專利名稱：重組可溶性組織因子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組可溶性組織因子及其制備方法。本發(fā)明還涉及用重組可溶性組織因子制備成新型凝血酶原時(shí)間檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
組織因子(Tissue Factor，TF)是凝血因子VII(VIIa)的受體和催化協(xié)同因子，TF與凝血因子VIIa形成二元復(fù)合物，可以激活凝血因子X(jué)和凝血因子IX，從而啟動(dòng)外源性凝血途徑。TF是唯一不存在于血液循環(huán)中的凝血因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)含量豐富，一旦血管壁損傷，便釋放入血液循環(huán)中，與凝血因子VII(因子VIIa)結(jié)合后共同啟動(dòng)凝血，發(fā)揮凝血和止血功能。
由于TF是外源性凝血途徑中唯一的外源因子，因此臨床檢驗(yàn)中通過(guò)加入TF啟動(dòng)凝血以判斷凝血功能，即凝血酶原時(shí)間(簡(jiǎn)稱PT)測(cè)定。PT測(cè)定廣泛應(yīng)用于口服抗凝治療的監(jiān)測(cè)、術(shù)前常規(guī)檢測(cè)、先天性凝血因子缺乏等疾病的診斷，還可以用于肝臟合成功能的評(píng)價(jià)。由于TF來(lái)源缺乏，臨床檢驗(yàn)中常用兔腦粉替代TF。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，本發(fā)明用基因工程生產(chǎn)重組TF，經(jīng)磷脂化后替代兔腦粉用于PT檢測(cè)，而且重組TF的應(yīng)用有利于PT試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化[TripodiA.，et al(1992)Thromb-Haemost.67(1)，41-45.]。
全長(zhǎng)TF是分子量為47kD的糖蛋白，由263個(gè)氨基酸組成；為跨膜受體蛋白質(zhì)，分子中有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，1-219殘基為胞外區(qū)，229-242殘基為疏水的跨膜區(qū)，243-263殘基為胞內(nèi)區(qū)。TF胞外區(qū)為可溶性TF，(簡(jiǎn)稱sTF)與因子VIIa高親和地結(jié)合，并作為因子VIIa的輔助因子，增強(qiáng)其對(duì)因子X(jué)轉(zhuǎn)化為.因子X(jué)a的酶解激活作用[Rehemetulla A.et a1.(1991)J.Biol.Chem.266(16)10294-10299.Stone M.J.，et al(1995)Biochem.J.310，605-614.]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組可溶性組織因子，即將組織因子C-末端缺失突變后，去除其跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)，只保留了胞外區(qū)編碼順序，得到具有與組織因子同樣活性的突變體，命名為重組可溶性組織因子(簡(jiǎn)稱r-sTF)。
本發(fā)明還提供置備r-sTF的方法，包括制備能表達(dá)具有生物活性的r-sTF cDNA基因；與表達(dá)載體重組；用該載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；以及純化r-sTF。本發(fā)明應(yīng)用基因工程方法對(duì)可溶性組織因子進(jìn)行生產(chǎn)，所得產(chǎn)品具有高效的促凝血功能，并且制備工藝簡(jiǎn)便、安全。本發(fā)明還提供了利用重組可溶性組織因子r-sTF與磷脂進(jìn)行磷脂化后，制備新型凝血酶原時(shí)間PT檢測(cè)試劑盒本發(fā)明中從胎盤組織中分離胎盤總RNA，并且用RT-PCR的方法克隆缺失突變的可溶性組織因子cDNA。獲得的cDNA與質(zhì)粒pUC19重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證cDNA基因。然后與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用原核表達(dá)載體，例如pLY-4等。
上述重組表達(dá)載體按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述基因。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌JF1125等。
本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于菌體中，勻漿機(jī)破菌后分離包涵體。包涵體溶解后，復(fù)性并分離和純化所需產(chǎn)品。
本發(fā)明采用所得r-sTF在Cd2+的存在下磷脂化后凍干，加Ca2+制成PT檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明中重組可溶性組織因子的磷脂化，并不限于某種磷脂或生物組織磷脂制劑，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了卵磷脂和磷脂酰絲氨酸。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 設(shè)計(jì)、制備r-sTF(1)克隆r-sTF基因、構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒r-sTF-pLY-4按照sTF的氨基酸順序，依照大腸桿菌偏好密碼子設(shè)計(jì)引物序列。采用RT-PCR的方法擴(kuò)增該基因并與pUC19重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，以相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶解鑒定，獲得特征性片斷，證實(shí)獲得陽(yáng)性克隆。核苷酸序列分析證實(shí)基因序列正確。然后將sTF基因切出，并與大腸桿菌表達(dá)載體pLY-4重組，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒r-sTF-pLY-4。質(zhì)粒r-sTF-pLY-4轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125，抽提質(zhì)粒并做相應(yīng)的酶切分析。質(zhì)粒片段與理論片段一致者為陽(yáng)性克隆。本發(fā)明所采用限制性內(nèi)切酶購(gòu)自BRL公司，大腸桿菌JM109、JF-1125，質(zhì)粒pUC19，pLY-4為本室保存。
(2)篩選高效表達(dá)r-sTF的菌株挑取上述陽(yáng)性克隆接種于5ml LBA培液中，30℃快速振搖(250RPM)，培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1∶50接種于5ml M9CA培液中，30℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)約3小時(shí)，使其測(cè)定光密度OD600達(dá)到1.00左右，留樣后將培養(yǎng)溫度升高至42℃，繼續(xù)振搖培養(yǎng)3小時(shí)，離心收集細(xì)菌。
誘導(dǎo)前后的細(xì)菌分別用1x上樣緩沖液懸浮后，沸水浴煮5分鐘，20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS掃描定純度、分子量。結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解液在相應(yīng)分子量處有一濃集的條帶，而誘導(dǎo)前的細(xì)菌裂解液沒(méi)有。經(jīng)掃描，目的蛋白約占菌體總蛋白的40％左右。以表達(dá)水平高的克隆為工程菌株。
誘導(dǎo)后的細(xì)菌，用超聲破菌并離心，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物是以非活性的包涵體的形式存在于菌體中。
用變性劑溶解包涵體，并稀釋后，表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)出TF活性。
上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進(jìn)行。
(3)發(fā)酵工程菌取上述篩選高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以5L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級(jí)潔凈度條件下劃LBA平板，30℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。從平板上挑取單菌落，同樣在100級(jí)潔凈度條件下接種于50ml LBA培養(yǎng)液中，30℃振搖培養(yǎng)8小時(shí)。此為一級(jí)種子液，再將一級(jí)種子液按1∶10接種于500ml LBA中，30℃振搖培養(yǎng)8小時(shí)，，此為二級(jí)種子液。種子菌按1∶10比例接種于4L M9CA培液中，調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)，溫度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并與攪拌連動(dòng)。繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，將培養(yǎng)溫度提高到42℃，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)，停止發(fā)酵，離心收集細(xì)菌。發(fā)酵工程菌的表達(dá)水平大于40％。
(4)破菌制備包涵體將發(fā)酵工程菌按濕重體積以1∶20的比例，用0.02M PB(pH 8.0)懸浮，高壓勻漿泵破菌，壓力保持在45-50MP，離心收集沉淀即為包涵體。用洗滌液洗滌包涵體。
(5)r-sTF復(fù)性。
洗滌后的包涵體用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的復(fù)性液，稀釋20倍。4℃攪拌復(fù)性過(guò)夜。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍體積的20mmol/LPB(pH 8.0，0.5M尿素)平衡，復(fù)性后的r-sTF離心后上清，直接上柱，上柱結(jié)束后，用20mmol/L PB(pH 8.0)繼續(xù)洗脫至基線，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH 8.0)線性梯度洗脫，收集有r-sTF活性組分，并進(jìn)行純度分析。
所有色譜操作均為常規(guī)操作。
(7)純度鑒定及分子量測(cè)定取純化樣品進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，Pharmacia InagemasterVDS掃描測(cè)定純度，所得產(chǎn)品純度95％以上。
5L發(fā)酵罐可生產(chǎn)r-sTF 2克，比活性大于5萬(wàn)單位/mg，純度大于95％。
實(shí)施例2 制備PT檢測(cè)試劑盒(1)r-sTF磷脂化取卵磷脂和磷脂酰絲氨酸溶于0.25％脫氧膽酸溶液中，濃度為5mg/ml，然后與100mM CdCl2和TBSA(0.05MTris，0.1MnaCl，0.1％BSA，pH7.5)按1∶10比例混合，配成磷脂化溶液。r-sTF溶液適當(dāng)稀釋后加入等體積的磷脂化液，使終濃度達(dá)到10萬(wàn)單位/ml。37℃保溫2小時(shí)后，按3萬(wàn)單位/每瓶分裝，凍干，-40℃保存。
(2)Ca2+溶液0.5ml 50mMCaCl2溶液/瓶。
(3)1瓶?jī)龈傻牧字痵TF與1瓶Ca2+溶液包裝成PT檢測(cè)試劑盒，每盒為30人份。
(4)PT檢測(cè)凍干的磷脂化TF 37℃ 1.5ml注射用水復(fù)溶，繼續(xù)保溫30分鐘以上，經(jīng)適當(dāng)稀釋后取50ul加入硅化過(guò)的玻璃試管內(nèi)，加入正常人血漿100ul，37℃保溫1分鐘，加入50ul 50mM CaCl2，測(cè)定凝血時(shí)間。
30人份正常人血漿測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明所生產(chǎn)的PT檢測(cè)試劑盒國(guó)際靈敏度指數(shù)(簡(jiǎn)稱ISI)值為1.07，而對(duì)照的兔腦粉ISI值為1.27。標(biāo)準(zhǔn)ISI值為1.00。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。所有這些變更和改進(jìn)均包括在所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
重組可溶性組織因子的核甘酸序列和氨基酸序列TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATrp Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
GAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT TCA GGA AAG AAA ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAC TAC TGT TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg
權(quán)利要求
1.一種重組可溶性組織因子r-sTF，其特征在于改變天然組織因子的結(jié)構(gòu)，保持TF的啟動(dòng)外源性凝血的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的r-sTF，其特征在于r-sTF保留天然TF的1-218氨基酸序列。
3.一種制備r-sTF的方法，其特征在于采用下列步驟(1)分析全長(zhǎng)TF的結(jié)構(gòu)及其生化特性，設(shè)計(jì)r-sTF分子結(jié)構(gòu)；(2)在表達(dá)的載體中克隆r-sTF基因；(3)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(4)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從培液中回收和純化所需產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的載體不限于特定的表達(dá)載體，只要它能夠與所述cDNA基因重組，形成表達(dá)質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的載體為原核表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的載體為pLY-4。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌JF1125。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中采用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，發(fā)酵參數(shù)為培養(yǎng)溫度30℃-32℃，誘導(dǎo)溫度40℃-42℃，氧容量控制在50±5％，pH＝6-7，攪拌速度與D0連動(dòng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中r-sTF是通過(guò)工程菌發(fā)酵后離心收集細(xì)菌，并經(jīng)破菌，包涵體溶解，復(fù)性和離子交換純化而獲得。
11.一種新型凝血酶原時(shí)間(PT)檢測(cè)試劑盒，其特征為將所述的r-sTF、磷脂和Cd2+混勻，凍干后與Ca2+制備成PT檢測(cè)試劑盒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的PT檢測(cè)試劑盒，其中所述的磷脂不限于具體的磷脂或動(dòng)物組織磷脂混合物，只要能和r-sTF組合后促進(jìn)凝血。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的PT檢測(cè)試劑盒，其中所述的磷脂是卵磷脂和磷脂酰絲氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13中所述的方法，其中所述的卵磷脂和磷脂酰絲氨酸的比例為7∶3。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中r-sTF與磷脂并不限于具體的比例，只要能達(dá)到合適的線性范圍。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組可溶性組織因子(r－sTF)及其制備方法，和采用.r－sTF與磷脂等制備成新型凝血酶原時(shí)間(PT)檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明根據(jù)對(duì)全長(zhǎng)組織因子的結(jié)構(gòu)及其生化特性的分析，設(shè)計(jì)了新型r－sTF。將突變后可溶性組織因子基因與原核表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選高表達(dá)工程菌，經(jīng)發(fā)酵擴(kuò)增，離心收集發(fā)酵工程菌后，勻漿泵破菌，離心收集包涵體，包涵體溶解，r－sTF復(fù)性后經(jīng)一步法純化r－sTF。所得產(chǎn)品與磷脂及Cd
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1496992SQ0113212
公開(kāi)日2004年5月19日 申請(qǐng)日期2001年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月6日
發(fā)明者宋后燕, 于敏, 王羽雄 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)