專(zhuān)利名稱：新型重組組織因子抑制肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及新型重組組織因子抑制肽。本發(fā)明還涉及新型重組組織因子抑制肽的制備方法及其應(yīng)用。
外源性凝血途徑，也稱TF凝血途徑，為人體主要的凝血途徑。TF的表達(dá)與敗血癥、DIC、心肌梗塞、癌、中風(fēng)、急性呼吸窘迫綜合征及缺血再灌注損傷等許多病理生理過(guò)程密切相關(guān)，因此對(duì)TF凝血途徑的阻斷調(diào)節(jié)，對(duì)許多疾病的預(yù)防與治療有非常重要的臨床意義。
在動(dòng)物模型中抗TF抗體可以防止由大腸桿菌引起的急性感染性休克導(dǎo)致的死亡，并能減輕由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的兔DIC，還可以抑制兔動(dòng)脈血栓形成模型中的血栓形成。因此調(diào)節(jié)TF凝血功能的藥物可能在血栓形成及敗血癥中起重要作用。[Taylor，F(xiàn).B.，et al.(1991)Circ Shock 33，127.Pawashe A.B.，et al(1994)Circ.Res.7456.]。
由于TF與因子VIIa結(jié)合的功能域與催化協(xié)同功能域是相對(duì)獨(dú)立的，因此可以通過(guò)設(shè)計(jì)其突變體，將其催化協(xié)同的功能域通過(guò)突變而失活，保留與因子VIIa結(jié)合的功能域。TF突變體可以與野生型TF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合因子VIIa，從而對(duì)野生型TF的功能發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，降低TF凝血途徑的啟動(dòng)速度，達(dá)到防治DIC以及其他以血栓形成為主要病理變化的疾病。
近年來(lái)，研究人員使用各種TF途徑抑制劑，進(jìn)行了一系列的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和若干臨床實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明抑制TF途徑對(duì)于冠狀動(dòng)脈血栓形成、膿毒血癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、中風(fēng)、癌癥、急性呼吸窘迫綜合征和缺血再灌注損傷等均有很好的療效，而且出血的危險(xiǎn)性明顯低于低分子肝素，有安全高效等特征。
本發(fā)明應(yīng)用蛋白質(zhì)工程方法對(duì)組織因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而生產(chǎn)抑制肽，所得產(chǎn)品具有高效的抗凝和抗栓功能，并且制備工藝簡(jiǎn)便、安全。
本發(fā)明r-TFIP1和r-TFIP2的基因核苷酸序列及氨基酸序列如序列表SEQID NO1、2所示。
另一方面，本發(fā)明還提供制備r-TFIP的方法，包括制備r-TFIP cDNA基因；在表達(dá)載體中克隆cDNA基因；用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞；及從培養(yǎng)液中純化所需r-TFIP。
本發(fā)明中r-TFIP基因的制備包括經(jīng)過(guò)缺失突變和點(diǎn)突變后的基因，與質(zhì)粒pUC19重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證cDNA基因。
將本發(fā)明的cDNA基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了PR、PL啟動(dòng)子，5sRNAt1、t2終止信號(hào)，cIts857阻抑蛋白基因的原核表達(dá)載體，例如pLY-4等商業(yè)化表達(dá)載體。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌菌株如JF1125，DH5α等。
本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于菌體中，勻漿泵破菌后分離包涵體。包涵體溶解后，復(fù)性并分離和純化所需產(chǎn)品。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照<分子克隆實(shí)驗(yàn)指南>。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 r-TFIP1的設(shè)計(jì)、制備和鑒定(1)r-TFIP1基因的克隆、改造及原核表達(dá)質(zhì)粒r-TFIP1-pLY-4的構(gòu)建按照sTF的氨基酸順序，依照大腸桿菌偏好密碼子設(shè)計(jì)引物序列。設(shè)計(jì)PCR引物，并且在引物中引入Ser163，Gly164，Lys165，Lys166突變?yōu)锳la的序列。(5’-TCT TCA AGT GCC GCT GCC ACA GCC AAA-3’)并以此引物和sTF基因的3’-端引物，以sTF基因?yàn)槟０澹肞CR的方法擴(kuò)增點(diǎn)3’端的核苷酸片段。回收后以此片段為3’-端引物和sTF基因的5’-端引物，以sTF基因?yàn)槟０?，用PCR的方法擴(kuò)增得到r-TFIP的基因。所得基因與pUC19重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，以相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶解鑒定，獲得特征性片斷，證實(shí)獲得陽(yáng)性克隆。核苷酸序列分析證實(shí)基因序列正確。然后將r-TFIP1基因切出，并與大腸桿菌表達(dá)載體pLY-4重組，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒r-TFIP1-pLY-4。質(zhì)粒r-TFIP1-pLY-4轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125，抽提質(zhì)粒并做相應(yīng)的酶切分析。質(zhì)粒片段與理論片段一致者為陽(yáng)性克隆。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自BRL公司，大腸桿菌JM109、JF-1125，質(zhì)粒pUC19，pLY-4為本室保存。
(2)篩選高效表達(dá)菌株挑取上述陽(yáng)性克隆接種于5mlLBA培液中，30℃快速振搖(250 RPM)，培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1∶50接種于5mlM9CA培液中，30℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)約3小時(shí)，使其測(cè)定光密度OD600達(dá)到1.00左右，留樣后將培養(yǎng)溫度升高至42℃，繼續(xù)振搖培養(yǎng)3小時(shí)，離心收集細(xì)菌。
誘導(dǎo)前后的細(xì)菌分別用1x上樣緩沖液懸浮后，沸水浴煮5分鐘，20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳。考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS掃描定純度、分子量。可見(jiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解液在相應(yīng)分子量處有一濃集的條帶，而誘導(dǎo)前的細(xì)菌裂解液沒(méi)有。經(jīng)掃描，目的蛋白約占菌體總蛋白的40％左右。取表達(dá)水平高的克隆為工程菌。
誘導(dǎo)后的細(xì)菌，用超聲破菌并離心，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物是以非活性的包涵體的形式存在于菌體中。
上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進(jìn)行。
(3)發(fā)酵表達(dá)工程菌按上述篩選高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以5L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級(jí)潔凈度條件下劃LBA平板，30℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。從平板上挑取單菌落，同樣在100級(jí)潔凈度條件下接種于50mlLBA培養(yǎng)液中，30℃振搖培養(yǎng)8小時(shí)。此為一級(jí)種子液，再將一級(jí)種子液按1∶10接種于500mlLBA中，30℃振搖培養(yǎng)8小時(shí)，，此為二級(jí)種子液。種子菌按1∶10比例接種于4L M9CA培液中，調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)，溫度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并與攪拌連動(dòng)。繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，將培養(yǎng)溫度提高到42℃，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)，停止發(fā)酵，離心收集細(xì)菌。發(fā)酵工程菌的表達(dá)水平大于40％。
(4)制備包涵體將發(fā)酵工程菌按濕重體積以1∶20的比例，用0.02M PB(pH8.0)懸浮細(xì)菌，高壓勻漿泵破菌，壓力保持在45-50MP，離心收集沉淀即為包涵體。用洗滌液洗滌包涵體。
(5)r-TFIP復(fù)性。
洗滌后的包涵體用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的復(fù)性液，稀釋20倍。4℃攪拌復(fù)性過(guò)夜。并測(cè)定r-TFIP活性。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍體積的20mmol/L PB(pH8.0，0.5M尿素)平衡，復(fù)性后的r-TFIP1離心后上清，直接上柱結(jié)束后，用20mmol/LPB(pH8.0)繼續(xù)洗脫至基線，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH8.0)線性梯度洗脫，收集有r-TFIP1活性組分，并進(jìn)行純度分析。
所有色譜操作均為常規(guī)操作。
(7)純度鑒定及分子量測(cè)定樣品進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS掃描測(cè)定純度。所得產(chǎn)品純度95％以上。
(8)r-TFIP1抑制TF活性測(cè)定將r-TFIP1加入正常人血漿，37℃保溫5分鐘，加入稀釋兔腦粉后，繼續(xù)保溫1分鐘，加入Ca2+后凝血時(shí)間。結(jié)果表明加入r-TFIP2后血漿凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)20％-30％，在r-TFIP1濃度達(dá)到12umol/L時(shí)，TF活性抑制50％以上。實(shí)施例2 r-TFIP2的設(shè)計(jì)、制備和鑒定(1)r-TFIP2基因的克隆、改造及原核表達(dá)質(zhì)粒r-TFIP2-pLY-4的構(gòu)建按照sTF的氨基酸順序，依照大腸桿菌偏好密碼子設(shè)計(jì)引物序列。設(shè)計(jì)PCR引物，并且在引物中引入Tyr185突變?yōu)锳la的序列。(5’-AAA GGA AAT GCATGC TTC AGT GTT CAA-3’)并以此引物為5’-端引物和sTF基因的3’-端引物，以sTF基因?yàn)槟０?，用PCR的方法擴(kuò)增點(diǎn)3’端的核苷酸片段。回收后以此片段為3’-端引物和sTF基因的5’-端引物，以sTF基因?yàn)槟０澹肞CR的方法擴(kuò)增得到r-TFIP2的基因。所得基因與pUC19重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，以相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶解鑒定，獲得特征性片斷，證實(shí)獲得陽(yáng)性克隆。核苷酸序列分析證實(shí)基因序列正確。然后將r-TFI2基因切出，并與大腸桿菌表達(dá)載體pLY-4重組，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒r-TFIP-pLY-4。質(zhì)粒r-TFIP2-pLY-4轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125，抽提質(zhì)粒并做相應(yīng)的酶切分析。質(zhì)粒片段與理論片段一致者為陽(yáng)性克隆。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自BRL公司，大腸桿菌JM109、JF-1125，質(zhì)粒pUC19，pLY-4為本室保存。
(2)高效表達(dá)菌株的篩選挑取上述陽(yáng)性克隆接種于5mlLBA培液中，30℃快速振搖(250RPM)，培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1∶50接種于5mlM9CA培液中，30℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)約3小時(shí)，使其測(cè)定光密度OD600達(dá)到1.00左右，留樣后將培養(yǎng)溫度升高至42℃，繼續(xù)振搖培養(yǎng)3小時(shí)，離心收集細(xì)菌。
誘導(dǎo)前后的細(xì)菌分別用1x上樣緩沖液懸浮后，沸水浴煮5分鐘，20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS掃描定純度、分子量?？梢?jiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解液在相應(yīng)分子量處有一濃集的條帶，而誘導(dǎo)前的細(xì)菌裂解液沒(méi)有。經(jīng)掃描，目的蛋白約占菌體總蛋白的40％左右。取表達(dá)水平高的克隆為工程菌。
誘導(dǎo)后的細(xì)菌，用超聲破菌并離心，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物是以非活性的包涵體的形式存在于菌體中。
上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進(jìn)行。
(3)工程菌的發(fā)酵表達(dá)取上述篩選高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以5L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級(jí)潔凈度條件下劃LBA平板，30℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。從平板上挑取單菌落，同樣在100級(jí)潔凈度條件下接種于50mlLBA培養(yǎng)液中，30℃振搖培養(yǎng)8小時(shí)。此為一級(jí)種子液，再將一級(jí)種子液按1∶10接種于500mlLBA中，30℃振搖培養(yǎng)8小時(shí)，，此為二級(jí)種子液。種子菌按1∶10比例接種于4L M9CA培液中，調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)，溫度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并與攪拌連動(dòng)。繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，將培養(yǎng)溫度提高到42℃，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)，停止發(fā)酵，離心收集細(xì)菌。發(fā)酵工程菌的表達(dá)水平大于40％。
(4)制備包涵體將發(fā)酵工程菌按濕重體積以1∶20的比例，用0.02M PB(pH8.0)懸浮細(xì)菌，高壓泵勻漿破菌，壓力保持在45-50MP，離心收集沉淀即為包涵體。用洗滌液洗滌包涵體。
(5)r-TFIP復(fù)性。
洗滌后的包涵體用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的復(fù)性液，稀釋20倍。4℃攪拌復(fù)性過(guò)夜。并測(cè)定r-TFIP2活性。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍體積的20mmol/L PB(pH8.0，0.5M尿素)平衡，復(fù)性后的r-TFIP離心后上清，直接上柱，上柱結(jié)束后，用20mmol/L PB(pH8.0)繼續(xù)洗脫至基線，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH8.0)線性梯度洗脫，收集有r-TFIP2活性組分，并進(jìn)行純度分析。
本發(fā)明所述所有色譜操作均為常規(guī)操作。
(7)純度鑒定及分子量測(cè)定樣品進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS掃描測(cè)定純度。所得產(chǎn)品純度95％以上。
(8)r-TFIP2抑制TF活性測(cè)定將r-TFIP2加入正常人血漿，37℃保溫5分鐘，加入稀釋兔腦粉后，繼續(xù)保溫1分鐘，加入Ca2+后凝血時(shí)間。結(jié)果表明加入r-TFIP2后血漿凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)20％-30％，在r-TFIP2濃度達(dá)到20umol/L時(shí)，TF活性抑制50％以上。
實(shí)施例3 r-TFIP在血栓性疾病中的應(yīng)用應(yīng)用本發(fā)明所制備的r-TFIP進(jìn)行抗血栓實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其在血栓性疾病的防治中有良好的作用，與低分子肝素相比，抗栓效果明顯，對(duì)凝血功能的影響明顯小于低分子肝素。
(1)抑制靜脈血栓形成結(jié)扎大鼠下腔靜脈誘發(fā)靜脈血栓形成。血栓形成2小時(shí)后靜脈注射給藥。陰性對(duì)照組給予生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予低分子肝素60-100抗Xa U/kg，治療組分別給予r-TFIP1.00-2.0mg/kg。給藥后4小時(shí)后取出血栓，稱重。結(jié)果顯示r-TFIP比低分子肝素更能抑制靜脈血栓形成。
(2)抑制動(dòng)脈血栓形成用氣囊導(dǎo)管損傷家兔股動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并結(jié)扎損傷部分的血管，使局部血流阻滯而誘發(fā)動(dòng)脈血栓形成。陰性對(duì)照組給予生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予低分子肝素60-120抗Xa U/kg，治療組分別給予r-TFIP 1.00-2.0mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，r-TFIP可使動(dòng)脈血栓形成率下降，并呈劑量相關(guān)性。
(3)防治彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)給家兔注射內(nèi)毒素誘發(fā)DIC形成。與低分子肝素相比，靜脈注射r-TFIP可明顯糾正DIC所致的凝血功能異常和血栓形成的程度。
(4)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)后血栓再形成的防治損傷狗的左冠狀動(dòng)脈前降支內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)阻塞性冠脈血栓形成。應(yīng)用r-TFIP作為重組鏈激酶的附加用藥，能促進(jìn)冠脈再通，抑制血栓再形成，減少殘余血栓的重量，并呈劑量的依賴性。與低分子肝素相比，發(fā)生再通的時(shí)間較短，再灌注的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，且殘留的血栓重量較輕。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。所有這些變更和改進(jìn)均包括在所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
新型重組組織因子抑制肽1的核甘酸序列和氨基酸序列，序列中斜體部分即為突變部分。TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATro Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val GluGAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT GCC GCA GCT GCC ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAC TAC TGT TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg
新型重組組織因子抑制肽2的核甘酸序列和氨基酸序列，序列中斜體部分即為突變部分。TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATrp Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val GluGAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu lle Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT TCA GGA AAG AAA ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAT GCA TGC TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Ala Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg
權(quán)利要求
1.新型重組組織因子抑制肽，其特征在于改變組織因子的胞外區(qū)C-末端的結(jié)構(gòu)域，重組特異性地競(jìng)爭(zhēng)抑制TF活性、抑制外源性凝血途徑、具有抗凝與抗栓的作用的組織因子抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型重組組織因子抑制肽，其特征在于重組組織因子抑制肽保留了TF胞外區(qū)1-218氨基酸殘基中與凝血因子VII(VIIa)結(jié)合的部位，其中參與激活凝血因子X(jué)和IX的部位被突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的新型重組組織因子抑制肽，其特征在于所述的重組組織因子抑制肽為重組組織因子抑制肽1和新型重組組織因子抑制肽2，
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型重組組織因子抑制肽，其特征在于所述的突變位點(diǎn)為重組組織因子抑制肽1將163位的絲氨酸、164位的甘氨酸、165位的賴氨酸和166賴氨酸被分別替換為丙氨酸，重組組織因子抑制肽2中185的酪氨酸被替換為丙氨酸。
5.一種制備新型重組組織因子抑制肽的方法，其特征在于采用下列步驟(1)分析全長(zhǎng)TF的結(jié)構(gòu)及其生化特性，設(shè)計(jì)新型重組組織因子抑制肽分子結(jié)構(gòu)；(2)重組組織因子抑制肽基因與表達(dá)載體重組；(3)用上述重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)的宿主細(xì)胞；(4)發(fā)酵培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從中純化所需產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的載體不限于特定的表達(dá)載體，只要它能夠與所述cDNA基因重組，形成表達(dá)質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的載體為真核表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的載體為pLY-4。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)上述重組表達(dá)載體。
10.根據(jù)權(quán)利9所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌菌株JF1125。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，發(fā)酵參數(shù)為溫度30℃-32℃，氧容量控制在50±5％，pH＝6-7，攪拌速度與DO連動(dòng)，誘導(dǎo)溫度為40℃-42℃。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中重組組織因子抑制肽終產(chǎn)物為將發(fā)酵工程菌高壓勻漿泵破菌，包涵體溶解、復(fù)性和離子交換色譜法純化而獲得。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的重組組織因子抑制肽在制備防治血栓性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型具有抗凝和抗栓活性的重組組織因子抑制肽及其制備方法。本發(fā)明根據(jù)對(duì)全長(zhǎng)組織因子的結(jié)構(gòu)及其生化特性的分析，設(shè)計(jì)了新型重組組織因子抑制肽結(jié)構(gòu)。將突變后組織因子抑制肽基因與原核表達(dá)載體pLY－4重組，轉(zhuǎn)化蛋白酶缺陷型大腸桿菌，篩選高表達(dá)工程菌。工程菌發(fā)酵，高壓破菌，包涵體溶解、復(fù)性和純化而獲得重組組織因子抑制肽。所得產(chǎn)品具有抗凝和抗栓活性，對(duì)于預(yù)防血栓性疾病的發(fā)生有明顯的作用。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1440981SQ0113212
公開(kāi)日2003年9月10日 申請(qǐng)日期2001年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月6日
發(fā)明者宋后燕, 于敏 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)