專(zhuān)利名稱：一種糖皮質(zhì)激素增效劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)增效劑，是將人參總皂苷(ginsenosides，GS)用作GC的抗炎、抗應(yīng)激、免疫抑制等生物學(xué)效應(yīng)增效劑的用途。
背景技術(shù)：
GC既是人體分泌的一種甾體類(lèi)激素，也是臨床常用的藥物，它主要通過(guò)與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)結(jié)合發(fā)揮作用。大劑量GC常用于抗炎、抗應(yīng)激作用，如搶救休克病人及控制嚴(yán)重變態(tài)免疫反應(yīng)等；小劑量GC常用于一些自身免疫性疾病的長(zhǎng)期治療。由于GC本身的副作用如可導(dǎo)致潰瘍出血、血壓升高、免疫力降低、骨質(zhì)疏松等，以及長(zhǎng)期使用產(chǎn)生激素抵抗等，使其在臨床應(yīng)用受到很大限制。如果能有一種藥物可以增加GC的生物學(xué)效應(yīng)，那么就可以減少其用量，降低副作用的發(fā)生而不影響其療效。GS是中藥人參的主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)它既具有抗應(yīng)激提高免疫力等作用，又可在一定程度上上調(diào)GR水平和最大結(jié)合容量，從而可以提高GC與其受體結(jié)合的數(shù)量和能力。但至今未見(jiàn)將GS用作GC增效劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種GC增效劑，它可以在增強(qiáng)GC的生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)上減少GC用量。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明GS與GC聯(lián)合應(yīng)用可以增強(qiáng)GC的抗炎、抗應(yīng)激及免疫抑制等效應(yīng)，從而減少GC用量。因此，可將GS用作GC的增效劑。
體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GS可以提高HL-7702細(xì)胞中地塞米松(dexamethasone，Dex)誘導(dǎo)的GR基因轉(zhuǎn)錄，并可以部分逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)GR表達(dá)和結(jié)合容量的抑制作用，這種情況同樣可見(jiàn)于除紅細(xì)胞以外的其它細(xì)胞株中。進(jìn)而我們又通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GS聯(lián)合小劑量GC對(duì)大鼠應(yīng)激后肝功能的保護(hù)作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單獨(dú)使用GC，其機(jī)理部分是通過(guò)提高GR最大結(jié)合容量、GRmRNA表達(dá)和抑制某些炎癥因子的釋放而實(shí)現(xiàn)的。這強(qiáng)烈提示GS可以通過(guò)提高GR的表達(dá)和結(jié)合能力來(lái)增強(qiáng)GC的生物學(xué)效應(yīng)。臨床前瞻性隨機(jī)雙盲對(duì)照研究也證實(shí)，低于臨床常用劑量的小劑量GC對(duì)應(yīng)激、炎癥等造成的肝損傷無(wú)明顯保護(hù)作用，但聯(lián)合一定量的GS后則呈現(xiàn)出肝功能明顯好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種糖皮質(zhì)激素增效劑，其特征在于使用人參總皂苷作為增效劑，其配比如下人參總皂苷200mg～1200mg，地塞米松0.75～187.5mg；人參總皂苷200mg～1200mg，倍他米松0.75～187.5mg；人參總皂苷200mg～1200mg，強(qiáng)的松5～1250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，強(qiáng)的松龍5～1250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，甲強(qiáng)龍4～1000mg；人參總皂苷200mg～1200mg，可的松25～6250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，氫化可的松20～5000mg。
本發(fā)明將GS用作GC增效劑，不僅增強(qiáng)了GC的生物學(xué)效應(yīng)，而且可以減少GC用量，從而降低其副作用的發(fā)生率。由于與GR結(jié)合是GC發(fā)揮作用的主要途徑，因而GS對(duì)GC的增效作用是沒(méi)有病種特異性的，即適用于所有適合GC治療的疾病?？蓪⑷藚⒖傇碥沼糜谒惺褂锰瞧べ|(zhì)激素的疾病中，尤其是需要長(zhǎng)期或大量使用糖皮質(zhì)激素治療的疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、多發(fā)性肌炎等等。


圖1.GS影響GC誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的量效關(guān)系圖2.GS影響GC誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的時(shí)效關(guān)系圖3.GS對(duì)Dex誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞GR mRNA表達(dá)下降的抑制效應(yīng)圖4.GS對(duì)Dex誘導(dǎo)GR蛋白下調(diào)的抑制效應(yīng)圖5.HL-7702細(xì)胞GR簡(jiǎn)單單位點(diǎn)飽和分析圖6.肝總動(dòng)脈結(jié)扎后12h各組大鼠血清ALT變化圖7.肝總動(dòng)脈結(jié)扎后12h各組大鼠血清AST變化圖8.肝總動(dòng)脈結(jié)扎后12h各組大鼠血清ALP變化圖9.各組肝臟GR Bmax的變化比較圖10.各組肝臟GR mRNA的變化比較圖11.各組血清皮質(zhì)酮的變化比較圖12.各組血清TNF-α的變化比較圖13.各組血清IL-1β的變化比較圖14.各組血清IL-6的變化比較注圖3、4中a，P＜0.01 vs control group；b，P＜0.05 vs Dex-treated group；圖6、7、8中△P＜0.01 vs NC group；*P＜0.01 vs Model group；**P＜0.05 vs Model group圖9、10、11、12、13、14中△△P＜0.05 vs NC group；△P＜0.01 vs NC group；*P＜0.01 vs Model group。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1.體外實(shí)驗(yàn)1.以不同濃度的GS(6.25～100 mg/L)與10-8M/L Dex共同處理HL-7702細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)GS對(duì)GC誘導(dǎo)GR轉(zhuǎn)錄激活功能的影響。
圖1所示是GS影響GC誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的量效關(guān)系?？梢?jiàn)GS對(duì)GC誘導(dǎo)GR報(bào)告基因的表達(dá)有顯著的增強(qiáng)作用，但是呈非劑量依賴性特征，當(dāng)GS濃度為25mg/L，GS的增強(qiáng)作用最強(qiáng)。
圖2所示是GS影響GC誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的時(shí)效關(guān)系。可見(jiàn)GS能夠顯著增強(qiáng)GC誘導(dǎo)GR轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)，當(dāng)GS劑量為25mg/L、作用時(shí)間為36h時(shí)，其作用效果最佳。
2.將同時(shí)含有25 mg/L GS與Dex(10-8mol/L)的培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞36h后，檢測(cè)細(xì)胞GRmRNA水平和GR蛋白表達(dá)。
圖3所示是GS對(duì)Dex誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞GR mRNA表達(dá)下降的抑制效應(yīng)?？梢?jiàn)Dex處理后細(xì)胞GR mRNA表達(dá)下降47％(P＜0.05)，然而，GSS能夠抑制Dex對(duì)細(xì)胞GR mRNA的下調(diào)作用，能夠使Dex誘導(dǎo)細(xì)胞GR mRNA的表達(dá)升高大約40％。表明GS在細(xì)胞GR轉(zhuǎn)錄水平上具有拮抗(反轉(zhuǎn))Dex對(duì)GR mRNA轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)的作用。
圖4所示是GS對(duì)Dex誘導(dǎo)GR蛋白下調(diào)的抑制效應(yīng)?？梢?jiàn)與對(duì)照組相比Dex可致細(xì)胞GR水平下降至52％，而Dex與GS合用后，可使GR表達(dá)水平上升至73％，兩組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。表明GS能夠顯著抑制Dex對(duì)細(xì)胞GR蛋白表達(dá)的下調(diào)作用，其作用效應(yīng)與GS增強(qiáng)被抑制的GR mRNA的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。
3.為了明確GS在改變細(xì)胞GR蛋白量的變化的同時(shí)，對(duì)GR與配體的結(jié)合活性是否有影響，分別觀察了細(xì)胞經(jīng)0.01％乙醇、10-8mol Dex或10-8mol Dex與25mg/L GS共同作用36 h后GR飽和曲線的變化。
圖5所示是HL-7702細(xì)胞GR簡(jiǎn)單單位點(diǎn)飽和分析。可見(jiàn)各組隨著3H-Dex濃度增加，非特異結(jié)合量(F)也增加，特異結(jié)合最終趨向飽和。Dex組飽和曲線起始段較陰性對(duì)照組明顯低平，其最大特異結(jié)合容量為36fmol/106細(xì)胞，明顯低于對(duì)照組(83fmol/106細(xì)胞)，說(shuō)明HL-7702細(xì)胞經(jīng)Dex處理后，其GR結(jié)合活性明顯降低；然而，Dex與GS聯(lián)合作用組細(xì)胞GR接近飽和時(shí)的特異結(jié)合容量約為58fmol/106細(xì)胞。證實(shí)GS可以部分拮抗Dex對(duì)GR結(jié)合活性的抑制作用，并且提高Dex作用下細(xì)胞GR的結(jié)合容量。
表1所示是不同誘導(dǎo)條件下HL-7702細(xì)胞平衡解離(Kd)常數(shù)最大結(jié)合容量(Bmax)的比較。HL-7702細(xì)胞在正常狀態(tài)下的Kd值和Bmax分別為3.57±0.52nM和49665±4863位點(diǎn)/細(xì)胞，經(jīng)Dex處理后細(xì)胞GR的Kd明顯升高達(dá)7.14±1.13 nM(P＜0.01)，而B(niǎo)max則下降至21672±2081位點(diǎn)/細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)Dex不僅使細(xì)胞GR與配體親和力降低，而且使GR結(jié)合容量明顯減少。與Dex組比較，GS與GC共同預(yù)處理的細(xì)胞GR的Kd和Bmax分別為5.1±0.67nM(P＞0.05)和3461 5±2935位點(diǎn)/細(xì)胞(P＜0.05)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GS能夠部分逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)GR結(jié)合活性的抑制作用，其作用是通過(guò)增加GR與配體的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而對(duì)GR的親和力無(wú)顯著影響。
表1.不同誘導(dǎo)條件下HL-7702細(xì)胞衡平解離(Kd)常數(shù)最大結(jié)合容量(Bmax)的比較


注與對(duì)照組比較a，P＜0.01；與Dex組比較b，P＜0.05。
以上實(shí)驗(yàn)可以在含有GR的多數(shù)細(xì)胞株中重復(fù)，并得到相似結(jié)論GS能夠增強(qiáng)GR轉(zhuǎn)錄激活，其機(jī)制與GS上調(diào)GR表達(dá)有關(guān)；GS能夠部分逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)GR基因表達(dá)和結(jié)合活性的下調(diào)作用，這可能是GS具有增強(qiáng)GC效應(yīng)的主要機(jī)制之一。
實(shí)施例2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.觀察不同濃度GS聯(lián)合Dex對(duì)肝總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠肝功能的保護(hù)作用。我們選擇術(shù)后12h這一肝功能損傷最為嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)作為觀察點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在10～100mg/kg范圍內(nèi)GS對(duì)Dex(5mg/kg)均有增效作用，其中以50mg/kg GS的增效作用最佳，故選擇該濃度劑量進(jìn)行進(jìn)一步研究。
圖6～8所示是肝總動(dòng)脈結(jié)扎后12h各組大鼠肝功酶學(xué)變化。結(jié)果顯示GS聯(lián)合Dex組的ALT、ALP可以恢復(fù)到正常對(duì)照組水平(P＞0.05)，AST雖然仍高于正常對(duì)照組(P＜0.01)但明顯低于模型組(P＜0.01)；Dex組的ALT、AST水平低于模型組(P＜0.01)，高于正常對(duì)照組和GS聯(lián)合Dex組(P＜0.05)，ALP也可以恢復(fù)到正常水平。表明GS聯(lián)合Dex組對(duì)肝功能的保護(hù)作用要優(yōu)于單純使用Dex組。
2.在實(shí)驗(yàn)1的基礎(chǔ)上，以GS的最佳增效濃度50mg/kg聯(lián)合5mg/kg Dex作為研究使用劑量，對(duì)GS增強(qiáng)GC效應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究。
圖9～11所示是各組肝臟GR Bmax、GR mRNA和血清皮質(zhì)酮的變化比較。結(jié)果顯示Dex對(duì)GR Bmax、GR mRNA和血清皮質(zhì)酮均有明顯的抑制作用；GS雖然對(duì)血清皮質(zhì)酮無(wú)影響，但可以明顯逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)GR Bmax和GR mRNA的抑制作用。
圖12～14所示是各組肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α的變化比較。結(jié)果顯示手術(shù)造成這三種細(xì)胞炎癥因子的升高，使用Dex可以減少炎癥因子的釋放；聯(lián)合GS后，IL-1β、IL-6和TNF-α均降至正常水平。說(shuō)明GS增加了GC減少炎癥因子釋放的作用，這可能是GS增加GC抗炎作用的機(jī)理之一。
同時(shí)我們還對(duì)多種應(yīng)激、炎癥和免疫抑制動(dòng)物模型如失血性休克模型大鼠、熱損傷模型、多發(fā)傷及自身免疫性疾病等模型大鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，得到如下結(jié)論GS可以增強(qiáng)Dex的抗炎、抗應(yīng)激及免疫抑制作用；GS可以部分逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)模型大鼠GR的抑制作用；GS增強(qiáng)GC效應(yīng)部分是通過(guò)提高GR Bmax和GRmRNA的表達(dá)及抑制某些炎癥因子釋放而實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例3.臨床試驗(yàn)通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)GS對(duì)GC的抗炎、抗應(yīng)激及免疫抑制效應(yīng)具有增強(qiáng)作用。經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞(TranscatheterArterial Chemoembolization，TACE)是一種有創(chuàng)操作，在其過(guò)程中患者會(huì)產(chǎn)生心理和生理的雙重應(yīng)激，同時(shí)經(jīng)動(dòng)脈所灌注的化療藥物和栓塞劑會(huì)造成肝組織的缺血壞死，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因而，TACE是研究抗炎、抗應(yīng)激的良好模型。在驗(yàn)證增強(qiáng)GC免疫抑制效應(yīng)方面，將選用系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、多發(fā)性肌炎等多種自身免疫性疾病患者作為研究對(duì)象。
1.采用隨機(jī)雙盲對(duì)照設(shè)計(jì)，按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)收集2004-6～2006-6在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科住院的原發(fā)性肝癌適合行TACE的患者120例，分為四組安慰劑組、Dex組、GS組、GS+Dex組。用藥劑量為GS 400mg/d、Dex 4.5mg/d。療程為從TACE前3天至術(shù)后3天，共6天。服藥方法均分為早晚兩次服用。
療效判斷分別于術(shù)前、術(shù)后第3、7d抽血查血常規(guī)包括白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)；肝功能包括總膽紅素(TB)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST/ALT)，堿性磷酸酶(ALP)，并按WHO《抗腫瘤藥物毒副反應(yīng)的分度標(biāo)準(zhǔn)》評(píng)定療效，同時(shí)對(duì)肝功能進(jìn)行Child-Pugh分級(jí)。
結(jié)果顯示GS聯(lián)合Dex可以更好地防止TACE后WBC、PLT的降低，降低TACE后TB、AST/ALT的升高，改善Child-Pugh分級(jí)。
2.在試驗(yàn)1的基礎(chǔ)上采用隨機(jī)雙盲對(duì)照設(shè)計(jì)，繼續(xù)觀察120例原發(fā)性肝癌適合行TACE的患者，分別給予GS 200mg、400mg、800mg、1200mg(每日用量)四個(gè)劑量聯(lián)合Dex(4.5mg/d)口服。結(jié)果顯示以上劑量的GS對(duì)GC均有增效作用，其中以GS 400mg的療效最佳，隨著GS劑量的加大，并未出現(xiàn)療效明顯增強(qiáng)。
3.在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合對(duì)GS增強(qiáng)GC效應(yīng)的機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們認(rèn)為GS的增效作用是通過(guò)調(diào)節(jié)GR實(shí)現(xiàn)的，而GR是GC發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要途徑。因而，GS對(duì)GC的增效作用是沒(méi)有選擇性的，即它不但可以增強(qiáng)GC的抗炎、抗應(yīng)激作用，也應(yīng)該可以增強(qiáng)GC的免疫抑制效應(yīng)。故我們將會(huì)把GS用于多種需要GC治療的自身免疫性疾病和呼吸系統(tǒng)等疾病。由于這類(lèi)疾病急性期需要大劑量激素沖擊治療，穩(wěn)定后可改作口服GC，同時(shí)GS的用量并不隨著GC用量的增加而無(wú)限制加大，故它的有效范圍在200～1200mg/d。
可以將人參總皂苷作為一種糖皮質(zhì)激素增效劑用于所有使用糖皮質(zhì)激素的疾病中，尤其是需要長(zhǎng)期或大量使用糖皮質(zhì)激素治療的疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、多發(fā)性肌炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等等。
權(quán)利要求
1.一種糖皮質(zhì)激素增效劑，其特征在于使用人參總皂苷作為增效劑，所說(shuō)糖皮質(zhì)激素選自地塞米松、倍他米松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍、甲強(qiáng)龍、可的松、氫化可的松，其配比分別如下人參總皂苷200mg～1200mg，地塞米松0.75～187.5mg；人參總皂苷200mg～1200mg，倍他米松0.75～187.5mg；人參總皂苷200mg～1200mg，強(qiáng)的松5～1250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，強(qiáng)的松龍5～1250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，甲強(qiáng)龍4～1000mg；人參總皂苷200mg～1200mg，可的松25～6250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，氫化可的松20～5000mg。
2.權(quán)利要求1所述增效劑在制備糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種糖皮質(zhì)激素增效劑，其特征在于使用人參總皂苷作為增效劑，其配比分別如下人參總皂苷200mg～1200mg，地塞米松0.75～187.5mg；人參總皂苷200mg～1200mg，倍他米松0.75～187.5mg；人參總皂苷200mg～1200mg，強(qiáng)的松5～1250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，強(qiáng)的松龍5～1250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，甲強(qiáng)龍4～1000mg；人參總皂苷200mg～1200mg，可的松25～6250mg；人參總皂苷200mg～1200mg，氫化可的松20～5000mg。人參總皂苷作為一種糖皮質(zhì)激素增效劑，可在包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、多發(fā)性肌炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等在內(nèi)的需要長(zhǎng)期或大量使用糖皮質(zhì)激素治療的疾病中得以應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101084910SQ200710041868
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日
發(fā)明者封穎璐, 凌昌全 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)