專利名稱：羥苯丙酮酸雙加氧酶基因的dna序列以及含有羥苯丙酮酸雙加氧酶基因的抗特定除草劑 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)基因，一個含有此作為編碼序列的此基因的嵌合基因及把它用于獲得抗特定除草劑的植物。
特定的除草劑已經(jīng)公開，例如特別是描述于法國專利申請95 06800和95 13570中的異噁唑，并且尤其是氟異噁唑(isoxaflutole)，一種選擇性玉米除草劑，例如那些描述于歐洲專利申請0 496 630，0 496 631中的二酮腈(diketonitriles)，特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3-苯基)丙烷-1，3-二酮[2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2CH3-4-CF3-phenyl)propane-1，3-dione]和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-2，3-Cl2苯基)丙烷-1，3-二酮[2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2CH3-4-2，3-Cl2phenyl)propane-1，3-dione]，描述于歐洲專利申請0 625 505和0 625 508中的三酮，特別是硫三酮(sulcotrione)。但是，并沒有記述對這些除草劑的耐受性基因。
羥基苯丙酮酸雙加氧酶是一種催化對羥基苯丙酮酸到尿黑酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶。
此外，描述了來源于假單胞菌菌株P(guān).J.874(Pseudomonas sp.P.J.874)的羥基苯丙酮酸雙加氧酶的氨基酸序列，但并未描述它在植物對除草劑耐受性方面的作用(Ruetschi等，“歐洲生物化學(xué)雜志”(Eur.J.Biochem.)205，459-466，1992)。本文沒有給出編碼此蛋白的基因的描述。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種基因的序列，并且一旦插入到植物細(xì)胞中，此類序列便能在植物中產(chǎn)生過量表達(dá)或HPPD的激活，給后者以很好的對特定的新除草劑，例如那些異噁唑族或三酮類除草劑的耐受性。
本發(fā)明的一個目的是一種分離的非人類來源的和非海洋細(xì)菌來源的基因的，或者一種植物基因的DNA序列，或者一種能與此分離的序列雜交的序列，特征在于它表達(dá)羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)。
更特殊地，此序列可以是細(xì)菌來源，例如特別是假單胞菌屬或者是植物來源，例如特別是單子葉或雙子葉植物，特別是擬南芥屬(Arabidopsis)或者傘形科，例如，舉例為胡蘿卜(野胡蘿卜(Daucus carotta))。它可以是天然的或野生型的或可能是突變的但同時基本保持對HPPD抑制劑的耐除草劑性，例如異噁唑族或三酮類除草劑。
發(fā)明也涉及分離上述基因的流程，其特征在于-從HPPD氨基酸序列中選擇一些寡聚核苷酸作為引物-從這些引物出發(fā)，通過PCR合成擴(kuò)增片段-通過構(gòu)建并篩選基因組庫分離該基因以及-克隆該基因優(yōu)選地使用來自假單胞菌屬細(xì)菌HPPD序列的引物。特別優(yōu)選地，它們來源于熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
本發(fā)明也涉及編碼HPPD的基因在轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)流程中的應(yīng)用，可以用作標(biāo)記基因或用作編碼序列提供給植物對特定除草劑的耐受性。它也可以與其它標(biāo)記基因和/或編碼序列聯(lián)合，用作一種農(nóng)學(xué)性質(zhì)。
編碼基因可以是任何來源，天然的或野生型的或可能是突變的，但同時基本保留對HPPD抑制劑的除草劑耐受性的屬性，例如異噁唑家族或三酮類除草劑。可以用作編碼序列，特別是可以使用那些依據(jù)本發(fā)明的例如上述的編碼基因。
植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可通過任何合適的已知方法完成。一序列的方法在于用偶合有DNA序列的微粒轟擊細(xì)胞或原生質(zhì)體。
另一序列的方法在于使用插入到根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根病土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri質(zhì)粒中的嵌合基因作為轉(zhuǎn)移到植物中的工具。
本發(fā)明的另一個目的物也是嵌合基因，它在轉(zhuǎn)錄方向上包括至少一個啟動子調(diào)節(jié)序列，一個表達(dá)羥基苯丙酮酸雙加氧酶的異源編碼序列以及至少一個終止子或聚腺苷酸化調(diào)節(jié)序列。
使用的啟動子調(diào)節(jié)序列可以是在植物中天然表達(dá)基因的任何啟動子序列，特別是來源于細(xì)菌，病毒或植物的啟動子，諸如例如來自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶(RuBisCO)小亞單位基因或α-微管蛋白基因(歐洲專利申請EPNo.0 652 286)，或者來源于植物病毒基因，諸如例為來自花椰菜花葉病毒(CAMV19S或35S)，但任何合適的啟動子均可使用。優(yōu)選地借助于促進(jìn)編碼序列過量表達(dá)的啟動子調(diào)節(jié)序列，諸如例為包括至少一種例如描述于歐洲專利申請EP 0507698中的組蛋白啟動子。
依據(jù)本發(fā)明，同樣可能與啟動子調(diào)節(jié)序列聯(lián)合使用其它位于啟動子和編碼序列之間的調(diào)節(jié)序列，例如“增強(qiáng)子”轉(zhuǎn)錄激活物，諸如例為描述于申請WO 87/07644中的煙草蝕紋病毒(TEV)翻譯激活物，或者來源于單或雙轉(zhuǎn)運肽，并且在這一情況下可能被一中間序列隔開，也就是說，在轉(zhuǎn)錄方向上包括編碼質(zhì)體定位酶的某植物基因的編碼轉(zhuǎn)運肽的序列，編碼質(zhì)體定位酶的某植物基因的N-末端成熟部分的部分序列，然后是編碼質(zhì)體定位酶的某植物基因的編碼第二個轉(zhuǎn)運肽的序列，由編碼質(zhì)體定位酶的某植物基因N-末端成熟部分的一部分序列形成，例如歐洲專利申請No.0 508 909中所述。
可能使用任何相應(yīng)的來源于細(xì)菌(諸如舉例為根癌土壤桿菌的nos終止子)或甚至來源于植物(諸如舉例為描述于歐洲專利申請EPNo.0 633 317中的組蛋白終止子)的序列作為終止子或聚腺苷酸化調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明的又一目的物單子葉或雙子葉植物的植物細(xì)胞，尤其是農(nóng)作物細(xì)胞，它們按照上述的一種流程轉(zhuǎn)化并在其基因組中含有有效量的表達(dá)羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)的基因。已經(jīng)觀察到用運種方法轉(zhuǎn)化的植物對特定的新除草劑有顯著耐受性，這些新除草劑如特別是描述于法國專利申請9506800和95 13570的異噁唑類以及特別地屬于4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲?；鵠-5-環(huán)丙基異噁唑{4-[4-CF3-2-(methyl sulphonyl)benzoly]-5-cyclopropylisoxazole}的異噁唑類，以及特別地是氟異噁唑，一種選擇性玉米除草劑，雙酮腈類(diketonitriles)，例如描述于歐洲專利申請0496 630，0 496 631中的那些，特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3-苯基)丙烷-1，3-二酮[2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2CH3-4-CF3-phenyl)propane-1，3-dione]和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-2，3-Cl2苯基)丙烷-1，3-二酮[2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2CH3-4-2，3-Cl2-phenyl)propane-1，3-dione]，描述于歐洲專利申請0 625 505和0 625 508中的三酮類，特別是硫三酮。
最后，本發(fā)明的目的是借助此類型除草劑來清除植物，特別是農(nóng)作物雜草的一種方法，特征在于在農(nóng)作物播種前，萌發(fā)前以及萌發(fā)后都把除草劑施用于按照發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明還有一個目的是把HPPD基因作為標(biāo)記基因用于植物物種“轉(zhuǎn)化-再生”周期過程中并在上述除草劑基礎(chǔ)上篩選。
借助在下面的實驗實施例，發(fā)明的各方面特征將得以更好的理解。
實施例1熒光假單胞菌A32(P.fluore scers A32)的HPPD基因的分離從假單胞菌菌株P(guān).J.874的HPPD氨基酸序列出發(fā)(Ruetschi U.等發(fā)表，1992，“歐洲生物化學(xué)雜志”(Eur.J.Biochem.)205459-466，推導(dǎo)出不同的寡聚核苷酸序列以通過PCR擴(kuò)增熒光假單胞菌A32(P.fluorescens A32)(由McKellar，R.C.分離，1982，“應(yīng)用細(xì)菌學(xué)雜志”(J.Appl.Bacteriol.)，53305-316)的HPPD編碼序列的一部分。已應(yīng)用此HPPD基因的一個擴(kuò)增片段來篩選熒光假單胞菌A32的部分基因組庫并從而分離編碼此酶的基因。
A)熒光假單胞菌A32基因組DNA的制備細(xì)菌在40毫升M63基本培養(yǎng)基(KH2PO413.6克/升，(NH4)2SO42克/升，MgSO40.2克/升，F(xiàn)eSO40.005克/升，pH7，添加10mML-酪氨酸作為單一碳源)中于28℃下培養(yǎng)48小時。
洗滌后，細(xì)胞溶解于1毫升裂解緩中液(100mM tris HCl，pH8.3，1.4MNaCl和10mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA))并在65℃下溫育10分鐘。
酚/氯仿(24∶1)處理和氯仿處理后，通過加入一體積異丙醇沉淀核酸，然后溶解于300微升無菌水并用終濃度10微克/毫升的RNA酶處理。DNA重新用酚/氯仿，氯仿處理并通過加入1/10體積3M醋酸鈉，pH 5和2體積乙醇再沉淀。DNA然后溶解于無菌水并檢測。
B)寡聚核苷酸的選擇以及合成從假單胞菌菌株P(guān).J.874的HPPD氨基酸序列出發(fā)，選擇五段寡聚核苷酸，其中兩段定向為蛋白質(zhì)NH2末端指向蛋白質(zhì)COOH末端的方向，另三段定向相反方向(參看

圖1)。選擇按下列標(biāo)準(zhǔn)決定-寡聚核苷酸有穩(wěn)定3′末端，也就是說至少兩個堿基沒有歧義。
一可能的簡并性最小選擇的寡聚核苷酸具有下面的序列P15′TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCTATGGG3′P25′GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3′P35′AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3′P45′AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3′
P55′GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCIC3′它們在MILLIPORE制造的Cycloneplus DNA合成儀中合成。
使用這五種寡聚核苷酸，通過起始于序列1的PCR，理論上應(yīng)該得到的擴(kuò)增片段具有下列大小使用引物P1和P3------------------→大約690堿基對(bp)使用引物P1和P4------------------→大約720bp使用引物P1和P5------------------→大約1000bp使用引物P2和P3------------------→大約390bp使用引物P4和P4------------------→大約420bp使用引物P2和P5------------------→大約700bpC)熒光假單胞菌A32的HPPD某編碼部分的擴(kuò)增擴(kuò)增在PERKIN ELMER 9600 PCR儀中進(jìn)行并在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用PERKIN ELMER的Taq聚合物酶及其緩中液，也就是說對50微升反應(yīng)混合液，含有200μMdNTP，20μM引物，2.5單位Taq聚合酶和2.5微克熒光假單胞菌A32的DNA。
使用的擴(kuò)增程序是95℃5分鐘，然后＜45秒95℃，45秒49℃，1分鐘72℃＞進(jìn)行35個循環(huán)，隨后是72℃5分鐘。
在這種條件下，所有獲得的擴(kuò)增片段大小與上述給出的理論大小相符，從而很好的表明擴(kuò)增特異性。
用各對引物P1/P4，P1/P5和P2/P4獲得的擴(kuò)增片段，在用Eco RV消化質(zhì)粒pBSII SK(-)并如HOLTON T.A.和GRAHAMM.W.1991，N.A.R.，Vol.19，No.5，p.1156所述在dd TTP存在下用末端轉(zhuǎn)移酶處理后，連接到pBSII SK(-)中。
對三種類型每一種的一個克隆進(jìn)行了部分測序；這使得可以證實在三種情況下熒光假單胞菌A32的HPPD部分編碼區(qū)真正得到了擴(kuò)增。P1/P4片段保留作為探針以篩選熒光假單胞菌A32部分基因組庫并分離完整的HPPD基因。
D)基因的分離通過Southern檢測表明，用限制性酶Bam HI消化熒光假單胞菌A32DNA后的7Kbp片段與探針HPPD P1/P4雜交。400微克熒光假單胞菌A32DNA從而用限制性酶Bam HI消化并且出等于大約7Kbp的DNA片段在瓊脂糖凝膠中純化。
這些片段連接到pBSII SK(-)中，后者已用BamHI消化并用堿性磷酸酶處理去磷酸化。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 10b(E.coli DH10b)后，用探針HPPD P1/P4篩選部分基因組庫。
篩選到一個陽性克隆并命名為pRPA。它的簡化圖譜示于圖2。此圖中標(biāo)出了HPPD基因編碼部分的位置。它由編碼358個氨基酸的1077個核苷酸組成(參看序列1)。熒光假單胞菌A32的HPPD與假單胞菌菌株P(guān).J.874具有很好的氨基酸同源性，實際上兩蛋白92％一致(參見圖3)。
實施例2兩個嵌合基因的構(gòu)建為使植物有對抑制HPPD的除草劑的耐受性，構(gòu)建了兩個嵌合基因第一個嵌合基因在于把熒光假單胞菌A32 HPPD基因的編碼部分置于雙組蛋白啟動子(歐洲專利No.0 507 698)控制之下，其后是煙草蝕紋病毒翻譯增強(qiáng)子(TEV)(pRTL-GUS(Carrington和Freed，1990；“病毒學(xué)雜志”(J.Virol.)641590-1597))以及胭脂氨酸合成酶基因的終止子。HPPD然后將定位到細(xì)胞質(zhì)。
第二個嵌合基因除了把最優(yōu)化轉(zhuǎn)運肽(OTP)插入到TEV轉(zhuǎn)錄激活物和HPPD編碼部分之間外(歐洲專利申請EPNo.0508 909)，幾乎與第一個相同。HPPD然后將定位于葉綠體。
A)載體pRPA-RD-153的構(gòu)建-pRPA-RD-11含有胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位點(NOS polyA)(歐洲專利申請EP No.0652 286)的pBSII SK(-)(Stratagene目錄#212206)衍生物克隆到KpmI和SalI位點之間。KpnI位點在150μM脫氧核苷三磷酸存在下用T4DNA聚合酶I處理轉(zhuǎn)化到NotI位點，然后用一個NotI接頭連接(Stratagene目錄#1029)。從而獲得了一個NOS polyA克隆盒。
-pRPA-RD-127一個pRPA-BL-466(歐洲專利申請EP No.0337 899)的衍生物克隆到pRPA-RD-11，產(chǎn)生oxy基因的表達(dá)盒并含有核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亞單位啟動子“啟動子(SSU)-oxy基因-NOS polyA”為產(chǎn)生此質(zhì)粒，用XbaI和Hind III消化pRPA-BL-448以分離含有SSU啟動子和oxy基因的1.9Kbp片段，它再連接到用兼容酶消化的質(zhì)粒pRPA-RD-11中。
-pRPA-RD-132這是克隆到pRPA-RD-127產(chǎn)生一個具有雙組蛋白啟動子的oxy基因表達(dá)盒pRPA-BL-488(歐洲專利申請EPNo.0507 698)的一個衍生物“雙組蛋白啟動子-oxy基因-NOS poly A”為產(chǎn)生此質(zhì)粒，用Hind III消化pRPA-BL-466，用Klenow酶處理然后用NcoI再消化。純化的含有組蛋白雙啟動子H3A 748的1.35Kbp片段與用XbaI消化，Klenow處理NcoI再消化的質(zhì)粒pRPA-RD-127相連接。
-pRPA-RD-153這是一個含有煙草蝕紋病毒(TEV)的pRPA-RD-132衍生物。用NcoI和EcoRI消化pRTL-GUS(Carrington和Freed，1990；“病毒學(xué)雜志”(J.Virol.，641590-1597)并把150bp片段連接到相同酶消化的pRPA-RD-132中。從而產(chǎn)生了含有啟動子“雙組蛋白啟動子-TEV-oxy基因-NOS polyA”的表達(dá)盒。
B)載體pRPA-RD-185的構(gòu)建pUC19/GECA含有多克隆位點的PUC19(Gibco目錄#15364-011)的衍生物。用EcoRI消化pUC-19并與寡聚核苷酸接頭1相連接接頭1AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTAGGGGGCCCG CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGATCCCCCGGGC TTAA選擇的克隆含有EcoRI位點，其后是含有下列位點的多接頭EcoRI，ApaI，AvrII，PmeI，SfiI，SacI，KpnI，SmaI，BamHI，XbaI，SalI，PstI，SphI和HindIII。
pRPA-RD-185這是一個含有修飾多接頭的pUC19/GECA衍生物。用HindIII消化pUC19/GECA并與寡核者酸接頭2相連接接頭2AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCTGGTTCAGGG AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA
CCAAGTCCCTCGA選擇的克隆在多接頭中間含有一個HindIII位點，多接頭現(xiàn)在含有下列位點EcoRI，ApaI，AvrII，PmeI，SfiI，SacI，KpnI，SmaI，BamHI，XbaI，SalI，PstI，SphI，HindIII，PacI，AscI，XhoI和EcoNI。
C)載體pRP T的構(gòu)建-pRPO一個含有HPPD表達(dá)盒，雙組蛋白啟動子-TEV-HPPD基因-終止子Nos的pRPA-RD-153衍生物。為了產(chǎn)生pRPO，用HindIII消化pRPA-RD-153，Klenow處理，然后用NcoI再消化以去除oxy基因，并使用來自以BstEII消化，Klenow處理以及NcoI再消化的pRPA質(zhì)粒的HPPD基因來代替它。
-pRPR為獲得此質(zhì)粒，用PvuII和SacI消化pRPO，純化嵌合基因并連接到pRPA-RD-185中，且后者已用PvuII和SacI消化。
-pRPT通過把來源于SacI和HindIII消化的pRPR的嵌合基因連接到用相同酶消化的質(zhì)粒pRPA-BL 150 alpha2(歐洲專利申請EPNo.0 508 909)中獲得。
pRPT載體的嵌合基因從而具有下列結(jié)構(gòu)
D)pRPV載體的構(gòu)建-pRPP運是含有最優(yōu)化的轉(zhuǎn)運肽且其后是HPPD基因pRPA-RD-7(歐洲專利申請EP No.0 652 286)的衍生物。它通過連接來自用BstEII和NcoI消化，Klenow處理的pRPA和來自質(zhì)粒pRPA-RD-7的HPPD編碼部分獲得，后者用SphI和AccI消化并用DNA酶聚合酶T4處理。
-pRPQ含有HPPD表達(dá)盒，雙組蛋白啟動子-TEV-OTP-HPPD基因-Nos終止子的pRPA-RD-153的衍生物。為構(gòu)建它，用SalI消化質(zhì)粒pRPA-RD-153，K1enow處理然后用NcoI再消化去除oxy基因并用由BstEII消化，Klenow處理并用NcoI再消化的pRPP質(zhì)粒釋放的HPPD基因代替它。
-pRPS為獲得它，有PvuII和SacI消化質(zhì)粒pRPQ以釋放嵌合基因并連接到pRPA-RD-185，后者已用PvuII和SacI消化。
-pRPV它通過把SacI和HindIII消化后從pRPS釋放的嵌合基因連接到質(zhì)粒pRPA-BL 150alpha2(歐洲專利申請EP No.0 508 909)中獲得。
pRPV載體的嵌合基因從而含有以下結(jié)構(gòu)
實施例3工業(yè)用煙草PBD6的轉(zhuǎn)化為了檢測這兩種嵌合基因的效率，根據(jù)歐洲專利申請EP No.0 508 909中所述的轉(zhuǎn)化和再生工藝把它們轉(zhuǎn)移到工業(yè)用煙草PBD6中。1)轉(zhuǎn)化把載體引入到攜帶粘粒pTVK291(Komari等，1986)的非致癌菌株土壤桿菌EHA 101中(Hood等，1987)。轉(zhuǎn)化技術(shù)基于HorshR.等(1985)，“科學(xué)”(Science)，227，1229-1231中的流程。
煙草PBD6(來自SEITA，法國)從葉外植體的再生在含有30克/升蔗糖和200微克/毫升卡那霉素的Murashige和Skoog(MS)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行。葉外植體從溫室或試管植物上選擇并按照葉盤法(“科學(xué)”(Science)1985，Vol，227，P.1229-1231)通過三個連續(xù)步驟轉(zhuǎn)化第一步包括在加有30克/升蔗糖并含有0.05毫克/升萘乙酸(NAA)和2毫克/升芐基氨基嘌呤(BAP)的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)苗15天。這一步形成的苗通過在加有30克/升蔗糖但不含任何激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天進(jìn)行發(fā)育。選擇發(fā)育的苗并在含有含量為一半的鹽，維生素和糖并不含任何激素的MS生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在接近15天時，把生根的苗置于土壤。實施例4檢測煙草對4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲?；鵠-5-環(huán)丙基異噁唑的耐受性萌發(fā)后處理。
在離開離體培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化煙草小植株在溫室中(60％相對濕度；溫度夜晚20℃，白天23℃)馴化五周，然后用4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲酰基]-5-環(huán)丙基異噁唑處理。
未轉(zhuǎn)化的對照煙草用劑量范圍50到400克/公頃(g/ha)的4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲酰基]-5-環(huán)丙基異噁唑處理，在大約72小時內(nèi)發(fā)生黃化，在一周內(nèi)增強(qiáng)至發(fā)展成顯著的枯斑(將最后的葉覆蓋大約80％)。
轉(zhuǎn)化后過量表達(dá)熒光假單胞菌HPPD的同一種煙草被很好地保護(hù)起來，抗400克/公頃劑量的4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲?；鵠-5-環(huán)丙基異噁唑處理。
如果過量表達(dá)的酶在細(xì)胞質(zhì)中，也就是說如果轉(zhuǎn)化通過載體pRPT攜帶的基因完成，那么植物顯示全部位于中間葉的非常輕微的黃化。
如果過量表達(dá)的酶在葉綠體中，也就是說如果轉(zhuǎn)化通過載體pRPV攜帶的基因完成，那么植物被非常好地保護(hù)起來并不顯示任何癥狀。實施例5檢測煙草對4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲?；鵠-5-環(huán)丙基異噁唑的耐受性萌發(fā)前處理。
a)體外試驗在實施例1到3中所述的400克/公頃的劑量時，使用收獲于來自“轉(zhuǎn)化-再生”周期并對氟異噁唑葉處理有抗性的植株的煙草種子。
把這些種子播種到有10克/升的植物瓊脂以及從0到1毫克/升范圍內(nèi)的不同濃度氟異噁唑的盒子中。發(fā)芽在25℃下12小時光照/12小時黑暗的光周期中進(jìn)行。
根據(jù)這一方案，萌發(fā)野生型煙草種子以及兩種轉(zhuǎn)基因煙草的種子，也就是說HPPD定位于細(xì)胞質(zhì)的CY煙草和HPPD定位于葉綠體的CO煙草的種子。
播種2和3周后以目測進(jìn)行抗性測定。
結(jié)果記錄于下表中。
°小植物在發(fā)芽過程中表現(xiàn)的癥狀是或多或少的子葉的顯著畸變，并首先是正常進(jìn)行光合作用并從而是綠色的組織變白。*75％的種子發(fā)芽是因為種子來自“轉(zhuǎn)化-再生”周期并從而只在一條染色體上攜帶耐受性基因的單基因座植物的自體受精。用同樣的方法以下面的產(chǎn)品進(jìn)行測定；使用美國專利4 780 127 No.51產(chǎn)品在0毫克/升和0.1毫克/升濃度下處理野生型煙草和CO煙草獲得相同的結(jié)果。b)溫室試驗除處理要在播種前24小時，萌發(fā)前進(jìn)行外，檢測如實施例4中所述進(jìn)行。田間播種按常規(guī)進(jìn)行。在這些條件下觀察到，對于未處理的對照播種，在至少等于10克/公頃的任何濃度除草劑處理后未出現(xiàn)發(fā)芽。與此相反，CY煙草在高至并包括100克/公頃時不表現(xiàn)如段落a)中定義的任何癥狀。相似地，CO煙草在高至并包括200克/公頃時不表現(xiàn)如段落a)中定義的任何癥狀。
這些結(jié)果清楚地表明熒光假單胞菌HPPD基因使煙草有對氟異噁唑萌發(fā)前處理的耐受性。如果蛋白定位到葉綠體而不是細(xì)胞質(zhì)時，耐受性更好。實施例6為了研究是否熒光假單胞菌HPPD基因在植物物種“轉(zhuǎn)化-再生”周期過程中可用作標(biāo)記基因，用HPPD基因轉(zhuǎn)化煙草并在氟異 唑篩選后獲得轉(zhuǎn)化的植株。材料、方法和結(jié)果按照歐洲專利申請EP No.0 508 909中所述的轉(zhuǎn)化和再生方法，把描述于下面的嵌合基因pRPV轉(zhuǎn)移到工業(yè)用煙草pBD6中。
載體pRPV的嵌合基因有下列結(jié)構(gòu)
1)轉(zhuǎn)化把載體引入到攜帶粘粒pTVK 291(Komari等，1986)的土壤桿菌EHA101非致癌菌株(Hood等，1987)中。轉(zhuǎn)化技術(shù)以Horsh等的方法(1985)為基礎(chǔ)。2)再生煙草PBD6(來自SEITA，法國)從葉外植體的再生在含有30克/升蔗糖以及350毫克/升氨噻肟酯頭孢菌素(cefotaxime)和1毫克/升氟異噁唑的Murashige和Skoog(MS)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行。葉外植體選自溫室或試管植物并按照葉盤法(“科學(xué)”(Science)1985，Vol.227，P.1229-1231)通過三個連續(xù)步驟轉(zhuǎn)化第一步包括在添加30克/升蔗糖且包含有0.05毫克/升萘乙酸(NAA)和2毫克/升芐基氨基嘌呤(BAP)及1毫升/升氟異噁唑的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)苗生長15天。這一步驟中形成的綠苗然后通過在添加30克/升蔗糖和1毫克/升氟異噁唑但不含激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天進(jìn)行發(fā)育。選擇發(fā)育的苗并在含量為一半的鹽，維生素和糖和1毫克/升氟異噁唑并不含任何激素的MS生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。大約15天后，把生根的苗移至土壤。
使用熒光假單胞菌HPPD的特異引物通過PCR檢測了根據(jù)這種方法獲得的所有小植物。PCR檢測使得可以證實這樣獲得的所有小植物整合了HPPD基因。
總之，此檢測證實HPPD基因可用作標(biāo)記基因并且與此基因相聯(lián)系，氟異噁唑可作為良好的選擇劑。
實施例7和8分離擬南芥(Arabidopsis thaliana)的HPPD基因和胡蘿卜(野胡蘿卜(Daucus carotta))的HPPD基因a)cDNA庫構(gòu)建從擬南芥幼小植株提取的mRNAs和從培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞提取的mRNAs通過從Stratagen公司購買的載體Uni ZapTMXR，按照該公司推薦的方法用于構(gòu)建兩個cDNA庫。b)篩選cDNA庫使用通過擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological ResourceCenter)(俄亥俄州，美國)獲得的并檢索為EST clone No.91B 13T17的部分長度的擬南芥cDNA相對應(yīng)的探針篩選這兩個庫。這一克隆由大約500堿基對組成，其中只有228堿基對已由MSU-DOE植物研究實驗室(MSU-DOEPlant Research Laboratory)測序于擬南芥cDNA隨機(jī)測序序列中。通過裂解區(qū)域雜交的經(jīng)典技術(shù)(參考文獻(xiàn)？)，我們在使用這個克隆篩選擬南芥和胡蘿卜cNDA庫之前，完全測定了500堿基對序列。c)獲得了一段對應(yīng)1338堿基對的擬南芥cDNA(序列2)。此cDNA在25位有一個翻譯起始密碼子，在1336位有一個翻譯終止密碼子。此cDNA從而是完全的并編碼一種445氨基酸的蛋白質(zhì)。d)獲得了一段對應(yīng)1329堿基對的胡蘿卜(野胡蘿卜(Daucus carotta))cDNA(序列3)。此cDNA在1位有一個翻譯起始密碼子，在1329位有一個翻譯終止密碼子。此cDNA從而是完全的并編碼一個442氨基酸的蛋白質(zhì)。
圖示的序列如下序列1熒光假單胞菌A32HPPD基因序列序列2擬南芥HPPD的cDNA序列序列3Daucus carottaHPPD的cDNA序列通過標(biāo)示給出下列圖形以說明本發(fā)明。
圖1表示假單胞菌P.J.874HPPD的蛋白質(zhì)序列以及相應(yīng)編碼部分的理論核苷酸序列；五個箭頭表示選擇的用于擴(kuò)增部分此編碼區(qū)的五段寡聚核苷酸。
圖2表示具有包含熒光假單胞菌A32HPPD基因的7kb基因組DNA片段的質(zhì)粒圖譜。
圖3給出了熒光假單胞菌A32HPPD氨基酸序列與假單胞菌P.J.874HPPD氨基酸序列的比較(只標(biāo)出了兩個序列相異的氨基酸)以及共有序列。
序列表(1)一般資料(i)申請人Sailland，AlainRolland，AnneMatringe，MichelPalltt，Kenneth E(ii)發(fā)明名稱羥苯丙酮酸雙加氧酶的DNA序列以及含有這個羥苯丙酮酸雙加氧酶基因且對特定除草劑有抗性的植物的獲得(iii)序列數(shù)目3(iv)通訊地址(A)收信人Francois Chretien(B)街道14-20rue Pierre BAIZET(C)城市Lyon Cedex09(E)國家法國(F)郵編89263(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.25版本(vi)現(xiàn)在申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朏RPH95033(B)填表日期1995年6月2日(C)分類(Viii)律師/代理人資料(A)姓名Chretien，F(xiàn)rancois(ix)通訊資料(A)電話72-29-26-42(B)傳真72-29-28-43(2)序列1的資料(i)序列特征(A)長度1077堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iv)反義無(vi)來源(A)生物熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)(xi)序列描述序列1ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTAGCG 60TCGCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 120ACCCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGCTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 840GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077(2)序列2的資料(i)序列特征(A)長度1338堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(vi)來源(A)生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)(B)品系Columbia(D)發(fā)育階段初生綠色植株(vii)直接來源(A)庫Unizap XR STRATAGENE(xi)序列描述序列2ATGGGCCACC AAAACGCCGC CGTTTCAGAG AATCAAAACC ATGATGACGG CGCTGCGTCG 60TCGCCGGGAT TCAAGCTCGT CGGATTTTCC AAGTTCGTAA GAAAGAATCC AAAGTCTGAT 120AAATTCAAGG TTAAGCGCTT CCATCACATC GAGTTCTGGT GCGGCGACGC AACCAACGTC 180GCTCGTCGCT TCTCCTGGGG TCTGGGGATG AGATTCTCCG CCAAATCCGA TCTTTCCACC 240GGAAACATGG TTCACGCCTC TTACCTACTC ACCTCCGGTG ACCTCCGATT CCTTTTCACT 300GCTCCTTACT CTCCGTCTCT CTCCGCCGGA GAGATTAAAC CGACAACCAC AGCTTCTATC 360CCAAGTTTCG ATCACGGCTC TTGTCGTTCC TTCTTCTCTT CACATGGTCT CGGTGTTAGA 420GCCGTTGCGA TTGAAGTAGA AGACGCAGAG TCAGCTTTCT CCATCAGTGT AGCTAATGGC 480GCTATTCCTT CGTCGCCTCC TATCGTCCTC AATGAAGCAG TTACGATCGC TGAGGTTAAA 540CTATACGGAG ATGTTGTTCT CCGATATGTT AGTTACAAAG CAGAAGATAC CGAAAAATCC 600GAATTCTTGC CAGGGTTCGA GCGTGTAGAG GATGCGTCGT CGTTCCCATT GGATTATGGT 660ATCCGGCGGC TTGACCACGC CGTGGGAAAC GTTCCTGAGC TTGGTCCGGC TTTAACTTAT 720GTAGCGGGGT TCACTGGTTT TCACCAATTC GCAGAGTTCA CAGCAGACGA CGTTGGAACC 780GCCGAGAGCG GTTTAAATTC AGCGGTCCTG GCTAGCAATG ATGAAATGGT TCTTCTACCG 840ATTAACGAGC CAGTGCACGG AACAAAGAGG AAGAGTCAGA TTCAGACGTA TTTGGAACAT 900AACGAAGGCG CAGGGCTACA ACATCTGGCT CTGATGAGTG AAGACATATT CAGGACCCTG 960AGAGAGATGA GGAAGAGGAG CAGTATTGGA GGATTCGACT TCATGCCTTC TCCTCCGCCT 1020ACTTACTACC AGAATCTCAA GAAACGGGTC GGCGACGTGC TCAGCGATGA TCAGATCAAG 1080GAGTGTGAGG AATTAGGGAT TCTTGTAGAC AGAGATGATC AAGGGACGTT GCTTCAAATC 1140TTCACAAAAC CACTAGGTGA CAGGCCGACG ATATTTATAG AGATAATCCA GAGAGTAGGA 1200TGCATGATGA AAGATGAGGA AGGGAAGGCT TACCAGAGTG GAGGATGTGG TGGTTTTGGC 1260AAAGGCAATT TCTCTGAGCT CTTCAAGTCC ATTGAAGAAT ACGAAAAGAC TCTTGAAGCC 1320AAACAGTTAG TGGGATGA1338(2)序列3的資料(i)序列特征(A)長度1329堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(vi)來源(A)生物野胡蘿卜(Daucus carota)(D)發(fā)育階段懸浮細(xì)胞(vii)直接來源(A)庫Uni zap XR STRATAGENE(xi)序列描述序列3ATGGGGAAAA AACAATCGGA AGCTGAAATT CTCTCAAGCA ATTCATCAAA CACCTCTCCT 60GCAACATTCA AGCTGGTCGG TTTCAACAAC TTCGTCCGCG CCAACCCCAA GTCCGATCAC 120TTCGCCGTGA AGCGGTTCCA CCACATTGAG TTCTGGTGCG GCGACGCCAC CAACACGTCG 180CGGCGGTTCT CGTGGGGCCT CGGCATGCCT TTGGTGGCGA AATCGGATCT CTCTACTGGA 240AACTCTGTTC ACGCTTCTTA TCTTGTTCGC TCGGCGAATC TCAGTTTCGT CTTCACCGCT 300CCTTACTCTC CGTCCACGAC CACTTCCTCT GGTTCAGCTG CCATCCCGTC TTTTTCGGCA 360TCGGGTTTTC ACTCTTTTGC GGCCAAACAC GGCCTTGCTG TTCGGGCTAT TGCTCTTGAA 420GTTGCTGACG TGGCTGCTGC GTTTGAGGCC AGTGTTGCGC GTGGGGCCAG GCCGGCTTCG 480GCTCCTGTTG AATTGGACGA CCAGGCGTGG TTGGCTGAGG TGGAGTTGTA CGGAGATGTG 540GTCTTGAGGT TTGTTAGTTT TGGGAGGGAG GAGGGTTTGT TTTTGCCTGG ATTCGAGGCG 600GTGGAGGGGA CGGCGTCGTT TCCGGATTTG GATTATGGAA TTAGAAGACT TGATCATGCG 660GTGGGGAATG TTACCGAGTT GGGGCCTGTG GTGGAGTATA TTAAAGGGTT TACGGGGTTT 720CATGAATTTG CGGAGTTTAC AGCGGAGGAT GTGGGGACTT TGGAGAGTGG GTTGAATTCG 780GTGGTGTTGG CGAATAATGA GGAGATGGTT CTGTTGCCCT TGAATGAGCC TGTGTATGGG 840ACCAAGAGGA AGAGTCAGAT ACAGACTTAC TTGGAGCACA ATGAAGGGGC TGGAGTGCAG 900CATTTGGCTT TAGTGAGTGA GGATATTTTT AGGACTTTAA GGGAGATGAG GAAGAGGAGT 960TGCCTTGGTG GTTTTGAGTT TATGCCTTCG CCACCGCCTA CGTATTACAA GAATTTGAAG 1020AATAGGGTCG GGGATGTGTT GAGTGATGAA CAGATCAAGG AGTGTGAAGA TTTGGGGATT 1080TTGGTGGATA GGGATGATCA GGGTACATTG CTTCAAATCT TTACCAAGCC TGTAGGTGAC 1140AGGCCTACCT TATTCATAGA GATCATTCAG AGGGTAGGGT GCATGCTCAA GGACGATGCA 1200GGGCAGATGT ACCAGAAGGG CGGGTGCGGA GGATTTGGGA AGGGGAACTT CTCAGAGCTG 1260TTCAAGTCCA TCGAAGAATA TGAAAAAACA CTTGAAGCTA AACAAATCAC TGGATCTGCT 1320GCTGCATGA 1329
權(quán)利要求
1.從非人類來源或非海洋細(xì)菌來源分離到的一個基因的序列或者能與此序列雜交的序列，其特征是表達(dá)羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的序列，其特征在于它來自細(xì)菌或植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的序列，其特征在于它來自假單胞菌(Pseudomonassp.)
4.根據(jù)權(quán)利要求3的序列，其特征在于它來自熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的序列，其特征在于它來自植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的序列，其特征在于它來自擬南芥屬(Arabidopsis)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的序列，其特征在于它來自一種傘形科植物。
8.分離根據(jù)權(quán)利要求1到4的基因的方法，其特征在于-從HPPD氨基酸序列出發(fā)選擇一些寡聚核苷酸作為引物，-從這些引物出發(fā)，通過PCR合成擴(kuò)增片段，-通過構(gòu)建和篩選基因組庫分離基因，并-克隆該基因。
9.用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的嵌合基因，在轉(zhuǎn)錄方向上包括-至少一個來自在植物中天然表達(dá)自身的某基因的啟動子調(diào)節(jié)序列，-一個異源編碼序列，-至少一個聚腺苷酸化序列，特征在于編碼序列是一個表達(dá)羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)基因的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的嵌合基因，其特征是啟動子調(diào)節(jié)序列有利于編碼序列的過量表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合基因，其特征是啟動子調(diào)節(jié)序列至少包括一個組蛋白啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求9到11中的一項的嵌合基因，特征是在啟動子調(diào)節(jié)序列如編碼序列之間包含一個轉(zhuǎn)運肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的嵌合基因，特征是在啟動子調(diào)節(jié)序列和編碼序列之間包含一個最優(yōu)化的轉(zhuǎn)運肽，其在轉(zhuǎn)錄方向上包括編碼質(zhì)體定位酶的某植物基因的編碼轉(zhuǎn)運肽的序列，編碼質(zhì)體定位酶的某植物基因N末端成熟部分的序列的一部分，然后編碼質(zhì)體定位酶的某植物基因的編碼第二個轉(zhuǎn)運肽的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求9到13中的一項的一個嵌合基因，特征是它在啟動子調(diào)節(jié)序列和編碼序列之間包含一個轉(zhuǎn)錄激活(增強(qiáng)子)序列。
15.可用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體，特征是它含有根據(jù)權(quán)利要求9到14中的嵌合基因。
16.植物細(xì)胞，特征是它含有根據(jù)權(quán)利要求9到14中的嵌合基因。
17.植株，特征是它從根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞再生。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的植物，特征是它屬于雙子葉類。
19.植物轉(zhuǎn)化以使它們耐受HPPD抑制劑的方法，其特征是把一個表達(dá)外源HPPD的基因?qū)胫参锛?xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，特征是使用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根病土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)完成轉(zhuǎn)移。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，特征是使用負(fù)載DNA的顆粒通過基因槍導(dǎo)入完成轉(zhuǎn)移。
22.植物轉(zhuǎn)化的方法，特征是把表達(dá)外源HPPD的基因作為選擇標(biāo)記導(dǎo)入植物細(xì)胞。
23.植物選擇性除草劑處理的方法，特征是把一個HPPD基因的抑制劑施加到根據(jù)權(quán)利要求17和18中的植株。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，特征是HPPD基因抑制劑是一種異噁唑。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，特征是異噁唑為4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲酰基]-5-環(huán)丙基異噁唑。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，特征是HPPD基因抑制劑是一種二酮腈。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征是HPPD基因抑制劑是一種三酮。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，特征是HPPD基因抑制劑是硫三酮。
全文摘要
羥苯丙酮酸雙加氧酶基因的DNA序列以及含有羥苯丙酮酸雙加氧酶基因的耐除草劑植物的生產(chǎn)。羥苯丙酮酸雙加氧酶基因的DNA序列;自細(xì)菌或植物分離;用于獲得耐除草劑植物。
文檔編號C12N15/53GK1192243SQ9619585
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月2日
發(fā)明者阿蘭·賽蘭德, 安妮·羅蘭, 米歇爾·馬特林格, 肯·帕利特 申請人:羅納-普朗克農(nóng)業(yè)化學(xué)公司