提高β-gal活性。實施例14GC-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染β-gal表達的增強的動力學(xué)為了確定糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)β-gal活性增強的時間進程，用培養(yǎng)基或用10-6M倍氯米松預(yù)處理A549細胞不同時間，以確定這一效應(yīng)的動力學(xué)。如圖7所見，為了看到β-gal轉(zhuǎn)染的增強，需要最少暴露于倍氯米松3-4小時。在8小時預(yù)處理時，增強的β-gal活性為最大，而且在監(jiān)測的24小時內(nèi)仍維持最大。3-4小時的預(yù)溫育需求加上質(zhì)粒攝入實驗暗示，在被倍氯米松增強的β-gal應(yīng)答的介導(dǎo)過程中涉及一細胞內(nèi)的合成步驟，而不是僅僅涉及一個細胞表面的事件。實施例15糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的載體活性增強的細胞內(nèi)作用為了確定被倍氯米松介導(dǎo)的β-gal活性的提高是否需要蛋白質(zhì)合成，采用了蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)。對指定的A549細胞培養(yǎng)物用培養(yǎng)基預(yù)處理或用CHX預(yù)處理以阻斷蛋白質(zhì)合成。在30分鐘之后，被培養(yǎng)基處理過的細胞培養(yǎng)物再用培養(yǎng)基或倍氯米松進行處理。那些早已用CHX處理過的細胞，再用培養(yǎng)基+CHX或倍氯米松+CHX處理4小時。所有的細胞都用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE進行轉(zhuǎn)染，并在48小時后測定β-gal活性。如圖8所示，在對照細胞中CHX中等地抑制了β-gal活性，最可能是阻斷了β-gal蛋白質(zhì)的合成(與pCMVβ-gal加和減CHX相比)。與之相反，在用倍氯米松+CHX處理過的細胞中，仍看到了倍氯米松介導(dǎo)的β-gal活性的提高。事實上，在存在CHX的情況下，倍氯米松介導(dǎo)的β-gal活性提高得更多。這些結(jié)果顯示，對于倍氯米松而言，為了提高β-gal活性并不需要蛋白質(zhì)合成。實施例16BEC對A549細胞中pCMVβ-galmRNA水平的影響為了建立β-gal基因表達的動力學(xué)，用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染A549細胞。在轉(zhuǎn)染結(jié)束(2.5小時)后的不同時間，在T＝2、3、7、11和24小時時收獲總RNA。在2小時時可檢測到mRNA，并且在整個檢測期間都維持高水平(數(shù)據(jù)未給出)。一旦建立了β-gal基因表達的動力學(xué)，用培養(yǎng)基或10-6M倍氯米松預(yù)處理A549細胞4小時，然后用pCMVβ-gal轉(zhuǎn)染2.5小時。在T＝0、2、3或24小時收獲總RNA，然后用RS-PCR確定mRNA水平。盡管T＝2小時時，在未處理的細胞以及用倍氯米松處理的細胞中mRNA水平是高的(分別為38倍和18倍誘導(dǎo))，但是在T＝3和T＝24小時時，在用倍氯米松雙丙酸酯處理過的細胞中檢測到穩(wěn)定態(tài)mRNA水平的明確增加(圖9)。這些結(jié)果表明，糖皮質(zhì)素或者使轉(zhuǎn)錄增加了，或者使mRNA在細胞質(zhì)中穩(wěn)定化了。本發(fā)明顯示，糖皮質(zhì)素可提高通過陽離子脂質(zhì)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法而轉(zhuǎn)入細胞中的報道基因的表達。這種糖皮質(zhì)素效應(yīng)并不依賴于特定的陽離子脂質(zhì)、載體啟動子、載體報道基因或細胞類型。相反，這種糖皮質(zhì)素效應(yīng)是一種與糖皮質(zhì)素有關(guān)的普遍現(xiàn)象，因為用兩種驅(qū)動β-gal基因的啟動子時，其他類固醇如雌激素、黃體酮或膽固醇不能提高報道基因的表達。糖皮質(zhì)素并不是通過增加細胞對質(zhì)粒的攝入來起作用，而是以某種方式提高報道基因的表達。為了看到基因表達的增加，需要最少3-4小時暴露于糖皮質(zhì)素。對于倍氯米松增加報道基因活性而言，并不需要新蛋白質(zhì)合成，而且在倍氯米松雙丙酸酯不存在時，CHX并不提高基因表達，這暗示在存在CHX時看見的超誘導(dǎo)可能是糖皮質(zhì)素特異性的。在A549細胞、人肺癌細胞系和大鼠原代肺細胞分離株中看到了糖皮質(zhì)素效應(yīng)。在用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE轉(zhuǎn)染的COS-1猴腎細胞中，沒有看到糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的β-gal活性的上升。這可能是因為COS-1細胞沒有糖皮質(zhì)素的受體，或者缺少某種其他在增強反應(yīng)中所涉及的糖皮質(zhì)素敏感性細胞內(nèi)因子。不對糖皮質(zhì)素效應(yīng)作出反應(yīng)的細胞系可用于闡明該反應(yīng)的本質(zhì)。最可能的是，如果使用濃度為10-7M倍氯米松而不是使用10-6M的濃度(在大鼠原代培養(yǎng)物中10-6M比10-7M的效力低)，那么在脂多糖存在時可看到更高的倍氯米松對β-gal活性的增強作用。用中間濃度5×10-7M，對這種改變進行檢查。在大多數(shù)實驗室中使用的質(zhì)粒制劑和幾乎每種其他制備的質(zhì)粒制劑中，都存在脂多糖。將脂多糖從質(zhì)粒中去除是一個需要在使用基因治療時加以克服的障礙。無論脂多糖是否存在于質(zhì)粒中，或者早已存在于有炎癥的肺中，倍氯米松能夠逆轉(zhuǎn)脂多糖或IL-1β(而且可能其他細胞因子或免疫過程)的抑制效應(yīng)這一能力，對于臨床上的基因治療是具有重大意義的。糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的報道基因表達增強的機制，才剛剛開始被闡明。已表明，糖皮質(zhì)素有多種調(diào)控性能，它們依賴于糖皮質(zhì)素濃度、細胞類型、和靶基因或細胞內(nèi)位點。糖皮質(zhì)素可以將調(diào)控作用于免疫應(yīng)答；已知被糖皮質(zhì)素負調(diào)控的基因包括IL-1β基因、TNF-α、胞內(nèi)粘著分子-1(ICAM-1)以及形成細胞外基質(zhì)如膠原和溶基質(zhì)素的結(jié)構(gòu)基因。已表明，糖皮質(zhì)素可通過幾種不同的機制調(diào)控基因，如通過降低基因轉(zhuǎn)錄(如在IL-1β基因中所見的那樣)，而且糖皮質(zhì)素還可在轉(zhuǎn)錄后步驟中影響IL-1β表達。糖皮質(zhì)素還可正調(diào)控基因表達。在與糖皮質(zhì)素相互作用之后，糖皮質(zhì)素受體就直接與調(diào)控元件即已知的糖皮質(zhì)素應(yīng)答元件(glucocorticoidresponseelement，GRE)特異性DNA片段結(jié)合。在糖皮質(zhì)素應(yīng)答性基因啟動子中，GC-糖皮質(zhì)素受體復(fù)合物的結(jié)合會正調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄?；蛘?，已表明，糖皮質(zhì)素受體會結(jié)合于其他的轉(zhuǎn)錄因子如c-fos或c-jun(它們在沒有糖皮質(zhì)素受體存在時會激活基因轉(zhuǎn)錄)。通過糖皮質(zhì)素受體-c-fos或c-jun締合作用，c-fos、c-jun就不能去激活應(yīng)答基因了。在本發(fā)明中，通過檢索序列基因庫加以確定，使用的啟動子中沒有一種具有更普通的GRE。信使RNA半衰期，可能因為糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的對mRNA-特異性內(nèi)切核酸酶的抑制作用而延長，但是因為在不存在倍氯米松時CHX并不超誘導(dǎo)基因表達，所以對內(nèi)切核酸酶的抑制作用必然對糖皮質(zhì)素是有某些特異性的。或者，一種增強轉(zhuǎn)錄或翻譯的輔因子(一種對于新蛋白質(zhì)合成不需要的輔因子)可能被糖皮質(zhì)素正調(diào)控，從而增強報道基因蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。Liu等人的最近研究表明，當(dāng)?shù)厝姿?DEX)被偶聯(lián)于抑生長素啟動子片段時，它可提高報道基因基活性。已表明，其機制并不涉及啟動子中經(jīng)典的GRE，相反糖皮質(zhì)素受體表現(xiàn)出與蛋白質(zhì)cAMP調(diào)控元件結(jié)合蛋白(CREB)(已知它結(jié)合于另一轉(zhuǎn)錄元件cAMP調(diào)控元件(CRE))的聯(lián)合活性。cAMP和蛋白質(zhì)激酶A都涉及Dex-介導(dǎo)的報道基因活性增強效應(yīng)。對于PEPCK基因也表現(xiàn)出類似的情況糖皮質(zhì)素正調(diào)控以及cAMP增加轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中，此處所示的糖皮質(zhì)素效應(yīng)對一個啟動子區(qū)域而言并不是特異的。就是說，對于具有SV40啟動子或CMV啟動子的載體，糖皮質(zhì)素都可提高該載體中β-gal的活性。不可能這兩種啟動子在其啟動子中都有類似的CRE序列，但是這種可能性還不確定。另一研究顯示了細胞增殖對轉(zhuǎn)染基因表達的正向效應(yīng)。與此處所見的相類似，沒有觀察到報道基因攝入的增加，但是在因細胞受傷而刺激進行增殖的細胞中觀察到熒光素酶活性增加10倍。在本發(fā)明的研究中，糖皮質(zhì)素不可能誘導(dǎo)細胞增殖，因為在48小時的整個溫育期間，A549細胞或肺細胞的密度是始終處于對數(shù)生長期的。多年來，糖皮質(zhì)素已被用于臨床，并被認為是安全和有效的。具有慢性肺炎疾病的病人是將糖皮質(zhì)素作為氣溶膠輸送以進行局部治療的良好候選對象。此外，已表明，糖皮質(zhì)素治療可提高囊性纖維變性病人的總體肺功能，尤其是當(dāng)治療是在局部早期進行時?？紤]到糖皮質(zhì)素的安全性和基因治療的成本(它由昂貴的DNA制劑和陽離子脂質(zhì)構(gòu)成)，并且考慮到將大量DNA-脂質(zhì)反復(fù)輸送所帶來的潛在副作用，這使本發(fā)明在基因治療和糖皮質(zhì)素的分子生物學(xué)方面更具吸引力。在本說明書中提及的所有專利和出版物代表了本發(fā)明有關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
中技術(shù)人員的水準。這些專利和出版物都同等地被引用作為參考，就象每篇出版物被具體而單獨地被注明被引用一樣。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會輕易地理解，本發(fā)明適用于實施目的并獲得所提及的結(jié)果和好處，以及那些內(nèi)在的結(jié)果和好處。此處所述的這些實施例和方法、程序、處理、分子、和具體的化合物是目前優(yōu)選例子的代表，是代表性的，因而不用于限制本發(fā)明范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進行改動或作其他用途，這些都包括在本發(fā)明的被權(quán)利要求所界定的范圍內(nèi)。序列表(1)一般信息(i)申請人Schwarz，L.等人(ii)發(fā)明名稱糖皮質(zhì)素對基因表達的增強作用(iii)序列數(shù)目3(iv)通訊地址(A)姓名JamesF.Weiler，律師(B)街道OneRiverway，Suite1560(C)城市Houston(D)州Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77056(v)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型DS，HD1.44Mb/1.44Mo(B)計算機IBMPC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect6.0(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Weiler，JamesF.(B)登記號16,040(C)參考/案卷號D-5806(ix)通訊信息(A)電話713-626-8646(B)傳真713-963-5853(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度50(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型(A)描述其他核酸(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)最初來源(B)菌株N/A(C)單個分離株N/A(D)發(fā)育階段N/A(F)組織類型N/A(G)細胞類型N/A(H)細胞系N/A(xi)序列描述SEQIDNO1GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATACACCTCGCGGAAACCGACAT50(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度22(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型(A)描述其他核酸(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)最初來源(B)菌株N/A(C)單個分離株N/A(D)發(fā)育階段N/A(F)組織類型N/A(G)細胞類型N/A(H)細胞系N/A(xi)序列描述SEQIDNO2GAGAATACCGACGGGTTGTTACT22(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度31(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型(A)描述其他核酸(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)最初來源(B)菌株(C)單個分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(xi)序列描述SEQIDNO3GAACATCGATGAACAAGCTTAGGTATCGATA3權(quán)利要求1.一種將基因輸送給動物之后，提高該基因在生物組織中細胞表達的方法，其特征在于，該方法包括步驟給該動物施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該糖皮質(zhì)素選自下組氫可的松、潑尼松、潑尼松龍、曲安西龍、倍他米松、布地奈德、氟尼縮松和地塞米松。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該糖皮質(zhì)素的施用劑量約為0.1-50毫克/千克。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該生物組織選自下組肝、白細胞、肺、腸胃道、腎、骨骼肌肉、平滑肌、神經(jīng)組織、皮膚細胞、癌細胞、眼、骨髓和腫瘤。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該糖皮質(zhì)素為選自下組的形式液體可溶形式、醇可溶形式或水可溶形式。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該基因被包裹在脂質(zhì)體中。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該基因被溶解在溶劑中。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該基因的輸送是通過選自下組的途徑注射、口服給藥、皮膚給藥或氣溶膠給藥。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該糖皮質(zhì)素的施用是與該基因的輸送同時進行，或在輸送該基因之前或之后進行。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該動物選自下組人和非人的動物。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該糖皮質(zhì)素選自下組合成的糖皮質(zhì)素和非合成的糖皮質(zhì)素。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該基因是用選自下組的方法轉(zhuǎn)染的病毒轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、以及采用受體和陽離子胺的靶向基因治療。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，該陽離子胺是聚-L-賴氨酸。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該基因選自下組重組基因、天然基因、cDNA和寡聚體。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該糖皮質(zhì)素增強質(zhì)?；虿《据d體中所含基因的表達和/或活性。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該糖皮質(zhì)素增強啟動子的活性。17.一種治療人病理狀態(tài)的方法，它是通過將基因輸送給需要這種治療的動物的生物組織之后，提高該基因的細胞表達，其特征在于，該方法包括步驟給該動物施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。全文摘要本發(fā)明提供了一種將基因輸送給動物之后,提高該基因在生物組織中細胞表達的方法,該方法包括步驟:給該動物施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。還提供了一種治療人病理狀態(tài)的方法,它是通過將基因輸送給需要這種治療的動物的生物組織之后,提高該基因的細胞表達,該方法包括步驟:給該動物施用藥理有效量的、足以提高該基因細胞表達的糖皮質(zhì)素。文檔編號C12N15/87GK1198676SQ96197408公開日1998年11月11日申請日期1996年9月6日優(yōu)先權(quán)日1995年9月8日發(fā)明者L·施瓦茨,J·L·約翰遜,V·奈特申請人:研究發(fā)展基金會