專利名稱：低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽及其篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多肽生物技術(shù)領(lǐng)域。
低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factorl，HIF1)是由HIF1α和HIF1β(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，HIF1通過與靶基因的啟動子或增強子上的缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response elemet，HRE)結(jié)合而誘導(dǎo)靶基因的表達，調(diào)節(jié)機體對低氧水平的生理反應(yīng)。由于它的作用之廣泛而日益引起國內(nèi)外學(xué)者的注意，對它的研究也在不斷向縱深方向發(fā)展。迄今為止，已有數(shù)十個HIF1調(diào)節(jié)基因得到確定，其中包括參與脈管形成、能量代謝、紅細胞生成、細胞增殖與發(fā)育能力、血管重構(gòu)與血管收縮反應(yīng)的蛋白基因。大量的研究表明，HIF1通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(如EPO、VEGF、葡萄糖運載體等)，可以增強細胞或組織對于缺血缺氧的耐受性，促進梗死區(qū)內(nèi)血管新生，在心肌缺血、腦缺血再灌注等病理生理過程中起著預(yù)防和保護作用，尤其是在實驗動物經(jīng)過缺氧預(yù)處理后，可以誘導(dǎo)HIF1的表達并在隨后的腦缺血中對神經(jīng)元起到了保護作用。
噬菌體表面展示肽庫是將隨機序列肽表達在噬菌體表面，肽庫是大量某一長度短肽的集合，它包括了該長度短肽的各種可能序列或其中絕大部分序列，容量可達數(shù)十億。用相應(yīng)的配體分子對文庫噬菌體進行親和篩選，可得到與配體特異親和的噬菌體克隆，通過測定克隆噬菌體所編碼的氨基酸序列，可以確定與配體特異親和的配基氨基酸組成及其關(guān)鍵性氨基酸殘基。噬菌體展示描述的是一種體外的選擇技術(shù)。它是將編碼外源肽或蛋白質(zhì)的DNA插入噬菌體外殼蛋白基因pIII或pVIII區(qū)，使外源肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達于絲狀噬菌體的表面，并使它們保持良好的空間構(gòu)象。噬菌體展示技術(shù)將一個巨大的隨機肽序列庫與編碼每一個序列的DNA有機地聯(lián)結(jié)在一起，通過一個被稱為“淘篩”的體外選擇過程，各種靶分子的肽配基可以迅速得以確認(rèn)。經(jīng)3輪的淘篩之后，可以得到與配體特異親和的，表達有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體克隆，通過測定插入噬菌體的DNA序列，就可以明確所表達的外源物質(zhì)的氨基酸序列，同其它技術(shù)相比，噬菌體展示肽庫更易篩選到大量的克隆，應(yīng)用此項技術(shù)可以得到109個以上的不同展示序列。由于篩選到的噬菌體可以在E.coli內(nèi)繁殖，因此可以采用親和免疫的方法，通過多輪反復(fù)的篩選使肽庫中的與靶分子結(jié)合的噬菌體由劣勢轉(zhuǎn)為優(yōu)勢，最終得到與靶分子特異結(jié)合最緊密的序列，這一過程又被形象地稱為“富集”。
本發(fā)明的目的在于提供一種HIF1相關(guān)肽，是一種利用噬菌體展示肽庫和HIF1α單克隆抗體結(jié)合篩選的12肽，鑒于該肽為本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的能與HIF1α單克隆抗體特異結(jié)合的新的噬菌體展示肽，因此目前對該肽的認(rèn)識僅限于我們的研究。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種HIF1相關(guān)肽篩選方法。通過改變每輪篩選時的HIF1α單克隆抗體的稀釋度和TBST洗脫液中Tween-20的比例，使肽庫中的與靶分子結(jié)合的噬菌體由劣勢轉(zhuǎn)為優(yōu)勢，最終得到與靶分子特異結(jié)合緊密的序列。
本發(fā)明所述的HIF1相關(guān)肽具有如下的多肽序列Gly Pro His His Tyr Trp TyrHis Leu Arg Leu Pro。利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選HIF1相關(guān)肽的過程如下
將1∶50稀釋的HIF1α單克隆抗體包被ELISA板，第二天加入封閉液，用TBST沖洗后，加入噬菌體展示12肽庫，與HIF1α單克隆抗體結(jié)合，1小時后，傾去未結(jié)合的噬菌體。然后用含0.1％[v/v]Tween-20的TBST洗脫液輕輕震蕩洗脫結(jié)合的噬菌體，將此噬菌體洗脫液加入到E.coli ER2738培養(yǎng)液中進行擴增。第二輪篩選時，按1∶100稀釋抗HIF1α抗體包板，并將TBST洗脫液中Tween-20提高至0.5％[v/v]。第三輪篩選時，按1∶200稀釋抗HIF1α抗體包板，TBST洗脫液中Tween-20仍為0.5％[v/v]。
用M13空載體做陰性參照，取原肽庫、3輪篩選后的噬菌體各3μl點于硝酸纖維素膜(NC)上，用不同稀釋度的HIF1α抗體雜交，進行膜斑點印記(dot-ELISA)鑒定特異性結(jié)合的噬菌體，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過三輪篩選，噬菌體得到了有效的富集，第三輪噬菌體的回收率是第1輪的回收率的200倍。第三輪篩選的噬菌體擴增后隨機挑選的10個克隆進行膜斑點印記鑒定也出現(xiàn)深淺不同的陽性反應(yīng)。按M13 ssDNA抽提試劑盒的說明提取10個克隆的單鏈DNA，采用雙脫氧終止法測序。發(fā)現(xiàn)有4個克隆的序列完全相同，這4個克隆共有氨基酸序列為Gly Pro His His Tyr Trp Tyr His Leu Arg Leu Pro。
HIF1通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(如EPO、VEGF、葡萄糖運載體等)，在缺氧適應(yīng)和病理反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，是與新生血管形成、血流供應(yīng)、氧化和能量代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和表達有關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子。但是，HIF1為一含八百多個氨基酸的蛋白質(zhì)，用人工合成和重組的方法獲得都十分困難。而HIF1相關(guān)肽可模擬HIF1的作用，僅含十幾個氨基酸，因此，利用噬菌體表面展示肽庫技術(shù)篩選HIF1相關(guān)肽，對缺血缺氧性疾病的防治及其機理研究具有重要的意義，HIF1相關(guān)肽尚可以用于制備治療缺血缺氧性疾病的藥物。
四、具體實施方案(一)HIF1相關(guān)肽篩選1.材料噬菌體展示12肽庫(Ph.D.-12TMPhage Display Peptide Library Kit)，其受體菌為E.coli ER2738，肽庫的滴度為2.0×1013pfu/ml，隨機多樣性為2.7×109，測序引物為(-96 gIIIsequencing primer)5’-CC CTC ATA GTT AGC GTAACG-3’，均購自美國NEW ENGLAND Biolabs公司?？笻IF1α單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠IgG多克隆抗體購自Novus Biologicals，Inc.M13噬菌體單鏈DNA抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司。ELISA板為Nunc公司產(chǎn)品，硝酸纖維素膜為Hybond公司產(chǎn)品。D-37520型低溫離心機為Biofuge公司產(chǎn)品。2方法2.1親和篩選過程2.1.1包板將抗HIF1α單克隆抗體按1∶50溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)，取100μl包被ELISA板的一孔，4℃孵育過夜。2.1.2封閉第二天棄去包板液，加入150μl封閉液(0.1MNaHCO3，5mg/mlBSA)，37℃封閉1h。2.1.3噬菌體結(jié)合棄去封閉液，用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)迅速洗6次，將10μl原肽庫用TBS稀釋至100μl加入孔內(nèi)，室溫下震蕩作用60min。2.1.4傾去未結(jié)合的噬菌體，用TBST洗10次。用100μl洗脫液(0.2MGlycine-HCL[pH2.2]，1mg/ml BSA)室溫輕輕震蕩8min洗脫結(jié)合的噬菌體，吸出洗脫液于一個微量離心管中，用15μl中和緩沖液(1MTris-HCl，pH9.1)中和至中性。2.1.5擴增取1μl洗脫液測滴度。其余的洗脫液加入到20mlE.coli ER2738培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)4.5h。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至離心管，4℃離心10,000rpm×10min，吸取80％的上清液于干凈的離心管，加入1/6體積的PEG/NaCl(20％[W/V]PEG-8000，2.5M NaCl)，4℃沉淀過夜。沉淀過夜后，4℃離心12,000rpm×15min，棄去上清液。用1ml TBS懸浮沉淀，轉(zhuǎn)移至一個微量離心管內(nèi)，4℃離心10,000rpm×5min沉淀殘余的細菌。將上清移至新的離心管，用1/6體積的PEG/NaCL冰上二次沉淀60min。40℃離心12,000rpm×15min棄上清。用100μl TBS懸起沉淀，測定擴增的噬菌體滴度。2.1.6第二輪篩選按1∶100稀釋抗HIF1α抗體包板，封閉后加入第一輪擴增后的噬菌體肽庫，將TBST中Tween-20提高至0.5％[v/v]進行第二輪篩選，其余步驟同第一輪篩選。2.1.7第三輪篩選按1∶200稀釋HIF1α抗體包板，封閉后加入第二輪擴增后的噬菌體肽庫，TBST中Tween-20仍為0.5％[v/v]，進行第三輪篩選和擴增。最后計算每一輪篩選后噬菌體的回收率。計算公式為回收率(％)＝(洗脫的噬菌體數(shù)/篩選時加入的噬菌體數(shù))×100％。2.1.8噬菌體克隆第三輪篩選的噬菌體擴增后，隨機挑選多個克隆，進行膜斑點印記(dot-ELISA)鑒定和DNA序列的測定。2.2噬菌體滴度的測定取每一輪洗脫下來的噬菌體依次稀釋，預(yù)熱3ml的頂瓊脂，加入IPTG和X-gal，取10μl的稀釋后的噬菌體加入到頂瓊脂中，快速鋪于LB平板上，反轉(zhuǎn)平板，37℃培養(yǎng)過夜。第二天取出平板，記數(shù)蘭色噬菌斑的數(shù)量。用相同的方法測定每一輪擴增后的噬菌體滴度。2.3膜斑點印記(dot-ELISA)鑒定特異性結(jié)合的噬菌體克隆用M13空載體做陰性參照，取擴增純化后滴度為2.0×1014pfu/ml原肽庫、3輪篩選后的噬菌體各3μl點于硝酸纖維素膜(NC)上。37℃放置10min使之干燥，用5％脫脂奶粉室溫封閉1小時。PBS洗膜10min×3次，用不同稀釋度的HIF1α抗體4℃雜交過夜。洗膜后，加入HRP標(biāo)記的抗鼠的IgG，室溫封閉1小時，PBS洗膜10min×3次，DAB顯色，觀察結(jié)果。另用隨即挑出10個克隆的噬菌體點膜，按上述的方法做dot-ELISA。2.4 DNA序列的測定取第三輪篩選洗脫下來的噬菌體鋪板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取10個蘭色噬菌斑，擴增純化，按M13 ssDNA抽提試劑盒的說明提取單鏈DNA，采用雙脫氧終止法測序。測序引物為(-96 gIIIsequencing primer)5’-CC CTC ATA GTTAGC GTA ACG-3’。3結(jié)果3.1親和篩選的結(jié)果在進行每一輪篩選時加入的噬菌體為1-2×1011pfu，3輪篩選依次提高HIF1α抗體的稀釋度，測定洗脫下來的噬菌體的滴度。從噬菌體的回收率來看，經(jīng)過3輪篩選，噬菌體得到了有效的富集，第3輪噬菌體的回收率是第1輪的回收率的200倍。3.2 dot-ELISA結(jié)果dot-ELISA結(jié)果顯示M13空載體和原肽庫未顯色呈陰性反應(yīng)，第1到第3輪篩選后的噬菌體陽性反應(yīng)逐輪增強，并且這種陽性反應(yīng)隨著HIF1α抗體的稀釋度的升高而減弱。結(jié)果還顯示出隨機挑選的10個克隆出現(xiàn)深淺不同的陽性反應(yīng)。3.3測序結(jié)果經(jīng)過3輪篩選后，挑選10個陽性克隆，進行測序，有4個克隆的序列完全相同，其它的6個克隆的序列為不相同的單獨序列，因此共獲得7個氨基酸序列，4個克隆共有氨基酸序列為Gly Pro His His Tyr Trp Tyr His Leu Arg LeuPro。(二)HIF1相關(guān)肽對HIF1下游基因mRNA和編碼蛋白表達的影響。1.HIF1相關(guān)肽對HIF1下游基因mRNA表達的影響。
采用RT-PCR技術(shù)，以β-actin作為內(nèi)參照來半定量檢測缺氧和氯化鈷處理不同時間后培養(yǎng)的神經(jīng)細胞、腫瘤細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、紅細胞生成素mRNA的表達水平，以及HIF1相關(guān)肽對缺氧和氯化鈷誘導(dǎo)的基因表達的影響。結(jié)果缺氧和氯化鈷處理后，VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、紅細胞生成素mRNA的表達逐漸增加，并隨著時間的延長而改變。HIF1相關(guān)肽可不同程度地改變?nèi)毖鹾吐然捳T導(dǎo)的VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、紅細胞生成素mRNA的表達。2.HIF1相關(guān)肽對HIF1下游基因編碼蛋白表達的影響。
采用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡，以熒光比值來表示VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、紅細胞生成素蛋白的表達，半定量分析缺氧和氯化鈷處理不同時間對體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞、腫瘤細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、紅細胞生成素蛋白表達的誘導(dǎo)作用，以及HIF1相關(guān)肽對缺氧和氯化鈷誘導(dǎo)的VEGF蛋白表達的影響。結(jié)果缺氧和氯化鈷處理后，VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、紅細胞生成素蛋白的表達逐漸增加，并隨著時間的延長而改變。HIF1相關(guān)肽可不同程度地改變?nèi)毖鹾吐然捳T導(dǎo)的VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、紅細胞生成素蛋白的表達。低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽氨基酸序列<110>南京醫(yī)科大學(xué)<120>低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽及其篩選<160>1<210>1<211>12<212>PRT<213>噬菌體(M13 Phage)<400>1Gly Pro His His Tyr Trp Tyr His Leu Arg Leu Pro1 5 10
權(quán)利要求
1.一種低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽，其特征在于多肽序列為Gly Pro His His Tyr Trp Tyr HisLeu Arg Leu Pro。
2.一種低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽篩選方法，其特征在于將稀釋的低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體包被ELISA板，第二天加入封閉液，用TBST沖洗后，加入噬菌體展示12肽庫，與低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體結(jié)合，1小時后，傾去未結(jié)合的噬菌體。然后用含Tween-20的TBST洗脫液輕輕震蕩洗脫結(jié)合的噬菌體，將此噬菌體洗脫液加入到E.coli ER2738培養(yǎng)液中進行擴增。第二輪篩選和第三輪篩選時，改變低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體稀釋度和TBST洗脫液中Tween-20含量，以富集與配體特異親和的噬菌體。第三輪篩選的噬菌體擴增后隨機挑選的多個克隆進行膜斑點印記鑒定和DNA測序，得到與低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體結(jié)合特異性強、親和力高的噬菌體多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽篩選方法，其特征在于第一輪篩選時，低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體的稀釋度為1∶50，TBST洗脫液中Tween-20的比例為0.1％(v/v)；第二輪篩選時，低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體的稀釋度為1∶100，TBST洗脫液中Tween-20的比例為0.5％(v/v)；第三輪篩選時，低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體的稀釋度為1∶200，TBST洗脫液中Tween-20的比例為0.5％(v/v)。
4.一種低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽的應(yīng)用，其特征在于低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽可以用于制備治療缺血缺氧性疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于多肽生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽，是一種利用噬菌體展示肽庫和低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體結(jié)合篩選的12肽。本發(fā)明還涉及到該12肽的篩選方法，通過改變每輪篩選時的低氧誘導(dǎo)因子1α單克隆抗體的稀釋度和TBST洗脫液中Tween－20的比例，使肽庫中的與靶分子結(jié)合的噬菌體由劣勢轉(zhuǎn)為優(yōu)勢，最終得到與靶分子特異結(jié)合緊密的序列。低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽可調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子1下游基因的表達，對缺血缺氧性疾病的防治及其機理研究具有重要的意義，低氧誘導(dǎo)因子1相關(guān)肽尚可以用于制備治療缺血缺氧性疾病的藥物。
文檔編號C07K7/08GK1398895SQ02138179
公開日2003年2月26日 申請日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者王斌, 張愛霞, 肖繼皋 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)