專利名稱：利用全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)蔗糖-6-乙酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)r-6，-二氯-r-6，-二脫氧-p-呋喃果糖-4-氯-4-脫氧-吡喃半
乳糖苷(TGS)的新方法和新策略，包括使用全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)其中間體 蔗糖-f乙酸酯。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)方法生產(chǎn)4,1，,6，三氯半乳蔗糖(TGS)的策略主要包括通過(guò)使 用來(lái)自形成氯化6-0-保護(hù)的蔗糖的Vilsmeier-Haack試劑來(lái)氯化6-0-保護(hù)的蔗 糖以形成6-乙?；?4， r，6，-三氯半乳蔗糖，所述Vilsmder-Haack試劑使用諸 如三氯氧磷、草酰氯、五氯化磷等的不同氯化試劑和諸如二甲基甲酰胺
(DMF)的三級(jí)酰胺(tertiary amide)。所述氯化反應(yīng)后，使用適宜的鈣、 鈉等的堿性氫氧化物中和反應(yīng)物料至pH7.0 7.5。然后將已中和物料的pH 進(jìn)一步升至9.5或更高以使6-乙?；?4， r,6，-三氯半乳蔗糖去酰化/去乙?；?形成4,1，,6，三氯半乳蔗糖。
本發(fā)明涉及利用微生物的生物催化法制備用于生產(chǎn)氯化糖4， 1，,6，-三氯 半乳蔗糖的關(guān)鍵中間體，蔗糖-6-乙酸酯。
蔗糖-6-乙酸酯是上述生產(chǎn)TGS的方案中的關(guān)鍵中間體。Mufti等(1983) 在美國(guó)專利no. 4380476中報(bào)道了一種方法，其中蔗糖-6-乙酸酯是蔗糖在吡 啶中與乙酸酐在低于-2(TC的溫度下的乙?；磻?yīng)的一種主要產(chǎn)物。雜質(zhì)包括 其它單乙酰酯以及一些較高的乙酰酯。這一反應(yīng)取決于從其它物中以純的形 式分離并獲得的所需單乙酰酯，或者取決于氯化所有這些乙酰酯并想出從其 它氯化糖中分離TGS的方法。
需要一種生產(chǎn)方法，其將生產(chǎn)蔗糖-6-乙酸酯而不形成其它單乙酰酯或較 高乙酰酯以便盡可能簡(jiǎn)便地分離并純化TGS。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了一種方法，其中獲得自能夠產(chǎn)生果糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物的
生物量(biomass)(包括全細(xì)胞量(whole cell mass))被用于催化來(lái)自果 糖基二糖的果糖部分轉(zhuǎn)移到受體單糖或受體單糖衍生物以產(chǎn)生果糖基二糖或 果糖基二糖的衍生物。
本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式涉及利用微生物的生物催化法制備用于生產(chǎn) 氯化糖4， r,6，-三氯半乳蔗糖的關(guān)鍵中間體，蔗糖-6-乙酸酯。這一實(shí)施方式 描述了利用/w/M"氾(de Bary) Arn全細(xì)胞，從葡萄糖-6-乙酸酯 或各自的6-O-保護(hù)的葡萄糖生物催化地制造蔗糖-6-乙酸酯和類似化合物的方 法。因此獲得的蔗糖-6-乙酸酯使用膜過(guò)濾從較高分子糖中被分離并可以被用 于制備鹵化的糖。
具體實(shí)施例方式
存在由多種微生物產(chǎn)生的不同類型的果糖基轉(zhuǎn)移酶。在Enzyme and Microbial Technology, 19, 107-117， 1996.中描述了不同來(lái)源的不同果糖基轉(zhuǎn)移
酶的作用。
已知果聚糖蔗糖酶(Levansucrase)(果糖基轉(zhuǎn)移酶類的一種代表酶)通 過(guò)重復(fù)的分開(kāi)蔗糖中葡萄糖-果糖的連接并轉(zhuǎn)移果糖至受體糖這一過(guò)程來(lái)催化 果聚糖(多聚果糖衍生物)的形成。因此，如果該受體糖是蔗糖自身，其建 立了高分子量果糖鏈。Hestrin和Avigad在Biochem丄69 (1958) pp. 388-398 的工作表明具有不同程度能力的一系列糖，作為良好的果糖受體與果聚糖生 成競(jìng)爭(zhēng)并抑制它。取代葡萄糖被發(fā)現(xiàn)是較差的受體。然而，當(dāng)果糖供體(即 蔗糖)與受體的比率很高，典型地在5: 1 10: 1，并且濃度很低時(shí)，顯示 了取代葡萄糖也可以作為受體。因此，Kunst等在Eur丄Biochem. 42, 611-620 (1974)中在使用D-葡萄糖6-磷酸酯作為受體與蔗糖中獲得成功，其使用了衍 生自Sac/〃w ^Zm'fe Marburg 168株系的突變體的酶。類似的專利no. GB2046757B公開(kāi)了使用各種醛糖起始原料作為受體與蔗糖或棉子糖，其中 使用的果聚糖蔗糖酶衍生自各種微生物，包括^c^om少c" v^cw^和 (ATCC 6051株系，艮卩the Marburg株系)。然而在本專利申請(qǐng)中，醛
糖通常是非衍生的糖并且所使用的供體和受體的摩爾比是1: 5，可能為了最小化鏈-形成反應(yīng)。
Rathbone等(1986)在美國(guó)專利no. 4617269中主張了制備6-衍生的蔗糖衍 生物的方法，其利用在蔗糖或棉子糖或水蘇糖存在時(shí)，將相應(yīng)的6-衍生的葡 萄糖或半乳糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，特定的限定是該方法使用的果糖基轉(zhuǎn)移 酶是從細(xì)菌中分離的。
在本發(fā)明中，微生物全細(xì)胞制備被成功地用于轉(zhuǎn)移來(lái)自蔗糖的果糖部分 至葡萄糖-6-酯以產(chǎn)生蔗糖-6-酯，所述微生物能夠合成果糖基轉(zhuǎn)移酶類的一種 或多種酶并且其全細(xì)胞應(yīng)該是通過(guò)一簡(jiǎn)單的分離方法(包括過(guò)濾、離心等 等)可從反應(yīng)混合物中分離。發(fā)現(xiàn)了即使用這些粗制品的轉(zhuǎn)變產(chǎn)率也非常 高，提高了該方法的經(jīng)濟(jì)性和便利性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，酵母 爿wwoZwwW/ww/ w〃w/ara (de Bary) Am.被用作生物催化劑以完成利用葡萄糖-6畫(huà) 乙酸酯與蔗糖反應(yīng)制備蔗糖-6-乙酸酯。然而，在本發(fā)明的方法中也可以使用 其它-一些與」weoZ^Www 表現(xiàn)出相同活性和功能的微生物，其包括
Jwreo6aw'c^m ; w〃w/ara的菌落特征是其在Malt Extract Agar中快速生 長(zhǎng)，顯得平滑，不久覆蓋粘的滲出物，奶油色或粉色，隨后大部分變成棕色 或黑色。
在作為受體的各種單糖、糖醇、垸基醇、糖苷、寡糖等等存在時(shí)，來(lái)自 微生物血w^咖W畫(huà)，//"/"m的酶作用于蔗糖以轉(zhuǎn)移果糖基團(tuán)至顯示非常廣 泛的受體特異性的受體分子。來(lái)自Aureobasidium pullulans的酶對(duì)分解蔗糖、 新科斯糖(neokestose)、木蔗糖(xylsucrose)、棉子糖和水蘇糖是有活性 的。全細(xì)胞反應(yīng)易受銀、汞、鋅、銅和錫離子的抑制作用的影響。
所述受體分子可以是下述任意D-阿拉伯糖，L-果糖，6-脫氧葡萄糖，6-0-甲基半乳糖，葡萄糖-6-乙酸酯，葡萄糖-6-丙酸酯，葡萄糖-6-月桂酸酯，蜜二糖, 半乳糖，木糖葡萄糖-6-磷酸酯，葡萄糖-6-戊二酸酯，乳糖，半乳糖-6-乙酸酯，甘 露糖，麥芽糖，l-硫代-葡萄糖，麥芽三糖(maltrotriose)，麥芽五糖,D-阿拉伯糖， 麥芽六糖，異麥芽糖，L-阿拉伯糖，核糖，來(lái)蘇糖，葡糖酸，L-鼠李糖,6-0-甲基葡萄糖，甲基a-D-葡糖苷，木糖醇，丙三醇等等。爿weokwWww jw〃w/fl/w (de Bary) Am.是一種微生物(酵母)，其產(chǎn)生果糖基轉(zhuǎn)移酶(SST)并在細(xì)胞內(nèi)以及細(xì) 胞外均被發(fā)現(xiàn)。來(lái)自」""okm'Ai^培養(yǎng)物的酶在果糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)中高度地位置 特異性。在本發(fā)明中，果糖基轉(zhuǎn)移酶生成^"^okwWwm培養(yǎng)物ATCCNo. 9348被用于通過(guò)蔗糖與6-0-乙酰基葡萄糖反應(yīng)進(jìn)行制備蔗糖-6-乙酸酯。通過(guò) 分子分離和色譜層析技術(shù)從蔗糖-6-乙酸酯中分離產(chǎn)生的其它更高分子的糖。果糖基轉(zhuǎn)移酶由v4wmoZ^/^/w /7"http://"/"^使用適宜的培養(yǎng)基深層發(fā)酵72h 產(chǎn)生。在本發(fā)明中，該酶并未從生物體分離，反而全細(xì)胞用于完成催化。在 本發(fā)明中，優(yōu)選利用離心從液體培養(yǎng)基中分離微生物細(xì)胞并用軟化水沖洗。 然而，可想到的是在達(dá)到產(chǎn)生足夠進(jìn)行轉(zhuǎn)果糖基反應(yīng)的生物量的臨界生長(zhǎng)階 段后，使用這些細(xì)胞和沒(méi)有分離的殘留的培養(yǎng)基自身，其作為溶解轉(zhuǎn)果糖基 反應(yīng)的供體以及受體的介質(zhì)，以及在反應(yīng)后的分離和純化的該反應(yīng)的產(chǎn)物被 剩下(over)。微生物細(xì)胞團(tuán)直接懸浮到含有蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯的緩沖液的反應(yīng)培 養(yǎng)基中。用于反應(yīng)的蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯的比率優(yōu)選2: 0.5。攪拌下保持 該反應(yīng)并且通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)蔗糖-6-乙酸酯的生成。向該反應(yīng)中加入適宜的添 加劑，包括但不限于轉(zhuǎn)化酶抑制劑，進(jìn)一步包括環(huán)己烯四醇-B-環(huán)氧化物 (Conduritol-B-epoxide)、萃他丁 (trestatin)等等，以避免可影響所需產(chǎn)物 生成的任何副反應(yīng)。 一旦獲得蔗糖-6-乙酸酯的合適的滴定值，即停止攪拌并 且過(guò)濾反應(yīng)混合物以分離微生物細(xì)胞。然后將含有蔗糖-6-乙酸酯和其它較高分子量糖的濾液進(jìn)行分子分離。在 此使用適宜的膜分離體系分離分子量大于500道爾頓。較低分子量糖被濃 縮。發(fā)現(xiàn)獲得的蔗糖-6-乙酸酯的純度是60%。在硅化硅膠上用水作為移動(dòng)相進(jìn)行色譜層析以進(jìn)一步純化。上面說(shuō)明的反應(yīng)可以通過(guò)維持蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯比率恒定以保持反應(yīng)向前進(jìn)行的方向而持續(xù)。從反應(yīng)中分離的微生物細(xì)胞根據(jù)酶活性也可以再 次被利用。也可以利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的全細(xì)胞固定化的諸多方法中的一種固定微 生物細(xì)胞團(tuán)。本文所使用的說(shuō)明性方法是采用geri, B., Sassi, G.， Specchia, V., Bosco, F.禾口 Marzona, M., /Vocew 1991, 21, 331—335。純化的蔗糖-6-乙酸酯用于氯化反應(yīng)以制備TGS。
下面描述的是實(shí)施例，其說(shuō)明了本發(fā)明的工作而不以任何方式限制本發(fā) 明的范圍。反應(yīng)物、使用的反應(yīng)物的比例、描述的反應(yīng)條件的范圍僅僅是說(shuō) 明性的并且范圍延伸至其類似的反應(yīng)物、反應(yīng)條件和類似通性的反應(yīng)。通 常，對(duì)氯化蔗糖生產(chǎn)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的任何等效替代被包括在本說(shuō)明 書(shū)的范圍內(nèi)。因此，提及乙酸酯包括了可以表現(xiàn)出相同功能的任何等效的酰 基基團(tuán)，而使用取代的葡萄糖將包括能夠在類似反應(yīng)條件下提供同種類似反 應(yīng)的任意取代的醛糖。實(shí)施方式的許多其它改變將被本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易 地預(yù)想并且它們也被包括在本說(shuō)明書(shū)的范圍內(nèi)。除非文中不允許，所提及的 單數(shù)也被認(rèn)為包括其復(fù)數(shù)形式，即，使用用于提取的"一種有機(jī)溶劑"包括使 用一種有機(jī)溶劑或連續(xù)使用多種有機(jī)溶劑或作為混合物組合使用多種有機(jī)溶 劑。
實(shí)施例1、用于生物催化的Aureobasidium細(xì)胞的生長(zhǎng)
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，獲得自ATCC No. 9348的Aureobasidium菌種的純培養(yǎng) 物通過(guò)從斜面接種一菌環(huán)的全部所述菌種在200ml的振蕩燒瓶中生長(zhǎng)。使用 "Maida"(印度制造的精制小麥)、大豆粉、酵母提取物、磷酸鹽和氯化物制 備由最佳水平的碳和氮源組成的培養(yǎng)物培養(yǎng)基。該培養(yǎng)物以200rpm在旋轉(zhuǎn)振 蕩器上生長(zhǎng)48h。
生長(zhǎng)良好的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到第二階段生長(zhǎng)培養(yǎng)物并繼續(xù)生長(zhǎng)120h。 120h后 獲得的培養(yǎng)液在8000rpm離心并且細(xì)胞被分離。用緩沖液沖洗該細(xì)胞兩次以 除去所有粘到細(xì)胞上的培養(yǎng)基組分。然后冷凍該細(xì)胞并冷凍干燥直到再次使 用。
實(shí)施例2、利用Aureobasidium細(xì)胞將葡萄糖-6-乙酸酯轉(zhuǎn)變成蔗糖-6-乙酸酯
取100g葡萄糖-6-乙酸酯和380g蔗糖用于反應(yīng)。將反應(yīng)物溶解在1.2L pH 6.5 7.0的乙酸鈉緩沖液中。保持?jǐn)嚢柙撊芤骸?50g冷凍干燥的 Aureobasidium細(xì)胞懸浮于該溶液中并且將溫度稍微升高至35°C。將0.25g萃 他丁加入到反應(yīng)物料中以抑制轉(zhuǎn)化酶活性。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)蔗糖-6-乙酸酯的形成。反應(yīng)時(shí)間為卯h后，在反應(yīng)混合 物中記錄到45g蔗糖-6-乙酸酯生成。該反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行直到120h并且所加入 的用于轉(zhuǎn)變的葡萄糖-6-乙酸酯的45%完成轉(zhuǎn)變。過(guò)濾反應(yīng)的內(nèi)含物以除去懸浮細(xì)胞然后利用反滲透分離進(jìn)行蔗糖-6-乙酸 酯的分離。RO膜分離所有較低分子量的化合物(例如葡萄糖和果糖)而較高 分子量的化合物被留下。然后被留下的化合物再一次用1: 5倍的水稀釋并以 500道爾頓分子量截流迸行納米過(guò)濾，并且收集滲出物，其主要是蔗糖-6-乙 酸酯和其它分子量在350 400道爾頓的化合物。這些化合物再次進(jìn)行RO過(guò) 濾以濃縮它們至濃度大于20%。在此蔗糖-6-乙酸酯的純度是大約85%并且然 后上樣到硅化的硅膠柱上。使用的移動(dòng)相是pH 9.0 9.5的乙酸鹽緩沖液并且純的蔗糖-6-乙酸酯流分 被分離并進(jìn)行進(jìn)一步濃縮和除水。徹底除水后，蔗糖-6-乙酸酯被加入到DMF 中并用于進(jìn)行氯化。分離的蔗糖-6-乙酸酯是90%純度的，被用于制備TGS。實(shí)施例3、利用固定在Eudragit RL 100 (丙烯酸樹(shù)脂的共聚物)上的 Anreobasidium細(xì)胞將葡萄糖-6-乙酸酯轉(zhuǎn)變成蔗糖-6-乙酸酯利用下述方法將Aureobasidium細(xì)胞固定在Eudragit RLIOO。通過(guò)混和將350g經(jīng)離心后分離的Aureobasidium細(xì)胞包埋到350g藻酸鈉中并壓成珠。然后將這些珠涂覆一種聚丙烯酸樹(shù)脂共聚物，Eudragit RL100。取100g葡萄糖-6-乙酸酯和380g蔗糖用于反應(yīng)。將反應(yīng)物溶解在1.2L pH 6.5 7.0的乙酸鈉緩沖液中。保持?jǐn)嚢柙撊芤?。?75g在Eudragit RL100 上固定化的Aureobasidium細(xì)胞加入到該溶液中并且將溫度稍微升高至 45。C。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)蔗糖-6-乙酸酯的形成。反應(yīng)時(shí)間為75h后，在反應(yīng)混合 物中記錄到52g蔗糖-6-乙酸酯生成。該反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行直到100h并且62g蔗 糖-6-乙酸酯完成轉(zhuǎn)變，這占起始蔗糖的32%。過(guò)濾反應(yīng)的內(nèi)含物以除去懸浮細(xì)胞然后利用反滲透分離進(jìn)行蔗糖-6-乙酸 酯的分離。RO膜分離所有較低分子量的化合物(例如葡萄糖和果糖)而較高分子量的化合物被留下。被留下的化合物然后再一次用1: 5倍的水稀釋并以
500道爾頓分子量截流進(jìn)行納米過(guò)濾，并且收集滲出物，其主要是蔗糖-6-乙 酸酯和其它分子量在350 400道爾頓的化合物。這些化合物再次進(jìn)行RO過(guò) 濾以濃縮它們至濃度大于20%。在此蔗糖-6-乙酸酯的純度是大約85%并且然 后上樣到硅化的硅膠柱上。
使用的移動(dòng)相是pH9.0 9.5的乙酸鹽緩沖液并且純的蔗糖-6-乙酸酯流分 被分離并進(jìn)行進(jìn)一步濃縮和除水。徹底除去水以后，蔗糖-6-乙酸酯被加入到 DMF中并用于進(jìn)行氯化。該分離的92%純度的蔗糖-6-乙酸酯用于制備 TGS。
實(shí)施例4、用Vilsmeier試劑氯化蔗糖-6-乙酸酯以產(chǎn)生TGS
在3L反應(yīng)燒瓶中，放置275ml 二甲基甲酰胺并冷卻到0 5。C。然后在 攪拌下緩慢加入158g五氯化磷以形成Vilsmeier試劑，保持該反應(yīng)物料的溫 度低于30。C。該物料進(jìn)一步冷卻至低于0°C并且在0 5°C緩慢加入實(shí)施例1 制備的蔗糖-6-乙酸酯。然后加熱反應(yīng)物料至80°C并保持lh，進(jìn)一步加熱至 100°C并保持6h以及最終至H0 115。C并保持2 3h。通過(guò)HPLC分析監(jiān)測(cè) 反應(yīng)進(jìn)程。
然后，將反應(yīng)混合物冷卻到-5 -8。C并且緩慢加入20%氫氧化鈉溶液以 便將物料的pH升到5.5 6.5。進(jìn)行這步以保持產(chǎn)物為乙酸酯形式，這有利于 所需產(chǎn)物分配到有機(jī)溶劑中。利用此方法獲得的產(chǎn)率是42.3%的蔗糖-6-乙酸 酯輸入。
實(shí)施例5、利用固定在Eudragit RL 100 (丙烯酸樹(shù)脂的共聚物)上的 Aureobasidium細(xì)胞將葡萄糖-6-苯甲酸酯轉(zhuǎn)變成蔗糖-6-苯甲酸酯
在pH6.5的乙酸鈉緩沖液中制備3%的葡萄糖-6-苯甲酸酯溶液 (600ml)。使用蠕動(dòng)泵將這一溶液泵到填充了 12g含有Aureobasidium細(xì)胞 的EudragitRL IOO的柱中(2cm直徑X8cm高)。從柱中的出口循環(huán)到供料 燒瓶。保持5ml/min的流速。將60g蔗糖加入供料燒瓶并且溶解以及保持恒 定的攪拌。反應(yīng)持續(xù)36h，周期性分析葡萄糖-6-苯甲酸酯到蔗糖-6-苯甲酸酯的轉(zhuǎn)變 以及其它雜質(zhì)的生成。在36h最后，形成1.2g蔗糖-6-苯甲酸酯并且停止該反 應(yīng)。在溶液中的葡萄糖-6-乙酸酯估計(jì)量被發(fā)現(xiàn)小于1%并且通過(guò)加入新鮮的 葡萄糖-6-乙酸酯其可以達(dá)到3%。將pH也調(diào)節(jié)到6.5并且繼續(xù)反應(yīng)。這再次 導(dǎo)致在72h最后轉(zhuǎn)變高達(dá)3.6g的蔗糖-6-苯甲酸酯。
權(quán)利要求
1、一種從果糖基二糖生產(chǎn)果糖基二糖或其衍生物的酯的方法，包括a、在果糖基轉(zhuǎn)移酶-生成微生物的生物量存在下，將所述果糖基二糖與醛糖的相應(yīng)酯或醛糖衍生物的相應(yīng)酯接觸以產(chǎn)生所述果糖基二糖或其衍生物的所述酯，和b、分離所述果糖基二糖或其衍生物的所述酯。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中a、 所述果糖基二糖衍生物包括一種或多種的酯，所述酯包括蔗糖-6-乙酸 酯、蔗糖-6-苯甲酸酯、6-0-甲基蔗糖、6-脫氧蔗糖、半乳蔗糖、木蔗糖(xylsucrose)、蔗糖-6-戊二酸酯、蔗糖-6-丙酸酯、蔗糖-6-月桂酸酯等，b、 所述果糖基二糖包括蔗糖、棉子糖或水蘇糖中的一種或多種，c、 所述醛糖的酯或醛糖衍生物的相應(yīng)酯包括葡萄糖、半乳糖、葡萄糖-6-乙酸酯、葡萄糖-6-苯甲酸酯、蔗糖-6-丁酸酯、蔗糖-6-戊二酸酯、蔗糖-6-月 桂酸酯、蔗糖-6-丙酸酯、蔗糖-6-苯甲酸酯等的一種或多種，d、 所述分離果糖基二糖通過(guò)分離和純化方法的一種或多種方法或其組合 完成，其包括過(guò)濾、反滲透、納米過(guò)濾、柱色譜層析等。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述微生物包括一種或多種果糖基轉(zhuǎn)禾多酶生成微生物，包括 v^eo6os7'血m戸〃w/ara， A/7erg77/ws 尸em'"'〃/畫(huà) ra w咖r賊5Vre/ tococcws 尸em'c/〃/ww )朋ceze薦械
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中制備」ra^Wop^ pw/Zw/ara的全細(xì) 胞生物量通過(guò)a、 從含有足夠促進(jìn)其快速生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中的純培養(yǎng)物重復(fù)再 培養(yǎng)，b、 利用一種或多種分離方法，優(yōu)選利用離心法從培養(yǎng)基分離細(xì)胞，c、 優(yōu)選沖洗細(xì)胞不含培養(yǎng)基，d、 照此或者精制后或者包括冷凍干燥的保存步驟后使用全細(xì)胞團(tuán)催化。Sac/j/iaram^yces, Bacf〃us swto7/5，五rwz'w/a
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中全細(xì)胞生物量或者以游離形式或者 固定在一種或多種固體載體上被使用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，用于制備6-0-保護(hù)的蔗糖-，優(yōu)選蔗糖-6-乙酸酯或蔗糖-6-苯甲酸酯，包括步驟a、 在冷凍干燥的、游離形式或固定化形式的Jw^^"W&ww 生 物量存在下，接觸蔗糖和6-0-保護(hù)的葡萄糖，優(yōu)選葡萄糖-6-乙酸酯或葡萄 糖-6-苯甲酸酯，進(jìn)一步優(yōu)選伴隨著振蕩，所述固定化形式利用固定的方法， 包括在由丙烯酸樹(shù)脂共聚物EudragitRL 100包覆的藻酸珠上固定，b、 利用分離的方法，優(yōu)選利用過(guò)濾除去游離的或固定的細(xì)胞生物量，和c、 將工藝液流進(jìn)行所生成的6-0-保護(hù)的蔗糖的分離。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，用于制備6-0-保護(hù)的蔗糖，優(yōu)選蔗糖-6-乙酸酯或蔗糖-6-苯甲酸酯，包括步驟a、 將固定在固體載體上的JMWokwW/wm pw〃"/ww生物量填充到柱中，和b、 重復(fù)通過(guò)蔗糖和6-0-保護(hù)的葡萄糖溶液以形成6-0-保護(hù)的蔗糖，和c、 從工藝液流分離6-0-保護(hù)的蔗糖。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，包括a、 將含有6-0-保護(hù)的蔗糖的所述工藝液流進(jìn)行反滲透以除去一種或多種 低分子量組分，包括葡萄糖、果糖等以得到含有6-0-保護(hù)的蔗糖和雜質(zhì)的保 留物，b、 將所述保留物在500道爾頓分子量截流下進(jìn)行納米過(guò)濾，優(yōu)選在稀釋 大約l: 5后，以得到主要含有6-0-保護(hù)的蔗糖的滲出物，c、 將所述含有6-0-保護(hù)的蔗糖的滲出物進(jìn)行反滲透以濃縮滲出物至大約 20%或更高濃度，和d、 將濃縮的滲出物利用柱色譜層析進(jìn)行進(jìn)一步純化和分離。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的柱色譜層析方法，其中所述濃縮的滲出物被a、 上樣到硅化硅膠柱，使用大約pH 9.0 9,5的堿性緩沖液，優(yōu)選乙酸 鹽緩沖液作為移動(dòng)相，和b、 分離蔗糖-6-乙酸酯作為純流分。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種方法，其使用全細(xì)胞制備的、固定化或未固定化的、能夠形成果糖基轉(zhuǎn)移酶類酶的微生物，包括Aureobasidium pullulans，以催化蔗糖和6-O-保護(hù)的葡萄糖之間的反應(yīng)以形成6-O-保護(hù)的蔗糖，其是合成三氯半乳蔗糖的中間體。從具有500道爾頓分子量的反應(yīng)的高分子量副產(chǎn)物中分離6-O-保護(hù)的蔗糖并且還利用反滲透以及進(jìn)一步利用柱色譜層析純化。
文檔編號(hào)C07H1/00GK101268090SQ200680034904
公開(kāi)日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日
發(fā)明者P·薩布拉曼亞姆, 拉克什·拉南, 森迪普·奧蘿拉 申請(qǐng)人:法馬德醫(yī)療保險(xiǎn)私人有限公司