專利名稱：來源于稻的高表達型多肽鏈延長因子啟動子及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有用植物的育種，其中使用植物基因的啟動子。更詳細地說，涉及有用植物的育種，其中使用稻的多肽鏈延長因子β1(以下稱為OsEF1β1)基因的啟動子。
背景技術(shù)：
近年來，為了賦予植物所需的性質(zhì)，一般是在植物中導入所需的基因，使之表達。但是，這種表達在植物的生長和發(fā)育階段會發(fā)生變化，例如雖然在植物幼小時期進行表達，但是隨著不斷生長和發(fā)育，有時表達會減弱。因此，需要一種啟動子，其能夠穩(wěn)定地表達導入的基因，而與植物的生長和發(fā)育階段無關(guān)。
多肽鏈延長因子是與核糖體中的氨基酸聚合反應(yīng)有關(guān)的因子，在進行蛋白質(zhì)合成的細胞中進行表達。在Arabidopsis thaliana中構(gòu)筑使多肽鏈延長因子1β(eEF-1β)的啟動子區(qū)域和5’末端區(qū)域以及β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因融合的嵌合基因，使用其考察轉(zhuǎn)基因植物中該基因的表達(Gene，170，(1996)201-206)。發(fā)現(xiàn)該基因的第1內(nèi)含子必須高水平表達。該試驗表明Arabidopsis thaliana的eEF-1β的第1內(nèi)含子中可以存在增強子樣的元件。
關(guān)于稻的多肽鏈延長因子的研究，在FEBS Letters 311(1992)46-48；FEBS Letters 338(1994)103-106；以及Biochemica etBiophysica Acta 1442(1998)369-372中有報道。FEBS Letters 311(1992)46-48報道了編碼稻多肽鏈延長因子1β’(EF-1β’)的cDNA的克隆和分離，F(xiàn)EBS Letters 338(1994)103-106報道了編碼稻多肽鏈延長因子1β(EF-1β)的cDNA的克隆和分離，而且Biochemicaet Biophysica Acta 1442(1998)369-372報道了稻多肽鏈延長因子1β(EF-1β)形成的多基因家族的新型基因EF-1β2的分離和特征。但是，任何一篇文獻都僅僅與多肽延長因子家族的其它成員進行了序列比較，而沒有提到啟動子活性。
因此，如果能夠由稻的基因取得一種用于表達的啟動子，該啟動子與植物的生長和發(fā)育階段無關(guān)，持久，且活性高，能夠?qū)嶋H使用，那么將會對包括稻等作物在內(nèi)的有用植物的品種改良做出巨大貢獻。
發(fā)明公開本發(fā)明涉及利用基因工程學方法的植物育種，其目的在于提供一種強烈促進在植物組織中表達的植物基因啟動子，及含有該啟動子的表達載體，以及其利用方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)稻的多肽鏈延長因子基因(OsEF1β1)持久地顯示非常高的啟動子活性，基于這一發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種DNA，其具有在植物組織中使異種基因強烈表達的啟動子活性。該DNA是具有序列號1(圖2A～C)表示的序列或其一部分，且具有與序列號1的序列同等的啟動子活性的DNA。其中，序列號1表示的序列包括稻OsEF1β1結(jié)構(gòu)基因的5’上游區(qū)域、第1外顯子、第1內(nèi)含子和第2外顯子的一部分。在本發(fā)明的1種實施方式中，本發(fā)明的啟動子能夠在生長分裂組織中特異地促進異種基因的表達。在本發(fā)明的一種實施方式中，該DNA在嚴緊條件下，與具有序列號1記載的序列或其一部分的多核苷酸雜交。
本發(fā)明還提供一種用于在植物組織中使異種基因強烈表達的表達載體。該表達載體包括稻OsEF1β1基因啟動子，其具有序列號1表示的序列或其一部分，且具有與序列號1的序列同等的啟動子活性，而且該表達載體還包括與該啟動子能夠表達地連結(jié)的異種基因。本發(fā)明還提供通過上述表達載體進行性狀轉(zhuǎn)化得到的植物細胞(可以是單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞)、由該植物細胞再生的植物體、該植物體的后代及傳播體、以及由該后代得到的種子。
本發(fā)明還提供在植物中導入希望在植物組織中表達的異種基因的方法。該方法包括下述步驟用上述表達載體使植物細胞進行性狀轉(zhuǎn)化的步驟，以及使進行了這種性狀轉(zhuǎn)化的植物細胞進行再分化，得到植物體的步驟。在上述方法中，植物細胞可以是單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞中任意一種。


圖1表示λOsEF1β1插入片段的限制圖。
圖2A～C是表示OsEF1β1的5’末端區(qū)域的序列的圖。圖中，“n”表示A、T、C或G。圖中，大寫字母對應(yīng)的堿基表示外顯子部位(1671位～1876位以及2639位～2651位)。
圖3是表示OsEF1β1GUS融合構(gòu)建物的模式圖。
圖4是表示本發(fā)明的性狀轉(zhuǎn)化植物以及用含有35S啟動子作為啟動子的載體進行性狀轉(zhuǎn)化得到的對照植物中各組織的GUS組織染色結(jié)果的照片。
發(fā)明的最佳實施方式以下更詳細地說明本發(fā)明。
(稻OsEF1β1基因啟動子的分離)稻OsEF1β1基因啟動子由稻的基因組文庫篩選得到。可以使用美國CLONTECH公司(CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)市售的稻基因組DNA文庫(Rice Genomic Library)。
作為篩選用的探針，可以使用本發(fā)明人分離得到的稻OsEF1β1cDNA。
首先，使大腸桿菌感染用噬菌體λ制作的稻基因組基因文庫，形成噬斑。按照常規(guī)方法將該噬斑移至硝酸纖維素等的膜上，用標記后的篩選用探針進行雜交。雜交結(jié)束后，洗滌，進行放射自顯影，由確認雜交的噬菌體制備DNA。
組合適當?shù)南拗泼笇χ苽涞氖删wDNA進行消化，通過凝膠電泳分離其消化產(chǎn)物。將分離的DNA片段移至尼龍薄膜上，使之雜交上述篩選用探針，根據(jù)信號強度和譜帶圖案的差異進行篩選。
認為信號最強的無性系含有OsEF1β1基因，信號弱的無性系含有的基因與OsEF1β1類似，但不是OsEF1β1。另外，通過譜帶圖案的比較，能夠識別缺失部分基因的無性系。而且，通過制作以譜帶圖案為基礎(chǔ)的各種無性系的物理地圖，可以確定推測構(gòu)成啟動子的結(jié)構(gòu)基因5’上游的長度為約1.6Kbp左右的無性系。
如上所述，分離得到完全的OsEF1β1基因組基因。
通過比較OsEF1β1基因組基因的堿基序列和OsEF1β1 cDNA的堿基序列，可以確定啟動子區(qū)域。作為啟動子序列，基因組基因具有內(nèi)含子時，不僅可以含有結(jié)構(gòu)基因的5’上游區(qū)域，也可以含有第1內(nèi)含子等區(qū)域。本啟動子序列優(yōu)選序列號1表示的序列(也參照圖2A～C；序列號1和圖2表示的序列中，“n”表示腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞苷(C)中任意一種)。序列號表示的序列包括稻OsEF1β1結(jié)構(gòu)基因的5’上游、第1外顯子、第1內(nèi)含子和第2外顯子。
(通過GUS活性測定確定啟動子活性部分)如果能夠確定OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域，則可以切出其序列，連結(jié)到植物表達用載體中。為了評價連結(jié)的啟動子的活性，可以制作在該啟動子的下游連結(jié)了報道基因例如編碼適當酶的基因的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒引入到植物細胞中，測定、觀察基因的表達，例如酶活性。以植物作為宿主的場合，一般例如使用pBI101等質(zhì)粒，以β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的表達作為指標進行測定，在本說明書中，也可以適用通過GUS的表達進行測定的方法。
GUS活性采用例如植物細胞工學，第4卷，第4號，281～286頁(1992)，植物細胞工學，第5卷，第5號，407～413頁(1992)，Plant Mole.Biol.Reporter 5(4)387-405(1987)記載的順序進行測定，但測定方法并不限于此。簡單而言，將植物體的各組織或切片浸漬于含有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)、7％(v/v)甲醇以及50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)的組織化學基質(zhì)溶液中，接著以適合進行反應(yīng)的溫度和時間(例如引入CaMV啟動子等和GUS的融合基因時，37℃下30分鐘～4小時)進行溫育。為了防止褐變以及GUS惰化，可以添加二硫蘇糖醇(DTT)等還原劑。例如可以在剛剛切出后、(制作切片時)瓊脂包埋階段、切削的過程中或切片的減壓脫氣時添加2mM DTT。另外，5mM濃度的DTT可以在37℃的GUS反應(yīng)時添加。接著，添加乙醇使反應(yīng)停止，使之脫色，接著在顯微鏡或?qū)嶓w顯微鏡下觀察組織或切片。
使用OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域的各種缺失體，例如5’上游側(cè)起以各種長度缺失的OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域，與GUS基因融合得到的質(zhì)粒，測定啟動子活性，可以確定其活性所必須的部分等。用于確定這種活性部分的方法，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。因此，例如除去OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域中不需要的序列得到的具有與OsEF1β1基因的啟動子同等活性的序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
一旦確定了OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域及其活性部分，也能夠進一步改變其序列，提高啟動子活性，或者使表達的組織改變特異性。例如，對OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域或其活性部分部分改變而得到的具有與改變前同等活性的序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
具有序列號1(圖2A～C)的序列的啟動子區(qū)域在植物組織中強烈表達其活性。因此，在本說明書中，關(guān)于啟動子活性，“強烈”是指活性的強度至少與以前的啟動子(例如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、胭脂氨酸合成酶的啟動子等)相比，為同等倍數(shù)以上，優(yōu)選2倍以上，更優(yōu)選5倍以上，進一步優(yōu)選10倍以上的強度。這種強度可以通過GUS活性測定方法進行測定。
本發(fā)明的啟動子可以在植物的生長分裂組織中特異地促進異種基因的表達。在本說明書中，在生長分裂組織中“特異地”促進異種基因的表達是指在生長分裂組織中，與相同植物體的其它組織或器官的至少1種相比，更高地促進目的基因的表達。“生長分裂組織”是指細胞分裂旺盛，且蛋白質(zhì)合成高的任意組織。通過本發(fā)明的啟動子，異種基因在例如莖頂端、根端部等生長點組織中強烈表達。通常，植物的最上部的分裂組織在某一期間內(nèi)形成莖和葉，莖伸長，且葉展開。最下部的分裂組織，其一生僅僅是形成根。利用本發(fā)明啟動子的異種基因表達，特別是在分裂組織中能夠得以促進。這種表達特異性可以通過在與本說明書的下述實施例同樣的條件下制作性狀轉(zhuǎn)化植物進行評價。
本發(fā)明的植物啟動子也可以使異種穩(wěn)定地表達，其表達與植物的生長和發(fā)育階段無關(guān)。也就是說，在植物的整個營養(yǎng)生長期，均可使異種基因表達。這種表達的恒定性也可以通過在與本說明書的下述實施例同樣的條件下制作性狀轉(zhuǎn)化植物進行評價。
另外，在本說明書中，關(guān)于啟動子活性，“同等”是指活性的強度至少與作為基準的啟動子區(qū)域的活性強度程度相同，同時活性的特異性也至少與作為標準的啟動子區(qū)域的活性的特異性程度相同。需要注意的是，用語“同等”并不是要排除活性的強度和活性的特異性與作為基準的啟動子區(qū)域相比明顯高的場合。“具有與序列號1的序列同等的啟動子活性”是指，例如在與本說明書的下述實施例同樣的條件下使GUS基因在原生質(zhì)體中表達時，其GUS活性為序列號1的序列相關(guān)的GUS活性的約50％以上，優(yōu)選約70％以上，更優(yōu)選約90％以上。
本發(fā)明的范圍內(nèi)含有的序列可以含有與OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域或其活性部分在嚴緊條件下雜交的序列。本說明書中使用的“嚴緊的雜交條件”或“嚴緊性”是指低于對靶具有正確的或幾乎正確的互補性的靶序列以及探針的融解溫度(Tm)，約5℃～約20℃或25℃的條件。本說明書中使用的融解溫度是雙鏈核酸分子的群體半解離形成單鏈的溫度。計算核酸的Tm的方法是本領(lǐng)域公知的(例如，Berger和Kimmel(1987)METHODS IN ENZYMOLOGY，VOL.152GUIDE TOMOLECULAR CLONING TECHNIQUES，San DiegoAcademic Press，Inc.以及Sambrooks等，(1989)MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL，第2版，第1-3卷Cold Spring Harbor Laboratory，以后簡稱為“Sambrook”)(均在本說明書中作為參考援引)。如標準文獻說明的那樣，核酸存在于1M NaCl水溶液中時，Tm的簡單估算可以通過等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)計算。(例如，參照Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION(1985))。其它文獻包括Tm計算中考慮結(jié)構(gòu)和序列特征的更精細的計算。雜交體的融解溫度(進而與嚴緊雜交有關(guān)的條件)受探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組合物)及靶的性質(zhì)(溶液中存在的或固定后的DNA、RNA、堿基組合物)，以及鹽和其它成分的濃度(例如甲酰胺、葡聚糖硫酸酯、乙二醇的存在和不存在)等各種因子影響。這些因子的影響是眾所周知的，可以在本領(lǐng)域的標準文獻中查到。例如參照Sambrook(如上所述)和Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1997)。典型的是，嚴緊的雜交條件為pH7.0～8.3的低于約1.0M的鈉離子鹽濃度，優(yōu)選約0.01～1.0M的鈉離子的鹽濃度，而且對于短探針(例如10～50核苷酸)為至少約30℃的溫度，對于長探針(例如，超過50的核苷酸)為至少約60℃的溫度。如上所述，嚴緊的條件可以通過添加甲酰胺等去穩(wěn)定劑實現(xiàn)，這時可以采用更低的溫度。例如2個多核苷酸，當它們在嚴緊的雜交條件下能夠相互特異地進行雜交時，可以鑒定為具有實質(zhì)上的序列同一性。本說明書中使用的用語“實質(zhì)上的同一性”、“實質(zhì)上的序列同一性”或“實質(zhì)上的相似性”，在核酸的情況下，是指2個多核苷酸間的序列類似性的尺度。或者，實質(zhì)上的序列同一性可以記載為2個核苷酸(或多肽)序列間的百分同一性。2個序列在至少約60％相同時，優(yōu)選至少約70％相同時，或者至少約80％相同時，或者至少約90％相同時，或者至少約95％或98％～100％相同時，認為是實質(zhì)上相同。序列同一性的其它程度(例如低于“實質(zhì)上”的程度)，可以通過不同的嚴緊條件下的雜交賦予特征。序列(核苷酸或氨基酸)的百分同一性，典型地可以通過下述方法求得，即確定2個序列間的最適對比排列，然后對2個序列進行比較。例如在蛋白質(zhì)表達中使用的外因性轉(zhuǎn)錄物可以記載為具有與參照序列(例如對應(yīng)的內(nèi)因性序列)比較得到的同一性或相似性的特定百分比。序列的最適對比可以通過下述方法進行，即，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性對比算法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的用于相似性方法的檢索，這些算法的計算機實施(Wisconsin Cenetics Software Package，Cenetics ComputerGroup，575 Science Dr.、Madison、WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者使用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法進行檢驗。選擇通過各種方法得到的最優(yōu)的對比排列(即，同一性達到最高百分比)。典型的是，這些算法在“比較窗口”(通常為至少18個核苷酸的長度)內(nèi)對2個序列進行比較，鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域，因此能夠有小的添加或缺失(即，缺口)。添加或缺失典型地是相對于沒有添加或缺失的參照序列為序列的20％以下的長度。通常優(yōu)選參照特定的長度或區(qū)域，記載2個序列間的序列同一性(例如2個序列可以記載為在至少500個堿基對的長度范圍具有至少95％的同一性)。通常長度至少為約50、100、200、300、400或500個堿基對、氨基酸或其它殘基。序列同一性的百分比可以通過下述方法計算對于在比較的區(qū)域內(nèi)最適對比排列的2個序列進行比較的步驟；確定相同核酸堿基(例如A、T、C、G或U)生成兩個序列的位置數(shù)，得到吻合的位置數(shù)，接著與參照序列或比較區(qū)域的堿基總數(shù)比較，確定吻合的位置數(shù)(或百分比)的步驟。適于測定序列相似性的其它算法是BLAST算法，記載于Altschul(1990)J.Mol.Biol.215403-410；以及Shpaer(1996)Genomics 38179-191中。用于進行BLAST解析的軟件可以由面向公眾的NationalCenter for Biotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。這種算法包括在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字碼進行對比時，通過鑒定在是否吻合或滿足某些評價為陽性的閾值T的質(zhì)疑序列中長度W的短字碼，首先鑒定高值的序列對(HSP)。T是指相鄰的字碼值閾值(Altschul等，如上所述)。這些最初的相鄰字碼的標的(ヒット)作為用于開始用以找出包含它們的更長的HSP的檢索的核心。如果累積對比值增加，則編碼的標的沿各序列向兩方向擴張。各方向中編碼標的的擴張在下列情況下停止，即，當累積對比值距離其最大達到值為未知數(shù)X時；當累積值由于1個以上的負值殘基序列對比累積而成為0以下時；或者到達任一序列的端部時。BLAST算法的參數(shù)W、T和X由序列對比的靈敏度和速度決定。BLAST程序使用的默認值為，編碼長(W)為11、BLOSUM62計分矩陣(參照Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)的序列對比(B)為50、預(yù)測(E)為10、M＝5、N＝4以及雙鏈比較。用語BLAST是指，對兩序列間的相似性進行統(tǒng)計解析的BLAST算法?？蓞⒄誎arlin(1993)Proc.Natl.Acd.Sci.USA 905873-5787。由BLAST算法所提供的相似性的1個尺度為最小總概率(P(N))，其提供了偶然發(fā)生2個核酸序列或氨基酸序列間的吻合性的概率指標?；蛘撸鳛?個核酸序列相似的其它指標為，第1核酸編碼的多肽與第2核酸編碼的多肽的免疫交差反應(yīng)性。
(表達盒(カセット)和表達載體的構(gòu)建及其應(yīng)用)具有確認活性的OsEF1β1基因的啟動子區(qū)域或其活性部分的序列，可以被引入到適當?shù)闹参锉磉_載體中。
本發(fā)明中植物表達載體可以使用本領(lǐng)域人員所周知的基因重組技術(shù)制得。植物表達載體的構(gòu)建例如優(yōu)選使用pBI系的載體，但并不限于此。
“植物表達載體”為，調(diào)節(jié)基因表達的啟動子等的各種調(diào)節(jié)元件以在宿主細胞的細胞中可以工作的狀態(tài)被連接的核酸序列。優(yōu)選地，可以包括本發(fā)明的植物基因啟動子、終止子以及藥劑耐受性基因。表達載體的類型和所使用調(diào)節(jié)元件的種類可以根據(jù)宿主細胞而更換，這一點是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。本發(fā)明的植物表達載體還可以具有T-DNA區(qū)域。特別是在使用農(nóng)桿菌屬性狀轉(zhuǎn)化植物時，T-DNA區(qū)域可以提高基因的導入效率。該表達盒可以進一步包括對于所使用特定的宿主生物適宜的選擇標記基因。
“終止子”位于基因的編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域的下游，為與DNA被轉(zhuǎn)錄為mRNA時的轉(zhuǎn)錄終結(jié)和多A序列增加有關(guān)的序列。已知，終止子提供mRNA穩(wěn)定性并對基因的表達量有影響。作為終止子的例子可舉出CaMV35S終止子和胭脂氨酸合成基因的終止子(Tnos)，但并不限于此。
“藥劑耐受性基因”優(yōu)選為，容易選拔性狀轉(zhuǎn)化植物的基因?？梢詢?yōu)選使用，可賦予耐卡那霉素性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因和可賦予耐潮霉素性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等，但并不限于此。
待表達的異種基因在上述啟動子的3’下游例如多克隆位點被可表達地連接，生成表達載體。本申請說明書中的“異種基因”是指，OsEF1β1基因以外的稻或其它植物中的內(nèi)因性基因、或相對于植物的外來基因，其基因產(chǎn)物的表達理想為在植物、特別是細胞增殖旺盛的組織中的基因表達的任意基因。
使用由此而產(chǎn)生的表達載體，可以性狀轉(zhuǎn)化植物細胞。植物細胞的性狀轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意方法進行，如使用農(nóng)桿菌屬的方法、向原生質(zhì)體中電穿孔的方法等。植物細胞的原生質(zhì)體的制備例如可以按照Kyozuka等，Mol.Gen.Genet.206408-413(1987)中記載的方法進行。單子葉植物中優(yōu)選的、使用農(nóng)桿菌屬的性狀轉(zhuǎn)化方法可舉出由本發(fā)明者開發(fā)的PCT/JP/03920中記載的方法。這種方法即使對于單子葉植物也可快速且有效地得到性狀轉(zhuǎn)化體植物，不過用于植物性狀轉(zhuǎn)化的方法并不限于此。
性狀轉(zhuǎn)化后的植物細胞經(jīng)常規(guī)方法再分化，得到性狀轉(zhuǎn)化后的植物組織，進而可以成為植物體。在制備用于性狀轉(zhuǎn)化的表達載體時，OsEF1β1基因啟動子例如可被引入到在細菌和植物兩宿主中可表達的二元載體中。這種二元載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。例如，當使用包括農(nóng)桿菌屬的表達系在內(nèi)的pBI系等載體時，可以利用用微生物感染植物的系統(tǒng)。使用適當?shù)谋磉_載體，可以將目的異種基因?qū)氲桨ǖ镜葐巫尤~植物和煙草等雙子葉植物在內(nèi)的任意可性狀轉(zhuǎn)化的植物中。
所謂植物細胞可以為任意的植物細胞。植物細胞可以為培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)組織、培養(yǎng)器官或植物體的任一形態(tài)。優(yōu)選為培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)組織或培養(yǎng)器官，更優(yōu)選培養(yǎng)細胞。可用于本發(fā)明生產(chǎn)方法的植物種為可進行基因?qū)氲娜我庵参锓N。
可用于本發(fā)明生產(chǎn)方法的植物種的例子可舉出，茄科、稻科、油菜科、薔薇科、豆科、瓜科、紫蘇科、百合科、藜科、水芹科的植物。
茄科植物的例子可舉出，屬于Nicotiana、Solanum、Datura、Lycopersion、或Petunia的植物，例如包括煙草、茄子、馬鈴薯、西紅柿、辣椒、矮牽牛等。
稻科植物的例子可舉出，屬于Oryza、Hordenum、Secale、Scccharum、Echinochloa或Zea的植物，例如包括稻、大麥、黑麥、稗子、高梁、玉米等。
油菜科植物的例子可舉出，屬于Raphanus、Brassica、Arabidopsis、Wasabia或Capsella的植物，例如包括蘿卜、油菜、シロイヌナズナ、山 菜、薺菜等。
薔薇科植物的例子可舉出，屬于Orunus、Malus、Pynus、Fragaria或Rosa的植物，例如包括梅、桃、蘋果、梨、草莓、薔薇等。
豆科植物的例子可舉出，屬于Glycine、Vigna、Phaseolus、Pisum、Vicia、Arachis、Trifolium、Alphalfa或Medicago的植物，例如可包括大豆、小豆、菜豆、豌豆、蠶豆、花生、三葉草、苜蓿等。
瓜科植物的例子可舉出，屬于Luffa、Cucurbita或Cucumis的植物，例如包括絲瓜、南瓜、黃瓜、白蘭瓜等。
紫蘇科植物的例子可舉出，屬于Lavandula、Mentha或Perilla的植物，例如包括薰衣草、薄荷、紫蘇等。
百合科植物的例子可舉出，屬于Allium、Lilium或Tulipa的植物，例如包括蔥、蒜、百合、郁金香等。
藜科植物的例子可舉出，屬于Spinacia的植物，例如包括菠菜。
水芹科植物的例子可舉出，屬于Angelica、Daucus、Cryptotaenia或Apitum的植物，例如包括獨活、胡蘿卜、鴨兒芹、旱芹等。
本發(fā)明啟動子可作用的“植物”還包括可基因?qū)氲娜我庵参?。“植物”包括單子葉植物和雙子葉植物兩者。這些植物包括任意的有用植物，特別是作物植物、蔬菜植物和花卉植物。優(yōu)選，稻、玉米、高梁、大麥、小麥、黑麥、稗子、小米、龍須菜/馬鈴薯、蘿卜、大豆、豌豆、油菜子、菠菜、西紅柿、矮牽牛等，但并不限于此。本發(fā)明方法使用的最優(yōu)選植物為稻、特別是日本稻。
如上所述，OsEF1β1基因啟動子在植物組織中可以強烈地表達異種基因。使用性狀轉(zhuǎn)化體選拔用標記基因作為異種基因，由此更容易選拔性狀轉(zhuǎn)化植物體。例如，使用編碼毒性蛋白質(zhì)的異種基因作為異種基因，由此可控制攝食莖葉的害蟲等。使用抗病害性基因作為異種基因，由此可以得到耐病害性優(yōu)異的植物。利用在營養(yǎng)生長組織中的特異基因表達而制備任意的有用植物，也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明啟動子所表達的基因可舉出，被希望在細胞增殖旺盛的組織中基因表達的全部基因。
本發(fā)明的啟動子的作用除了性狀轉(zhuǎn)化植物當代外，還可遺傳給其后代植物。在性狀轉(zhuǎn)化當代植物和下一代植物、其傳播體(例如花粉)、和由其傳播體生成的種子中，本發(fā)明的啟動子都能發(fā)揮作用。向后代導入啟動子的遺傳，例如可以通過以該啟動子的序列作為探針的DNA分析或RNA分析來確定。
本發(fā)明提供，來自稻的基因、在植物組織(特別是生長分裂組織、細胞分裂旺盛的組織等)中比以往啟動子活性高的啟動子的使用。因此，本發(fā)明不僅可用于稻品種改良，還可用于其它各種植物的品種改良。
(實施例)以下舉出實施例，具體說明本發(fā)明。這些實施例并不是對本發(fā)明的限定。實施例中使用的材料、試劑等沒有特別的限制，可以從商業(yè)供應(yīng)源處獲得。
實施例1 稻OsEF1β1基因組基因的分離從基因組文庫中篩選為了分離稻EF啟動子，使用已知的cDNA序列(松本等、如前)合成1對引物，以由稻愈傷組織提取的mRNA作為模板進行RT-PCR，得到cDNA片段。同位素標記該PCR產(chǎn)物用作探針，對經(jīng)日本晴Sam3A部分分解而得的基因組文庫(EMBL3噬菌體載體)進行篩選。按常規(guī)方法用大腸桿菌(XLI Blue)感染噬菌體(EMBL3)。按常規(guī)方法將噬斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，使其與用32P標記的上述探針按常規(guī)方法雜交(Molecular Cloning、第2版、該公開內(nèi)容作為參考援引在本說明書中)。雜交結(jié)束后，洗滌，放射自顯影，由確認雜交的噬菌體制得DNA。
將適當?shù)南拗泼窼aII、EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI組合，對制得的噬菌體DNA進行消化，將消化物用瓊脂糖凝膠電泳分離。將分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，按常規(guī)方法與上述篩選用探針雜交。按常規(guī)方法對該膜進行放射自顯影，檢出與探針雜交的DNA片段。
根據(jù)信號強度和譜帶圖案的不同進行篩選。認為，信號最強的無性系含有OsEF1β1基因，信號弱的無性系含有與OsEF1β1相似但并非OsEF1β1的基因。此外，通過比較譜帶圖案，可以識別缺失部分基因的無性系。進而制作基于譜帶圖案的各無性系物理地圖，由此推斷構(gòu)成啟動子，得到結(jié)構(gòu)基因的5’-上游區(qū)域的長度為約1.6kbp左右的無性系λOsEF1β1。λOsEF1β1插入片段的限制地圖如圖1所示。由此可知，在λOsEF1β1插入片段中存在7個外顯子。
由詳細的DNA分析、部分堿基序列的解析、基于OsEF1β1 cDNA堿基序列的PCR解析等，得到含有對應(yīng)于OsEF1β1 cDNA的基因和其5’上游被判定為啟動子區(qū)域的由約1.6kbp構(gòu)成的序列的無性系λOsEF1β1。該序列如圖2A～C所示。
實施例2.具有OsEF1β1基因啟動子的表達載體的制備用作含有實施例1中所得OsEF1β1基因的5’末端區(qū)域的表達載體的序列為2，651bp。而且可知，從該序列的第1，671到第1，876存在第1外顯子，從第2，639到第2，651存在部分第2外顯子，以及在各外顯子之間存在第1內(nèi)含子(參照序列號1和圖2A～C)。
具有稻OsEF1β1基因啟動子的載體的制備如圖3所示。
作為含有稻OsEF1β1基因的5’非翻譯區(qū)域的片段，使用了由實施例1所得無性系λOsEF1β1(SalI(5’末端)和SmaI(3’末端))。該片段具有從克隆插入序列的第1到第2，651的序列，而且含有5’非翻譯序列、第1外顯子、第1內(nèi)含子和部分第2外顯子。為了確認OsEF1β1基因的啟動子功能，使用了植物細胞用表達載體pBI101(CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)。該載體依次具有胭脂氨酸合成酶啟動子(NOS-Pro)、用以賦予耐卡那霉素性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II編碼區(qū)域(NPTII(KON R))、胭脂氨酸合成酶的終止子(NOS-T)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)編碼區(qū)域和胭脂氨酸合成酶的終止子(NOS-T)。將上述片段連接在經(jīng)限制消化的上述表達載體上，制得含有與GUS報道基因的融合的pBI101-Hm3。該表達載體中，為了賦予耐潮霉素性，在GUS編碼區(qū)域的下游還可插入潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因(位于花椰菜花葉病毒35S(35S)和胭脂氨酸合成酶基因的終止子(Tnos)之間)。
實施例3.向稻種子中的性狀轉(zhuǎn)化將作為稻代表品種的日本晴的種子，除去谷殼后，在無損傷的狀態(tài)下，在70％乙醇中放置10秒后，水洗，然后在0.1％Tween20和2.5％次氯酸鈉(NaC10)的水溶液中放置30分鐘，由此殺菌。在水中充分洗滌后，將稻提供到下述無菌操作中。
(前培養(yǎng))將種子播種到含有2，4-D的N6D培養(yǎng)基(30g/l蔗糖、0.3g/l酪蛋白氨基酸、2.8g/l脯氨酸、2mg/l 2，4-D、4g/l脫乙酰吉蘭糖膠、pH5.8)，在27℃～32℃下保溫5天。期間種子發(fā)芽。
(植物表達用載體)用上述生成的pBI101-Hm3性狀轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌屬EHA101(Hood等、J.Bacteriol.，1681291-1301(1986))。EHA101為源自輔助質(zhì)粒的vir區(qū)域為強病原性的農(nóng)桿菌屬A281的菌。將農(nóng)桿菌屬在補充了潮霉素(50mg/l)的AB培養(yǎng)基(葡萄糖(5g/L)、K2HPO4(3g/L)、NaH2PO4·2H2O(1.3g/L)、NH4Cl(1g/L)、KCl(150mg/L)、CaCl2·2H2O(10mg/L)、F2SO4·7H2O(2.5mg/L)、pH7.2、bactoagar(1.5％)(3g/200ml)、1M MgSO4·7H2O(120μl/100ml))中在25℃下暗處培養(yǎng)2～3天。
(農(nóng)桿菌屬感染)使性狀轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌屬懸濁在添加了2μg/ml乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基(AA-1(×1000)1ml(MnSO4·4～6H2O(1000mg/100ml)、H3BO3(300mg/100ml)、ZnSO4·7H2O(200mg/100ml)、Na2MoO4·2H2O(25mg/100ml)、CuSO4·5H2O(2.5mg/100ml)、CoCl2·6H2O(2.5mg/100ml)、KI(75mg/100ml))、AA-2(×1000)1ml(CaCl2·2H2O(15.0g/100ml))、AA-3(×1000)1ml(MgSO4·7H2O(25g/100ml))、AA-4(×1000)1ml(Fe-EDTA(4.0g/100ml))、AA-5(×1000)1ml(NaH2PO4·2H2O(15.0g/100ml))、AA-6(×200)5ml(煙酸(20mg/100ml)、硫胺HCl(200mg/100ml)、維生素B6HCl(20mg/ml)、肌醇(2000mg/100ml))、從-Sol(×100)10ml(L-精氨酸(5300mg/300ml)、氨基乙酸(225mg/300ml))、AA-KCl(×50)20ml(KCl(3g/20ml))、酪蛋白氨基酸(500mg/L)、蔗糖(68.5g/L)、葡萄糖(36g/L)、L-谷酰胺(900mg/L)、L-天冬氨酸(300mg/L)、pH5.2)中。將前培養(yǎng)的上述種子在此懸濁液中浸漬90秒，然后移植到2N6-AS培養(yǎng)基(30g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.3g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l 2，4-D、10mg/l乙酰丁香酮、4g/l脫乙酰吉蘭糖膠、pH5.2)中。在暗黑條件下25℃保溫3天共存培養(yǎng)。
(除菌和選拔)共存培養(yǎng)結(jié)束后，使用含有500mg/l羧芐青霉素的N6D培養(yǎng)基，從種子中洗出農(nóng)桿菌。接著在以下條件下選拔性狀轉(zhuǎn)化的種子。
第一次選拔將種子放置在補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(50mg/l)的、含2mg/l的2，4-D的N6D培養(yǎng)基上，在30℃保溫7天。
第二次選拔將種子放置在補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(50mg/l)的、含2～4mg/l的2，4-D的N6D培養(yǎng)基上，再在30℃保溫7天。
(再分化)將選拔后的性狀轉(zhuǎn)化種子在以下條件下再分化。
第一次再分化將選拔后的種子放置在再分化培養(yǎng)基(補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(25mg/l)的MS培養(yǎng)基(30g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇、2g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l激動素、0.002mg/l NAA、4g/l脫乙酰吉蘭糖膠、pH5.8))上，在30℃保溫2周。
第二次再分化使用與第一次再分化中所用相同的再分化培養(yǎng)基，再在30℃保溫2周。
(裝盆)將再分化后的性狀轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(補充了潮霉素(25mg/l)的不含激素的MS培養(yǎng)基)上，確認根生長后裝盆。
實施例4 GUS染色的組織表達在用具有本發(fā)明稻OsEF1β1基因啟動子的載體性狀轉(zhuǎn)化的植物(播種后經(jīng)過約6周后的稻)的各植物組織中，為了討論由上述啟動子的基因表達，進行了GUS活性的組織化學分析。使用由含有以往用作植物表達用啟動子的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子的pBI121性狀轉(zhuǎn)化的植物作為對照，比較通過啟動子的基因表達。
為了討論植物組織中通過上述啟動子的基因表達，進行GUS活性的組織化學分析。這樣的組織化學分析使用植物細胞工學、第4卷、第4號、281～286頁記載的步驟實施。本方法以Jefferson等的方法(EMBO J 63901-3907(1987))為基礎(chǔ)，同時伴有Kosugi等的改良(Kosugi等，Plant Science 70133-140(1990))。簡單地，將切除了的切片包埋在5％(w/w)瓊脂中，然后使用微切片機將瓊脂塊切薄。將厚度為100～130μm的組織切片浸漬在含有1mM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)、7％(v/v)甲醇以及50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)的組織化學基質(zhì)溶液中，接著37℃下溫育2～24小時。在剛剛切出后、瓊脂包埋階段、切削的過程或切片的減壓脫氣時添加2mM DTT。另外，5mM濃度的DTT可以在37℃的GUS反應(yīng)時添加。接著，添加乙醇使反應(yīng)停止，使之脫色，接著在顯微鏡切片。
這些結(jié)果示于圖4中。左側(cè)表示使用本發(fā)明啟動子性狀轉(zhuǎn)化的植物的各種組織中的GUS活性，右側(cè)表示對照植物的各種組織中的GUS活性(從上開始依次為莖、葉、根)。圖3中，在莖、葉和根的任一中，本發(fā)明的性狀轉(zhuǎn)化植物都表現(xiàn)出比對照植物強烈的表達。本發(fā)明性狀轉(zhuǎn)化植物的GUS活性為對照植物的用35S啟動子表達的GUS活性的約5倍以上的差。還有，本發(fā)明的性狀轉(zhuǎn)化植物中，在靠近莖中心的部分(維管束區(qū)域)、葉的基部、根端部對有強烈表達。這些表明，本發(fā)明的啟動子特別在分裂組織有強烈表達。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的OsEF1β1基因啟動子可以強烈促進植物組織中基因的表達。因此，本發(fā)明對于通過植物的基因操作而對稻等植物進行品種改良是極為有用的。
序列表<110>獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所<120>來源于稻的高表達型多肽鏈延長因子啟動子及其使用方法<130>AR025PCT<160>1<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2651<212>DNA<213>稻<220>
<221>外顯子<222>(1671)..(1876)
<220>
<221>外顯子<222>(2639)..(2651)<220>
<223>n為A，T，C或G.
<400>Igtcgacaaat aaccatattt tactgttgat taccctgttg tcattattta ctgtaatttt 60attttaaaaa tggaggattt tcccatataa ctatataaac cgatgttcaa tgaccgaacg120aaaatgggaa aagtttcaaa aaggaaaaaa acttttcgcc ttcaaccggg cctaattcaa180aacagcccaa ctattttgcc tctgtttttt tacgtgattt ttcaaatgtt caatttcaaa240aaaaaaaggt caagttcaag cttgacatga attttgacct tgtttttaca tgcattttaa300aatggaaact gaagttcaaa acatagggga gaaagcaata gcctagcaaa caaaaccatt360ttccccctcc aattggacct aatttgaaac aacacccaat tgaaaatgga atatgtctac420tttgactccc ttaactagtg tcttaaccta atttgtatct ttaaaccgta atagcggata480ttttgacccc caactattaa aactggtgta atttgtctcc ctcaacggtt ttggaggact540gttcactatc atggagcata cgtggcggng ttgtaagcgt ctgtcgagga gtgatcctct600ctagcaggag atcgtgagac ccccctttcg tgagttcggc cggggaagaa gctcgcctct660agaaatcgcg tatccgtccc caaggctcct agctagctcg cacacaacca aattatacag720
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ttg gat ccg atc cga cgg ctg aga cca gcc aca caa acc ctc aat ata 1772Leu Asp Pro Ile Arg Arg Leu Arg Pro Ala Thr Gln Thr Leu Ash Ile20 25 30tat tcg ctc gcc ccc cgc tgc gtc tcg ccg ctc cta cac cgc gcc gtc 1820Tyr Ser Leu Ala Pro Arg Cys Val Ser Pro Leu Leu His Arg Ala Val35 40 45 50gcc agc agc cgc gcc gct gcc tct cct cct cct ccc ctc gcc gcc gat 1868Ala Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ser Pro Pro Pro Pro Leu Ala Ala Asp55 60 65cca atc cg gtaagcctgc cgccgaagct cccctcgtcc ttccccggat agttcgtcgc 1926Pro Ile Argctcgtcaggc atctcgccga tttggcgccg ttctgttgtt ctgtttggtg gagccgtgcg 1986cgagatttcc ggtgtttgtt gacctgttta gctctgatgg attcaccttg tgttagttag 2046ttttccgtcg aatggtgtgg cgattaggtt tggggggatt ggttcgtctg tgattttgta 2106gctagatttt ttgaaatcta gggtagtgtg agtggggaag ctgctggcct tagtggatac 2166atgctgttcg tggtctcctg gttcttgaaa tcatgatgag ttagtgctgt ttgaaccttg 2226aagcaaagtt ttaagttatt ggagttcctg tgcttagatt tgtatactat tagtgaagag 2286atgcatagct gtactgctgt agtggatata ggagtgttgt ttttgatttg ctggtgctct 2346tccatagcat ccggatgcgg tgttcaattg tgtagttgtt tatgtagttc aatgcactag 2406aagcttttat ttctgaatgc ctagttatta gttgggtatg aagtccaatg tgtgaaatgc 2466tgtcatgttt caacttttag ttaagatatg aaacttgaga aacaaatgaa aggtttagat 2526tcagtactga tgtacaactt aagtaacatc tatggttgta aattgtacca tgcattggtt 2586
attgtgaatt agctcttttg gttgattgaa acaattctct atgtgccaac ag g tca2642Ser70ctt tca gtc2651Leu Ser Val
權(quán)利要求
1.具有在植物中強烈表達異種基因的啟動子活性的DNA，其中，是具有序列號1所示的序列或其一部分的序列，且具有與序列號1的序列同等的啟動子活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中所述啟動子在植物的生長分裂組織中特異地促進所述異種基因的表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中在嚴緊條件下與所述序列號1所示序列或具有其一部分的序列雜交。
4.表達載體，其中含有權(quán)利要求1所述DNA以及與該DNA可表達地連接的異種基因。
5.由權(quán)利要求4所述表達載體性狀轉(zhuǎn)化的植物細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的植物細胞，其中所述植物細胞為單子葉植物細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的植物細胞，其中所述植物細胞為雙子葉植物細胞。
8.由權(quán)利要求5所述植物細胞再生得到的植物體。
9.權(quán)利要求8所述植物體的后代。
10.權(quán)利要求8所述植物體的傳播體。
11.由權(quán)利要求9所述的后代得到的種子。
12.將希望在植物中表達的異種基因?qū)胫参镏械姆椒?，其中包括用?quán)利要求3所述的表達載體性狀轉(zhuǎn)化植物細胞的步驟；和使該性狀轉(zhuǎn)化后的植物細胞再分化、得到植物體的步驟。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述植物細胞為單子葉植物細胞。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述植物細胞為雙子葉植物細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供具有在植物組織(特別是細胞增殖旺盛的組織)中強烈表達異種基因的啟動子活性的DNA。該DNA為序列號1所示序列或具有其一部分的序列，其具有與序列號1的序列同等的啟動子活性，為稻OsEF1β1基因啟動子。還提供包含與該啟動子可表達地連接的異種基因的表達載體。還提供由此表達載體性狀轉(zhuǎn)化的植物細胞、由此植物細胞再生的植物體、該植物體的后代和傳播體以及由其后代得到的種子。還提供使用表達載體將基因?qū)胫参镏械姆椒ā?br> 文檔編號A01H5/00GK1494595SQ0182310
公開日2004年5月5日 申請日期2001年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月27日
發(fā)明者田中宥司, 番保德, 萱野曉明, 松岡信, 坂本知昭, 明, 昭 申請人:獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所