專利名稱：用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，尤其涉及一種基于表皮角質細胞水平的用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法。
背景技術：
因為皮膚保濕功能是皮膚護理類化妝品和皮膚保健產品的最基本功能，人們一直在尋找能夠持水保濕/抗干燥的有效添加劑，因此建立方便快捷直觀的評價方法尤為重要。目前，國內外對保濕相關產品功效評價多采用人體測試，而對于保濕相關的活性添加劑的功效評價手段單一，報道較多的體外方法只有稱重法，即通過稱取重量、計算吸濕率和保濕率來評價添加劑的保濕性。MTT測定(噻唑藍測定)是一種檢測細胞活性的方法，是檢測細胞增殖方面常用手 段。其基本原理是活細胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT轉變?yōu)椴蝗艿淖仙w粒，后者的生成量與細胞數目和/或細胞活性呈正相關，用二甲亞砜(DMSO)溶解所，通過檢測光密度值變化，可間接反映細胞生長及增殖活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其特征在于，該方法包括以培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞、細胞同步化、細胞鋪板、加入藥物、干燥和噻唑藍(MTT)測定步驟，然后使用t檢驗和方差分析對實驗結果進行統(tǒng)計學處理，P < O. 05，表示差異顯著；所述干燥步驟按照如下方式進行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風速O. lm/s-1. Om/s、濕度為15% -50%和 20-30°C溫度下放置 5min-20min。本發(fā)明所使用的術語“細胞同步化”意指在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細胞處于不同的細胞周期時相之中。為了研究某一時相細胞的代謝、增殖、基因表達或凋亡，常需采取一些方法使細胞處于細胞周期的同一時相，這就是細胞同步化技術。本發(fā)明所使用的術語“細胞鋪板”意指將細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)板的過程。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述細胞為人表皮角質細胞。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基(低限基本培養(yǎng)基)或 RMPI-1640 培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute 培養(yǎng)基 1640)。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述藥物可以選自常見保濕劑如甘油、透明質酸鈉和中草藥提取物如銀耳多糖等。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，加入藥物后細胞孵育12h 48h。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述干燥步驟按照如下方式進行所述干燥步驟按照如下方式進行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風速O. 2m/s-0. 6m/s、濕度為20% -40%和20-30°C溫度下放置 6min-15min。根據本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案，所述干燥步驟按照如下方式進行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風速O. 3m/s、濕度為35%和27°C溫度下放置lOmin。
所述MTT測定步驟按照如下方式進行細胞以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT液，在5% C02、37°C下孵育4h后于570nm測定。所述MTT液的濃度可以為O. 5mg/ml，每孔加入量可以為500ul。本發(fā)明是基于表皮角質細胞水平的用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其操作方便、可重復，并可通過客觀的科學數據可以直觀的反映被篩選物質的保濕/抗干燥損傷功效。
具體實施例方式實施例I :甘油體外保濕/抗干燥損傷功效的評價I. I試驗材料細胞人表皮角質細胞株HaCat試劑MEM培養(yǎng)基、O. 25%胰酶、小牛血清、雙抗、PBS (磷酸緩沖液)、MTT材料及儀器24孔細胞培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標儀、濕度計I. 2試驗方法I. 2. I細胞培養(yǎng)人表皮角質細胞以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，當細胞生長至融合率 達80 %以上時，去除培養(yǎng)基，用PBS洗一次，然后加入O. 25%的胰酶消化，當細胞皺縮變圓時,傾去胰酶,加入含10%小牛血清的MEM輕輕吹打，收集細胞并離心，計數細胞，用MEM將細胞濃度調整至適當濃度接種至培養(yǎng)瓶中。待生長至融合率達80%以上時，進行下一次傳代。I. 2. 2細胞同步化細胞生長至融合率達80%以上時，加入不含小牛血清的MEM培養(yǎng)基作同步化處理12h。I. 2. 3細胞鋪板同步化后的細胞，O. 25%胰酶消化，收集細胞計數，調整細胞濃度，接種至24孔培養(yǎng)板，Iml細胞懸液每孔，5% C02，37°C培養(yǎng)過夜使貼壁。I. 2. 4 加藥待細胞貼壁，24h后加入對細胞增殖無明顯影響的O. 5%、1%和2. 5%濃度的甘油，分別設立正常對照組(不作干燥處理組)、空白對照組(干燥處理空白組)和加藥組，每組3個復孔，孵育24h。I. 2. 5干燥處理在25°C下，超凈臺內，干燥風速O. 3m/s-0. 5m/s，RH%= 45% ±5%，空白對照組和加藥組每孔依次吸去所有培養(yǎng)基，在超凈臺內放置IOmin 15min。I. 2. 6MTT 測定干燥處理后的細胞以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)正常培養(yǎng)24h后，每孔加Λ MTT it (O. 5mg/ml)500ul,5% C02，37°C孵育 4h 后轉至 96 孔板，570nm 測定。I. 2. 7實驗結果分析記錄下各孔抗干燥時間(T)，每組3個復孔取平均值，實驗結果應用統(tǒng)計軟件STATA 8. O分析，進行t檢驗、方差分析等統(tǒng)計學處理。P < O. 05，表示差異顯著；p < O. 01表示差異非常顯著。并按照以下公式計算出細胞干燥死亡率)和防護率(％ )。細胞干燥死亡率) = [1_(空白/藥品)OD值/正?？瞻譕D值]*100% ；防護率(％ )=[(空白組細胞干燥死亡率-藥品組細胞干燥死亡率)/空白組細胞干燥死亡率]*100%。結果如下
名稱__正常細胞組空白細胞組 2.5%甘油組 1%甘油組 0.5%甘油組
細胞干燥死一49.61%料 32.63%39.08%51.05%
亡率(％)_______
防護率(％) I —___ 34.23%** 21.23%* —_# :空白組相對于正常組，形成干燥損傷，P < O. 01，具有極顯著差異；** :相對于空白組，有極顯著性差異(P < O. 01)* :相對于空白組，有顯著性差異(P < O. 05)。實施例2 :透明質酸鈉體外保濕/抗干燥損傷功效的評價體外保濕/抗干燥損傷功效評價實驗按照實施例I方法進行，除了 I. 2. I的細胞培養(yǎng)步驟中以含10%小牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基代替含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基。選取O. 2%、0. 1%、0. 05%和O. 025%幾個對細胞增殖無明顯影響的濃度進行功效測定實驗。結果如下
名稱正常細空白細胞0.2%透明0.1%透明0.05%透明0.025%透 胞組組質酸鈉組質酸鈉組質酸鈉組明質酸鈉
_______M_
細胞干一50.85% 料 13.54% 22.03% 22.08% 36.38%
燥死亡
率(％)___________________
防護率一一 73.37%** 56.68%** 56.58%** 28.46%**(%)_____# :空白組相對于正常組，形成干燥損傷，P < O. 01，具有極顯著差異；** :相對于空白組，有極顯著性差異(P < O. 01)；* :相對于空白組，有顯著性差異(P < O. 05)。實施例3、銀耳多糖體外保濕/抗干燥損傷功效的評價體外保濕/抗干燥損傷功效評價實驗按照實施例I方法進行，除了1.2.5的干燥處理步驟在27 °C下進行。
選取2%、0. 5%、0. 2%和0. 05%幾個對細胞增殖無明顯影響的濃度進行功效測
定實驗。結果如下
權利要求
1.用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其特征在于，該方法包括以培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞、細胞同步化、細 胞鋪板、加入藥物、干燥和噻唑藍測定步驟，然后使用t檢驗和方差分析對實驗結果進行統(tǒng)計學處理，P < O. 05，表示差異顯著；所述干燥步驟按照如下方式進行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風速O. lm/s-1. Om/s、濕度為15% -50%和20-30°C溫度下放置5min_20mino
2.根據權利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述細胞為人表皮角質細胞。
3.根據權利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基或RMPI-1640 培養(yǎng)基。
4.根據權利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述藥物選自保濕劑或中草藥提取物。
5.根據權利要求4所述的體外評估方法，其特征在于，所述保濕劑為甘油或透明質酸鈉。
6.根據權利要求4所述的體外評估方法，其特征在于，所述中草藥提取物為銀耳多糖。
7.根據權利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，加入藥物后細胞孵育12h 48h。
8.根據權利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述干燥步驟按照如下方式進行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風速O. 2m/s-0. 6m/s、濕度為20% -40%和20-30°C溫度下放置6min-15min。
9.根據權利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述干燥步驟按照如下方式進行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風速O. 3m/s、濕度為35%和27°C溫度下放置lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其特征在于，該方法包括以培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞、細胞同步化、細胞鋪板、加入藥物、干燥和噻唑藍測定步驟，然后使用t檢驗和方差分析對實驗結果進行統(tǒng)計學處理，p＜0.05，表示差異顯著；所述干燥步驟按照如下方式進行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風速0.1m/s-1.0m/s、濕度為15％-50％和20-30℃溫度下放置5min-20min。本發(fā)明是通過表皮角質細胞水平建立的保濕/抗干燥損傷功效的體外評估方法，其操作方便、可重復，并可通過客觀的科學數據可以直觀的反映被篩選物質的保濕/抗干燥損傷功效。
文檔編號C12Q1/02GK102888439SQ201110201708
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權日2011年7月19日
發(fā)明者陳默, 趙亞, 魏少敏 申請人:上海家化聯(lián)合股份有限公司