專利名稱：提高細胞催化活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將細胞作為催化劑使用，以產(chǎn)生標(biāo)的物的方法。更為詳細的是，把用低級醇處理的細胞作為催化劑使用，以產(chǎn)生標(biāo)的物的方法。
例如，許多已發(fā)表的研究結(jié)果表明，如用甲苯和乙醇的混合液(Serrano等，Eur.J.Biochem.34:479-482,1973)、溴化十六烷基三甲基銨(Gowda等，Enzyme.Micro.Technol,13:154-157,1991)、乙醚(Seip及Cosimo等，Biotechnol.Bioeng.40:638-642,1992)、醇類(Fenton等，Enzyme Micro.Technol.4:229-232,1982)、毛地黃皂苷(Joshi等，Enzyme Micro.Technol.11:439-444,1989)、Triton X-100(Vlach等，J.Mol.Catal.26:173-185,1984)及六甲撐二胺(Inoue等，Process Biochem.29:271-2751994)來處理酵母，就可以提高膜的通透性。
但是，上述這些有關(guān)通透性的研究，都是以確定細胞內(nèi)酶活性的位點為目的，而不是以工業(yè)化利用為目的(Felix等，同前)。
在另一方面，近年來，隨著基因重組技術(shù)的飛躍發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)出了優(yōu)良的基因表達系統(tǒng)。例如，Romanos等在Yeast,8:423-488(1992)中就報告了多種酵母菌的基因表達系。通過這些基因表達系統(tǒng)，可使細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的酶，并蓄積起來，使細胞本身變成了有效的催化劑。
另外，存在于細胞表層、外周胞質(zhì)或細胞膜中的酶，比如脂肪酶就存在于細胞表層，這些酶就可以直接利用，或通過基因操作使其表達，就能使細胞本身變成有效的催化劑。
不過，要想利用這些蓄積于細胞內(nèi)的酶，或存在于細胞表層、外周胞質(zhì)及細胞膜上的酶，就需要降低細胞壁或細胞膜的屏障。但是由于缺乏降低這種通透性屏障的有效方法，就需要一個將細胞破碎的過程。并且，這種方法存在例如為了防止酶失活而需要對溫度進行嚴格控制以及精制等步驟，操作復(fù)雜，成本高等缺點。
因此，人們迫切希望開發(fā)出一種不經(jīng)過細胞破碎過程、不需要酶提取及精制、操作簡單，成本低廉地提供酶催化劑的技術(shù)，也就是通過降低細胞的通透性屏障，把細胞本身直接作為催化劑使用的技術(shù)。
在優(yōu)選的實施方案中，上述細胞是用酵母或絲狀菌作為上述的處理細胞，并將這些細胞固定在載體上。
在優(yōu)選的實施方案中，上述低級醇選自甲醇、乙醇、丙醇及異丙醇。
在優(yōu)選的實施方案中，上述細胞是干燥細胞。
此外，在優(yōu)選的實施方案中，上述細胞是含有對低級醇具有耐受性的酶的細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，上述酶是乙二醛酶I(Glyoxalase Ⅰ)或脂肪酶。
在優(yōu)選的實施方案中，上述酶是用重組基因表達的酶。
本發(fā)明涉及用低級醇處理得到的細胞組成的催化劑，這種催化劑的反應(yīng)速度比未用低級醇處理的細胞組成的催化劑的反應(yīng)速度提高50倍或者更高。
在優(yōu)選的實施方案中，上述酶是用重組基因表達的酶。
本發(fā)明還涉及含有用低級醇處理細胞過程的、細胞的反應(yīng)速度比未處理時提高50倍或更高的方法。
本發(fā)明進一步涉及將細胞與基質(zhì)反應(yīng)，生成標(biāo)的物的方法。這種方法包括將用低級醇處理的、反應(yīng)速度比未處理細胞的反應(yīng)速度提高50倍或更高的細胞與對應(yīng)于酶的基質(zhì)進行反應(yīng)的步驟。
在優(yōu)選的實施方案中，上述細胞是酵母或絲狀菌，其中以固定在載體上為佳。
在優(yōu)選的實施方案中，上述細胞是含有耐低級醇處理的酶的細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，上述酶是乙二醛酶Ⅰ，上述目的產(chǎn)物是S-乳酰谷胱甘肽(S-lactoylglutathione)。
在優(yōu)選的實施方案中，上述酶是脂肪酶，上述的目的產(chǎn)物是脂肪酸酯。
在優(yōu)選實施方案中，上述乙二醛酶Ⅰ或脂肪酶是用重組基因表達的。
在優(yōu)選的實施方案中，上述細胞被固定于載體上，并填充在柱子中。
本發(fā)明還涉及含有經(jīng)低級醇處理所得細胞的傳感器，該經(jīng)處理的細胞的反應(yīng)速度比未用低級醇處理細胞的反應(yīng)速度高50倍或更高。
在優(yōu)選的實施方案中，上述細胞是酵母或絲狀菌。
本發(fā)明解決了上述各種問題。即，本發(fā)明通過用低級醇處理細胞，使細胞的反應(yīng)速度比未處理時至少提高50倍以上，可望時甚至達到200-600倍?？梢哉J為，這是由于細胞經(jīng)過低級醇處理后，降低了細胞壁或細胞膜的通透性屏障而帶來的結(jié)果。在本發(fā)明中，經(jīng)低級醇處理后的游離細胞可以作為催化劑直接使用。被固定的細胞經(jīng)低級醇處理后也可作為催化劑直接使用。用低級醇處理后的細胞或被固定的細胞可以在干燥后使用。于是，本發(fā)明提供了一種用非常簡單的方法即可制作、可反復(fù)使用的、具有優(yōu)良催化活性的細胞。
此外，本發(fā)明還提供了用低級醇處理的細胞作為催化劑，生產(chǎn)標(biāo)的物質(zhì)的方法。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案在本發(fā)明中使用的細胞包括大腸桿菌等革蘭氏陰性細菌、枯草菌等革蘭氏陽性細菌、絲狀菌、酵母等真核細胞、動物細胞、植物細胞等。特別是，作為基因重組等的宿主、用于物質(zhì)生產(chǎn)的大腸菌和酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)的釀酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、念珠菌屬的酵母(Candida antractica,Candida rugosa,Candidacylindracea)等優(yōu)選使用，但又不局限于這些。另外，還可以優(yōu)選使用根粘菌屬(Rhizomucor)、毛霉菌屬(Mucor)、曲霉菌屬(Aspergillus)、根霉菌屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)的絲狀菌。
本發(fā)明中用于處理細胞的低級醇優(yōu)選為碳原子數(shù)為1-11的水溶性醇?？梢允且粌r、二價或三價的醇，也可以用甲醇、乙醇等一級醇，異丙醇等二級醇、t-丁醇等三級醇。優(yōu)選使用的是甲醇、乙醇及異丙醇。這些醇可以單獨使用，也可以兩種以上聯(lián)合使用。
處理細胞時所用醇的濃度根據(jù)醇的種類不同各異，一般在10％-100％范圍內(nèi)。優(yōu)選的濃度范圍為20-100％，更優(yōu)選的濃度為40-80％，最優(yōu)選的濃度為40-60％。另外，醇濃度以v/v％表示。
醇處理時間只要在5分鐘以上，沒有特別限制。優(yōu)選的處理時間在10分鐘以上。根據(jù)醇的種類不同，處理時間可作相應(yīng)變化。跟酶種類也有關(guān)系，用甲醇、乙醇處理既使時間長一些，酶活性幾乎不受影響。但用異丙醇長時間處理時，酶活性有若干降低的傾向。
對醇處理的溫度沒有特別的限制，只要作為目的的酶不會失活的溫度即可。因此，對不耐熱的酶可用低溫處理，而對耐熱的酶例如脂肪酶則可用高溫處理。對超嗜熱的原始菌類可以在100℃以上進行處理。一般的處理溫度為4℃-40℃。
在本發(fā)明中，對低級醇處理具有耐受性的酶是指用甲醇、乙醇或丙醇處理時不會失活(不會失去活性)。這類酶有乙二醛酶Ⅰ、脂肪酶、磷脂酶等。
在本發(fā)明中，可以采用例如測定在單位時間內(nèi)生成物的生成量或基質(zhì)的減少量的方法等適當(dāng)?shù)臏y定系統(tǒng)來測定反應(yīng)速度。本發(fā)明中所稱的反應(yīng)速度相當(dāng)于酶學(xué)上的初速度。
本發(fā)明中，經(jīng)低級醇處理的細胞的死亡情況雖然也比較多，但是因為細胞內(nèi)的酶對低級酶處理有耐受性，既使用低級醇處理，酶也不會失活。另外，由于降低了細胞壁或細胞膜的通透性屏障，細胞本身可以作為催化劑反復(fù)使用。經(jīng)過上述處理后，細胞的反應(yīng)速度至少提高50倍，通常提高100倍以上。在用40-60％的低級醇處理這種優(yōu)選條件下，細胞活性可提高300-600倍以上。
考慮到要作為催化劑反復(fù)利用，細胞最好固定在載體上。最好是將細胞固定在載體上后在進行，必要時也可以經(jīng)過干燥。進行干燥時要使用不使酶失活的方法，如真空干燥法，冷凍干燥法等。
細胞的固定方法可以采用載體結(jié)合法，架橋法及包容法等已知方法。從操作上考慮，以載體結(jié)合法最為適合。載體結(jié)合法中又包括吸附于離子交換樹脂上的化學(xué)吸附法或物理吸附法。在本發(fā)明中，以使用多孔載體的物理吸附方法最為合適。因為物理吸附方法不需要特別的操作。僅僅將細胞和載體(如前述的多孔物質(zhì)或泡沫體)混合在一起加以培養(yǎng)，細胞就從載體的開口處進入，并附著于載體上。通過這一操作，細胞就固定在載體上。
本發(fā)明中所稱的“載體”，其意思是能夠使細胞固定的材料，優(yōu)選的是不溶于水或不溶于特定溶劑的物質(zhì)。本發(fā)明中所使用的載體原料優(yōu)選的有例如，聚乙烯醇、聚氨酯泡沫體、聚苯乙烯泡沫體、聚丙烯酰胺、聚乙烯縮甲醛樹脂多孔體、硅膠泡沫體、纖維素多孔物等泡沫體或樹脂。多孔體或泡沫體開口孔徑的大小也根據(jù)所固定的細胞的大小有所不同，只要具備細胞能充分進入并且增殖的空間即可。對大腸菌、枯草菌等細菌而言，其孔徑約為10μm-500μm；對絲狀菌、酵母、真菌及植物細胞而言，其孔徑約為50μm-1,000μm；對動物細胞而言其孔徑約為30μm-250μm為適合，但不限于此。
此外，對載體的形狀沒有特殊要求，但考慮到載體的強度，培養(yǎng)效率等因素，以球狀體或立方體為好。其尺寸，當(dāng)形狀為球狀時，以直徑2mm-50mm為宜；立方體狀時以2mm-50mm見方為宜。
如上所述，只要把菌體與載體混合在一起，菌體就被固定在載體上，然后直接用低級醇進行處理。
經(jīng)這樣處理后所得到的被固定細胞，可以以游離狀態(tài)用于反應(yīng)，也可以把它們填充到柱子里，制成所謂的生物反應(yīng)器來使用。它們可以連續(xù)地或分批地循環(huán)使用。
本發(fā)明的細胞(催化劑)不僅適用于醫(yī)藥品、食品等使用的蛋白質(zhì)(酶、抗體等)、氨基酸類的生產(chǎn)，也適用于環(huán)境污染物質(zhì)的除去等用途。此外，還適用于光學(xué)活性體的分離等。
本發(fā)明中，對有機溶劑具有耐受性的酶還可以用基因重組來表達。將目的基因?qū)爰毎?，使目的?蛋白質(zhì))表達的方法，是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。所謂目的基因的導(dǎo)入是指將基因?qū)爰毎麅?nèi)，并使其表達，而不論其采用的方法如何。對細菌、酵母、絲狀菌、真菌、植物及動物細胞可以用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染、電穿孔術(shù)等方法，通過質(zhì)粒形式，或插入宿主的基因中，或與宿主基因進行相同的重組等，這些方法意味著對遺傳特征進行表達。
用上述方法得到的重組細胞，能在菌體內(nèi)蓄積多量的目的酶(蛋白質(zhì))。因此，本發(fā)明方法通過降低細胞壁或細胞膜的通透性屏障，使基質(zhì)容易通透，從而能夠獲得使基質(zhì)與酶的接觸機會增多，酶反應(yīng)更快地進行的效果。
此外，本發(fā)明中的細胞或催化劑也可以作為傳感器使用。例如，利用細胞內(nèi)的氧化還原酶，可以測定BOD。作為傳感器，它包括氧電極，過氧化氫電極等轉(zhuǎn)導(dǎo)物。根據(jù)所使用的酶(催化劑)和要測定的物質(zhì)來確定用什么樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)物即可。因為已降低了細胞壁或細胞膜的通透性屏障，本發(fā)明的生物傳感器具有基質(zhì)通透性好、感度高、可以反復(fù)使用等優(yōu)點。
用本發(fā)明的細胞制備脂肪酶時，可以將細胞用低級醇處理，并將處理后的細胞作為催化劑，用于酯交換反應(yīng)。即，如本領(lǐng)域人員眾所周知的那樣，把脂肪酸的甘油酯(如甘油三酯)作為基質(zhì)，使其在低級醇的存在下與經(jīng)低級醇處理的細胞進行反應(yīng)，可以得到脂肪酸酯。而脂肪酸酯可以作為生物能源(biodiesel)使用。(實施例)以下，用酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為細胞，用乙二醛酶Ⅰ作為對低級醇處理具有耐受性的酶，介紹從丙酮醛(methylglyoxal)制備S-乳酰谷胱甘肽(以下有時略稱為S-LG)的過程，以及用絲狀菌Rhizopus oryzae作為細胞，用脂肪酶作為反應(yīng)酶，以制備脂肪酸酯為實施例對本發(fā)明進行說明。但是，不言而喻，本發(fā)明并不局限于這些實施例。
此外，如下所示，而乙二醛酶Ⅰ在從丙酮醛生成乳酸的反應(yīng)過程中，催化了從半硫縮醛(hemimercaptal)生成S-LG的反應(yīng)步驟(反應(yīng)步驟B)。并且，GSH表示谷胱甘肽。 丙酮醛 半硫縮醛S-乳酰谷胱甘肽(S-LG) 乳酸A反應(yīng)步驟為非酶反應(yīng)；B反應(yīng)步驟為乙二醛酶Ⅰ；C反應(yīng)步驟為乙二醛酶Ⅱ。
反應(yīng)生成物S-LG是具有多方面生理學(xué)功能的化合物(Gillespie等，Nature 227:135-136,1995；Kosugi等，Appl.Microbiol.Biotechnol,28:263-267,1988及Thornalley等，Biochem,Biophys.Res.Commum,145:769-774,1979)，為解析和利用其生理學(xué)功能，人們希望大量生產(chǎn)這種物質(zhì)。(酵母的調(diào)制例大量表達乙二醛酶Ⅰ的酵母的調(diào)制例)具有乙二醛酶Ⅰ基因的質(zhì)粒pE24GL01是由京都大學(xué)糧食科學(xué)研究所的木村光教授寄贈的。這一質(zhì)粒pE24GL01是象Inoue和Kimura等在J.Biol.Chem,271:25958-25965,(1996)中記載的那樣，將含有乙二醛酶Ⅰ基因(GL01基因)的可讀框的2500bp片段重組到多拷貝質(zhì)粒Yep24(Ura3)中的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒pE24GL01用醋酸鋰法導(dǎo)入到酵母Saccharomyces cerevisiae YPH250(trp-、leu-、lys-、ade-、ura3-52)中。轉(zhuǎn)化株是在分別含有40、60、30、40μg/ml的trp、leu、lys及ade的含SD基本培養(yǎng)基(葡萄糖20g/l,Difco酵母氮基w/o氨基酸6.7g/l)的瓊脂培養(yǎng)基中得到的生育株。
將得到的轉(zhuǎn)化株用上述組成的SD液體培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)16小時，然后用后述的細胞提取方法制備細胞提取液，對乙二醛酶Ⅰ的活性進行了測定。這種轉(zhuǎn)化體(重組酵母)與非轉(zhuǎn)化體相比較，菌體內(nèi)蓄積了大量的乙二醛酶Ⅰ。
此外，測定乙二醛酶Ⅰ活性的方法為將細胞提取液或處理后的酵母懸浮于含有50mM丙酮醛及50mM谷胱甘肽的100mM磷酸緩沖液(pH6.0)中，30℃振搖一定時間后，在240nm處測定吸光度，把摩爾吸光系數(shù)定在3300cm-1M-1，通過測定S-LG的生成量，求出乙二醛酶Ⅰ的活性。把單位時間內(nèi)，單位濕潤酵母重量的S-LG生成量(μmol/min/g-濕潤酵母)作為反應(yīng)速度。(實施例1及比較例1)(用低級醇及有機溶劑處理酵母)將以上述方法得到的酵母用SD基本培養(yǎng)基于30℃進行16小時預(yù)培養(yǎng)，然后移植到新鮮的SD培養(yǎng)基中，于30℃再次培養(yǎng)，當(dāng)OD610達到1.0時終止培養(yǎng)。以5000rpm，離心分離5分鐘，以回收酵母菌體。回收后的細胞沉淀用0.85％的NaCl溶液洗凈后，用于有機溶劑處理。
在濕重0.1g的酵母細胞沉淀中分別加入1.0ml的各種濃度的低級醇，如甲醇、乙醇及異丙醇，以及作為對照的丙酮、醋酸乙酯和乙醚，使酵母懸浮，在4℃或25℃進行所需要時間的有機溶劑處理。處理后，以5,000rpm，離心分離5分鐘，回收酵母菌體?；厥盏募毎恋碛?.85％的NaCl洗凈，作為酶(催化劑)備用。
另外，作為對照，在濕重0.1g的酵母細胞沉淀中加入1ml含有1％TritonX-100或80mM的六亞甲基二胺(HMDA)的350mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)，在4℃反應(yīng)10分鐘。處理后，以5000rpm，離心分離5分鐘，以回收經(jīng)處理的酵母菌體?；厥蘸蟮募毎恋碛?.85％的NaCl溶液洗凈，將其作為酶(催化劑)備用。
另外，作為比較，將經(jīng)上述方法培養(yǎng)并洗凈的重組酵母重新懸浮在pH7.0、100mM的磷酸鉀緩沖液中，加入玻璃珠，在渦旋勻漿機上勻漿30秒鐘及冰冷1分鐘，將該過程重復(fù)15次，將細胞破碎。然后在10,000g,4℃下將勻漿液離心分離20分鐘，將上清液用作細胞提取液。
另外，根據(jù)Inoue等在Appl.Microbiol.Biotechnol.36:569-472(1992)中介紹的方法，用醋酸乙酯制備了細胞提取液。具體過程是將上述培養(yǎng)、洗凈得到的0.1g重組酵母(濕重)再次懸浮于2ml的pH7.0、100mM磷酸鉀緩沖液中，再向其中添加2ml醋酸乙酯，于30℃保溫培養(yǎng)10小時后，以5,000rpm,4℃下離心分離5分鐘，把分離后的水相作為細胞提取液備用。(用處理的酵母產(chǎn)生S-LG)將所得到的處理酵母0.1g(濕重)或同量的細胞提取液懸浮于含有50mM甲基乙二醛(methylglyoxal)和50mM谷胱甘肽(GSH)的100mM磷酸緩沖液(pH6.0)中，于30℃振搖，用上述方法測定S-LG的生成量，求出其生成初速度。表1所示為25℃時，用各種濃度的低級醇，在各種時間處理后的結(jié)果。表中的ND表示未做試驗。表1

(25℃處理)表1結(jié)果顯示，經(jīng)低級醇處理后，細胞的反應(yīng)性(初速度)驚人地提高了200-550倍(即，細胞的通透性屏障變小，反應(yīng)容易進行)。低級醇的種類不同，對細胞的處理效果也不同。結(jié)果表明，用濃度40％以上的醇處理細胞10分鐘時，初速度提高200倍以上。從上述結(jié)果可以看出，即使在低級醇當(dāng)中，異丙醇能夠在比甲醇和乙醇更低的濃度降低細胞的通透性屏障。在用各種醇進行處理時，均具有處理時間越短效果越好的傾向。
試驗結(jié)果還表明，用乙醚、醋酸乙酯、丙酮處理時，也能象低級醇一樣提高酵母的反應(yīng)性。但是，從細胞中漏出蛋白質(zhì)是其一大問題。
表2表示在4℃條件下，用各種濃度的低級醇在各種時間處理細胞的結(jié)果。表2

(4℃處理)從表2可以看出，4℃處理的效果與25℃時的結(jié)果基本相同，但隨著醇的濃度升高，以低溫處理的效果為好，比25℃的效果要好。
并且，從上表還能看出，用Triton X-100處理及用80mM的六亞甲基二胺(HMDA)處理時，初速度增加10-15倍，而用低級醇處理的效果則要好得多(至少提高200倍以上)。
另外，用以玻璃珠將酵母破碎得到的細胞提取液以及用醋酸乙酯提取的酶分別顯示出無處理酵母的109倍、260倍的反應(yīng)初速度。但是，本發(fā)明的低級醇處理酵母的調(diào)制比這些酶提取液調(diào)制要容易的多，而且反應(yīng)速度也高。并且，還具有以下實施例2所示的可以重復(fù)使用的優(yōu)點。(實施例2)再次用實施例1中的在4℃條件下經(jīng)40％的甲醇、乙醇及丙醇10分鐘處理的酵母菌體，測定了S-LG的生成量。結(jié)果如

圖1所示。在圖中，a)表示用40％的甲醇、b)表示40％的乙醇、c)表示用40％的丙醇分別處理酵母的結(jié)果。0表示第2次使用、▲表示第3次使用、◇表示第4次使用。該結(jié)果表示，酶活性盡管有若干程度的下降，但是還可以反復(fù)使用。此結(jié)果還提示，在經(jīng)低級醇處理的酵母中還存在有酶，而且在催化反應(yīng)過程中，酶也很少漏到細胞外。(實施例3)在裝有100ml脂肪酶生產(chǎn)培養(yǎng)基(每升中含多肽胨70g、KH2PO41.0g、NaNO31.0g、MgSO4·7H2O 0.5g及油酸20g)的振蕩燒瓶中放入100個6mm見方的聚氨基甲酸酯的泡沫體(BSPs)作為固定用載體，然后植入根霉屬(Rhizopus oryzae)IFO 4697菌株，于30℃培養(yǎng)4天。在培養(yǎng)中菌體被固定于BSPs上。培養(yǎng)完畢后，回收固定有菌體的BSPs，然后用80％的醇、在25℃處理10分鐘。利用經(jīng)處理菌體的脂肪酶，并向其中添加按摩爾比1∶1混合的大豆油與甲醇的混合物，然后在30℃每分鐘振搖130次使其邊浸透邊反應(yīng)兩天，進行了脂肪酸酯的合成反應(yīng)。對所得脂肪酸酯的量，用DB-5毛細管柱子，以甘油三辛酸酯作為內(nèi)標(biāo)，用氣相色譜層析法定量進行了定量。并且，與用丙酮處理的BSPs菌體做比較，以未經(jīng)處理的BSPs菌體做對照。結(jié)果列于表3。表3

結(jié)果表明，對于絲狀體，用醇處理，特別是用異丙醇處理的效果最好，而未處理的幾乎沒有活性。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明用低級醇處理細胞，其操做簡便，而且比未處理的細胞活性提高數(shù)百倍，可作為能循環(huán)利用的催化劑來使用。換言之，細胞只經(jīng)過低級醇處理，就可使細胞中的對有機溶液劑具有耐受性的酶的反應(yīng)速度比未用低級醇處理的細胞的反應(yīng)速度提高600倍?？梢云诖氖?，通過降低細胞膜、細胞壁等的通透性屏障，保持在細胞內(nèi)、細胞表層以及細胞質(zhì)中的酶活性能夠得到飛躍的提高。
權(quán)利要求
1．一種用低級醇處理所得到的細胞，該被處理細胞的反應(yīng)速度比未用低級醇處理的細胞的反應(yīng)速度提高50倍或更高。
2．根據(jù)權(quán)利要求1中記載的細胞，其中所述細胞是酵母或絲狀菌。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2中記載的細胞，其中所述細胞被固定于載體上。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3任何一項中記載的細胞，其中所述低級醇選自甲醇、乙醇、丙醇及異丙醇。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4任何一項中記載的細胞，其中所述細胞經(jīng)過干燥。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至5任何一項中記載的細胞，其中所述細胞是含有對低級醇處理具有耐受性的酶的細胞。
7．根據(jù)權(quán)利要求6中所記載的細胞，其中所述酶是乙二醛酶I或脂肪酶。
8．根據(jù)權(quán)利要求6或7任何一項中記載的細胞，其中所述酶是用重組基因表達的酶。
9．一種用低級醇處理所到細胞組成的催化劑，該催化劑的反應(yīng)速度比未用該低級醇處理所的細胞組成的催化劑的反應(yīng)速度高50倍或更高。
10．根據(jù)權(quán)利要求9中記載的催化劑，其中所述細胞酵母或絲狀菌。
11．一種包括用低級醇處理細胞步驟的、使細胞的反應(yīng)速度比未用處理時提高50倍或者更高的方法。
12．一種使細胞與基質(zhì)反應(yīng)，生成標(biāo)的物質(zhì)的方法，該方法包括將用低級醇處理的細胞的反應(yīng)速度比未處理細胞的反應(yīng)速度提高50倍或更高的細胞與對應(yīng)于酶的基質(zhì)進行反應(yīng)的步驟。
13．根據(jù)權(quán)利要求12中記載的方法，其中所述酶乙二醛Ⅰ，所述標(biāo)的物質(zhì)是S-乳酰谷胱甘肽。
14．根據(jù)權(quán)利要求12中記載的方法，其中所述酶是脂肪酶，所述標(biāo)的物質(zhì)是脂肪酸酯。
15．根據(jù)權(quán)利要求13或14記載的方法，其中所述酶是用重組基因表達的酶。
16．根據(jù)權(quán)利要求13至15任何一項所記載的方法，其中所述細胞固定在載體上，并填充于柱子中。
全文摘要
提供一種通過用低級醇處理細胞,該經(jīng)處理的細胞的反應(yīng)速度比未經(jīng)處理的細胞的反應(yīng)速度提高350－600倍。換言之,僅通過將細胞用低級醇處理這一簡單操作,就能提供一種比通常的細胞提取液的活性高、可重復(fù)利用的催化劑。
文檔編號C12N1/38GK1309697SQ99808788
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月21日
發(fā)明者福田秀村, 近藤昭彥 申請人:關(guān)西化學(xué)機械制作株式會社