專利名稱：用于生產(chǎn)偶姻的方法,其適用的丙酮酸脫羧酶,以及兩者的制備,和編碼pdc基因的dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過在丙酮酸脫羧酶的存在下酶促轉(zhuǎn)化α-酮羧酸和/或乙醛(Aldehyd)而生產(chǎn)偶姻，而且包括對此適用的PDC，以及它們的制備以及其編碼基因。
偶姻即α-羥基酮是具有一個光學(xué)活性C-原子的化合物，在復(fù)雜的化合物的合成中起重要的作用，特別是(R)-(-)-苯基乙?；状?PAC)，對于簡便的黃麻素生產(chǎn)具有重大意義。此處感興趣的是R-對映異構(gòu)體，在苯甲醛存在下，借助于啤酒酵母通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化丙酮酸而形成(DE-PS 548 459，1932)。
借助于酵母細(xì)胞合成PAC，其基礎(chǔ)是大量的現(xiàn)有酵母中多種酶的副產(chǎn)物，其細(xì)胞生長在苯甲醛的存在下被抑制。
從酵母中分離的丙酮酸脫羧酶還用于PAC異構(gòu)體2-羥基乙基苯基酮的大份額的轉(zhuǎn)化。
焦磷酸硫胺素和Mg2+依賴PDC是廣泛分布的，發(fā)現(xiàn)于多種植物，酵母和真菌，以及一些細(xì)菌中。它催化從丙酮酸到乙醛的非氧化性脫羧作用，在α-羥基酮形成時，作為副反應(yīng)接著發(fā)生了偶姻縮合，如由

圖1所顯而易見的。
這樣的酶促轉(zhuǎn)化甚至可以從位于α-酮羧酸上的醛出發(fā)而完成，甚至通過脫羧作用形成的醛，亦作為“共底物”，參與R＝R′的同聚偶姻R-CHOH-CO-R′的形成的縮合反應(yīng)。
已經(jīng)從運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中分離了PDC。然而有關(guān)從酵母中分離的PDC與從運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中分離的PDC在相似的條件下PAC的形成比較表明來源于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的合成能力明顯地微弱(S.Bringer-Meyer和H.Sahm，生物催化1(1988)321-331頁)。
目前令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過對來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的PDC基因的有目的的基因工程改變會獲得其有提高的形成PAC的合成能力，該改變的基因以與生成2-羥基乙基苯基酮相比具有高度選擇性地生成PAC而見稱。
開始時提及的技術(shù)的本發(fā)明的方法的基本特征在于，所使用的PDC酶，在通往其活性中心的引導(dǎo)底物通路上的色氨酸殘基被一個空間上較小的氨基酸殘基取代。
空間上較小的氨基酸涉及簡單的，尤其是脂族氨基酸，如丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，精氨酸或組氨酸或以及絲氨酸和蘇氨酸。
通過將來自于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的PDC基因的DNA序列的1174-1176位的編碼392位色氨酸的密碼子TCG用公知的方式進(jìn)行改變將PDC在生產(chǎn)生物體(例如特別是大腸桿菌)中表達(dá)，并由此分離PDC，從而獲得基因工程改變的新的PDC該有目的的突變例如借助于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用第9頁中表述的引物完成。用于該突變PDC的表達(dá)載體pBTac2從野生型酶的大腸桿菌表達(dá)載體pPDC構(gòu)建。
從粗提物中收獲和增溶細(xì)胞，以公知的方式通過色譜法回收突變PDC。
PDC通過本發(fā)明的改變，其關(guān)于因子4的PAC合成能力提高。這種提高是由這種有目的的改變引起的，換言之，是由取消了在通往酶的活性中心引導(dǎo)底物通道上的限制而引起的，因而體積龐大的底物分子進(jìn)入活性中心和生成產(chǎn)物的離去都變得容易起來。
在獲得焦磷酸硫胺素依賴性酶的情形之下，亦常見一類似的優(yōu)化過程，這些酶在其通往酶活中心的引導(dǎo)底物通道上顯示了進(jìn)入限制-這種進(jìn)入限制是以立體的或通過電荷影響的限制性方式通以將編碼該酶的DNA序列進(jìn)行類似的改變，確切地說，通過將編碼進(jìn)入限制的密碼子用一個用于編碼取消了進(jìn)入限制的氨基酸殘基置換，致使該酶的合成能力極大提高。
根據(jù)本發(fā)明的出發(fā)點建立的目標(biāo)，如此獲得的PDC是用于為了大量的需求而進(jìn)行的PAC合成，因此將獲得R-(-)-對映異構(gòu)體的高光學(xué)的純度(＞＞98％)和僅伴有低百分比2-羥基-乙基苯基酮的PAC。該酶從合適的微生物體的回收和分離可以采用相對簡單的方法(以酵母中常見的)。
當(dāng)借助于PDC進(jìn)行酶促偶姻縮合時，作為底物可使用線性和/或分支α-酮羧酸，且作為底物和/或共底物可使用芳香族，環(huán)化，長鏈和/或分支醛。例如在此可例舉苯甲醛，環(huán)己醛，糖醛，肉桂醛，冠醛，丙酮酸，2-酮丁酸，2-酮戊酸，2-酮-4-甲基己酸，2-酮-4-甲基戊酸，2-酮-4，4-二甲基己酸，3-苯基-2-酮-丙酸。
本發(fā)明的其他優(yōu)點在權(quán)利要求和下述實施方案詳盡描述中展示。援引以下幾幅附圖圖1例舉丙酮酸和苯甲醛作為底物和輔助底物借助于脫羧基作用主要途徑和羰基連接酶(Carboligase)-副反應(yīng)以生成PAC的PDC反應(yīng)圖解。
圖2含有來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的PDC的表達(dá)載體pPDC的構(gòu)建圖解，和圖3通過借助于乙醇脫氫酶進(jìn)行乙醛分離，使它照圖1的PAC的生產(chǎn)最優(yōu)化的圖解。
實施例1.PDC突變體PDC-N392A的生產(chǎn)1.1表達(dá)載體pPDC的構(gòu)建為表達(dá)來自于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的PDC將選用載體pBTac2(Boehringer，Mannheim)。外源基因的轉(zhuǎn)錄處于強(qiáng)的tac啟動子的控制之下，該啟動子是源自trp-和lac UV-啟動子的雜種分子，具有其母體啟動子的11倍及3倍的效率。操縱基因序列和核糖體結(jié)合區(qū)來自lacZ基因。因而轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通過過表達(dá)的細(xì)菌來源的lac-阻遏物完成，而且是異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)的。該載體含有一個單一的限制性內(nèi)切核酸酶EcoRl的識別位點，其后跟隨有起始密碼子ATG和緊接而來的其他限制性酶識別序列(位點)，因而該載體不僅普遍用于基因序列的表達(dá)，而且無需插入一個起始密碼子。
多克隆位點緊隨強(qiáng)核糖體RNA轉(zhuǎn)錄終止子(rrnB)之后，以保證轉(zhuǎn)錄的被控制地中止。作為用于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(ATCC29191)PDC基因的克隆的出發(fā)材料，可指定使用載體pZY134B(G.Sprenger，Instf.生物技術(shù)2，KFA-Julich)。這個質(zhì)粒含有一個3.2kb大小的來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的片段，帶有全長的PDC基因，包括非編碼區(qū)(圖2)。為了在表達(dá)載體中編碼序列的連接成為可能，必要時，在起始密碼子的5′方向引入一個新的限制性酶識別序列。該載體的Shine-Dalgarno序列的起始密碼子的最適距離保證了該基因連接到pBTac 2-載體的EcoRI位點上。一種便利簡單的修飾DNA序列的方法是對其進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。將DNA雙鏈進(jìn)行多輪熱變性和通過熱穩(wěn)定DNA聚合酶進(jìn)行多輪酶促合成，使確定的DNA片段的指數(shù)擴(kuò)增成為可能。產(chǎn)物的大小和一致性取決于合成的出發(fā)點(引物)。該引物含有出發(fā)序列的一種修飾，比如突變，缺失或添加殘基(插入)，因此在合成的片段中，這種修飾也是現(xiàn)有的。
借助于這種方法，可在PDC基因的起始密碼子的5′方向引入必需的EcoRI限制性位點，這時，寡核苷酸合成連接在該酶的識別序列的與基因互補(bǔ)的引物的5末端上。因為一些內(nèi)切核酸酶對于限制性末端穩(wěn)定序列表現(xiàn)出強(qiáng)烈減低的活性，在EcoRI一位點的上游添加幾個其他的堿基。
用于PCR的多數(shù)Taq聚合酶不具有3′-5′-外切核酸酶活性(proof-reading)。其合成序列因此為統(tǒng)計學(xué)上的錯誤率所累。甚至通過選擇合適的反應(yīng)條件使之僅有1/100,000的極其微弱的概率，為保障合成的完美性，決定了測序任一片段的必要性。因而為了擴(kuò)增選擇的不是PDC基因的完整的編碼區(qū)，而是一較小的片段(890bp)從5′末端至一個單一性限制性位點(EcoRV)。
PCR產(chǎn)物可用相應(yīng)的限制內(nèi)切酶EcoRI和E.coRV消化。
PDC基因的缺少的第二個部分通過從質(zhì)粒pIY134B用ECoRV和BamHI限制性酶切而獲得，這時如此獲得片段(1.2kb)含有在PDC-基因3末端的大約350bp的非翻譯序列。兩個片段通過制備性瓊脂糖凝膠電泳分開，分離與用EcoRI和BamHI線性化，分離的pBTac2(4.6kb)連接。該克隆即在Ecoli JM109中繼續(xù)進(jìn)行，該菌株是lac阻遏物過表達(dá)菌株。1.2分子生物學(xué)操作為獲得通過于392位色氨酸/丙氨酸突變的PDC，首先將野生型酶現(xiàn)有的密碼子TGG(色氧酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镚CG(丙氨酸)(來源于運(yùn)動發(fā)酵單孢菌的丙酮酸脫羧酶基因的1174-1176位的改變)。有目標(biāo)的突變的實施借助于Ho等人描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法而完成(S.N.Ho，H.D.Hunt.R.M.Horton，J.K.Pullen，L.R.Pease，基因77(1989)51頁)。
作為起點，可采用在E.coli表達(dá)載體pPDC中的來自于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的PDC基因(見圖2)。按標(biāo)準(zhǔn)方法完成DNA分離(J.Sambroch，E.F.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆(1989)冷泉港實驗室出版社)。
質(zhì)粒pPDC用作合成兩個重疊單一片段的模板。引物(按照附錄的引物序列)以0.2-0.4nM的濃度使用。反應(yīng)借助于Taq聚合酶(Biomaster，koln)在生產(chǎn)商推薦的連同1.5mM MgCl2和一般是0.2mM核苷酸反應(yīng)緩沖液中，于″Robo-Cycler″(Stratgene)中，以下述溫度程序進(jìn)行2.5分鐘，94℃變性，隨后是30輪循環(huán)94℃變性1.5分鐘，于48℃退火1.2分鐘，72℃延伸2分鐘，隨后于72℃，10分鐘以完成該反應(yīng)。退火溫度在48℃和56℃之間變動，這視所采用引物的理論熔點而定。寡核苷酸的熔點按下式計算Tm＝2×(A+T)+3×(C+G)片段通過電泳分開并分離，用乙醇沉淀濃縮，再次溶于Tris·HCl·10mM，pH7.4緩沖液中。
在第二種組合的PCR中，使用大約50-100ng的重疊片段以用作模板。其他的反應(yīng)條件與第一輪反應(yīng)一致。退以溫度的選擇用生成片段的重疊區(qū)的熔點校定。用突變片段在表達(dá)載體pPDC中替代野生型DNA的其他操作(限制性酶切，分離，連接)接標(biāo)準(zhǔn)方法完成(J.Sambrock，E.F，F(xiàn)ritsch，T.Maniatis，分子克隆(1989)冷泉港實驗室出版社)。所用引物的序列編號將PDC序列的5’核苷酸定為1。s＝有義as＝反義突變堿基下面劃線用于合成5’-單個片段的引物· PDC867sCTACTCCACCACTGGTTGGACG· PDC1186asGAGGATTGAAGGAGAGTCACC用于合成3’-單個片段的引物· PDC1159sGAAACCGGTGACTCTGCGTTCAATGC· PBTAC453asATCTTCTCTCATCCGCCAAACA(該引物與緊鄰PDC序列之后的3’末端的載體序列互補(bǔ))用于合成融合片段的引物· PDC867sCTACTCCACCACTGGTTGGAGG· PBTAC453asATCTTCTCTATCCGCCAAACA(該引物與緊鄰PDC序列之后的3’末端的載體序列互補(bǔ))ATGAGTTATA CTGTCGGTAC CTATTTAGCG GAGCGGCTTG TCCAGATTGGTCTCAAGCAT CACTTCGCAG TCGCGGGCGA CTACAACCTC GTCCTTCTTGACAACCTGCT TTTGAACAAA AACATGGAGC AGGTTTATTG CTGTAACGAACTGAACTGCG GTTTCAGTGC AGAAGGTTAT GCTCGTGCCA AAGGCGCAGCAGCAGCCGTC GTTACCTACA GCGTTGGTGC GCTTTCCGCA TTTGATGCTATCGGTGGCGC CTATGCAGAA AACCTTCCGG TTATCCTGAT CTCCGGTGCTCCGAACAACA ACGACCACGC TGCTGGTCAT GTGTTGCATC ACGCTCTTGGCAAAACCGAC TATCACTATC AGTTGGAAAT GGCCAAGAAC ATCACGGCCGCCGCTGAAGC GATTTACACC CCGGAAGAAG CTCCGGCTAA AATCGATCACGTGATCAAAA CTGCTCTTCG CGAGAAGAAG CCGGTTTATC TCGAAATCGCTTGCAACATT GCTTCCATGC CCTGCGCCGC TCCTGGACCG GCAAGTGCATTGTTCAATGA CGAAGCCAGC GACGAAGCAT CCTTGAATGC AGCGGTTGACGAAACCCTGA AATTCATCGC CAACCGCGAC AAAGTTGCCG TCCTCGTCGGCAGCAAGCTG CGCGCTGCTG GTGCTGAAGA AGCTGCTGTT AAATTCACCGACGCTTTGGG CGGTGCAGTG GCTACTATGG CTGCTGCCAA GAGCTTCTTCCCAGAAGAAA ATGCCAATTA CATTGGTACC TCATGGGGCG AAGTCAGCTATCCGGGCGTT GAAAAGACGA TGAAAGAAGC CGATGCGGTT ATCGCTCTGGCTCCTGTCTT CAACGACTAC TCCACCACTG GTTGGACGGA TATCCCTGATCCTAAGAAAC TGGTTCTCGC TGAACCGCGT TCTGTCGTTG TCAACGGCATTCGCTTCCCC AGCGTTCATC TGAAAGACTA TCTGACCCGT TTGGCTCAGAAAGTTTCCAA GAAAACCGGT TCTTTGGACT TCTTCAAATC CCTCAATGCAGGTGAACTGA AGAAAGCCGC TCCGGCTGAT CCGAGTGCTC CGTTGGTCAACGCAGAAATC GCCCGTCAGG TCGAAGCTCT TCTGACCCCG AACACGACGGTTATTGCTGA AACCGGTGAC TCTTGGTTCA ATGCTCAGCG CATGAAGCTCCCGAACGGTG CTCGCGTTGA ATATGAAATG CAGTGGGGTC ACATTGGTTGGTCCGTTCCT GCCGCCTTCG GTTATGCCGT CGGTGCTCCG GAACGTCGCAACATCCTCAT GGTTGGTGAT GGTTCCTTCC AGCTGACGGC TCAGGAAGTTGCTCAGATGG TTCGCCTGAA ACTGCCGGTT ATCATCTTCT TGATCAATAACTATGGTTAC ACCATCGAAG TTATGATCCA TGATGGTCCG TACAACAACATCAAGAACTG GGATTATGCC GGTCTGATGG AAGTGTTCAA CGGTAACGGTGGTTATGACA GCGGTGCTGC TAAAGGCCTG AAGGCTAAAA CCGGTGGCGAACTGGCAGAA GCTATCAAGG TTGCTCTGGC AAACACCGAC GGCCCAACCCTGATCGAATG CTTCATCGGT CGTGAAGACT GCACTGAAGA ATTGGTCAAATGGGGTAAGC GCGTTGCTGC CGCCAACAGC CGTAAGCCTG TTAACAAGCTCCTCTAG1.2表達(dá)和純化通過在E.coli細(xì)胞中表達(dá)修飾的DNA將獲得本發(fā)明的酶(PDC-W392A)。突變酶(突變體)PDC-W392A按下述步驟進(jìn)行實驗，從細(xì)胞提取物中純化載有突變體PDC-W392A的表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞在含有用于選擇的100ng/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵。該培養(yǎng)基用處于穩(wěn)定長期的預(yù)培養(yǎng)物以1∶50的比例接種，于37℃，220rpm溫孵。
當(dāng)OD600為0.6時，通過加入1mM IPTG而誘導(dǎo)表達(dá)。在這種條件下，PDC-突變體在E.coli中過表達(dá)20％可溶性蛋白質(zhì)。
為產(chǎn)生足夠的酶量，該表達(dá)如上所述在8升罐中進(jìn)行。將pH值調(diào)至7.0，將通風(fēng)量調(diào)至10l/h。攪拌速度為200rpm。為避免過快的泡沫形成按需要加入丙二醇。細(xì)胞在表達(dá)3小時之后，通過gekuhlte持續(xù)離心而收獲。
增溶通過用玻璃珠研磨而完成。對此將制備在50mM，pH6.5Mes/KOH緩沖液(含有5mM MgCl2和0.1mM)ThDP中的30％細(xì)胞懸液，并加入兩倍體積的玻璃珠。取決于待處理的體積，增溶在Eppendorf管內(nèi)在Retsch-Muhle或在Disintegrator S(最大體積80ml)中冰浴(eisgekuhlen)進(jìn)行。研磨超過10分鐘時收率最大。離心懸液，用緩沖液洗玻璃珠。過濾合并的離心液(1um)。如下進(jìn)行PDC突變體的純化柱層析1.陰離子交換層析應(yīng)用Fa.Pharmacia的FPLC設(shè)備，將粗提物(大約110ml，約1.0-1.5g蛋白質(zhì))以3ml/mn速度上Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)(2.6×9.5cm)柱。通過設(shè)置在10mM Mes/KOH，pH6.5，2mM MgCl2，0.1mM ThDP中的NaCl(梯度(0-200mM)，在100mM NaCl時洗脫酶。含有目的蛋白質(zhì)的級分通過活性試驗(見下文)而確定。
2.疏水相互作用層析通過加入1體積的飽和硫酸銨溶液，將合并的級分施加50％飽和的硫酸銨含量。疏水互相作用層析在丁基-瓊脂糖(Pharmacia)(5×8cm柱)上進(jìn)行，洗脫速度是2ml/mn。在上樣之前柱材料預(yù)先用在50mMMes/KOH，2mM MgCl2，0.1mM ThDP中的40％硫酸銨平衡。用同樣的、具有下降硫銨酸銨梯度(40-0％)的緩沖液，在24％時洗脫該酶。目標(biāo)級分進(jìn)一步借助于活性測試鑒定和合并。
3.通過Sephadex G25而脫鹽，將緩沖液轉(zhuǎn)換(Umpnffern)為50mMMes/KOH，2mM MgCl2，0.1mM ThDP。流出速度為20ml/mn。隨即進(jìn)行冷凍干燥。1.3活性測試(脫羧基反應(yīng))酶活性的測試將通過偶聯(lián)酶促試驗完成，在此通過來源于酵母的輔助酶乙醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1)監(jiān)測可光度測量的NADH-氧化。反應(yīng)混合物中含有16.9mM丙酮酸，0.18M NADH和10UADH，以上物質(zhì)溶于50mM Mes/KOH，pH6.5，20mM MgSO4，1.5mMThDP。PDC的一個酶單位相應(yīng)于在30℃1分鐘內(nèi)催化/n/mel底物轉(zhuǎn)化的酶量。酶活如下計算ΔE/mn×VC(U/ml)＝ ×5ε×d×vε(NADH)＝6.31×mMol-1×cm-1V＝總體積v＝樣品體積d＝比色杯層厚度(Schichtdicke der Kuvette)(1cm)ΔE/min＝每分鐘消光減少f＝樣品稀釋系數(shù)2.PDC-W392A在PAC合成中的應(yīng)用可以從作為底物的α-酮羧酸例如乙醛，和作為共底物的另一種醛出發(fā)，借助于PDC或PDC突變體，獲得手性偶姻。例如下列應(yīng)用中所提及的從丙酮酸和苯甲醛出發(fā)，進(jìn)行PAC合成反應(yīng)混合物中含有溶于Mes/KOH-緩沖液，50mM pH6.5，20mM MgSO4，1.5mM ThDP中的40mM丙酮酸，70mM苯甲醛和10U/ml PDC-W392A。反應(yīng)在37℃進(jìn)行1小時，用HDLC檢測生成的PAC(6.2mM)。從乙醛和苯甲醛出發(fā)，進(jìn)行PAC合成PAC合成混合物中含有替代丙酮酸的40mM乙醛。其余的則如上述進(jìn)行。1小時后生成3.7mM PAC.。在偶聯(lián)3酶體系中，用PDC-W302A進(jìn)行PAC合成按照圖3進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)換。來自于酵母的乙醇脫氫酶(ADH)的使得乙醛的持續(xù)清除和因而部分失活PDC-W392A成為可能。來自于Candida boidinii的甲酸鹽脫氫酶(Formiat-dehydrogenase)(FDH)(E.C.1.2.1.2)用于再生NADH。酶促PAC合成在20mlMes/KOH緩沖液，50mM，pH6.5，20mM MgSO4，1.5mM THDP中進(jìn)行。
混合物中含有1.3U/ml PDC-W392A，2U/ml ADH，2.5U/ml FDH。丙酮酸起始濃度校定為70mM。該混合物還含有2mM NADH和200mM甲酸鹽。120分鐘后，補(bǔ)加0.7ml 2.1M丙酮酸溶液和0.125ml 8M甲酸鈉溶液。
用甲酸滴定由酶促轉(zhuǎn)化引起的pH升高。7小時后獲得6.8mMPAC。酶促反應(yīng)產(chǎn)物的處理和分析反應(yīng)產(chǎn)物的拆分借助于制備型反相HPLC完成。用C8-MOSHypersil-Saule，250×4.6mM作穩(wěn)定相。洗脫在isokratisch條件下，用冰乙酸/乙腈0.5％/12.5％(v/v)，流速為1.5ml/分。在該條件下洗脫時間是PAC，4.77分，2-羥基乙基苯基甲酮，5.41分。作為R-(-)PAC的獲得的對映異構(gòu)體的配置(Zuo dnung)借助于按照PAC產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行極性測量而完成。
借助于性氣相色譜測定PAC異構(gòu)件含量＞＞98％。
權(quán)利要求
1.一種用于獲得一種用于以＞95％對映異構(gòu)體單位產(chǎn)生(R)-(-)苯基乙?；状?I)，且(I)/2-羥基乙基苯基甲醇的產(chǎn)物比率＞95％的丙酮酸脫羧酶(PDC)的方法，這種丙酮酸脫羧酶具有關(guān)于苯基乙酰基甲醇生成的比活＞1U/mg，通過從生產(chǎn)生物體中分離而獲得，其特征在于應(yīng)用了一種具有來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的編碼丙酮酸脫羧酶的基因的生產(chǎn)生物體，在其DNA序列的1174-1176位編碼色氨酸殘基的密碼子TGG被編碼具有減小的體積(Raumerfullung)的氨基酸殘基的密碼子替代。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，密碼子TGG被編碼一個簡單氨基酸殘基的密碼子替代。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，密碼子TGG被編碼一個脂族氨基酸殘基的密碼子替代。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，密碼子TGG被編碼丙氨酸殘基的密碼子替代。
5.一種丙酮酸脫羧酶，能夠在苯甲醛存在時將丙酮酸轉(zhuǎn)化成具有＞95％對映異構(gòu)體單位的(R)-(-)苯基乙?；状?，且(I)/2-羥基乙基苯基甲酮的產(chǎn)物比率＞95％，該酶關(guān)于產(chǎn)物形成的比活＞1U/mg，可以按照權(quán)利要求1至3獲得，在其392位的色氨酸殘基被尺寸較小的氨基酸殘基替代。
6.權(quán)利要求5的丙酮酸脫羧酶，其特征在于在392位的色氨酸殘基被丙氨酸殘基替代。
7.用于在PDC存在時通過酶促偶姻縮合α-酮羧酸和/或乙醛而酶促生成偶姻的方法，其特征在于，作為PDC應(yīng)用權(quán)利要求5或6的酶。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于出自α-酮羧酸的偶姻縮合，在同時借助于乙醇脫氫酶和NADH而還原過量的、由脫羧基而形成的乙醛的情況下進(jìn)行。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于當(dāng)轉(zhuǎn)化時形成的NAD，在原位通過甲酸鹽脫氫酶再生成NADH。
10.在通往活性中心的引導(dǎo)底物通路上具有進(jìn)入限制的硫胺素焦磷酸鹽依賴性酶的基因的DNA序列，其特征在于在編碼進(jìn)入限制的密碼子的位置上引入了一個編碼清除了進(jìn)入限制的氨基酸殘基的密碼子。
11.權(quán)利要求10的DNA序列，其特征在于，來自于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的PDC基因的DNA序列在其1174-1176位上具有編碼較小尺寸的氨基酸殘基的密碼子。
12.權(quán)利要求11的DNA序列，其特征在于，在其1174-1176位具有編碼脂族氨基酸殘基的密碼子。
13.權(quán)利要求12的DNA序列，其特征在于在其1174-1176位具有編碼丙氨酸殘基的密碼子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于從生產(chǎn)生物體分離而獲得丙酮酸脫羧酶的方法,該丙酮酸脫羧酶具有以>95%對映異構(gòu)體單位產(chǎn)生(R)－(－)苯基乙?；状?且(Ⅰ)/2－羥基乙基苯基甲酮的產(chǎn)物比率>95%的能力。另外,丙酮酸脫羧酶關(guān)于苯基乙?；状忌傻谋然钍?U/mg。本發(fā)明的目的是,獲得一種具有提高的關(guān)于(R)－(－)－苯基乙?；状夹纬傻暮铣赡芰Φ谋崦擊让?。為此目的而形成的本發(fā)明的方法的特征在于:應(yīng)用了一種具有來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的編碼丙酮酸脫羧酶的基因的生產(chǎn)生物體,在其DNA序列的1174—1176位編碼色氨酸殘基的密碼子TGG被編碼具有減小的體積(Raumerfullung)的氨基酸殘基的密碼子替代。
文檔編號C12P7/26GK1192244SQ96195936
公開日1998年9月2日 申請日期1996年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月26日
發(fā)明者H·布魯恩, M·波爾, K·梅斯赫, M·R·庫拉 申請人:于利奇研究中心有限公司