專利名稱：按植物偏愛(ài)密碼子合成降鈣素基因及其在植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種首次根據(jù)植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)人工合成的降鈣素(Calcitonin，CT)的核酸序列。本發(fā)明還涉及降鈣素在植物中的表達(dá)。
本發(fā)明中，我們用化學(xué)合成法，首次根據(jù)植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)了可以在植物中表達(dá)的具有生物活性的降鈣素及其編碼序列。
在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本專利申請(qǐng)中提及的在植物中表達(dá)的降鈣素編碼序列。
本發(fā)明的第二目的是提供一種在植物中表達(dá)的降鈣素。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述新的降鈣素的蛋白及核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種新的降鈣素和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種人工設(shè)計(jì)并合成的含有新的降鈣素基因的克隆載體pGEM-5zf-ct，該載體包括根據(jù)植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)的降鈣素的核酸序列，所述的核酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位DNA分子的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種在植物中表達(dá)的降鈣素，它包括具有SEQ IDNO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了幾種表達(dá)載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是煙草和番茄。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種在植物中產(chǎn)生和表達(dá)具有活性的降鈣素的方法，其步驟如下(1)將人工合成的編碼具有降鈣素活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成降鈣素蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列有至少85％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成降鈣素的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)降鈣素的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)再生重組細(xì)胞，獲得表達(dá)降鈣素的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.5中第18-113位的序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“降鈣素編碼序列”指編碼具有降鈣素活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中第18-113位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的編碼框第18-113位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所有與SEQ ID NO.5中第18-113位核苷酸序列同源性低至約85％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.6所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列的同源性至少85％，較佳地至少90％，更佳地至少95％，最佳地至少99％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的降鈣素相同功能的蛋白的SEQ ID NO.5中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“降鈣素”指具有降鈣素活性的SEQ ID NO.6序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與降鈣素在植物中表達(dá)相同功能的SEQ ID NO.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-20個(gè)，較佳地1-15個(gè)，更佳地1-10個(gè)，最佳地1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為15個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的在植物中偏愛(ài)的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)植物偏愛(ài)密碼子所表達(dá)的氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括在植物中的表達(dá)的降鈣素的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的降鈣素的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與降鈣素DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗降鈣素的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“降鈣素保守性變異多肽”是指與SEQ ID NO.6的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明還包括人工合成的在植物中表達(dá)的降鈣素或多肽的類似物。這些類似物與降鈣素的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其它已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的在植物中表達(dá)的降鈣素時(shí)，可以將降鈣素編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成降鈣素表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞、番茄細(xì)胞及其它植物細(xì)胞。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析降鈣素基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析降鈣素的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
降鈣素RNA的Nothern印跡分析和特異抗體的降鈣素Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實(shí)在生物樣本中降鈣素的表達(dá)。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有降鈣素核苷酸編碼序列的8-50個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在核苷酸序列的降鈣素方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于降鈣素核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
本發(fā)明的降鈣素核苷酸編碼序列通?？梢杂萌斯ず铣傻姆椒ǐ@得。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
表2為本發(fā)明的按植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)人工合成的降鈣素與人類降鈣素核苷酸序列(GenBank Accession No.14768192)的同源比較(GAP)表。相同的核苷酸在兩個(gè)序列之間用豎線符標(biāo)出。
表3為本發(fā)明的按植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)的降鈣素與人類降鈣素的氨基酸序列(GenBank Accession No.XP 030254.1)的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用用豎線符標(biāo)出。
實(shí)施例1，降鈣素基因的合成1.基因合成(gene synthesis)降鈣素基因由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)合成后連入pGEM-5zf載體。
2.酶切(restriction enzyme cutting)將含合成基因的質(zhì)粒載體用Bam H I及Sac I雙酶切，切下合成的降鈣素基因；3.連接(ligation)將切下的基因連入已經(jīng)用Bam H I及Sac I切好的質(zhì)粒pBI121和改造的pCAMBIA2301植物表達(dá)載體大片段中，用藍(lán)白篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌陽(yáng)性克隆。
4.基因的PCR檢測(cè)以以下序列為引物，用合成的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR檢測(cè)CTF1GCGGGATCCATGTGCGGAAACCTTTCTACT(SEQ ID NO.1)CTR2GCGGAGCTCGTTATTATGGGGCTCCAACTC(SEQ ID NO.2)PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、54℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為124bp。
將基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體后用以下引物對(duì)所含基因進(jìn)行PCR檢測(cè)CTF12ATGTGCGGAAACCTTTCTACT(SEQ ID NO.3)CTR12CATCGCAAGACCGGCAACAG(SEQ ID NO.4)PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、56℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為190bp。
實(shí)施例2，降鈣素基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明的降鈣素基因的全長(zhǎng)為136bp(含接頭)，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.5，其中開(kāi)放讀框位于15-118位核苷酸。根據(jù)推導(dǎo)出的全長(zhǎng)降鈣素的氨基酸序列，共33個(gè)氨基酸殘基，分子量為8272.36 pI為5.42。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.6。
將按植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)合成的降鈣素全長(zhǎng)序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人類降鈣素基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與人類降鈣素基因的全編碼序列(GenBank Accession No.14768192)有82.29％的相同性(見(jiàn)表2)，在氨基酸水平上，它與人類降鈣素(GenBank Accession No.XP 030254.1)的第85-116位氨基酸殘基有100％的相似性(見(jiàn)表3)。由上可見(jiàn)，在植物中表達(dá)的降鈣素與人類降鈣素基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
實(shí)施例3，降鈣素在煙草和番茄細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)含目的基因(降鈣素基因)表達(dá)載體的構(gòu)建將含降鈣素基因的中間載體PGEM-5zf進(jìn)一步克隆到植物雙元表達(dá)載體(如pBI121、pCAMBIA2301)中，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(如EHA105)中，利用葉盤(pán)法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草和番茄。
利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草1.用無(wú)菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽(yáng)性菌落，接種于2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長(zhǎng)兩周左右的煙草的無(wú)菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見(jiàn)方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無(wú)菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時(shí)；7.將葉片轉(zhuǎn)到含卡那霉素(Kan)的篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見(jiàn)抗性愈傷組織的形成；8.約20天后可見(jiàn)分化芽長(zhǎng)出，待芽長(zhǎng)大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)化番茄1.將番茄種子滅菌后播于1/2MS培養(yǎng)基上，約10天左右長(zhǎng)出子葉；2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)過(guò)夜，OD為0.8-1.5，室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，加入子葉浸泡10分鐘；4.在無(wú)菌濾紙上吸干菌液；將子葉放在MS1培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)兩天；
5.將葉片轉(zhuǎn)到含Kan的愈傷和分化培養(yǎng)基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見(jiàn)抗性愈傷組織的形成和植株再生；6.待芽長(zhǎng)大后約1-2厘米的時(shí)將幼芽移植在生根培養(yǎng)基中(1/2MS)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；7.根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化一周，用1％的MS澆灌，移入土中。
利用western blot檢測(cè)降鈣素在轉(zhuǎn)基因煙草和番茄植株中的表達(dá)1.蛋白的提取a)取50mg葉片，加入100ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml離心管中研磨；b)13000，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過(guò)程于冰上進(jìn)行。
2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1ml Bradford試劑，混勻后，分光光度計(jì)測(cè)OD595。
3.SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加樣前，將樣品置于含50mmol/L DTT的加樣緩沖液(2*加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.8 1ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；b)室溫100V電壓下聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部。
4.蛋白質(zhì)向硝酸纖維膜上轉(zhuǎn)移a)轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；b)室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移1h，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；5.膜上蛋白的檢測(cè)a)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動(dòng)、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml 1*PBS(含0.5g疊氮鈉))；b)再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；c)加入第一抗體(抗降鈣素的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌三次；d)加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌兩次；e)加入底物顯色觀察蛋白條帶。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1
GCGGGATCCATGTGCGGAAACCTTTCTACT(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2GCGGAGCTCGTTATTATGGGGCTCCAACTC(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.3ATGTGCGGAAACCTTTCTACT(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.4CATCGCAAGACCGGCAACAG(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度136bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.51 GGAATTCCGGATCCATGTGCGGAAACCTTTCTACTTGCATGCTTGGAACT51 TACACCCAAGACTTCAACAAGTTCCACACCTTCCCACAAACTGCTATTGG101 AGTTGGAGCCCCATAATAACGAGCTCCAAGCTTGGG(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.61 CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP32表218 tgcggtaatctgagtacttgcatgctgggcacatacacgcaggacttcaa 288 tgcggaaacctttctacttgcatgcttggaacttacacccaagacttcaa68 caagtttcacacgttcccccaaactgcaattggggttggagcacct 338 caagttccacaccttcccacaaactgctattggagttggagccccaPercent Identity 82.29％ in nt overlap上列本發(fā)明的按植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)的降鈣素的核酸序列下列人類的降鈣素的核酸序列(GenBank Accession No.14768192))表3p1 CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 32 h85 CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 116plantct本發(fā)明的按植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)的降鈣素氨基酸序列humct人類降鈣素氨基酸序列(GenBank Accession No.XP 030254.1)
權(quán)利要求
1.一種人工合成的DNA分子，其特征在于，它包括根據(jù)植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)的編碼具有降鈣素活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列。
4.一種在植物中表達(dá)的降鈣素，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是在植物中表達(dá)的具有SEQ IDNO.6序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA序列。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于它是真核細(xì)胞。
8.一種在植物中產(chǎn)生和表達(dá)具有降鈣素活性的多肽的方法，特征在于其步驟如下(1)將人工合成的編碼具有降鈣素活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成降鈣素蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-113位的核苷酸序列有至少85％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成降鈣素蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)降鈣素的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)再生重組細(xì)胞，獲得表達(dá)降鈣素的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。
9.一種核酸分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
10.一種用于檢測(cè)樣品中是否存在降鈣素核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用權(quán)利要求9所述探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于降鈣素核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長(zhǎng)度為15～50個(gè)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種按植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)合成的編碼降鈣素的基因。涉及包含所說(shuō)基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體。該表達(dá)載體具有在普通植物中高效表達(dá)的特性。還涉及被所說(shuō)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及由所說(shuō)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的表達(dá)降鈣素的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。本發(fā)明還提供了在樣品中檢測(cè)降鈣素核酸序列和多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1412308SQ0113197
公開(kāi)日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2001年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者唐克軒, 龐永珍, 孫小芬, 趙凌俠, 左開(kāi)井, 趙秀云 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)