專利名稱：：監(jiān)控非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的途徑與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性和抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)用于鑒定治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的有效藥物制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用表型和基因型分析法監(jiān)控臨床HIV感染進(jìn)程及其對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的反應(yīng)。本發(fā)明還涉及用于完成表型敏感性試驗(yàn)的新型載體、宿主細(xì)胞及組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用各種基因分析方法鑒別HIV感染患者對(duì)特定抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物制劑產(chǎn)生的抗性。本發(fā)明還涉及依據(jù)對(duì)病毒、選定的病毒序列和/或病毒蛋白進(jìn)行抑制的能力篩選抗逆轉(zhuǎn)錄病毒候選藥物。本發(fā)明特別涉及到使用表型敏感性試驗(yàn)和/或基因分析試驗(yàn)測(cè)定非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗性。本發(fā)明的背景HIV感染特點(diǎn)是在發(fā)病過程中高頻率的病毒更新，最終導(dǎo)致CD4細(xì)胞的消亡和病情發(fā)展惡化。WeiX,GhoshSK,TaylorME,etal.(1995)Nature343,117-122,andHoDD,NaumannAU,PerelsonAS,etal.(1995)Nature373,123-126?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療的目的是對(duì)病毒復(fù)制獲得實(shí)質(zhì)和持續(xù)的抑制，對(duì)病毒獲得持續(xù)的控制包括采用一系列的治療方法，總體上每一種治療方法包括3種或更多抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的聯(lián)合使用，因此選擇開始和后續(xù)的治療方法應(yīng)當(dāng)建立在的理性基礎(chǔ)上，充分了解抗性和交叉抗性對(duì)于指導(dǎo)治療方法的確定至關(guān)重要。聯(lián)合治療的基本理性基礎(chǔ)是藥物配合作用和加和作用可對(duì)病毒復(fù)制獲得更大抑制。然而藥物制劑的耐受性仍然至關(guān)重要，因?yàn)橹委煼椒ㄐ枰３衷S多年。在沒有接受治療的患者體內(nèi)每天產(chǎn)生大約1010個(gè)新病毒顆粒，加上HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)沒有核酸外切酶校正功能，不能校正轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤，這種高水平的病毒更新導(dǎo)致在HIV基因組的每個(gè)位置每天有104到105次突變，結(jié)果迅速產(chǎn)生了基因組的廣泛突變。盡管某些模板位置或堿基對(duì)取代更傾向于發(fā)生錯(cuò)誤(ManskyLM,TeminHM(1995)JVirol69,5087-5094)(SchinaziRF,LloydRM,RamanathanCS,etal.(1994)AntimicrobAgentsChemother38,268-274)，數(shù)學(xué)模型仍然顯示在感染個(gè)體中每個(gè)可能位點(diǎn)每天可能發(fā)生10,000次突變。要產(chǎn)生對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的抗性，作為藥物作用靶位的酶分子必須得到修飾并在抑制劑存在時(shí)保持其功能。導(dǎo)致單個(gè)氨基酸取代的點(diǎn)突變可能導(dǎo)致酶形狀、大小的改變，或者活性部位、底物結(jié)合部位或周邊區(qū)域的改變。在初始治療之前已經(jīng)在低水平上檢測(cè)到對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物有抗性的突變。(MohriH,SinghMK,ChingWTWetal.(1993)ProcNatlAcadSciUSA90,25-29)(NajeraI,RichmanDD,OlivaresI,etal.(1994)AIDSResHumRetroviruses10,1479-1488)(NajeraI,HolguinA,Quinones-MateuE,etal.(1995)JVirol69,23-31)。然而，這些突變株僅占整個(gè)病毒總量的一小部分，而且與野生型病毒相比可能處于復(fù)制和競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)。(CoffinJM(1995)Science267,483-489)?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生的選擇壓力為這些抗藥突變株提供了競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，這樣它們逐漸成為優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種(FrostSDW,McLeanAR(1994)AIDS8,323-332)(KellamP,BoucherCAB,TijnagalJMGH(1994)JGenVirol75,341-351)，最終導(dǎo)致患者體內(nèi)抗藥和抗病毒治療失敗。非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)是一類有多種化學(xué)基團(tuán)的化合物，它們?cè)隗w外對(duì)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶有強(qiáng)烈抑制作用。這些化合物包括吡啶類衍生物，雙芳香雜環(huán)哌嗪(BHAPs)例如地拉呋啶(delavirdine)和艾特呋啶(atevirdine)，聯(lián)吡啶二氮雜草耐呋絡(luò)平(nevirapine)，腺苷衍生物族TSAO和HEPT，一種α-苯胺苯乙酰胺(α-APA)化合物絡(luò)呋瑞得(loviride)，和奎諾啉族抑制劑如(HBY-097),1-和硫酮苯并嗪(TIBO)化合物和吡啶衍生物(L-697,661)，綜述見(DeClercqE.(1996)RevMedVirol6,97-117)(EminiEA(1996)AntiviralDrugResistance抗病毒藥物抗性，ed.DDRichman,JohnWiley&Sons,Led.)。病毒通常在進(jìn)行單一治療的前幾周內(nèi)似乎就迅速對(duì)每種化合物產(chǎn)生高抗性，這常常包括單一位點(diǎn)突變，而且在許多情況下導(dǎo)致對(duì)其它非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑可觀的交叉抗性。大多數(shù)報(bào)道的突變發(fā)生在密碼子110-108和181-190之間，它們編碼與逆轉(zhuǎn)錄酶催化部位相鄰的兩個(gè)β-折疊(KohlstaedtLA,WangJ,FriedmanJM,etal.(1992)Science256,1783-90)，非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的結(jié)合口袋正如文獻(xiàn)已經(jīng)描述的那樣，是逆轉(zhuǎn)錄酶非底物結(jié)合疏水區(qū)。在這里，這些制劑直接與逆轉(zhuǎn)錄酶相互作用。它們通過干擾指形亞結(jié)構(gòu)域的活動(dòng)或者阻斷對(duì)催化活性必需的天冬氨酸側(cè)鏈方向抑制酶的活性(D′AquillaRT.(1994)ClinLabMed14,393-432)(ArnoldE.,DingJ.,HughesSH,etal.(1995)CurrOpinStmctBiol5,27-38)。已有報(bào)道說，引起耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性減弱的突變位于密碼子98、100、103、106、108、181、188和190(RichmanDD,HavlirD,CorbeilJ.(1994)JVirol68,1660-1666)。在耐呋絡(luò)平(nevirapine)單一治療過程中最頻繁的選擇突變是酪氨酸181-半胱氨酸(Y181C)突變，它會(huì)導(dǎo)致HIV對(duì)該制劑敏感性減弱100倍，對(duì)吡啶衍生物L(fēng)-696,229和L-697,661的敏感性也會(huì)減弱(Arnold，同上)。181突變也會(huì)限制TSAO的活性，但對(duì)于100和103位密碼子突變?nèi)员３只钚裕⑶以隗w外選擇獨(dú)特型突變谷氨酸138-半胱氨酸，在該位點(diǎn)TSAO與逆轉(zhuǎn)錄酶緊密相互作用(Richman,DD，同上)(RichmanDD,ShihC-K,LowyI,etal.(1991)ProcNatlAcadSciUSA88,11241-11245)。大多數(shù)患者在使用單-治療24周后會(huì)產(chǎn)生絡(luò)呋瑞得(loviride)抗性，已經(jīng)繪制了密碼子100-110；181-190的圖譜，最普遍的是103密碼子突變(StaszewskiS，MillerV,KoberA,etal.(1996)AntiviralTher1,42-50)。使用絡(luò)呋瑞得(loviride)與瑞得烏啶(zidovudine)或瑞得烏啶(zidovudine)與來咪烏啶(lamivudine)聯(lián)合治療，在24周內(nèi)在密碼子98和103位發(fā)生的變異是最高頻的缺失突變(StaszewskiS,MillerV,RehmetS,etal.(1996)AIDS10,F1-7)。盡管101、103和181位的突變也能導(dǎo)致對(duì)雙芳香雜環(huán)哌嗪(BHAPs)的交叉抗性，(BalzariniJ,KarlssonA,Perez-PerezM-J,etal.(1992)Virology192,246-253)在體外由于這些藥物選擇作用236位P取代L，使逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)其它非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑敏感，例如耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性/半數(shù)抑制濃度IC50減少7至10倍，但不影響對(duì)核苷類似物的敏感性(StaszewskiS.,同上)。盡管在單一治療中已有報(bào)道說密碼子103位和181位發(fā)生抗性獲得性突變，并在與瑞得烏啶(zidovudine)聯(lián)合治療中發(fā)生密碼子101、188、233和238位突變，但是在艾特呋啶(atevirdine)的臨床治療中還未發(fā)現(xiàn)密碼子236位發(fā)生突變的個(gè)體。HBY-097在體外最先選擇出密碼子190位突變，并進(jìn)一步不斷選出逆轉(zhuǎn)錄酶密碼子74和75位突變，這樣一些突變病毒對(duì)地達(dá)喏森(didanosine)和斯塔烏啶(stavudine)敏感性降低，但對(duì)瑞得烏啶(zidovudine)的敏感性并不降低(KleimJ-P,RosnerM,WinklerI,etal.(1995)JAcquirImmuneDeficSyndr10Suppl3,2)已有報(bào)道說41和251位密碼子的典型突變可以抵消181位密碼子突變對(duì)瑞得烏啶(zidovudine)的抗性，(ZhangD,CaliendoAM,EronJJ,etal.(1994)AntimicrobAgentsChemother38,282-287)，這說明應(yīng)用一些非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和瑞得烏啶(zidovudine)進(jìn)行聯(lián)合治療可能可行。盡管有報(bào)道說HIV突變株在體外對(duì)瑞得烏啶(zidovudine)、地達(dá)喏森(didanosine)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)有三重抗性，(LarderBA,KellamP,KempSD(1993)Nature365,451-453)，但聯(lián)合使用這三種藥物治療CD4細(xì)胞數(shù)小于350/mm3的患者48周后，免疫及抗病毒療效的確優(yōu)于單獨(dú)用瑞得烏啶(zidovudine)和地達(dá)喏森(didanosine)。用瑞得烏啶(zidovudine)和吡啶衍生物L(fēng)-697,661聯(lián)合治療能阻礙在使用這一非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑藥物單一治療過程中引發(fā)典型的181突變，延緩對(duì)該化合物高抗性的出現(xiàn)，本研究沒有檢測(cè)到瑞得烏啶(zidovudine)敏感性改變。(StaszewskiS,MassariFE,KoberA,etal.(1995)JInfectDis171,1159-1165)。在使用耐呋絡(luò)平(nevirapine)治療時(shí)同時(shí)或交替用瑞得烏啶(zidovudine)治療不會(huì)延緩抗性出現(xiàn)；(RichmanDD，同上)(NunbergJH,SchleifWA,BootsEJ,etal.(1990)JVirol65,4887-4892)(DeJongMD,LoewenthlM,BoucherCAB,etal.(1994)JInfectDis169,1346-1350)(CheesemanSH,HarlirD,McLaughlinMM＜etal.(1995)JAcquirImmuneDeficSyndr8,141-151)，然而在聯(lián)合治療過程中并沒有觀察到181突變，最常見突變發(fā)生在190位密碼子(RichmanDD，同上)。這說明由于181密碼子突變?cè)隗w外能抵消瑞得烏啶(zidovudine)抗性，所以不適于將其用于體內(nèi)篩選允許對(duì)這個(gè)NNRTI藥物的敏感性降低卻同時(shí)伴隨有瑞得烏啶(zidovudine)抗性的突變。由于對(duì)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑敏感性迅速降低，這些藥物的使用受到了限制，單一治療尤其如此。這就引發(fā)對(duì)這些分子進(jìn)行人工修飾，以期延緩抗藥病毒的出現(xiàn)。一種“第二代”非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，即吡啶衍生物L(fēng)-702,019，對(duì)野生型和181突變株HIV-1的半數(shù)抑制濃度IC50僅有3倍改變，而且獲得性的多突變導(dǎo)致高抗性(GoldmanME,O′BrienJA,RuffingTL,etal.(1993)AntimicrobAgentsChemother37,947-949)。本發(fā)明的目的之一是提供一種藥物敏感性和抗性檢測(cè)方法，它能顯示患者體內(nèi)的病毒種群對(duì)給定的藥物配方是否有抗性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在患者接受治療后對(duì)特定的一種或多種藥物產(chǎn)生抗性時(shí)，為醫(yī)生提供一個(gè)用于替換治療配方中一種或數(shù)種藥物的試驗(yàn)。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一個(gè)能夠篩選治療HIV感染和/或AIDS有效藥物配方的試驗(yàn)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是為那些產(chǎn)生抗性，尤其是已查明對(duì)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑產(chǎn)生抗性的患者提供合適藥物選擇的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種評(píng)價(jià)作用于特定病毒、病毒基因和/或病毒蛋白的候選藥物生物有效性的試驗(yàn)和方法，特別是與非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑相關(guān)的病毒抗藥試驗(yàn)和方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供評(píng)價(jià)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物抗性和敏感性的方法以及組合物。顯然本發(fā)明該目的和其它目的技術(shù)要求是一個(gè)整體。發(fā)明概述本發(fā)明涉及運(yùn)用表型和基因分析方法監(jiān)控人類免疫缺陷型病毒感染進(jìn)程以及它對(duì)抗病毒治療反應(yīng)的方法。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了使HIV對(duì)抗病毒治療產(chǎn)生抗性的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)遺傳突變可以使用表型或基因分析方法直接通過患者血漿HIVRNA迅速確定這一發(fā)現(xiàn)，這些方法使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，或者不使用擴(kuò)增步驟使用測(cè)定編碼病毒蛋白的病毒核酸序列的方法也可使本發(fā)明監(jiān)控和/或改進(jìn)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(efavirenz)治療的患者體內(nèi)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶225位密碼子單獨(dú)突變或與103位密碼子同時(shí)突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加相關(guān)，并且對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)的敏感性幾乎不改變，這些突變是在治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在225位密碼子突變和103位密碼子突變的形成可作為形成抗性和最終免疫低下的指標(biāo)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在接受非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑藥物(NNRTI)治療的患者中發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄酶236位密碼子突變與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低、對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)的敏感性不降低相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在190和103和/或101位密碼子突變和103位密碼子突變的形成可作為表型敏感性/抗性發(fā)生改變的指標(biāo)，這與抗病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低有關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在接受非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑劑類藥物(艾發(fā)呋瑞茲efavirenz)治療的患者體內(nèi)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶190位密碼子單獨(dú)突變或109位密碼子與103和/或101位密碼子同時(shí)突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加和對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)的敏感性降低相關(guān)，這些突變是在NNRTI治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在236和103位密碼子突變和/或181位密碼子突變的形成可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(耐呋絡(luò)平nevirapine)治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶230位密碼子單獨(dú)突變或與181位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡(luò)平(nevirapine)的敏感性顯著降低相關(guān)，這些突變是在NNRTI治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在230和181位密碼子突變的形成可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(耐呋絡(luò)平nevirapine)治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶181位密碼子突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低和耐呋絡(luò)平(nevirapine)的敏感性顯著降低、對(duì)艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性沒有變化相關(guān)，該突變是在NNRTI治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在181位密碼子發(fā)生突變可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(艾發(fā)呋瑞茲efavirenz)治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶188位密碼子突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低和耐呋絡(luò)平(nevirapine)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低相關(guān)，該突變是在NNRTI治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在188位密碼子發(fā)生突變可作為表型敏感性/抗性發(fā)生改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在沒有用非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶188位密碼子突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低和耐呋絡(luò)平(nevirapine)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低，以及對(duì)艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性中度降低相關(guān)，該突變是在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在138和188位密碼子發(fā)生突變可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在以前沒有用非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶98位密碼子突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低相關(guān)，該突變是在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在98位密碼子突變的形成可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與抗病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)在不清楚患者接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療情況時(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶98位密碼子單獨(dú)突變或者與190位密碼子同時(shí)突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性提高和耐呋絡(luò)平(nevirapine)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低相關(guān)，這些突變是在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在98位密碼子突變和190位密碼子突變可作為形成抗性和最終免疫能力降低的指標(biāo)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在接受非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(地拉呋啶delavirdine)治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶181位密碼子單獨(dú)突變或與98位密碼子同時(shí)突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)降低相關(guān)，這些突變是在治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在98和181位密碼子突變可作為形成抗性和最終免疫能力降低的指標(biāo)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了101位密碼子單獨(dú)突變，或者與190位密碼子同時(shí)突變(例如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶190S)，與接受非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(艾發(fā)呋瑞茲efavirenz)治療的患者對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性沒有改變和耐呋絡(luò)平(nevirapine)、艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)降低相關(guān)。這些突變是在治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在101和190位密碼子發(fā)生突變(例如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶190S)，可作為形成抗性和最終免疫能力降低的指標(biāo)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在以前沒有用非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶108位密碼子突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性沒有改變、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性輕微降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性沒有改變相關(guān)，該突變是在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在108位密碼子突變可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與抗病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在以前沒有用非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶101位密碼子單獨(dú)突變或與103和/或190位密碼子同時(shí)突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性改變相關(guān)，該突變是在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。特別是101和190位密碼子突變，例如190A，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性沒有改變、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性顯著降低相關(guān)，這些突變是在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在101、103和/或190位密碼子突變可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在用非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(耐呋絡(luò)平nevirapine)治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶106位密碼子單獨(dú)突變或者與189和/或181和227位密碼子突變，與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性改變相關(guān)，特別是106和181位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低相關(guān)，106和189位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性沒有改變相關(guān)，106和227位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低相關(guān)，181和227位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性顯著降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性增加相關(guān)，106、181和227位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低相關(guān)，這些突變是在NNRTI治療治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在106、189和/或181和227位密碼子突變可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫能力降低相關(guān)。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在用非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(耐呋絡(luò)平nevirapine)治療的患者中HIV逆轉(zhuǎn)錄酶103位密碼子單獨(dú)突變或者與100和/或188位密碼子突變，這些突變與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性改變相關(guān)，特別是103和188位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低相關(guān)，100和103位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低相關(guān)，103、100和188位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低相關(guān)，這些突變是在NNRTI治療治療開始一段時(shí)間后在血漿HIVRNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在103、100和/或188位密碼子突變可作為表型敏感性/抗性改變的指標(biāo)，這與病毒治療失敗和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)225位密碼子突變，還可檢測(cè)包括HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在103位在內(nèi)的其它密碼子突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低的特定模型相關(guān)。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)236位密碼子單獨(dú)突變或包括HIV逆轉(zhuǎn)錄酶103位和/或181位在內(nèi)的其它位點(diǎn)同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)190位密碼(G190S)單獨(dú)突變或與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上101位密碼子(K101E)同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶190位密碼子(G190A)單獨(dú)突變或與103位密碼子(K103N)同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶230位密碼子單獨(dú)突變或與181位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶181位密碼子突變，該突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上188位密碼子突變，該突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶138位密碼子單獨(dú)突變或與188位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶98位密碼子突變，該突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶98位密碼子單獨(dú)突變或與190位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上181位密碼單獨(dú)突變或與98位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上101位密碼子單獨(dú)突變或與190位密碼子同時(shí)突變(例如190s的突變)，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上108位密碼子突變，該突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上101位密碼子單獨(dú)突變或與103和/或190位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上106位密碼子單獨(dú)突變或與189和/或181和227位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內(nèi)的PCR分析方法檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上188位密碼子單獨(dú)突變或與100和/或103位密碼子同時(shí)突變，這些突變與對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療產(chǎn)生抗性和隨后的免疫力降低相關(guān)。一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到225和103位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到236和/或103和/或181位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到190和/或103和/或101位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到230和/或181位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到181位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到188位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到138和/或188位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到98位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到98和/或190位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到181和/或98位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到101和/或190位密碼子突變，例如190S，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到108位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到101和/或103和/或190位密碼子突變(例如190A)，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到106和/或189和/或181和/或227位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)檢測(cè)到188和/或100和/或103位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。在使用PCR分析方法評(píng)價(jià)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后，應(yīng)該確定修改治療藥物配方的時(shí)間，這依賴于包括患者病毒負(fù)載量、CD4細(xì)胞數(shù)量和以前的治療史這幾個(gè)因素。本發(fā)明另外一個(gè)方面是提供了評(píng)價(jià)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物有效性的方法，包括(a)將帶有患者來源片段和報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；(b)培養(yǎng)來自(a)的宿主細(xì)胞；(c)檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)，其中報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段；和(d)將來自步驟(c)報(bào)告基因的表達(dá)與在實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)不加入NNRTI抗HIV藥物的情況下所檢測(cè)到的報(bào)告基因的表達(dá)二者進(jìn)行比較，其中抗HIV藥物NNRTI的試驗(yàn)濃度在步驟(a)-(c)；在步驟(b)-(c)；或在步驟(c)中標(biāo)出。本發(fā)明還提供了評(píng)價(jià)患者接受非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療有效性的方法，包括(a)繪制NNRTI類抗HIV藥物的敏感性標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b)使用如上所述的敏感性試驗(yàn)確定患者NNRTI抗HIV藥物的敏感性；以及(c)將步驟(b)中NNRTI抗HIV藥物的敏感性與步驟(a)中確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，其中NNRTI抗HIV敏感性降低表明在患者體內(nèi)形成了對(duì)抗HIV藥物的抗性。本發(fā)明還提供了評(píng)價(jià)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒候選藥物復(fù)方生物有效性的方法，包括(a)將帶有患者來源片段和報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；(b)培養(yǎng)來自(a)的宿主細(xì)胞；(c)檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)，其中報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段；和(d)將來自步驟(c)報(bào)告基因的表達(dá)與在實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)不加入NNRTI抗HIV藥物的情況下所檢測(cè)到的報(bào)告基因的表達(dá)二者進(jìn)行比較，其中抗HIV藥物NNRTI的試驗(yàn)濃度在步驟(a)-(c)；在步驟(b)-(c)；或在步驟(c)中標(biāo)出。靶細(xì)胞中抗性試驗(yàn)載體所帶報(bào)告基因的表達(dá)最終依賴于患者來源片段序列，報(bào)告基因的功能可有可無。本發(fā)明的另一個(gè)方面是為指導(dǎo)針對(duì)HIV/AIDS的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性/抗性試驗(yàn)。本發(fā)明中用于HIV/AIDS的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性/抗性試驗(yàn)的特殊抗性試驗(yàn)載體載體已被標(biāo)識(shí)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了鑒定和評(píng)價(jià)對(duì)于HIV和/或AIDS治療具有潛力的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)方生物有效性的方法。另一方面，本發(fā)明針對(duì)一個(gè)新型抗性試驗(yàn)載體。該載體包含有一個(gè)患者來源片段和一個(gè)報(bào)告基因?；颊邅碓雌瑪噙M(jìn)一步包含有一個(gè)或更多逆轉(zhuǎn)錄酶基因的突變。附圖簡(jiǎn)要說明圖1抗性試驗(yàn)載體。用圖形示意包含有一個(gè)患者來源片段和一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體。圖2雙細(xì)胞分析。示意性地標(biāo)識(shí)分析方法。通過將患者來源片段克隆到一個(gè)報(bào)告基因病毒載體中構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體，接著將該抗性試驗(yàn)載體與一個(gè)表達(dá)兼嗜性鼠白血病病毒(MLV)外殼蛋白或其它能侵染的病毒或細(xì)胞蛋白的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，這樣產(chǎn)生的假型病毒顆粒包含有源于患者序列的蛋白酶(PR)和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因產(chǎn)物，接著收集顆粒用于感染新鮮細(xì)胞。使用缺陷的蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶序列證明熒光素酶活性依賴于有功能的蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。另一方面，在病毒顆粒感染的同時(shí)或在此之前向細(xì)胞中加入逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，該試驗(yàn)設(shè)有不含藥物和加入不同濃度藥物的多個(gè)組，測(cè)定熒光素酶的含量，測(cè)定不同試驗(yàn)藥物濃度下的抑制百分比(％)。圖3藥物表型敏感性圖例。通過繪制熒光素酶活性對(duì)log10濃度(um)抑制百分比分析數(shù)據(jù)。該圖用于計(jì)算抑制病毒復(fù)制的50％(IC50)和95％(IC95)所需的藥物濃度，抑制曲線向更高藥物濃度移位可以用抗藥性解釋。圖中顯示出3種典型曲線即一種核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(AZT)、一種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(地拉呋啶delavirdine)和一種蛋白酶抑制劑(ritonavir)。與基線(治療前)樣品或?qū)φ账幬镆赘胁《鞠啾?，例如在基線樣品不易獲得時(shí)選用的PNL4-3或HXB-2，藥物敏感性曲線向更高藥物濃度(右移)位移反映了藥物敏感性(抗性)降低。圖4藥物表型敏感性和抗性圖487例患者。實(shí)施PCR表型敏感性分析繪制表型藥物敏感性和抗性圖顯示地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性增加，這是NNRTI敏感性/抗性第一個(gè)模型的例子。通過分析血漿來源病毒證明HIV逆轉(zhuǎn)錄酶184密碼子突變(M184V)與3TC抗性有關(guān)，103位突變(K103N)與對(duì)地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性相關(guān)。圖5逆轉(zhuǎn)錄酶定點(diǎn)突變株藥物表型敏感性和抗性圖。實(shí)施PCR表型敏感性分析繪制表型敏感性和抗性圖顯示103位和181位密碼定點(diǎn)突變(K103N；Y181C)使地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性增加，雙突變株顯示雙突變的加和效應(yīng)導(dǎo)致抗性進(jìn)一步增加。圖6藥物表型敏感性和抗性圖；487例患者。實(shí)施PCR表型敏感性分析血漿來源HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒核酸，繪制表型敏感性圖顯示對(duì)地拉呋啶(delavirdine)有抗性而耐呋絡(luò)平(nevirapine)沒有抗性，這是NNRTI敏感性/抗性第二個(gè)模型的例子。該患者來源病毒對(duì)試驗(yàn)所用蛋白酶抑制劑有抗性，也對(duì)AZT和3TC有明顯抗性，對(duì)ddC、ddI和d4T敏感性輕微轉(zhuǎn)移。運(yùn)用PCR和測(cè)序進(jìn)行基因型分析血漿來源病毒評(píng)價(jià)顯示HIV逆轉(zhuǎn)錄酶在103和236位密碼子突變(K103N；P236L)。先前報(bào)道P236L突變株引起地拉呋啶(delavirdine)抗性和耐呋絡(luò)平(nevirapine)超敏(DuewekeTJetal.(1993)ProcNatlAcadSci90,4713-4717)。然而，在該患者樣本中，地拉呋啶(delavirdine)抗性和耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性與野生型一樣。圖7逆轉(zhuǎn)錄酶定點(diǎn)突變株(P236L)的藥物表型敏感性和抗性圖。實(shí)施PCR表型敏感性分析繪制出顯示P236L定點(diǎn)誘變突變株對(duì)地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性的表型敏感性和抗性圖，結(jié)果與圖6中所示的患者病毒樣本的觀察結(jié)果相同，后面2個(gè)方格指標(biāo)K103N定點(diǎn)誘變突變株，2個(gè)方格下方指標(biāo)雙突變株K103N+P236L。在K103N突變基礎(chǔ)上再發(fā)生P236L，引發(fā)對(duì)地拉呋啶(delavirdine)高抗性，但由于K103N因而對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性不產(chǎn)生影響。圖右邊顯示當(dāng)P236L附加于Y181→突變時(shí)會(huì)有類似結(jié)果。圖8A藥物表型敏感性抗性圖302例患者。這是NNRTI敏感性/抗性第三個(gè)模型的例子?；颊卟《颈硇头治鲎C明對(duì)地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性降低。該模型的特征是與地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低相比，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性更大幅度地降低，患者病毒基因型分析顯示逆轉(zhuǎn)錄酶K103N突變與耐呋絡(luò)平(nevirapine)和地拉呋啶(delavirdine)抗性以及P225H相關(guān)。圖8B藥物表型敏感性和抗性圖780例患者。這是NNRTI敏感性/抗性第三個(gè)模型的第二個(gè)例子。患者病毒表型分析顯示地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性均降低。該模型的特征是與地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低相比，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性更大幅度地降低，患者病毒基因型分析顯示逆轉(zhuǎn)錄酶K103N位點(diǎn)發(fā)生突變與耐呋絡(luò)平(nevirapine)和地拉呋啶(delavirdine)抗性以及P225H相關(guān)。圖8C藥物表型敏感性和抗性圖302例患者單個(gè)病毒克隆。對(duì)來自患者302的單個(gè)病毒克隆基因型分析顯示帶有K103N突變而沒有P225H突變(K103N,1135M,R211K)的病毒，帶有K103N突變同時(shí)具有P225H突變(K103N,P225H)的病毒。這些病毒克隆表型特征表明P225H突變減少與K103N突變相關(guān)的地拉呋啶(delavirdine)抗性(比較底部方格)，但不改變與K103N突變相關(guān)的耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性(比較頂部方格)。圖8D藥物表型敏感性和抗性圖逆轉(zhuǎn)錄酶定點(diǎn)突變株。帶有逆轉(zhuǎn)錄酶定點(diǎn)突變P225H的病毒的表型特征表明該突變?cè)黾訉?duì)地拉呋啶(delavirdine)抗性，但對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性沒有改變(比較頂部方格)。帶有逆轉(zhuǎn)錄酶定點(diǎn)突變P225H加K013N或P225H加Y181C的病毒的表型特征圖表明P225H突變降低與K103N或Y181C突變相關(guān)的地拉呋啶(delavirdine)抗性，但不降低與K103N或Y181C突變相關(guān)的耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性。是針對(duì)地拉呋啶(delavirdine)而不是耐呋絡(luò)平(nevirapine)(比較對(duì)應(yīng)的中部和底部方格)。圖9A藥物表型敏感性和抗性圖644例患者。這是NNRTI敏感性/抗性第四個(gè)模型的例子。對(duì)患者病毒表型分析發(fā)現(xiàn)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性大幅降低，地拉呋啶(delavirdine)敏感性不降低，對(duì)患者病毒基因型分析發(fā)現(xiàn)存在逆轉(zhuǎn)錄酶突變G190S，以及伴隨有艾特呋啶(atevirdine)敏感性降低的K101E突變、MMP226、L-697、661和UC-10、38、57(Schinazi,Mellors,Larderresistancetable)。圖9B逆轉(zhuǎn)錄酶定點(diǎn)突變株藥物表型敏感性和抗性圖。包含有逆轉(zhuǎn)錄突變G190A或G190S的病毒的表型特征證明這些突變使耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性大副降低，對(duì)地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微升高(比較頂部表格)。本發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明涉及監(jiān)控接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒臨床治療的患者，特別是接受非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者體內(nèi)HIV的感染進(jìn)程。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，在逆轉(zhuǎn)錄酶上有一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)。突變與表型敏感性/抗性的改變呈正相關(guān)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在225和103位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用藥物表型敏感性分析，本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶225位密碼單獨(dú)突變或與103位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性變化很小或不變化以及艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性不改變相關(guān)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在236和103和/或18l位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶236位密碼單獨(dú)突變或與103和/或181位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低(抗性增加)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性不變相關(guān)，236位單獨(dú)突變或在Y181C的背景下突變不影響艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性，但很大程度恢復(fù)了由103N突變引起的敏感性喪失。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在230和/或181位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶230位密碼單獨(dú)突變或與181位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低(抗性增加)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性顯著降低相關(guān)。在再一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在181位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶181位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低(抗性增加)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性顯著降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性不變相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在188位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶188位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低(抗性增加)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性顯著降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在138和/或188位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶138位密碼單獨(dú)突變或與188位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低(抗性提高)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性中度降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在98位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶98位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低(抗性增加)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性輕微降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性輕微降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在98和/或190位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶98位密碼單獨(dú)突變或與190位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加(抗性降低)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在181和/或98位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶181位密碼單獨(dú)突變或與98位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低(抗性增加)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性輕微降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在101和/或190位密碼子突變，例如190S的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶101位密碼單獨(dú)突變或與190位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性不變(野生型)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在108位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶108位密碼子突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性不變(野生型)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性輕微降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)性不變相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在101和103和/或190位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶101位密碼單獨(dú)突變或與130和/或190位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性或不變(101和190)或中度降低(103和190，例如190A)(抗性增加)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在106和/或189和/或181和/或227位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶106位密碼單獨(dú)突變或與106和/或189和/或181和/或227位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性改變相關(guān)。特別地，106和181密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性輕微降低相關(guān)，106和189密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性不變相關(guān)，106和227密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性輕微降低相關(guān)，181和227密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性顯著降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性增加相關(guān)，106和181密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性輕微降低相關(guān)。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在188和100和/或103位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析本發(fā)明證實(shí)了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶188位密碼單獨(dú)突變或與100和/或103位密碼同時(shí)突變，這些突變與地拉呋啶(delavirdine)、耐呋絡(luò)平(nevirapine)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性改變相關(guān)。特別地，103和188密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低相關(guān)，100和103密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低相關(guān)，103和100和188位密碼存在突變與地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)性降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的敏感性實(shí)質(zhì)性降低相關(guān)。在上述情況下，感染患者的HIV病毒的表型敏感性/抗性圖和基因型圖已經(jīng)修改以便反映對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑反應(yīng)性變化。對(duì)于NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，感染患者的HIV病毒可能對(duì)這里所描述的一種或多種NNRTIs有抗性，但對(duì)其它NNRTIs沒有抗性，因此在檢測(cè)到突變后需要或者增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑的劑量，或者改換另外的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑，或者在患者治療的組合物中加入一種或多種額外的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑。例如，如果患者在接受艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)(DMP-266)治療時(shí)225位發(fā)生突變，患者治療組合物可能需要做以下修改，(Ⅰ)或者改換不同的NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑，例如地拉呋啶(delavirdine)或耐呋絡(luò)平(nevirapine)，并停止艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)治療；或者(ⅱ)增加艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)的劑量；或者(ⅲ)在患者治療復(fù)方中加入其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑?？梢酝ㄟ^檢測(cè)病毒負(fù)載量例如HIVDNA拷貝數(shù)評(píng)價(jià)經(jīng)修改的治療的有效性，HIVDNA拷貝數(shù)降低的確與治療復(fù)方的有效性相關(guān)。用在這里的術(shù)語“正相關(guān)”指特定的結(jié)果導(dǎo)致特定最有可能的結(jié)論，而不是其它結(jié)論。本發(fā)明另外一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或225和103位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在225或103位密碼子突變或二者同時(shí)突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或103和/或181和236位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在236和103和/或181位密碼子突變。本發(fā)明再一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或101和190位(G190S)密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在190(G190S)和101密碼位突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或103和190位(G190A)密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在190(G190A)和103位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或230和181位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在230和181位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或181位突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在181位突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或188位突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在188位突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或138和188位突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在138和188位突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或98位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在98位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或98和190位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在190和98位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或98和181位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在98和181位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或101和190位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在190位，例如190S和101位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或108位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在108位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或101和103和190位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在101和103和190位密碼子突變，例如190A。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或106和189和181和227位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在106和189和181和227位密碼子突變。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(Ⅰ)從HIV感染的患者中采集生物樣品；(ⅱ)從生物樣品中擴(kuò)增HIV編碼的RNA，即將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用HIV引物擴(kuò)增HIV序列，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有逆轉(zhuǎn)錄酶基因；(ⅲ)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含有野生型或188和100和103位密碼子突變；以及(ⅳ)通過PCR產(chǎn)物確定是否存在188和100和103位密碼子突變。存在HIV逆轉(zhuǎn)錄酶225和103位密碼子突變表明現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性需要改進(jìn)，因?yàn)槿绫景l(fā)明所顯示的那樣103位密碼子突變降低易感性，這可通過225位密碼子突變部分恢復(fù)易感性。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶上存在236和103和/或181位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在190(G190A)和103(K103N)位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在190(G190S)和101(K101E)位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在230和181位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在181位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在188位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在138和188位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在98位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在98和190位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在181和98位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在101和190位密碼子突變，例如190S，表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在108位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在101和103和190位密碼子突變，例如190A，表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在106和189和181和227位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實(shí)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶存在188和100和103位密碼子突變表示現(xiàn)有或?qū)淼腘NRTI治療的有效性已經(jīng)被降低。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在236和103和/或181位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)這3個(gè)突變的確與地拉呋啶(delavirdine)抗性相關(guān)，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)這3個(gè)突變的確與耐呋絡(luò)平(nevirapine)抗性相關(guān)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，HIV逆轉(zhuǎn)錄酶236位突變的密碼編碼亮氨酸(L)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶在103密碼子突變、181密碼子突變或二者一并突變并伴隨HIV逆轉(zhuǎn)錄酶236位密碼子突變。在又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，103突變密碼編碼天冬酰胺(N)，并且103突變密碼編碼半胱氨酸(C)。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)患者NNRTI抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在225和103位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶225密碼單獨(dú)突變或與103位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加，而對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性不產(chǎn)生影響。在又一個(gè)實(shí)施方案中，225突變密碼編碼組氨酸，230密碼編碼亮氨酸，181密碼編碼半胱氨酸。本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼181密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)181密碼子突變的確與地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度減少、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性明顯減少和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性不變相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，181突變密碼編碼異亮氨酸。本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼188密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)188密碼子突變的確與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性顯著降低相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，188突變密碼編碼半胱氨酸、組氨酸或亮氨酸。本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼190密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)190密碼子突變的確與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性大幅度降低相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，190突變密碼編碼丙氨酸或絲氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在230和181位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶230密碼單獨(dú)突變或與181位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性顯著降低。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在138和188位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶138密碼單獨(dú)突變或與188位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性中度降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，138突變密碼編碼丙氨酸、188突變密碼編碼亮氨酸。本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼98密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)98密碼子突變的確與地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低、耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性輕微降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，98突變密碼編碼甘氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在98和190位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶98密碼單獨(dú)突變或與190位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，190突變密碼編碼絲氨酸、98突變密碼編碼甘氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在181和98位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶181密碼單獨(dú)突變或與98位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，98突變密碼編碼甘氨酸、181突變密碼編碼半胱氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在101和190位密碼子突變，例如190S的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶101密碼單獨(dú)突變或與190位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性不變，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，190突變密碼編碼絲氨酸、101突變密碼編碼谷氨酸。本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼108密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)108密碼子突變的確與地拉呋啶(delavirdine)敏感性不變、耐呋絡(luò)平(inevirapine)敏感性輕微降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性不變相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，108突變密碼編碼異亮氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在101和190位密碼子突變，例如190A的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶101密碼單獨(dú)突變或與190位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性不變，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性顯著降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，190突變密碼編碼甘氨酸、101突變密碼編碼谷氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在103和190位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶103密碼單獨(dú)突變或與190位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性顯著降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，190突變密碼編碼丙氨酸、103突變密碼編碼天冬酰胺。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在106和181位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶106密碼單獨(dú)突變或與181位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性顯著降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，106突變密碼編碼丙氨酸、181突變密碼編碼半胱氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在106和189位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶106密碼單獨(dú)突變或與189位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性不變。在又一個(gè)實(shí)施方案中，189突變密碼編碼亮氨酸、106突變密碼編碼丙氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在106和227位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶106密碼單獨(dú)突變或與227位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性輕微降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，227突變密碼編碼亮氨酸、106突變密碼編碼丙氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在181和227位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶181密碼單獨(dú)突變或與227位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性顯著降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性增加。在又一個(gè)實(shí)施方案中，227突變密碼編碼亮氨酸，181突變密碼編碼半胱氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在106和181和227位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶106密碼單獨(dú)突變或與181和227位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性輕微降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，106突變密碼編碼丙氨酸，181突變密碼編碼半胱氨酸，和227密碼編碼亮氨酸。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在103和188位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶103密碼單獨(dú)突變或與188位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性實(shí)質(zhì)降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，188突變密碼編碼亮氨酸，103突變密碼編碼天冬酰胺。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在100和103位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶100密碼單獨(dú)突變或與103位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，100突變密碼編碼異亮氨酸，103突變密碼編碼天冬酰胺。本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的、非限定性特定實(shí)施方案如下一種評(píng)價(jià)對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性的方法，(a)從HIV感染的患者中采集生物樣品；和(ⅱ)確定生物樣品是否包含有編碼在100和103和188位密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸，運(yùn)用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶100密碼單獨(dú)突變或與103和188位密碼同時(shí)突變引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性實(shí)質(zhì)降低，對(duì)耐呋絡(luò)平(nevirapine)敏感性中度降低和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)敏感性實(shí)質(zhì)降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，100突變密碼編碼異亮氨酸，103突變密碼編碼天冬酰胺，以及188密碼編碼亮氨酸。本發(fā)明還提供了使用抗性試驗(yàn)載體的手段和方法，載體含有HIV基因，更進(jìn)一步地含有藥物篩選所需的NNRTI突變。尤其是，本發(fā)明描述了包含有HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的抗性試驗(yàn)載體，逆轉(zhuǎn)錄酶具有藥物篩選所需的225和103密碼子突變。本發(fā)明還描述了包含有在236和103和/或181密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體，本發(fā)明還描述了包含有在190(G190A)和103(K103N)密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體，本發(fā)明還描述了包含有在190(G190S)和101(K103E)密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在230和181密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在181密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在188密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在138和188密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在98密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在98和190密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在181和98密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在101和190密碼子突變，例如190S的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在108密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在101和103和/或190密碼子突變，例如190A的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在106和189和/或181和/或227密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明還描述了包含有在188和100和/或103密碼子突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抗性試驗(yàn)載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于分離和鑒定非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗性突變株的新型載體、宿主細(xì)胞及組份，以及使用這些載體、宿主細(xì)胞和組份實(shí)施抗病毒篩選。本發(fā)明還涉及根據(jù)其抑制所述突變株的能力篩選候選藥物。實(shí)施例1使用抗性試驗(yàn)載體測(cè)定藥物表型敏感性和抗性使用PCT國際申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朜o.PCT/US/01609，申請(qǐng)日1997年1月29)上所述手段和方法進(jìn)行藥物表型敏感性和抗性試驗(yàn)。這些試驗(yàn)中有一段來自患者的片段(PDS)。這個(gè)片段，或者是通過從HIV患者血清中的病毒粒子里分離出病毒RNA，再利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從病毒RNA中擴(kuò)增出來的一段片段；或者是對(duì)抗性試驗(yàn)載體DNA父系克隆進(jìn)行定點(diǎn)突變，所獲得的野生型HIV-1突變體。這段來自患者的片段對(duì)應(yīng)于HIV蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域。使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序分離病毒RNA，例如RNAgentsTotalRNAIsolationSystem(普洛麥格公司，美國威斯康星州麥迪遜)或RNAzol(泰爾-泰施特公司，美國得克薩斯州福蘭德伍德)。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)操作程序分為兩步。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，例如MoloneyMuLV的逆轉(zhuǎn)錄酶(羅氏分子系統(tǒng)公司，美國新澤西州布蘭奇堡)，或者禽成髓細(xì)胞性白血病病毒AMV的逆轉(zhuǎn)錄酶(寶靈曼公司，美國印第安那州印第安納波利斯)，從病毒RNA復(fù)制cDNA。然后使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶擴(kuò)增cDNA，例如Taq酶(羅氏分子系統(tǒng)，美國新澤西州布蘭奇堡)，Tth酶(羅氏分子系統(tǒng)，美國新澤西州布蘭奇堡)，PrimeZyme酶(從棲熱菌屬brockianus中分離，生物統(tǒng)計(jì)公司，德國歌廷根)擴(kuò)增cDNA，或按“長片段PCR”的描述使用組合使用熱穩(wěn)定性聚合酶(Barnes,W.M.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci,USA91,2216-2220)[例如擴(kuò)增高保真PCR(Taq+Pwo)(寶靈曼公司，美國印第安那州印第安納波利斯)或GeneAmpXLPCR試劑盒(Tth+Vent)，(羅氏分子系統(tǒng)公司，美國新澤西州布蘭奇堡)]。使用ApaⅠ引物(PDSApa)和AgeⅠ引物(PDSAge)擴(kuò)增來自病人的片段，通過在PCR產(chǎn)物5’和3’端分別引入ApaⅠ和AgeⅠ酶切位點(diǎn)，請(qǐng)分別參見見PCT國際申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/0169，申請(qǐng)日1997年1月29日。按PCT國際申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/01609，申請(qǐng)日1997年1月29日)中所述的方法，以病毒RNA作為模板，以寡聚核苷酸PDSApa和PDSAge為引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增該片段，然后用ApaⅠ和AgeⅠ或同裂酶PINAI消化制備1.5KB的DNA產(chǎn)物，通過逆轉(zhuǎn)錄-PCR摻入來自于患者的“試驗(yàn)”片段構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。為保證在對(duì)應(yīng)于所合成抗性試驗(yàn)載體的質(zhì)粒DNA中含有特定患者血清中HIV病毒準(zhǔn)種的代表性樣本，在構(gòu)建特定抗性試驗(yàn)載體時(shí)采集大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，將大量(＞100)獨(dú)立的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體合并作為制備質(zhì)粒DNA。一個(gè)編碼兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV4070Aenv基因產(chǎn)物的包裝表達(dá)載體，能夠在抗性試驗(yàn)載體宿主細(xì)胞中合成抗性試驗(yàn)載體病毒顆粒。此顆粒能有效感染人靶細(xì)胞。除了env基因以外，編碼其它所有HIV基因的抗性試驗(yàn)載體都被用來轉(zhuǎn)染一種包裝的宿主細(xì)胞(一旦宿主細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，就稱其為抗性試驗(yàn)載體宿主細(xì)胞)。編碼兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV4070Aenv基因產(chǎn)物的包裝表達(dá)載體和抗性試驗(yàn)載體一起被用于在抗性試驗(yàn)載體宿主細(xì)胞中合成具有偽型特征的(pseudotyped)抗性試驗(yàn)載體侵染性顆粒。在利用抗性檢測(cè)進(jìn)行抗性試驗(yàn)時(shí)，使用了包裝宿主和靶宿主細(xì)胞。靶宿主細(xì)胞是人胚胎腎細(xì)胞系293(細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備公司，美國加州大學(xué)舊金山分校)或Jurkat白血病T細(xì)胞系(ArthurWeiss，美國加州大學(xué)舊金山分校)。使用抗性試驗(yàn)載體在兩種類型的宿主細(xì)胞中進(jìn)行抗性試驗(yàn)。抗性試驗(yàn)載體的病毒顆粒由第一種宿主細(xì)胞(抗性試驗(yàn)載體宿主細(xì)胞)產(chǎn)生，利用使用抗性試驗(yàn)載體和包裝表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染一個(gè)包裝宿主細(xì)胞，制備該抗性試驗(yàn)載體宿主細(xì)胞。然后用抗性試驗(yàn)載體病毒顆粒感染第二種宿主細(xì)胞(靶宿主細(xì)胞)，在靶宿主細(xì)胞中檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。構(gòu)建帶有一個(gè)功能性熒光素酶的基因盒的抗性試驗(yàn)載體，并用該抗性試驗(yàn)載體DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。抗性試驗(yàn)載體帶有來自患者的序列，此序列包括逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶序列，它們對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥劑(如核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)具有敏感性或抗性。用抗性試驗(yàn)載體DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，產(chǎn)生抗性試驗(yàn)載體病毒粒子。無論蛋白酶抑制劑存在與否，用該載體DNA感染靶細(xì)胞，靶細(xì)胞生長時(shí)不加NRTI或NNRTI藥物，或藥物濃度不斷增加的環(huán)境中。存在藥物時(shí)被感染的靶細(xì)胞中產(chǎn)生的熒光素酶活性數(shù)量與不加藥物時(shí)被感染靶細(xì)胞產(chǎn)生熒光素酶的量相比較。用抑制不加藥物時(shí)熒光素酶活性的50％所需要的藥量(半數(shù)抑制濃度，IC50)來測(cè)量藥物抗性。用抑制百分?jǐn)?shù)對(duì)Log10藥物濃度作圖，測(cè)定IC50值。宿主細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，加入抗性試驗(yàn)載體質(zhì)粒DNA和包被表達(dá)載體模板，數(shù)天后用磷酸鈣法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后1到24小時(shí)內(nèi)，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基替換含DNA沉淀的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后1到4天內(nèi)，收獲含有抗性試驗(yàn)載體病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基，用0.45mm的濾膜過濾后在-80℃保存。收獲的細(xì)胞培養(yǎng)基中HIV衣殼蛋白(p24)表達(dá)水平用EIA方法，按廠商說明書(SIAC公司，美國馬里蘭州佛勒德利克)。感染前，先將靶細(xì)胞(293和293/T)接種到細(xì)胞培養(yǎng)基中。感染實(shí)驗(yàn)對(duì)照組是(不含DNA的)偽轉(zhuǎn)染或不含包膜表達(dá)質(zhì)粒的抗性試驗(yàn)載體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。感染后1到3天或更多天以后棄去培養(yǎng)基，向每孔中加入細(xì)胞裂解緩沖液(普洛麥格公司)。檢測(cè)細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性(圖3)。通過以下方程計(jì)算藥物抑制效果％熒光素酶抑制率=1-(RLUluc[藥物]/RLUluc)×100其中RLUluc[藥物]為存在藥物時(shí)被感染細(xì)胞熒光素酶活性的相對(duì)光單位，RLUluc是不存在藥物時(shí)被感染細(xì)胞的熒光素酶活性的相對(duì)光單位。用熒光素酶活性抑制百分比對(duì)的log10藥物濃度作圖，從此S形曲線上找到IC50值。藥物抑制曲線見圖3。實(shí)施例2分析基因型建立基因型與表型敏感性之間的關(guān)聯(lián)性患者HIV樣本的表型敏感性分析如實(shí)施例1中所述構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。對(duì)抗性試驗(yàn)載體或來自抗性試驗(yàn)載體庫的克隆進(jìn)行表型敏感性試驗(yàn)，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定一系列抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物可能包括所說的核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)類藥物、非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)類藥物及蛋白酶抑制劑(PRIs)類藥物。如果有新藥或新藥物靶可利用則可擴(kuò)大這組藥物。在每一個(gè)抗性載體庫上，測(cè)定每一個(gè)試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。將所有試驗(yàn)藥物的敏感性模型與已知的敏感性模型進(jìn)行比較。可以對(duì)患者樣本做進(jìn)一步檢查，找出與已觀察到的敏感性模型相關(guān)的基因型變化?；颊逪IV樣本基因型分析用實(shí)施例2中所述的基因測(cè)型方法分析抗性試驗(yàn)載體庫或其克隆。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，純化病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增，用ABI鏈終止子方法自動(dòng)測(cè)序。測(cè)出序列與數(shù)據(jù)庫中的對(duì)照序列進(jìn)行比較?；蛘撸缬锌赡?，與在患者接受治療之前所采集的樣本比較。檢查該基因型序列，找出不同于對(duì)照或治療前樣本的序列，并建立與所觀察到的表型之間的相關(guān)性。定點(diǎn)突變體基因型敏感性分析在背景明確的野生型背景下，構(gòu)建帶有特定突變的抗性試驗(yàn)載體，觀察基因型變化和表型敏感性，分析兩者之間的關(guān)聯(lián)性。突變可以單獨(dú)導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體；或與其它藥物抗性突變組合導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體。這些藥物抗性突變被認(rèn)為調(diào)節(jié)了HIV對(duì)某一特定藥物或一類藥物的敏感性。可用任何一種廣為人知的定點(diǎn)突變方法將突變導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用大引物PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。然后按照前面所述的表型敏感性分析方法，對(duì)帶有特定突變或一組突變的抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行的測(cè)定。測(cè)得的敏感性圖與另一野生型抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，缺乏特定突變。觀察對(duì)試驗(yàn)中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性表型發(fā)生的變化，這些變化歸因于導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體的特定突變。實(shí)施例3建立P225H基因型分析與表型敏感性的關(guān)聯(lián)性患者97-302表型分析如實(shí)施例1所述用患者97-302樣本構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者接受過大約10個(gè)月d4T、indinavir和DMP-226治療。分離病毒RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增出一段來自患者的片段。該片段包括了編碼蛋白酶全長及逆轉(zhuǎn)錄酶1-313氨基酸的病毒片段。將該片段插入帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，得到抗性試驗(yàn)載體命名為RTV-302。使用表型敏感性試驗(yàn)準(zhǔn)確而定量地測(cè)定RTV-302對(duì)一系列抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這些藥物包含所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTIs(地拉呋啶，耐呋絡(luò)平)及PRIs(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。測(cè)定每一試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢測(cè)患者病毒對(duì)每一個(gè)試驗(yàn)藥物的敏感性并與已知的敏感性模型比較。觀察到患者RTV-302對(duì)NNRTI類藥物的一種敏感性模型。在該模型中，耐呋絡(luò)平敏感性顯著降低(抗性增加)，地拉呋啶敏感性中度降低(見圖8A)。進(jìn)一步檢測(cè)患者97-302樣本找到與所觀察到敏感性模型相關(guān)的基因型變化?；颊?7-302基因型的確定使用ABI鏈終止子法自動(dòng)測(cè)定RTV-302的DNA序列。核苷酸序列同野生型分枝BHIV-1(HIV序列數(shù)據(jù)庫LosAlamos,NM)比較，找出與對(duì)照序列不同的序列。在逆轉(zhuǎn)錄酶K103N,T200A及P225H位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變。K103N與NNRTI類藥物抗性相關(guān)，使用表型敏感性試驗(yàn)已經(jīng)證明K103N突變與地拉呋啶及耐呋絡(luò)平抗性下降相關(guān)，降低程度相等。已知在HIV野生型(藥物敏感)變體之間，1135M和T200A位點(diǎn)具有序列多態(tài)性。利用定點(diǎn)突變和表型敏感性分析，鑒定P225H突變，建立225位氨基酸變化與NNRTI類藥物敏感性之間的關(guān)聯(lián)性。定點(diǎn)誘變構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體，使其帶有P225H突變，或者同時(shí)還帶有含有其它一些藥物抗性突變(K103N,Y181C)。已知這些藥物抗性突變能調(diào)節(jié)HIV對(duì)NNRTI類藥物敏感性。使用大引物PCR方法將定點(diǎn)突變導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體(SakarG和SommarSS(1994)Biotechniques8(4),404-407)。使用以前所述的表型敏感性試驗(yàn)，檢測(cè)含有P225H突變的抗性試驗(yàn)載體，并另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在225位點(diǎn)為野生型。與野生型RTV比較，NNRTI類藥物地拉呋啶的敏感性模型發(fā)生改變。P225H-RTV處于野生型背景，僅含有P225H突變時(shí)。與野生型對(duì)照RTV比較，P225H-RTV對(duì)地拉呋啶更加敏感。P225H-RTV對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性沒有顯著變化。P225H突變還導(dǎo)入到一個(gè)還含有其它突變(K103N,Y181C或K103N+Y181C)的RTV。在所有情形之下，相應(yīng)于與不帶P225H突變的RTV載體，帶有P225H突變的RTV載體對(duì)地拉呋啶抑制更加敏感(Fig.8D)。在所有情形之下，P225H突變不會(huì)顯著改變耐呋絡(luò)平敏感性(Fig.8D)。實(shí)施例4建立HIVP236L位點(diǎn)基因型與表型之間的關(guān)聯(lián)性HIV患者97-268樣本的表型分析如實(shí)施例1中所述，用患者97-268樣本構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過下列藥物治療AZT和3TC(NRTI類藥物)；indinavirhe和saquinavir(PRJ類藥物)；以及地拉呋啶(NNRTI類藥物)。治療時(shí)間在1個(gè)月到2個(gè)月之間。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生的抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-268。然后對(duì)RTV-268進(jìn)行表型試驗(yàn)，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定RTV-268對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查患者病毒對(duì)每一種試驗(yàn)藥物的敏感性，并與對(duì)照病毒的敏感性比較。觀察到患者樣本RTV-268對(duì)NNTRI類藥物的一種敏感性模型。在該模型中，病毒樣本對(duì)地拉呋啶具有抗性而對(duì)耐呋絡(luò)平不具有抗性。進(jìn)一步檢查該樣本找出敏感性模型相關(guān)的基因型變化。HIV患者97-268的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-268DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列，與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。分析該基因型找出與對(duì)照不同的序列。與對(duì)照序列比較，在逆轉(zhuǎn)錄酶如下位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變M41L,D67N,M184V,T200A,E203D,L210W,T215Y,K219Q和P236L。已知在HIV野生型(藥物抗性)變體之間，T200A和E203D處突變具有序列多態(tài)性。在M41L,D67N,L210W,T215Y和K219Q位點(diǎn)處突變與AZT抗性相關(guān)。M184V位點(diǎn)的突變與3TC抗性相關(guān)。P236L位點(diǎn)的突變與地拉呋啶抗性相關(guān)，并與耐呋絡(luò)平敏感性增加相關(guān)(Dueweke等，Ibid.)。與以前報(bào)道相反，RTV-268樣本對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性沒有改變。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，鑒定P236L突變，以建立236位氨基酸改變與表型敏感性改變之間的關(guān)聯(lián)性。定點(diǎn)突變制備抗性試驗(yàn)載體，使這些載體僅帶有P236L突變，或者還同時(shí)帶有已知與抗藥性相關(guān)的其它突變(K103N,Y181C)。已知這些與抗藥性相關(guān)突變可調(diào)節(jié)HIV-1對(duì)NNTRI類藥物的敏感性。利用大引物PCR方法，進(jìn)行定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體P236L-RTV含有P236L突變。對(duì)P236L-RTV進(jìn)行表型敏感性分析，將試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在236位點(diǎn)是野生型。試驗(yàn)結(jié)果證明P236L-RTV對(duì)NNRTI類藥物的敏感性改變了。P236L-RTV處于野生型背景，僅含有P236L突變，對(duì)地拉呋啶的敏感性不如野生型對(duì)照RTV。與Dueweke等人的報(bào)道相反，觀察到P236L突變并沒有使耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生顯著改變。P236L突變還被導(dǎo)入帶有K103N和(或)Y181C突變的RTV載體上。與相應(yīng)的不帶有P236L突變的RTV比較，在所有的情況下，帶有P236L突變的RTV對(duì)地拉呋啶都不如前者敏感(抗性更高)。在所有的情況下，P236L突變不會(huì)顯著改變耐呋絡(luò)平敏感性。實(shí)施例5建立HIVG190S位點(diǎn)基因型與敏感性表型之間的關(guān)聯(lián)性HIV患者97-644樣本的表型分析如實(shí)施例1中所述，用患者97-644樣本構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過下列藥物治療d4T(NRTI類藥物)；indinavir(PRI類藥物)；以及艾發(fā)呋瑞茲(NNRTI類藥物)。治療時(shí)間從5個(gè)月到17個(gè)月不等。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生的抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-644。然后對(duì)RTV-644進(jìn)行表型試驗(yàn)，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定RTV-644對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查患者病毒對(duì)每一種試驗(yàn)藥物的敏感性，并與一種對(duì)照病毒比較。觀察到患者樣本RTV-644對(duì)NNRTI類藥物的一種敏感性模型。在該模型中，病毒樣本對(duì)耐呋絡(luò)平具有抗性而對(duì)地拉呋啶幾乎不具有抗性。進(jìn)一步檢查該樣本找出與敏感性模型相關(guān)的基因型變化。HIV患者97-644的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-644DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列，與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。分析該基因型找出與對(duì)照不同的序列。與對(duì)照序列比較，在逆轉(zhuǎn)錄酶K101E和G190S位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變。已知在HIV野生型(藥物敏感)變體之間，位于T200A和E203D兩位點(diǎn)處的突變具有序列多態(tài)性。在L101E位點(diǎn)處突變與一些NNRTI類藥物敏感性相關(guān)，但并不是與全部NNRTI類藥物敏感性都相關(guān)。G190A突變和G190S突變均與耐呋絡(luò)平和loviride抗性相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，鑒定G190S和G190A突變，以建立190位氨基酸變化與表型敏感性變化之間的關(guān)聯(lián)性。定點(diǎn)突變構(gòu)建帶有G190S和G190A突變的抗性試驗(yàn)載體。利用大引物PCR反應(yīng)，進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體G190S-RTV帶有G190S突變，G190A-RTV帶有G190A突變。利用表型敏感性試驗(yàn)突分析G190S或G190A的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在G190位點(diǎn)為野生型。G190S-RTV和G190A-RTV對(duì)NNRTI類藥物敏感性都發(fā)生了改變。在野生型背景下，這些RTV對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性顯著低于野生型對(duì)照RTV，對(duì)地拉呋啶敏感性則稍強(qiáng)于野生型對(duì)照RTV。實(shí)施例6通過鑒定HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶中氨基酸變化預(yù)測(cè)對(duì)非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的反應(yīng)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶236位氨基酸突變的表型與基因型之間的相關(guān)性在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如下方法評(píng)價(jià)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)236位氨基酸變化引起的效應(yīng)，這些方法包括(ⅰ)收集HIV-1感染者生物樣本；(ⅱ)判斷該生物樣本中編碼HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列在密碼子236位是否發(fā)生突變；密碼子236位突變(P236L)與地拉呋啶敏感性降低相關(guān)，而耐呋絡(luò)平敏感性則沒有改變。這些生物樣本由全血和血液組分組成，包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、血清、血漿(使用不同的抗凝劑制備的血漿，例如EDTA、檸檬酸-葡萄糖、肝素)、組織活檢、腦脊液(CSF)，或者其它細(xì)胞、組織或體液。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以直接從生物樣本中分離HIV-1核酸或逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白；或者先從生物樣本中純化出病毒顆粒然后再從中分離HIV-1核酸(基因組RNA)或逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白。可以使用不同的方法分析HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶第236位密碼子是否發(fā)生突變，例如直接鑒定編碼HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒核酸或直接鑒定HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白本身?？梢岳媒?jīng)典或新型蛋白測(cè)序方法直接鑒定逆轉(zhuǎn)錄蛋白，或者利用抗體或其它特異的結(jié)合蛋白或化合物進(jìn)行表位識(shí)別，都能測(cè)定HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶第236位氨基酸。此外，還可以通過擴(kuò)增和鑒定編碼逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的HIV-1核酸序列，測(cè)定HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶第236位氨基酸。有許多方法可用來擴(kuò)增HIV-1核酸序列，這些方法包括逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)、NASBA、SDR、RCR或3SR，這些方法只要具有普通技能的技術(shù)人員就能知道。直接測(cè)定編碼HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列就可以判斷第236位密碼子是否發(fā)生突變，測(cè)定核酸序列可以用引物延伸-鏈終止法(SANGER,ABI/PEandVisibleGenetics)或鏈斷裂法(MaxamandGilbert)；或者例如飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorptoin-ionizationtimeofflight,MALDI-TOF)、質(zhì)譜(Sequenom,GeneTraceSystems)這些新近開發(fā)的測(cè)序方法。此外，也可利用各種探針雜交方法測(cè)定編碼236位氨基酸的核酸序列，例如基因芯片雜交測(cè)序技術(shù)(Affymetrix)，狹縫雜交技術(shù)(LiPA；Murex)，以及差異雜交技術(shù)(Chiron)。在本發(fā)明一個(gè)首選實(shí)施方案中，使用從生物樣本中制備的抗性試驗(yàn)載體DNA進(jìn)行敏感性表型分析，對(duì)生物樣本中HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶236位的氨基酸是野生型還是突變型進(jìn)行了測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，收集血漿樣本，純化病毒RNA并用逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)技術(shù)擴(kuò)增出一段編碼HIV-1蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域來自患者的核酸片段。經(jīng)過DNA連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化，將這段來自患者的擴(kuò)增片段摻入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，從而產(chǎn)生一個(gè)抗性試驗(yàn)載體。從細(xì)菌培養(yǎng)物分離抗性試驗(yàn)載體，并按實(shí)例1中所述進(jìn)行敏感性表型試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果與一個(gè)發(fā)生P236L突變患者樣本進(jìn)行比較。用熒光檢測(cè)鏈終止循環(huán)測(cè)序法(ABI/PE)，測(cè)定患者268樣本中HIV-1蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的核酸(DNA)序列。該方法被用來測(cè)定代表送檢樣本中混合存在的各種HIV-1變體的共有序列(代表準(zhǔn)種)。該方法也被用來測(cè)定每種變體的核酸序列?；颊邩颖镜谋硇兔舾行詧D和定點(diǎn)突變證明地拉呋啶和耐呋絡(luò)平敏感性與HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶103位，181位，或236位不發(fā)生突變相關(guān)?；颊邩颖镜谋硇兔舾行詧D和定點(diǎn)突變證明地拉呋啶敏感性的顯著降低(抗性增加)。在編碼HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶103位，181位不發(fā)生突變時(shí)，236位氨基酸L的核酸序列發(fā)生突變，與之相關(guān)的耐呋絡(luò)平敏感性卻幾乎沒有降低?；颊邩颖镜谋硇兔舾行詧D和定點(diǎn)突變證明，在逆轉(zhuǎn)錄酶103位，181位或103位+181位氨基酸出現(xiàn)突變(K103N,Y181C,或K103N+Y181C)時(shí)，236位脯氨酸并不引起delvirdine或耐呋絡(luò)平敏感性進(jìn)一步增加。然而，患者樣本的表型敏感性圖和定點(diǎn)突變證明在與NNRTI抗性相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄酶突變(K103N,Y181C，或K103N+Y181C)之外，236位L引起地拉呋啶敏感性進(jìn)一步降低(抗性增加)而對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性則幾乎沒有進(jìn)一步降低。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶225位氨基酸突變的表型與基因型之間的相關(guān)性利用患者樣本的表型敏感性圖和定點(diǎn)突變體證明，在不出現(xiàn)與NNRTI抗性相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶突變(K103N,Y181C)時(shí)，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶225位出現(xiàn)脯氨酸不會(huì)引起地拉呋啶或耐呋絡(luò)平敏感性的改變。然而，利用患者樣本的表型敏感性圖和定點(diǎn)突變體也證明，在不出現(xiàn)與NNRTI抗性相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶突變(K103N,Y181C)時(shí)，225位出現(xiàn)組氨酸引起地拉呋啶敏感性增加而耐呋絡(luò)平敏感性幾乎沒有變化。利用患者樣本的表型敏感性圖和定點(diǎn)突變體證明除了產(chǎn)生與NNRTI抗性相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶突變(K103N,Y181C或K103N+Y181C)之外，225位出現(xiàn)脯氨酸不引起地拉呋啶和耐呋絡(luò)平敏感性進(jìn)一步降低。與此相反，利用患者樣本的敏感性表型和定點(diǎn)突變體證明在逆轉(zhuǎn)錄酶出現(xiàn)與NNRTI抗性相關(guān)的突變(K103N,Y181C或K103N+Y181C)時(shí)，225位出現(xiàn)組氨酸引起地拉呋啶敏感性增加，而耐呋絡(luò)平敏感性則幾乎沒有變化。在HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶190位氨基酸突變的基因型和表型之間的關(guān)聯(lián)性利用患者樣本的表型敏感性圖和定位突變證明，在逆轉(zhuǎn)錄酶不出現(xiàn)與NNRTI類藥物抗性相關(guān)的突變(K103N,Y181C)時(shí)，如果在190位出現(xiàn)G，不引起地拉呋啶和耐呋絡(luò)平敏感性改變。利用定點(diǎn)突變體的表型敏感性圖證明，在逆轉(zhuǎn)錄酶不出現(xiàn)與NNRTI類藥物抗性相關(guān)的突變時(shí)，在190位出現(xiàn)A，將引起地拉呋啶敏感性增加，耐呋絡(luò)平敏感性降低。利用患者樣本表型敏感性圖和定點(diǎn)突變體證明，在逆轉(zhuǎn)錄酶不出現(xiàn)與NNRTI抗性相關(guān)的突變時(shí)，190位出現(xiàn)S引起地拉呋啶敏感性增加和耐呋絡(luò)平敏感性降低。實(shí)施例8利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVY181I位點(diǎn)基因型和NNRTI類藥物敏感性抗性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并分析患者HIV樣本98-964的表型如實(shí)例1所述，用患者樣本98-964構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過下列藥物的治療ddI,d4T,AZT,3TC和ddC(NRTI類藥物)；saquinavir和nelfinavir(PRI類藥物)；耐呋絡(luò)平(NNRTI類藥物)和HU。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒核酸序列。將這個(gè)片段插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，得到一個(gè)抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-964。然后對(duì)RTV-964進(jìn)行表型分析，準(zhǔn)確定量地測(cè)定其對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性。這組藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir，和saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢察抗性試驗(yàn)載體對(duì)每一種試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的藥物敏感性模型比較。觀察到患者RTV-964對(duì)NNRTI類藥物的一種敏感性模型。在此模型中，RTV-964對(duì)地拉呋啶的敏感性發(fā)生中度降低(10倍)，而對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性則顯著降低(750倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-964DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸系列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出不同于對(duì)照的序列。與對(duì)照序列相比較，在載體RTV-964中如下位置發(fā)現(xiàn)突變M41L,K43E,D67N,K70R,L74I,V75S,Y181I,R211T,T215Y,D218E和K219Q。M41L,D67N,K70R,L74I,V75S,T215Y和K219Q與NRTI類藥物抗性相關(guān)。已知在HIV的各種野生型(藥物敏感)變體之間，R211T位突變具有序列多態(tài)性。以前已經(jīng)證明Y181I與耐呋絡(luò)平高水平抗性相關(guān)。我們用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)檢查突變Y181I，建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。利用定點(diǎn)突變證明HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒敏感性(表型)中的作用利用大引物PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，將突變Y181I導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體(Sakar和Sommar,Ibid.)?？剐栽囼?yàn)載體Y181I-RTV帶有Y181I突變。按前面所述方法對(duì)Y181I-RTV進(jìn)行表型試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在181位點(diǎn)為野生型。我們?cè)赮181I-RTV載體上測(cè)定了NNRTI類藥物地拉呋啶，耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的敏感性模型。Y181I-RTV僅含有Y181I突變，處于野生型背景。與野生型對(duì)照RTV比較，地拉呋啶敏感性中度降低(20倍)，耐呋絡(luò)平敏感性顯著降低(740倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲表現(xiàn)出野生型敏感性(1.4倍)。實(shí)施例9利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVY188位點(diǎn)基因型和與NNRTI類藥物敏感性抗性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并分析患者HIV樣本97-300的表型如實(shí)例1所述，用患者樣本97-300構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過下列藥物的治療d4T和3TC(NRTI類藥物)；indinavir(PRI類藥物)；和艾發(fā)呋瑞茲(NNRTI類藥物)。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增到一段來自患者的核酸片段(PDS)。該片段包括了病毒用于編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的核酸序列。將這個(gè)片段插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，得到一個(gè)抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-300。然后對(duì)RTV-300進(jìn)行表型分析，準(zhǔn)確定量地測(cè)定其對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性。這組藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，efarenz和耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir和saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查抗性試驗(yàn)載體對(duì)每一種試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的藥物敏感性模型比較。觀察到患者RTV-300對(duì)NNRTI類藥物的一種敏感性模型。在此模型中，RTV-300對(duì)地拉呋啶的敏感性發(fā)生中度降低(25倍)，而對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性則有實(shí)質(zhì)性地降低(大于800倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子對(duì)RTV-300DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸系列，與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出與對(duì)照不同的序列。與對(duì)照序列比較，在載體RTV-300中，發(fā)現(xiàn)如下突變K32N,M184V和Y188L。M184V與3TC抗性相關(guān)。以前已經(jīng)證明突變Y188L與艾發(fā)呋瑞茲高水平抗性相關(guān)。已有報(bào)道說用數(shù)種NNRTI類藥(E-ePseU,E-EPS,HEPT，耐呋絡(luò)平，BHAP,U-8720,TIBOR82913,Loviride)治療，篩選Y188位的其它突變，即Y188C和Y188H。我們用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)檢查Y188L突變，建立基因型改變與表型之間的關(guān)聯(lián)性。利用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV中特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用使用大引物-PCR方法進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.),將突變Y188L導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體。抗性試驗(yàn)載體Y188L-RTV含有Y188L突變。應(yīng)用早先描述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)抗性試驗(yàn)載體Y188L-RTV進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在188位點(diǎn)為野生型。我們?cè)诳剐栽囼?yàn)載體Y181L-RTV上，測(cè)定NNRTI類藥物地拉呋啶，耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的表型敏感性模型。Y188L-RTV處于野生型背景下，只含有Y188L突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV，Y188L-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性有輕微降低(9倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性有實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲的敏感性有顯著降低(109倍)。對(duì)艾發(fā)呋瑞茲的敏感性降低大約100倍，這個(gè)數(shù)值沒有以前報(bào)道的那樣高。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV中特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用利用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變Y188C導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體Y188C-RTV含有Y188C突變。應(yīng)用早先描述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)Y188C-RTV進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在188位點(diǎn)為野生型。我們?cè)诳剐栽囼?yàn)載體Y188C-RTV上，測(cè)定NNRTI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的表型敏感性模型。Y188C-RTV處于野生型背景下，只含有Y188C突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,Y188C-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性有輕微降低(3倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性有中度降低(30倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性也中度降低(20倍)。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV中特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用使用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.),將突變Y188H導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體Y188H-RTV含有Y188H突變。應(yīng)用早先描述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)Y188H-RTV進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在188位點(diǎn)為野生型。我們?cè)诳剐栽囼?yàn)載體Y188H-RTV上，測(cè)定NNRTI類藥物地拉呋啶和耐呋絡(luò)平的表型敏感性模型。Y188H-RTV處于野生型背景，只含有Y188H突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,Y188H-RTV對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性有中等程度降低(3.5倍)。沒有測(cè)定對(duì)艾發(fā)呋瑞茲的敏感性。實(shí)施例10應(yīng)用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVE138和Y188位點(diǎn)基因型和與NNRTI類藥物敏感性抗性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并分析患者HIV樣本97-209的表型如實(shí)例1所述，用患者樣本97-209構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過下列藥物的治療AZT,ddI,d4T和3TC(NRTI類藥物)；indinavir(PRI類藥物)；和adefovir(NNRTI類藥物)。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增到一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒核酸序列。將這個(gè)片段插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生一個(gè)抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-209。然后對(duì)RTV-209進(jìn)行表型分析，準(zhǔn)確定量地測(cè)定其對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性。這組藥物包括了所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查抗性試驗(yàn)載體對(duì)每一種試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的藥物敏感性模型比較。觀察到患者RTV-209對(duì)NNRTI類藥物的敏感性模型。在此模型中，RTV-209對(duì)地拉呋啶的敏感性中度降低(75倍)，而對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性則有實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子對(duì)RTV-209DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出與對(duì)照不同的序列。與對(duì)照序列比較，在載體RTV-209中如下位置發(fā)現(xiàn)突變A62V,S68G,V76I,F77L,F116Y,E138A,Q151M,M184V,Y188L和E291D。在A62V,V75I,F77L,F116,Q151M和M184V這些位點(diǎn)上的突變與NRTI類藥物抗性相關(guān)。以前已經(jīng)證明E138K位點(diǎn)突變與數(shù)種NNRTI類藥物抗性相關(guān)聯(lián)，Y188L位突變與艾發(fā)呋瑞茲敏感性降低相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，我們檢查了突變Y188L和E138A，建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。利用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV中特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用使用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.),將突變E138A單獨(dú)導(dǎo)入或者與Y188L一起導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體E138A-RTV含有突變E138A，抗性試驗(yàn)載體E138A-Y188L-RTV含有E138A和Y188L兩個(gè)突變。應(yīng)用早先描述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)這兩個(gè)抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在138位點(diǎn)為野生型。我們?cè)诳剐栽囼?yàn)載體E138A-RTV,Y188L-RTV和E138A-Y188L-RTV上測(cè)定NNRTI類藥物地拉呋啶，耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的表型敏感性模型。E138A-RTV只含有E138A突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,E138A-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性處于野生型水平(1.6倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性處于野生型水平(1.3倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性處于野生型水平(1.4倍)；Y188L-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性輕微降低，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，而對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性顯著降低(110倍)；E138A-Y188L-RTV對(duì)地拉呋啶和艾發(fā)呋瑞茲的敏感性均中度降低，地拉呋啶降低75倍，艾發(fā)呋瑞茲降低88倍，對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)。與單獨(dú)突變(指E138A或Y188L單個(gè)突變)時(shí)所觀察到的效應(yīng)相比較，組合突變(指E138A和Y188L雙突變)對(duì)地拉呋啶敏感性的效應(yīng)增加了。實(shí)施例11應(yīng)用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVA98位點(diǎn)基因型和與NNRTI類藥物敏感性抗性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并分析患者HIV樣本98-675的表型如實(shí)例1所述，用患者樣本98-675構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過下列藥物的治療ddI,AZT和3TC(NRTI類藥物)；saquinavir和nelfinavir(PRJ類藥物)。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增到一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒核酸序列。將這個(gè)片段插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生一個(gè)抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-675。然后對(duì)RTV-675進(jìn)行表型分析，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定其對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組藥物包括通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，艾發(fā)呋瑞茲和耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查抗性試驗(yàn)載體對(duì)每一種試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的藥物敏感性模型比較。觀察到患者RTV-675對(duì)NNRTI類藥物的一種敏感性模型。在此模型中，觀察到RTV-675對(duì)地拉呋啶敏感性處于野生型水平(2.1倍)，而對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性則有輕微降低(6倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型利用ABI鏈終止子法對(duì)RTV-675DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列，與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出與對(duì)照不同的序列；在如下位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變M41L,S48T,L74V,A98G,M184V,T215Y。這些突變與NRTI類藥物抗性相關(guān)。以前已經(jīng)證明在A98G位點(diǎn)上的突變與耐呋絡(luò)平抗性相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外表型敏感性試驗(yàn)，我們檢查A98G突變以建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。利用定點(diǎn)突變技術(shù)證明HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用利用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變A98G導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體，產(chǎn)生帶有該突變的抗性試驗(yàn)載體A98G-RTV。應(yīng)用早先描述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)這個(gè)抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，在98位點(diǎn)為野生型。我們?cè)贏98G-RTV上測(cè)定NNTRI類藥物地拉呋啶，耐呋絡(luò)平，艾發(fā)呋瑞茲的表型敏感性模型。A98G-RTV處于野生型背景，只有A98G突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,A98G-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性輕微降低了3倍，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性輕微降低了8倍，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲輕微降低了3倍。實(shí)施例12利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVA98和G190位點(diǎn)基因型與NNTRI類藥物抗性敏感性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并分析患者BHIV樣本的表型如實(shí)施例1中所述，用患者B樣本構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。不清楚患者B所受過的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-133位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生的抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-B。從RTV-B庫中篩選出單個(gè)克隆。然后對(duì)單個(gè)克隆進(jìn)行表型試驗(yàn)，準(zhǔn)確定量地測(cè)定RTV-B單個(gè)克隆對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，艾發(fā)呋瑞茲)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體克隆上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查全部試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的敏感性模型比較。觀察到患者RTV-B克隆1對(duì)NNTRI類藥物的一種敏感性模式。在該模型中，克隆1對(duì)地拉呋啶敏感性增加了0.55倍，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(640倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性顯著降低(250倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-B克隆1DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列，與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出不同于對(duì)照的序列。與對(duì)照序列比較，在如下位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變M41L,A98G,M184V,L210W,R211,T215Y,E297A,G190S。M41L,M184V,L210W和T215Y與NRTI抗性相關(guān)。以前已經(jīng)證明在A98G位點(diǎn)的突變與耐呋絡(luò)平抗性相關(guān)。以前已經(jīng)證明在G190A位點(diǎn)的突變與耐呋絡(luò)平敏感性改變相關(guān)。對(duì)190位的其它突變，即由G突變?yōu)镋,Q和T已有報(bào)道。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，我們檢查突變A98G和G190S以建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用利用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變A98G和G190S單獨(dú)或組合導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體A98G-RTV含有A98G突變；抗性試驗(yàn)載體G190S-RTV含有G190S突變，抗性試驗(yàn)載體A98G-G190S-RTV含有A98G和G190S雙突變。應(yīng)用早先描述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)這三個(gè)帶有突變的抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，其98和190位點(diǎn)都是野生型。在這三個(gè)載體上，我們測(cè)定了NNTRI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平、艾發(fā)呋瑞茲的敏感性模型。A98G-RTV，處于野生型背景下，只含有A98G突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,A98G-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性輕微降低了3倍，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性輕微降低8倍，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性中度降低了3倍。G190S-RTV處于野生型背景下，只含有G190S突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,G190S-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性增加了0.5倍，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性中度降低(75倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微降低了8倍。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,A98G-G190S-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性增加了0.8倍，但對(duì)耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲敏感性均發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低，分別大于800倍和250倍。雖然觀察到單獨(dú)突變時(shí)艾發(fā)呋瑞茲敏感性只有輕微降低，A98G和G190S同時(shí)突變引起耐呋絡(luò)平抗性的降低卻大于兩個(gè)單獨(dú)突變抗性降低之和。實(shí)施例13利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVY181和A98位點(diǎn)基因型與NNTRI類藥物抗性敏感性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并對(duì)患者98-1057樣本進(jìn)行表型分析如實(shí)施例1中所述，用患者98-1057樣本構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過下列藥物治療ddI,d4T,AZT和3TC(NRTI類藥物)；saquinavir和indinavir(PRI類藥物)；以及地拉呋啶(NNRTI類藥物)。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-1057。然后對(duì)RTV-1057進(jìn)行表型試驗(yàn)。準(zhǔn)確而定量地測(cè)定RTV-1057對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，艾發(fā)呋瑞茲，耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查全部試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的敏感性模型比較。觀察到患者RTV-1057對(duì)NNTRI類藥物的一種敏感性模型。在該模型中，RTV-1057對(duì)地拉呋啶敏感性中度降低(35倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性顯著降低(610倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-1057DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出不同于對(duì)照的序列。與對(duì)照序列比較，在如下位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變T39A,M41L,A62V,D67E,T69SST,A98G,I135T,Y181C,T200I和T215Y。這些突變與NNRTI類藥物抗性相關(guān)。已知在HIV野生型(對(duì)藥物敏感)變體之間，I135T和T200I突變具有序列多態(tài)性。以前已經(jīng)證明在Y181C和A98G位點(diǎn)的突變與特定的NNRTI類藥物抗性相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，我們檢查了突變Y181C和A98G以建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用利用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變Y181C和A98G單獨(dú)或同時(shí)導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體。抗性試驗(yàn)載體Y181C-RTV含有Y181C突變；抗性試驗(yàn)載體A98G-RTV含有A98G突變，抗性試驗(yàn)載體Y181C-A98G-RTV含有A98G和G190S雙突變。應(yīng)用早先描述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)這三個(gè)帶有突變的抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，其181和98位點(diǎn)都是野生型。在這三個(gè)載體上，我們測(cè)定了NNTRI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平、艾發(fā)呋瑞茲的敏感性模型。Y181C-RTV只含有Y181C突變，處于野生型背景下。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,Y181C-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性中度降低(35倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性顯著降低(161倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微降低(3倍)。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV，A98G-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性輕微降低(3倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性輕微降低(8倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微降低(3倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,Y181C-A98G-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性顯著降低(240倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微降低(7倍)。這些數(shù)據(jù)說明，與Y181C和A98G單獨(dú)突變相比較，兩者同時(shí)突變引起耐呋絡(luò)平敏感性降低的效應(yīng)，大于兩個(gè)單獨(dú)突變引起抗性降低之和。實(shí)施例14利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVK101和G190位點(diǎn)基因型與NNTRI類藥物抗性敏感性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并對(duì)患者98-644和98-1060HIV樣本進(jìn)行表型分析如同實(shí)施例1中所述，用患者98-644HIV樣本構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-644。該患者以前接受過下列藥物治療d4T(NRTI類藥物)，indinavir(PRI類藥物)，以及艾發(fā)呋瑞茲(NNRTI類藥物)。如同實(shí)施例1中所述，用患者98-1060HIV樣本構(gòu)建另一抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-1060。該患者以前接受過下列藥物治療d4T(NRTI類藥物)，indinavir(PRJ類藥物)，以及艾發(fā)呋瑞茲(NNRTI類藥物)。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生的抗性試驗(yàn)載體，分別命名為RTV-644和RTV-1060。然后對(duì)RTV-644和RTV-1060進(jìn)行表型試驗(yàn)，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定它們對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查全部試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的敏感性模型比較。觀察到患者RTV-644對(duì)NNTRI類藥物的一種敏感性模型。在該模型中，RTV-644對(duì)地拉呋啶敏感性降低非常輕微(2.5倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性顯著降低(600倍)。觀察到患者RTV-1060對(duì)NNTRJ類藥物的敏感性模型。在該模型中，RTV-1060對(duì)地拉呋啶敏感性表現(xiàn)為野生型水平(1.5倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性顯著降低(900倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-1060DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出與對(duì)照不同的序列。與對(duì)照序列比較，在RTV-644中K101E和G190S位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變。與對(duì)照序列比較，在RTV-1060中如下位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變K101E,G190S,T200A和T215Y。在T215位點(diǎn)的序列是野生型和突變型混合(存在)。以前已經(jīng)證明在K101E位點(diǎn)的突變與數(shù)種NNTRI藥物抗性相關(guān)，包括對(duì)地拉呋啶的高水平抗性。以前已經(jīng)證明在G190A位點(diǎn)的突變與耐呋絡(luò)平敏感性改變相關(guān)。在G190位點(diǎn)的其它突變，即由G突變?yōu)镋、Q和T，也有報(bào)道。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，我們檢查了突變K101E和G190S，建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用利用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變K101E和G190S單獨(dú)或同時(shí)導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體K101E-RTV含有K101E突變；抗性試驗(yàn)載體G190S-RTV含有G190S突變。利用先前所述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)這兩個(gè)帶有突變的抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，其101和190位點(diǎn)都是野生型。在這兩個(gè)載體上，我們測(cè)定了NNTRI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平、艾發(fā)呋瑞茲的敏感性模型。K101E-RTV只含有K101E突變，處于野生型背景下。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV，K101E-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性輕微降低(5倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微降低(5倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性中度降低(12倍)。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,G190S-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性增加(0.5倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性中度降低(75倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微降低(7.6倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,K101E-G190S-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性處于野生型水平(1.4倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(250倍)。在這個(gè)實(shí)施例中，G190S和K101E同時(shí)突變出現(xiàn)了新的敏感性模型。觀察到G190S和K101E同時(shí)突變會(huì)逆轉(zhuǎn)G190S單獨(dú)突變對(duì)地拉呋啶敏感性的效應(yīng)，二者同時(shí)突變對(duì)耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞敏感性的影響大于其單獨(dú)突變之和。實(shí)施例15利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVV108I位點(diǎn)基因型與NNTRI類藥物敏感性抗性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并對(duì)患者98-652HIV樣本進(jìn)行表型分析如同實(shí)施例1中所述，用患者98-652HIV樣本構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-652。該患者以前未接受過抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生一個(gè)抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-652。然后對(duì)RTV-652進(jìn)行表型試驗(yàn)，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定它們對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。該組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶，耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查全部試驗(yàn)藥物的敏感性模型，與已知的敏感性模型比較。觀察到患者RTV-652對(duì)NNTRI類藥物的一種敏感性模型。在該模型中，RTV-652對(duì)地拉呋啶敏感性增加(0.97倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性輕微降低(5倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-652DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出與對(duì)照不同的序列。與對(duì)照序列比較，在RTV-644中K101E和G190S位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變。與對(duì)照序列比較，在如下位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變M41L,V108I,I135T,L210W和T215D。M41L,L210W和T215D位點(diǎn)與NRTI類藥物敏感性和抗性相關(guān)。已知在HIV野生型(藥物敏感)變體之間，1135T和R211K位點(diǎn)的突變具有序列多態(tài)性。已知V108I與數(shù)種NNRTI類藥物抗性相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，我們檢查了突變V108I以建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中所具有的作用利用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變V108I導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體V108I-RTV含有V108I突變。利用先前所述的表型試驗(yàn)方法，對(duì)抗性試驗(yàn)載體V108I-RTV進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，其108位點(diǎn)是野生型。在載體V108I-RTV上，我們測(cè)定了NNTRI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平、艾發(fā)呋瑞茲的敏感性模型?？剐栽囼?yàn)載體V108I-RTV處于野生型背景下，只含V108I突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV，V108I-RTV對(duì)地拉呋啶表現(xiàn)出野生型敏感性(1.3倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲表現(xiàn)出野生型敏感性(1.7倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性輕微降低(3倍)。實(shí)施例16利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體建立HIVK103K101和G190位點(diǎn)基因型與NNRTI類藥物敏感性抗性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并對(duì)患者98-955HIV樣本進(jìn)行表型分析如實(shí)例1中所述，用患者樣本98-955構(gòu)建了抗性試驗(yàn)載體。該患者以前接受過nelfinavir(PRI類藥物)治療。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段包括了編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒核酸。這段PDS序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生一個(gè)抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-955。然后進(jìn)行表性分析，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定RTV-955對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶、艾發(fā)呋瑞茲、saquinavir),PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢驗(yàn)RTV-955對(duì)所有試驗(yàn)藥物的敏感性模型，并與已知的敏感性模型比較。觀察到(患者)RTV-955對(duì)NNRTI類藥物的一種敏感性模型，發(fā)現(xiàn)地拉呋啶敏感性輕微降低(4倍)而耐呋絡(luò)平敏感性卻顯著降低(530倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-955DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列比較。與對(duì)照序列比較，檢查該基因型找出不同于對(duì)照的序列。在如下發(fā)現(xiàn)突變K20R,V35I,A62V,D67N,T69D,V75I,F77L,K101E,K103N,Y115F,F116Y,Q151M,I167V,Y181C,M184V,G190A,I202V,R211K,F214L,T215V和K219Q。在K101E,K103E,Y181C,G190A和F214L位點(diǎn)的突變是突變型和野生型混合(存在)。A26V,D67N,T69D,V75I,F77L,Y115F,F116Y,Q151M,M184V,T215V和K219Q與NRTI抗性相關(guān)。已知在不同HIV野生型(藥物敏感)變體之間，在V35I,R211K和F214L位點(diǎn)的突變具有序列多態(tài)性。以前已經(jīng)證明K101E突變與NNRTI類藥物抗性相關(guān)。以前已經(jīng)證明Y181I位點(diǎn)突變與耐呋絡(luò)平高水平抗性相關(guān)。以前已經(jīng)證明在K103N位點(diǎn)的突變與對(duì)地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲這三個(gè)NNRTI類藥物的抗性相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，我們檢查了K101E,J103N和G190A突變，建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證明HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用使用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變，將突變K101E,K103N和G190A單獨(dú)或組合導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體(SakerandSommar,Ibid.)?？剐栽囼?yàn)載體K101E-RTV含有K101E突變；抗性試驗(yàn)載體K0103E-RTV含有K103N突變；抗性試驗(yàn)載體G190A-RTV含有G190A突變；抗性試驗(yàn)載體K101E-G190A-RTV和抗性試驗(yàn)載體K103N-G190A-RTV分別各兩個(gè)突變。應(yīng)用早先描述的表型分析法，對(duì)這五種含有突變的抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)。將試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。此載體遺傳背景明確，在101,103,190位點(diǎn)均為野生型。我們?cè)谌?個(gè)載體上測(cè)定其對(duì)NNTRI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲表型敏感性模型。K101E-RTV處于野生型背景下，只含有K101E突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,K101E-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性輕微降低(5倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性中度降低(55倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性中度降低(30倍)。G190A-RTV處于處于野生型背景，只含有G190A突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,G190A-RTV對(duì)艾發(fā)呋瑞茲的敏感性增加8倍。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,K101E-G190A-RTV對(duì)地拉呋啶表現(xiàn)出野生型敏感性(2倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性有實(shí)質(zhì)上降低(大于800)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲的敏感性顯著降低(120倍)。向帶有G190A單突變的抗性試驗(yàn)載體中導(dǎo)入第二個(gè)突變，導(dǎo)致地拉呋啶敏感性發(fā)生逆轉(zhuǎn)。G190A突變體對(duì)地拉呋啶敏感性增加。但是向G190A導(dǎo)入K101E或K103N中兩者之中任意一種突變，就引起對(duì)地拉呋啶敏感性的輕度下降。其次，G190A和K101E同時(shí)突變引起耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲敏感性下降，下降的程度大于兩種單獨(dú)突變(所觀察)效應(yīng)之和。最后，G190A和K103N同時(shí)突變，引起對(duì)耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的敏感性都降低，降低程度大于兩種單獨(dú)突變(所觀察)效應(yīng)之和。實(shí)施例17利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVV106V189V181和F227位點(diǎn)基因型與NNTRI類藥物敏感性抗性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并對(duì)患者98-1033和98-757HIV樣本進(jìn)行表型分析正如實(shí)例1中所述，用患者樣本98-1033構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者先前接受過下列藥物的治療AZT,d4T,3TC和ddI(NRTI),saquinavir,indinavir和nelfinavir(PRIs)，耐呋絡(luò)平(NNTRI)。在另一時(shí)間采集該患者的另一份樣本98-757。如實(shí)例1中所述，用樣本98-757構(gòu)建了另一抗性試驗(yàn)載體。在8周附加治療期間，該患者接受了耐呋絡(luò)平(NNTRI),d4T(NRTI),saquinavir和nelfinavir(PRJ類藥物)這四種藥物的治療。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出一段來自患者的片段(PDS)。該片段編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生兩個(gè)抗性試驗(yàn)載體，分別記為RTV-1033,RTV-757。然后進(jìn)行表型分析，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定RTV-1033和RTV-757對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶和耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir和saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查(抗性試驗(yàn)載體)對(duì)全部試驗(yàn)藥物的敏感性模型，并與已知的敏感性模型比較。觀察到患者抗性試驗(yàn)載體RTV-1033對(duì)NNTRI類藥物的一種敏感性模型。在該模型里，地拉呋啶敏感性中度降低(30倍)，耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，艾發(fā)呋瑞茲敏感性顯著降低(200倍)。觀察到患者抗性試驗(yàn)載體RTV-757對(duì)NNTRI類藥物的敏感性模型。在該模型里，地拉呋啶敏感性輕微降低(10倍)，耐呋絡(luò)平敏感性有實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子技術(shù)對(duì)RTV-1033和RTV-757DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出與對(duì)照不同的序列。在載體RTV-1033中如下位置發(fā)現(xiàn)突變V35I,D67N,T69D,K70R,V106A,V189L,T200A,I202T,R211K,T215F,D218E,K219Q,H221Y,F227L,L228H和R284K。與對(duì)照序列相比較，在載體RTV-757中如下位置發(fā)現(xiàn)突變V35I,D67N,T69D,K70R,V106A,V108I,L109V,Y180C,V189L,T200A,I202T,R211K,T215F,D218E,K219Q,H221Y,L228H,L283I和R284K。在V106A,V108I和L109V位點(diǎn)的序列是野生型與突變型混合(存在)。D67N,T69D,K70R,T215F和K219Q與NTRI抗性相關(guān)。已知在不同HIV野生型(藥物敏感)變體之間，V35I,T200A,R211K和R284K這些位點(diǎn)的突變具有序列多態(tài)性。以前已經(jīng)證明V106A突變與耐呋絡(luò)平抗性增加相關(guān)，V189I位突變與NNRTI抗性相關(guān)。V189I位點(diǎn)處氨基酸突變?yōu)長，與NNTRI抗性相關(guān)，這一點(diǎn)以前并未報(bào)道過。以前已經(jīng)證明V108I位點(diǎn)的突變與地拉呋啶和耐呋絡(luò)平抗性增加相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)檢查V106A,V189L,V181C和F227L突變，建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證明HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用使用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變，將突變V106A,V189L,V181C,F227L單獨(dú)導(dǎo)入或組合導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體(Saker和Sommar,Ibid.)?？剐栽囼?yàn)載體V106A-RTV含有V106A突變；抗性試驗(yàn)載體V189L-RTV含有V189L突變；抗性試驗(yàn)載體Y181C-RTV含有Y181C突變；抗性試驗(yàn)載體F227L-RTV含有F227L突變；抗性試驗(yàn)載體V106A-Y181C-RTV,V106A-V189L-RTV,V106A-F227L-RTV和V181C-F227L-RTV各兩種突變。抗性突變載體V106A-Y181C-F227L-RTV含有三種突變。應(yīng)用早先描述的表型分析方法，對(duì)這九個(gè)含有突變的抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，106,189,181,227位點(diǎn)均為野生型。我們?cè)谌?個(gè)載體上測(cè)定了NNTRI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的表型敏感性模型。V106A-RTV背景為野生型，只含有V106A突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,V106A-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性輕微降低(5倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性中度降低(60倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲表現(xiàn)出野生型敏感性水平(1.7倍)。V189L-RTV背景為野生型，它只含V189L突變。相對(duì)于野生型RTV(對(duì)照)，V189L-RTV對(duì)地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲敏感性均在野生型水平，分別為1.8倍，1.3倍，1.3倍。Y181C-RTV背景為野生型，只含有Y181C突變。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,Y181C-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性顯著降低(100倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微下降(4倍)。F227L-RTV背景為野生型，只含有F227L突變。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,F227L-RTV對(duì)地拉呋啶(0.03倍)和艾發(fā)呋瑞茲(0.48倍)敏感性輕微增加，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性輕微下降(3倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微下降(4倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,V106A-Y181C-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性顯著降低(100倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微下降(4倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,V106A-V189L-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性輕微下降(3倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性中度降低(50倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲表現(xiàn)為野生型敏感性(1倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,V106A-F227L-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性輕微下降(3倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性有實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕度下降(8倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,Y181C-F227L-RTV對(duì)地拉呋啶(0.89倍)和艾發(fā)呋瑞茲(0.99倍)敏感性增加，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性顯著降低(285倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,V106A-Y181C-F227L-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性中度下降(50倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微下降(12倍)。實(shí)施例18利用抗性試驗(yàn)載體和定點(diǎn)突變體，建立HIVY188、L100和K103位點(diǎn)基因型與NNTRI類藥物敏感性抗藥性相關(guān)表型之間的關(guān)聯(lián)性制備抗性試驗(yàn)載體并分析患者HIV樣本98-1058的表型正如實(shí)例1中所述，用患者樣本98-1058構(gòu)建抗性試驗(yàn)載體。該患者先前接受過ddI,d4T,AZT,3TC,ddC和abacavir(NRTI類藥物)，indinavir和amprenavir(PRI類藥物)。分離病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增出處一段來自患者的片段(PDS)。該片段編碼蛋白酶全長和逆轉(zhuǎn)錄酶1-313位氨基酸的病毒序列。將這段序列插入一個(gè)帶有報(bào)告基因的病毒載體內(nèi)，產(chǎn)生抗性試驗(yàn)載體，命名為RTV-1058。選擇RTV-1058各個(gè)單克隆，然后進(jìn)行表型分析，準(zhǔn)確而定量地測(cè)定RTV-1058對(duì)一組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括了通常所說的NRTI類藥物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI類藥物(地拉呋啶和耐呋絡(luò)平)和PRI類藥物(indinavir,nelfinavir,ritonavir和saquinavir)。在抗性試驗(yàn)載體庫上測(cè)定每一種試驗(yàn)藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。檢查抗性試驗(yàn)載體對(duì)全部試驗(yàn)藥物的敏感性模型，并與已知的敏感性模型比較。觀察來自患者RTV-1033的三個(gè)克隆(克隆4,5,10)的敏感性模型。克隆4對(duì)地拉呋啶敏感性有顯著降低(85倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)?？寺?對(duì)地拉呋啶的敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(250倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性顯著降低(120倍)?？寺?0對(duì)地拉呋啶的敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于250倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性也發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)。測(cè)定患者HIV樣本的基因型應(yīng)用ABI鏈終止子對(duì)RTV-1058DNA自動(dòng)測(cè)序。所得核酸序列與野生型進(jìn)化枝BHIV-1(美國新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列數(shù)據(jù)庫)的共有序列作比較。檢查該基因型找出與對(duì)照不同的序列。在RTV-1033中如下位置發(fā)現(xiàn)突變M41L,A62V,D67N,T69SST,L74V,L100I,K103N,V181I,I135T,T200S,L210W,R211K和T215Y。L74V和L100I位點(diǎn)是野生型和突變型序列混合存在。克隆4含有K103N和Y188L突變。克隆5含有L100I和K103N位點(diǎn)突變?？寺?0含有L100I,K103N和Y188L突變。M41L,A62V,D67N,T69SST,L74V,L210W和T215Y與NTRI抗性相關(guān)。已知在不同HIV野生型(藥物敏感)變體之間，I135T,T200S和R211T位點(diǎn)的突變具有序列多態(tài)性。以前已經(jīng)證明L100I位點(diǎn)突變與地拉呋啶和耐呋絡(luò)平抗性相關(guān)，K103N位點(diǎn)突變與地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲抗性相關(guān)。利用定點(diǎn)突變和體外敏感性表型試驗(yàn)，我們檢查了突變Y188L,L100I和K103N，建立基因型變化與表型之間的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)證明HIV特定突變?cè)诳鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物敏感性(表型)中的作用使用大引物-PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)定點(diǎn)突變(SakerandSommar,Ibid.)，將突變Y188L,L100I和K103N單獨(dú)導(dǎo)入或組合導(dǎo)入抗性試驗(yàn)載體?？剐栽囼?yàn)載體Y188L-RTV含有Y188L突變；抗性試驗(yàn)載體L100I-RTV含有L100I突變；抗性試驗(yàn)載體K103N-RTV含有K103N突變；抗性試驗(yàn)載體K103N-Y188LRTV,L100I-K103N-RTV各含有兩種突變。抗性突變載體L100I-K103N-Y188L-RTV含有三種突變。應(yīng)用早先描述的表型分析方法，對(duì)這6個(gè)含有突變的抗性試驗(yàn)載體進(jìn)行抗性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與另一抗性試驗(yàn)載體比較。該載體遺傳背景明確，188,100和103位都是野生型。我們?cè)谌?個(gè)載體上測(cè)定了NNTRI類藥物地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的表型敏感性模型。Y188L-RTV只含有Y188L突變。相對(duì)于野生型對(duì)照RTV,Y188L-RTV對(duì)地拉呋啶的敏感性輕微降低(9倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低(大于800倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性中度降低(110倍)。L100I-RTV只含有L100I突變。相對(duì)于野生型RTV(對(duì)照)，L100I-RTV對(duì)地拉呋啶敏感性中度降低(30倍)，對(duì)艾發(fā)呋瑞茲敏感性輕微降低(10倍)，對(duì)耐呋絡(luò)平敏感性輕微降低(3倍)。K103N只含有K103N突變。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,K103N-RTV對(duì)地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲敏感性中度降低，地拉呋啶降低50倍，耐呋絡(luò)平降低55倍，艾發(fā)呋瑞茲降低30倍。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV，K103N-Y188L-RTV對(duì)地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低，地拉呋啶降低大于250倍，耐呋絡(luò)平降低大于800倍，艾發(fā)呋瑞茲降低大于250倍。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,L100I-K103N-RTV地拉呋啶和耐呋絡(luò)平發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低，地拉呋啶降低大于250倍，艾發(fā)呋瑞茲降低大于250倍，對(duì)耐呋絡(luò)平的敏感性中度降低(70倍)。相對(duì)于對(duì)照野生型RTV,L100I-K103N-Y188L-RTV對(duì)地拉呋啶，耐呋絡(luò)平和艾發(fā)呋瑞茲的敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性降低，地拉呋啶敏感性降低大于250倍，耐呋絡(luò)平降低大于800倍，艾發(fā)呋瑞茲降低大于250倍。突變按新方式組合，產(chǎn)生了出乎意料的敏感性模型。這些新模型與單個(gè)突變所具有的模型不同。權(quán)利要求1．一種評(píng)估HIV感染患者非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法有效性的方法，包括a收集感染患者血漿樣本；b檢測(cè)患者血漿樣本中是否含有在236位密碼子發(fā)生突變的編碼HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸；其中，該突變的存在與地拉呋啶敏感性降低、耐呋絡(luò)平敏感性變化很小或不改變相關(guān)。2．權(quán)利要求1的方法，其中，236位突變密碼子編碼亮氨酸。3．權(quán)利要求1的方法，其中，逆轉(zhuǎn)錄酶在103位密碼子或181位密碼子存在額外單突變，或二者同時(shí)突變。4．權(quán)利要求3的方法，其中，103位突變密碼子編碼天冬酰胺(N)，181位突變密碼子編碼半胱氨酸(C)。5．權(quán)利要求1的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。6．一種評(píng)估HIV感染患者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法有效性的方法，包括a收集HIV感染患者的生物樣本；b檢測(cè)患者的生物樣本中是否含有在225位密碼子發(fā)生突變的編碼HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列；其中，該突變的存在與地拉呋啶敏感性降低、耐呋絡(luò)平敏感性變化很小或不變化相關(guān)。7．權(quán)利要求6的方法，其中，225位突變密碼子編碼組氨酸。8．權(quán)利要求6的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。9．權(quán)利要求6的方法，其中，該逆轉(zhuǎn)錄酶在103位密碼子或181位密碼子存在額外單突變，或二者同時(shí)突變。10．一種評(píng)估HIV感染患者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法有效性的方法，包括a收集HIV感染患者的生物樣本；b檢測(cè)患者的生物樣本中是否含有在190位密碼子發(fā)生突變的編碼HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸；其中，該突變的存在與地拉呋啶敏感性的提高和耐呋絡(luò)平敏感性的降低相關(guān)。11．權(quán)利要求10的方法，其中，190位突變密碼子編碼丙氨酸或絲氨酸。12．一種評(píng)估候選抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物化合物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入一個(gè)帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該患者來源片段進(jìn)一步包括236位和103位和/或181位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。13．一種評(píng)估抗候選抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物化合物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入一個(gè)帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括225位和103位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。14．一種評(píng)估候選HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物化合物的生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入一個(gè)帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在236位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。15．一種評(píng)估候選抗HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物化合物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入一個(gè)帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在225位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。16．一種評(píng)估候選HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物化合物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入一個(gè)帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在190位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。17．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在190位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中，該報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。18．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在225位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中，該報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。19．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在236位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中，該報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。20．權(quán)利要求17的抗性試驗(yàn)載體，其中，包含有190位密碼子突變的患者來源的片段進(jìn)一步包括103位密碼子突變。21．權(quán)利要求18的抗性試驗(yàn)載體，其中，包含有225位密碼子突變的患者來源的片段進(jìn)一步包括103位密碼子突變。22．權(quán)利要求19的抗性試驗(yàn)載體，其中，包含有236位密碼子突變的患者來源的片段進(jìn)一步包括103位和/或181位密碼子突變。23．一種評(píng)估HIV感染患者非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法有效性的方法，包括a收集HIV感染患者血漿樣本。b檢測(cè)患者血漿樣本中是否含有編碼230位密碼子發(fā)生突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶；其中，突變的存在與地拉呋啶和耐呋絡(luò)平的藥物敏感性降低相關(guān)。24．權(quán)利要求23的方法，其中，230位突變密碼子編碼亮氨酸(L)。25．權(quán)利要求23的方法，其中，逆轉(zhuǎn)錄酶在181位密碼子存在額外突變，或同時(shí)突變。26．權(quán)利要求25的方法，其中，281位突變密碼子編碼半胱氨酸(C)。27．權(quán)利要求23的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。28．一種評(píng)估對(duì)HIV感染患者進(jìn)行非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的有效性的方法，包括a收集HIV感染患者血漿樣本；b檢測(cè)患者血漿樣本中是否含有編碼在181位密碼子發(fā)生突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸；其中，該突變的存在與地拉呋啶和耐呋絡(luò)平的藥物敏感性降低和艾發(fā)呋瑞茲敏感性變化很小或不變化相關(guān)。29．權(quán)利要求28的方法，其中，181位突變密碼子編碼半胱氨酸(C)。30．權(quán)利要求28的方法，其中，逆轉(zhuǎn)錄酶在98位、106位、或227位密碼子存在額外的單突變，或這些單突變的組合。31．權(quán)利要求30的方法，其中，98位突變密碼子編碼甘氨酸(G)，106位突變密碼子編碼丙氨酸(A)，227位突變密碼子編碼亮氨酸(L)。32．權(quán)利要求28的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。33．一種評(píng)估HIV感染患者非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的有效性的方法，包括a收集HIV感染患者的血漿樣本。b檢測(cè)患者的血漿樣本中是否含有編碼在188位密碼子發(fā)生突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸；其中，突變的存在與對(duì)地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)洛瑞茲藥物敏感性降低相關(guān)。34．權(quán)利要求33的方法，其中，188位突變密碼子編碼亮氨酸(L)、半胱氨酸(C)或組氨酸(H)。35．權(quán)利要求33的方法，其中，逆轉(zhuǎn)錄酶在138位、103位、或100位密碼子存在單突變，或這些突變的組合。36．權(quán)利要求35的方法，其中，138位突變密碼子編碼丙氨酸(A)，103位突變密碼子編碼天冬酰胺(N)，100位突變密碼子編碼異亮氨酸(I)。37．權(quán)利要求33的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。38．一種評(píng)估HIV感染患者非核甘類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的有效性的方法，包括a收集HIV感染患者的血漿樣本；b檢測(cè)患者的血漿樣本中是否含有編碼在190位密碼子發(fā)生突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸；其中，突變的存在與地拉呋啶敏感性提高，耐呋絡(luò)平和艾發(fā)洛瑞茲藥物敏感性降低相關(guān)。39．權(quán)利要求38的方法，其中，190位突變密碼子編碼丙氨酸(A)或絲氨酸(S)。40．權(quán)利要求38的方法，其中，逆轉(zhuǎn)錄酶在98位、101位或103位密碼子存在額外單突變或這些單突變的組合。41．權(quán)利要求40的方法，其中，98位突變密碼子編碼甘氨酸(G)，101位突變密碼子編碼谷氨酸(E)，103位突變密碼子編碼天冬酰胺(N)。42．權(quán)利要求38的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。43．一種評(píng)估HIV感染患者非核甘類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的有效性的方法，包括a收集HIV感染患者的血漿樣本；b檢測(cè)患者的血漿樣本中是否含有編碼在106位密碼子發(fā)生突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸；其中，突變的存在與地拉呋啶和耐呋絡(luò)平敏感性降低、艾發(fā)洛瑞茲敏感性變化很小或不改變相關(guān)。44．權(quán)利要求43的方法，其中，106位突變密碼子編碼丙氨酸(A)。45．權(quán)利要求43的方法，其中，逆轉(zhuǎn)錄酶在227位和189位密碼子存在額外的單突變或這些單突變的組合。46．權(quán)利要求45的方法，其中，227位突變密碼子編碼亮氨酸(L)，189位突變密碼子編碼亮氨酸(L)。47．權(quán)利要求43的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。48．一種評(píng)估HIV感染患者非核甘類逆轉(zhuǎn)錄酶抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的有效性的方法，包括a收集HIV感染患者的血漿樣本；b檢測(cè)患者的血漿樣本中是否含有編碼在103位密碼子發(fā)生突變的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸；其中，突變的存在與地拉呋啶、耐呋絡(luò)平和艾發(fā)洛瑞茲敏感性降低相關(guān)。49．權(quán)利要求48的方法，其中，103位突變密碼子編碼天冬酰胺(N)。50．權(quán)利要求48的方法，其中，逆轉(zhuǎn)錄酶在100位密碼子存在額外突變或同時(shí)突變。51．權(quán)利要求50的方法，其中，100位突變密碼子編碼異亮氨酸(I)。52．權(quán)利要求48的方法，其中，HIV感染患者正接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的治療。53．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括230位和181位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。54．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括181位和98位和/或106位和/或227位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。55．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括188位和138位和/或103位和/或100位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。56．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括190位和98位和/或101位和/或103位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。57．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括106位和227位和/或189位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。58．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括103位和100位密碼子突變；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。59．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在230位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。60．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在227位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。61．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在188位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。62．一種評(píng)估HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療侯選藥物生物有效性的方法，包括a向宿主細(xì)胞導(dǎo)入帶有一個(gè)患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段編碼在189位密碼子具有突變的逆轉(zhuǎn)錄酶；b培養(yǎng)步驟a中的宿主細(xì)胞；c檢測(cè)報(bào)告基因在靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)；d比較步驟(c)與不加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物實(shí)施步驟(a)-(c)時(shí)二者所測(cè)的報(bào)告基因表達(dá)；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中具有試驗(yàn)濃度的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒侯選藥物。63．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄酶230位密碼子突變，其中，報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。64．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄酶227位密碼子突變，其中，報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。65．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄酶188位密碼子突變，其中，報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。66．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄酶189位密碼子突變，其中，報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。67．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄酶181位、98位、106位和227位密碼子突變或這些突變的組合，其中，報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。68．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄酶106位、227位和189位密碼子突變或這些突變的組合，其中，報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。69．一種帶有一個(gè)HIV患者來源片段以及一個(gè)報(bào)告基因的抗性試驗(yàn)載體，該片段進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄酶103位和101位密碼子突變，其中，報(bào)告基因的表達(dá)依賴于患者來源片段。70．權(quán)利要求17的抗性試驗(yàn)載體，其中，在190位密碼子具有突變的患者來源的片段還包括98位和101位密碼子突變或這些突變的組合。71．權(quán)利要求63的抗性試驗(yàn)載體，其中，在230位密碼子具有突變的患者來源片段還包括181位密碼子突變。72．權(quán)利要求65的抗性試驗(yàn)載體，其中，在188位密碼子具有突變的患者來源片段進(jìn)一步包括138位、103位和190位密碼子突變或這些突變的組合。全文摘要本發(fā)明涉及用于檢測(cè)治療人類免疫缺陷型病毒(HIV)感染和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的藥物有效性的抗病毒藥物敏感性和抗性測(cè)試,本發(fā)明還涉及監(jiān)測(cè)HIV感染的臨床進(jìn)程以及對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法,特別是使用表型敏感性測(cè)試或基因型測(cè)試的非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑療法的響應(yīng)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1311823SQ99808689公開日2001年9月5日申請(qǐng)日期1999年5月26日優(yōu)先權(quán)日1998年5月26日發(fā)明者珍尼特·惠特科姆申請(qǐng)人:病毒科學(xué)公司